SERIES EM BIOTECNOLOGIA volume I Tecnologia de BioprocessosP436t Pereira Jr., Nei. (editor-autor) Tecnologia de bioprocessos / Nei Pereira Jr., Elba Pinto da Silva Bon, Maria Antonieta Ferrara. — Rio de Janeiro: Escola de Quimica/UFRJ, 2008. 62 p.: il. - (Séries em Biotecnologia, v. 1) ISBN 978-85-903967-2-7 Inclui bibliografia, 1. Bioprocessos. 2. Tecnologia. 3. Bioprodutos. 1. Bon, Elba Pinto da Silva. II. Ferrara, Maria Antonieta. IIl. Titulo. IV. Série. DD 600 Biblioteca Nacional ISBN 978-85-303967-2-7 rT 396727 738590BREVE NOTA BIBLIOGRAFICA SOBRE OS AUTORES Nel Pereira Jr é Professor Titular do Departamento de Engenharia Bioquimica da Escola de Quimica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Possui os titulos de Engenheiro Quimico (EQ-UFRJ, 1977); MSc em Tecnologia de Processos Bioquimicos (EQ-UFRJ, 1982) e PhD em Biotecnologia (The University of Manchester, UK, 1991). Desde 1991, vem liderando projetos de Pesquisa & Desenvolvimento & Inovagao nos Laboratérios de Desenvolvimento de Bioprocessos da UFRJ, onde jé orientou 65 teses (43 MSc e 22 DSc). Coordena as seguintes linhas de pesquisa: Biotecnologia de Lignocelulésicos; Processos com Microrganismos Recombinantes; Biotecnologia Ambiental; Floculacdo/Imobilizacio de Células e Enzimas; Tecnologia da\ Producéo de Antibidticos; Producéo de Alimentos Funcionais; Gestéo Tecnolégica e Tratamento/Minimizacéo de Residuos e Efluentes Industriais. Atualmente, orienta 05 estudantes de mestrado e 08 de doutorado, Jé publicou mais de 200 trabalhos (artigos em periddicos indexados e trabalhos em eventos cientificos) e 07 patentes, uma delas relacionada producio de bioetanol de bagaco de cana-de-acicar via hidrdlise enzimatica de celulose, trabalho realizado para a PETROBRAS que resultou na patente de numero 1000 da empresa. Também desenvolve trabalhos cooperativos com instituicdes de ensino e pesquisa nacionais e internacionais, bem como com empresas. E bolsista do CNPq (Produtividade em Pesquisa) e da FAPER) (Cientista do nosso Estado) em reconhecimento as suas contribuigdes ao desenvolvimento da ciéncia e tecnologia nacionais, assim como na formaco de recursos humanos altamente capacitados. Ele foi recentemente agraciado com os seguintes prémios: PETROBRAS Inventor 2005, 2006 e 2007; Tese Ouro (2006), concedido pela Escola de Quimica por ter atingido a orientacdo de 50 teses em seu Programa de Pés-graduagéo e 0 prémio nacional da Associagéo Brasileira da Industria Quimica (ABIQUIM) - Pesquisador de Destaque 2006 Elba Pinto da Silva Bon é Professora Associada do Departamento de, Bioquimica do Instituto de Quimica da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). E graduada em Ciéncias Biolégicas (UERI, 1970), com Mestrado em Bioquimica (UFRJ, 1974) e em Engenharia Bioquimica (UMIST-UK, 1987), Doutorado em Engenharia Bioquimica (UMIST-UK, 1991) e Pés-Doutorado no Departamento de Biologia do Massachusetts Institute of Technology (MIT, Cambridge, USA, 1995). & a coordenadora do Laboratério de Tecnologia Enzimética do IQ/UFRJ, onde atua nas areas de Microbiologia Aplicada, Biocatélise e Regulacéo do Metabolismo por Nitrogénio, com énfase a produg&o e uso de enzimas industriais e especiais e regulaco da expresso génica. JA orientou 27 teses (15 MSc e 12 DSc) e atualmente, orienta 03 estudantes de mestrado e 02 de doutorado, Coordena projetos de pesquisa desenvolvidos em colaborago com o Instituto Nacional de Tecnologia - MCT e a Fundagao Oswaldo Cruz - MS. 34 coordenou ou coordena projets de pesquisa com colaborago internacional com Portugal, Alemanha e Suécia, € coordenadora cientifica coordenadora setorial da drea de Producao de Celulases do Projeto Bioetanol. Atua também na drea de politicas de Ciéncia e Tecnologia tendo estruturado e organizaco muitas edices do evento ENZITEC. Participa das atividades do Férum de Biotecnologia do Governo Federal, como contratada pelo CGEE na drea de Enzimas Industriais e Especiais. Maria Antonieta Ferrara & Pesquisadora do Instituto de Tecnologia em Farmacos de Far- Manguinhos / Fundacgo Oswaldo Cruz. Possui graduagio em Quimica (IQ/UFRJ, 1974), Mestrado (EQ/UFRJ, 1988) e Doutorado (EQ/UFRJ, 2004) em Tecnologia de Processos Quimicos e Bioquimicos. Tem experiéncia nas dreas de Microbiologia, com énfase em Bioprocessos e de Tecnologia Enzimatica, atuando principalmente nos seguintes temas: producao de enzimas, producao de metabdlitos microbianos bioativos, producao de proteinas heterdlogas por Pichia pastoris, bioconverséo, enzimas terapéuticas, fungos endofiticos e pré-tratamento e hidrélise enzimética de biomassa vegetalAPRESENTACAO A Biotecnologia Moderna oferece inovadoras possibilidades para a produgao de substancias quimicas e processos mais limpos. Em seu cerne esté o principio de se trabalhar em harmonia com o mundo natural. A Biotecnologia tem solugées para atender 4 humanidade em suas mais diferentes necessidades (alimentos, energia, medicamentos), bem como suplantar tecnologias que poluem a biosfera ou que contribuam para a deplecéo de fontes finitas. No entanto, a industria, a comunidade cientifica e 0 governo necessitam trabalhar em conjunto para que o Brasil possa langar mao plenamente do potencial da Biotecnologia, a fim de alcangar sua sustentabilidade industrial/econémica/ ambiental e permitir que o pais siga a sua vocacao natural para essa drea. E neste contexto, que lancamos a primeira verséo das Séries em Biotecnologia com a intencéo de disponibilizar material instrucional a estudantes que tencionem atuar profissionalmente nesta importante drea. Esta primeira edi¢éo apresenta conceitos e fundamentos necessarios para uma melhor compreenséo das diferentes etapas que compéem a Tecnologia de Bioprocessos, com o objetivo de fornecer aos estudantes uma viso global e integrada desta teméatica, imprescindivel quando se pretende transformar conhecimento em realidade produtiva. No entanto, de cardter introdutério e cunho aplicado, néo tem a pretensdo de ser uma apresentac3o exaustiva sobre 0 assunto. Na realidade, séo notas de aulas que temos a intengdo de transformar em séries didaticas, de forma a colocar o estudante em contato com os problemas e desafios da Biotecnologia, quer seja na drea académica ou no setor industrial. Esperamos que 0 contevido desta edicéo proporcione aos leitores uma viso abrangente da érea para conhecimento e reflexdes. Estamos convictos da importéncia da Biotecnologia para o Brasil, pois ela concilia 0 desenvolvimento tecnolégico com a preservacao ambiental. Somos conscientes de que 0 meio ambiente brasileiro representa um ativo de valor incalculével e contribui decisivamente para a representatividade brasileira no cendrio internacional. Para isto registramos nosso firme propdsito e compromisso de contribuir efetivamente na formacao de massa critica capacitada para atuar nesta importante area, permitindo a insercéo desses profissionais em um mercado cada vez mais competitive e regulador em termos de produtos e processos. Os AutoresINDICE Tépico 1. A Biotecnologia Microbiana: Conceitos e Aplicagées Biotecnologia de Bactérias Biotecnologia de Leveduras e Fungos Filamentosos Tecnologia do DNA Recombinante 2. Bioprocessos 3. Agente Biolégico: Caracteristicas 4. Nutrigo dos Microrganismos Fontes de Energia Fontes de Carbono Fontes de Nitrogénio Fontes de Minerais Fatores de crescimento 5. Matérias-Primas Glicidicas 6. Meio de Cultivo Otimizagao do meio de cultivo Formulag3o de meio de cultivo com base na composicao centesimal de microrganismos 7. Esterilizacao de Meios e Equipamentos 8. Biorreator 9. Modos de Operacao de Bioprocessos Quanto a condugao Quanto ao desenvolvimento do agente microbiano Quanto ao suprimento de oxigénio 10. Processos de Separagio e Purificagdo de Produto 11, Extrapolagao de Escala 12. Tratamento Biolégico de Residuos e Efluentes 13. Consideracées Gerais 14, Referéncias Bibliograficas Recomendadas 33 35 41 41 45 47 50 50 53 57 58TECNOLOGIA DE BIOPROCESSOS Nei Pereira Jr.’; Elba Pinto da Silva Bon?& Maria Antonieta Ferrara? 1 Laboratérios de Desenvolvimento de Bioprocessos Escola de Quimica - CT/UFRJ - nei@eg.ufrj.br 2 Laboratério de Tecnologia Enzimatica Instituto de Quimica - CCMN/UFRJ 3 Instituto de Tecnologia em Farmacos Farmanguinhos/FIOCRUZ 1. A Biotecnologia Microbiana: Conceitos e Aplicagées Os varios conceitos da Biotecnologia se referem ao uso de células ou sistemas bioquimicos em processos de produgéo de bens ou de prestagao de servicos (Tabela 1). Neste contexto, a Biotecnologia tem papel destacado, sob o ponto de vista histérico e tecnolégico, visto que os primeiros processos industriais basearam-se na agéo de microrganismos e a grande maioria daqueles consagrados utiliza microrganismos nativos ou modificados geneticamente. A Biotecnologia apresenta carater inter e multidisciplinar, necessitando aqueles que militam nesta érea de conhecimentos fundamentais em Bioquimica, Genética, Microbiologia Aplicada e Engenharia Bioquimica, a fim de se ter uma maior compreensdo sobre a atividade do biocatalisador e buscar suas melhores condigdes de desempenho em biorreator (otimizacao). Outras ferramentas como a Modelagem e a Simulacao, bem como o Controle e a Instrumentagao sao “pecas-chaves” na otimizacao de Bioprocessos. Trata-se de uma area muito extensa, conforme exemplificado a seguir, para processos, produtos e servicos: diferentes microrganismos sao utilizados para a produgao de substancias de interesse comercial, como: antibidticos, dcidos organicos, solventes, enzimas e biocombustiveis por processos fermentativos. O produto pode ser ainda o proprio microrganismo, como a producao de levedura de panificagao e inoculantes agricolas, ou as células microbianas podem ser utilizadas em processos de biotransformacéo, como por exemplo, para a produgao de esterdides, aromas e fragrancias, Além da produg3o de bens de consumo, os microrganismos sdo também utilizados em processos de tratamento de residuos e efluentes urbanos e industriais, na recuperacdo de metais, tais como cobre, chumbo e urdnio, ou em processos de biorremediagao de solos contaminados. Os principais produtos da Biotecnologia podem ser agrupados de acordo com o seu uso, em produtos da industria farmacéutica (antibisticos, horménios, vacinas, vitaminas e proteinas terapéuticas humanas), da industria de alimentos (aminodcidos, flavorizantes, polissacarideos e gomas xantana) e da industria quimica (etanol, acetona, butanol, glicerol, acido lactico, Acido citrico, poliésteres, inseticidas microbianos). Como as enzimas microbianas so utilizadas em diferentes segmentos industriais, ndo é conveniente classificé-las de acordo com a sua aplicagao. Em decorréncia das varias aplicacées de seus produtos, a Biotecnologia insere-se em uma gama de segmentos industriais (Figura 1). 6Tabela1: Definigées de Biotecnologia. DEFINICAO REFERENCIA “Conjunto de processos microbianos e outros processos bioquimicos desenvolvidos em escala industrial" Stenesh (1989) “Uso de organismos vivos para produzir produtos benéficos para a espécie humana” Glazer & Nikaido (1995) “Integragao de ciéncias naturais e de ciéncias da engenharia visando a aplicacio de organismos, células, derivados celulares e andlogos moleculares para produtos e servicos" Smith-Doerr et al. (1997) “E toda tecnologia de proceso ou produto que lance mo, em pelo menos uma de suas etapas, da acdo de microrganismos, células animais ou vegetais, ou de substancias produzidas por estes agentes biolégicos, sendo caracterizada por sua multidisciplinaridade” Rehn & Reed (1993) “Conjunto de tecnologias habilitadoras (enabling technologies), que possuem em comum o uso de células ou moléculas biolégicas para aplicacées na produgao de bens e servicos, em dreas como sauide humana & animal, agricultura, energia e meio ambiente” Marx (1989) agropecuario Figura 1: Insercao da Biotecnologia em diferentes setores produtivos.Todos os microrganismos produzem uma variedade muito grande de enzimas intracelulares em pequenas quantidades, para a catdlise das suas reacdes metabélicas. As enzimas, também denominadas de biocatalisadores, sao catalisadores protéicos com caracteristicas particulares pela sua alta eficiéncia em condicées fisiolégicas e alta especificidade, sendo inclusive capazes de catalisar reagdes estereoespecificas. Este potencial catalitico ¢ utilizado industrialmente n&o sé nos cléssicos processos fermentativos, mas também em processos de biotransformagées microbianas para a catdlise de reacdes quimicas de dificil ocorréncia e de grande importancia na industria farmacéutica. Um exemplo tipico refere-se & producao de esterdides utilizando-se Rhizopus nigricans. O fungo é, inicialmente, cultivado em biorreatores em condigdes otimizadas para se atingir altas concentragées celulares. Finda a fase de crescimento celular, o substrato a ser transformado, a progesterona, é adicionado ao biorreator e, apés um periodo de jincubagéo determinado, 0 produto da biotransformacéo, a 11a hidroprogesterona, é extraido com solvente organico. Este composto pode ser subseqiientemente transformado, por via quimica, para a producdo industrial de um outro esterdide, a cortisona (Madigan et a/., 2000 e Atlas, 1997) Enquanto nas biotransformacdes os sistemas enzimaticos de interesse nao sao extraidos das células, a catdlise enzimética industrial usa enzimas microbianas excretadas ou extraidas de microrganismos e com diferentes graus de purificago. As enzimas microbianas excretadas sdo produzidas em maiores quantidades do que as intracelulares e tém a funco principal de degradar macromoléculas presentes no meio ambiente, como a celulose, o amido, a lignina e proteinas, para que seus componentes possam ser absorvidos como nutrientes pelos microrganismos. As enzimas sao utilizadas em muitos segmentos industriais, como o de alimentos e bebidas, de detergentes, téxtil, couro, celulose e papel, quimica fina, medicamentos e cosméticos e, ainda, em metodologia analitica e em biologia molecular. Amilases, glicose oxidase, pectinases, invertase, renina, naraginase, lipases, proteases, celulases e peroxidases sao os biocatalisadores mais utilizados (Atlas, 1997 e Bon & Pereira Jr., 1999). Enzimas sdo também empregadas como medicamento, como por exemplo, a asparaginase utilizada no tratamento de leucemia. 0 mercado mundial de biocatalisadores, atualmente avaliado, em US$ 1,5 bilhdes tem previsdes de crescimento continuado em resposta as demandas por processos industriais com menor impacto ambiental e menor consumo energético e também por produtos de melhor qualidade (Godfrey, 2003). © desenvolvimento da Biotecnologia tem importancia impar para o Brasil, devido ao seu baixo impacto ambiental, sendo possivel conciliar 0 desenvolvimento industrial com a preservacio de ecossistemas. Sabemos que o Brasil apresenta uma das maiores biodiversidades do planeta e que seu territério possui recursos hidricos correspondentes a 12% da agua doce do planeta, incluindo o Aqiifero Guarani, que € 0 maior do mundo. Séo esses os recursos naturais mais importantes para a humanidade a partir deste século, representando um ativo de valor incalculavel. Essas riquezas, patriménio da sociedade brasileira, devem ser preservadas da poluicéo ambiental provocada por praticas inadequadas de diferentes setores industriais e agro-industriais. 0 equilibrio natural dos ecossistemas, to antigo quanto a vida na Terra, pode ser considerado como uma importante area da Biotecnologia Microbiana. Os microrganismos habitam praticamente todos os ambientes terrestres, sendo 8transportados por correntes de ar para a atmosfera e de continente para continente. Esses seres microscépios também habitam todos os ambientes marinhos, das superficies aquaticas ao fundo dos oceanos. Por causa desta caracteristica de crescimento nos mais variados ambientes, os microrganismos, através de suas vias metabélicas intracelulares e de moléculas bioativas excretadas para o meio externo, atuam na manutencdo do ciclo biolégico de elementos quimicos, no controle populacional, na descontaminacao de ambientes aquaticos e terrestres e na disponibilizagao de nutrientes para diferentes formas de vida. Estas tarefas gigantescas, inestimdveis e insubstituiveis nao so facilmente perceptiveis, correndo o risco de nao serem adequadamente protegidas. Embora a acao antropogénica venha interferindo de forma negativa no modus operandi dos ecossistemas e, portanto, no seu equilibrio, as populagdes microbianas que habitam o nosso planeta continuam alicercando a manutengao da vida na Terra. © fantastico potencial metabélico envolvido na sintese e degradagao das mais variadas estruturas quimicas por bactérias, fungos, algas e protozodrios esta distribuido em microrganismos com caracteristicas fisiolégicas muitas vezes peculiares. As bactérias, por exemplo, so encontradas nos mais diferentes climas e microambientes do planeta, alguns considerados inéspitos. Bactérias halofilicas vivem em ambientes aquaticos com alto teor salino, como o Mar Morto, as termofilicas, em fontes termais, em temperaturas entre 80°C e 100°C e as barofilicas se adaptaram as enormes pressdes das profundezas do mar. Adicionalmente, algumas bactérias so parasitas de tecidos animais e vegetais e algumas vivem em consércio com outros microrganismos, plantas e animais. Biotecnologia de Bactérias Embora as bactérias sejam mais conhecidas como microrganismos patogénicos, a grande maioria é inofensiva e inclusive benéfica a outros seres vivos. Como exemplo, a tarefa fundamental da fixagao do nitrogénio atmosférico molecular é levada a efeito por bactérias dos géneros Rhizobium, Bradyrhizobium e Frankia, que viver em associacées simbidticas com plantas leguminosas, como © feijao e a soja. Estas bactérias, que sao encontradas no solo, infectam naturaimente plantas hospedeiras formando nédulos nas raizes onde proliferam Este mecanismo natural de infecco tem sido utilizado, hé quase cem anos, para aumentar a fertilidade do solo através da sua inoculagéo com bactérias fixadoras de nitrogénio produzidas industrialmente por processos fermentativos (Glazer & Nikaido, 1995) Sao também de grande importancia biotecnolégica cepas selvagens ou modificadas geneticamente de bactérias dos géneros Corynebacterium, Bacillus Microbacterium pela capacidade de excretar produtos do seu metabolismo primdrio, como aminodcidos. A constatacao de que Corynebacterium glutamicum era capaz de produzir grandes quantidades de dcido glutémico, quando crescida em glicose, reportada em 1957, resultou na selecdo e desenvolvimento de bactérias para a producdo de acido L-glutémico, L-arginina, L-isoleucina, L- histidina, L-leucina, L-lisina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-treonina, L- triptofano e L-tirosina, além de vitaminas e nucleotideos. Fermentagées com concentragées de L-tirosina e L-fenilalanina em torno de 25g/L esto descritas na literatura (Piepersberg, 1993). A produgdo anual de aminodcidos utilizados na industria de alimentos é estimada em 530 toneladas (Madigan et al., 2000)