Disciplina: Análises Saúde Toxicológicas Titulo da Aula: Determinação de Metemoglobina ou Metahemoglobina
INTRODUÇÃO: A molécula de hemoglobina (Hb) corresponde a um tetrâmero, formado por cadeias alfa, beta, gama ou delta. A forma de Hb mais comum nos adultos (HbA) é composto de duas cadeias alfa e de duas cadeias beta. Cada cadeia da Hb é constituída de um polipetídeo globina ligada a um grupo prostético heme, o qual consiste em um anel de protoporfirina IX complexado com um único átomo de ferro no estado ferroso (Fe2+). Assim, há quatro átomos de ferro em cada molécula de Hb. Cada átomo de ferro no estado ferroso pode se ligar reversivelmente a uma molécula de O2 somando um total de quatro moléculas de O2 transportadas por cada molécula de Hb . Quando o Fe2+ é oxidado a Fe3+ (estado ferrico), a hemoglobina torna-se incapaz de transportar o O aos tecidos causando, então, hipóxia. Nesta condição, a hemoglobina passa a 2
ser chamada de metemoglobina (MetHb)2 .
A MetHb é um pigmento hemoglobínico que pode ser de origem congênita ou adquirida, sendo esta a causa mais frequente e podendo ser provocada por medicamentos, alimentos e vários outros agentes químicos. As consequências decorrentes da MetHb elevada podem ser várias, sendo a principal a cianose refratária à oxigenioterapia , determinando um quadro de metemoglobinemia. As três principais causas que determinam o aumento de metemoglobina têm origens diferentes e se devem à: 1) deficiência de enzimas eritrocitárias específicas para as atividades redutoras da oxidação do ferro do grupo heme; 2) à indução tóxico-oxidativa da hemoglobina causada por compostos químicos oxidantes; 3) ao defeitos molecular da hemoglobina que causa contínua auto oxidação.
Princípio da técnica: Método baseado na detecção da cianometehemoglobina. O
aparecimento de cor avermelhada é proporcional a presença de hemoglobina livre. Os eritrócitos são lisados e o átomo de ferro +2 da hemoglobina livre é oxidado pelo ferricianeto de potássio em pH FRACAMENTE alcalino, formando metehemoglobina. A metehemoglobina é convertida a cianohemoglobina após reação com o cianeto de potássio. Dará uma cor vermelha.
OBJETIVO: Determinar os teores para se verificar se estão dentro das
normas da monitorização biológicas do Ministério do Trabalho
PROCEDIMENTO: 1. Transferir 3,0 mL da amostra de sangue hemolisada e já tamponada para um tubo de centrífuga, adicionar 1 gota de Triton X-100 e agitar até completa hemólise. Se necessário, centrifugar. 2. Transferir o sobrenadante, com o auxílio de pipeta Pasteur para outro tubo de ensaio pequeno. Deste tubo, transferir 2,4 mL do sobrenadante para uma cubeta ou tubo de ensaio pequeno ( I ) e 0,2 mL do sobrenadante para outra cubeta, esta contendo 2,2 mL de reativo ferricianeto-fosfato ( II ). 3. Efetuar as leituras das duas cubetas (AI e AII) em 632 nm, contra ar. 4. Adicionar 80 µL de solução de cianeto neutralizada às duas cubetas e, após 1 minuto, efetuar novamente a leitura das absorbâncias (AIII e A IV).
5. Calcular a % de MeHb na amostra, expressando em percentagem
de metemoglobina total, a partir da seguinte fórmula:
% MeHb = AI – AIII x 100
(AII – AIV) x 12 DADOS O valor de referência de metemoglobina é < 2,0% e o IBMP é igual a 5%, segundo a NR7.
MATERIAIS QUANTIDADE
Amostra de Sangue 6 mL
K3Fe(CN)6 5g
NaOH 0,5 M 7 mL
KH2PO4 0,5 M 10 mL
NaCN a 10% 1 mL
Ácido acético a 12%. 1 mL
Triton X-100 0,5 mL
Água Destilada 1L
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Espectrofotômetro 01
Cubeta para leitura no 01
espectrofotômetro
Béqueres 100 mL 03
Bageta de Filtro 01
Papel Universal pH 02 fitas
Pipeta Capacidade 5 mL 02
Pipeta Capcidade 10 mL 02
Pipeta Capacidade 1 mL 02
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de
Segurança.
Perguntas: 1. O que é metehemoglobina ou metahemoglobia? R: A MetHb é um pigmento hemoglobínico que pode ser de origem congênita ou adquirida, e quando o Ferro 2+ (estado ferroso) é oxidado a Ferro 3+, (estado ferrico), e a hemoglobina torna-se incapaz de transportar o O2 (oxigênio), ao tecidos, causando hipóxia, nesse momento se torna metehemoglobina. 2. O que é hemólise e dê exemplos de substâncias hemolíticas: principalmente medicamentos ou outras substâncias. R: Hemólise é destruição rápida dos glóbulos vermelhos, ou seja, o rompimento das membranas das hemácias. Os medicamentos são substancias que causam hemólise ex: antimaláricos, derivados da sulfa e nitrofurantoína, agentes químicos como venenos, (cianeto) entre outros. 3. Explique o significado da técnica para uma questão de monitoramento da metehemoglobina? Porque se usa essa técnica? R :O princípio da técnica é utilizar o método para detecção da cianometahemoglobina, ao utilizar todo o processo se houver o aparecimento da cor avermelhada é proporcional a presença de hemoglobina livre, ou seja, se a hemoblobina está livre pode está acontecendo a hipóxia, falta a oxigenação. 4. Qual é o significado do cálculo? R: É demonstrar a percentagem da metehemoglobina total, ou seja, utilizar o fator de correção para fazer a leitura real da metehemoglobina na amostra, nesse cálculo vai se extrair as substancias que não devem ser lidas no espectrofotômetro.
