Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Faculdade de Tecnologia
Departamento de Química e Ambiental
Laboratório de análise de águas

Ensaio Presuntivo-Métodos Tubos Múltiplos (Standard Methods 9221 B)

1-Utilizando 5 tubos para cada ponto amostrado e diluição 1:1 (meio 2X)

Materiais:
 5 tubos de ensaios rosqueáveis para cada ponto de coleta
 Tubos de Durham -O mesmo número de tubos de ensaio
 1 pipeta de 10mL para cada ponto de coleta (ou ponteira de 5 mL e pipeta automática de 5
mL)
 Becker para preparo do meio
Equipamentos:
 Auto clave
 estufa bacteriológica a 35,5oC – 36°C
Reagentes:

Caldo Lactosado

Tiossulfato de sódio (Na2S2O3) 1 mol.L-1

álcool etílico a 70%

Procedimento:
1) Preparo e Esterilização do caldo lactosado
 Preparar o caldo lactosado conforme determinação do fabricante (para diluição 1:1 e inóculo
de 10 mL ou mais) usar o dobro da massa usada para concentração simples (2X).
 Após o preparo, colocar 10 mL do caldo nos tubos de ensaio (para cada ponto de
amostragem).
 Inserir 1 tubo de Durham (invertido), fechar o tubo de ensaio e eliminar as bolhas de ar
contidas no tubo de Durham inclinando o tubo de ensaio.
 Autoclavar por 15 min a 121°C e 1 kgf.cm -2. Não deixar os tubos totalmente fechados ao
irem ao autoclave. Após esfriar, fechar totalmente os tubos de ensaio autoclavados.

2) Preparo do frasco de coleta e pipetas

 Colocar 2 gotas de tiossulfato de sódio (Na 2S2O3) 1 mol.L-1 apenas nos frasco(s) de coleta de
água clorada;
 Enrolar com papel os frascos der coleta, identificando-os; Só devem ser abertos no momento da
utilização.
 Enrolar com papel ou papel alumínio cada pipeta (ou ponteira) a ser utilizada (1 pipeta ou
ponteira para cada amostra coletada);
 Autoclavar os frascos de coleta e as pipetas de 10 mL /ponteiras por 15 min a 121°C e 1
kgf/cm2. (não fechar totalmente o frasco de coleta ao autoclavar). Ao esfriar, fechar totalmente
os frascos.

3) Coleta da(s) amostra(s)

3.1 Para coleta em torneira
Obs: A coleta de amostras para análise microbiológica deve ser realizada sempre antes da coleta de
qualquer outro tipo de análise. Isso evita a contaminação do local da amostragem com frascos não
estéreis.
  Lavar as mãos /higienizar com álcool 70/ usar luvas;
 Limpar a torneira com algodão embebido de álcool 70 (flambar a torneira);
 Abrir a torneira e deixar escorrer a água durante 1 ou 2 minutos;
 Remover a parte protetora do frasco e a tampa do frasco de coleta com cuidados de assepsia,
evitando a contaminação da parte interna da tampa pelos dedos ou outro material; Não
colocar a tampa no chão;
 Não tossir ou espirrar próximo do frasco de coleta;
 Coletar a amostra (cerca de 100 mL), deixando 1 ou 2 cm da boca do frasco para
homogeneização posterior;
 Fechar imediatamente o frasco;
 Identificar no frasco o ponto de coleta, hora e nome do coletor;
 Colocar o frasco da amostra na caixa de isopor com gelo; Se possível lacrar a caixa
 As amostras devem ser conservadas sob refrigeração até a chegada ao laboratório. O prazo
para análise é de 24 h (manter as amostras refrigeradas a 4º C).


3.2 Para coleta em mananciais superficiais (rios, lagos)

 Lavar as mãos /higienizar com álcool 70/ usar luvas;
 Remover a parte protetora do frasco e a tampa do frasco de coleta com cuidados de assepsia,
evitando a contaminação da parte interna da tampa pelos dedos ou outro material; Não
colocar a tampa no chão;
 Com uma das mãos segurar o frasco pela base,mergulhando-o rapidamente com a boca para
baixo, a cerca de 15 a 30 cm da superfície da água sempre que possível;
 Direcionar o frasco de modo que a boca fique em sentido contrário à corrente. Se o corpo
hídrico for estático criar uma corrente artificial através da movimentação do frasco
lentamente na direção horizontal (sempre para frente);
 Inclinar o frasco lentamente para cima para permitir a saída do ar e o enchimento do mesmo;
 Coletar a amostra, deixando um espaço dentro do frasco suficiente para homogeneização;
 Fechar imediatamente o frasco;
 Colocar a amostra na caixa de isopor (deve ser mantido em refrigeração até a chegada ao
laboratório);
 Prazo de 24 horas para análise.

4) Inoculação das amostras

 Primeiramente, higienizar a bancada que será utilizada com álcool iodado a 2% ou
álcool etílico 70%.
 Acender o bico de Bunsen e realizar a inoculação por trás da chama;
 Agitar (25 vezes) os frascos de coleta ou utilizar o mixer;
 Inocular em 5 tubos de ensaio contendo caldo lactosado e tubo de Durham invertido
(verificar se não tem bolha de ar), para cada ponto de coleta, 10 mL de amostra
(usando a pipeta de 10 mL estéril ou ponteira autoclavada) em cada um e agitar (25
vezes ou usar o mixer) o tubo após inoculado.
 Ao abrir e fechar cada tubo de ensaio com o caldo lactosado, flambar a boca desse
tubo na chama.

 Encubar em estufa bacteriológica por 24 ± 2h horas a 35 ± 0,5°C.Verificar se a
presença de bolha no tubo de Durham ou crescimento (turbidez característica), se
não há, reincubar por mais 24 horas e verificar ao final das 48 horas ± 3 horas.

 Resultados
 FASE PRESUNTIVA POSITIVO: há formação de gás e/ou turbidez intensa
característica => Realizar Fase CONFIRMATIVA (meio VB (COLIFORMES
TOTAIS) e meio EC (E.Col)

 FASE PRESUNTIVA NEGATIVA: não formação de bolhas de gás no tubo de

Durhan e/ou não presença de turbidez intensa característica

Esquema do procedimento para Fase presuntiva de Coliformes Totais e Coliformes Termotolerantes

– Eschericha Coli (E.C)

Ensaio Presuntivo
(Caldo lactosado)
à 35 ± 0,5oC – 48 horas

POSITIVO NEGATIVO
Ensaio Confirmativo

Fim da análise

(Caldo Verde brilhante) Escherichia Coli (E.C)

COLIFORMES TOTAIS (Caldo Verde E.C)
à 35 ± 0,5oC – 48 horas 44,5°± 0,2 oC – 24 horas

2-Utilizando 5 tubos para cada DILUIÇÃO: DILUIÇÕES 1:1 (10 mL meio 2X +

10 meio amostra), 1:10 (10 mL meio X + 1 mL amostra) e 1: 100 (10 mL meio X
+ 0,1 mL amostra)

Fazer o mesmo procedimento do 1, só que observando as diluições a serem realizadas.

Bibliografia
Standard Methods for the Examination of Water and WasteWater, APHA-AWWA-WPCF,
22ed. 2012.