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Contagem de Bactérias Heterotróficas) - Método Pour Plate (Methods Standard


9215 B)
1) Introdução

Além do controle de qualidade microbiológica realizado através de análise de coliformes é


fundamental importância que se mantenha sob controle a população bacteriana geral da água.
Densidades bacterianas elevadas podem representar um risco à saúde dos consumidores, pois embora a
maioria das bactérias da flora normal da água não seja considerada patogênica, alguns pode agir como
oportunistas.
Bactérias heterotróficas’ inclui todas as bactérias que usam nutrientes orgânicos para o
crescimento. Essas bactérias estão presentes em diversos tipos de ambientes, inclusive naturalmente na
água. A sua contagem fornece informações sobre a qualidade bacteriológica da água de uma forma
ampla. O teste realiza a detecção inespecífica de bactérias que utilizam nutrientes orgânicos, sejam de
origem fecal, componentes naturais da água ou resultantes da formação de biofilmes no sistema de
armazenamento e distribuição.

Para as bactérias heterotróficas representarem risco à saúde, devem estar presentes em grande
quantidade, aumentando a probabilidade de existirem bactérias patogênicas, que podem provocar
infecções (podendo atuar como patógenos secundários). Além disso, a presença dessas bactérias fora
do limite recomendável, pode indicar eventuais falhas no sistema de desinfecção e falta de limpeza e
higienização de reservatórios e caixas d’água, falta de higiene em tubulações ou em torneiras e
bebedouros.
Também altas densidades de bactérias afetam os resultados de análise de coliformes. Alguns
microrganismos quando presentes em numero elevados, poden impedir a detecção de coliformes, seja
devido a produção de fatores inibidores, seja por crescimento mais intenso.
Segundo a Portaria 2914 (anexo XX da Portaria de Consolidação nº 5, 28 de setembro de 2017),
a determinação de bactérias heterotróficas deve ser realizada como um dos parâmetros de potabilidade
para avaliar a integridade do sistema de distribuição (reservatório e rede). Essa Portaria recomenda que
a contagem dessas bactérias não ultrapasse 500 UFC/mL de amostra.
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2) Materiais:
 Placa de Petri – estéril (Contar as placas de acordo com o número de pontos amostrados,
duplicatas ou triplicatas (para cara diluição);
 Ponteiras de 1 mL estéreis (quantidade de acordo com o número de diluições e número de
pontos amostrados) e Pipeta automática de 1 mL;
 Bico de Bunsen ou lamparina a álcool;
 Pipetas de 10 mL estéreis;
 Amostra(s) devidamente coletada(s) (com 2 gotas de tiossulfato a 10% para amostras cloradas)
em frascos autoclavados limpos e secos.
3) Equipamentos:
 Contador de colônias;
 Estufa bacteriológica a 35 ± 0,5 °C;
 Estufa para secar as placas de Petri autoclavadas (200 oC);
 Banho-maria para manter os tubos rosqueáveis com o meio Agar count plate fundidos em 44-46
o
C.
4) Reagentes:
 Meio Plate Count Agar;
 NaCl (para preparar água das diluições das amostras, caso seja necessário).
 Fosfato dihirogenio de potássio (KH2PO4) e de MgCl2.6H2O para preparar água das diluições
das amostras, caso seja necessário;
 NaOH 1 M. para ajuste de pH.
5) Procedimento

5.1-Preparo e Esterilização do Plate Count Agar


 Preparar o Plate Count Agar conforme determinação do fabricante: dissolver 23,5 g/1000 mL
em água destilada fria (deixar em repouso durante 5 minutos) e aquecer até completa dissolução
agitando com bastão de vidro, não levar à ebulição. O volume deve necessário para ser
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colocado em cada placa de Petri, considerando ou não diluição e triplicata em cada ponto ou em
cada diluição e brancos;
 Se necessário ajustar o pH para 7,1 ± 0,2 com NaOH 1 M;
 Distribuir 12 mL do caldo preparado em tubos rosqueáveis;
 Autoclavar os tubos por 15 min a 121 oC e 1 kgf/cm2;
 Deixar esfriar e guardar na geladeira, caso utilize no outro dia.
Obs: Esse meio, depois de frio, se solidifica. Fundir em banho-maria antes de usá-lo.
Devido à variedade de meios de culturas existentes no mercado, seguir sempre as instruções do
fabricante, que vêm estampadas no rótulo do frasco.

5.2-Preparo e Esterilização da água de diluição (caso faça diluições da amostra)


A-Usando solução salina
Preparar solução salina de 0,9 % (m/m) e colocar 9 mL nos tubos rosqueáveis (quantidade de
tubos acordo com o numero de diluições e numero de pontos analisados) e autoclavar por 15 min a 121
o
C e 1 kgf/cm2. Guardar na geladeira, caso utilize no outro dia.

B-Usando água tamponada para água de diluição (Manual Funasa, 4ª ed)


a-solução tampão de fosfato:
Dissolver 34,0 g de fosfato dihirogenio de potássio (KH 2PO4) (fosfato de potássio monobásico) em 500
mL de água destilada. Ajuste o pH para 7,2 ± 0,5 com solução de NaOH 1 M. Dilua a 1 L de água
destilada. Manter refrigerado. Discartar se estiver turva.
b-Solução de cloreto de magnésio:
Pesar 81,1 g de MgCl2.6H2O e dissolver em 1 L de água destilada. Guardar sob refrigeração e discartar
se estiver turva.
A água tamponada é obtida juntando 1,25 mL da soluçãao a e 5,0 mL da solução b e dilua para
1L usando água destilada. O pH da solução tamponada deve ser 7,2 ± 0,1 (O pH mudará com o tempo).
Deve ser estocada sob refrigeração depois de aberta e discarte se ficar turva. Utilizar em até 6 meses.
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Distribuir a solução tamponada em tubos de ensaio em quantidade que, após autoclavação, assegurem
um volume de 9 ± 0,2 mL e autoclavar.

5.3-Procedimento

5.3.1-Realização das diluições (caso seja necessário)


 Limpar a bancada usando álcool a 70% e ligar bico de Bunsen;
 Pegar 1 mL (com a pipeta automática e usando ponteira estéril) da amostra (devidamente
homogeneizada, pelo menos 25 vezes) e transferir para o tubo contendo 9 mL de ÁGUA
DE DILUIÇÃO, essa é a diluição 1/10. Transferir 1 mL da diluição 1/10 e adicionar so
tubo contendo 9 mL de ÁGUA DE DILUIÇÃO, essa é a diluição 1/100; Fazer esse
procedimento para as outras diluições, caso necessário.
 Homogeneizar pelo menos 25 vezes a diluição preparada ou utilizar um vórtex. Flambar
a boca do tubo de ensaio após abrir e antes de fechar.
 Na contagem das colônias, deve-se ter resultados de diluições preparadas de modo que
se obtenha de 30 UFC a 300 UFC colônias por placa de Petri. O objetivo é ter ao menos
uma diluição de modo que o número de colônias a serem contadas estejam dentro desses
limites;

5.3.2- Método Pour Plate


 Fundir os tubos com Ágar e manter a 44-46 oC em banho-maria até a sua utilização;
 Limpar a bancada usando álcool a 70% e ligar bico de Bunsen;
 Iniciar a análise o mais rápido possível após a coleta da amostra para minimizar
mudanças na população microbiana. Tempo máximo recomendado é de 8 horas entre a
coleta e análise, mantendo a amostra refrigerada, abaixo de 4°C, sem congelar. Tempo
máximo entre coleta e análise não deve exceder 24 horas;
 Marcar cada placa de Petri com o número da amostra, diluição, data e alguma outra
informação importante. Preparar ao menos 3 triplicatas para cada diluição utilizada,
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para cada amostra;;


 Agitar a amostra pelo menos 25 vezes ou usar o vórtex;
 Próximo a chama do bico de Bunsen, transferir com pipeta estéril (ou ponteira estéril) 1
mL da amostra (ou da amostra após passar pela primeira diluição) para uma placa de
Petri, previamente esterilizada e seca, entreaberta e em seguida, com a placa entreaberta
adicionar o meio de cultura, previamente fundido e estabilizado em banho-maria a 44-
46°C, contido no tubo de ensaio rosqueável (flambar após abrí-lo).
 Homogeneizar o conteúdo da placa em movimentos circulares moderados em forma de
infinito, em torno de 10 vezes consecutivas;
 Repetir para as replicatas ou diluições;
 Quando o meio de culturo se solidificar, incubar a placa em posição invertida (meio para
cima) em estufa bacteriológica a 35 ± 0,5 °C por 48 horas ± 3 horas;
 No final da incubação, realizar a contagem das colônias (contar placas com diluição que
contenha entre 30 à 300 colônias) com o auxílio contador de colônias; Se for guardar,
manter entre 5 à 10°C por no máximo 24 horas; Se não houver placa com contagem
entre 30 e 300 colônias e uma ou mais placas tem mais que 300 colônias, contar a placa
com a contagem mais próxima de 300 e reportar como valor estimado de UFC/mL. Se
nenhuma placa de todas as diluições de uma amostra não apresentarem colônias, reportar
como <1 UFC dividido pelo maior volume de amostra usado;
 Os resultados são expressos como numero de colônias de bactérias/mL ou Unidades
Formadoras de Colônias (UFC/mL de amostra);
 Limitar o número de amostras a serem submetidas ao procedimento de Pour plate em
uma série de modo que não mais que 20 minutos (preferencialmente 10 minutos) seja
gasto entre a diluição da primeira amostra e o último emplacamento.
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6)Bibliografia:
 Standard Methods For the Examination of Water and Wastewater. 22 edition. APHA,
AWWA,WEF.
 Manual.Prático de Análise de àguas -4ª edição. Funasa-Fundação Nacional de Saúde.

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