LIVRO - Produção de Biomassa e Coprodutos

Esta publicação, Microalgas de Águas Continentais: Potencialidades e Desafios do
Cultivo, é o segundo volume de um conjunto de três, que foram escritos como parte
das atividades do Projeto Microalgas, desenvolvido com o objetivo de estudar as
2 MICROALGAS DE ÁGUAS CONTINENTAIS
VOLUME 2
microalgas como fonte alternativa de energia e de coprodutos de valor agregado

com possibilidades de aplicações biotecnológicas.
Nos capítulos deste volume são apresentadas informações quantitativas sobre
PRODUÇÃO DE
trabalhos científicos, revisões de literatura e publicações que tratam do tema
microalgas. Além disso, é apresentado um roteiro para a realização de buscas
nas principais bases de dados mundiais. Na sequência, é discutido o biodiesel
produzido a partir das microalgas, as técnicas de cultivo destes microrganismos
BIOMASSA E
para essa finalidade e as exigências climáticas para o cultivo massal em diferentes
regiões do Estado do Paraná. Também é considerado o aproveitamento de resíduos
agroindustriais paro o cultivo de microalgas, como forma de destinação desses
resíduos. Fotobiorreatores abertos e fechados para o cultivo massal são abordados
COPRODUTOS
e os principais fatores bióticos e abióticos que podem influir na eficiência do
cultivo são descritos. Também é apresentado um estudo de caso com dados reais
PRODUÇÃO DE BIOMASSA E COPRODUTOS

MICROALGAS DE ÁGUAS CONTINENTAIS
de um fotobiorreator aberto. Uma coleção de microalgas foi montada durante o
Diva Souza Andrade e Arnaldo Colozzi Filho | Editores

desenvolvimento do projeto e detalhes sobre a amostragem, o isolamento das
microalgas para obtenção de culturas puras, a caracterização morfológica dos
isolados obtidos, a preservação dos cultivos ex situ e a determinação da viabilidade
celular dos isolados obtidos e depositados na coleção são apresentados. Técnicas
de biologia molecular foram utilizadas para a caracterização das microalgas
e os resultados do sequenciamento completo de microalgas e dados sobre o
levantamento dos gêneros de microalgas que ocorrem nas águas continentais do
Estado do Paraná são discutidos. Também são abordados, a partir de dados de
pesquisa, temas relacionados à composição lipídica das microalgas, a produção e
concentração de proteínas, pigmentos, clorofila e outras moléculas de importância
bioquímica, com relações entre as condições de cultivo e a produção dessas
DIVA SOUZA ANDRADE
moléculas. Por fim, são fornecidas informações sobre a possibilidade de utilização
das cianobactérias, microalgas fixadoras de nitrogênio atmosférico, para a
ARNALDO COLOZZI FILHO
inoculação de leguminosas e gramíneas. EDITORES
Essas informações abrem novas possibilidades de utilização de inoculantes
microbianos nas culturas agrícolas no Brasil.
ISBN 858818449-4
9 788588 184497
Diva Souza Andrade
Arnaldo Colozzi Filho
Editores
Capa 2 - Alisson.indd 1 15/08/2014 16:46:08

CARLOS ALBERTO RICHA
Governador do Estado do Paraná
NORBERTO ANACLETO ORTIGARA

Secretário de Estado da Agricultura
e do Abastecimento
INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ - IAPAR
FLORINDO DALBERTO
Diretor-Presidente
ARMANDO ANDROCIOLI FILHO

Diretor de Pesquisa
ALTAIR SEBASTIÃO DORIGO

Diretor de Administração e Finanças
ADELAR ANTONIO MOTTER

Diretor de Gestão de Pessoas
MARCOS VALENTIN FERREIRA MARTINS

Diretor de Inovação e Transferência de Tecnologia
Capa 2 - Alisson.indd 2 15/08/2014 16:46:09

MICROALGAS DE ÁGUAS CONTINENTAIS
VOLUME 2
PRODUÇÃO DE
BIOMASSA E
COPRODUTOS
Diva Souza Andrade
Editores
INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ

Londrina
2014
5 Livro Microalgas V2.indb 1 30/07/2014 09:46:55

INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ
Editor ExEcutivo
Álisson Néri
rEvisão
diagramação
imprEssão
Midiograf
distribuição
Área de Difusão de Tecnologia - ADT
adt@iapar.br | (43) 3376-2373
tiragEm: 1.000 exemplares
Trabalho realizado em parceria com a Fundação de Apoio
à Pesquisa e ao Desenvolvimento do Agronegócio (FAPEAGRO).
Todos os direitos reservados.
É permitida a reprodução parcial, desde
que citada a fonte.
É proibida a reprodução total desta obra.
Esta publicação, MICROALGAS DE ÁGUAS CONTINENTAIS: PRODUÇÃO DE BIO-

MASSA E COPRODUTOS é o segundo volume de um conjunto de três, que foram escritas
como parte das atividades do “Projeto Microalgas”. Este projeto de pesquisa foi desenvolvi-
do através uma parceria firmada entre o Instituto Agronômico do Paraná-IAPAR, a Empresa
Paranaense de Energia Elétrica – COPEL /Geração de Energia e a Fundação de Apoio a
Pesquisa e ao Agronegócio – FAPEAGRO, durante os anos de 1989 a 2014, com o objetivo
de estudar as microalgas como fonte alternativa de energia e de coprodutos de valor agrega-
do com possibilidades de aplicações biotecnológicas. As publicações apresentam dados de
pesquisa obtidos durante o desenvolvimento do projeto, analisados à luz das informações
existentes na literatura. As opiniões expressas nesta publicação são de seus autores e não
necessariamente refletem aquelas das instituições às quais os mesmos são filiados.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
M626 Microalgas de águas continentais / editores: Diva Souza

Andrade, Arnaldo Colozzi Filho. – Londrina : IAPAR, 2014.
3v. : il. ; 24 cm.
Inclui bibliografia.
Conteúdo: v.1. Potencialidades e desafios do cultivo - v.2.
Produção de biomassa e coprodutos - v.3. Coleção IPR de
microalgas.
ISBN 978-85-8818-449-7 (obra compl.)
1. Microalga – Cultivo. 2. Microalga – Biotecnologia. I.

Andrade, Diva Souza. II. Colozzi Filho, Arnaldo.
CDU 582.26
Impresso no Brasil / Printed in Brazil

2014

Editores
Diva Souza Andrade
Engenheira Agrônoma, doutora em Ciências Biológicas
Pesquisadora, Instituto Agronômico do Paraná
Londrina, Paraná, Brasil
diva@iapar.br

Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia
Pesquisador, Instituto Agronômico do Paraná
acolozzi@iapar.br

Autores
Adriano Rausch Souto
Engenheiro Sanitário, doutor em Agronomia
adriano@iapar.br
Admilson Lopes Vieira

Engenheiro Químico, doutor em Engenharia Química
Professor, Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Campus
Londrina
lopesvieira@utfpr.edu.br
Alexandra Scherer
Engenheira Agrônoma, doutora em Agronomia
Professora, Universidade Norte do Paraná
ascherer2000@gmail.com
Antônio Costa
Engenheiro Agrônomo, doutor em Agronomia
antcosta@iapar.br

acolozzi@iapar.br

Cássio Egidio Cavenaghi Prete
Engenheiro Agrônomo, doutor em Fitotecnia
Professor, Universidade Estadual de Londrina
cassio@uel.br
Diva Souza Andrade

Engenheira Agrônoma, doutora em Ciências Biológicas
diva@iapar.br
Elisângela Andrade Angelo

Bióloga, mestre em Ciências de Alimentos
Companhia Paranaense de Energia
Curitiba, Paraná, Brasil
elisangela.angelo@copel.com
Fernanda de Almeida Fin de Lima

Química, mestre em Engenharia Química
fer_fin@hotmail.com
Freddy Zambrano Gavilanes

Engenheiro Agrônomo
Portoviejo, Manabí, Equador
freddyzg_86@hotmail.com
Gabriela da Silva Machineski

Engenheira Agrônoma
gabymachine@yahoo.com.br

Gisele Milani Lovato
Bióloga, mestre em Microbiologia
gimilanibio@yahoo.com.br
Graziela Moraes de Cesare Barbosa

Engenheira Agrícola, doutora em Agronomia
graziela_barbosa@iapar.br
Helder Rodrigues da Silva

Biólogo, mestre em Bioenergia
heldersrodrigues@hotmail.com
Iara Cintra de Arruda Gatti

Química, doutora em Agronomia
Professora, Universidade Norte do Paraná
iaracintra@gmail.com
João Henrique Caviglione

caviglione@iapar.br
Juscélio Donizete Cardoso

Farmacêutico bioquímico, doutor em Microbiologia
Professor colaborador, Universidades Federal da Paraíba
João Pessoa, Paraíba, Brasil
juscelio.cardoso@gmail.com

Kelly Campos Guerra Pinheiro de Goes Olivieri
Bióloga, mestre em Biotecnologia
k.goes@yahoo.com.br
Krisle da Silva
Engenheira Agrônoma, doutora em Microbiologia Agrícola
Pesquisadora, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Boa Vista, Roraima, Brasil
krisle.silva@embrapa.br
Lisandra Ferreira de Lima

Engenheira Química, doutora em Engenharia Química
Professora, Universidade Tecnológica Federal do Paraná – Campus
Londrina
lisandra@utfpr.edu.br
Lucas Alves Maroubo

Engenheiro Ambiental
lucasmaroubo@hotmail.com
Maria Aparecida de Matos

Química, mestre em Química dos Recursos Naturais
Analista em Ciência e Tecnologia, Instituto Agronômico do Paraná
mariamatos@iapar.br
Maria Elisabeth da Costa Vasconcellos

Engenheira Agrônoma, mestre em Estatística e Experimentação
Agronômica
Analista em Ciência e Tecnologia, Instituto Agronômico do Paraná
bethvasc@iapar.br

Michele Regina Lopes da Silva
Bióloga, doutora em Agronomia
michele@iapar.br
Patrícia Cristina Gomes

Bióloga, doutora em Zootecnia
patriciacristinagomes@gmail.com
Rafael Bruno Guayato Nomura

Farmacêutico bioquímico
rafaelguayato@gmail.com

Prefácio
Coleção
Microalgas de Águas Continentais
É
nosso dever preservar o meio ambiente para as
futuras gerações, um compromisso que afeta
praticamente todas as áreas da atividade hu-
mana e, em particular, leva à busca de alternativas
renováveis de energia para a promoção do desenvol-
vimento econômico e social.
Com essa preocupação, Instituto Agronômico do
Paraná (IAPAR), Companhia Paranaense de Energia
Elétrica (COPEL) e Fundação de Apoio à Pesquisa e
ao Desenvolvimento do Agronegócio (FAPEAGRO)
iniciaram o PROJETO MICROALGAS, em 2009, com
o objetivo de investigar o potencial desses microrga-
nismos como alternativa energética.
A dedicada equipe avançou na coleta, classifica-
ção e identificação, cultivo em diferentes meios de
cultura e chegou a definir parâmetros para avaliar a
quantidade e qualidade do material graxo e dos co-
produtos que possam vir a ser de interesse tecnológi-
co e comercial.
Como resultado, além do fortalecimento da pes-
quisa em energias renováveis, chegou-se a uma vas-
ta diversidade de informações úteis à comunidade
científica e ao desenvolvimento da matriz energéti-
ca brasileira e mundial, compiladas em três volumes

(dois técnicos e um catálogo da coleção de microal-
gas), que são um marco para as entidades envolvidas
e para toda a sociedade paranaense.
Florindo Dalberto
Diretor-Presidente do IAPAR

Prefácio
Volume II
Produção de Biomassa e Coprodutos
A
ocorrência de microalgas em diversos ambien-
tes, principalmente em ambientes aquáticos
marinhos e continentais confere a esse grupo
de microrganismos uma imensa versatilidade metabó-
lica. Sua participação em diversos processos de impor-
tância ecológica é bastante conhecida, sendo destacado
o seu papel na realização de fotossíntese e fixação do
CO2, contribuindo não apenas para a disponibilidade de
oxigênio para a respiração de quase todos os seres vi-
vos do planeta, como também para a redução dos riscos
apresentados pelos gases do efeito estufa. Além disso,
algumas microalgas possuem a capacidade de fixar o ni-
trogênio atmosférico em vida livre ou em associações, o
que as coloca numa posição de destaque como micror-
ganismos que participam nos dois processos responsá-
veis pela manutenção da vida em nosso planeta.
Além de sua importância ecológica, muitas microal-
gas são capazes de produzir quantidades significativas
de biomassa que pode ser utilizada como fertilizantes,
enriquecendo os solos e outros ambientes, bem como
apresentam facetas metabólicas como a produção de
pigmentos e lipídeos em quantidades que as tornam po-
tenciais candidatas à utilização em programas de gera-
ção de energia, através da produção de biocombustíveis.
Mesmo com todas essas qualidades, a explora-

ção comercial e tecnológica das microalgas no Brasil é
praticamente inexistente, o que pode ser devido à es-
cassez de estudos e informações sobre o potencial de
aproveitamento econômico de suas capacidades, ou à
indisponibilidade de técnicas adequadas para seu culti-
vo e utilização industrial. Nesse sentido, as informações
contidas nos dois volumes desta obra significam uma
contribuição inestimável a pesquisadores, professores
e indústrias, podendo proporcionar ferramentas para
estudos aplicados e para o desenvolvimento de méto-
dos e técnicas que levem ao aproveitamento, em larga
escala, das microalgas no cenário nacional.
Nos dois capítulos iniciais deste volume, o leitor
obterá informações sobre como realizar levantamentos
bibliográficos, revisões de literatura e busca de publica-
ções que ajudem a nortear programas de pesquisa ou
desenvolvimento e inovação tecnológica voltados para
a utilização prática de microalgas.
No terceiro capítulo o leitor é apresentado à capa-
cidade de produção de biodiesel pelas microalgas. In-
formações sobre o processo produtivo em si, bem como
técnicas de cultivo das microalgas com essa finalidade,
processamento da biomassa, extração e purificação do
óleo e produção do biodiesel de microalgas são apre-
sentadas de maneira clara e didática, constituindo-se
não apenas em uma grande fonte de informação, como
também numa leitura aprazível sobre um tema pouco
conhecido.
O capítulo seguinte aborda, de maneira clara e ob-
jetiva, as exigências climáticas das principais espécies
de microalgas com potencial de utilização para a pro-
dução de biodiesel em relação às condições de cultivo.

São apresentados, ainda, resultados de um minucioso
estudo do clima do Estado do Paraná quanto à aptidão
para o cultivo massal de microalgas, facilitando a deci-
são em relação à forma mais adequada de cultivo. Uma
vasta coleção de mapas torna a visualização das carac-
terísticas climáticas do Estado bastante objetiva.
A agroindústria brasileira vem tentando, ao máxi-
mo, reduzir a produção de resíduos, mas muitas ativi-
dades ainda geram quantidades consideráveis de ma-
teriais residuais que, muitas vezes, são descartados no
meio ambiente ou acumulam-se por longos períodos
em depósitos sem que tenham uma destinação adequa-
da. No quinto capítulo é considerado o aproveitamento
de resíduos agroindustriais no cultivo de microalgas
destinadas à produção de biodiesel. A caracterização
físico-química desses resíduos e informações sobre a
ocorrência e cultivo de microalgas nesses materiais são
apresentadas, contribuindo para o aumento da eficiên-
cia das cadeias produtivas da agroindústria brasileira,
com uma destinação mais adequada e racional de seus
resíduos.
O sexto capítulo aborda aspectos relacionados ao
cultivo de microalgas em biorreatores de bancada. São
elucidados assuntos relacionados à influência de fato-
res abióticos como luminosidade e fotoperíodo, pH do
meio de cultivo e fontes de nitrogênio sobre a produção
de biomassa de microalgas. Essas informações são de
grande utilidade na hora de optar por um determinado
tipo de biorreator e pela composição do meio de cultivo,
já que a relação entre esses fatores e a qualidade das mi-
croalgas obtidas é apresentada e seus impactos sobre a
produção de proteínas são discutidos.

O sétimo capítulo deste livro considera as possibi-
lidades de utilização dos fotobiorreatores de bancada e
no cultivo massal de microalgas em sistemas abertos no
Estado do Paraná. Aqui, detalhes sobre os componen-
tes e tipos de cultivo massal, meios de cultivo, avaliação
do crescimento e da produção de biomassa e processa-
mento da biomassa de algas são apresentados. Um es-
tudo de caso do norte do Estado do Paraná apresenta
dados reais em relação à escolha e preparo da área para
cultivo, bem como à construção dos fotobiorreatores
abertos. Finalmente, são apresentados dados sobre a
validação de sistemas de cultivo de duas espécies de mi-
croalgas para a produção de biodiesel estabelecidos no
norte do Estado do Paraná.
No oitavo capítulo desta obra o leitor é apresenta-
do a uma série de informações quanto a métodos rela-
cionados ao estabelecimento da Coleção IPR de micro-
algas. São fornecidos detalhes sobre a amostragem, o
isolamento das microalgas para obtenção de culturas
puras, a caracterização morfológica dos isolados obti-
dos, a preservação dos cultivos ex situ e sobre a deter-
minação da viabilidade celular dos isolados obtidos e
depositados na coleção. Ao final, é abordado o processo
de registro e depósito dos espécimes para o estabeleci-
mento da Coleção IPR de microalgas. Essas informações
podem servir de base para trabalhos semelhantes que
venham a ser desenvolvidos por outras instituições em
outras regiões do País.
O capítulo seguinte aborda a utilização de técnicas
de biologia molecular para a caracterização das micro-
algas. São apresentadas informações sobre a utilização
de técnicas de PCR e RFLP e sequenciamento de genes

específicos para a caracterização dos isolados deposi-
tados na Coleção IPR. Também são apresentados re-
sultados do sequenciamento completo de microalgas e
dados sobre o levantamento dos gêneros de microalgas
que ocorrem nas águas continentais do Estado do Pa-
raná. A associação de técnicas básicas, apresentadas no
capítulo anterior, com as modernas ferramentas de bio-
logia molecular apresentadas neste capítulo torna mais
precisa a caracterização e identificação das microalgas.
O décimo capítulo aborda assuntos relacionados
à composição lipídica das microalgas que, por sua vez,
está relacionada à capacidade de produção e às proprie-
dades do biodiesel de microalgas obtido. O leitor encon-
trará, ainda, informações referentes às microalgas (Cya-
nophyta e Chlorophyta), pertencentes à Coleção IPR, no
que diz respeito à sua composição lipídica. Essas infor-
mações podem ser de grande relevância no momento
de escolher microalgas dessa coleção para determina-
dos tipos de cultivo, visando à produção de proteínas
ou de biodiesel.
No capítulo seguinte são apresentados resultados
de análises bioquímicas das microalgas de águas conti-
nentais. O leitor encontrará informações sobre a produ-
ção e concentração de proteínas, pigmentos, clorofila e
outras moléculas de importância bioquímica pelas mi-
croalgas constantes da Coleção IPR. São apresentados,
ainda, resultados sobre a relação entre as condições de
cultivo e a produção dessas moléculas, que podem auxi-
liar na manipulação dos cultivos com base no fim a que
se destinam, seja para a produção de biomassa, biodie-
sel, proteínas ou pigmentos de importância industrial.
No décimo segundo capítulo são fornecidas infor-

mações sobre a possibilidade de utilização das ciano-
bactérias, microalgas fixadoras de nitrogênio atmos-
férico, em inoculação de cultivos de leguminosas e
gramíneas. Nos dados apresentados podemos observar
que esses microrganismos atuam como promotores do
crescimento de culturas como o milho e o trigo, além
de interagirem de forma positiva com rizóbios utiliza-
dos na inoculação de leguminosas. Essas informações
abrem uma nova avenida de possibilidades de utiliza-
ção de inoculantes microbianos nas culturas agrícolas
no Brasil.
É gratificante descobrir que, em um espaço de
tempo relativamente curto, o cenário brasileiro saiu da
quase total ausência de informações sobre o potencial
das microalgas em diferentes aplicações, bem como
sobre técnicas para seu cultivo, manejo e demais
aspectos relacionados à maximização de sua utilização.
O potencial de emprego desses microrganismos para
a produção de biodiesel, sobretudo nos dias atuais,
quando cresce a conscientização sobre a importância
de fontes alternativas para a obtenção de combustíveis
“limpos”, merece mais destaque e atenção por parte dos
segmentos de pesquisa, desenvolvimento e inovação
tecnológica. Para o setor industrial de inoculantes,
abre-se uma possibilidade a mais, capaz de ajudar a
otimizar a utilização das fábricas, relativamente ociosas
em períodos de entressafra.
A possibilidade de cultivar microalgas sem que seja
necessário utilizar áreas destinadas à agricultura volta-
da para produção de alimentos torna esses microrga-
nismos excelentes candidatos para a produção de bio-
diesel em comparação a outras fontes como mamona,

dendê e outras culturas que representariam a incorpo-
ração de novas áreas para cultivo ou a redução de áreas
destinadas a culturas alimentícias. Esta obra represen-
ta um avanço importantíssimo para as futuras gerações,
oferecendo informações que podem contribuir para o
aperfeiçoamento da matriz energética de nosso País,
sem causar mais impactos negativos ao meio ambiente.
Ricardo Silva Araujo, Ph.D.

Diretor de Qualidade da Total Biotecnologia
Indústria e Comércio S/A

Sumário
PARTE 1
ESTADO DA ARTE SOBRE O CULTIVO DE MICROALGAS ......... 33
CAPÍTULO 1
ESTRATÉGIAS DE BUSCA
DE ARTIGOS CIENTÍFICOS
COM ENFOQUE EM MICROALGAS PARA BIOENERGIA .......... 35
Introdução ................................................................. 37
1.1 Plataformas de Dados Bibliográficos Online ................ 39
1.2 Metodologia de Busca .............................................. 41

1.3 Metodologia de Busca no SCOPUS .............................. 41
1.4 Busca Utilizando o Termo Microalgae ......................... 42
1.5 Busca Refinada ....................................................... 47
1.6 Busca Utilizando o Termo Microalgae and Biofuel* ...... 52

Considerações Finais .................................................... 57
Referências ................................................................ 58

CAPÍTULO 2
MINERAÇÃO TEXTUAL DE ARTIGOS SOBRE O CULTIVO

HETEROTRÓFICO DE MICROALGAS ................................... 59
Introdução ................................................................. 61
2.1 Mineração Textual .................................................. 62
2.2 Banco de Dados de Artigos Científicos ........................ 64
2.3 Publicações Sobre Cultivo Heterotrófico de Microalgas . 66

2.3.1 Evolução temporal ......................................................... 67
2.3.2. Localização das publicações ..................................... 67
2.3.3 Principais institutos e pesquisadores ...................... 70
2.3.4 Principais categorias de revistas ............................... 74
2.3.5 Principais palavras-chave ............................................ 77
2.3.6 Principais artigos ............................................................ 80
Referências ................................................................ 85

CAPÍTULO 3
VANTAGENS E DESAFIOS DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL

DE MICROALGAS ........................................................... 89
Introdução ................................................................. 91
3.1 Processo de Produção de Biodiesel a partir
de Microalgas ......................................................... 95
3.1.1 Seleção de local e da microalga ................................. 96
3.1.2 Técnicas de cultivo.......................................................... 97
3.3 Cultivo de Microalgas .............................................. 103
3.3.1 Meios de cultivo .............................................................. 116
3.3.2 Colheita da biomassa microalgal .............................. 122
3.3.3 Sedimentação por gravidade ..................................... 123
3.3.4 Floculação e coagulação ............................................. 127
3.3.5 Centrifugação .................................................................. 134
3.3.6 Flotação ............................................................................. 140
3.3.7 Filtração .............................................................................. 141
3.4 Processamento da Biomassa ..................................... 143
3.5 Extração de Óleo (Ruptura Celular e
Extração dos Lipídios) ............................................. 145
3.6 Produção de Biodiesel ............................................. 153
Referências ................................................................ 161

PARTE 2
DESAFIOS DE CULTIVO DE MICROALGAS PARA

PRODUÇÃO DE BIOMASSA .............................................. 173
CAPÍTULO 4
POTENCIAL CLIMÁTICO PARA O CULTIVO DE MICROALGAS

EM SISTEMAS ABERTOS NO ESTADO DO PARANÁ ............... 175
Introdução ................................................................. 177
4.1 Exigências Climáticas para a Produção Massal de
Microalgas ................................................................. 178
4.2 Caracterização Climática (Temperatura e PAR) do Paraná
183
4.3 Temperatura do Ar no Paraná ................................... 184
4.4 Radiação Fotossinteticamente Ativa (PAR) ................. 188
Referências ................................................................ 198

CAPÍTULO 5
POTENCIALIDADES E LIMITAÇÕES DO USO DE RESÍDUOS

AGROINDUSTRIAIS NO CULTIVO DE MICROALGAS PARA
PRODUÇÃO DE BIODIESEL .............................................. 203
Introdução ................................................................. 205
5.1 Caracterização Físico-Química dos Resíduos
como Meio de Cultura para Microalgas ....................... 207
5.2 Ocorrência de Microalgas em Resíduos Agroindustriais . 217

5.3 Cultivos de Microalgas em Resíduos Agroindustriais ..... 225
Referências ................................................................ 239
CAPÍTULO 6
CULTIVO DE MICROALGAS EM FOTOBIORREATORES DE

BANCADA: FATORES ABIÓTICOS ...................................... 243
Introdução ................................................................. 245
6.1 Efeito do Fotoperíodo no Cultivo de Microalgas ........... 246
6.2 Cultivo de Microalgas em Fotobiorreator
de Polietileno ........................................................ 252
6.3 Meios de Cultivo: pH e Concentração
de Nitrato de Sódio ................................................ 254

6.3.1 Preparo do inóculo de ambiente de cultivo ......... 255
6.4 Densidade Ótica e Teor de Proteína na
Biomassa de Microalgas .......................................... 258
6.5 Biomassa de Microalga em Função do pH
e Nitrato de Sódio .................................................. 263
Referências ................................................................ 266
CAPÍTULO 7
CULTIVO DE MICROALGAS EM FOTOBIORREATORES FECHADOS

E EM SISTEMAS ABERTOS ............................................... 269
Introdução ................................................................. 271
7.1 Classificação e Componentes para Produção
Massal de Microalgas em Sistemas Fechados e Abertos . 274
7.2 Tipos e os Métodos de Cultivo Massal de Microalgas ..... 277
7.3 Fotobiorreatores Fechados e Sistemas Abertos ............ 278
7.4 Fotobiorreatores em Bancada em Casa de Vegetação ... 280
7.5. Fotobiorreatores hexaédricos fechados ..................... 282

7.5.1. Alimentação e dispositivo de coleta ....................... 282

7.5.2 Produção de biomassa de Chlorella
vulgaris em fotobiorreatores fechados .................... 284
7.6 Construção de Sistema Aberto de Cultivo
de Microalgas no Norte do Paraná ............................ 285
7.6.1 Infraestrutura de apoio ................................................. 286
7.6.2 Escolha da área, preparo do terreno
e fundações ..................................................................... 287
7.6.3 Execução do sistema de produção aberto ............ 289
7.6.4 Layout da plataforma de “raceways” ....................... 291
7.6.5 Validação do sistema de produção .......................... 295
7.6.6 Coleta da biomassa algal, lavagem
e desinfecção do sistema de cultivo ....................... 295
7.6.7 Cultivo de Chlorella sorokiniana e Neochloris
oleoabundans em “raceways”............................................... 296
7.6.2 Composição da biomassa da
Chlorella sorokiniana após extração
de lipídeos totais .......................................................... 298
Referências ................................................................ 299

PARTE 3
DESAFIOS PARA O ISOLAMENTO, MANUTENÇÃO E

CARACTERIZAÇÃO
DE MICROALGAS ...........................................................
303
CAPÍTULO 8
COLETA, ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO

MORFOLÓGICA E MANUTENÇÃO IN VIVO
DE MICROALGAS DA COLEÇÃO IPR ................................... 305
Introdução ................................................................. 307
8.1 Coleta e Preparo de Amostras para Isolamento
de Microalgas ex situ ............................................... 309
8.1.1 Coleta de material biológico....................................... 309
8.1.2 Preparo de amostras para isolamento .................... 314
8.2 Métodos de Isolamento para Obtenção
de Culturas Axênicas ............................................... 315
8.2.1 Isolamento em meio de cultivo sólido ................... 315
8.2.2 Isolamento em meio de cultivo líquido ................. 320
8.3 Caracterização Morfológica ...................................... 322
8.3.1 Morfologia de colônias de microalgas
em meio sólido ................................................................ 324
8.3.2 Caracterização morfológica celular ......................... 324

8.3.3 Análise de diversidade morfológica
de colônias e celulares ................................................. 326
8.4 Preservação dos Cultivos Unialgais ex situ ................. 327
8.4.1 Cultivos de microalgas in vivo ................................... 328
8.4.2 Cultivos in vivo por congelamento
a ultrabaixas temperaturas ........................................ 333
8.6 Viabilidade Celular, Uso de Corantes Vitais
e Contagem nas Células Viáveis ............................... 340
8.6.1 Contagem de células viáveis de microalgas......... 340
8.6.2 Testes de viabilidade celular de microalgas
com corantes azul metileno ...................................... 341
8.6.3 Medidas de viabilidade e observações
microscópicas ................................................................. 343
8.7 Registro/Depósito das Estirpes para o
Estabelecimento da Coleção IPR de Microalgas ................ 345
Referências ................................................................ 346

CAPÍTULO 9
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
DE MICROALGAS ........................................................... 353
Introdução ................................................................. 355
9.1 Caracterização das Estirpes da Coleção
IPR de Microalgas ................................................... 356
9.1.1 Análise BOX-PCR para caracterizar
estirpes de microalgas .................................................. 356
9.1.2 Diversidade genética de estirpes
de microalgas.................................................................. 364
9.2 Agrupamento de Estirpes de Microalgas
pela Técnica PCR-RFLP ............................................. 367
9.3 Análise de Genes Específicos .................................... 371
9.4 Sequenciamento dos Genes 16S e 18S
RNA das Microalgas ................................................ 373
9.4 Ocorrência de Gêneros de Microalgas
em Águas Continentais do Paraná ............................. 376
9.5 Sequenciamento de Microalgas ................................ 377
9.6 Sequenciamento do Genoma
de Microalgas ............................................................. 379
Referências ................................................................ 386

PARTE 4
MICROALGAS: COPRODUTOS DA BIOMASSA

E POTENCIAL USO COMO BIOFERTILIZANTES ..................... 393
CAPÍTULO 10
PRODUÇÃO DE LIPÍDEOS PELAS MICROALGAS

DA COLEÇÃO IPR ........................................................... 395
Introdução ................................................................. 397
10.1 Cultivo das Microalgas ........................................... 398
10.2 Produção de Biomassa pelas Microalgas.................... 399
10.3 Alteração do pH e a relação entre biomassa
e densidade ótica do cultivo ................................... 401
10.4 Lipídeos em Microalgas .......................................... 404
10.5 Produção de lipídeos pelas microalgas
da Coleção IPR ...................................................... 411
Referências ................................................................ 415

CAPÍTULO 11
PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS E PIGMENTOS

PELAS MICROALGAS DA COLEÇÃO IPR .............................. 419
Introdução ................................................................. 421

11.1 Cultivo das Microalgas ............................................ 422
11.2 Produção de Proteína pelas Microalgas ..................... 424
11.3 Produção de Pigmentos pelas Microalgas .................. 426
11.4 Produção de Clorofila-a e Formação de
Feofitina-a em Pigmentos Produzidos
pelas Microalgas ................................................... 431
11.5 Produção de Carotenoides Totais pelas Microalgas ...... 437
Referências ................................................................ 440
CAPÍTULO 12
INOCULAÇÃO DE CIANOBACTÉRIAS EM
LEGUMINOSAS E GRAMÍNEAS ......................................... 445
Introdução ................................................................. 447
12.1 Potencial da Inoculação de Cianobactérias ................ 449

12.2 Interação entre Cianobactérias e
Outros Microrganismos ........................................... 451
12.3 Metabólitos de Cianobactérias
de Interesse Agronômico ........................................ 452
12.4 Caracterização de Cianobactérias da Coleção IPR ....... 453
12.5 Produção de Hormônios por Cianobactérias ............... 455
12.6 Quantificação in vitro da FBN em Cianobactérias
da Coleção IPR ...................................................... 456
12.7 Inoculação de Cianobactérias em Milho,
em Casa de Vegetação ............................................ 459
12.8 Inoculação do Trigo com Cianobactérias .................... 463
12.9 Dupla Inoculação: Rizóbios
e Cianobactérias ......................................................... 466
Referências ................................................................ 476

PARTE 1
ESTADO DA ARTE SOBRE O

CULTIVO DE MICROALGAS

CAPÍTULO 1
ESTRATÉGIAS DE BUSCA
DE ARTIGOS CIENTÍFICOS
COM ENFOQUE EM MICROALGAS
PARA BIOENERGIA
Freddy Zambrano Gavilanes
Maria Elisabeth da Costa Vasconcellos
Diva Souza Andrade

Produção de Biomassa e Coprodutos 37
Introdução
Neste capítulo, o objetivo é apresentar o caminho para
realizar “busca” por informações bibliográficas sobre temas
de interesse em uma plataforma online e, também, conhecer
o número e o desenvolvimento (incremento) das publicações
relacionadas com o tema microalgas e bioenergia ao longo do
tempo.
Esse tipo de levantamento bibliográfico de dados quantita-
tivos e qualitativos é de extrema importância para tomada de
decisões de cunho técnico cientifico, pois assim é possível evi-
denciar as áreas de pesquisas em ascensão, a produtividade de
instituições e países, revistas, autores, artigos e instituições em
destaque na produção intelectual e cientifica. Essa busca deve
ser conduzida de acordo com o tema de interesse e o objetivo
da pesquisa e para isso é necessário estabelecer critérios para
a escolha da (s) plataformas de dados bibliográficos e também
para a seleção dos artigos de interesse.
Nas últimas décadas, o tema microalgas tem sido abordado
em diversas pesquisas de grande interesse mundial, e isso se
deve principalmente à capacidade desses microrganismos em
produzir metabólitos de grande interesse biotecnológico e com
curto tempo de crescimento comparado com culturas oleagino-
sas. Desta forma a biomassa produzida pelas microalgas pode
ser empregada como matéria-prima para a produção de bio-
combustíveis, produção de fármacos, alimentação humana e
animal, entre outras aplicações. Nas ultimas três décadas, uma
das linhas de pesquisa neste tema com destaque é a da utiliza-
ção da biomassa de microalgas para produção de biocombustí-
veis, principalmente para produção de biodiesel.
A revisão sistemática (RS) e a meta-análise (MA) relaciona-
das a qualquer tema científico dão confiabilidade para as con-
clusões da busca (SAMPAIO et al., 2007). Neste sentido as RS e
MA são métodos sistemáticos para evitar vícios (viés) e possibi-
litar uma análise mais objetiva dos resultados facilitando uma

38 Microalgas de Águas Continentais | Volume 2
síntese conclusiva de determinada pesquisa. Ainda na área da

medicina, um trabalho interessante que pode ser aplicado em
qualquer área descreve as cinco principais etapas de uma busca
na revisão sistemática (KHAN et al., 2003). Recentemente, dois
trabalhos de revisão sistemática foram publicados sobre o tema
biocombustíveis e sinergismo de coprodutos dessa atividade
industrial (MARTIN et al., 2014; SILVA et al., 2014).
A partir da internet as facilidades para o uso das bases de
dados têm sido ampliadas. A escolha da base de dados é impor-
tante para a eficácia da busca. Definição da base de dados ele-
trônica é uma habilidade de uma RS ou busca, considerada
(sondagem) eficiente. Após a escolha da plataforma de dados
é uma das estratégias de busca, neste capítulo foi definir os
termos e palavras chave.
Com o uso do SCOPUS (www.scopus.com/) que é uma das
maiores base de dados de resumos e citações de artigos para
jornais/revistas acadêmicos, realizou-se a busca dos termos
Microalgae (microalgas), Microalgae and Bioenergy (bioener-
gia) e Microalgae and Biofuel* (biocombustível), ao longo dos
anos. Os objetivos foram determinar o número de documen-
tos publicados por ano, número de documentos publicados por
países, os tipos de documentos publicados, as principais áreas
das publicações, as instituições que desenvolveram pesquisa
no tema com o número de publicações geradas e as principais
revistas e editoras com o número de publicações.
A busca é utilizada tanto para uma RS como para uma MA,
embora cada uma delas tenha métodos e objetivos diferentes,
Neste capítulo, os objetivos foram também, registrar as dife-
rentes metodologias de “buscas” para de realizar um levanta-
mento bibliográfico sobre microalgas para produção de bioe-
nergia e mostrar também o aumento de publicações nesta área
nas últimas décadas.
Para simular um exemplo de busca a base escolhida foi
a Scopus por ser mais abrangente e possuir maior número de
publicações (artigos, livro, anais de congressos) relacionadas
com o tema de interesse. Microalgas e bioenergia.

1.1 Plataformas de Dados Bibliográficos Online

As bases de dados internacionais possibilitam acesso rápido
e fácil de artigos científicos, teses, dissertações, relatórios, nor-
mas técnicas, dados estatísticos, patentes, ensaios, estudos de
caso, monografias, livros, entre outros documentos produzidos
em várias regiões do mundo. Existem diferentes bases de dados
contendo temas específicos ou multidisciplinares. Entre elas
está a Greenfile (www.libraries.rutgers.edu/indexes/greenfile)
que é uma coleção que contém títulos científicos, governa-
mentais e de interesse geral. Essa plataforma possui perto de
700.000 referências cobrindo as área de ciência, tecnologia,
ciências biomédicas, econômica, social e humanas. Esse banco
de dados é compilado pelas bibliotecas nacionais de vários paí-
ses europeus.
A base de dados SciELO - Scientific Electronic Library Online
(http://www.scielo.org/php/index.php), disponibiliza 544
periódicos de acesso gratuito na internet publicados no Bra-
sil, Argentina, Chile, Colômbia, Costa Rica, Cuba, Espanha,
México, Portugal, Peru, Uruguai e Venezuela, cobrindo as
Áreas de Ciências Biológicas, Ciências da Saúde, Ciências Agrá-
rias, Ciências Exatas e da Terra, Engenharias, Ciências Sociais
Aplicadas, Ciências Humanas, Letras e Artes.
A Editora Springer (http://www.springer.com/) possui uma
Coleção de 1.384 publicações periódicas nas áreas de Ciências
Biológicas, Ciências da Saúde, Ciências Agrárias, Ciências Exa-
tas e da Terra, Engenharias, Ciências Sociais Aplicadas e Ciên-
cias Humanas.
Nesta área, ainda pode ser citada a plataforma Wilson
(http://www.ebscohost.com/wilson) que é uma Coleção de
periódicos com textos completos cobrindo as áreas de Ciências
Biológicas, Ciências da Saúde, Ciências Agrárias, Ciências Exa-
tas e da Terra, Engenharias, Ciências Sociais Aplicadas, Ciên-
cias Humanas e Letras e Artes, disponibilizados junto com as
bases de dados de resumos publicadas pela H. W. Wilson.

Na Science Direct estão disponíveis 2.558 publicações peri-

ódicas da Elsevier e de outras editoras científicas, cobrindo as
Áreas de Ciências Biológicas, Ciências da Saúde, Ciências Agrá-
rias, Ciências Exatas e da Terra, Engenharias, Ciências Sociais
Aplicadas, Ciências Humanas e Letras e Artes. O período dispo-
nível online varia a partir de 1993, não é gratuito e precisa-se
de ter subscrição, para poder acessar a plataforma.
A base de dados Scopus fornece a conexão entre o meio
ambiente e uma variedade de disciplinas, tais como agricul-
tura, educação, direito, saúde e tecnologia. Alguns dos tópicos
cobertos referem-se à mudança climática no mundo, poluição,
agricultura sustentável, energia renovável e reciclagem. A
maioria teve início em 1990, com alguns conteúdos a partir de
1948 que foram incluídos.
Scopus é a maior base de dados de referências e resumos
de literatura e de fontes de alta qualidade na internet. Apesar
do caráter multidisciplinar de sua coleção, seu acervo compre-
ende mais de 4.300 periódicos nas áreas de ciências da vida e
mais de 6.800 títulos em ciências da saúde. Entre suas opções
para a busca bibliográfica, se encontra a busca por autor e filia-
ção deste, assim como a busca simples por palavras chave e
frases nos campos: “Título do artigo”, “Resumo” e “Palavras
chave” e a busca avançada. A plataforma Scopus caracteriza-
-se por estar atualizada com a tecnologia e sua integração com
outros produtos-chave da Elsevier, tais como: ScienceDirect e
Scirus, com o objetivo de evitar a duplicação de esforços dos
pesquisadores em trabalhos de busca da informação e acelerar
o avanço das pesquisas.
Tanto Science Direct como Scopus são dois portais da Elsevier
bastante utilizados por quase todos os pesquisadores, devido
ao seu conteúdo multidisciplinar. Essas duas plataformas
proporcionam excelentes meios de busca de artigos nas principais
revistas científicas, permitem fazer conjuntos de temas através
de RSS, guardar buscas personalizadas, estabelecer alertas e
fazer listas de autores, temas e instituições. Scopus, além de
ter muita informação recompilada, tem o seguimento das refe-
rências e isso é essencial na realização de revisões. Scopus nos

permite analisar e comparar a importância de uma ou várias

revistas ao longo do tempo além de refinar os resultados por
muitas categorias, o que na Science Direct somente pode ser
feito por título, tema, ano, tipo de documento.
1.2 Metodologia de Busca

Na primeira etapa deve se formular as questões para a
revisão. Os problemas na revisão devem ser especificados de
forma clara. Antes de iniciar o trabalho de revisão as ques-
tões não ambíguas e estruturadas devem ser formuladas. Uma
vez formulada as questões da revisão (hipóteses) modificações
do protocolo são permitidas somente se caminhos alternati-
vos aparecem. O segundo passo é identificar as bases de dados
a serem consultadas; definir palavras chave e estratégias de
busca. No exemplo deste capitulo (microalgae; microalgae and
bioenergia e microalgae and biofuel).
A terceira etapa é conduzir a busca nas bases de dados
escolhidas e com base nas estratégias definidas. Procurar o que
está buscando na base de dados. Neste processo deve comparar
as buscas e definir a seleção inicial de artigos. Na quarta etapa
deve estabelecer critérios para a seleção dos artigos a partir
da busca. Aplicar os critérios na seleção dos artigos e justifi-
car exclusões. Na ultima etapa deve preparar o resumo crítico
sintetizando as informações disponibilizadas pelos artigos que
foram incluídos na revisão. Apresentar uma conclusão infor-
mando a evidência sobre a quantidade relevante de trabalhos
encontrado.
1.3 Metodologia de Busca no SCOPUS

Para ter acesso à plataforma SCOPUS, o primeiro passo
é acessar a página principal da web site http://www.scopus.
com/ e realizar o login. Após o login, abrirá uma nova janela do
navegador, na qual vai aparecer a página principal do sistema

Scopus; nessa página existe a opção para se fazer buscas básicas

ou avançadas.
Na área de (busca) Search é necessário colocar o tema de
“busca”, por exemplo, se o foco da revisão: microalgas e bio-
combustível, então, a busca será Microalgae and Biofuel.
Com o Scopus, pode-se iniciar a busca com uma pesquisa
ampla e depois redefinir a um conjunto de resultados viá-
veis de publicações com os quais se possa trabalhar. A caixa
refine results (refinar resultados) permite obter uma visão geral
rápida dos resultados da pesquisa. A partir daí, pode-se defi-
nir um limite para a pesquisa clicando em limit to (limitar a)
ou exclude (excluir) para resultados selecionados nas seguintes
categorias: Source title (Título da fonte), Author name (Nome do
autor), Year (Ano), Document type (Tipo de documento) ou Sub-
ject area (Área de interesse). No caso da busca deste trabalho
fez-se sem refinar os resultados.
Após redefinir os resultados pode se visualizar a busca com
detalhes da pesquisa obtida clicando no título do artigo. Abre-
-se uma nova página que contém o resumo e as referências do
artigo, além de mais informações, como Web Cites (Citações na
Web), Patent Cites (Citações em patentes), Library links (Links
para bibliotecas) e Find related documents (Localizar documen-
tos relacionados).
Essa nova página da busca, também permite imprimir,
exportar, enviar por correio eletrônico ou agregar a uma lista
de citações de interesse da “busca”, marcando cada una delas
na caixa correspondente. Este processo deve ser feito para cada
um dos trabalhos de interesse detectados na busca para recu-
perar as referências.
1.4 Busca Utilizando o Termo Microalgae

O termo microalgas engloba uma grande variedade de
micro-organismos fotossintéticos que desempenham ampla
gama de funções. Na busca feita em 12 de junho de 2014, na

plataforma SCOPUS, o número de publicações geradas desde

1963 com o tema Microalgae somam se um total de 10.037
documentos, num período de 51 anos. Neste levantamento,
nota-se que nos últimos cinco anos o maior número de publica-
ções foi em 2013 com 1.673, em seguida em 2012 com 1.208,
2011 com 931, 2010 com 688 e 2009 com 497 documentos por
ano (Figura 1.1a).
Em relação ao número de documentos publicados sobre
microalgas por países, os Estados Unidos lideram o número de
publicações com 1.797, seguidos de China com 1.016, Espanha
com 717, França com 681, Austrália com 565. Dos países da
América do Sul, o Brasil lidera com 285 publicações, de um
total de 545 publicações (Figura 1.1b).
Na busca por forma de documento, o maior número de
publicações até a atualidade foi na forma de artigo cientí-
fico com 7.780 publicações em revistas com corpo editorial,
seguido por publicações em conferência com 975, revisão com
577, artigo impresso com 223 e outros com 202 tipos de docu-
mentos publicados (Figura 1.2a).
As cinco áreas que mais contribuíram com as publicações
foram Agricultura e Ciências Biológicas com 4.177 seguidas de
Ciências e Ambiente com 3.049, Bioquímica Genética e Gené-
tica Molecular com 2.274, Engenharia Química com 1.920 e
Imunologia e Microbiologia com 1.050 (Figura 1.2b).
Na busca por instituição, dentre as que mais geraram
publicações estão (Figura 1.3a):
1. Universidad de Almería (Espanha): 95 publicações;

2. Université de Nantes (França): 90 publicações;
3. Ocean University of China (China): 88 publicações;
4. Centre National de la Recherche Scientifique – CNRS
(França): 81 publicações;
5. Marine and Atmospheric Research – CSIRO (Austrália):
78 publicações.

As principais revistas ou editoras que se destacaram em

número de publicações foram (Figura 1.3b):
1. Bioresource Technology: 661 publicações;

2. Journal of Applied Phycology: 326 publicações;
3. Aquaculture: 203 publicações;
4. Marine Ecology Progress Series: 165 publicações;
5. Journal of Phycology: 138 publicações.
1800
1600
1400
Número de documentos
1200
1000
800
600
400
200
0
1960 1970 1980 1990 2000 2010 2020
Anos
Colômbia 70
Chile 95
Brasil 285
Austrália 565
França 681
Espanha 717
China 1016
Estados Unidos 1797
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
Figura 1.1. Número de documentos publicados a partir de 1963 até

12/06/2014, abordando o tema microalgae por: (a) ano
e (b) países. Fonte: SCOPUS, 2014.

142
1 os de ocumentos
202 18
17
22
77
97
Art o
on er nc er
7780 e s o
Art o m reso
nde n do
tu o de ro
e uen s es u s s
Not
A ri ultura e Ci n ias Biol i as
Ci n ia e Ambiente
Bio u mi a en ti a e en ti a ole ular
46 En enharia u mi a
10
munolo ia e i robiolo ia
8 4
u mi a
41
1 erra e Ci n ias lanetárias
En enharia
Ener ia
edi ina
10 0
04
1 20
22 4
Figura 1.2. Distribuição do número de publicações a partir de 1963

até 12/06/2014 abordando o tema Microalgae por: (a)
tipos de documentos e (b) de acordo com as áreas. Fon-
te: SCOPUS 2014.

Centro de n esti a iones Biolo i as

0
el oroeste
F E E Centre de antes 1
Uni ersit o ueensland
onash Uni ersit
Ben urion Uni ersit o the e e

C arine and Atmospheri
8
esear h
C Centre ational de la
81
e her he ienti i ue
ean Uni ersit o China 88
Uni ersite de antes 0
Uni ersidad de Almeria
0 20 40 60 80 100
Número de u c es er d s
Biote hnolo and Bioen ineerin 1
drobiolo ia 6
ournal o E perimental arine Biolo and

128
E olo
ournal o h olo 1 8
arine E olo ro ress eries 16
A ua ulture 20
ournal o Applied h olo 26
Bioresour e e hnolo 661
0 200 400 600 800

Número de u c es
Figura 1.3. a) Número de publicações geradas com a busca com o

tema microalgas a partir de 1963 até 12/06/2014 e de
acordo com as áreas: a) por instituições; b) por revistas
científicas. Fonte: Scopus (2014).

1.5 Busca Refinada

A bioenergia ou energia da biomassa é um tipo de energia
renovável que se produz a partir do aproveitamento da maté-
ria orgânica e industrial formada em alguns processos biológi-
cos ou mecânicos, geralmente das substâncias que constituem
os seres vivos ou seus resíduos. Suas formas mais conhecidas
são o biocombustível (Biodiesel, Bioetanol e o Biogás) ou a
biomassa sendo as microalgas matéria prima importante para
geração de bioenergia.
Uma busca utilizando os termos: Microalgae and Bioenergy
foi feita. Sabendo se que as pesquisas com este tema se inicia-
ram na década de oitenta, resultando em aumento das publica-
ções a partir desta data, então, procurou se refinar a busca com
o tema Microalgae and Bioenergy por período de 1986 até 2014.
O resultado obtido foi um total de 207 documentos. Nota-se
que, nos últimos cinco anos, o maior número de publicações foi
em 2013 com 63, seguido de 2012 com 32, 2011 com 35, 2014
com 28 e 2010 com 21 documentos (Figura 1.4a). Em relação
ao número de documentos publicados por países observa se
que os Estados Unidos lideram com 66, seguido da China com
24, Reino Unido com 17, Índia com 16, Austrália com 13. Na
América do Sul foram encontradas 7 publicações com o tema,
sendo 4 do Brasil, 2 da Argentina e 1 do Chile (Figura 1.4b).
O maior número de publicações a partir de 1986 até 12
junho de 2014 foi na forma de artigos com 131, revisão com
32, resumo de conferência com 25, artigos impressos com 11
e capítulos de livro com três tipos de documentos publicados
(Figura 1.5a). As 5 áreas que mais geraram publicações foram
Ciência e Ambiente com 83, seguida da Engenharia Química
com 74, Bioquímica Genética e Genética Molecular com 56,
Energia com 53 e Agricultura e Ciências Biológicas com 41
(Figura 1.5b).

70
60
40
20
10
0
1 80 1 8 1 0 1 2000 200 2010 201 2020
Anos
16
17
66
0 10 20 0 0 50 60 70
Figura 1.4. Número de publicações abordando o tema Microalgae

and Bioenergy e redefinindo a pesquisa a partir de 1986
até 12/06/2014: (a) ano e (b) países. Fonte: SCOPUS
2014.

1 1 1
1 1
11
2
1 1
Arti o e is o
Con er n ia paper Arti o impreso
Cap tulo de li ro i ro
e is o de o eren ias Errata
e ueno in u rito esumo reportado
re de u c es
1
26 8
2
Ci n ia e Ambiente
En enharia u mi a
41 Ener ia
4 munolo ia e i robiolo ia
En enharia
u mi a
edi ina
6 F si a e Astronomia
Figura 1.5. Número de publicações abordando o tema microalgae

and bioenergy de acordo com: (a) tipo (formato) e. (b)
grandes áreas das publicações. Pesquisa realizada de
1986 até 2014. Fonte: SCOPUS 2014.

As instituições que geraram mais publicações foram

(Figura 1.6a):
1. University of Georgia (EUA): 7 publicações;

2. Conseil National de Recherches (Canadá): 5 publicações;
3. Universität Bielefeld (Alemanha): 5 publicações;
4. Institut National de La Recherche Agronomique – INRA
(França): 5 publicações;
5. University of Virginia (EUA): 5 publicações.
As principais revistas ou editoras que tiveram mais publi-

cações foram (Figura 1.6b):

2. National Meeting Book of Abstracts – ACS: 9 publica-
ções;
3. Biomass and Bioenergy: 9 publicações;
4. Applied Energy: 8 publicações;
5. Renewable and Sustainable Energy Reviews: 7 publica-
ções.

ampereen e nillinen liopisto 4
hio tate Uni ersit 4
ational ene able Ener aborator
Ban or Uni ersit
Finnish En ironment nstitute
Uni ersit o ir inia
A nstitut ational de a
Uni ersit t Biele eld
Conseil national de re her hes Canada
he Uni ersit o eor ia
0 1 2 4 6 8
Número de u c es
Ener Con ersion and ana ement

Applied i robiolo and Biote hnolo
ournal o Biote hnolo
hotos nthesis esear h 4
Applied Bio hemistr and Biote hnolo 4
Current pinion in Biote hnolo 4
Biote hnolo or Bio uels 4
los ne
Al al esear h
ene able and ustainable Ener e ie s
Applied Ener 8
Biomass and Bioener
AC ational eetin Boo o Abstra ts
0 10 1 20 2 0 40 4
Número de u c es
Figura 1.6. Número de publicações abordando o tema (microalgae

and bioenergy) geradas por: (a)Instituições; (b) Revistas
científicas. Pesquisa realizada a partir de 1986. Fonte:
SCOPUS 2014.

1.6 Busca Utilizando o Termo Microalgae and

Biofuel*
A busca pelo título, resumo e palavras-chave dos termos
microalgae and biofuel*, utiliza-se para este último um símbolo
de truncamento, o asterisco, ao final da palavra, com finalidade
de recuperar os possíveis sinônimos deste termo. O número
de documentos publicados por ano, com relação aos termos
(microalgae and biofuel*), pesquisados na plataforma Scopus
estão apresentados na Figura 1.7a. Nesta busca obteve se um
resultado de 1.624 documentos. Estas publicações começaram
a se intensificar a partir do ano de 2005. Os países que se desta-
cam com maior número de documentos indexados, utilizando
os termos de busca microalgae and biofuel* são: Estados Unidos,
China, Índia, Austrália e Coréia do Sul. O Brasil aparece em 16°
lugar com um total de 33 documentos (Figura 1.7b).
Dos 1.624 documentos mais de 50% estão publicados na
forma de artigos. Na Figura 1.8a podem ser visualizados os
tipos de documentos publicados, referentes a busca na plata-
forma Scopus.
As áreas de pesquisa com maior número de documentos
usando os termos Microalgae and Biofuel* são: Engenharia
Química com 711; Ciências Ambientais com 606; Bioquímica,
Genética e Biologia Molecular com 412; Energia com 311;
Agricultura e Ciências Biológicas com 254 documentos (Figura
1.8b).

600
Numero de documentos 500
00
00
200
100
0
1970 1980 1990 2000 2010 2020
nos
e 9
o om 26
r s
or do u 74
Austr 82
nd 96
n 207
st dos n dos 41
0 100 200 00 400 00 600

Número de documentos u c do or s
Figura 1.7. Número de documentos publicados obtidos pela pesquisa

realizada a partir de 1979 até 12/06/2014 e realizando
a busca dos termos, microalgae and biofuel* (a) por ano
e (b) por países. Fonte: SCOPUS, 2014.

1 1 42 4
1 4
208 11
2 4
41 606
412
En enharia u mi a
Ci n ia e Ambiente
Ener ia
En enharia
munolo ia e i robiolo ia
u mi a
Figura 1.8. Número de documentos encontrados com a busca, utili-
zando os termos Microalgae and Biofuel*. Pesquisa rea-
lizada a partir de 1979 até 12/06/2014: (a) tipos e (b)
áreas de pesquisas. Fonte: SCOPUS 2014.

As instituições em que se encontram os maiores números

de documentos em relação a esta busca são (Figura 1.9a):
1. Chinese Academy of Science (China): 32 publicações;

2. University of Minnesota: Twin Cities (EUA): 32 publica-
ções;
3. National Cheng Kung University (China): 27 publica-
ções;
4. National Renewable Energy Laboratory (EUA): 25 publi-
cações;
5. Monash University (Australia): 23 publicações.
As revistas em que aparece maior número de documentos

em função dos termos pesquisados são (Figura 1.9b):

2. Applied Energy: 52 publicações;
3. Journal of Applied Phycology: 43 publicações;
4. Biomass and Bioenergy: 36 publicações;
5. American Chemical Society National Meeting Book of
Abstracts: 35 publicações.

Uni o ueensland 20
Uni nd de antander 21
orea Ad nst o e h 21
sin hua Uni 21
a enin en Uni and es C 21
onash Uni 2
at en Ener ab 2
at Chen un Uni 2
Uni innesota C 2
Chinese A 2
0 10 1 20 2 0
Número de u c es
ene able and ustainable Ener e ie s 2
Applied Bio hemistr and Biote hnolo 2
Applied i robiolo and Biote hnolo 2
Biote hnolo Ad an es 24
Al al esear h 0
AC ational eetin Boo o Abstra ts
Biomass and Bioener 6
Applied Ener 2
0 0 100 1 0 200 2 0 00 0
No de er od cos e ed tor s
Figura 1.9. Número de publicações de acordo com os termos de

busca microalgae and biofuel*. Pesquisa realizada a
partir de 1979 até 12/06/2014: (a) por Instituições (b)
por Períodicos. Fonte: SCOPUS 2014.

Considerações Finais
Desde o ano 1963 até 2014 usando a base de dados SCO-
PUS com o termo Microalgas foram encontrados 10.037 docu-
mentos publicados. No ano de 2013 teve maior número de
publicações sendo 16,66% do total.
Quando os termos Microalgae, Microalgae and Bioenergy e
Microalgae and Biofuel* foram utilizados os maiores percentu-
ais das publicações foram observados nos EUA e China.
Na plataforma Scopus, utilizando o termo Microalgae, foi
observado incremento no percentual de publicações em vários
países, os EUA tiveram um incremento de 17,9% e a China de
10,12%. Alterando os termos para Microalgae and Biofuel os
EUA mostraram um aumento de 33,86% e China 12,31%. O
mesmo padrão de percentagem de incremento nestes países foi
observado com a busca com Microalgae and Bioenergy.
Ás áreas que obtiveram maior número de publicações até
a atualidade com o termo Microalgae foram as da Agricultura
e Ciências Biológicas, seguidas de Ciências Ambientais; com o
termo Microalgae and Bioenergy foram Ciências Ambientais e
Engenharia Química; já com os termos Microalgae and Biofuel,
a Engenharia Química e Ciências Ambientais lideram sendo as
publicações escritas mais na forma de artigo seguidas daquelas
escritas na forma de resumo de conferência.
Entre as principais instituições que geraram mais publi-
cações com o termo Microalgae destaca-se a Universidad de
Almería (Espanha), Université de Nantes (França). Com o termo
Microalgae and Bioenergy a University of Georgia (Estados Unidos
da América, EUA) e Conseil National de Recherches (Canadá) e
com o termo Microalgae and biofuel Chinese Academy of Scien-
ces (China) e University Minnesota (Estados Unidos da América,
EUA).
Estudos com o tema envolvendo microalgas são de grande
interesse mundial, com pesquisas importantes nos diferentes
continentes, especialmente no Americano com os Estados Uni-

dos e no Asiático com a China. Na América do Sul observou-

-se tendência de incremento das publicações em alguns países
liderados pelo Brasil.
Referências
KHAN, K.; R. KUNZ; J. KLEIJNEN; G. ANTES. Five steps to conducting a
systematic review. J R Soc Med., v. 96, n. 3, p. 118-121. 2003.
MARTIN, M.; A. J. E. FONSECA. A systematic literature review of biofuel
synergies. L. U. Linköping University Environmental Technology and
Management, Se-581 83 Linköping, Sweden 51 p. 2014.
SAMPAIO, R.; M. MANCINI. Estudos de revisão sistemática: um guia para
síntese criteriosa da evidência científica. Rev. Bras. Fisioter, v. 11, n. 1,
p. 83-89. 2007.
SILVA, V.; E. LOPES; E. ANDRADE; R. SOUSA; M. ZANGERONIMO; L.
PEREIRA. Use of biodiesel co-products (Glycerol) as alternative sources
of energy in animal nutrition: a systematic review Uso de co-productos
de biodiesel (Glicerol) como fuentes alternativas de energía en la
alimentación animal: una revisión sistemática. Arch Med Vet v. 46, p.
111-120. 2014.

CAPÍTULO 2
MINERAÇÃO TEXTUAL DE ARTIGOS

SOBRE O CULTIVO HETEROTRÓFICO
DE MICROALGAS
Elisângela Andrade Angelo

Introdução
As microalgas representam um grupo bastante diverso de
microrganismos e, embora muitos as definam apenas como
fotossintetizantes, estudos recentes sobre sua bioquímica têm
demonstrado ampla versatilidade metabólica. Destaca-se que
há espécies de microalgas heterotróficas, capazes de oxidar
compostos orgânicos externos como fonte de carbono e ener-
gia. Há ainda espécies mixotróficas, capazes de realizar fotos-
síntese e também oxidar fontes de carbono, e espécies fotohe-
terotróficas, as quais necessitam de luz para oxidar compostos
orgânicos (BUMBAK et al., 2011; CHOJNACKA; MARQUEZ-
-ROCHA, 2004).
Desde o início dos estudos sobre a produção de microalgas,
tem predominado o cultivo baseado no metabolismo fotoauto-
trófico destes microrganismos (CARVALHO et al., 2006; CHEN,
1996). No entanto, é importante considerar a versatilidade das
microalgas ao se desenvolver sistemas de produção. A escolha
de qual o melhor sistema para o cultivo envolve vários fatores
como: objetivo da produção (produto ou processo almejado),
bem como as características da microalga. Destaca-se que cada
sistema apresenta vantagens, desvantagens e desafios tecnoló-
gicos próprios.
Nos últimos dez anos, têm despontado estudos que focam
o cultivo heterotrófico e mixotrófico das microalgas. De acordo
com a literatura, esta forma de cultivo apresenta a vantagem
de não necessitar de uma fonte luminosa, o que permite a pro-
dução em maiores volumes e com altas densidades, já que não
há a limitação quanto à penetração da luz. Além disso, o cul-
tivo heterotrófico pode ser feito em biorreatores com tecnolo-
gias já estabelecidas, o que favorece o controle de parâmetros.
O cultivo heterotrófico necessita de menor área para instala-
ção e, em geral, as espécies de microalgas com esta forma de
metabolismo apresentam altas produtividades. As principais
desvantagens e os desafios para o cultivo heterotrófico seriam:

dependência de uma fonte externa de carbono orgânico, o que

pode encarecer o processo; grande demanda por gás oxigênio
no sistema e, por fim, há menor quantidade de cepas capazes
de crescer heterotroficamente (AZMA et al., 2011; LI et al.,
2007; CHENG et al., 2009; SHEN et al., 2010; PEREZ-GARCIA
et al., 2011).
Embora o cultivo heterotrófico de microalgas possa se
mostrar promissor, ainda há muitas perguntas sobre este pro-
cesso de produção. Desta maneira, o presente capítulo tem por
objetivo realizar uma mineração textual com base em artigos,
a fim de levantar mais informações sobre o tema, bem como
sobre os grupos de pesquisas que o estudam. Estes resultados
fazem parte da meta sobre levantamento do estado da arte, do
convênio entre o Instituto Agronômico do Paraná, Companhia
Paranaense de Energia e Fundação de Apoio à Pesquisa e ao
Desenvolvimento do Agronegócio.
2.1 Mineração Textual

A mineração textual pode ser definida como um processo
que tem como objetivo descobrir padrões implícitos, com-
preensíveis e úteis com base em documentos de textos (BAO
et al., 2012). Este processo faz parte de uma metodologia mais
ampla, denominada: Descoberta de Conhecimento em Banco
de Dados, representada pela sigla KDD (no inglês: Knowledge
Discovery in Databases). Esta área do conhecimento começou a
ser desenvolvida principalmente na década de 1980, quando já
era comum a existência de grandes bancos de dados, que torna-
vam muito difícil a busca manual por informações relevantes
(NEVES, 2012).
O KDD consiste, basicamente, em cinco etapas (BAO et al.,
2012):
1. Definição de qual informação se deseja obter, ou quais

questões espera-se que o processo responda;

2. Escolha do banco de dados, o qual deve apresentar po-
tencial para responder às expectativas levantadas na
primeira etapa;
3. Pré-processamento dos dados, a fim de evitar inter-
ferências indesejáveis em processamentos posteriores,
bem como, adequar a linguagem do banco de dados às
ferramentas que serão utilizadas;
4. Mineração dos Dados corresponde à análise dos da-
dos, a fim de encontrar os padrões e informações rele-
vantes;
5. Visualização dos resultados na forma de gráficos, tabe-
las e sumários, o que facilita a análise geral do tema.
A aplicabilidade do KDD é bastante ampla, indo desde o

setor comercial e industrial, ao acadêmico e onde a análise de
dados permite uma melhor compreensão do estado da arte do
tema em estudo, o que facilita o avanço da pesquisa, bem como
a inovação tecnológica.
Destaca-se que na mineração textual, geralmente, são utili-
zados textos estruturados, ou seja, com uma ordem reconhecí-
vel por um software. Os artigos e patentes são exemplos destes
textos, pois apresentam uma disposição padrão de seus itens,
tais como: título, autores, palavras-chaves, entre outros (DING;
FU, 2012; VENTURA; SILVA, 2012).
O KDD apresenta metodologias e ferramentas próprias,
sendo comum a utilização de softwares. Alguns bancos de
dados, como o Scopus, apresentam ferramentas que permitem
uma mineração textual prévia, bem como o levantamento de
informações relevantes.
Tendo em vista que este estudo visava um mapeamento
mais profundo, utilizou-se o programa Vantage Point (Search
Technology). Este programa foi desenvolvido para a minera-
ção textual e permite responder às seguintes perguntas sobre o

tema: quem são e onde estão os pesquisadores? O que eles pes-

quisam? Como está a evolução da quantidade de publicações
ao longo dos anos? O programa também permite compreender
as relações entre autores, instituições e países; as tendências,
bem como a evolução de indicadores (PORTER, 2004; 2012).
Embora o Vantage Point permita a mineração em artigos
e patentes, este estudo focou na mineração textual de artigos
sobre cultivo heterotrófico de microalgas. Utilizando ferramen-
tas adequadas do Vantage Point, versão 7.0, realizou-se a mine-
ração textual, com os seguintes objetivos:
1. Observar a evolução das publicações sobre cultivo he-

terotrófico de microalgas ao longo dos anos;
2. Identificar quais eram os principais países, instituições
e autores que trabalham com este tema;
3. Verificar as redes de contato dos principais países e
dos principais autores;
4. Identificar quais as principais áreas de publicação so-
bre o tema;
5. Correlacionar as áreas de publicação com os princi-
pais países e autores;
6. Identificar informações com base no estudo das pala-
vras-chaves utilizadas pelos autores;
7. Ranquear os artigos mais citados sobre o tema;
8. Identificar algumas publicações-chave sobre o tema.
2.2 Banco de Dados de Artigos Científicos

Os artigos científicos são o principal veículo formal de
comunicação da comunidade científica, pois guardam a memó-
ria da ciência, o que possibilita reconhecer seu histórico, evo-
lução, bem como, apontar para desenvolvimentos futuros. Para
ser publicado na forma de artigo, a regra geral é que o estudo
passe por avaliação de pares; o que serve como filtro seletivo

para as publicações, dando maior credibilidade aos estudos e

pesquisadores (GRUSZYNSKI; GOLIN, 2006). Embora exista
crítica a este processo, ele é o predominante no meio acadê-
mico nas várias partes do mundo.
As primeiras revistas científicas surgiram na França e
Inglaterra no ano de 1665 e, desde então, a quantidade de
títulos cresceu expressivamente (GRUSZYNSKI; GOLIN, 2006).
Nos últimos anos, além das tradicionais revistas impressas, tem
se desenvolvido uma mídia eletrônica, a qual tem se dedicado
à divulgação científica.
É notório que a quantidade de informação nas últimas
décadas não tem precedentes na história, o que levou muitos a
considerar a atual sociedade como “a sociedade da informação”
(WERTHEIN, 2000). No campo científico, este “boom” de
informações não foi diferente, o que resultou na publicação de
maior quantidade de artigos. A fim de facilitar a busca por estes
trabalhos, várias editoras e instituições científicas organizaram
bancos de dados eletrônicos, nos quais os artigos de diferentes
revistas (impressa e/ou eletrônica) são cadastrados. Estes
bancos de dados facilitam o acesso, o resgate de informações,
permitem maior interatividade entre os pesquisadores, bem
como facilitam a navegabilidade eletrônica (GRUSZYNSKI;
GOLIN, 2006).
Há vários bancos de dados científicos, alguns específicos de
determinadas áreas e outros multidisciplinares. Nesse estudo,
optou-se por utilizar dois bancos de dados multidisciplinares
para busca de artigos: Web of Science e Scopus Basic Research.
Web of Science é organizado e administrado pela Thomson
Reuters, empresa do setor de jornalismo que atua em vários seg-
mentos do ramo e é considerada uma das maiores do mundo.
Web of Science é um dos mais tradicionais bancos de dados de
pesquisa de artigos científicos e até junho de 2013 contava
com 2,5 milhões de registros, sendo que os mais antigos datam
de 1898.

Scopus Basic Research é a maior base de dados para

procura de artigos científicos, conta com cerca de 50 milhões
de registros, sendo que os mais antigos datam de 1823. Este
banco de dados é administrado pela Elsevier, a maior editora
científica do mundo.
2.3 Publicações Sobre Cultivo Heterotrófico

de Microalgas
Neste estudo, foram utilizados os seguintes termos:
“microalgae” e “heterotrophic” para busca nos bancos de dados
escolhidos. Destaca-se que só foram considerados os artigos em
que estes termos apareciam juntos no título, palavras-chaves
ou no resumo. Após o levantamento, os resultados das pesqui-
sas nas duas bases foram integrados e trabalhados em conjunto.
Utilizando-se o programa Vantage Point, versão 7.0, foi
feita a integração entre as pesquisas nos dois bancos de artigos.
Posteriormente, procedeu-se uma limpeza dos artigos, a fim
de eliminar duplicidade. Em seguida, utilizando filtros e fer-
ramentas do programa, procedeu-se a limpeza dos dados, que
consiste em analisar os termos, a fim de eliminar duplicidades
e erros de grafia. Estas etapas consistem no pré-processamento
do texto.
Após a realização do levantamento bibliográfico, integra-
ção dos resultados dos dois bancos e limpeza das duplicações,
trabalhou-se com um conjunto de 493 artigos. Foram incluídos
no conjunto tanto os artigos que tinham como tema central
o cultivo heterotrófico, como aqueles que o tratavam como
assunto secundário da pesquisa. Para facilitar a visualização
das informações e dados, os gráficos foram exportados para o
programa Excel, versão 2010, onde foram trabalhados.

2.3.1 Evolução temporal

O primeiro item avaliado foi a evolução das publicações
ao longo dos anos (Figura 2.1). Nota-se que nos últimos anos
a quantidade de trabalhos sobre o assunto aumentou consi-
deravelmente; sendo que os últimos 10 anos correspondem a
65% das publicações. Percebe-se uma tendência de aumento de
interesse pelo tema, com tendência de continuidade das pes-
quisas; trata-se, portanto, de um tema com características de
emergente. No ano de 2011 foram publicados 63 artigos sobre
cultivo heterotrófico ou que tratam secundariamente deste
tema; e até junho de 2012 foram publicados 40 artigos.
u nt d de de
u c es
60
20
0
1978 1991 1996 2001 2006 2011
no
Figura 2.1. Quantidade de publicações sobre cultivo heterotrófico

de microalgas entre 1978 e junho de 2012.
2.3.2. Localização das publicações

Em relação à localidade da pesquisa, constatou-se que
os artigos provinham de 48 países. Na Figura 2.2 apresenta a
quantidade de publicações dos 10 principais países. A Figura
2.3 apresenta a evolução das publicações dos EUA e China,

principais países que publicam sobre o tema, correspondendo

a cerca de 30% dos artigos levantados na pesquisa bibliográ-
fica. É possível perceber que os Estados Unidos foram pioneiros
nesta área, sendo que a China iniciou suas publicações apenas
em 1997, seguido por um crescimento acentuado de suas pes-
quisas. Atualmente os EUA respondem por 18% das publica-
ções e a China corresponde a 13%.
rt os
80
70
60
50
0
0
20
10
0
ses
Figura 2.2. Quantidade de artigos dos 10 países que mais publica-

ram, de acordo com o levantamento bibliográfico com
os termos “microalgae” e “heterotrophic” (1978 e 2011).
Com a mineração textual, é possível verificar quais as rela-

ções entre as publicações dos diferentes países, autores ou insti-
tuições. Com base nos dados, foram feitas análises estatísticas de
correlação. No caso dos países, por exemplo, é possível verificar
a interação não apenas considerando a quantidade de trabalhos
publicados juntos, mas a representatividade desta quantidade
frente ao conjunto global de publicações de cada país. Dessa
maneira, é possível mapear as relações de trabalho. A Figura 2.4
apresenta o mapa de correlações de publicações dos 20 princi-
pais países de acordo com o levantamento realizado.

u nt d de de
u c es
1
12
10
0
1991 199 1997 2000 200 2006 2009 2012
nos
2 2
Figura 2.3. Evolução das publicações dos EUA e China entre 1991 e
2012, de acordo com o levantamento bibliográfico com
os termos “microalgae” e “heterotrophic”.
Analisando-se a Figura 2.4, nota-se que os EUA apresen-

tam forte correlação com México e Canadá, provavelmente
pela proximidade geográfica. Secundariamente, o EUA tem
correlação com Holanda, China e Suíça. A sinergia entre alguns
países europeus também pode ser percebida, como é o caso da
Suécia, Reino Unido e Alemanha. Em relação ao Brasil, nota-se
que o país encontra-se isolado em termos de publicação sobre
este tema, o que pode ser prejudicial para a evolução nacional
destas pesquisas.

Figura 2.4. Mapa das correlações entre os 20 países que mais pu-
blicam sobre os termos “microalgae” e “heterotrophic”.
Quanto mais forte o tracejado, maior a correlação en-
tre os países.
2.3.3 Principais institutos e pesquisadores

Verificou-se também quais eram as instituições que mais
publicam sobre o tema. Destaca-se que entre as cinco princi-
pais, duas são chinesas: Universidade de Hong Kong e Acade-
mia Chinesa de Ciências. Nos EUA destaca-se a Universidade

de Maryland, porém diferente da China, observa-se que as pes-

quisas norte-americanas encontram-se mais difusas em vários
institutos. A Figura 2.5 apresenta as publicações destas cinco
principais instituições ao longo dos anos, a partir de 1990.
rt os
18
16
12
10
nos
Figura 2.5. Quantidade de publicações das principais instituições,

de acordo com o levantamento bibliográfico com os ter-
mos “microalgae” e “heterotrophic”.
Em relação aos autores, o que mais publica sobre o cultivo

heterotrófico de microalgas é Feng Chen, do Departamento de
Botânica da Universidade de Hong Kong. Chen iniciou suas
publicações em 1991 e, desde então, tem mantido certa cons-
tância, resultando em um total de 40 artigos sobre microalgas,
a maioria com foco principal em cultivo heterotrófico e mixo-

trófico. Dentre os artigos mais citados sobre microalgas e for-

mas de cultivo heterotrófico encontram-se trabalhos de Chen
como: “High cell density culture of microalgae in heterotrophic
growth” (CHEN, 1996) e “Biodiesel production by microalgal bio-
technology” (HUANG; GUAN HUA; CHEN; FENG et al., 2010),
tornando-o uma referência no tema. Outros autores chineses
que vem se destacando no estudo do cultivo heterotrófico e/ou
mixotrófico de microalgas são: Y. Jiang, Z. Y. Wen, Xiufeng Li,
Qingyu Wu, Han Xu e Xiaoling Miao.
Entre os autores que desenvolvem pesquisas nos EUA,
pode-se destacar: Roger Ruan, Luz E. de-Bashan, Yoav Bashan,
Yanna Liang, Nicolas Sarkany, R. W. Barclay, Paul Chen.
A Figura 2.6 apresenta o mapa de relações entre os 20
principais autores de acordo com o levantamento feito. Já a
Figura 2.7 apresenta a correlação entre estes autores.
Figura 2.6. Mapa que representa as interações entre os 20 autores

que mais publicam sobre o cultivo heterotrófico de mi-
croalgas.

Figura 2.7. Mapa das correlações entre os 20 autores que mais pu-
blicam sobre o cultivo heterotrófico de microalgas.
Quanto mais forte o tracejado, maior a correlação entre
os países.
Pode-se observar claramente que há três grupos de autores

que publicam com frequência em conjunto, isto pode ser perce-
bido porque o grau de correlação entre eles foi superior a 0,5;
ou seja, mais de 50% dos trabalhos destes autores são publica-

dos em conjunto nestes grupos (Figura 2.7). Os demais auto-

res, embora apresentem publicações em conjunto, a correlação
estatística entre eles é baixa. Devido à sua representatividade,
a correlação de F. Chen com outros autores foi baixa (entre
0,25 e 0,5, em uma escala com máximo de 1); porém, pode-se
observar a interação deste autor com outros como: R. Johns, Y.
Jiang e Z. Y. Wen.
2.3.4 Principais categorias de revistas

As revistas científicas são classificadas em categorias, de
acordo como os temas mais comuns dos artigos que elas publi-
cam. Com base nestas áreas de publicação, procurou-se fazer
uma análise dos artigos levantados. Destaca-se que algumas
revistas são classificadas em mais de uma categoria, por exem-
plo, uma revista pode ser classificada como da área de biotec-
nologia e, ao mesmo tempo, também da categoria das enge-
nharias. Além disso, para facilitar a análise dos dados, algumas
categorias de publicações foram unidas, por exemplo: “Biolo-
gia marinha e aquática”, “Oceanografia” e “Pesquisas Aquáti-
cas” foram unidas em uma só categoria. A Figura 2.8 apresenta
a distribuição dos artigos levantados de acordo com as catego-
rias das revistas, entre 1990 e 2012 (primeiro semestre).
Analisando-se a Figura 2.8, percebe-se que a área relacio-
nada à Biologia Aquática manteve-se em destaque ao longo dos
anos, o que reflete a história das pesquisas com microalgas,
que teve início entre pesquisadores desta área. Estes micror-
ganismos são utilizados como alimento na piscicultura e aqui-
cultura. Destaca-se que os trabalhos pioneiros dos EUA foram
publicados nesta categoria de revistas. Porém, entre 2010-2012
observou-se aumento dos artigos em revistas sobre Biotecnolo-
gia e Microbiologia Aplicada, sendo que esta categoria passou
a ser a mais representativa (PEREZ-GARCIA et al., 2011).

100
90
80
70
60
50
0
0
20
10
0
1990 199
1995 1999
2000 200
2005 2009
2010 2012
Figura 2.8. Quantidade relativa das publicações em relação às ca-

tegorias das revistas, entre 1990 e primeiro semestre
de 2012.
O estudo procedeu relacionando-se as categorias das

publicações com os principais países (Figura 2.9) e com os
principais autores (Figura 2.10). Analisando-se a Figura 2.9,
percebe-se que a China destaca-se na área de biotecnologia
e microbiologia aplicada, porém são escassos os trabalhos
chineses em categorias como Ecologia e Ciências Ambientais.
Já os EUA apresentam uma produção mais diversificada.
Em relação aos autores (Figura 2.10), percebe-se que F.
Chen é uma referência para questões biotecnológicas sobre o
assunto. Quando o enfoque é em Ecologia e Ciências Ambien-
tais, os autores de referência seriam G. Bourdier e C. Amblard,
que, juntamente com D. Bradkey Eyre, são também os que mais
apresentam artigo na categoria Biologia Marinha, Aquicultura
e Piscicultura.

corr nc
100
90
80
70
60
50
0
0
20
10
0
utores
Figura 2.9. Quantidade relativa das publicações em relação às cate-

gorias das revistas, entre 1990 e primeiro semestre de
2012: Categorias em relação aos países.
corr nc
100
90
80
70
60
50
0
0
20
10
0
utores
Figura 2.10. Quantidade relativa das publicações em relação às ca-

tegorias das revistas, entre 1990 e o primeiro semes-
tre de 2012: Categorias em relações aos autores.

2.3.5 Principais palavras-chave

Embora as categorias das revistas reflitam de certa forma
o escopo geral da pesquisa, as palavras-chaves tendem a repre-
sentar ainda melhor o estudo, pois foram escolhidas pelos pró-
prios autores. Desta maneira, a mineração textual no campo
das palavras-chaves pode resultar em informações importantes.
No entanto, esta análise requer um trabalho detalhado de lim-
peza e conhecimento sobre o assunto alvo da pesquisa, pois é
necessário analisar termos técnicos. Neste estudo, as palavras-
-chaves foram agrupadas nas seguintes categorias principais:
Taxonomia; Bioquímica e Genética; Ecologia; Microbiologia
básica de microalgas; Ambiental/Toxicologia (termos relacio-
nados ao tratamento de resíduos e toxicidade ambiental das
microalgas); Produtos microalgais; Meios de cultivo e técni-
cas de produção; Biologia Aquática. A Figura 2.11 apresenta
a porcentagem das palavras-chaves presentes nos artigos, nas
categorias citadas anteriormente.
Analisando-se a Figura 2.11, percebe-se que os artigos con-
centram-se mais nas pesquisas aplicadas, que visam a produção
das microalgas para obtenção de substâncias de interesse, com
destaque para: lipídios (poli-insaturados e para produção de
biodiesel) e pigmentos. As categorias relacionadas à produção
correspondem a 42% das palavras-chaves: 26% na categoria
“Meios de cultivo e técnicas de produção” e 16% em “Produ-
tos microalgais”. Destaca-se que os equipamentos, técnicas de
cultivo e separação de microalgas ainda são um gargalo tecno-
lógico-financeiro, principalmente para a produção em grande
escala. Desta maneira, esta área ainda necessita de desenvol-
vimento tecnológico e, portanto, de pesquisas; o que se reflete
na frequência recorrente com que estes temas são abordados
nos artigos.

5 5 1
1
26
11
11
16
Figura 2.11. Distribuição das palavras-chaves dos artigos pesquisa-

dos.
Em pesquisas e desenvolvimentos tecnológicos que envol-

vem microrganismos é essencial saber quais são as espécies
mais promissoras. Cerca de 25% dos artigos pesquisados inse-
riram palavras-chave referentes à taxonomia da microalga do
estudo. Foram citados 32 diferentes gêneros de microalgas,
sendo os mais comuns (ordem decrescente de ocorrência, as
porcentagens consideram apenas as citações dos nomes de
gêneros): Chlorella (47%), Cryphecodinium (10%); Nitzschia
(7%), Tetraselmis (5%) e Chlamydomonas (4%).
Vários autores citam o gênero Chlorella como um dos mais
promissores para o cultivo heterotrófico (ISLETEN-HOSOGLU

et al., 2012; PEREZ-GARCIA et al., 2011). Neste levantamento,

as espécies de Chlorella citadas nas palavras-chaves foram: C.
emersonii, C. minutissima, C. protothecoides, C. pyrenoidosa, C.
vulgaris, C. zofingiensis, C. saccharophila, C. sorokiniana. Sendo
que a espécie C. protothecoides foi a mais citada: correspondeu
a 20% das citações das palavras-chaves deste gênero, seguida
por C. vulgaris (13 % das citações do gênero). Miao e Wu (2006)
e Perez-Garcia et al. (2011) citam que essas espécies são as
mais promissoras para o cultivo heterotrófico de microalgas.
Os trabalhos de Xiong et al. (2008) alcançaram densidade
de 51,2 g L-1 no cultivo de C. protothecoides em meio à base de
extrato de levedura e glicose. Os trabalhos de Miao e Wu (2006)
indicam que a composição da biomassa de C. protothecoides
altera-se quando esta cresce em condições fotoautotrófica ou
heterotrófica (Tabela 2.1). Sendo que nesta última condição,
ela é mais promissora para aproveitamento da porção lipídica.
Outro destaque na análise da taxonomia é a citação repre-
sentativa da classe Bacillariophyta, a qual pertence as diatomá-
ceas (13% das palavras-chave relativas à taxonomia).
Tabela 2.1. Composição da biomassa de C. protothecoides em cultivo

fotoautotrófico e heterotrófico.
Componente (%) Cultivo fotoautotrófico Cultivo heterotrófico
Proteínas 52,64 (± 0,26) 10,28 (±0,10)
Lipídios 14,57 (±0,16) 55,20 (±0,28)
Carboidratos 10,62 (±0,14) 15,43 (±0,17)
Cinzas 6,36 (±0,05) 5,93 (±0,04)
Umidade 5,39 (± 0,04) 1,96 (±0,02)
Outros 10,42 (±0,65) 11,20 (±0,61)

Fonte: Miao e Wu (2006).

2.3.6 Principais artigos

A mineração textual também pode ser utilizada para se
estabelecer o ranking dos artigos, de acordo com a quantidade
de vezes que o mesmo é citado. Ressalta-se que os artigos mais
antigos tendem a serem os mais citados, por isto, a compara-
ção foi feita considerando cada ano isoladamente. A Tabela
2.2 apresenta os artigos mais citados, publicados entre 2008 e
2011. Observa-se que alguns destes artigos não tinham como
foco principal o cultivo heterotrófico, porém apresentam infor-
mações relevantes sobre esse tema.
Tabela 2.2. Artigos mais citados ranqueados durante a mineração

textual.
Título do artigo Ano Autores
Cultivation,
photobioreactor Chen, Chun-Yen; Yeh,
design and harvesting Kuei-Ling; Aisyah,
2011
of microalgae for Rifka; Lee, Duu-Jong;
biodiesel production: A Chang, Jo-Shu.
critical review
Huang, GuanHua;
Biodiesel production
Chen, Feng; Wei, Dong;
by microalgal 2010
Zhang, XueWu; Chen,
biotechnology
Gu.
Biomass and lipid

productivities of
Chorella vulgaris
Liang, Yanna; Sarkany,
under autotrophic, 2009
Nicolas; Cui, Yi.
heterotrophic and
mixotrophic growth
conditions
The technology of
2008 Eriksen, Niels Thomas
microalgal culturing

Além dos artigos ranqueados entre os mais citados, outras

publicações com foco principal no cultivo heterotrófico de
microalgas merecem destaque, por também focarem em pon-
tos relevantes para o desenvolvimento deste tema; a Tabela 2.3
apresenta informações sobre alguns destes artigos.
Tabela 2.3. Alguns artigos de referência sobre cultivo heterotrófico

de microalgas.
Título do artigo (primeiro autor,

Comentários
ano de publicação)
Optimization of carbon and

Dentre as fontes testadas,
nitrogen sources for biomass
as melhores foram glicose
and lipid production by
e peptona bacteriológica.
Chlorella saccharophila under
Comparando com o cultivo
heterotrophic conditions
autotrófico, o heterotrófico
and development of Nile red
resultou em concentração de
fluorescence based method for
biomassa 7,7 vezes maior e
quantification of its neutral lipid
porcentagem de lipídios 3 vezes
content (Muge Isleten-Hosoglu,
maior.
2012)17.
Estuda a mudança na
composição da biomassa em
função do meio de cultivo
The dynamics of heterotrophic
heterotrófico e do tempo de
algal cultures (H. de la Hoz
cultivo. Propõe um modelo para
Siegles, 2011)18.
cultivo fed-batch heterotrófico
da microalga Auxenochlorella
protothecoides.
Best practices in heterotrophic

Revisão geral sobre as
high-cell-density microalgal
microalgas que crescem em
processes: achievements,
condições heterotróficas e as
potential and possible
possibilidades de técnicas e
limitations (Fabian Bumbak,
meios para este cultivo.
2011)2.

Improvement of medium Otimiza um meio heterotrófico

composition for heterotrophic com a glicose como fonte de
cultivation of green microalgae, carbono. A concentração celular
Tetraselmis suecica, using final (28,88 g L-1) foi de 2 a 3
response surface methodology vezes maior do que o cultivo de
(Mojtaba Azma, 2011)19. fotoautotrófico de T. suecica.
Heterotrophic cultures of Revisão geral sobre microalgas
microalgae: Metabolism and heterotróficas e produtos de
potential products (Octavio interesse que podem ser obtidos
Perez-Garcia, 2011)4. nesta forma de cultivo.
Testa a influência da ureia,
extrato de levedura e nitrato de
Heterotrophic Culture of
potássio sobre o crescimento
Chlorella protothecoides in
de 4 cepas de Chlorella
Various Nitrogen Sources for
protothecoides. O cultivo é fed-
Lipid Production (Y. Shen,
bach e a maior concentração de
2010)20.
biomassa seca obtida foi 17 g
L-1.
High-density fermentation A máxima densidade conseguida
of microalga Chlorella no estudo foi 51,2 g L-1 (167
protothecoides in bioreactor for horas de cultivo) em um meio
microbio-diesel production (Wei a base de minerais, extrato de
Xiong, 2008)14. levedura e glicose.
O aumento de escala não
Large-scale biodiesel production
prejudicou significativamente
from microalga Chlorella
a produção de biomassa; em
protothecoides through
biorreator de 11.000 L alcançou
heterotrophic cultivation in
densidade de 14,2 g L-1. Estuda
bioreactors (XIUNFENG LI,
a transesterificação utilizando
2007).21
enzimas imobilizadas.
Heterotrophic high-cell-density O estudo visa à produção

fed-batch and continuous-flow de pigmentos em cultivo
cultures of Galdieria sulphuraria heterotrófico, obtendo
and production of phycocyanin resultados satisfatórios
(OLAV SUNE GRABERHOLT, (produtividade de ficocianina
2007)22. entre 0,5 a 0,9 g L-1 dia-1).

Cultiva em condições
heterotróficas a microalga
Biodiesel production from Chlorella protothecoides e
heterotrophic microalgal oil compara formas de obtenção do
(XIAOLING MIAO, 2006)13. biodiesel a partir da biomassa,
bem como as características
finais deste biocombustível.
Testa um meio a base de

High quality biodiesel
hidrolisado de milho, para
production from a microalga
o cultivo heterotrófico de C.
Chlorella protothecoides by
protothecoides, a fim baratear os
heterotrophic growth in
custos. Estuda o biodiesel obtido
fermenters (HAN XU, 2006)23.
do processo.
Kinetic and stoichiometric

relationships of the energy O estudo apresenta informações
and carbono metabolismo relevantes sobre o metabolismo
in the culture of Microalgae e a fisiologia das microalgas nas
(KATARZYNA CHOJNACKA, diferentes formas de cultivo.
2004)1.
Revisão com várias informações

sobre o cultivo e as
High cell density culture of
características de microalgas. É
microalgae in heterotrophic
o primeiro artigo de Chen que
growth (FENG CHEN, 1996)10.
ganhou destaque em termos de
quantidade de citações.
Heterotrophic production of
O foco é a produção de ômega-3
long-chain omega-3-fatty-
com microrganismos, com
acids utilizing agae and algae-
destaque para as microalgas
like microorganisms (W. R.
heterotróficas.
BARCLAY, 1994)24.

A mineração textual é uma importante metodologia para
se fazer um panorama geral sobre as publicações em determi-
nado tema. Neste estudo, esta metodologia permitiu observar a
evolução das publicações sobre cultivo heterotrófico ao longo
dos anos. Percebeu-se que a quantidade de publicações vem
aumentando com o tempo, caracterizando o tema como emer-
gente.
Os principais países que publicam sobre o cultivo hetero-
trófico de microalgas são EUA e China, sendo que esta iniciou
suas pesquisas mais tardiamente, porém, conta com o autor
que mais publica sobre o tema: Feng Chen, da Universidade de
Honk Kong. As publicações chinesas sobre o cultivo heterotró-
fico concentram-se nas seguintes áreas: Biotecnologia e Micro-
biologia Aplicada (33,4%) e Microbiologia e Biologia Molecular
(18,6%). Já os EUA apresenta uma maior diversificação quanto
aos campos de publicação sobre este tema, destacando-se nas
seguintes categorias: Biologia marinha, aquática e piscicultura
(42,9%), Ecologia e Ciências Ambientais (20,1%) e Biotecnolo-
gia e Microbiologia Aplicada (10,7%).
Os principais gêneros de microalgas citados nas palavras-
-chaves dos artigos são Chlorela, Cryphecodinium, Nitzschia,
Tetraselmis e Chlamydomonas. Entre as espécies, as que mais
constaram nas publicações foram Chlorela protothecoides e C.
vulgaris; as quais vem se mostrando promissoras para o cultivo
heterotrófico.
Por ser uma tecnologia emergente, percebe-se que o cul-
tivo heterotrófico ainda necessita de vários estudos e desenvol-
vimento tecnológico. No entanto, esta área vem se mostrando
promissora, sendo que há trabalhos que citam sua aplicabi-
lidade para produção de vários compostos. Percebe-se que é
cedo para pensar na viabilidade econômica do processo, pois
ainda não se tem toda a tecnologia desenvolvida; porém, como
o cultivo heterotrófico de outros microrganismos já é bem

desenvolvido, a incorporação destas tecnologias já maduras

pode contribuir para a aplicabilidade desta forma de cultivo
de microalgas.
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CAPÍTULO 3
VANTAGENS E DESAFIOS
DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL
DE MICROALGAS
Lisandra Ferreira de Lima

Lucas Alves Maroubo
Admilson Lopes Vieira

Introdução
Pesquisas recentes têm focado no desenvolvimento de tec-
nologias para a produção de biodiesel, um combustível biode-
gradável derivado de biomassa, utilizado para substituir parcial
ou totalmente o diesel, por motivos econômicos e ambientais.
Uma das principais vantagens da substituição do diesel conven-
cional pelo biodiesel é a redução considerável na emissão de
poluentes atmosféricos ao meio ambiente (FERRERO, 2011).
O biodiesel pode ser produzido a partir de diversas maté-
rias-primas, incluindo gorduras animais, óleos vegetais, ou
mesmo óleos residuais de frituras e graxas de alta acidez.
Entretanto, do ponto de vista econômico, devem ser adotados
alguns critérios para a seleção da matéria-prima, uma vez que
a mesma representa aproximadamente 75% do custo total da
produção do biodiesel (AHMAD, 2011a).
Estes critérios de seleção se baseiam nos seguintes aspec-
tos: teor de lipídio por área cultivada; período de cultivo da
espécie; existência de um balanço energético favorável; preço
da matéria-prima compatível com a necessidade de fornecer
biodiesel a preços competitivos; possibilidade de aproveita-
mento do subproduto da extração do óleo, principalmente para
a alimentação humana ou animal; e atendimento às especifi-
cações de qualidade do produto final (TEIXEIRA; MORALES,
2006).
Atualmente, no Brasil, a principal matéria-prima para a
produção de biodiesel é o óleo de soja, conforme mostrado
na Figura 3.1, com dados extraídos da página 19 do Boletim
Mensal dos Combustíveis Renováveis, mês de fevereiro/2014
(BRASIL, 2014a).
A partir de um ponto de vista socioeconômico e ambiental,
novos estudos para produção de biodiesel têm incluído tecno-
logias que evitem a utilização de terras para o cultivo da maté-
ria-prima, com intuito de eliminar o conflito existente com o
setor alimentício. Um exemplo que se enquadra neste contexto

é o aproveitamento da biomassa proveniente de determinadas

espécies de microalgas, constituídas por grande quantidade de
lipídios que servem como insumo para a produção de biodiesel
(FERRERO, 2011).
2 9
20 5
Fonte: Baseado nos dados de Brasil (2014a).
Figura 3.1. Participação das matérias-primas utilizadas na produção

de biodiesel no Brasil em 2013 (acumulado até novem-
bro).
Todas as células vegetais e consequentemente, as células

de microalgas apresentam lipídios na sua composição (RICH-
MOND; HU, 2013). É certo que nem todas as microalgas são
capazes de produzir lipídios em quantidades competitivas às
culturas tradicionais de extração de óleo. No entanto, algu-
mas estirpes de microalgas chegam a possuir 75% de lipídios
em sua composição, valor muito superior à soja, que alcança,
em média, 20% de concentração mássica de lipídios no grão
(CAVALCANTE et al., 2011). A produção de biodiesel a partir
de microalgas, apesar de incipiente, possui numerosas vanta-
gens sobre os cultivos clássicos, dentre as quais se destacam:

a) Muitas espécies de microalgas apresentam altas con-

centrações de lipídios em suas estruturas. Comumen-
te os níveis de lipídios nestas microalgas estão entre
20 a 50% da biomassa seca (CHISTI, 2007; HU et al.,
2008), podendo alcançar 75%, dependendo da espécie
e das condições de cultivo (MATA; MARTINS; CAETA-
NO, 2010);
b) O cultivo de microalgas não participa do impasse en-
tre segurança alimentar e energética, por não ser uma
forma convencional de alimentação como a soja e a
canola, por exemplo, e não competirem pelo solo de
agriculturas tradicionais (DEFANTI; SIQUEIRA; LI-
NHARES, 2010);
c) Devido a estes dois fatores anteriormente citados, há
possibilidade de produção de 3 a 10 vezes mais ener-
gia por hectare, uma vez que existe uma relação favo-
rável entre a área agricultável e a composição lipídica
da biomassa (DEMIRBAS, 2010);
d) As microalgas apresentam-se enorme diversidade eco-
lógica, filogenética, morfológica, genética e metabóli-
ca, o que permite a seleção de estirpes mais adequadas
a determinadas condições, locais de cultivo e sistemas
de colheita (DISMUKES et al., 2008), sendo capazes
de se adaptar a diversos ambientes, podendo assumir
vários tipos de metabolismo em resposta às mudanças
das condições ambientais (MATA; MARTINS; CAETA-
NO, 2010), com algumas espécies capazes de crescer
em água marinha ou salobra e até em resíduos agroin-
dustriais e sanitários (DERNER et al., 2006; DEFANTI;
SIQUEIRA; LINHARES, 2010; ARCEO, 2012);
e) As microalgas têm crescimento contínuo e apesar das
restrições climáticas ou estacionais a que estão sub-
metidas, em sistemas fechados, parâmetros como tem-
peratura e incidência luminosa podem ser controlados

(FERRERO, 2011; OSHE et al., 2007);

f) O cultivo de microalgas não exige aplicação de herbi-
cidas ou pesticidas (ARCEO, 2012);
g) A atividade fotossintética e a capacidade de fixação de
dióxido de carbono das microalgas são inúmeras vezes
superiores as das plantas terrestres (SCRAGG et al.,
2002; DEMIRBAS, 2010). Segundo Arceo (2012), as
microalgas têm capacidade de absorver até 15 vezes
mais CO2 que as florestas; e,
h) Após a extração lipídica para produção de biodiesel,
a biomassa residual de microalgas pode ser utilizada
para a produção de coprodutos, inclusive outras for-
mas de combustíveis, assunto a ser tratado posterior-
mente.
Mesmo com tantos pontos favoráveis ao aproveitamento

da biomassa microalgal para a produção de biodiesel, desa-
fios operacionais ainda devem ser vencidos de forma a tornar
o processo mais competitivo economicamente. Operações de
colheita da microalga e de extração do óleo ainda não estão
totalmente elucidados e provocam um acréscimo considerável
ao custo final do produto. Neste capítulo serão apresentadas as
potencialidades da microalga como matéria prima e as etapas
de obtenção dos lipídios oriundos das microalgas disponíveis
à produção de biodiesel, visto que após a obtenção do óleo, o
processo segue caminho semelhante ao processo produtivo de
outras matérias primas já estabelecidas, como a soja. Conjun-
tamente, uma visão macroscópica dos custos do processo será
apresentada, como ferramenta inicial decisória das operações
que podem ser utilizadas no processo.

3.1 Processo de Produção de Biodiesel a partir

de Microalgas
O processo de produção de biodiesel a partir de microal-
gas pode ser seccionado em várias etapas. No modelo proposto
(Figura 3.2), inicia-se com a seleção das espécies de microal-
gas e a implementação do sistema de cultivo microalgal. Em
seguida, após o crescimento da cultura microalgal, a biomassa
é colhida e processada para a extração do óleo que, através de
reação química, produzirá o biodiesel (CAROLINO, 2011).
Fonte: Adaptado de Mata, Martins e Caetano (2010).
Figura 3.2. Etapas do processo de produção de biodiesel a partir de

microalgas.

3.1.1 Seleção de local e da microalga

Antes de avaliar as otimizações relacionadas ao cultivo é
preciso selecionar a espécie de microalga a ser utilizada e onde
ela será cultivada.
Estas escolhas, quando o objetivo principal é a produção
de biodiesel, devem ser pautadas tanto sobre aspectos econô-
micos quanto sobre aspectos biológicos (ou metabólicos).
Para a seleção da estirpe a ser utilizada, os aspectos eco-
nômicos relevantes são: a disponibilidade da cepa da espécie
desejada (facilidade de obtenção), os custos de aquisição da
cepa e de manutenção do cultivo (meios de cultivo, condições
de cultivo, etc.).
Os aspectos biológicos (ou metabólicos) que devem ser
analisados simultaneamente e com bastante atenção, uma vez
que interferem diretamente sobre os custos de produção, são:
• Exigência nutricional da cepa, que deve ser capaz de

crescer e se desenvolver em meios de cultivo de baixo
custo;
• Resistência da espécie frente a fatores físicos e quími-
cos, como por exemplo, tensões de cisalhamento e
stress químico, além de fácil adaptabilidade ao meio;
• Produtividade de biomassa, que indica a taxa de ganho
de massa total de microalgas em um determinado
volume sob certo período (massa/(volume*tempo));
• Conteúdo lipídico (ou teor lipídico), que indica o
percentual de lipídios presentes na biomassa seca de
microalgas (% em peso seco);
• Produtividade lipídica, que indica a taxa de ganho de
massa lipídica em um determinado volume sob certo
período (massa/(volume*tempo));
• Composição lipídica, que indica o percentual de cada
ácido graxo presente na biomassa microalgal em rela-
ção aos ácidos graxos totais desta mesma biomassa

(%); e,
• Genética do material que deve se manter estável e
com características conservadas mesmo após sucessi-
vas produções ou longos períodos de armazenamento.
As microalgas podem ser cultivadas a partir de uma grande

variedade de métodos, desde os mais estritamente controlados,
como os laboratoriais, até os menos previsíveis, como os tan-
ques ao ar livre. Portanto, o cultivo de microalgas pode ser
executado em diferentes sistemas, com volumes e característi-
cas diversas. É evidente que quanto maior o controle, mais efi-
ciente é o processo, no entanto, mais oneroso também, devendo
existir um ponto ótimo entre eficiência e custos operacionais.
3.1.2 Técnicas de cultivo

Os sistemas abertos são mais simples e com menor custo
de instalação, podendo variar desde as lagoas sem nenhum
aparato mecânico que facilite a mistura até racewayponds (tan-
ques de recirculação a céu aberto) e o sistema turfscrubber1.
Estes sistemas podem ser construídos de materiais acessíveis
como PVC (cloreto de polivinila) e tem como restrição a pro-
fundidade, pois o sistema deve permitir a penetração da luz em
todo seu volume. Este fato limita os cálculos de produtividade
por volume, sendo melhores expressos por área (BENEMANN;
OSWALD, 1996).
Dentre os sistemas fechados, os fotobiorreatores se sobres-
saem como principal sistema de cultivo microalgal em maio-
res escalas (BJERK, 2012). Chama-se fotobiorreator um reator
transparente (vidro ou plástico) que pode ter inúmeras geo-
metrias (BITOG et al., 2011; TAMBURIC et al., 2011), sendo
a tubular a mais convencional, com a disposição planejada de
1“Consiste na utilização de uma comunidade de espécies de algas filamentosas,
bactérias, fungos entre outras associadas, que se desenvolvem sobre uma tela por
onde flui uma solução com excesso de nutrientes”(BJERK, 2012).

forma a maximizar a exposição da biomassa à luz. Sua prin-

cipal característica é o controle de quase todos os parâmetros
bióticos e abióticos do cultivo de microalgas tais como pH,
temperatura, velocidade de agitação e aeração.
Do ponto de vista operacional, diversas literaturas apre-
sentam comparações entre sistemas abertos e fechados para
cultivo de microalgas. A Tabela 3.1 apresenta uma compilação
destas comparações:
Tabela 3.1. Comparativo entre sistemas fechados e abertos para o

cultivo de microalgas.
Sistemas fechados Sistemas abertos

Parâmetro
(fotobiorreatores) (tanques)
Crescimento 2 a 4 semanas 6 a 8 semanas
Controle da
Fácil Difícil
contaminação
Risco de contaminação Reduzido Alto
Esterilidade Possível Nenhuma
Ação de chuvas Insignificante Afeta a produção
Controle do processo Fácil Difícil
Controle das espécies Fácil Difícil
Mistura Uniforme Muito baixa
Batelada ou Batelada ou
Regime operacional
semicontínuo semicontínuo
Depende da Depende da
Espaço requerido
produtividade produtividade
Razão área/volume Alta (20-200 m-1) Baixa (5-10 m-1)

Densidade
populacional (células Alta Baixa
microalgais)
Investimento Alto Baixo
Tanques <
Custo operacional 3 a 10 vezes mais caro
Fotobiorreatores
Reprodutividade Fácil Difícil
Eficiência de utilização
Alta Baixa
da luz
Controle da Temperatura mais

Difícil
temperatura uniforme
3 a 5 vezes mais
Produtividade Baixa
produtivo
Depende da
refrigeração- mas é
Depende da
Perda de água maior
refrigeração
Acentuada por
evaporação
Tensão hidrodinâmica
Baixa a Alta Muito baixa
nas microalgas
Evaporação em
Baixo Alto
crescimento médio
Controle de
Alto Baixo
transferência gasosa
Depende do pH, (Maior) depender do

Perda de CO2
alcalinidade, etc. pH, alcalinidade, etc.
Tanques <
Inibição por O2 Possível
Fotobiorreatores
Concentração da Tanques <

3 a 5 vezes maior
biomassa Fotobiorreatores

Qualidade da biomassa Alta Baixa
Ampliação da escala Difícil Difícil

Fonte: (ARCEO, 2012; DEMIRBAS, 2010; MATA et al., 2010)
Um tópico que não consta no fluxograma apresentado na

Figura 3.2, mas que vale a pena ser mencionado é a foto-con-
versão máxima da biomassa. Este fator promove a compreen-
são sobre o desenvolvimento da microalga e dos fatores termo-
dinâmicos que limitam seu crescimento. Este item é relevante,
pois facilita o entendimento da maior eficiência do sistema
fechado ao aberto.
A produção da biomassa microalgal é resultado direto da
foto-conversão, ou seja, respeitando a primeira lei da termodi-
nâmica, há uma transformação química da energia luminosa
que incide sobre o organismo em biomassa, fotossíntese. Neste
sentido, a produtividade de biomassa pode apresentar grande
variabilidade, principalmente em função das diferentes locali-
dades do globo onde se deseja realizar o cultivo da microalga.
De acordo com Weyer et al. (2010), a eficiência máxima
teórica da foto-conversão em qualquer organismo fotossinteti-
zante é 26,7% de toda radiação solar utilizável pela fotossín-
tese (PAR) que, por sua vez, corresponde, em média, a 43% da
radiação solar que chega à superfície do planeta. No mesmo
trabalho, Weyer et al. (2010) propõem a utilização de valo-
res realísticos de eficiência para a transmissão e absorção de
fótons (95% e 50%, respectivamente) e para a eficiência de
transformação em biomassa (50%), resultando numa eficiência
de foto-conversão máxima com valor 6,3% do PAR.
Zemke, Wood, Dye (2010) reportam que a eficiência ter-
modinâmica para foto-conversão de microalgas à lipídios
(triacilgliceróis) é de 9%. Neste mesmo trabalho, os autores
enumeraram os principais fatores que influenciam na taxa de
conversão de luz solar em biomassa microalgal, por área e por
tempo, considerando a disponibilidade plena de nutrientes:
i) Densidade de energia fornecida pela luz (Ed);

ii) Eficiência na qual a luz solar é transmitida para as

microalgas ();
iii) Conteúdo energético das microalgas por unidade de
biomassa (Ee)
iv) Eficiência na qual as microalgas convertem a energia
luminosa em biomassa (Ec);
A taxa de produção de microalgas pode ser descrita con-

forme indicado na Equação 1:
(Equação 1)
Onde:
• Pa = taxa de produção de biomassa por área por tempo
(kg/m2.d);
• Ed = densidade de energia fornecida pela luz solar
(MJ/m2.d);
• PAR = porcentagem de radiação absorvida pelos
organismos fotossintetizantes em relação a toda radia-
ção solar que chega a superfície do planeta (%) – valor
assumido de 43%;
• = eficiência na qual a luz solar é transmitida para as
microalgas (%);
• Ec = eficiência na qual as microalgas convertem a
energia luminosa em biomassa (%);
• Ee = conteúdo energético por unidade de biomassa
(MJ/kg).
Segundo McGinnis (1997), a densidade de energia pela luz

solar (Ed) pode ser calculada com base na média de incidência
solar diária da região em estudo multiplicada pela quantidade
de horas correspondente a um dia (t), seguido de um fator de
conversão de unidades (fc) (Equação 2):

(Equação 2)
Onde:
• Ps = média da potência incidida sobre a superfície da
região (MW/m2);
• t = tempo de incidência (t = 1 dia = 24 h);
• fc = fator de conversão de unidades (fc = 1Wh =
0,0036 MJ).
Essa densidade será dependente prioritariamente da locali-

zação do cultivo da microalga, pois quanto maior for a incidên-
cia solar diária na região, maior será a quantidade de energia
fornecida à microalga.
O conteúdo energético por unidade de biomassa (Ee) pode
ser calculado a partir da composição celular e de seus respecti-
vos valores de Poder Calorífico Inferior (PCI).
O PCI, quantidade de energia liberada pela combustão
completa do material, quando os produtos estiverem na fase
vapor, pode ser calculado de inúmeras maneiras, dentre elas,
pela média ponderada do poder calorífico de cada constituinte.
Dentre os constituintes da biomassa podem-se considerar ape-
nas os lipídios, as proteínas e os carboidratos, pois são os com-
ponentes mais abundantes, compondo quase a totalidade da
matéria microalgal. O cálculo do conteúdo energético de cada
espécie pode ser realizado de acordo com a Equação 3:
(Equação 3)
Onde:
• L = porcentagem de lipídios presentes na biomassa
(%);
• PCIL = poder calorífico dos lipídios (MJ/kg);
• P = porcentagem de proteínas presentes na biomassa
(%);

• PCIP = poder calorífico das proteínas (MJ/kg);

• C = porcentagem de carboidratos presentes na
biomassa (%);
• PCIC = poder calorífico dos carboidratos (MJ/kg).
Segundo Azeredo (2012) o PCI dos lipídios, proteínas e

carboidratos são respectivamente: 37 MJ/kg, 23 MJ/kg e 16
MJ/kg. Baseado nestes valores é possível concluir que quanto
maior a produção lipídica ou menor produção de carboidratos,
menor será a taxa de produção de biomassa. Uma maneira sim-
ples de compreender esta relação é que o aumento de lipídios
ocorre quando o crescimento é suprimido, pois o carbono utili-
zado anteriormente para a síntese de proteínas pode agora ser
armazenado como lipídios (McGINNIS, 1997).
Eficiência na qual as microalgas convertem a energia lumi-
nosa em biomassa (Ec) possui valor teórico de 26,7% e valor
mínimo encontrado por Weyer et al. (2010) de 6,3%, mesmo
com a disponibilidade de nutrientes maximizada, o que mostra
que a variação na eficiência observada deve ocorrer em função
de outros fatores que influenciam a fotossíntese. Dentre estes
fatores, destacam-se: as técnicas, as condições e os meios de
cultivo.
3.3 Cultivo de Microalgas

Segundo Derner et al. (2006), o crescimento de uma popu-
lação de microalgas é resultado de uma interação entre fatores
biológicos, físicos e químicos. Os fatores biológicos se relacio-
nam às taxas metabólicas da espécie cultivada, o tamanho das
células e a possível influência de outros organismos sobre o
desenvolvimento microalgal (OSHE et al., 2007).
Quanto aos fatores físicos, a luz e a temperatura estão rela-
cionadas diretamente com o crescimento microalgal. A maioria
das espécies de microalgas são fotoautotróficas, ou seja, reti-
ram energia da luz solar e utilizam o carbono inorgânico (CO2)

necessário para a construção de sua biomassa através da fotos-

síntese (DERNER et al., 2006; OSHE et al., 2007). As caracte-
rísticas das principais formas de metabolismo das microalgas
estão apresentadas na Tabela 3.2.
Tabela 3.2. Características das diferentes formas de metabolismo

das microalgas.
Metabolismo Fonte de energia Fonte de carbono
Fotoautotrófico Luz Inorgânico
Heterotrófico Composto orgânico Orgânico
Luz ou composto
Mixotrófico Inorgânico ou orgânico
orgânico
Fotoheterotrófico Luz Orgânico

Fonte: Adaptado de Chen et al. (2011).
Devido à fundamental importância da luz para a grande

maioria das microalgas, sua manutenção deve ser efetivada
com cautela, de modo a encontrar um ponto ótimo de inten-
sidade luminosa que proporcione a maior taxa fotossintética.
A temperatura tem o seu principal efeito sobre os proces-
sos enzimáticos. A maioria das espécies de microalgas sobre-
vive numa ampla faixa térmica, porém, só há incremento na
síntese orgânica em determinada faixa térmica, considerada a
faixa ótima de crescimento, faixa esta específica a cada espé-
cie microalgal. Ohse et al. (2007) afirmam que a aeração, o
tamanho e a forma dos tanques também podem influenciar no
desenvolvimento das microalgas.
Do ponto de vista químico, a disponibilidade de nutrientes,
a salinidade e o pH interferem no crescimento das microalgas
(DERNER et al., 2006; OSHE et al., 2007). Para as microalgas
apresentarem ótimo crescimento são necessários macronu-
trientes (C, N, O, H, Ca, Mg, S e K) e micronutrientes (Mn,

Mo, Fe, Co, Cu, Zn, Se e B), além da adição ao meio de cultura
de vitaminas ou substâncias específicas que algumas espécies
necessitam. Os nutrientes limitantes para as microalgas são:
nitrogênio e fósforo, embora o carbono seja considerado o
macronutriente mais importante (OSHE et al., 2007).
Por se tratar de um amplo espectro de espécies, as condi-
ções ótimas de desenvolvimento das microalgas variam muito.
Cotteau (1996) apresenta um conjunto de parâmetros com
faixas generalizadas de algumas condições para o cultivo de
microalgas (Tabela 3.3). Estes valores são válidos apenas como
estimativa inicial, visto que, trabalhos mais recentes apresen-
tam uma faixa mais ampla para temperatura, como Ras, Steyer,
Bernard (2013) que apresentaram a possibilidade de cultivo de
17 diferentes espécies de Chlorella em uma faixa de tempera-
tura de 26°C a 36°C.
Tabela 3.3. Configuração generalizada das condições para o cultivo

de microalgas.
Parâmetros Faixa de alcance Faixa ótima
Temperatura (°C) 16-27 18-24
Salinidade (g L-1) 12-40 20-24
1.000-10.000
Intensidade de luz
2.500-5.000
(lux)
16:8 (mínimo)
Fotoperíodo (claro: -
escuro, horas) -
24:0 (máximo)
pH 7-9 8,2-8,7
*depende do volume e da densidade Fonte: Cotteau (1996).
Ao analisar o conteúdo lipídico (ou teor lipídico) de muitas

espécies de microalgas, é possível comprovar sua verdadeira

aptidão como matéria para a produção de biodiesel, uma vez

que sua produtividade lipídica pode ser dezenas de vezes supe-
rior a das culturas vegetais. Entretanto, Chen et al. (2011) des-
tacam que o teor de lipídios não é o único fator que determina
a capacidade de produção de óleo de microalgas. Segundo os
autores, o teor de lipídios e a produção de biomassa precisam
ser considerados simultaneamente. Assim, a produtividade
lipídica, que representa o efeito combinado destes dois fatores
mencionados é o índice de desempenho mais adequado para
indicar a capacidade produtiva de lipídios por uma microalga.
A alta produtividade lipídica das microalgas (Figura 3.3)
pode ser comprovada pelo tempo de duplicação, bem como pela
área necessária para a produção. O tempo médio de duplicação
de um cultivo de microalgas (24 horas) é significativamente
inferior ao correspondente para os cultivos vegetais clássicos
(FERRERO, 2011), durante a fase exponencial de crescimento,
o tempo de duplicação da biomassa é de aproximadamente
3,5 horas dependendo da espécie. O tempo necessário para a
colheita de microalga é de 9 a 18 dias (LEMOS, 2012) enquanto
que as culturas vegetais geralmente levam mais que 100 dias
para chegar ao ponto de colheita (FIOREZE, 2013).
rodut d de dc u tur s
70000
58700
no
60000
50000
0000
dc
0000
rodut d de
20000
10000 5 66
97 6 6 172
0
Fonte: Adaptado de Chisti (2007).
Figura 3.3. Produtividade lipídica de diferentes culturas vegetais.

A Tabela 3.4 apresenta a produtividade e teor lipídico de

diversas espécies de microalgas submetidas a diferentes condi-
ções de cultivo. Ao analisar a Tabela 3.4, pode-se constatar que
as espécies Chlorella sp., Neochloris oleoabundans e Nannochloris
sp. são as que apresentam maiores produtividades lipídicas no
cultivo fotoautotrófico, com valores máximos de 178,8, 133,0
e 109,3 mg L-1 d-1, respectivamente. Contudo, a espécie que
mais se destaca é a Chlorella protothecoides, quando submetida
às condições de cultivo heterotrófico pela alta produtividade
lipídica (entre 1840,0 e 1881,3 mg L-1 d-1).
Estes valores não são absolutos, sendo conhecido desde
1949 o fato de que a composição química de uma microalga
pode variar em virtude de alterações em suas condições de cul-
tivo, como a Chlorella que obteve a sua composição química
variando de 58% de proteína e 4,5% de lipídio para 8,7% de
proteína e 86% de lipídio, por alterações na concentração de
dióxido de carbono do meio, tipo de atmosfera presente (aeró-
bia e anaeróbia), concentrações dos nutrientes minerais, varia-
ção na temperatura e na iluminação (SPOEHR; MILNER, 1949).
Muitas microalgas aumentam sensivelmente sua produção
de lipídios quando submetidas às condições de stress (McGIN-
NIS, 1997; WHITE et al., 2011). Este estado de stress pode ser
provocado por um desvio da salinidade ideal do meio, da luz,
da temperatura, ou no fornecimento de nutrientes. A deficiên-
cia de nitrogênio no meio é especialmente eficiente para esti-
mular a produção de lipídeos nas células (DENG et al., 2011).
Todavia, foi demonstrado que as mesmas condições de stress
que induzem a acumulação de lipídios também reduzem dras-
ticamente o crescimento.
Os lipídios compreendem um conjunto de substâncias quí-
micas que são caracterizadas pela sua alta solubilidade em
solventes orgânicos e baixa solubilidade em água. A natureza
física dos lipídios e sua consequente nomenclatura são coman-
dadas pelo comprimento da cadeia, pelo grau de insaturação e
pela distribuição dos radicais (ARCEO, 2012).
Estudos também mostraram que o acúmulo de lipídios
acontece principalmente sob a forma de lipídios neutros, sendo
estes mais adequados para a produção de biodiesel.

108
Tabela 3.4. Produtividade e teor lipídico de diferentes espécies de microalgas sob diferentes condições de
5 Livro Microalgas V2.indb 108

cultivo.
Produtividade de Produtividade
Espécies de Condições de Conteúdo lipídico
biomassa (g L-1 lipídica (mg L-1 Referência
microalgas cultivo (% peso seco)
d-1) d-1)
Chaetoceros Rodolfi et al.

Fotoautotrófico 0,07 33,6 21,8
muelleri (2009)
Chlorella Illman, Scragg e

Fotoautotrófico 0,03-0,05 29,0-63,0 8,1-49,9
emersonii Shales (2000)
Microalgas de Águas Continentais | Volume 2
Chlorella Cheng et al.

Heterotrófico 4,0-4,4 43,0-46,0 1840,0-1881,3
protothecoides (2009)
Chlorella Rodolfi et al.

sorokiniana (2009)
Chlorella sp. Fotoautotrófico 0,37-0,53 32,0-34,0 121,3-178,8 Chiu et al. (2008)
Illman, Scragg e
Chlorella vulgaris Fotoautotrófico 0,03-0,04 18,0-40,0 5,4-14,9
Shales (2000)
Liang, Sarkany e
Chlorella vulgaris Heterotrófico 0,08-0,15 23,0-36,0 27,0-35,0
Cui (2009)
30/07/2014 09:47:04
Liang, Sarkany e
Chlorella vulgaris Mixotrófico 0,09-0,25 21,0-34,0 22,0-54,0
Cui (2009)
Rodolfi et al.
Chlorococcum sp. Fotoautotrófico 0,28 19,03 53,7
(2009)
Dunaliella Takagi, Karseno e

Fotoautotrófico 0,10 60,6-67,8 60,6-69,8
tetriolecta Yoshida (2006)
Rodolfi et al.
Elipsoidion sp. Fotoautotrófico 0,17 27,4 47,3
(2009)
Rodolfi et al.
Isochrysis sp. Fotoautotrófico 0,14 27,4 37,8
(2009)
Monodus Rodolfi et al.

subterraneus (2009)
Takagi, Karseno e
Nannochloris sp. Fotoautotrófico 0,04-0,35 29,9-40,3 15,6-109,3
Yoshida (2006)
Nannochloropsis Rodolfi et al.

sp. (2009)
Neochloris
Fotoautotrófico 0,31-0,63 7,0-40,3 38,0-133,0 Li et al. (2008)
oleoabundans
109
30/07/2014 09:47:04
110
Rodolfi et al.
Pavlova lutheri Fotoautotrófico 0,14 35,5 50,2

(2009)
Rodolfi et al.
Pavlova salina Fotoautotrófico 0,16 30,9 49,4
(2009)
Phaedactylum Rodolfi et al.

tricornutum (2009)
Porphyridium Rodolfi et al.

cruentum (2009)
Scenedesmus Gouveia e
obliquus Oliveira (2009)
Scenedesmus Mandal e Mallick

Mixotrófico 0,10-0,51 6,6-11,8 11,6-58,6
obliquus (2009)
Scenedesmus Rodolfi et al.

quadriculata (2009)
Rodolfi et al.
Scenedesmus sp. Fotoautotrófico 0,26 21,1 53,9
(2009)
Skeletonema Rodolfi et al.

costatum (2009)
30/07/2014 09:47:04
Rodolfi et al.
Skeletonema sp. Fotoautotrófico 0,09 31,8 27,3
(2009)
Rodolfi et al.
Tetraselmis sp. Fotoautotrófico 0,30 14,7 43,4
(2009)
Tetraselmis Rodolfi et al.

suecica (2009)
Fonte: Adaptado de Chen et al. (2011).
111
30/07/2014 09:47:04
O óleo das microalgas é composto principalmente pela

mistura de ácidos graxos instaurados, embora também estejam
presentes os ácidos graxos saturados, porém em menor pro-
porção (BJERK, 2012), óleos estes com características físico-
-químicas similares aos de óleos vegetais (MIYAMOTO, 1997).
Segundo Arceo (2012), em algumas espécies, os ácidos
graxos poli-insaturados representam entre 25% e 60% dos lipí-
dios totais, como indicado na Tabela 3.5, que apresenta a com-
posição de ácidos graxos de algumas espécies de microalgas.
Esta considerável quantidade de ácidos graxos poli-insatura-
dos presente nas microalgas, facilita a oxidação do biodiesel
durante seu armazenamento, limitando assim sua utilização
(BRENNAN; OWENDE, 2010). Desta forma, torna-se preferível
a escolha de uma espécie de microalga com uma proporção
majoritária de ácidos graxos saturados, a fim de garantir um
produto de melhor qualidade (KNOTHE et al., 2006).
Neste sentido, pela análise da Tabela 3.5, verifica-se que
as espécies mais promissoras para a produção de biodiesel são:
Trichodesmium erythraeum, entre 27% e 50% dos ácidos graxos
totais presentes em cadeia saturada de 10 carbonos; Chlorella
sorokiniana, com 40% de ácidos graxos presentes em cadeia
de 16 carbonos; e Emiliania huxleyi, com 35% de ácidos graxos
presentes em cadeia de 14 carbonos.
É importante ressaltar que são necessários mais estudos
sobre a composição lipídica das espécies de microalgas. A
composição de muitas espécies ainda não é conhecida, sendo
importantes, pesquisas em trabalhos de prospecção e caracte-
rização.

Tabela 3.5. Composição (%) dos ácidos graxos totais de algumas espécies de microalgas.
Ácidos graxos
B.a
Haptophyceae
Cyanophyceae
Cryptophyceae
Chlorophyceae
Pinguiophyceae
Bacillariophyceae
Eustigmatophyceae
C.sp N.sp M.s C.s C.v P.i E.h I.g P.p G.c A.sp T.e H.b R.l
C10:0 27-50
C11:0 2-5
C14:0 32,0 23,6 6,9 2,3 35,1 23,1 18,7 22,0 29-34 7,21 2,0 18,0
C14:2 9-13
Saturados
C15:0 2,2 1,1 1,2
C16:0 5,0 9,2 19,9 20,2 40,0 18,0 9,1 5,1 14,0 3,7 4,4 11-17 13,3 13,1
C17:0 2,0
C18:0 0,6 2,1 1,0 1,1 1-2 2-6 2,2

113
30/07/2014 09:47:04
114
C16:1
5-7

ω5
C16:1
27,0 36,5 27,4 26,9 4,0 5,0 0,7 2,0 3,5 4,0 4,7 13,0 5,0
ω7
C16:1
3,6 1,0 36-39
ω9
C18:1ω7 5,9 1,0 1,0
Monoinsaturados
C18:1ω9 3,0 1,7 4,5 5,0 9,2 9,2 14,3 13,0 1,3 6,6 1-2 3-7 2,0 10,1
C18:1
1-4
ω13
C20:1 18,0
30/07/2014 09:47:04
C16:2
6,0 0,6 3,0 6,1
ω4
C16:2
2,0 0,9 11,0 12,0 1,0
ω7
C16:3 8,0 2,6 17,0 2,1
C18:2
3,5 2,0 36,0 43,0 9,3 2,1 5,0 1,8 3,9 1-2 2,2
ω6
C18:3
0,5 0,7 23,0 10,0 1,0 7,0 6-19 11,0 16,0
ω3
C18:3
0,9 1,0 0,6 7,0 1,1
ω6
C18:4
0,6 4,2 1,2 8,0 10,0 30,0 23,0
ω3
Poli-insaturados
C18:5
10,0
ω3
C20:4
4,1 58,9 2,9 5,5
ω6
C20:5
26,0 8,0 34,9 37,1 56,0 39,2 11,0 13,0
ω3
C22:5
1,0 13,3 1,0
ω3
C22:6
1,0 11,0 14,0
ω3
Fonte: Adaptado de Hu et al. (2008). Abreviação das espécies de microalgas: B.a., Biddulphia áurica (ORCUTT; PATTERSON, 1974); C.sp.
Chaetoceros sp. (RENAULD et al., 2002); N.sp., Nannochloropsis sp. (SUKENIK, 1999); M.s., Monodus subterraneus (COHEN, 1999); C.s.,
Chlorella sorokiniana (PATTERSON, 1970); C.v., Chlorella vulgaris (HARRIS et al., 1965); P.i., Parietochloris incise (KHOZIN-GOLDBERG;
COHEN, 2006); E.h., Emiliania huxleyi (VOLKMAN et al., 1981); I.g., Isochrysis galbana (VOLKMAN et al., 1981); P.p., Phaeonomonas parva
(KAWACHI et al., 2002); G.c., Glossomastrix chrysoplasta (KAWACHI et al., 2002); A.sp., Aphanocapsa sp. (KENYON, 1972); S.p., Spirulina
platensis (MUHLING et al., 2005); T.e., Trichodesmium erythraeum (PARKER et al., 1967); H.b., Hemiselmis brunescens (CHUECAS; RILEY,
1969); R. l., Rhodomonas lens (BEACH et al., 1970).
115
30/07/2014 09:47:04
3.3.1 Meios de cultivo

Segundo Oliveira (2009), há diversos meios de cultura que
fornecem quantidades apropriadas de nutrientes às microal-
gas. Para fins de produção microalgal em escala de laboratório
utilizam-se normalmente sais de pureza pró-análise (HALIM et
al., 2011), enquanto que em cultivos de grande escala os meios
podem ser preparados de fontes residuais e/ou comerciais de
composição nutricional conhecida.
De modo geral, tem sido constatado por diversos auto-
res que a limitação de nitrogênio e enxofre, em determina-
dos momentos do cultivo, influencia positivamente a síntese
lipídica em diversas espécies de microalgas, proporcionando
incremento do conteúdo de lipídios e ácidos graxos. Já a defi-
ciência de fósforo gera resultados controversos: aumento do
teor lipídico em algumas espécies e redução em outras (KHO-
ZIN-GOLDBERG et al., 2003; VERMA et al., 2010).
Lemos (2012) aponta que a proporção de nitrogênio:fósforo
ideal para Scenedesmus sp. é 16:1, o que permite que esta cul-
tura de microalgas produza carboidratos, triglicerídeos satu-
rados e lipídios neutros, além de reduzir o teor de ácidos gra-
xos poli-insaturados. Outro fator relevante narrado por Lemos
(2012) é que o aumento na porcentagem de lipídios totais nas
células de Scenedesmus sp ocorre na fase estacionária de cres-
cimento. Para diferentes gêneros de microalgas os teores lipí-
dicos são menores na fase exponencial de crescimento, devido
à alta demanda de energia, mas tendem a aumentar na fase
estacionária, quando as células passam a acumular reservas
energéticas devido à limitação de nutrientes no meio.
Os dados presentes na Tabela 3.6 mostram a quantidade
e o volume de biomassa necessários para a obtenção de um
quilograma de óleo extraído. A biomassa requerida para obten-
ção de uma dada quantidade de lipídios é função do teor lipí-
dico presente na biomassa, ao passo que o volume requerido
de cultivo para obtenção desta mesma quantidade de lipídios

depende da produtividade da biomassa. Assim, para efeito de

demonstração, foram realizados cálculos a fim de expressar a
quantidade de biomassa e o volume de cultivo requeridos para
a obtenção de um quilograma de lipídio por dia, considerando
três diferentes eficiências de recuperação de biomassa microal-
gal:
• Máxima possível (100%),

• A melhor eficiência de recuperação via floculação
encontrada em literatura (LEMOS, 2012) (96,8%) e,
• A melhor eficiência de recuperação via centrifugação
encontrada em literatura (91,7%).
Para tanto, foram levados em consideração os dados apre-

sentados na Tabela 3.4, sendo que, para os dados apresentados
em faixas de valores, foi utilizada uma média aritmética.

118
Tabela 3.6. Biomassa e volume de cultivo requeridos para a produção diária de 1 quilograma de lipídios

sob diferentes eficiências de recuperação de biomassa.
Biomassa requerida (kg/d) Volume requerido de cultivo (m³)
Espécies de Condições de Eficiência Eficiência Eficiência Eficiência

Eficiência de Eficiência de
microalgas cultivo máxima de de máxima de de
Centrifugação Centrifugação
recuperação Floculação recuperação Floculação
(91,7%) (91,7%)
(100%) (96,8%) (100%) (96,8%)
Botryococus
Fototrófico 4,81 4,97 5,24 160,26 165,55 174,76
braunii
Chaetoceros
Fototrófico 2,98 3,07 3,25 42,52 43,92 46,37
muelleri
Chlorella
Fototrófico 2,17 2,25 2,37 54,35 56,14 59,27
emersonii
Chlorella
Heterotrófico 2,25 2,32 2,45 0,54 0,55 0,58
protothecoides
Chlorella
Fototrófico 5,18 5,35 5,65 22,53 23,27 24,57
sorokiniana
Chlorella sp. Fototrófico 3,03 3,13 3,3 6,73 6,96 7,34
30/07/2014 09:47:04
Chlorella
Fototrófico 3,45 3,56 3,76 98,52 101,78 107,44
vulgaris
Chlorella
Heterotrófico 3,39 3,5 3,7 29,48 30,45 32,14
vulgaris
Chlorella
Mixotrófico 3,64 3,76 3,97 21,39 22,1 23,33
vulgaris
Chlorococcum
Fototrófico 5,25 5,43 5,73 18,77 19,39 20,47
sp.
Dunaliella
Fototrófico 1,56 1,61 1,7 15,58 16,09 16,99
tetriolecta
Elipsoidion sp. Fototrófico 3,65 3,77 3,98 21,47 22,18 23,41
Isochrysis sp. Fototrófico 3,65 3,77 3,98 26,07 26,93 28,43
Monodus
Fototrófico 6,21 6,42 6,77 32,69 33,77 35,65
subterraneus
Nannochloris sp. Fototrófico 2,85 2,94 3,11 8,63 8,92 9,41
Nannochloropsis
Fototrófico 2,8 2,89 3,05 16,48 17,02 17,97
sp.
119
30/07/2014 09:47:04
120
Neochloris

Fototrófico 4,23 4,37 4,61 4,5 4,65 4,91
oleoabundans
Pavlova lutheri Fototrófico 2,82 2,91 3,07 20,12 20,79 21,94
Pavlova salina Fototrófico 3,24 3,34 3,53 20,23 20,9 22,06
Phaedactylum
Fototrófico 5,35 5,52 5,83 22,28 23,02 24,3
tricornutum
Porphyridium
Fototrófico 10,53 10,87 11,48 28,45 29,39 31,02
cruentum
Scenedesmus
Fototrófico 5,65 5,84 6,16 62,77 64,85 68,46
obliquus
Scenedesmus
Mixotrófico 11,24 11,61 12,25 36,84 38,06 40,17
obliquus
Scenedesmus
Fototrófico 5,43 5,61 5,93 28,6 29,55 31,19
quadriculata
Scenedesmus sp. Fototrófico 4,74 4,9 5,17 18,23 18,83 19,88
Skeletonema
Fototrófico 4,74 4,9 5,17 59,24 61,2 64,6
costatum
30/07/2014 09:47:04
Skeletonema sp. Fototrófico 3,14 3,25 3,43 34,94 36,1 38,1
Spirulina
Fototrófico 24,39 25,2 26,6 116,14 119,98 126,66
maxima
Tetraselmis sp. Fototrófico 6,8 7,03 7,42 22,68 23,43 24,73
Tetraselmis
Fototrófico 7,75 8,01 8,45 27,69 28,6 30,19
suecica
Thalassiosira
Fototrófico 4,85 5,01 5,29 60,68 62,69 66,17
psedonana
121
30/07/2014 09:47:04
3.3.2 Colheita da biomassa microalgal

A colheita (Recuperação da Biomassa Microalgal) é a etapa
mais crítica, em termos energéticos e financeiros, para obten-
ção de biodiesel de microalgas. Pelo tamanho das células a
serem separadas e sua diluição, esta etapa pode corresponder
de 20 a 30% do custo total da produção da biomassa (MATA;
MARTINS; CAETANO, 2010).
A recuperação da biomassa, ou comumente conhecida
como colheita, consiste na remoção da biomassa microalgal
do meio de cultivo. De forma mais genérica consiste de opera-
ções de separação sólido-líquido, através de processos físicos,
químicos ou biológicos. Os métodos mais habituais de recu-
peração incluem os processos físicos, nos quais se destacam
a sedimentação, a centrifugação, a filtração e a ultrafiltração.
Por vezes, esses processos são otimizados com uma etapa pre-
liminar de processos químicos como a floculação, a coagulação
ou a flotação (CHEN et al., 2011).
Brennan e Owende (2010) dividem a colheita das microal-
gas em um processo de duas etapas:
1. colheita de grandes quantidades destinada à separa-

ção da biomassa a partir da suspensão, empregando
técnicas de floculação, flotação ou sedimentação por
gravidade;
2. espessamento, cujo objetivo é concentrar a pasta de
microalgas por meio de centrifugação, filtração ou
agregação ultrassônica.
A escolha da técnica de colheita é dependente dos recur-

sos operacionais e financeiros disponíveis, bem como das pro-
priedades das microalgas e do sistema de cultivo (densidade
celular, tamanho das partículas e qualidade dos produtos dese-
jados) (BRENNAN; OWENDE, 2010). Por exemplo, do ponto de
vista operacional, tanques ou lagoas de sedimentação são reco-

mendados em casos de recuperação da biomassa proveniente

de estações de tratamento de esgoto, ou seja, em larga escala,
quando o aproveitamento total da biomassa não se constitui
um dos principais objetivos do processo. Por outro lado, o uso
de centrífugas também pode recuperar grandes volumes de
biomassa se operado continuamente, apesar de seu custo mais
elevado (MATA; MARTINS; CAETANO, 2010).
Para Bjerk (2012), devido à variabilidade das caracterís-
ticas da biomassa microalgal, como tamanho, forma e mobili-
dade, é difícil selecionar uma única técnica de recuperação de
biomassa que possa vir a se tornar um método padrão para ser
adotado em escala industrial para todas as espécies. Azeredo
(2012) e Schenk et al. (2008) apontam que não há um método
de recuperação de biomassa adequado a todos os sistemas
de produção e, portanto, são necessárias avaliações tanto do
ponto de vista econômico quanto do técnico-operacional para
a seleção da tecnologia mais apropriada a cada caso. Contudo,
Chen et al. (2011) salientam que um método de colheita ideal
deve requerer o mínimo de produtos químicos e de energia,
e, se possível, facilitar a liberação de materiais intracelulares
para a coleta.
Pela impossibilidade de uma análise única de etapa de
colheita, será disponibilizada uma breve análise a respeito de
algumas das operações unitárias possíveis ao processo, como
um meio facilitador na escolha do método a ser empregado.
3.3.3 Sedimentação por gravidade

A sedimentação é um processo de separação física, na
qual as fases são separadas pela atuação da força gravitacional
ao meio. Assim sendo, praticamente não apresenta dispêndio
energético nem requer grande investimento operacional.
Equipamentos onde a sedimentação ocorre são conhecidos
como sedimentadores e consistem em tanques, normalmente

cilíndricos, visando facilitar a separação de substâncias parti-

culadas. Os sedimentadores podem ser classificados como cla-
rificadores, quando o produto de interesse é a fase mais diluída
e espessadores, quando o interesse está na fase mais concen-
trada (MCCABE et al., 1998).
A sedimentação para processos diluídos pode ser descrita
pela Lei de Stokes, que prediz que a velocidade de sedimenta-
ção é proporcional à diferença de densidade entre os objetos
esféricos e o meio líquido, e ao quadrado do diâmetro do objeto
esférico e inversamente proporcional à viscosidade dinâmica
do meio líquido (GEANKOPLIS, 1998) (Equação 4):
(Equação 4)
Onde:
• = velocidade de sedimentação das partículas (m s-2);
• = massa específica das partículas (kg m-3);
• = massa específica do líquido (kg m-3);
• = diâmetro das partículas (m);
• = aceleração da gravidade (m s-2);
• = viscosidade do líquido (Pa.s = 3 kg m-1s-1).
Diversos autores salientam que a sedimentação por si só

não é viável quando se visa à produção de biodiesel, conside-
rando a relação do tempo necessário de processamento versus
a eficiência de remoção de biomassa microalgal.
Segundo Silva (2013), o diâmetro da microalga Chlorella
vulgaris em condições normais de cultura é de aproximada-
mente 5 μm. Entretanto, em condições de deficiência nutri-
tiva, esta microalga pode formar pequenas colônias estáveis
a partir da agregação com mais sete células, adquirindo cerca
de 17 μm de diâmetro. Assim, para o cálculo das velocidades
de sedimentação das partículas na forma unicelular (Vu) e na

forma multicelular (Vm) utiliza-se a Lei de Stokes (Equação 4)

e a água em condições ambiente como meio líquido, sendo os
valores das variáveis descritos como:
• = massa específica da água a 20°C (998 kg m-3);

• = aceleração da gravidade (9,81 m s-2);
• = viscosidade da água a 20°C (1,003.10-3Pa.s =
1,003.10-3 kg m-1s-1).
• = massa específica da microalga Chlorella vulgaris
(1070 kg m-3) Edzwald (1993) apud Milledge e Heaven
(2013).
• = diâmetro da partícula na forma unicelular (5.10-6
m);
• = diâmetro da partícula na forma multicelular (17.10-
6
m).
As velocidades de sedimentação obtidas para os dois esta-

dos comportamentais das microalgas foram respectivamente:
O tempo de sedimentação para cada caso pode ser calcu-

lado a partir da altura da lâmina d’água no tanque e da veloci-
dade de sedimentação (Equação 5). É importante ressaltar que
estes cálculos foram simplificados para casos de lagoas abertas
e que estas sejam pouco profundas em virtude da incidência de
luz solar (consideradas profundidade de 0,5 m) e sem a utili-
zação de equipamentos que favoreçam a agitação nos tanques.
(Equação 5)
Onde:
• = tempo de sedimentação das partículas (s);
• = altura da lâmina d’água (m);
• = velocidade de sedimentação das partículas (m s-1).

Realizando os cálculos do tempo necessário para sedimen-

tação quando as microalgas encontram-se na forma unicelular
(tu) e na forma multicelular (tm), obtiveram-se:
A partir dos resultados pode-se concluir que o comporta-

mento físico da matéria interfere substancialmente no processo
de sedimentação, de forma que, quando as microalgas se agru-
pam, mesmo que não seja em resposta à adição de agente flocu-
lante, o tempo de sedimentação se reduz drasticamente. Outros
fatores importantes quando esta aglomeração celular ocorre
não foram levados em conta neste cálculo, como por exem-
plo, a perda de produtividade lipídica. São cálculos apenas de
estimativa inicial e que demonstram que a utilização exclusiva
do método de sedimentação por gravidade não é um processo
eficiente quando se deseja recuperar a biomassa microalgal
visando à produção de biodiesel, uma vez que este processo
demanda muito tempo e espaço, além do risco de degradação
microalgal em virtude do tempo gasto.
É possível identificar a importância de se promover
previamente a agregação das partículas por outros mecanismos,
tornando a sedimentação uma operação secundária deste
processo de colheita, a fim de aumentar a eficiência global
do processo de recuperação de biomassa microalgal. Tais
observações evidenciam a necessidade de se realizar, por
exemplo, a floculação como etapa prévia à sedimentação.
Desta maneira, a adição de floculantes contribuirá ao aumento
das partículas devido à agregação das células, o que reduzirá
o tempo necessário para o posterior processo de sedimentação.
De Godos et al. (2011) realizaram ensaios de sedimentação
com e sem adição de floculantes, os quais indicaram que, inde-
pendente da espécie de microalga testada, a recuperação de
biomassa apenas por sedimentação foi insignificante quando
comparada aos resultados que se utilizaram de floculantes
(orgânicos ou inorgânicos).

Desta maneira, quando se visa à produção de biodiesel a

partir de microalgas, a execução deste procedimento (flocula-
ção procedida de sedimentação) é recomendada. Ressalta-se
que, durante o cultivo é interessante que o meio esteja subme-
tido à agitação lenta e constante, a fim de homogeneizá-lo, o
que proporciona um melhor desenvolvimento microalgal. Por-
tanto, somente quando a cultura tiver alcançada a fase estável
de crescimento ou os limites máximos de produtividade de bio-
massa e de lipídios é que se deve realizar a colheita, preferen-
cialmente da maneira mais rápida possível.
3.3.4 Floculação e coagulação

Através dos cálculos realizados no item anterior (utilizando
a equação 4) é possível observar que o processo de sedimenta-
ção pode ser acelerado pela neutralização das cargas elétricas
das partículas e pela aglomeração das mesmas. A coagulação/
floculação são métodos químicos utilizados para acelerar este
processo. As duas operações serão tratadas no mesmo item por
serem muitas vezes utilizadas indistintamente, por suas seme-
lhanças e por poderem ser provocadas pelos mesmos reagentes
(RUSHTON et al., 1996).
Em termos de tratamento de água, a coagulação descreve
a adição de reagentes na água para induzir a neutralização
e a floculação descreve a agitação lenta subsequente na qual
ocorre o crescimento dos flocos.
De forma mais ampla, o termo coagulação é reservado
para fenômenos ocorridos pela diminuição do potencial zeta
(dupla camada elétrica) de uma partícula suspensa num eletró-
lito alterando a natureza e as concentrações dos íons presen-
tes. A existência da coagulação no meio depende do balanço
entre as forças atrativas de van der Waals e as forças repulsivas
da dupla camada. Pequenas partículas são submetidas cons-
tantemente a um bombardeamento aleatório pelas moléculas

do líquido, dando origem ao movimento irregular conhecido

como movimento Browniano. Tal comportamento pode pro-
vocar uma atração entre partículas suficientemente próximas
propiciando a formação de pequenos aglomerados. Chama-se
este processo de coagulação espontânea. Isto só é possível se
a forças repulsivas não forem suficientes para evitar esta aglo-
meração espontânea provocada pelo movimento Browniano
(RUSHTON et al., 1996).
Algumas espécies de microalgas, segundo Benemann e
Oswald (1994), floculam naturalmente com o aumento do con-
teúdo lipídico e, outras, em resposta a estímulos ambientais
como alterações no pH do meio de cultura e das concentra-
ções de oxigênio dissolvido. A autofloculação está associada
ao aumento do pH ocasionado pelo consumo de CO2 durante
a fotossíntese, acarretando supersaturação de íons. A flocula-
ção espontânea requer um custo muito menor quando compa-
rado à floculação química, principalmente porque dispensa a
aplicação de floculantes químicos. Em contrapartida, o tempo
demandado para que o processo de floculação espontânea
ocorra é maior. É importante frisar que não é um processo
comum a todas as microalgas, para algumas espécies a coagu-
lação espontânea é impossível em qualquer condição.
Se a coagulação não ocorrer espontaneamente, produtos
químicos são adicionados com a missão de alterar a carga da
superfície para permitir a aglomeração local. Segundo Boo-
naert et al. (2003), a coagulação pode ocorrer por ajustes de
pH ou pela adição de eletrólitos. São exemplos de coagulantes:
alguns polímeros catiônicos e ácidos, hidróxido de cálcio e sul-
fatos férricos, que coagulam e precipitam em pH neutro.
Geralmente, a floculação e a coagulação não ocorrem natu-
ralmente com as microalgas, uma vez que as superfícies das
suas células possuem carga negativa e, portanto, a agregação é
inibida pelas forças repulsivas, havendo necessidade da adição
de coagulantes orgânicos (naturais) ou inorgânicos (químicos)

que agem no sentido de neutralizar a carga negativa superficial

das células microalgais (CHEN et al., 2011)
Como exemplo de floculantes para biomassa microalgal
tem-se entre os inorgânicos, os sais metálicos multivalentes
como, por exemplo, o policloreto de alumínio, o sulfato de
alumínio, o sulfato férrico ou o cloreto férrico (GRIMA et al.,
2003). Quanto aos orgânicos, estes podem ser à base de tanino,
quitosana e sementes de moringa, dentre outros. Silva (2013)
aponta que os floculantes orgânicos têm demonstrado vanta-
gens sobre os químicos, especificamente em relação à biode-
gradabilidade, baixa toxicidade e baixa produtividade de lodos
residuais.
Diversos autores divergem quanto à eficiência dos diferen-
tes tipos de floculantes, sendo que até mesmo o meio de cultivo
influencia nos resultados e nas concentrações necessárias para
maximizar a remoção de biomassa, onde o cultivo em “águas
limpas”, geralmente, necessita de menor concentração de flo-
culantes (GODOS et al., 2011).
De acordo com Chen et al. (2011) e Azeredo (2012), a efi-
ciência da floculação é função de diversos fatores, tais como:
a) Massa molar do floculante: quanto maior a massa mo-

lar, maior o efeito de ponte induzido pelo floculante;
b) Densidade de carga do floculante: quanto maior a den-
sidade de carga, maior otimização da conformação ce-
lular do efeito de ponte e da neutralização das cargas
superficiais;
c) Concentração do floculante: quanto maior a dose,
maior é a estabilização da biomassa;
d) Concentração da biomassa: quanto maior a concentra-
ção da biomassa, maior a frequência de colisão e, con-
sequentemente, maior a taxa de floculação;
e) Hidrodinâmica: a presença de um sistema de mistura
lenta aumenta a eficiência da floculação. Entretanto,

forças excessivas de cisalhamento podem romper os

flocos já formados;
f) Meio de cultura: o pH e as forças iônicas influenciam
a conformação dos agregados e, portanto, o processo
de floculação.
A floculação tem se apresentado como um caminho pro-

missor para a colheita em grande escala, mas a sua aplicação
parece ser atualmente limitada a microalgas de água doce, pois
à medida que a força iônica de água aumenta, a eficiência do
agente de floculação diminui (UDUMAN et al., 2010).
A escolha do floculante ideal depende do tipo de uso ao
qual a biomassa será submetida. Por exemplo, para extração
de metabólitos de alto valor nutricional, o adequado é utilizar
floculantes que não sejam tóxicos e que não contaminem o
produto final; do ponto de vista econômico, o ideal é empregar
floculantes baratos e eficientes, em baixas concentrações (AZE-
REDO, 2012; CHEN et al., 2011; GRIMA et al., 2003).
A utilização de cloreto férrico tem demonstrado alta efi-
ciência na recuperação da biomassa microalgal sem agredir as
células, dispensando o ajuste de pH do meio, isso porque este
floculante não altera significativamente o pH (LEMOS, 2012).
Adicionalmente, o cloreto férrico também é um dos componen-
tes de alguns meios de cultivo, demandando menores adições
deste floculante em casos de reciclagem do material sobrena-
dante.
Para possibilitar uma estimativa financeira da floculação
foi realizada uma análise, tendo o cloreto férrico hexahidra-
tado (FeCl3.6H2O) como floculante (Tabela 3.7). De acordo
com Lemos (2012) este floculante apresenta maior eficiência
de remoção de biomassa com a utilização de menor dosagem.
A metodologia de recuperação do meio de cultivo por flocu-
lação estabelecida neste trabalho foi de agitação rápida (500
rpm) por 5 segundos seguida por agitação lenta (250 rpm) por
5 minutos e sedimentação de 10 minutos.

Tabela 3.7. Dados utilizados nos cálculos do balanço financeiro da

etapa de floculação utilizando cloreto férrico hexahi-
dratado como floculante.
Parâmetros Fonte
Cultivo:
Microalga selecionada: Scenedesmus sp. Lemos (2012)
Produtividade de
34,7 mg L-1 d-1 Lemos (2012)
biomassa1 (PB):
Tempo de cultivo até a

18 dias Lemos (2012)
colheita (t):
Teor lipídico em
relação à biomassa 36% Lemos (2012)
seca2
Floculação:
Cloreto férrico
Tipo de floculante: hexahidratado Lemos (2012)
(FeCl3.6H2O)
Concentração ideal do
54,1 mg L-1 Lemos (2012)
floculante (ConcF):
Eficiência de remoção
96,80% Lemos (2012)
de biomassa (ER):
Custo do floculante
R$ 0,009752 por g Splabor (2013)
(CF):
Volume (V)*: 1000 L = 1 m3

1
Valor médio.
2Determinado após a floculação da biomassa. Volume de 1.000 L foi a base de cálculo para os parâmetros
descrito em Lemos (2012).

Para determinação da quantidade de biomassa removível

(BR), multiplicou-se a produtividade de biomassa da microalga
Scenedesmus sp. (PB) pelo volume de cultivo (V) e o tempo de
cultivo até a colheita (t) (Equação 6):
(Equação 6)
Onde:
• = massa removível de biomassa (g);
• = produtividade de biomassa (mg L-1 d-1);
• = volume do meio de cultivo (L);
• = tempo de cultivo até a colheita (d).
A massa removível de lipídios (LR) pode ser determinada

pelo produto da massa removível de biomassa (BR) pelo teor
lipídico (TL) e a eficiência de remoção de biomassa (ER) obtida
a partir da utilização do floculante cloreto férrico hexahidra-
tado (melhor resultado encontrado em literatura), determinado
após o processo de floculação, conforme a Equação 7:
(Equação 7)
Onde:
• = massa removível de lipídios (g);
• = teor de lipídios presente na biomassa seca (%).
• = eficiência de remoção de biomassa (%).
O custo total do processo de floculação por unidade de

massa removível de lipídios (C) é determinado considerando o
custo do floculante (CF), a dose necessária de floculante (ConcF)
para se atingir a máxima eficiência, o volume do meio de cul-
tivo (V) e a quantidade removível de lipídios (LR) para esse
processo (Equação 8):

(Equação 8)
Onde:
• = custo total por unidade de massa removível de lipí-
dios (R$ por kg de lipídios removíveis);
• = custo do floculante (R$ por g);
• = concentração do floculante (g L-1);
Utilizando dados descritos na Tabela 3.7, os resultados

obtidos foram:
Vale ressaltar que não estão considerados valores adicio-

nais de implantação da operação de floculação devido à sua
simplicidade operacional e ao mínimo gasto energético reque-
rido para agitação lenta após a adição do agente floculante.
Esses resultados podem sofrer variação, provocadas pela
alteração da concentração do floculante em função da espécie
de microalga, da composição do meio de cultivo, do pH do
meio, dentre outros parâmetros, sendo útil apenas como esti-
mativa financeira inicial.
Silva (2013) salienta que, apesar de apresentar elevada
eficiência na remoção da biomassa, algumas características do
processo de floculação podem ser apontadas como desvanta-
gens:
a) Grandes concentrações de floculantes podem ser ne-

cessárias para promover a separação, o que acarreta
alta produção de lodo;
b) O processo é altamente sensível às variações de pH;
c) Os floculantes podem não apresentar a mesma eficiên-
cia para todos os grupos de microalgas;
d) A biomassa microalgal pode ser contaminada pela pre-

sença dos componentes químicos do floculante, como

alumínio e ferro, comprometendo, desta forma a sua
utilização.
3.3.5 Centrifugação
A centrifugação é uma extensão da sedimentação por gra-
vidade na medida em que a aceleração gravitacional (g) é subs-
tituída pela aceleração centrífuga (rω2) (GEANKOPLIS, 1998).
Esta substituição de força motriz pode acelerar a separação em
até 10000 vezes, reduzindo efetivamente o tempo de separação
sólido-líquido (PERRY; CHILTON, 1973). A equação da velo-
cidade de centrifugação pode ser simplificadamente calculada
pela Equação 9:
(Equação 9)
Onde:
• = velocidade de centrifugação das partículas (m s-1);
• ω = velocidade angular (rad s-1);
• r = distância da partícula em relação a eixo rotacional
(m);
• = massa específica das partículas (kg m-3);
• = massa específica do fluido (kg m-3);
• = diâmetro das partículas (m);
• = viscosidade do fluido (Pa.s = kg m-1 s-1).
A centrifugação é um dos métodos mais rápidos (SILVA,

2013) e mais eficientes (ZARDO, 2011) para a remoção da bio-
massa microalgal por ser um método rápido e confiável, apre-
sentando características ideais de aplicação em larga escala.
Este processo é capaz de separar cerca de 90 a 95% da bio-
massa presente no meio, resultando em um produto com baixo
grau de umidade. Nessa técnica, forças centrífugas promovem

a separação sólido-líquido com base na diferença entre as den-

sidades. Entretanto, a eficiência da técnica é dependente das
características das células microalgais, do tempo de aplicação
da força e da profundidade do tubo da centrífuga.
São ideais para separação de partículas com tamanhos
de 3 a 30 μm e concentrações de 0,02-0,05 % (MILLEDGE;
HEAVEN, 2013). Do ponto de vista financeiro, levando em
consideração a aquisição e a operação do equipamento, este
método somente é recomendado como uma etapa secundária
para aumentar a concentração de uma biomassa já recuperada
a partir de outra técnica, uma vez que, grandes volumes con-
tendo baixas concentrações de biomassa torna a recuperação
por centrifugação um método inviável para aplicação em larga
escala (AZEREDO, 2012), além do alto consumo energético
(UDUMAN et al., 2010).
Segundo Zardo (2011), apesar de alguns tipos de centrí-
fugas apresentarem resultados bastante confiáveis e eficien-
tes, este método requer elevados custos (de aquisição e opera-
cionais), principalmente quando se deseja trabalhar em larga
escala.
De acordo com Grima et al. (2003), a recuperação da
biomassa em centrífugas depende de três fatores: da taxa de
deposição da biomassa, do tempo de residência da biomassa no
interior da centrífuga e da distância da deposição da biomassa.
A distância de deposição é função do design do equipamento,
enquanto que o tempo de residência pode ser reduzido pelo
controle da taxa de fluxo de processamento.
Shelef, Sukenink e Green (1984) dividiram os principais
equipamentos de centrifugação em: dispositivos com parede
fixa (hidrociclones) e dispositivos com parede rotativa (centrí-
fugas de sedimentação). Os principais tipos de centrífugas de
sedimentação são: centrífugas de discos ou pratos (com des-
carregamento de sólidos manual ou automático), centrífuga
parafuso decantadora, centrífuga multicâmaras, centrífugas

tubulares e centrífugas com tela perfurada (AZEREDO, 2012).

A centrífuga de discos é o modelo mais utilizado em plantas
piloto de produção de biocombustível via microalgas (GRIMA
et al., 2003). Uma centrífuga de discos consiste em uma super-
fície externa cilíndrica contendo cones de metal espaçados
(discos) em seu interior, que ao girarem fazem com que a solu-
ção alimentada ao centro, force a fase mais densa a viajar para
discos mais distantes, separando em camadas os materiais de
diferentes densidades.
Para uma análise financeira da operação de centrifugação,
o cálculo da massa removível de biomassa e da massa remo-
vível de lipídios utilizam as mesmas equações do balanço do
processo de floculação (Equações 6 e 7). Para a determinação
do custo total da operação de centrifugação por unidade de
massa removível de lipídios, foram considerados o custo com
energia elétrica, a energia requerida e a quantidade removível
de lipídios por esse processo (Equação 10):
(Equação 10)
Onde:
• = custo total por unidade de massa removível de lipí-
dios (R$/kg de lipídios removíveis);
• = custo de 1 KWh;
• = energia requerida (KWh m-3);
• = volume do meio de cultivo (m3);
• = massa removível de lipídios (kg).
Os dados utilizados estão apresentados na Tabela 3.8.

Tabela 3.8. Dados utilizados nos cálculos do balanço financeiro da

etapa de centrifugação.
Parâmetros Fonte
Cultivo:
Microalga selecionada: Scenedesmus sp. Lemos (2012)
Produtividade média
34,7 mg L-1 d-1 Lemos (2012)
de biomassa1 (PB):
Tempo de cultivo até a

18 dias Lemos (2012)
colheita (t):
Teor lipídico em
relação à biomassa 39% Lemos (2012)
seca2
Centrifugação:
Centrífuga discos Milledge e Heaven

Tipo de equipamento:
Westfalia (2013)
Potencia da centrífuga 50 kW Gea (2009)
Capacidade da
35 m3/h Gea (2009)
centrífuga
Energia consumida
1,4 KWh m-3
(E)1:
Eficiência de remoção
98% Lemos (2012)
de biomassa (ER):
Custo de 1 KWh (CE): R$ 0,39631 COPEL (2013)
Volume (V): 1 m3
1
Valor se todo for utilizado em sua totalidade.
2 (TAMBURIC et al., 2011).
*Volume em estudo foi de uma base de cálculo de 1000 L.

As condições de operação da centrífuga descritas foram

obtidas do ensaio realizado por Lemos (2012), com a biomassa
Scenedesmus sp., sendo utilizada uma centrífuga de discos com
capacidade máxima de 95 m3/h, mas com limite de 35 m3 /h
para a colheita de algas (GEA, 2009) com o máximo de potên-
cia do motor de 75 kW.
Quanto aos custos com energia elétrica, aplicou-se o valor
cobrado pela Companhia Paranaense de Energia (COPEL,
2013) entre junho de 2013 a junho de 2014. A tarifa aplicada
refere-se ao uso convencional, ou seja, sem diferenciação de
preço em função da hora e para consumidores de classe B1
(industrial com tensão inferior a 2 kV).
Os valores encontrados são:
O custo para um m3 é de:
Se utilizar a centrífuga em sua totalidade, o custo diminui

significativamente, para:
É importante observar que a centrífuga, como qualquer

equipamento elétrico, mostra-se muito mais econômica se
utilizada na sua capacidade máxima, uma vez que a energia
utilizada é desperdiçada ao se subutilizar o equipamento.
Deve-se considerar também que, apesar do balanço finan-
ceiro ter sido realizado sobre os melhores resultados de flocula-
ção e centrifugação encontrados no trabalho de Lemos (2012),
a produtividade de biomassa atingida neste trabalho é inferior
ao atingido por outros autores. Rodolfi et al. (2009), relataram
produtividade de 260 mg L-1 d-1 para este mesmo gênero de
microalga, ou seja, 9 vezes a mais do que a conseguida por
Lemos (2012).

Nesse sentido, caso fosse considerada a produtividade rela-

tada por Rodolfi et al. (2009), o custo por quilograma de lipí-
dios removível na centrifugação seria reduzido em cerca de
89%, chegando a R$ 0,33.
Também foram desconsiderados os custos de manuten-
ção do equipamento. Sendo assim, os resultados encontrados
por meio destas análises financeiras estão subestimados, o que
significa que, efetivamente, o custo operacional por unidade
de massa de lipídios removíveis será ainda maior do que os
demonstrados.
Em uma análise restrita à centrifugação, levando em conta
que o tempo ideal para crescimento desta espécie de microalga
(Scenedesmus sp.) de 18 dias, é possível obter 20 ciclos por ano
de cada tanque de cultivo. Ao se considerar 18 tanques de 280
m3 cada, será possível centrifugar 1 tanque por dia (supondo 8
h de trabalho) e ao final dos 18 dias, o primeiro tanque estará
apto a nova centrifugação. Serão centrifugados ao final de um
ano 20 vezes em cada tanque, o que corresponde a 100.800
m3 ou 19.000 kg de óleo ao ano. Supondo o valor aproximado
para a centrífuga Alfa LAVAL ou Westfalia de R$ 250.000,00,
centrifugas estas específicas para processo de separação da
biomassa, ter-se-á um valor adicional de R$ 13,00 por kg de
lipídios removíveis, o que poderá ser amortizado em 10 anos
(tempo de vida útil do equipamento) resultando valor aproxi-
mado de R$ 0,13/kg de lipídios para pagamento do bem durá-
vel, que é o equipamento.
Entretanto, nestes cálculos não foram considerados os
gastos com a instalação do equipamento e com a execução de
obras (escavação dos tanques). Portanto, para uma tomada de
decisão, recomenda-se a realização de uma análise detalhada
de custos que envolva estes fatores, a fim de investigar com
melhor nível de precisão a relação custo-benefício.

3.3.6 Flotação
A flotação é um processo de separação por gravidade no
qual o ar ou as bolhas de gás agem sobre as partículas sólidas e,
em seguida, carregam-nas para a superfície do líquido (CHEN
et al., 2011). Esse processo é mais eficaz que a sedimentação
para a remoção de microalgas, visto ser uma tecnologia efetiva
para a captura de pequenas partículas (até 500 μm) em solu-
ção aquosa, utilizando bolhas de gás (MATIS et al., 1994). É
uma operação relativamente rápida e de custos operacionais
moderados; segundo Liu et al. (1999), a técnica de flotação
tem o potencial para superar o gargalo da produção viável de
biocombustível de microalgas.
De acordo com o tamanho das bolhas de gás, as aplicações
podem ser dividas em flotação:
• Flotação por ar disperso (bolhas com diâmetro entre

700-1.500 μm);
• Flotação por ar dissolvido (bolhas com diâmetro entre
10-100 μm);
• Flotação eletrolítica como mesmo diâmetro de bolhas,
mas com maior intensidade de agitação (CHISTI, 2007;
POONCHINDA et al., 2004; UDUMAN et al., 2010).
A flotação dispersa envolve a formação de bolhas de ar

a partir de um agitador mecânico de alta velocidade com um
sistema de injeção de ar. O gás é introduzido na superfície e se
mistura completamente com o líquido e, após passar por um
dispersor, forma múltiplas bolhas cujos tamanhos variam de
700-1500 μm de diâmetro (SILVA, 2013).
A eletroflotação, também conhecida como flotação eletro-
lítica, é uma reação eletroquímica que utiliza eletrodos para
desestabilizar a matéria em suspensão. Nesta técnica, a dife-
rença de potencial aplicada entre os eletrodos permite que
sejam geradas microbolhas de oxigênio e hidrogênio de dimen-
sões extremamente reduzidas (< 0,01 mm) que, por apre-

sentarem massa específica diferente à do efluente, tendem a

subir em direção à superfície arrastando os coloides formados
(SILVA, 2013).
Alfafara et al. (2002) investigaram a eficiência da eletro-
flotação para remoção de microalgas, sendo que os eletrodos
de ferro se mostraram menos eficientes que os eletrodos de
alumínio, muito provavelmente devido a maior eficiência da
corrente elétrica gerada pelos eletrodos de alumínio, se com-
parada com a originada pelos eletrodos de ferro.
Testes satisfatórios utilizando o eletrodo de ferro têm sido
realizados com a adição de cloreto de sódio, variação da cor-
rente e aumento da área de contato (BJERK, 2012). Sendo
assim, verificou-se que a composição dos eletrodos é um fator
extremamente significativo na remoção de biomassa microal-
gal por eletroflotação, permitindo a redução da demanda de
energia e de custos com eletrólitos, além de proporcionar
ganho de tempo no processo.
Pelo diâmetro médio das células e o pelo custo operacio-
nal, a flotação por ar dissolvido é, entre as técnicas de flotação,
a técnica mais utilizada para a colheita de microalgas.
Surendhian (2012) propõem técnicas como ozonização,
onde o ozônio favorece a quebra celular, aumentando a con-
centração de óleo extraído. Este procedimento deve ser utili-
zado preferencialmente em biorreatores para evitar a contami-
nação.
A energia consumida com o processo de flotação é em
média de 0,015 kWh m-3, valor 100 vezes inferior ao apre-
sentado para a centrifugação e alcança eficiências similares
(COWARD et al., 2013).
3.3.7 Filtração
A operação de filtração é a separação de uma mistura de
líquido-sólido, envolvendo a passagem da solução através de
uma barreira porosa que retém a maior parte das partículas
sólidas contidas na mistura.

O filtro, também conhecido como meio filtrante, é uma

parte do equipamento, através da qual a filtração é realizada.
Serve de barreira que permite a passagem do líquido, enquanto
retém a maior parte dos sólidos, podendo ser constituída por
uma tela, tecido, papel, ou a camada de sólidos. O líquido que
atravessa o filtro é chamado de filtrado e o que o material que
fica retido no filtro é chamado de torta de filtração (PERRY;
CHILTON, 1973).
A passagem do fluido através do filtro pode ser possibi-
litada pela ação da gravidade ou pela aplicação de pressão,
vácuo ou força centrífuga (AZEREDO, 2012; SHELEF et al.,
1984).
Dentre as técnicas de filtração, as que utilizam pressão são
consideradas as mais adequadas à recuperação de biomassa
microalgal (MOHN, 1978). Filtros à vácuo ou pressurizados
podem ser utilizados para recuperar grandes quantidades de
biomassa, mas para algumas aplicações a operação pode ser
relativamente lenta, uma vez que o adensamento da torta pro-
voca queda de pressão do meio.
A filtração, no entanto, não é um método muito aplicado
em processos de colheita de microalga para produção de bio-
diesel, uma vez que a filtração é adequada para microalgas de
dimensões superiores a 70 μm, como Coelastrum proboscideum
e Spirulina platensis, mas não pode recuperar organismos de
menor dimensão (< 30 μm) como Scenedesmus, Dunaliella, ou
Chlorella (GRIMA et al., 2003; BRENNAN; OWENDE, 2010).
Segundo Mata, Martins e Caetano (2010) e Azeredo (2012),
a microfiltração e a ultrafiltração também são alternativas para
a recuperação da biomassa microalgal, sendo mais adequadas
para células frágeis de menores dimensões (< 30 μm) e para
processos de produção em pequena escala, mas pelo baixo
custo do produto final, tornam-se inviáveis para produção de
biodiesel.
Grima et al. (2003) apresentaram uma análise compara-
tiva de eficiência e gasto energético da colheita de C. probos-
cideum via filtração a vácuo e à pressão, tendo observado um
gasto energético de 0,1 e 0,88 kWh m-3 para filtração a pressão

e à vácuo, respectivamente, sendo que a filtração sob pressão

obteve eficiência de concentração da biomassa superior em 3
vezes.
Esta avaliação energética dos processos de filtração quando
comparada aos dados da centrifugação (1,4 kW/m3) mostram
que esta operação unitária carece de maiores estudos de efici-
ência de processo.
3.4 Processamento da Biomassa

Após a separação sólido-líquido, a biomassa recuperada
ainda possui alta umidade e deve ser rapidamente processada
para que não perca sua qualidade. Para aumentar o tempo
de conservação do material coletado, bem como facilitar as
operações posteriores, a desidratação é comumente aplicada
(ARCEO, 2012), podendo constituir-se pelos seguintes méto-
dos: secagem ao sol, secagem por nebulização, tambor de seca-
gem e liofilização.
A secagem ao sol é o método de desidratação de menor
custo, mas possui como principais desvantagens a necessidade
de longos períodos de secagem e de grandes áreas superficiais.
Outro fator relevante que desfavorece a eficácia da técnica é
a falta de controle operacional (BRENNAN; OWENDE, 2010).
No contraponto, a secagem por nebulização é o método
mais oneroso financeiramente. Esta operação pode ser definida
como a obtenção de partículas esféricas e de escoamento livre
através da atomização de uma solução e/ou suspensão, com
formação de gotículas em uma corrente de ar quente, ou seja, é
o bombeamento da solução até o atomizador, de onde é asper-
gido em forma de spray para a câmara de secagem e seco pelo
ar quente, transformando, desta forma, gotas líquidas em par-
tículas sólidas, que são recolhidas em um sistema de coleta de
pó (BRAGA, 2005). Pelo seu alto custo não é um método eco-
nomicamente viável para produtos de baixo valor de mercado,

como o caso de biocombustíveis (MATA et al., 2010).

Outro método de alto custo e eficiência é a liofilização.
O método é baseado no ponto triplo da água, necessitando de
baixa temperatura e pressão. A Figura 3.4 apresenta o diagrama
de fases da água que auxilia na compreensão do processo. O
ponto 1 corresponde às condições normais de congelamento da
biomassa submetida à pressão ambiente (760 mm Hg) e tempe-
ratura inferior a 0,01°C. O ponto 2 corresponde à mesma con-
dição de temperatura e redução da pressão a valores inferiores
a 4,0 mm Hg, onde os cristais de gelo sublimam diretamente
pela exposição a condições inferiores a do ponto triplo da água
(4,58 mm Hg e 0,01°C). No entanto, o gasto energético é alto
sendo necessários aproximadamente 2.800 KJ para cada quilo-
grama de gelo sublimado (CHISTI, 2007).
Segundo Arceo (2012), a liofilização é um método
tecnicamente eficiente e reduz qualquer tipo de degradação da
matéria-prima. Brennan e Owende (2009) afirmam que óleos
de difícil extração a partir da biomassa úmida por solventes sem
prévia ruptura celular, podem ser mais facilmente extraíveis se
a biomassa estiver liofilizada. Entretanto, este método é tão
caro quanto à secagem por nebulização, sendo inviável para
utilização em escala comercial de produção de derivados de
microalgas de baixo valor agregado, como o biodiesel (GRIMA
et al., 2003).
O método de secagem a tambor consiste no aquecimento
a vapor de maneira uniforme sobre o interior um tambor cilín-
drico que gira continuamente. O produto a ser seco é aplicado
como uma fina película sobre o exterior deste tambor e, então
a secagem se inicia imediatamente. Após cada rotação, uma
lâmina raspa o produto seco da superfície, como uma película
em forma de flocos. Trata-se de um secador indireto, pois o ar
quente não entra em contato com o produto, ficando confinado
no interior do cilindro.

Figura 3.4. Diagrama de fases da água.
Shelef, Sukenike Green (1984) utilizaram a operação drum-

-drying em microalgas da espécie Scenedesmus sp. e obtiveram
ótimos resultados do ponto de vista da qualidade de extração
do óleo da biomassa, pois este processo, assim como a liofili-
zação, auxilia no rompimento das células além de desidratar a
biomassa. Neste trabalho, a superfície do tambor era de 0,5 m2,
com capacidade evaporativa de 20 L h-1 m-2 de biomassa com
concentração inicial de 30% em sólidos, sendo consumidos 52
KWh.
Tendo em vista os altos custos com energia, processos com
secagem mecânica devem ser mais explorados, por substituí-
rem a fonte energética do processo.
3.5 Extração de Óleo (Ruptura Celular e

Extração dos Lipídios)
A ruptura das células das microalgas é um pré-tratamento
para a extração, tendo como objetivo a facilitação da extração
dos metabólitos de interesse (no caso da produção de biodiesel,

os lipídios). Não é uma etapa obrigatória e a decisão por sua

utilização depende do método de extração a ser utilizado.
Vários métodos podem ser aplicados para a ruptura celular,
dependendo da característica da parede celular das microalgas
e da natureza do produto a ser obtido. Segundo Mata, Martins
e Caetano (2010), a ruptura e a extração podem ocorrer de
duas maneiras:
a) Pela ação mecânica: através de homogeneizador de

alta pressão, moinho de bolas, ultrassom, autoclaves
ou liofilização, micro-ondas; ou,
b) Pela ação não mecânica, por meio de congelamento,
utilização de solventes orgânicos, choque osmótico ou
reações de ácidos, bases ou enzimas, por exemplo.
Estas etapas de pré-tratamento utilizam energia intensi-

vamente e, portanto, só podem ser realizadas aumentando-se
a eficiência da extração lipídica das microalgas. No entanto,
esta não é uma área que tem sido amplamente avaliada. Outro
fator relevante é que quando ocorre o rompimento celular, os
lipídios são liberados para o meio circundante, o que facilita a
sua separação (CHISTI; MOO-YOUNG, 1986; LEE et al., 2010).
A maioria dos pré-tratamentos de rompimento celular exi-
gem água, e, portanto, devem ser realizados antes do processo
de secagem.
Os métodos mais utilizados para o rompimento das células
são os mecânicos (SILVA, 2013, ZARDO, 2011) uma vez que os
métodos não mecânicos podem desnaturar enzimas e proteínas
presentes nas células. Dentre os métodos mecânicos, o moinho
de bolas, a homogeneização de alta pressão e o ultrassom são
os métodos mais utilizados para microalgas em escala labora-
torial (CHISTI; MOO-YOUNG, 1986; HARRISON et al., 2003).
Utilizando o moinho de bolas, as células de microalgas
em suspensão são passadas por discos dentro de uma câmara

fechada na presença de esferas de vidro ou aço (geralmente

com 0,2-1,0 mm de diâmetro) sob forte agitação, com o intuito
de quebrar as células devido à força cisalhante. A eficiência
deste processo depende do tamanho das partículas, da agita-
ção aplicada, do tempo de residência do material no sistema,
bem como das dimensões do equipamento (GREENWELL et
al., 2010). Este método parece ser o mais indicado para escala
industrial devido ao seu baixo custo operacional (CHISTI;
MOO-YOUNG, 1986).
A homogeneização de alta pressão celular envolve a pas-
sagem forçada do fluido através de um orifício, criando uma
rápida mudança de pressão, bem como uma elevada tensão de
cisalhamento, o que causa a ruptura celular das microalgas. O
nível de ruptura depende da pressão aplicada, da resistência
da parede celular e do tamanho das células. Microrganismos
cultivados em condições subótimas, geralmente são fisica-
mente mais resistentes, possuindo parede celular mais espessa
(GREENWELL et al., 2010).
O processo de extração lipídica por ação não mecânica que
se apresenta mais eficiente é a utilização de solventes, que pode
ocorrer por duas metodologias: extração por solvente orgânico
e extração em meio supercrítico.
De modo geral, a extração líquido-líquido (óleo-água na
biomassa) envolve a transferência de massa a partir de uma
fase líquida para uma segunda fase líquida imiscível, podendo
ser realizada de maneiras diferentes (PERRY; CHILTON, 1973).
Durante a extração de lipídios por solvente orgânico, a
biomassa de microalgas é exposta a um solvente de eluição
que extrai os lipídios para fora da matriz celular. Este solvente
orgânico penetra na célula através da membrana celular e inte-
rage com os lipídios neutros ligados ao citoplasma, por meio
de forças de van der Waals, formando um complexo de sol-
vente orgânico-lipídio. Este complexo solvente-lipídio, devido
ao gradiente de concentração entre a fase intra e extracelular,

difunde-se através da membrana celular, havendo a extração

do solvente orgânico juntamente aos lipídios para fora das
células. Alguns lipídios neutros são, no entanto, encontrados
no citoplasma estando ligados aos lipídios polares. Esta ligação
tem força superior à força dos lipídios neutros (estão unidos
por pontes de hidrogênio) e solventes orgânicos não polares
(ex. hexano, clorofórmio) não são capazes de se associar a estes
lipídios. Por outro lado, solventes orgânicos polares (tais como
metanol ou isopropanol) são capazes de interromper as ligações
entre lipídios e as proteínas, formando ligações de hidrogênio
com os lipídios polares do complexo (KATES, 1986; MEDINA
et al., 1998).
Segundo Mata, Martins e Caetano (2010), embora o etanol
seja um bom solvente, ele é capaz de extrair também alguns
contaminantes celulares, como açúcares, aminoácidos, sais,
proteínas e pigmentos, o que não é desejável quando o objetivo
da extração é apenas os lipídios. Em microalgas, a composição
da fração lipídica extraída pode sofrer alterações de acordo
com a polaridade do solvente utilizado. Lipídios polares como
os fosfolipídios e os glicolipídeos requerem solventes polares,
tais como o etanol ou metanol; lipídios apolares como triacil-
glicerídeos devem ser extraídos com solventes apolares, como
o hexano ou de média polaridade, como o clorofórmio.
Usualmente a extração com solventes é realizada a partir
da biomassa liofilizada, configurando-se em um método rápido
e eficiente. Neste procedimento, vários solventes podem ser
utilizados, tais como: o benzeno, o clorofórmio, o éter etílico, o
n-hexano, o metanol, o etanol, uma mistura de hexano-etanol,
uma mistura de clorofórmio-metanol, etc. (MATA; MARTINS;
CAETANO, 2010).
A extração com fluido supercrítico (SCF) é uma tecnologia
emergente que tem o potencial de substituir solvente orgânico
tradicional na extração.
As primeiras observações experimentais de que o aumento
simultâneo da pressão e da temperatura aumentava a solubi-

lidade da substância foi feita a mais de 100 anos. No entanto,

as dificuldades na obtenção das temperaturas e pressões neces-
sárias, fizeram com que ainda nos dias de hoje, a utilização de
fluidos supercríticos seja tímida (LIMA, 2005).
Apesar de ser usualmente definido a partir de diagramas
de fases, na prática, o estado supercrítico é obtido elevando-
-se a pressão e/ou a temperatura de um gás ou de um líquido
de forma que se altere o estado de agregação e, como conse-
quência, modifique as suas propriedades de interesse. Caso a
pressão ou a temperatura estejam abaixo dos valores críticos,
diz-se que a substância está no estado subcrítico.
Essas alterações promovem mudança na densidade, na vis-
cosidade e na difusividade mássica do meio, ou seja, o fluido
supercrítico possui densidade próxima a dos líquidos (bom sol-
vente) e viscosidade e difusividade mássica mais próximas aos
gases (facilidade no transporte de massa), modificando o com-
portamento químico da substância (RIZVI, 1994).
Os fluidos frequentemente usados para reações em meios
supercríticos são a água (SCW) e o dióxido de carbono (SCCO2).
Apesar de a água possuir um maior potencial para sistemas
reacionais, ela sofre o prejuízo por possuir uma alta tempera-
tura e pressão crítica (Tc=647,3 K e Pc=22,0 MPa).
O CO2 é relativamente barato e possui baixa temperatura e
pressão crítica (Tc=304,2 K e Pc=7,4 MPa). É ambientalmente
aceito, não tóxico, não inflamável e inerte a oxidações.
A Figura 3.5 mostra as típicas variações de densidade nas
propriedades de transporte do CO2 sob diferentes pressões pró-
ximas da crítica ao longo de uma isoterma (acima de Tc).
A Figura 3.5 mostra que as propriedades de transporte
podem ser drasticamente alteradas passando do comporta-
mento de gás para o de líquido pela simples variação da pres-
são. Para pressões acima de 1,2 Pc (pressão crítica), a densidade
possui valor próximo da densidade de líquidos e a os valores da
difusividade e a viscosidade são intermediários entre líquidos
e gases. Este comportamento pode ser esperado para qualquer

fluido ou mistura em condições críticas. Portanto, se a mis-

tura reacional estiver a uma temperatura acima da crítica e a
pressão próxima da Pc, uma combinação favorável de taxas de
transporte pode ser obtida.
Fonte: (SUBRAMANIAM et al., 2002).
Figura 3.5. Variações das propriedades físico químicas do CO2 em

pressões próximas a pressão e temperaturas críticas.
Um dos principais fatos medidos recentemente de forma

experimental foi a mudança na constante dielétrica de vários
solventes em função das condições de temperatura e pressão
(e. g. o dióxido de carbono, apolar em condições normais de
temperatura e pressão e em elevadas pressões, apresenta cons-
tante dielétrica equivalente a substâncias polares; a água, con-
siderada como substância altamente polar em condições nor-
mais de temperatura e pressão apresenta constante dielétrica
próxima de zero em elevadas temperaturas e pressões) (SAR-
GENTI; LANÇAS, 1994).
O poder solvente de extração do CO2 supercrítico é uma
função direta da pressão e da temperatura de extração (TAY-

LOR, 1996). Maiores pressões (Figura 2.3) conduzem a um

aumento de densidade e, portanto, a um aumento no poder de
solvente. No entanto, o aumento da pressão, também aumenta
o custo operacional e reduz a seletividade, resultando na extra-
ção de componentes indesejáveis.
De acordo com Arceo (2012), a extração por fluido super-
crítico pode extrair quase 100% dos lipídios, porém necessita
de aparelhagem especial para confinamento e aplicação de
pressão.
Dentre os critérios para a seleção do(s) método(s) de extra-
ção a ser (em) utilizado(s), devem ser considerados a veloci-
dade da extração, a eficiência, a complexidade operacional e
os custos (de investimento e de operação), com foco em reduzir
a degradação dos lipídios e dos triacilglicerídeos. No caso de
se optar pela extração com solventes, estes devem ser baratos,
voláteis (para posterior remoção), de baixa toxicidade, puros,
imiscíveis em água e seletivos (ARCEO, 2012).
A extração de lipídios a partir de biomassa microalgal não
tem recebido atenção suficiente e ainda se apresenta com um
gargalo a produção em escala industrial de biodiesel microal-
gal. Futuras pesquisas em biodiesel de microalgas devem se
concentrar no desenvolvimento de um processo de extração de
lipídios eficaz e energeticamente eficiente. Uma tecnologia de
extração de lipídios ideal para o biodiesel de microalgas deve
ser seletiva a lipídios, minimizando a coextração de outros
compostos contaminantes não lipídicos tais como proteínas e
carboidratos.
Do ponto de vista energético, outro item não abordado
pelo fluxograma (Figura 3.1) e de extrema relevância é a possi-
bilidade da utilização da biomassa microalgal para a produção
de outros produtos energéticos (Figura 3.6).
A Figura 3.6 apresenta algumas opções para a conversão
de biomassa microalgal em outros produtos energéticos. No
caso do processo central ser a produção de biodiesel, após a

extração lipídica, os carboidratos existentes no bolo vegetal

remanescente podem ser utilizados como substrato para outros
processos como: fermentação para a produção de bioetanol
(ANTUNES; SILVA, 2010) reações a altas temperaturas na
presença de oxigênio (gaseificação) ou na ausência parcial do
mesmo (pirólise) favorecendo a quebra de ligações químicas e
formação de novos compostos desde os voláteis (metano) até
os produtos com alto peso molecular (carvão); a forma mais
simples de utilização é sua queima para cogeração de energia
elétrica (MATA; MARTINS; CAETANO, 2010). Estes processos
permitem uma otimização do uso da biomassa potencialmente
energética proveniente das microalgas, através do aproveita-
mento de seus coprodutos, assegurando a rentabilidade global
do processo (CHEN et al., 2011; FERRERO, 2011).
Fonte: Zardo (2011).
Figura 3.6. Formas de se obter energia a partir da biomassa microalgal.

Além disso, há possibilidade de utilização da biomassa

após extração lipídica para obtenção de coprodutos, entre eles
outras formas de combustíveis, conforme já apresentado ante-
riormente.
3.6 Produção de Biodiesel

Conforme o artigo 6º, inciso 25 da Lei 9.478 de 1997,
entende-se por “Biodiesel: biocombustível derivado de bio-
massa renovável para uso de motores a combustão interna com
ignição por compressão ou, conforme regulamentação, para
geração de outro tipo de energia, que possa substituir parcial
ou totalmente o combustível de origem fóssil” (BRASIL, 1997).
Esta definição é ampla e possibilita a produção de biodie-
sel de diversas formas, uma vez que a conversão dos triglicerí-
deos em ésteres pode ocorrer por diversas rotas químicas: via
transesterificação, pirólise, microemulsificação ou hidroesteri-
ficação. Entretanto, o processo mais comum para a produção
de biodiesel é a transesterificação (ARCEO, 2012).
Cada nação possui regulamentação própria de biodiesel e,
no Brasil, a regulamentação da ANP no. 14, de 11/05/2012, res-
tringe como biodiesel brasileiro “Biodiesel: combustível com-
posto de alquil ésteres de ácidos carboxílicos de cadeia longa,
produzido a partir de transesterificação e ou esterificação de
matérias graxas de gorduras de origem vegetal ou animal e
que atenda as especificações contida no Regulamento Técnico
no. 4/2012” (BRASIL, 2012). Esta definição é semelhante à uti-
lizada pela American Society of testing and materials (ASTM) e
pela União Europeia.
Este regulamento técnico padroniza as análises que devem
ser realizadas para garantir a qualidade do biodiesel nacional,
segundo normas da ABNT, ASTM ou EM/ISO. Dentre as análi-
ses para assegurar a qualidade do biodiesel destacam-se: aci-
dez, ponto de fulgor, número de cetano, ponto de névoa e a

viscosidade cinemática, mas os valores permitidos são especí-

ficos em cada país.
Igualmente aos óleos e as gorduras, os lipídios das micro-
algas são constituídos por diferentes ácidos graxos saturados e
insaturados e mesmo poli-insaturados como ômega 3 ou ômega
6 (HU et al., 2008; HUANG et al., 2010). Além disso, o óleo
de microalga pode apresentar uma elevada acidez (WU, 2006)
sendo necessária a modificação no metabolismo ou no meio de
cultura, ou mesmo a utilização de processos semelhantes ao de
utilização de óleos residuais.
Segundo Mata, Martins e Caetano (2010) a transesterifi-
cação é uma reação química que inclui três passos reversíveis
em série, em que os triglicerídeos são convertidos em diglice-
rídeos, que por sua vez são convertidos em monoglicerídeos.
Finalmente, estes monoglicerídeos são transformados em éste-
res (biodiesel) e glicerol (subproduto).
Segundo Chisti (2007), a transesterificação industrial
deve ocorrer catalíticamente, seja via catálise ácida, básica ou
enzimática (lipase), envolvendo um óleo e um álcool (Figura
3.7).
R representa a cadeia carbônica de ácidos graxos e R1 a cadeia carbônica do álcool reagente.

Fonte: Zardo (2011).
Figura 3.7. Equação geral da reação de transesterificação.

Alguns aspectos podem influenciar de maneira relevante

o processo de transesterificação, como: o tempo reacional, o
tipo de catalisador, a razão molar álcool:óleo, a temperatura
da reação, a pureza dos reagentes e a quantidade de ácidos
graxos livres presentes nas matérias-primas.
Segundo Bjerk (2012), a reação via catálise básica ocorre
cerca de 4000 vezes mais rápida que a ácida. Sendo assim, a
catálise básica é mais comumente empregada, com a utiliza-
ção de hidróxido de sódio ou de potássio. Outras desvanta-
gens na utilização de ácidos como catalisadores são apontados
por Ramos et al. (2011): as reações devem ser conduzidas com
elevadas razões molares álcool:óleo (comumente 30:1) e em
temperaturas próximas à da ebulição do álcool. Além disso, a
cinética de reação é menos favorecida, sendo necessária, pelo
menos 3 horas de reação.
De acordo com Dias (2012), o teor de ácidos graxos livres
influencia na transesterificação, devendo ser considerado na
escolha do catalisador. Ácidos graxos com alto índice de acidez,
especialmente na presença de água em uma reação de catálise
básica, podem formar produtos saponificados e emulsões, o que
dificulta a separação dos produtos e provoca a diminuição da
conversão e rendimento reacional. Portanto, se o óleo possui
um alto teor de ácidos graxos livres, recomenda-se a utilização
de catalisadores ácidos, uma vez que o uso dos catalisadores
básicos provocaria desperdícios devido à neutralização.
A rota enzimática é uma das alternativas tecnológicas pro-
missoras para produção de biodiesel (SOUZA et al., 2010). A
utilização de lipases isoladas ou imobilizadas como catalisa-
dores enzimáticos vêm sendo uma das alternativas propostas
na literatura para a obtenção de ésteres com altas conversões.
Entretanto, o uso destes catalisadores tem sido inviabilizado
pelo seu alto custo aliado à sua rápida desativação na presença
de álcool, além de ser necessário longo tempo (18 horas) para
que estes atuem como catalisador.

Os alcoóis mais utilizados na transesterificação são o meta-

nol e o etanol, não apenas por seu baixo custo, mas também
por suas vantagens físico-químicas: cadeias mais curtas e alta
polaridade (ARCEO, 2012). Segundo Dias (2012), o metanol
se sobressai por ser mais reativo, necessitando menor tempe-
ratura e menor tempo reacional. Entretanto, a rota etílica tem
sido bastante estudada, pela menor toxidade do etanol em rela-
ção ao metanol e por ser oriunda de energia renovável, o que
torna o ciclo produtivo do biodiesel ambientalmente menos
agressivo. É importante considerar que o metanol apesar de ser
costumeiramente obtido a partir de petróleo, também pode ser
obtido a partir da biomassa.
A razão molar estequiométrica de álcool e óleo na transes-
terificação é de 3:1. Entretanto, segundo Ramos et al. (2011)
um grande excesso de álcool, usualmente 6:1 ou 12:1, deve ser
utilizado a fim de maximizar a produção de ésteres graxos.
De modo geral, a relação entre a entrada de massa de
matéria-prima e produção em massa de biodiesel é de cerca de
1:1, ou seja, teoricamente, 1 quilograma de óleo resulta aproxi-
madamente em 1 quilograma de biodiesel (MATA; MARTINS;
CAETANO, 2010). É importante reafirmar que este valor teó-
rico é analisado levando em conta apenas a estequiometria da
reação, um estudo sobre o equilíbrio químico da reação pro-
porcionaria um resultado da máxima conversão que é possível
ser obtida no processo.
Após a reação de transesterificação, os ésteres resultantes
devem ser separados da glicerina, dos reagentes em excesso
e do catalisador. Isto pode ser realizado em dois passos: pri-
meiro, separa-se a glicerina via decantação ou centrifugação;
em seguida, eliminam-se os sabões, restos de catalisador e de
metanol/etanol por um processo de lavagem com água e bor-
bulhação ou pelo uso de silicato de magnésio, requerendo este
último uma filtragem, ou ainda por destilação, que dispensa o
uso de produtos químicos para promover a purificação (HU et

al., 2008). Depois de separado destes componentes, o biodiesel

é purificado e tratado, estando pronto para uso, tanto puro
como misturado ao óleo diesel.
Um mecanismo reacional diferente, hidroesterificação,
pode ser obtido para produção de biodiesel. As etapas reacio-
nais são a hidrólise ácida do ácido graxo seguido por uma este-
rificação. A hidroesterificação é um processo alternativo muito
eficiente para matérias-primas de alta acidez e umidade, uma
vez que a matéria-prima nesta condição facilita a formação de
sabão quando submetidos à catálise básica (ARCEO, 2012).
Segundo Bueno (2007), a reação de hidrólise converte
triglicerídeos em ácidos graxos livres, mono e diglicerídeos, e
glicerol, sendo que ao final do processo o glicerol é removido,
evitando qualquer interação com o álcool ou com o biodie-
sel. Após a hidrólise, os ácidos graxos são esterificados com
metanol ou etanol, gerando então biodiesel (produto) e água
(subproduto). Essa água pode ser reaproveitada no processo de
hidrólise, fechando o ciclo. Embora o processo de hidroesterifi-
cação gere taxas muito elevadas de conversão, podendo atingir
valores superiores a 99%, a fase de reação de hidrólise requer
a utilização de trocadores de calor e de bombas de alta pressão,
além de catalisadores mais caros, o que eleva consideravel-
mente os custos de investimento em equipamentos e insumos
para esta técnica, limitando sua aplicação a escalas menores.
Apesar da produção de biodiesel ser relativamente sim-
ples, o produto final deve atender rigorosos padrões de quali-
dade determinados pela ANP conforme acima citado (ou outras
normativas, dependendo do país onde o biodiesel for utilizado)
a fim de que o combustível não prejudique o funcionamento
dos motores a longo prazo. A preocupação com a qualidade
deve se estender desde a escolha da matéria-prima até o arma-
zenamento após a fabricação (ZARDO, 2011).

A vantagem principal da produção de biodiesel de microal-
gas é que as microalgas não precisam competir com as oleagino-
sas alimentícias, que hoje são usadas na produção do biodiesel,
como é o caso do óleo de soja no Brasil e o óleo de canola na
Europa. Acredita-se que em futuro próximo a demanda de bio-
diesel produzido a partir de algas crescerá substancialmente.
No decorrer deste capítulo foi possível visualizar os desa-
fios a serem vencidos para possibilitar a produção de biodiesel
de microalgas de forma economicamente viável.
A eficiência de conversão pelas microalgas da energia
luminosa em biomassa, em dado cultivo, em relação à eficiên-
cia máxima teórica de conversão, se mostra como um indi-
cador da necessidade de otimização do cultivo de microalgas
para a produção de biodiesel.
O ideal é otimizar o cultivo de microalgas em larga escala
a fim de atingir uma produtividade de biomassa maior, equipa-
rável aos valores alcançados em cultivos fechados (fotobiorrea-
tores). Assim, é recomendável o cultivo em fotobiorreatores em
grandes plantas instaladas em locais que forneçam condições
ambientais mais favoráveis ao desenvolvimento das microalgas
a custo reduzido como, por exemplo, nas regiões onde a inci-
dência de luz solar é intensa (próximas a linha do Equador).
O custo de produção pode ser reduzido ao usar um meio
de cultivo de baixo custo, como uma fonte de CO2 resultante do
processo de fermentação da cana-de-açúcar, onde a demanda
nutricional pode ser suprida parcial ou totalmente por subpro-
dutos de outras atividades, como águas residuárias industriais,
efluentes sanitários ou gás carbônico proveniente de fábricas.
Outra alternativa que contribui para a viabilidade financeira é
o aproveitamento de outros componentes da biomassa microal-
gal.
Após a extração lipídica para a produção de biodiesel,
pode haver um aproveitamento da biomassa remanescente

como substrato de fermentação para a produção de bioetanol

(ANTUNES; SILVA, 2010), ou sua queima para produção de
metano, utilizada na produção de ração animal ou simples-
mente queimada para cogeração de energia (eletricidade ou
calor) (MATA; MARTINS; CAETANO, 2010). Essas medidas
permitem otimização do uso da biomassa potencialmente ener-
gética proveniente das microalgas, através do aproveitamento
de seus coprodutos, assegurando a rentabilidade global do pro-
cesso (CHEN et al., 2011; FERRERO, 2011).
As etapas entre o cultivo da biomassa e a extração lipídica
são o gargalo do processo produtivo do biodiesel a partir das
microalgas, pois como foi possível analisar através de cálculos
superficiais ao longo de todo texto, as etapas são muitas e one-
rosas, resultando em um alto custo operacional para obtenção
da matéria prima do biodiesel: os lipídios. Como o custo da
matéria prima utilizada para a produção do biodiesel constitui
cerca de 70% do valor final do produto (CEPEA, 2006) este
alto valor de obtenção de lipídios impacta drasticamente no
valor final do produto.
Para a obtenção de uma mesma quantidade de lipídios,
quanto maior for a produtividade de biomassa, menor será o
volume de cultivo requerido; e quanto maior for o teor lipídico
da microalga, menor será a quantidade de biomassa requerida
para o processo de colheita.
Cultura de microalgas é colhida como uma solução aquosa
diluída (de 0,1 a 2 g de biomassa de microalgas secas/L de cul-
tura) e é substancialmente concentrada. No entanto, a desidra-
tação da biomassa de microalgas para concentrações superiores
a 200 g de microalgas secas L-1 de cultura é energeticamente
proibitiva. É economicamente mais vantajosa a tecnologia
de extração de lipídios que puder ser aplicada diretamente à
matéria prima relativamente úmida, ou seja, processo prévios
de concentrações máximas entre 10 g e 200 g de biomassa de
microalgas secas L-1 de cultura (HALIM et al., 2011). Uma com-

paração entre a extração via solvente orgânico e por dióxido de

carbono supercrítico (SCCO2), mostra que cada uma delas tem
seus méritos e suas limitações. Apesar de ter baixa reatividade
com lipídios e sendo diretamente aplicável à matéria prima
relativamente úmida, a extração com solvente orgânico é lenta
e utiliza uma grande quantidade de solventes caros e tóxicos.
Por outro lado, a extração com SCCO2 é rápida, não tóxica, tem
elevada seletividade e produz lipídios livres de solventes. Suas
principais desvantagens estão associadas com o elevado custo
de capital e de energia.
Em meio supercrítico, as propriedades do meio variam
muito com a densidade, que por sua vez está fortemente ligada
às variações de temperatura e de pressão, provocando um
aumento na difusividade e na solubilidade do meio, atuando
como um excelente solvente para extração do óleo das micro-
algas, minimizando custos de processos de separação e dimi-
nuindo as perdas de produtos voláteis.
Pode-se concluir que o processo de produção de biodiesel
a partir de microalgas tem sua viabilidade econômica pautada
em três pontos principais:
• Aumento da escala produtiva, a fim de diluir os custos

de investimento;
• Otimização do cultivo microalgal, com o intuito de
se obter maiores produtividades de biomassa, a fim
de favorecer a minimização do custo operacional na
etapa de colheita;
• Escolha da metodologia operacional de colheita e da
extração adequadas à microalga cultivada.
Ainda existem muitos questionamentos a esse respeito

que merecem atenção da comunidade cientifica até que este
processamento promissor do ponto de vista ecológico se torne
favorável economicamente.

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PARTE 2
DESAFIOS DE CULTIVO
DE MICROALGAS PARA
PRODUÇÃO DE BIOMASSA

CAPÍTULO 4
POTENCIAL CLIMÁTICO PARA

O CULTIVO DE MICROALGAS
EM SISTEMAS ABERTOS
NO ESTADO DO PARANÁ
João Henrique Caviglione
Diva Souza Andrade

Introdução
O planeta sofre o impacto das mudanças climáticas, o que
acaba por fomentar a busca por alternativas energéticas ao uso
dos combustíveis fósseis. A viabilização dos biocombustíveis é
objetivo de muitos, quer seja pela redução na emissão de gases
de efeito estufa e carbono de origem fóssil na atmosfera, pela
sustentabilidade, ou pelo custo elevado das fontes energéticas
tradicionais. Dentre os microrganismos, as microalgas se desta-
cam como um importante grupo, que se caracteriza pelo cresci-
mento rápido e grande produção de biomassa, a qual apresenta
compostos específicos, alguns altamente energéticos. Além de
produzir biomassa altamente energética, o cultivo das microal-
gas não compete com a produção de grãos pela agricultura,
pois independe de solos. Por isto, as microalgas tem sido foco
de estudos da pesquisa e da indústria, principalmente com o
objetivo energético. No entanto, em países como os USA, onde
o número de empresas ligadas a algacultura é grande, Trenta-
coste et al. (2014) questionam os potenciais de políticas e pro-
gramas que poderiam apoiar o cultivo de biomassa algal, bem
como as barreiras para a expansão destes programas.
De todas as fontes disponíveis para biocombustíveis, os
derivados de microalgas mostram potencial em termos ener-
géticos para se tornarem uma alternativa viável e sustentável
aos combustíveis fósseis. Essa premissa de sustentabilidade
pode fazer a diferença na produção e uso do biocombustível
a partir de microalgas. Explorando a possibilidade do uso de
combustível de microalgas na aviação comercial, Haddad e
Fawaz (2012) demonstram a competitividade do combustível
derivado de microalgas em relação aos combustíveis fósseis,
quando se considera no processo a questão ambiental.
Como há pouco conhecimento disponível na literatura
sobre a modelagem da temperatura e radiação, relacionado
ao desenvolvimento e crescimento de microalgas, o objetivo
neste capítulo é apresentar um estudo de caso sobre este tema.

Nesse sentido, foi conduzida uma análise do potencial climá-

tico anual para o cultivo massal de microalgas em sistemas
abertos no Estado do Paraná, visando a obtenção de óleo e o
aproveitamento comercial de seus subprodutos.
4.1 Exigências Climáticas para a Produção

Massal de Microalgas
Os dados das exigências climáticas para o crescimento de
microalgas foram obtidos através de um levantamento biblio-
gráfico, considerando principalmente a temperatura e lumino-
sidade, ou Radiação Fotossinteticamente Ativa (Photosyntheti-
cally active radiation, PAR), citadas nos artigos sobre microalgas.
De acordo com este levantamento, as temperaturas para o cul-
tivo microalgal variaram de 15 a 39ºC (Tabela 4.1). Todavia,
na maioria dos artigos cita a temperatura e luminosidade ou a
PAR de cultivo, mas sem otimizar essas condições para obter
a máxima produtividade de biomassa da espécie ou da estirpe
de microalga estudada. Considerando se que a moda estatística
dos dados levantados nos artigos foi de 20°C e a média de 22°C,
esta última foi utilizada como temperatura base para gerar os
mapas da regionalização do cultivo de microalgas no Paraná.
Tabela 4.1. Espécies e temperatura (°C) de crescimento das microalgas.
Microalga
Temperatura Fonte
Gênero Espécie
Ankistrodesmus gracilis 20 Almeida (2007)
Fioresi e
A. gracilis 24 Sipaúba-Tavares
(2008)

Nordi et al.
A. gracilis 23
(2006)
Sipaúba-Tavares
A. gracilis 22
et al. (2009)
Jacob-Lopes;
Revah et al.
Aphanothece microscopica 35
(2009)REVAH,
et al., 2009
Teixeira et al.
Arthospira platensis 30
(2008)
Borges et al.
Chaetoceros Affinis 15
(2007)
Moura-Junior et
C. gracilis 18
al. (2006)
Borges et al.
C. muelleri 20
(2007)
Borges et al.
C. muelleri 22
(2007)
Ding et al.
Chlamydomonas sp. 25
(2007)
Borges et al.
Isochrysis galbana 27
(2007)
Junior et al.
Isochrysis galbana 18
(2006)
Microcystis panniformis 20 Almeida (2007)
Rückert e Giani
M. viridis 20
(2004)
Borges et al.
Nannochloropsis oculata 20
(2007)

Borges et al.
Phaeodactylum tricornutum 20
(2007)
Borges et al.
Skeletonema costatum 20
(2007)
Gonzales et al.
Spirulina maxima 30-35
(2006)
Macedo e Alegre
S. maxima 25-35
(2001)
Miranda et al.
S. maxima 20
(1998)
Santos et al.
S. maxima 25
(2003)
Muliterno et al.
S. platensis 30
(2005)
Andrade et al.
Spirulina sp. 30
(2008)
Borges et al.
Tetraselmis chuii 20
(2007)
Klein e González
T. chuii 24
(1993)
Borges et al.
T. tetrathele 20
(2007)
Borges et al.
Thalassiosira weissflogii 20
(2007)
Borges et al.
T. pseudonana 20
(2007)
Moura-Junior et
T. weissflogii 18
al. (2006)
Os dados de luminosidade levantados nos artigos estão sintetizados na Tabela 4.2. Neste parâmetro
destaca-se a grande variação nas unidades de medida utilizadas. A unidade adotada da Radiação Fotossin-
teticamente Ativa se refere ao acúmulo de energia no dia e não ao fluxo de radiação, em razão do objetivo
buscar a maior produtividade de biomassa de microalgas. Todos os dados de luminosidade ou iluminação
foram convertidos para radiação acumulada no dia e expressa em MJ m-2 dia-1.

Tabela 4.2. Intensidade de luz e Radiação Fotossinteticamente Ativa

(PAR) por espécies de microalgas.
Microalga Fluxo de
PAR1
fótons Fonte
Gênero Espécie μmol.m-2.s-1
Ankistrodesmus gracilis 600 (12h) 5,55 Almeida (2007)
fioresi e
13,5 a
gracilis
20,7
0,38 Sipaúba-
Tavares (2008)
Nordi et al.
gracilis 174 (12h) 1,61
(2006)
Sipaúba-
gracilis 24,12 0,45 Tavares et al.
(2009)
Jacob-lopes;
150
Aphanothece microscopica 2,78 Scoparo et al.
(24h)
(2009)
43 kLux Teixeira et al.

Arthospira platensis (12h)
2,72
(2008)
Borges et al.,
Chaetoceros affinis 64 (12h) 0,59
(2007)
Moura-Junior
C. gracilis 40 w2 0,05
et al. (2006)
Borges et al.
C. muelleri 369 (12h) 3,42
2007)
Borges et al.
C. muelleri 40 w 0,05
2007)

Ding et al.
Chlamydomonas sp. 24-34 0,63 (2007)
Borges et al.
Isochrysis galbana 457 5,06
(2007)
Moura-Junior et
I. galbana 40 w 0,05 al., (2006)
Microcystis panniformis 700 6,47 Almeida, 2007)
Rückert e Giani
viridis 60 0,56
(2004)
BorgeS et al.
Nannochloropsis oculata 399 3,69
(2007)
Borges et al.
Phaeodactylum tricornutum 135 1,25
(2007)
BorgeS et al.
Skeletonema costatum 279 2,58
2007)
3.2 kLux GonzaleS et al.

Spirulina maxima 0,21
(12h) (2006)
6x40 w Macedo e
S. maxima 0,32
2.4 kLux Alegre (2001)
5 kLux Miranda et al.

S. maxima 0,37
(14h) (1998)
6x40 w Santos et al.

S. maxima 2.4 kLux
0,32
(2003)
3 kLux Muliterno et al.

S. platensis 0,19
(12h) (2005)
Andrade et al.
Spirulina sp. 2.5 kLux 0,32
(2008)

Borges et al.
Tetraselmis chuii 209 1,93
(2007)
Klein e
T. chuii 40w 0,05
González 1993)
Borges et al.
T. tetrathele 261 2,41
(2007)
Borges et al.
Thalassiosiora weissflogii 199 1,84
(2007)
Borges et al.
T. pseudonana 416 3,84
(2007)
Moura-Junior et
T. weissflogii 2x40w 0,10 al. (2006)
1
Radiação Fotossinteticamente Ativa (PAR) acumulada no dia (MJ m-2 dia-1). Quando não definido, o
fotoperíodo considerado para os cálculos foi de 24 h; 1 lux = 1 lumen m-2; 1 watt = 683 lumens, 1 lumen =
6,792.10-3 µmol fótons s-1; 1 watt m-2 = 4,67 μmol fóton m-2 s-1 de PAR na luz solar. Fonte: (BOOTHE, 2002).2
Lâmpadas fluorescentes de 40 w
4.2 Caracterização Climática (Temperatura e

PAR) do Paraná
O Paraná situa-se na região Sul do Brasil, com o Trópico de
Capricórnio passando pelo estado. O estado apresenta transi-
ções entre climas Cfa e Cfb, segundo a classificação de Köppen,
conforme a Figura 4.1 (CAVIGLIONE et al., 2000). O clima Cfa
é subtropical, com temperatura média no mês mais frio infe-
rior a 18°C (mesotérmico) e temperatura média no mês mais
quente acima de 22°C, com verões quentes, geadas pouco fre-
quentes e tendência de concentração das chuvas nos meses de
verão, contudo sem estação seca definida. Já o clima Cfb é
temperado propriamente dito, com temperatura média no mês
mais frio abaixo de 18°C (mesotérmico), com verões frescos,
temperatura média no mês mais quente abaixo de 22°C e sem
estação seca definida.

Figura 4.1. Mapa da classificação climática do Estado do Paraná, Brasil.
4.3 Temperatura do Ar no Paraná

Os mapas de temperatura média mensal para o Estado do
Paraná foram gerados a partir de uma série de dados meteo-
rológicos históricos de até 30 anos, coletados nas 55 estações
meteorológicas do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) e
do Sistema Meteorológico do Paraná (SIMEPAR), que estão dis-
tribuídas em todo o Estado do Paraná (Figura 4.2).
Foram obtidas regressões entre as coordenadas (latitude,
longitude) e altitude das estações. As interpolações, através das
regressões, foram obtidas com base no modelo digital de ele-
vação SRTM (RABUS et al., 2003), com resolução espacial de
900 metros.
As áreas com potencial de cultivo no estado para espécies
de diversos gêneros de microalgas em sistema aberto, sem con-
trole de temperatura, no Estado do Paraná, são apresentadas
segundo as médias mensais para os meses de janeiro a abril,
nas Figuras 4.3 a 4.6, respectivamente, de maio a agosto, na

Figura 4.7 e de outubro a dezembro nas Figuras 4.8 a 4.11,

respectivamente.
Figura 4.2. Municípios do Paraná onde estão localizadas as estações

meteorológicas do IAPAR.
Figura 4.3. Distribuição das áreas com potencial de cultivo de mi-

croalgas em sistemas de tanques abertos no mês de ja-
neiro, considerando a temperatura base de 22ºC.


croalgas em sistemas de tanques abertos no mês de fe-
vereiro, considerando a temperatura base de 22ºC.
Jorquera et al. (2010) apontam que o cultivo e a produção

de biomassa de microalgas ricas em lipídeos em lagoas e canais
adutores são economicamente viáveis. Para espécies da Classe
das Chlorophyceae, por exemplo, Chlorella sorokiana, foi rela-
tado que, usando uma coluna cilíndrica acrílica transparente
como fotobiorreator, a temperatura do meio de cultivo atin-
giu 41°C, no entanto, o controle da temperatura não é essen-
cial (BÉCHET et al., 2013). Em contraste, a temperatura ótima
variou de 27 a 35ºC, em estudos realizados para determinar a
taxa de crescimento ao longo de uma ampla gama de intensi-
dades de luz (30-456 μmol m-2 s-1) e de temperatura (15-35ºC),
utilizando fotoperíodo com ciclo de 15/9h (claro/escuro). As
taxas de crescimento máximas para algumas microalgas e as
intensidades de luz ideal em fótons a uma temperatura de
35ºC foram 1,73 d-1 e 420 μmol m-2 s-1 para Selenastrum minu-
tum, 1,64 d-1 e 400 μmol m-2 s-1 para Coelastrum microporum e
de 1,00 d-1 e 400 μmol m-2 s-1 para Cosmarium subprotumidum
(BOUTERFAS et al., 2002).

Para os diferentes gêneros de microalgas consultados na

literatura nesse estudo, as temperaturas médias no Paraná nos
meses de janeiro a março (Figuras 4.3, 4.4 e 4.5), permitem
o cultivo em sistemas abertos em grande parte do estado. No
período de maio a agosto (Figura 4.7), a temperatura média
apresenta-se abaixo da base utilizada para a maioria dos gêne-
ros citados na literatura e, portanto, sem condições de cultivos
produtivos com as espécies citadas nos artigos da Tabela 4.1.
Essa análise do potencial de áreas de cultivo em tanques
abertos no Paraná mostra que os parâmetros que influenciam
na produção devem ser detalhados. Uma alternativa é a sele-
ção de espécies adaptadas a temperaturas abaixo de 22°C. Por
exemplo as microalgas dos gêneros Ankistrodesmus e Chae-
toceros adaptam se bem a temperaturas abaixo de 20°C. No
trabalho de coleta, no Estado do Paraná, para a formação da
Coleção de microalgas IPR foram encontradas espécies dos
gêneros Ankistrodesmus e Chaetoceros. Há espécies de micro-
algas que são capazes de crescer a temperaturas menores que
20ºC, como exemplo, Ankistrodesmus gracilis crescem em 15°C
(ALMEIDA, 2007), Chaetoceros gracilis a 18°C (BORGES et al.,
2007; JUNIOR et al., 2006). Outra opção para o cultivo de
microalgas em regiões com temperaturas abaixo de 22ºC é o
uso de sistemas fechados ou parcialmente fechados, com con-
trole de temperatura, que tendem a resultar em maior produti-
vidade durante todo o ano.
Portanto, no período de maio a agosto (Figura 4.6), a tem-
peratura média para alguns dos gêneros descritos na literatura
está abaixo da considerada ótima e, dessa maneira, nessas
regiões é necessária a seleção de espécies adaptadas a tempe-
raturas inferiores a 22ºC ou, alternativamente, a produção de
microalgas deve ser feita em espaços fechados ou parcialmente
fechados, com controle de temperatura para aumentar a pro-
dutividade e permitir produção durante todo o ano.
A análise sazonal dos dados de temperatura mostra que
no verão, primavera e parte do outono, há a possibilidade de
produzir biomassa de microalgas usando sistemas ao ar livre,

sem controle de temperatura. No entanto, no inverno, metade

da área do Estado do Paraná precisa de algum controle de tem-
peratura ou microalga adaptada a condições de baixas tempe-
raturas. No entanto, a validação desses modelos deve ser feita
por meio de cultivos em sistemas aberto ou fotobiorreatores ao
ar livre, bem como o cultivo de diferentes espécies de microal-
gas.
4.4 Radiação Fotossinteticamente Ativa (PAR)

Os cloroplastos convertem uma faixa da radiação solar em
energia química. Esta faixa da radiação solar é denominada de
Radiação Fotossinteticamente Ativa (Photosynthetically active
radiation - PAR), ela é semelhante ao espectro visível e com-
preende a radiação entre os comprimentos de onda de 400 a
700 nm (MCCREE, 1972). A PAR pode ser expressa de formas
distintas, a fotônica em fluxo e a energética, ou acumulada
em um período. A forma fotônica quantifica o fluxo de fótons,
representada por mol de fótons m-2 s-1 ou Einstein m-2 s-1. O
fluxo de energia é expresso em Watts m-2 e a energia acumu-
lada em J m-2.
A forma fotônica da PAR normalmente é utilizada em tra-
balhos sobre a fisiologia da fotossíntese, enquanto que para
acúmulo e conversão em biomassa a forma energética (acumu-
lada) é apropriada. A conversão entre as formas depende da
constante de Planck em cada frequência do espectro.
A maioria das estações meteorológicas convencionais é
desprovida de equipamentos específicos para a determina-
ção da PAR. No entanto, a PAR é um componente da radiação
global medida nas estações. A PAR corresponde, aproximada-
mente, a 46% da radiação global e sofre pequenas alterações
em função da posição no planeta, nebulosidade, dia do ano e
horas do dia. A Figura 4.12 mostra a distribuição da radiação
solar, nos diferentes comprimentos de onda que já foi determi-
nado e padronizado (ASTM, 2012).


croalgas em sistemas de tanques abertos no mês de
março, considerando a temperatura base de 22ºC.

abril, considerando a temperatura base de 22ºC.


croalgas em sistemas de tanques abertos nos meses de
maio, junho, julho e agosto, considerando a tempera-
tura base de 22ºC.

croalgas em sistemas de tanques abertos no mês de se-
tembro, considerando a temperatura base de 22ºC.


croalgas em sistemas de tanques abertos no mês de ou-
tubro, considerando a temperatura base de 22ºC.

novembro, considerando a temperatura base de 22ºC.


dezembro, considerando a temperatura base de 22ºC.
ASTM G173-03 Reference Spectra
2,00
1,75
Topo da atmosfera Radiação global

Irradiância espectral (W m-2 nm -1)
1,50
1,25
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
100 400 700 1000 1300 1600 1900 2200
Comprimento de onda (nm)
Figura 4.12. Referência da distribuição do espectro de radiação so-

lar (ASTM, 2012).

Dentre os trabalhos que buscam a equivalência entre a

Radiação Global (RG) e a PAR, Galvani (2009) determinou
quatro equações para São Paulo, segundo as quatro estações
do ano. Estas estimam a PAR em razão da radiação global e
foram utilizadas tendo em vista a proximidade geográfica entre
São Paulo e Paraná, bem como a deficiência de trabalhos seme-
lhantes para o Paraná. Nas equações 1, 2, 3 e 4, PAR é a radia-
ção fotossinteticamente ativa e RG é a radiação global e R2 é o
coeficiente de determinação da cada regressão.
Verão - PAR = 0,429.RG (R2 = 0,97)

(1)
Outono - PAR = 0,451.RG (R2 = 0,98) (2)
Inverno - PAR = 0,448.RG (R2 = 0,98) (3)
Primavera - PAR = 0,457.RG (R2 = 0,97)
(4)
As equações de Galvani (2009) foram utilizadas para esti-

mativa de PAR a partir dos dados de registrados de radiação
global de 38 estações meteorológicas do SIMEPAR no período
de 1999 a 2005. Os dados estimados de PAR foram utilizados
para interpolação e construção dos mapas. A Figura 4.13 apre-
senta a localização das estações do SIMEPAR utilizadas.
A partir dos dados de Radiação global horária das estações
meteorológicas do SIMEPAR e das equações de Galvani (2009),
estimou-se os dados da PAR para o Paraná. Foram determi-
nadas as médias diárias acumuladas de energia e sumariza-
das para cada uma das estações do ano. Em razão da variação
da duração dia, as medias diárias são apresentadas em Mj m-2
dia-1. Os dados foram interpolados no software ArcGis, resul-
tando nos mapas de estimativa da PAR apresentados a seguir.
A Figura 4.14 refere-se à PAR de outono, a Figura 4.15 à PAR
de inverno, a Figura 4.16 à PAR de verão, a Figura 4.17 à PAR
de primavera e a Figura 4.18 à PAR anual.

Figura 4.13. Mapa da localização das estações meteorológicas do

SIMEPAR utilizadas para os dados de radiação.
Figura 4.14. Mapa da radiação solar fotossinteticamente ativa

(PAR), média diária acumulada com base em dados
do período de outono.


do período de inverno.

do período de verão.


do período de primavera.
Figura 4.18. Mapa da Radiação solar fotossinteticamente ativa

(PAR), média diária acumulada PAR com base em
dados anuais.

Os dados da distribuição de radiação mostram claramente

que não há limitações de luminosidade ou PAR ao desenvol-
vimento de microalgas no Paraná, em “raceways” ou sistemas
sem iluminação artificial. No entanto, a produção com rendi-
mento econômico, depende de uma análise da eficiência da
conversão da PAR em biomassa.
As áreas do noroeste, norte e oeste do estado do Paraná
apresentaram maior potencial para produção de biomassa de
microalgas em fotobiorreatores ao ar livre e tanques abertos
durante todo o ano. No entanto, quando se considera a possi-
bilidade de cultivo de espécies mais adaptadas a baixas tempe-
raturas (menores do que 22ºC), na maioria da área do estado
é possível o crescimento de microalgas, sem controle da tem-
peratura.
A análise preliminar das potenciais áreas de cultivo em
tanques abertos no estado do Paraná mostra que as alternativas
apresentadas devem ser detalhadas. Um exemplo é a seleção
de espécies de microalgas adaptadas a temperaturas inferio-
res a 22°C pode ser uma opção para aumentar o período de
recomendação para o cultivo durante o ano. Outra alternativa
são os cultivos fechados ou parcialmente fechados, com con-
trole de temperatura para aumentar a produtividade de micro-
algas ao longo do ano.
Com relação à luminosidade ou PAR, não existe limitação
para o cultivo massal de microalgas no Paraná em nenhuma
época do ano.
O estudo da viabilidade considerando as condições cli-
máticas mostrou o grande potencial para o cultivo massal de
microalgas no estado do Paraná.

Referências
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CAPÍTULO 5
POTENCIALIDADES E LIMITAÇÕES DO
USO DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS
NO CULTIVO DE MICROALGAS PARA
PRODUÇÃO DE BIODIESEL
Antônio Costa
Graziela Moraes de Cesare Barbosa
Patrícia Cristina Gomes

Introdução
O uso de combustíveis fósseis tem aumentando considera-
velmente nas últimas décadas. Há preocupação com a capaci-
dade das reservas de petróleo conhecidas atender esse aumento
de demanda no longo prazo, mesmo com a descoberta de novas
jazidas.
Além do eventual esgotamento das reservas de petróleo e
os seus reflexos na economia, também é preciso considerar os
aspectos ambientais do uso dos combustíveis fósseis. Assim, a
produção sustentável de energia representa uma questão a ser
equacionada no século XXI.
Os biocombustíveis podem ser uma contribuição promis-
sora para que essa equação seja resolvida, aliando economi-
cidade e baixo impacto ambiental. Dentre os combustíveis
renováveis mais promissores destaca-se o biodiesel, cujas limi-
tações estão relacionadas à disponibilidade de matéria-prima
que atenda, quantitativa e qualitativamente, à demanda por
óleos vegetais e processos de produção viáveis economica-
mente, com capacidade de competição com os combustíveis
fósseis e com sustentabilidade ambiental.
De um lado o biodiesel é um componente essencial para
garantir a sustentabilidade econômica e socioambiental de
nosso setor energético. De outro lado, o biodiesel oriundo de
plantas oleaginosas, bem como de óleos de fritura e de gor-
dura animal, não consegue atender sequer uma pequena parte
da demanda global por biocombustíveis, uma vez que exigiria
uma extensão elevada de áreas cultiváveis e uma complexa
rede de coleta de resíduos. Ainda, o histórico da produção bra-
sileira de biodiesel mostra o setor em crescente dependência de
uma única matéria-prima, a soja, contrapondo-se ao objetivo
do Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel (PNPB)
de sustentar sua cadeia na diversidade de materiais graxos dis-
poníveis nas várias regiões do País (FRANCO et al., 2013).
A soja, como matéria-prima para o biodiesel, tem a limita-
ção de ser uma commodity, assim seu valor é cotado conforme
a variação do mercado internacional. Atualmente, com mer-

cado firme, seu preço tem sido elevado encarecendo a matéria-

-prima para produção de biodiesel.
Nessa visão, a produção de biocombustíveis a partir de
microalgas apresenta como vantagens alta produtividade,
necessidade de menor área que os cultivos de plantas agríco-
las oleaginosas, capacidade para absorver nutrientes de meios
residuais e elevada eficiência no uso da água.
As microalgas necessitam basicamente de energia solar e
CO2 para produzirem óleos com uma eficiência maior do que
a obtida em plantações de oleaginosas. Enquanto a soja pro-
duz de 13 a 22 barris equivalentes de petróleo (ha-1 ano-1), as
microalgas tem potencial para produzir 390 a 700 barris equi-
valentes de petróleo (ha-1 ano-1) (FRANCO et al., 2013).
Apesar dos aspectos positivos e das grandes perspectivas
que o cultivo de microalgas apresenta, a produção em escala
está ainda muito distante de alcançar viabilidade econômica e
comercial. A dificuldade se justifica pelos desafios ainda exis-
tentes para esta tecnologia emergente, que podem ser resumi-
dos nos seguintes itens (RAMOS et al., 2011):
a) complexidade da logística de produção em larga esca-

la;
b) dificuldades no uso de organismos geneticamente mo-
dificados em sistemas abertos;
c) alto custo na formulação dos meios de cultivo;
d) complexidade no escalonamento de estratégias de pro-
dução em sistema fechado, a exemplo dos fotobiorrea-
tores;
e) alto custo de produção em sistemas heterotróficos;
f) alta demanda energética para secagem e extração de
lipídeos;
g) alta acidez do material lipídico isolado, algo que de-
pende intrinsecamente da tecnologia empregada para
a extração.

A produção de microalgas em meios formulados torna o

processo de cultivo economicamente limitante devido ao alto
custo de produtos químicos comerciais. Os meios de cultivo
devem proporcionar todos os elementos essenciais ao desen-
volvimento de uma microalga. Mais do que isso, há elementos
essenciais para certas espécies que podem ser desnecessárias
para outras. Não há, portanto, nenhum meio de cultura viável
para o cultivo de todas as espécies de microalgas. Os exem-
plos mais bem sucedidos de meios de cultura contemplam, de
forma abrangente, as necessidades nutricionais de centenas de
espécies testadas, que passam a ser naturalmente a primeira
opção de meio de cultura a ser testado no caso de espécies
cujas necessidades nutricionais básicas são desconhecidas
(LOURENÇO, 2006).
Uma solução para os elevados custos dos meios de cultivo
sintéticos é o uso de meios alternativos para o cultivo desses
microrganismos, onde se procura estabelecer um substrato
eficiente e, financeiramente, menos dispendioso (MOREIRA,
2007). Nesse sentido, vários resíduos agroindustriais têm sido
utilizados como base para meios de cultivo. O objetivo deste
capítulo é discutir o uso de alguns desses resíduos no cultivo
de microalgas.
5.1 Caracterização Físico-Química dos

Resíduos como Meio de Cultura para
Microalgas
Resíduo pode ser definido como todo material em estado
sólido, líquido ou gasoso, que é descartado. Resulta de um pro-
cesso de extração direta dos recursos da natureza, de transfor-
mação, de fabricação ou de consumo. É material considerado
de baixo ou nenhum valor econômico. É o que sobra de alguma
atividade.

Atividades agropecuárias e de processamento de seus pro-

dutos têm proporcionado grandes volumes de resíduos, alguns
com alto impacto poluente. Esses resíduos podem apresentar
alta concentração de material orgânico e seu lançamento in
natura em corpos hídricos pode ocasionar grande decréscimo
na concentração de oxigênio dissolvido, provocando a morte
de animais, a exalação de odores fétidos e gases agressivos,
dificultando o tratamento da água para abastecimento público.
As microalgas vivem essencialmente em meio líquido. Por
essa razão, os resíduos do criatório de animais e das atividades
agroindustriais podem ser constituintes dos meios de cultivo
das mesmas. O uso desses resíduos justifica-se, pois são fontes
de nutrientes para o meio de cultivo, reduzindo o seu custo.
Ainda, promove a reciclagem e a disposição adequada des-
ses dejetos, contribuindo para mitigar problemas ambientais
decorrentes do seu lançamento em mananciais, como elevação
da demanda bioquímica por oxigênio (DBO), eutrofização dos
corpos hídricos e proliferação de doenças. Em muitos casos, é
possível observar, a olho nu, a presença de algas nesses resí-
duos.
Por outro lado, o uso de resíduos pressupõe riscos, pois
pode fazer parte de sua constituição metais pesados, compostos
orgânicos persistentes, patógenos, nitratos etc. Portanto, deve-
-se buscar a minimização ou eliminação do risco pela avaliação
da viabilidade do resíduo a ser usado no cultivo da microalga.
A origem do material deve ser conhecida, a amostragem e a
análise do resíduo devem ser criteriosas. Depois de caracteri-
zar o resíduo, deve-se avaliar a necessidade de pré-tratamento
desse material para o cultivo de microalgas.
No Projeto Microalgas para Produção de Biodiesel, convê-
nio IAPAR, Copel, Fapeagro, a busca por fontes alternativas de
meios de cultivo foi definida como uma linha de pesquisa, pois o
estado do Paraná apresenta várias cadeias produtivas que geram
elevada quantidade de resíduos, entre as quais podemos citar
aqueles originados: da suinocultura, da indústria sucroalcoo-
leira, dos aterros sanitários e da indústria de sucos de frutas.
A suinocultura gera grande volume de dejeto, com cerca

de 1,3 milhões de m3 mensais (IBGE, 2010). É composto pelas

fezes dos animais confinados, restos de ração, pelos, urina e
água de lavagem das instalações. Esse volume produzido causa
grande impacto no meio ambiente como, por exemplo, a eutro-
fização dos mananciais, com consequente desequilíbrio dos
ecossistemas.
O resíduo da suinocultura, utilizado como fonte alterna-
tiva para cultivo de microalgas no projeto, foi coletado em uma
granja de suínos de ciclo completo, situada no município de
Arapongas, PR (Figura 5.1). Antes da coleta, o dejeto passou
por processo de biodigestão. O uso desse resíduo no cultivo de
microalgas tem se mostrado promissor, ainda que limitações
existam, como será discutido ao longo desse capítulo.
Figura 5.1. Coleta de resíduo, após passagem por biodigestor, em

granja de suínos de ciclo completo, localizada no muni-
cípio de Arapongas, PR.
A produção de cana-de-açúcar gerou no Paraná, em 2010,

22 milhões de m3 de resíduo (ALCOPAR, 2011). A vinhaça
apresenta baixo teor de matéria orgânica, mas é rica principal-

mente em fontes minerais. O resíduo da indústria sucroalcoo-

leira (vinhaça) utilizado no trabalho foi coletado em uma lagoa
de decantação da Usina situada no município de Rolândia, PR,
(Figura 5.2).
Figura 5.2. Coleta de vinhaça em usina de processamento de cana

localizada no município de Rolândia, PR.

O cultivo de microalgas em meio à base de vinhaça tem

apresentado resultados satisfatórios, mas há necessidade de se
equilibrar o balanceamento de nutrientes desse resíduo, bem
como sua concentração, uma vez que sua tonalidade escura
dificulta a entrada de luz no meio de cultivo.
A fruticultura, particularmente o cultivo de laranja no
Norte do Paraná, gera resíduo no processamento de extração
e industrialização do suco. Esse resíduo contém água de lava-
gem e restos de suco e representa de 30 a 50% da quantidade
de suco produzida. É uma fonte muito diluída e que necessita
da complementação de nutrientes para seu uso no cultivo de
microalgas.
O resíduo da extração do suco de laranja foi proveniente
de lagoa de decantação que continha resto de suco e água
de lavagem das máquinas de extração do suco de laranja, no
município de Rolândia, PR (Figura 5.3).
Entre outros resíduos incluem os produzidos em aterros
sanitários que são abundantes no estado do Paraná e um dos
principais causadores de impactos ambientais. O lixiviado
(chorume) formado nos aterros pode ser aproveitado como
meio no cultivo de microalgas para a produção de biodiesel. A
formação do chorume em aterros sanitários ocorre principal-
mente pela percolação de água advinda da precipitação atmos-
férica e escoamento superficial, que infiltra pela cobertura do
aterro; da umidade inicial contida nos resíduos depositados e
da decomposição dos resíduos devido à atividade microbioló-
gica. Em decorrência de seu processo de formação, a compo-
sição do resíduo é muito variável e necessita de padronização
para o cultivo de microalgas.

Figura 5.3. Coleta de resíduo da indústria de suco de laranja em

unidade localizada no município de Rolândia, PR.
O chorume foi coletado no aterro do município de Lon-

drina, PR (Figura 5.4).

Figura 5.4. Coleta de resíduo em lagoa de tratamento de aterro sa-

nitário de Londrina, PR.
Uma das limitações na utilização dos resíduos no cultivo

de microalgas é a grande variabilidade dos teores de nutrientes
e o desequilíbrio da composição dos resíduos em relação à
demanda por nutrientes das microalgas. Portanto, ao contrário

dos meios sintéticos, formulados para cada situação específica

de cultivo das microalgas, os resíduo apresentam, simultanea-
mente, vários nutrientes que se encontram em quantidades
desproporcionais em relação às exigências das microalgas. Na
Tabela 5.1 apresentam-se resultados médios dos meios usados
no cultivo de microalgas, originados dos resíduos, no projeto
de cooperação IAPAR, Copel, Fapeagro.
Há grande variabilidade na composição química dos resí-
duos e as quantidades que os constituem não são proporcionais
à demanda de nutrientes exigida pelas microalgas. Na compo-
sição elementar média das algas a relação de nitrogênio (N),
fósforo (P) e potássio (K), nutrientes mais abundantes em sua
constituição, é de 6:1:1,5, respectivamente (HECKY; KILHAM,
1988), sendo 55 mg de N, 11 mg de P e 17,3 mg de K por g
de massa seca de alga. Essa relação não é contemplada por
nenhum dos resíduos avaliados, fato que constituí uma limita-
ção ao uso (Tabela 5.1).
As amostras do resíduo de suco de laranja foram as que
apresentaram as menores concentrações em nutrientes e, parti-
cularmente, com concentração muito baixa em nitrogênio, ele-
mento exigido em grande quantidade pelas microalgas (Tabela
5.1). Esse fato, em si, limita o uso desse resíduo como fonte de
nutrientes para cultivo destes microrganismos, uma vez que a
quantidade de elementos a ser fornecida no meio de cultivo
para complementar sua composição seria elevada, não contri-
buindo assim para reduzir consideravelmente os custos de pro-
dução de microalgas.
No resíduo proveniente do aterro sanitário, mostra que
a relação N:P:K média analisado foi de 29:1:56, portanto há
necessidade de adição de fontes de fósforo e nitrogênio para
balancear sua composição para o cultivo de microalgas, de
modo a atingir a relação de 6:1:1,5.

Tabela 5.1. Nutrientes nos resíduos de suinocultura, aterro sanitá-

rio, indústria sucroalcooleira e de extração de suco de
laranja.
N P K Ca Mg B Cu Mn Zn
avaliados
Resíduos
g kg-1 mg kg-1
Resíduo de
laranja
0,05 0,020 0,276 0,139 0,018 0,223 0,118 0,721 0,264

suinocultura
Resíduo da
1,38 2,515 0,376 3,295 0,552 2,084 3,969 78,564 194,407

de aterro
sanitário
Resíduo
1,04 0,036 2,203 0,263 0,250 3,188 0,353 2,638 2,904

(vinhaça)
Resíduo
da cana
0,36 0,049 2,40 0,368 0,220 11,2 4,8 5,2 13,2
A vinhaça é um resíduo abundante na região Norte do

Paraná. Os resultados médios das amostras analisadas de
vinhaça indicaram teores elevados de potássio e bons níveis
de micronutrientes: boro, cobre, manganês e zinco. A relação
N:P:K, entretanto, é bastante desequilibrada, 7,35:1:48,98. O
uso de vinhaça pressupõe sua diluição e complementação com
nitrogênio e fósforo, condição que onera o custo do seu uso no
cultivo de microalgas, porém, dependendo das condições não
o inviabiliza.

O resíduo da suinocultura, também denominado dejeto

líquido de suíno (DLS) foi o que apresentou, na média, maior
concentração de nutrientes dos resíduos avaliados. Os teores
de cálcio, fósforo, cobre e manganês são relativamente altos,
quando comparados aos demais resíduos. A relação de N:P:K
nesse resíduo é de 3,67:6,69:1, respectivamente, portanto,
diferente da relação média da composição das microalgas de
6:1:1,5, mencionada anteriormente no texto.
Para realizar uma comparação do resíduo suíno biodige-
rido (RSB) com meio sintético no cultivo das microalgas, culti-
vou-se Chlorella vulgaris, por 21 dias, em condições de tempera-
tura e luz controladas em meio BG-11 (meio sintético utilizado
em cultivos de microalgas), conforme descrito na Tabela 5.1, e
em RSB, em três concentrações de nitrogênio, 25% (RSBN25);
50% (RSBN50) e 100% (RSBN100). A maior dose de RSBN100
correspondia à dose de nitrogênio no meio BG-11. O objetivo
do experimento foi observar o crescimento da microalga no
RSB e avaliar a possibilidade do resíduo substituir o meio sin-
tético de cultivo, BG-11.
A maior produção de biomassa para a microalga Chlorella
vulgaris foi observada em meio sintético BG-11 e no RSBN100,
ou seja, com a quantidade de nitrogênio foi a mesma, tanto no
RSB como no BG-11. O uso de RSB fornecendo menores quanti-
dades de N comprometeu a produção de biomassa de Chlorella
vulgaris, indicando que a menor quantidade de nitrogênio foi
limitante à produção nos tratamentos RSBN25 e RSBN50. De
outro lado, a menor produção de biomassa nos cultivos com
RSB pode indicar deficiências de outros nutrientes, que não só
N, quando comparado ao meio BG-11, que recebeu todos os
nutrientes para o adequado desenvolvimento das microalgas.
(Figura 5.5).

Figura 5.5. Massa seca de Chlorella vulgaris (g L-1) cultivada em meio

sintético BG-11 e em resíduo suíno biodigerido (RSB)
em três doses de nitrogênio, correspondentes a 25%
(RSBN25), 50% (RSBN50) e 100% (RSBN100) compa-
rada ao meio BG-11. Médias seguidas de mesma letra
não diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
O resultado obtido indica, portanto, que o uso de RSB, na

dose RSBN100, pode substituir o uso do meio sintético BG-11.
5.2 Ocorrência de Microalgas em Resíduos

Agroindustriais
As microalgas estão entre os microrganismos mais abun-
dantes em ambientes poluídos (lagoas de estabilização), com
predominância do gênero Chlorella sp., que são microrganis-
mos fotossintetizantes clorofilados e sem flagelos.
Dessa forma, ao isolar espécies de microalgas que ocorrem
em resíduos pode-se aproveitar a adaptação desses organismos
a esses meios e avaliar seu potencial de produtividade de lipí-

deos para a produção de biodiesel (CERTIK; SHIMIZU, 1999).

Os principais desafios para realização dessa atividade decor-
rem de dificuldades no isolamento, seleção e caracterização
morfofisiológica de espécies nativas promissoras e da avalia-
ção dos atributos relevantes de cada espécie ou estirpe (TAVA-
RES, 2009).
Para os estudos com microalgas as estirpes podem ser
isoladas de ambientes naturais ou adquiridas em Coleções de
microrganismos que prestam este tipo de serviço. Esses centros
de cepas podem fornecer microrganismos de características
já conhecidas, mas nem sempre estão presentes os melhores
caracteres desejados, enquanto no ambiente encontra-se uma
infinidade de variações (ROITMAM; TRAVASSOS; AZEVEDO,
1988).
Dessa forma, o isolamento inicia-se com o estabelecimento
dos resíduos a serem trabalhados e da constatação da ocorrên-
cia de microalgas nesse meio. Definiu-se selecionar microalgas
nos resíduos do confinamento de suínos, da indústria sucroal-
cooleira e do lixiviado de aterro sanitário, uma vez que esses
resíduos são de ocorrência expressiva no estado do Paraná.
Há dois métodos básicos para o isolamento das microalgas
em cultura: plaqueamento e seleção por capilar (pescaria). No
isolamento de microalgas dos resíduos optou-se pelo método
de plaqueamento. Usando-se essa técnica foram isoladas oito
estirpes de microalgas (Figuras 5.6 a 5.13):

Figura 5.6. Estirpe de microalga eucariota (clorófita) nominada IPR-

7121, isolada de resíduo suíno biodigerido.
Figura 5.7. Estirpe de cianobactéria nominada IPR-7122, isolada de

resíduo suíno biodigerido.

Figura 5.8. Estirpe de cianobactéria nominada IPR-7124, isolada de

resíduo suíno biodigerido.
Figura 5.9. Estirpe de microalga eucariota (clorófita) nominada IPR-

7125, isolada de resíduo suíno “in natura”.

Figura 5.10. Estirpe de microalga eucariota (clorófita) nominada

IPR-7126, isolada de vinhaça.

IPR-7127, isolada de vinhaça.


IPR-7128, isolada de resíduo de aterro sanitário.

IPR-7129, isolada de resíduo de aterro sanitário.

Após o isolamento, nos diferentes resíduos, foi estabele-

cida a curva para caracterização do crescimento de algumas
das microalgas isoladas. Os cultivos foram realizados em meio
BBM autoclavado, com adição de 10% de inóculo, mantidos em
câmara de crescimento com temperatura constante de 27°C,
com fotoperíodo de 12 h/12 h (claro/escuro), com iluminação
de lâmpadas de 65W.
O inóculo inicial da IPR-7121 foi de 0,75 x 105 células (cel)
mL-1. O inóculo inicial da IPR-7125 foi 4,0 x 105 cel mL-1. O
inóculo inicial da IPR-7126 foi de 2,28 x 106 cel mL-1 e da IPR-
7127 foi de 2,25 x 106 cel mL-1. O inóculo inicial da IPR-7128
foi de 3,375x106 cel mL-1 e da IPR-7129 foi de 23,125x106 cel
mL-1.
As curvas de crescimento foram elaboradas utilizando a
média da contagem celular diária (Figura 5.14).
A microalga IPR-7121 teve um crescimento inicial lento
atingindo sua densidade celular máxima no 17° dia (com 237,5
x 105 cel mL-1).
A estirpe de microalga IPR-7125 apresentou um cresci-
mento inicial lento nos primeiros dias de cultivo, porém atin-
giu alto crescimento ao final do ciclo. A IPR-7125 teve cresci-
mento expressivo no 21° dia (com 560 x 105 cel mL-1 e 576,25 x
105 cel mL-1, respectivamente).
A maior taxa de crescimento da IPR-7126 ocorreu no 25º
dia (819,38 x105 células mL-1) e da IPR-7127 ocorreu no 20º
dia (64,25 x 105 células mL-1). A IPR-7128 e IPR-7129 alcança-
ram maior taxa de crescimento no 22º dia (321,5 x105 células
mL-1 e 599,5 x106 células mL-1, respectivamente).
As estirpes foram incorporadas à Coleção IPR de Microal-
gas.

10
o 10
N n s
o 10
10
9 N n s
1
m
1
m
8
N de c u s
N de c u s
7
7
6
6
5 5
0 5 10 15 20 25 0 0 10 20 0
s
s
o 10
10 N n s
o 10
10
N n s
1
9
m
9
1
m
N de c u s
8 8
N de c u s
7 7
6 6
5 5
0 10 20 0 0 10 20 0
s
s
10 10
N n s
o 10
N n s
o 10
9 9
1
m
1
N de c u s
8 8
N de c u s
7 7
6 6
5 5
0 10 20 0 0 10 20 0
s s
Figura 5.14. Curvas de crescimento das microalgas IPR-7121, IPR-

7125, IPR-7126, IPR-7127, IPR-7128 e IPR-7129 ava-
liadas pelo número de células em função do tempo,
em dias.

5.3 Cultivos de Microalgas em Resíduos

Agroindustriais
As microalgas necessitam de uma fonte de energia para
o seu crescimento. A energia luminosa é a fonte usada no
crescimento autotrófico, enquanto no heterotrófico essa fonte
é representada por um composto orgânico. Entre esses dois
extremos existem rotas metabólicas intermediárias.
O crescimento autotrófico tem como fonte de carbono o
CO2 ou HCO3- dissolvido na água. Essa modalidade de cultivo
requer outros nutrientes, especialmente os macronutrientes
nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio e enxofre, bem
como micronutrientes. Outros fatores também influenciam no
crescimento, como temperatura, luminosidade, pH e agitação
do meio de cultivo. Estes fatores devem estar na faixa de tole-
rância da microalga cultivada. Essa faixa é bastante variável
entre gêneros e até entre espécies de microalgas (COSTA et al.,
2014).
As microalgas apresentam alta diversidade, são organismos
adaptados a diferentes meios, sendo encontrados em ambien-
tes aquáticos de água doce, salobra e salgada. Como observado
anteriormente, estes microrganismos são encontrados também
em resíduos de atividades agroindustriais e águas de aterro de
lixo urbano e do tratamento de lodo de esgoto, dentre outras.
Essa diversidade proporciona vantagens relevantes em compa-
ração com os cultivos vegetais convencionais utilizados para a
produção de biodiesel, com potencial para minimizar o uso e
os impactos ambientais adversos nos recursos naturais solo e
água (FRANCO et al., 2013).
No sistema autotrófico de cultivo, o uso de resíduos, além
de fonte de nutrientes, pode ser uma forma de mitigação da
poluição ambiental, pelo não descarte desses resíduos nas
águas dos mananciais. A produção de resíduos das atividades
agropecuária e agroindustriais, bem como aquelas originadas

de resíduos urbanos, é concentrada em determinadas regiões

do estado do Paraná, algumas delas localizadas em grandes
centros populacionais. A estratégia de aliar os cultivos de
microalgas ao uso de resíduos pode ser uma alternativa viável
para tratar biologicamente esses resíduos e contribuir para a
viabilização econômica de biodiesel.
Particularmente, o custo com reagentes químicos que com-
põem o meio de cultivo é um fator limitante à produção de
microalgas (SIPAÚBA-TAVARES, 1995). A fim de reduzir os
custos dos meios padrões de cultivo tem sido realizados estudos
com meios alternativos que sejam eficientes e, financeiramente,
menos dispendiosos (MOREIRA, 2007). Dentre os meios de cul-
tura alternativos avaliados para a produção de biomassa de
microalgas destacam-se: esgoto doméstico esterilizado (PIPES;
GOTAAS, 1960), efluentes de biodigestores (RODULFO et al.,
1980), despejos industriais purificados (JUSSIAK et al., 1984),
vinhaça de cana de açúcar (CAZETTA et al., 2005), águas resi-
duais de produção de azeite de oliva (SÁNHEZ et al., 2001)
e resíduo da suinocultura (RODRIGUES; BELLI FILHO, 2004;
TRAVIESO et al., 2006).
Dos resíduos avaliados, aqueles originados do confina-
mento de suínos, e que passaram por processamento, foram os
que apresentaram resultados mais promissores.
Apresenta-se a seguir um estudo de caso sobre o cultivo
de microalgas em meio de cultivo à base de resíduo suíno bio-
digerido (RSB). A fim de servir como parâmetro de compa-
ração, utilizou-se o meio sintético BBM (Bold Basal Medium).
As microalgas cultivadas foram Chlorella vulgaris (C. vulgaris),
Chlorella minutissima (C. minutissima) e IPR-7121, esta isolada
em resíduo suíno biodigerido, proveniente de uma granja de
ciclo completo, situada no município de Arapongas, PR. O cul-
tivo foi realizado em câmara de crescimento, em condições
controladas de luz, de temperatura e de agitação dos meios.
Foram testados quatro concentrações de RSB, equivalentes
a 25% (N25), 50% (N50), 75% (N75) e 100% (N100) do teor
de nitrogênio no meio BBM, que contém 41 mg de N L-1. No
RSB, os demais nutrientes que constituíam o resíduo, variaram

em função da dose de nitrogênio usada.

O inóculo inicial das microalgas C. vulgaris, C. minutis-
sima e IPRM 7121, em cada meio, foi 5,6 x 105 células mL-1,
na proporção de 10% do volume de cultivo. O crescimento das
microalgas foi avaliado pelas alterações nos valores do pH, da
densidade óptica, da contagem de células e pela produção de
biomassa, avaliada por gravimetria, ao final do experimento.
Os valores de pH, em amostras dos meios avaliadas aos
quatro, oito e doze dias após o início do cultivo, variaram em
função do tempo de amostragem, das espécies cultivadas e dos
meios em que as microalgas se desenvolveram. Valores mais
elevados de pH foram observados nos meios de cultivo que
continham RSB; quando comparados ao meio BBM, uma vez
que o RSB era originalmente mais alcalino, o que sugere o uso
de materiais básicos na limpeza das áreas de confinamento dos
suínos. O pH do meio foi mais elevado quanto maior a concen-
tração de resíduo no meio, atingindo o valor máximo médio,
durante o período de cultivo, de 9,44, no tratamento N100.
O pH é um dos parâmetros mais importantes no processo
de cultivo de microalgas e determina a solubilidade do dió-
xido de carbono e minerais no meio, o que influencia direta
ou indiretamente o metabolismo das microalgas. As alterações
no valor de pH dependem de vários fatores, como composição
e capacidade tamponante do meio, quantidade de dióxido de
carbono dissolvido, temperatura (que determina a solubilidade
do CO2) e atividade metabólica das células (BECKER, 1995).
Por outro lado, cada espécie de microalgas possui uma faixa
de pH adequada para seu crescimento, além disso, sua exigên-
cia nutricional interfere nos valores de pH ao final do cultivo.
Segundo Richmond (1990), a faixa ótima de pH para o cresci-
mento da microalga Spirulina é de 9,5 a 10,5; enquanto Mayo e
Noike (1994) indicam que Chlorella vulgaris tem intervalo ideal
de pH de 5,0 a 8,0 e sensibilidade a valores de pH alcalinos.
O valor do pH aumentou no cultivo em meio BBM para as
três microalgas, durante o período avaliado, passando de 7,15
a 9,10, apresentando variação de quase duas unidades (Tabela

5.2). A relação entre nitrogênio nítrico (N-NO-3) e amoniacal

(N-NH+4) na solução interfere no valor do pH durante o desen-
volvimento da microalga. Quando somente o N-NO-3 é usado
como fonte de nitrogênio, o pH da solução aumenta. Contra-
riamente, quando a fonte de nitrogênio tem exclusivamente
N-NH+4 o pH da solução decresce.
Esse fato ocorre, pois as microalgas, ao absorverem íons do
meio de cultivo (cátions) liberam outros íons, como H+ e, desse
modo, acidificam a solução. Já quando absorvem ânions, as
microalgas liberam HCO-3, elevando o pH da solução (CLARK,
1982). O meio BBM é constituído exclusivamente de N-NO-3,
por essa razão observou-se elevação do pH da solução durante
o cultivo das microalgas. As variações nos valores de pH nas
soluções que continham RSB foram menos acentuadas e tanto
menores quanto maior a concentração de resíduos no meio
de cultivo. No meio de cultivo RSBN100, a média do cultivo
das três microalgas testadas, o pH variou de 9,08 a 9,80, no
período de 12 dias, portanto 0,72 unidades, (Tabela 5.2). Esse
fato sugere a presença de nitrogênio amoniacal e nítrico na
solução com RSB.
A C. minutíssima foi a microalga que apresentou menor
variação no valor do pH dos meios de cultivo, seguida da IPR-
7121. A C. vulgaris apresentou a maior elevação do valor pH no
meio de cultivo (Tabela 5.2). Maior faixa de alteração no valor
de pH pode representar maior quantidade de nutrientes absor-
vidos pela C. vulgaris e justificar sua maior produção de bio-
massa em relação às outras duas microalgas avaliadas, como é
apresentado posteriormente (Tabela 5.5). Independentemente
da microalga cultivada, os maiores valores de pH ocorreram
nas maiores concentrações de resíduo (N75 e N100). Esse fato
indica que para serem cultivados em RSB as microalgas devem
tolerar meios medianamente alcalinos, com valores de pH em
torno de 9-10. Por essa razão, justifica-se a seleção de mate-
riais que ocorrem nesse meio de cultivo.

Tabela 5.2. Variação dos valores de pH, em meio BBM (Bold’s Basal Medium) e em 4 diferentes concentra-
ções de RSB (Resíduo Suíno Biodigerido), cultivados com as estirpes de microalgas C. vulgaris
(Cv), C. minutissima (Cm) e IPR-7121 (IPR).
Época de Amostragem (dias) Média

Meios de
Inicial 4 8 12
cultivo2
Cv Cm IPR Média Cv Cm IPR Média Cv Cm IPR Média Cv Cm IPR Média
BBM 7,15 7,15 7,15 7,15 7,4 7,2 6,75 7,12 8,35 7,1 9,7 8,38 9,85 7,6 9,85 9,1 7,94 c
RSBN25 8,05 7,8 7,95 7,93 9,6 8,45 9,9 9,32 9,8 9,25 9,85 9,63 9,95 9,25 9,55 9,58 9,11 b
RSBN50 8,7 8,55 8,25 8,5 9,85 8,5 8,65 9 10,25 9,5 9,85 9,87 10,2 9,45 9,6 9,75 9,28 a
RSBN75 8,9 8,95 8,85 8,9 8,9 8,95 8,85 8,95 10,2 9,45 9,75 9,8 10,25 9,55 9,65 9,82 9,36 a
RSBN100 9 9,1 9,15 9,08 9 9,1 9,15 9,17 10,1 9,3 9,7 9,7 10,1 9,7 9,6 9,8 9,44 a
8,36 8,31 8,27 9,15 8,67 9,74 8,92 9,11 9,65

Média1 8,31 8,31 C 8,71 9,77 A 9,47 10,1A 9,61 9,03 a
A A A A B A B C B
Épocas (Ep) DMS = 0,1952 F = 155,84** CV (%) = 3,01
Espécies (Sp) DMS = 0,0657 F = 282,85** CV (%) = 1,41
Meios (Me) DMS = 0,1092 F = 261,32** CV (%) = 2,08

229
30/07/2014 09:47:27
230
Ep*Sp DMS = 0,1314 F = 38,47** ---

Ep*Me DMS = 0,2184 F = 20,36** ---
Sp*Me DMS = 0,1780 F = 14,45** ---
Ep*Sp*Me DMS = 0,3783 F = 10,67** ---

1
As médias seguidas pela mesma letra, minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linha, não diferem estatisticamente entre si. São apresentados os valores da diferença
mínima significativa (DMS) e o valor de F (F) para cada variável e para as interações e o valor do coeficiente de variação (CV), em percentagem, para cada variável. Foi
aplicado o teste de t no nível de 5% de probabilidade.
2
Concentração de resíduo suíno biodigerido (RSB) equivalentes a 25% (N25), 50% (N50), 75% (N75) e 100% (N100) do teor de nitrogênio no meio BBM.
30/07/2014 09:47:27
Os valores médios de densidade ótica (DO) variaram em

função dos meios de cultivo usados e das microalgas cultiva-
das. A avaliação da turbidez de um meio de cultivo constitui
um método rápido, embora indireto, de estimar a concentra-
ção celular nesse meio. Valores mais elevados de DO foram
observados nos meios de cultivo que continham RSB quando
comparados ao meio BBM. Os valores de DO foram tanto mais
elevados quanto maior a concentração de resíduo no meio,
indicando que partículas sólidas contidas no RSB podem ter
contribuído para os aumentos nesses valores, além do aumento
da concentração do número de células das microalgas cultiva-
das (Tabela 5.3).
Em todos os meios de cultivo, a estirpe de microalga IPR-
-7121foi a que apresentou maiores valores de DO, seguida da
C. minutissima. Os menores valores determinados ocorreram
nos meios de cultivo para a C. vulgaris (Tabela 5.3). Microalgas
com menor tamanho de células apresentam densidade ótica
mais elevada do que aquelas de maior tamanho. A IPR-7121
tem pequeno tamanho celular, Figura 5.6, assim como a C.
minutíssima. A C. vulgaris tem células de maior tamanho (OHSE
et al., 2008), o que justifica seu menor valor de densidade ótica.
Independentemente da microalga cultivada os maiores valo-
res de DO ocorreram nas maiores concentrações de resíduo,
RSBN50, RSBN75 e RSBN100. Esse fato ocorreu, à exceção de
alguns meios de cultivo com C. vulgaris, para todas as microal-
gas, indicando que o RSB é um meio com alta possibilidade de
aproveitamento para o cultivo de microalgas.
Avaliou-se o número de células (NC) das três espécies de
microalgas cultivadas nos diferentes meios de cultivo ava-
liados. O NC variou em função dos meios usados e das espé-
cies cultivadas. Valores mais elevados foram observados nos
meios de cultivo que continham RSB quando comparados ao
meio BBM. O NC foi elevado no tratamento N75, seguido do
tratamento N50. Essa avaliação também indica que o RSB é

um meio cultivo que pode viabilizar o cultivo de microalgas

(Tabela 5.4). São apresentados os valores da diferença mínima
significativa (DMS) e o valor de F da análise de variância (F)
para cada variável e para as interações e o valor do coeficiente
de variação (CV), em porcentagem, para cada variável.
Tabela 5.3. Variação da densidade ótica (DO), em meio BBM e em

quatro diferentes concentrações de RSB, cultivados com
as microalgas C. vulgaris, C. minutissima e IPR-7121.
Meios1,2 C. vulgaris1 C. minutissima IPR-7121 Média
BBM 0,111 B 0,081 B 0,374 A 0,189 b
RSBN25 0,161 B 0,200 B 0,313 A 0,225 ab
RSBN50 0,149 B 0,261 A 0,395 A 0,268 a
RSBN75 0,119 C 0,311 B 0,405 A 0,278 a
RSBN100 0,153 C 0,281 B 0,415 A 0,283 a
Média2 0,139 C 0,227 B 0,380 A 0,249
Espécies DMS = 0,056 F = 588,11** ---
Meios DMS = 0,061 F = 10,72** ---
DMS
Espécies* F=
espécies = DMS meios = 0,061
Meios 5,94**
0,056
1
As médias seguidas pela mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem estatistica-
mente entre si. Foi aplicado o teste de t no nível de 5% de probabilidade. São apresentados os valores da
diferença mínima significativa (DMS) e o valor de F (F) para cada variável e para as interações.
2
Concentração de resíduo suíno biodigerido (RSB) equivalentes a 25% (N25), 50% (N50), 75% (N75) e 100%
(N100) do teor de nitrogênio no meio BBM.
A microalga C. vulgaris ,apresentou o menor número de

células em todos os meios de cultivo testados. Não houve dife-

rença significativa entre C. minutíssima e a IPR-7121. Esses

resultados apresentam relação com aqueles observados para DO
das microalgas cultivadas. Ou seja, os menores valores deter-
minados para DO e NC ocorreram nos meios de cultivo de C.
vulgaris (Tabelas 5.3 e 5.4). Essas relações são justificadas pela
diferença existente nos tamanhos celulares dessas microalgas.
C. vulgaris tem maior tamanho do que as duas outras microal-
gas avaliadas, por essa razão apresentou valores menores de
densidade ótica e de número de células (OHSE et al., 2008).
Tabela 5.4. Número de células (NC x105 mL-1), em meio BBM e em

quatro diferentes concentrações de RSB, cultivados com
C. vulgaris, C. minutissima e IPR-7121.
Meios1,2 C. vulgaris1 C. minutissima IPR-7121 Média2
BBM 16,33 C 42,09 B 81,80 A 46,74 d
RSBN25 18,70 C 124,81 A 81,38 B 74,96 c
RSBN50 18,79 B 134,68 A 136,84 A 96,77 ab
RSBN75 13,31 C 174,65 A 134,50 B 107,49 a
RSBN100 14,74 C 102,08 B 137,08 A 84,63 bc
Média 16,22 B 115,66 A 114,32 A 82,12
CV % =
Espécies DMS = 8,60 F = 468,28**
35,29
CV % =
Meios DMS = 13,64 F = 23,53**
20,27
DMS
Espécies* F=
espécies= DMS meios = 23,63
Meios 11,97**
22,34
As médias seguidas pela mesma letra, minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem estatistica-
1
mente entre si pelo teste de t no nível de 5% de probabilidade.

2

As maiores ocorrências de NC foram observadas nos trata-

mentos RSBN75 e RSBN50, independentemente da microalga
cultivada, os maiores números de células foram observados nos
tratamentos RSBN75 e RSBN50. Observou-se diferença entre
os meios para as diferentes microalgas. Enquanto o RSBN50
foi mais adequado para a C. vulgaris, para a C. minutíssima o
maior número de células ocorreu no RSBN75. Enquanto que
para a IPRM7121, selecionada no resíduo de suíno biodige-
rido o maior número de células foi observado no tratamento
RSBN100.
A produção de biomassa não variou em função dos meios
de cultivo usados. (Tabela 5.5).
Tabela 5.5. Produção de biomassa, em g L-1, de Chlorella vulgaris,

Chlorella minutíssima e IPR-7121 em função de cinco
meios de cultivo.
Meios1,2 C. vulgaris1 C. minutissima IPR-7121 Média2
BBM 0,22 bA 0,09 aA 0,24 aA 0,18 a
DS25 0,27 abA 0,16 aA 0,21 aA 0,21 a
DS50 0,27 abA 0,14 aA 0,21 aA 0,20 a
DS75 0,44 aA 0,17 aB 0,21 aB 0,27 a
DS100 0,32 abA 0,23 aA 0,32 aA 0,29 a
Média2 0,30 A 0,16 C 0,23 B 0,23 a
CV (%) =
Espécies DMS = 0,056 F = 33,42**
17,29
CV (%) =
Meios DMS = 0,116 F = 1,57
39,95
DMS
Espécies*
espécies = DMS meios = 0,200 F = 0,681
Meios
0,181
1
As médias seguidas pela mesma letra, minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas, não diferem esta-
tisticamente entre si. Foi aplicado o teste t no nível de 5% de probabilidade. São apresentados os valores
da diferença mínima significativa (DMS) e o valor do teste F (F) para cada variável e para as interações e o
valor do coeficiente de variação (CV), em porcentagem, para cada variável.
2

Entretanto, observou-se diferença entre as espécies culti-

vadas. A microalga mais produtiva foi C. vulgaris, seguida da
IPR-7021. A menor quantidade de biomassa foi produzida pela
C. minutissima. Esse fato sugere que microalgas mais robustas
são mais produtivas e adaptadas ao cultivo em RSB. C. vulga-
ris teve sua maior produtividade quando cultivada no RSB, no
tratamento RSBN75. Não se observou diferenças, entre meios,
para as outras duas microalgas cultivadas (Tabela 5.5). As
avaliações realizadas sugerem que o RSB pode ser um meio
potencial para cultivo de microalgas adaptadas a esse resíduo,
podendo assim ser uma alternativa econômica para essa ativi-
dade e com sustentabilidade ambiental.
Um segundo estudo de caso é apresentado, com objetivo
de avaliar a produção de biomassa e de lipídeos pela C. minutis-
sima cultivada em resíduo suíno biodigerido (RSB) e em meio
BBM. A Figura 5.15 apresenta a relação entre a produção de
massa seca e a quantidade de lipídio acumulado pela C. minu-
tissima, ao final do cultivo, em resíduo suíno biodigerido. A
determinação da biomassa foi realizada pela centrifugação de
300 ml de cultivo a 10.000 rpm, por 10 minutos, seguido de
secagem em estufa a 50°C e posterior pesagem até obter massa
constante. No meio BBM, composto de sais e água, a massa
determinada foi constituída exclusivamente de C. minutíssima
(CM). No RSB, a massa representava as microalgas mais as par-
tículas sólidas dispersas no resíduo. A quantidade de partículas
sólidas dispersas era tanto maior quanto maior a quantidade de
resíduo adicionada à solução de cultivo. A maior produção de
massa seca após trinta dias de cultivo, 0,56 g L-1, foi obtida no
tratamento RSBN50, seguido dos tratamentos RSBN150, 0,20
g L-1, e, por fim, RSBN100 e BBM, ambos com produção de
0,19 g L-1 de massa seca (Figura 5.15). Os índices N50, N100
e N150 representam, respectivamente, a metade, a mesma e
uma e meia vez a quantidade de N contida no meio sintético
BBM. A maior produção de biomassa de CM foi determinada
no tratamento RSB50N, superior ao meio BBM (Figura 5.15).
Os lipídeos foram extraídos da biomassa com solução de
clorofórmio:metanol e determinados gravimetricamente. Os

valores obtidos variaram em função dos diferentes tratamen-

tos. O maior teor foi verificado em RSBN50, 29,27%, seguido
do meio de cultivo BBM, 27,89%, e do tratamento RSBN100,
22,72%. O menor valor observado para teor de lipídeo, de
4,97%, foi determinado no RSBN150. À exceção deste último
tratamento, os teores de lipídio ficaram acima do observado
por Lemoes et al. (2009) e por Soares et al. (2010). No estudo
dos primeiros autores, os lipídios foram extraídos da biomassa
de Chlorella pyrenoidosa utilizando-se metanol e agitação mag-
nética, por 2 horas, e alcançaram valores médios de 18%. Soa-
res et al. (2010) concluíram, entre os métodos testados, que o
de Bligh e Dier modificado foi o mais adequado para a deter-
minação de lipídeo.
Associando-se a produção de biomassa e o teor de lipídeo
na massa seca, em %, calculou-se a quantidade, em mg L-1,
dessa substância acumulada pela C. minutissima , após 30 dias
de cultivo nos diferentes tratamentos. O maior acúmulo de lipídio
foi observado no tratamento RSBN50, seguido do cultivo em meio
BBM e no RSBN100. A menor quantidade de lipídeo determinada
ocorreu no tratamento RSBN150.
Não se observou diferença na produção de massa seca nos
tratamentos RSBN100, RSBN150 e BBM (Figura 5.15). Entre-
tanto o número de células de C. minutissima no meio BBM,
dados não apresentados, foi superior a esses dois tratamentos
que usaram RSB como meio de cultivo. Esses resultados suge-
rem que os sólidos dispersos no RSB contribuíram para a com-
posição da massa seca, onde o resíduo foi usado como meio
de cultivo. Ainda observou-se queda nos teores e acúmulo de
lipídios com o aumento das doses de RSB indicando que esse
aumento de dose incorporou à produção de massa, centrifu-
gada após 30 dias de cultivo, material menos rico em lipídios
do que aquele contido na C. minutíssima.

Figura 5.15. Quantidades de massa seca (g L-1) e de lipídio (mg L-1)

produzidas por Chlorella minutissima, cultivada em re-
síduo suíno biodigerido (RSB) e meio BBM.
Outro aspecto a considerar é que entre os diversos compo-

nentes do meio de cultura, a fonte ou a composição de nitrogê-
nio pode afetar o crescimento e a composição das microalgas em
cultivo, atingindo diretamente a produtividade e a composição
bioquímica da biomassa obtida (MOLINA et al., 1994). Estu-
dos prévios (BECKER, 1988; FIDALGO et al., 1995) mostraram
algumas variações bioquímicas relacionando o aumento do teor
de lipídeo com baixas concentrações de nitrogênio. Fioresi e
Sipaúba-Tavares (2008) cultivaram Ankistrodesmus gracilis, em
esterco suíno biodigerido, encontraram níveis mais elevados
de lipídeos (20,5%) em baixas concentrações de nitrogênio.
Segundo Illman et al. (2000), baixas concentrações de
nitrogênio são consideradas condições ótimas para o aumento
da produção de lipídeos nas estirpes de Chlorella, conforme
evidenciado, neste relato, para a Chlorella minutissima culti-
vada em câmara de crescimento, no RSB-N50. Estes resultados
concordam com os estudos realizados por Shifrin e Chisholm
(1981) com 30 espécies de microalgas, onde algas verdes, com

17% de lipídeos, aumentaram 2 ou 3 vezes o seu conteúdo lipí-

dico após 4 a 9 dias de ausência de nitrogênio. Torres (1994)
também constatou aumento de 2,14 vezes no lipídio acumu-
lado com a redução de nitratos de 2,5 para 0,2 g L-1 e de 3,7
vezes para o meio com ausência de nitrogênio, em cultivo de
Spirulina maxima.
Portanto, a concentração de nitrogênio no resíduo suíno
biodigerido afetou o crescimento e composição lipídica da
microalga C. minutissima. Na concentração de nitrogênio, 50%
menor que a do meio sintético BBM, a densidade populacional,
biomassa e produção de lipídio dessa microalga foram supe-
riores aos obtidos no meio padrão de cultivo. Assim, o resíduo
suíno biodigerido pode ser utilizado como meio de cultivo para
a produção da microalga C. minutissima.
A produção de biocombustíveis a partir de microalgas
apresenta como vantagens alta produtividade de biomassa e
óleo, ocupando menor área de cultivo quando comparada a
plantas oleaginosas. Há iniciativas no sentido de alcançar a
viabilidade econômica e ambiental para a implementação, em
larga escala, da produção de biocombustíveis a partir de bio-
massa de microalgas. No entanto, há inúmeras limitações para
se alcançar esse objetivo.
As microalgas vivem em meio líquido. Por essa razão, os
resíduos do criatório de animais e das atividades agroindus-
triais podem ser constituintes dos meios de cultivo desses orga-
nismos. O uso desses resíduos justifica-se, pois as microalgas
ocorrem naturalmente nas lagoas de decantação que contém
esses dejetos e por serem fontes de nutrientes e carbono para as
microalgas. Ainda, o uso como constituinte do meio de cultivo
promove a reciclagem e a disposição adequada desses dejetos,
contribuindo para mitigar problemas ambientais decorrentes

do seu lançamento em mananciais.

O uso de resíduos, no entanto, pressupõe riscos e limita-
ções, pois faz parte de sua constituição metais pesados, com-
postos orgânicos persistentes, patógenos, nitratos etc. Por-
tanto, deve-se buscar a minimização ou eliminação do risco
pela avaliação da viabilidade do resíduo a ser usado no cultivo
da microalga, sendo recomendável que os dejetos sejam sub-
metidos a tratamentos como fermentação.
No Projeto Microalgas para a Produção de Biodiesel, con-
vênio IAPAR, Copel, Fapeagro, a busca por fontes alternativas
de meios de cultivo foi definida como uma linha de pesquisa,
pois o estado do Paraná apresenta várias cadeias produtivas que
geram elevada quantidade de resíduos. Foram estudados aque-
les originados: da suinocultura, da indústria sucroalcooleira,
dos resíduos de aterros sanitários e da indústria do processa-
mento da laranja. Nesses materiais isolaram-se 08 microalgas
de ocorrência natural e avaliou-se o potencial de cada resí-
duo como constituinte de meios de cultivo. O dejeto líquido de
suíno biodigerido foi o resíduo que apresentou maior potencial
para compor meios de cultivo para as microalgas. As microal-
gas selecionadas nesse resíduo, IPR-7121 e IPR-7122, foram as
que produziram maior quantidade de biomassa e óleo quando
o dejeto foi um constituinte do meio de cultivo.
A produtividade máxima de massa seca de microalgas pro-
duzida em resíduo suíno biodigerido, nos trabalhos realizados
no projeto, foi 280 mg L-1 dia-1. A produção média de lipídeo
na massa seca das microalgas foi de 20%, o que correspondeu,
na média, a 25 mg de óleo L-1 dia-1.
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CAPÍTULO 6
CULTIVO DE MICROALGAS EM
FOTOBIORREATORES DE BANCADA:
FATORES ABIÓTICOS

Cássio Egidio Cavenaghi Prete
Diva Souza Andrade

Introdução
Produzir biomassa de microalgas em grandes quantidades
pode ser possível através de cultivos heterotróficos ou foto-
autotróficos. O cultivo heterotrófico é realizado em fermen-
tadores nos quais uma fonte de carbono, por exemplo, glicose
ou outro composto orgânico, é adicionado ao meio de cultivo,
para que ocorra a fermentação. O cultivo autotrófico pode ser
realizado em sistemas abertos, como as lagoas tipo raceway,
em sistemas fechados ou parcialmente fechados, chamados de
fotobiorreatores (FBR). Nos fotobiorreatores, a luminosidade
natural (MASOJÍDEK et al., 2003) ou artificial não incide dire-
tamente sobre a superfície do cultivo e não ocorre a troca direta
de gases e contaminantes entre o cultivo e a atmosfera (BAR-
SANTI et al., 2006; RODOLFI et al., 2009). No que diz respeito
ao formato, as principais categorias de fotobiorreatores são:
achatados (placas), tubulares, horizontais, tubulares verticais,
inclinados e espirais. Estes sistemas podem ser confeccionados
em vidro ou material plástico, acrílico, polietileno (TREDICI,
2007). O custo da construção, no teto de um laboratório, de
um FBR de vidro foi de 8.700 euros, incluindo as placas para
concentrar a luz solar, as mangueiras, os suportes, os sensores
e a caixa de controle da temperatura, pH, luz e da concentra-
ção de O2 dissolvido e da medida da clorofila por flurescência
(MASOJÍDEK et al., 2003).
Com o objetivo de mostrar a influência de fatores abióticos
no crescimento de microalgas, em fotobiorreatores fechados
de bancada, inicialmente, são apresentados os resultados do
experimento, avaliando os efeitos do fotoperíodo na produção
de biomassa e lipídeos da microalga Neocloris oleoabundans.
Posteriormente, pela análise de superfície de resposta, os resul-
tados da densidade ótica (DO), teores de proteína e produção
de biomassa da N. oleoabundans são discutidos em função do
pH e concentração de nitrato de sódio no meio de cultivo.

6.1 Efeito do Fotoperíodo no Cultivo de

Microalgas
O cultivo da microalga N. oleoabundans (UTEX#1185) foi
realizado em fotobiorreator vertical de bancada. Os fotobior-
reatores - FBR tipo aquário (BOYU® modelo 50 MT) com capa-
cidade para 90 litros foram testados para o cultivo de microal-
gas em Meio Basal de Bold (BBM) pH 6,8 (Figuras 6.1A, B e C).
Figura 6.1. Preparo do Meio Basal de Bold nos fotobiorreatores tipo

aquário (A, B) e inoculação com a microalga Neochloris
oleoabundans (UTEX#1185) (C).
O inóculo contendo a microalga Neochloris oleoabundans

(UTEX#1185), na quantidade de 20% do volume total do aquá-
rio, foi transferido para o fotobiorreator, conforme ilustrado na
Figura 6.1C. Os cultivos foram conduzidos com dois regimes de
iluminação: de 18 h e 24 h, com radiação fotossinteticamente
ativa de cerca de 4 μW/cm-2, fornecida por lâmpada fluores-
cente tubular (24W) e aeração constante fornecida por bomba.
Os FBRs foram separados um do outro por meio de anteparo de
plástico preto para evitar a passagem de luz. O delineamento
experimental foi inteiramente casualizado com dois tratamen-

tos e três repetições.

A viabilidade das células de microalgas foi verificada ao
longo do período por meio da coleta de alíquotas dos cultivos
nos FBR e plaqueamento em placas de Petri contendo meio
de cultivo BBM solidificado com agar 12% (m/v). Também se
realizou diluição seriada das alíquotas, com posterior plaquea-
mento, a fim de quantificar as células viáveis de microalgas. A
avaliação foi realizada visualmente pela observação do cresci-
mento das células no meio conforme Figura 6.2.
Na avaliação da contagem de células viáveis da N. oleoa-
bundans, foi observado também crescimento de contaminantes
bacterianos nos meios de cultivo, possivelmente devido às con-
dições dos fotobiorreatores que são semiabertos.
Figura 6.2. Colônias de microalgas mostrando a viabilidade das cé-

lulas ao longo do desenvolvimento do cultivo em fo-
tobiorreator tipo aquário após 10 dias de cultivo. A)
viabilidade de células da microalga Neochloris oleoa-
bundans (UTEX#1185); B) técnica gota “drop-plate”
pela diluição seriada para contagem de células de mi-
croalga.
A biomassa algal dos cultivos foi determinada 10 dias após

a inoculação da microalga por meio de secagem em estufa a

aproximadamente 40ºC até a obtenção de peso constante. Para

coleta da biomassa total os cultivos foram retirados dos FBR e
acondicionados em sacos plásticos para facilitar a decantação
natural das células. A coleta da biomassa foi realizada através
de decantação natural das células após a eliminação do meio
de cultivo (Figura 6.3).
Figura 6.3. Coleta da biomassa de Neochloris oleoabundans, cultiva-

da durante 10 dias em fotobiorreator tipo aquário. (A-
D) Transferência dos cultivos para recipientes gradativa-
mente menores para facilitar a decantação do meio de
cultivo da biomassa; (E) biomassa úmida e (F) biomassa
seca.

O teor de lipídeo total dos cultivos foi determinado em

amostras do cultivo que foram retiradas 10 dias após a ino-
culação da microalga. O lipídeo da biomassa da microalga foi
extraído com acetona e determinado pela técnica de fluores-
cência do corante Vermelho do Nilo.
A fase de coleta da biomassa pode ser considerada o gar-
galo da produção neste tipo de fotobiorreator. A decantação
das células de maneira natural ou pelo uso de floculadores
químicos e/ou biológicos dentro do aquário dificulta tanto a
coleta da biomassa sem perdas significativas, quanto à lim-
peza do fotobiorreator para posterior utilização. Assim, formas
alternativas de coleta da biomassa precisam ser ainda testadas.
Após o cultivo, o meio de cultura BBM separado da bio-
massa foi analisado quanto aos teores de macro e micronu-
trientes de acordo com metodologia descrita para tecido vege-
tal (MIYAZAWA et al., 2009). O objetivo desta análise foi
verificar a quantidade de nutrientes ainda no meio de cultura
para serem reutilizados em outro cultivo. Na literatura existem
relatos de reciclagem de nutrientes pelo reuso do meio de cul-
tivo para Nannochloropsis sp. (RODOLFI et al., 2003) este tipo
de reaproveitamento também foi avaliado em Scenedesmus sp.
(KIM et al., 2011) e em tratamento e reciclagem para biodiesel
(LEMOS, 2012).
Em relação aos parâmetros avaliados, não foi possível veri-
ficar diferença significativa na biomassa produzida e nem na
produção de lipídeo total entre os FBRs que permaneceram
com fotoperíodo de 18 horas de luminosidade e aqueles em
que a luminosidade foi constante (Tabela 6.1).
Na comparação da microalga N. oleoabundans entre os tra-
tamentos com 24 h e com 18 h de luminosidade foi observado
um ganho na produção de biomassa seca de quase 50% com
o aumento do fotoperíodo. Todavia, possivelmente devido as
variabilidades experimentais, coeficiente de variação de 70%,
e ao aumento da temperatura nos fotobiorreatores com 24 h de

luminosidade, não foram observadas diferenças significativas

entre os dois tratamentos. Estes resultados não eram esperados
uma vez que a iluminação é um fator abiótico de grande muito
importante para o desenvolvimento de microalgas em cultivos
fotoautotróficos Lourenço (2006).
Tabela 6.1. Parâmetros avaliados no cultivo de Neochloris oleoabun-

dans (UTEX#1185) durante 10 dias em fotobiorreator
tipo aquário em Meio Basal de Bold.
Luminosidade Biomassa seca Lipídeo total

T (°C)1 pH1
(h) (mg L-1) (%)
24 50a 4,4a 35,0 7,6
18 30a 8,4a 34,0 7,5
CV (%) 1,7 70
1=Temperatura e pH do meio de cultivo no décimo dia no final do experimento. Valores seguidos da
mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste t a 5% de probabilidade.
Um dos fatores que dificulta a penetração da luz no inte-

rior do fotobiorreator é a profundidade e continua sendo um
gargalho em cultivo massal de microalgas (BARBOSA et al.,
2003).
Shimidt (2007) relata que o fotoperíodo é importante
para a sincronização das células do cultivo, embora um grande
número de espécies de microalgas sejam capazes de crescer sob
luminosidade contínua. A combinação do aumento de lumi-
nosidade de temperatura, que permaneceu em torno de 30°C
dentro dos FBR, deveria ter aumentado a taxa de crescimento
dos cultivos segundo Sandnes et al. (2005). Contudo é mais
provável que tenha ocorrido fotoinibição nos cultivos. Ao tra-
balhar com Nannochloropsis oceanica Sandnes (2005) observou
que temperaturas acima de 30ºC nos cultivos resultou em redu-

ções na taxa de desenvolvimento dessa microalga.

A análise do meio de cultivo residual após 10 dias de cul-
tivo apontou esgotamento dos nutrientes nitrogênio e magné-
sio (Tabela 6.2), porém, não foi possível verificar diferenças
significativas na concentração de nutrientes dos mesmos em
função dos cultivos em diferentes fotoperíodos, pelo teste t a
5% de probabilidade.
Tabela 6.2. Concentrações de macro e micronutrientes no Meio

Basal de Bold de Neochloris oleoabundans (UTEX1185),
após 10 dias de cultivo em fotobiorreator tipo aquário.
Concentração Fotoperíodo
inicial dos CV (%)
Nutrientes nutrientes 18 h 24 h
(g L-1)
P 59,2 65,6 65,5 1,57
Ca 6,9 6,3 6,0 11,10
Mg 0,01 0,01 0,01 1,50
S 3,0 3,2 3,3 3,50
mg L-1
N ** 41,2 0,1 0,1 18,70
Cu (0,4) 0,5 0,5 3,50
Zn (2,3) 2,6 2,6 2,60
B (2,3) 2,4 2,4 4,10
Mn (0,6) 0,3 0,5 45,10
Fe (0,4) 0,9 0,8 11,90

Lemos (2012) trabalhando com a microalga Scenedes-

mus sp. em meio de cultivo fresco e reciclado observou que
não houve decréscimo na densidade celular e lipídeos totais
quando adicionado ao meio reciclado 100% do volume origi-
nal de solução de nitrato e fosfato e 25% de solução de metais,
mas sugere que não existe a necessidade deste ser aplicado no
sistema de reciclagem do meio de cultivo.
A quantidade de biomassa, em valores médios, foi de 50
mg L-1 no fotobiorreator, com 24 h de luminosidade; e foi de
20 mg L-1, no cultivo com fotoperíodo de 18 h. A porcenta-
gem de lipídeos foi de 4,4 e 8,4% sem diferenças significativas
(p<0,05) entre o tempo de luminosidade. Nos fotobiorreato-
res com luminosidade direta (24 h), a temperatura e pH do
meio de cultivo foram maiores em 0,1 unidades. Os resultados
evidenciaram que o crescimento de N. oleoabundans não foi
afetado pelo fotoperíodo.
O cultivo da microalga Nannochloropsis sp. em meio reci-
clado não mostrou produtividade de biomassa, possivelmente
devido aos efeitos inibitórios de substâncias liberadas durante
o crescimento da microalga no cultivo anterior (RODOLFI et al.
2003) e comportamento similar foi observado em cultivos de
Scenesdesmus sp.
6.2 Cultivo de Microalgas em Fotobiorreator

de Polietileno
A produção das microalgas pode ser em sistemas simples e
fechados (fotobiorreator) para evitar contaminação e aumen-
tar a biomassa algal em tempo menor. Silva e colaboradores
(2012) relataram o crescimento da microalga Neochloris oleoa-
bundans em fotobiorreator vertical construído em saco plástico
transparente, composto de polietileno de baixa densidade, com
baixo custo de instalação, em torno de R$ 70,00 por unidade
com capacidade de 100 L de meio de cultivo.
Essa unidade de “fotobiorreator vertical” foi mantida sobre
uma mesa em casa de vegetação contendo 55 L de meio de cul-

tivo, com aeração constante durante 10 dias de crescimento.

O meio de cultivo sintético, sem fonte de carbono, utilizado
foi o Bold’s Basal Medium (BBM). O preparo do inóculo inicial
da microalga foi feito em três frascos com capacidade de 2 L,
constando 1,7 L de cultivo em sala de fotoperíodo de 12 h, com
temperatura de 28 ± 2°C na fase luminosa e 22 ± 2°C na fase
escura, intensidade de radiação de 100 ± 20 μE m-2 s-1 obtida
com lâmpadas tubulares frias e fluorescentes e sem agitação.
Depois de inoculado os 10% no fotobiorreator, foram realiza-
das análises diárias de pH, densidade ótica (DO) a 670 nm,
contagem de células (cel) (câmara de Neubauer), temperatura
interna da casa de vegetação aferida a cada 2 h.
A estirpe microalga Neochloris oleoabundans (UTEX#1185)
foi cultivada durante 10 dias em meio de cultivo BBM, em um
fotobiorreator vertical confeccionado em polietileno de baixa
densidade, com capacidade para 80 L, instalado sobre bancada
em casa de vegetação de vidro (Figura 6.4). O inóculo inicial
foi de 5,3 x 106 células mL-1 (Log10= 6,7 UFC mL-1), que corres-
ponde a 0,13 de densidade óptica (DO670nm).
A temperatura média do ar na casa de vegetação durante
os dez dias de cultivo foi de 35,63°C (fase clara das 8 as 18 h)
e 23,23°C (fase escura das 20:00 as 6:00h). Desta forma, foram
obtidos os seguintes resultados: o inóculo inicial apresentou
D.O de 0,13 e contagem celular de 5,32 106 cel mL-1. O pH ini-
cial do meio de cultivo no fotobiorreator foi de 6,8 e durante
o crescimento da microalga o pH do cultivo foi se aumentando
até alcançar o pH 9,0 no 10° dia. A D.O670nm do cultivo inocu-
lado foi de 0,002 e o número de cel de 7,5.104 (cél mL-1) e no
10° dia a D.O foi de 0,226 e concentração celular de 6,8 106
(cel mL-1), mas o maior índice de crescimento foi observado no
9° dia de cultivo com D.O de 0,29 e concentração celular de
1,07 107 (cel mL-1).

Figura 6.4. Cultivo de Neochloris oleoabundans em fotobiorreator

vertical, em bancada em casa de vegetação.
Este tipo de FBR, em ambiente de casa de vegetação, mos-

trou-se uma alternativa viável para produção de inóculo de
microalgas, para utilizar nos cultivos em tanques abertos para
produção em grande escala. A produtividade de biomassa de
microalga aumentou pois foi observado incremento em cerca
de 3 unidades logarítmicas no número de células no meio de
cultivo.
6.3 Meios de Cultivo: pH e Concentração de

Nitrato de Sódio
As microalgas são microrganismos que se destacam como
fonte de proteína de qualidade para a alimentação humana e

animal, principalmente pela alta taxa de crescimento, capaci-

dade fotossintética e algumas substâncias sintetizadas. Estudos
descrevem que concentração de nitrogênio (N) assim como a
sua fonte em meio de cultivo influenciam na produtividade
das microalgas e, consequentemente, no teor de lipídeos e pro-
teínas da biomassa (GRIFFITHS et al., 2009; LIN et al., 2011;
ARUMUGAM et al., 2013). Vários meios de cultivo utilizam
nitrato de sódio (NaNO3) como fonte de nitrogênio para cres-
cimento de microalgas, com doses variando com a composição
e características do meio preparado. De acordo com Richmond
(2004), a variação em meios tradicionais utilizados para culti-
var microalgas pode chegar até 10 vezes, quando comparadas
suas composições. Por exemplo, o meio BBM apresenta 0,25 g
L-1, Modified Allen´s 1,5 g L-1, Zarrouk 2,5 gL-1, BG11 1,5 g L-1.
Em relação ao pH, o controle dessa variável química é
essencial no cultivo de microalgas, pois afeta diretamente a
disponibilidade de vários elementos químicos, influenciando
efetivamente na absorção dos nutrientes do meio de cultivo
pelas células microalgais. Valores de pH em torno de 9,0 a 9,5
podem ser tóxicos para algumas espécies de microalgas (LOU-
RENÇO, 2006).
O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da concen-
tração de nitrogênio (NaNO3) e da alteração do pH no meio de
cultivo da microalga Neochloris oleoabundans (UTEX#1185).
6.3.1 Preparo do inóculo de ambiente de cultivo

O meio de cultura utilizado no crescimento da estirpe de
microalga N. oleoabundans foi o (BBM) (BOLD, 1949), auto-
clavado a 120ºC por 20 minutos. O cultivo foi realizado em
erlenmeyers com 2 L de cultivo microalgal, inoculado a 10%
com um cultivo de 18 dias e densidade ótica de 1,573. O cul-
tivo permaneceu por 14 dias em câmara de crescimento com
temperatura e fotoperíodo controlados. Os cultivos da estirpe

de N. oleoabundans foram realizados em frascos de vidro trans-

parentes com capacidade de 2 L em condições controladas de
temperatura e luz. Os frascos de cultivos foram mantidos sem
aeração em câmara de crescimento, com fotoperíodo de 12 h,
temperatura controlada de 28 ± 2°C na fase luminosa e 22 ±
2°C na fase escura. A luminosidade para os cultivos foi provida
utilizando-se 4 lâmpadas fluorescentes tubulares (65 W) dis-
postas paralelamente na parte superior do recipiente e foi de
aproximadamente 100 ± 20 μmol m-2 s-1 (porômetro Licor INC
modelo LI-1600) (Figura 6.5).
Figura 6.5. Cultivo de Neochloris oleoabundans em meio BBM sem

aeração, em frascos de 2 L colocados sobre a bancada,
em câmara de crescimento com lâmpadas na parte su-
perior. Fotoperíodo e temperaturas controladas.
O delineamento fatorial completo foi aplicado para estu-

dar os efeitos e otimizar as quantidades de nitrato de sódio e o
pH para as variáveis dependentes, na densidade ótica, no teor
de proteína e na biomassa, conforme a metodologia de super-
fície de resposta.

O planejamento experimental dos dois fatores, nitrato de

sódio (NaNO3) e pH, e dos três níveis foi realizado com o auxílio
do programa STATISTICA versão 7.0. A Tabela 6.3 apresenta
as combinações das concentrações de nitrato de sódio (NaNO3)
em g L-1 (0,25, 1,12 e 2,50) e três níveis de pH (5,0; 7,0 e 9,0),
com ponto central, perfazendo nove tratamentos, cada um com
três repetições. Como com o crescimento da microalga ocorre
alteração do pH, esse foi ajustado diariamente com KOH (4M)
ou HCL (4M).
Tabela 6.3. Níveis dos fatores concentração de nitrato de sódio

(NaNO3) em g L-1 e pH e os correspondentes níveis
codificados (X).
Níveis
Fatores
-1 0 1
NaNO3 0,25 1,12 2,5
pH 5,0 7,0 9,0
Para o delineamento experimental em esquema fatorial

completo para dois fatores em três níveis os 9 tratamentos são
apresentados na Tabela 6.4 em níveis codificados. Esse deli-
neamento foi feito visando à análise dos resultados pela meto-
dologia de superfície de resposta.

Tabela 6.4. Delineamento experimental em esquema fatorial com-

pleto para duas variáveis e três níveis.
Tratamentos NaNO3 pH
1 -1 -1
2 -1 0
3 -1 1
4 0 -1
5 0 0
6 0 1
7 1 -1
8 1 0
9 1 1
6.4 Densidade Ótica e Teor de Proteína na

Biomassa de Microalgas
Foi realizada a análise da Densidade ótica (DO) a 670nm
do experimento no 14º dia de cultivo, em cubeta de vidro em
espectrofotômetro UV-visível (Genesys 10UV). A determina-
ção do teor de proteínas na biomassa microalgal foi realizada
no 14º dia de cultivo utilizando-se o método Bradford (BRAD-
FORD, 1976) adaptado e soroalbumina bovina como padrão.
No experimento avaliando o efeito do pH e do NaNO3 no 14°
dia de cultivo de acordo com a densidade ótica, a análise esta-
tística indicou efeito significativo (p<0,05) das duas variáveis
estudadas. O coeficiente de regressão obtido foi de (R2=0,96),
o que indica que 96% da variabilidade pode ser explicada pelo
modelo com melhor previsão de resposta (Tabela 6.5).

Tabela 6.5. Análise de variância ANOVA após o delineamento Box-

-Behnken para a variável resposta densidade ótica
(D.O.) do cultivo da estirpe de Neochloris oleoabundans
(UTEX#1185) com variação do pH e NaNO3.
Soma Média
Fatores GL Teste F p
quadrática quadrática
NaNO3 (L+Q) 0,00280 2 0,001403 9,657 0,001*
pH (L+Q) 0,07594 2 0,037972 261,428 0,000*
Interação (L+Q) 0,00495 2 0,002478 17,057 0,000*
Falta de ajuste 0,00021 2 0,000105 0,723 0,499
Erro puro 0,00261 18 0,000145
Total 0,09008 26
R2= 0,96; R2adj= 0,95; *p<0,05; L= efeito linear; Q= efeito quadrático; GL= Graus de liberdade.
Pela análise do gráfico de superfície de resposta (Figura

6.6) é possível visualizar o efeito das concentrações de NaNO3
e do pH sobre os resultados da densidade ótica, expressos em
absorbância, nos quais a maior média experimental obtida no
14º dia de cultivo foi de 0,36 no tratamento com pH 9,0 e à
concentração de 1,12 g L-1 de NaNO3, e a menor média experi-
mental obtida de densidade óptica foi de 0,18 na qual o pH foi
de 5,0 e a menor concentração de NaNO3.

Figura 6.6. Superfície de resposta para densidade ótica dos trata-

mentos experimentais com variação do pH e NaNO3
no 14° dia de cultivo da microalga Neochloris oleoa-
bundans.
A equação Z = 0,367 + 0,101x – 0,013x2 – 0,084y +

0,009y2 – 0,007xy, que descreve a modelagem de superfície de
resposta para densidade ótica.
Na Figura 6.6 pode-se visualizar a grande importância do
pH e do NaNO3 no crescimento da microalga N. oleoabundans
em meio de cultivo. Assim verifica-se que ocorreu maior multi-
plicação celular da microalga nos tratamentos em que o pH foi
ajustado para 9,0.
Em relação ao teor de proteína, a análise estatística do
14º dia de cultivo indicou efeito significativo para as variá-
veis pH e concentração de NaNO3 (p < 0,05). O coeficiente
de regressão obtido foi de 0,92 (Tabela 6.6), indicando que
92% da variabilidade podem ser explicados pelo modelo com
melhor previsão de resposta.

Tabela 6.6. Análise de variância ANOVA após o delineamento Box-

-Behnken para a variável resposta teor de proteína
na biomassa da estirpe de Neochloris oleoabundans
Soma Média
NaNO3 (L+Q) 185,1915 2 92,59575 69,517 0,0000*
pH (L+Q) 40,0645 2 20,03227 15,039 0,0002*
Interação (L+Q) 71,7168 2 35,85840 26,921 0,0000*
Falta de ajuste 2,3697 2 1,18487 0,889 0,4302
Erro puro 21,3118 16 1,33199
Total 338,1077 24
A equação que descreve a modelagem de superfície de res-

posta para proteína está apresentada na Figura 6.7, z= 35,435
+ 25,027x - 13,078x2 - 5,816y+0,543y2 - 0,224xy2 + 1,180x2y
na qual observa-se a importância das variáveis estudadas na
produtividade de proteína pela microalga N. oleoabundans.
A maior quantidade média de proteína foi obtida na bio-
massa microalgal cultivada nos na concentração de NaNO3 de
1,12 g L-1 e nessa concentração foram obtidos maiores valores
experimentais de 32,9 mg L-1 de proteína em pH 5,0 e de 31,8
mg L-1 de proteína em pH 7,0 e de 30,6 mg L-1 para pH 9,0. A
menor média experimental obtida foi de 23,1 mg L-1 de pro-
teína em pH 5,0 e 0,25 g L-1 de NaNO3.
Observa-se a importância das variáveis estudadas na pro-
dução de proteína pela microalga N. oleoabundans. Tem-se que,
a quantidade de proteína obtida foi maior para os tratamentos
em que a concentração de NaNO3 foi de 1,12 L-1.

A redução de nitrato de sódio alterou o teor de lipídeo

e proteína da microalga marinha Nannochloropsis oceanica,
mostrando a importância de estudos de otimização da dose
desse nutriente visando o aumento da produção de biomassa
microalgal (WAN et al., 2013).
Figura 6.7. Superfície de resposta para proteína dos tratamentos

experimentais com variação do pH e NaNO3 no 14º dia
de cultivo da microalga Neochloris oleoabundans.
A variação da concentração de proteínas em mg L-1 na bio-

massa das células da microalga N. oleoabundans, no 14º dia
de cultivo. Para otimizar os fatores abióticos, pH e nitrato de
sódio, visando aumentar a quantidade de proteína, a concen-
tração de NaNO3 para a maior produtividade foi de 1,37 g L-1 e
pH = 9,0 do meio de cultivo BBM ajustado diariamente.

6.5 Biomassa de Microalga em Função do pH e

Nitrato de Sódio
Para determinação da biomassa nos cultivos, foi coletada
uma fração de 50 mL de cada amostra experimental, de acordo
com o planejamento experimental. Esta amostra foi centrifu-
gada a 10.000 g por 15 min em uma centrífuga refrigerada
(JOUAN modelo BR4i) com temperatura controlada a 25°C.
O pellet formado durante a centrifugação foi ressuspen-
dido em 2 mL de água destilada e (10.000 g por 15 minutos)
centrifugado, secos e pesados. O sobrenadante foi retirado e
seco em estufa a 60ºC, para posterior determinação da massa
final. A biomassa foi obtida pela diferença entre a massa sec
inicial a final e a.
A análise estatística indicou efeito significativo do pH e
concentração de NaNO3 para a biomassa seca (p < 0,05) e o
coeficiente de regressão obtido foi de 0,96 (Tabela 6.7). Isso
demonstra que 96% da variabilidade pode ser explicada pelo
modelo com melhor previsão de resposta.
Tabela 6.7. Análise de variância ANOVA após o delineamento

Box-Behnken para a variável resposta biomassa de
células secas da estirpe de Neochloris oleoabundans
Soma Média
NaNO3 (L+Q) 0,000376 2 0,000188 8,1621 0,0030*
pH (L+Q) 0,010146 2 0,005073 220,3612 0,0000*
Interação (L+Q) 0,000568 2 0,000284 12,3318 0,0004*
Falta de ajuste 0,000007 2 0,000003 0,1499 0,8618
Erro puro 0,000414 18 0,000023

Total 0,011315 26
Na Figura 6.8 o gráfico da modelagem da superfície de

resposta para a biomassa seca verifica-se que houve maior
crescimento da microalga N. oleoabundans nos tratamentos em
que o pH foi ajustado para 9.
Figura 6.8. Superfície de resposta para biomassa seca da microalga

Neochloris oleoabundans em função dos tratamentos ex-
perimentais com variação do pH e NaNO3. Cultivo sem
aeração durante 14° dia com ajuste diário do pH.
Os resultados do 14º dia, de acordo com a analise estatís-

tica (p < 0,05), evidenciam influência significativa das variá-
veis concentração de NaNO3 e do pH, mostrando que há maior
produção de biomassa da N. oleoabundans em pH 9,0 e que os
valores de densidade ótica decresceram com a redução do pH.

Para a biomassa microalgal, os maiores valores variando entre

85 e 104 mg L-1 foram encontrados com a concentração de 2,5
mg L-1 de nitrato de sódio o meio de cultivo.
No geral, os resultados encontrados demonstraram aumento da
biomassa e da densidade ótica em pH 9,0 e, para a proteína a
maior quantidade foi encontrada combinando no pH 5,0 e 1,12
mg L-1 de NaNO3.
O fotoperíodo altera a produção de biomassa e teor de lipí-
deo nas células d N. oleoabundans, mas com a alta variabili-
dade dos resultados não foi possível detectar diferenças signifi-
cativas para cultivos em fotobiorreatores de bancada.
O fotobiorreator vertical em saco plástico transparente
composto de polietileno de baixa densidade apresenta bai-
xos custos de instalação e potencial para cultivo da microalga
Neochloris oleoabundans, buscando a produção de biomassa
bioenergética que minimize a degradação ambiental.
De acordo com os resultados dos experimentos realiza-
dos, verificou-se que as variáveis pH e concentração de nitro-
gênio apresentaram influência significativa no cultivo da
microalga N. oleoabundans. A densidade ótica (DO) do cultivo
da microalga N. oleoabundans apresentou maior média para
concentração de 1,12 mol L-1 de NaNO3 e em pH 9,0. A maior
quantidade de proteína, foi obtida com 1,12 mol L-1 de NaNO3
e em pH 7,0 com valor médio de 32,98 mg L-1. O maior valor
para produtividade de biomassa microalgal foi encontrado na
concentração de NaNO3 de 2,5 mol L-1 de NaNO3 e pH 9,0 com
média de 105 mg L-1.

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CAPÍTULO 7
CULTIVO DE MICROALGAS
EM FOTOBIORREATORES FECHADOS
E EM SISTEMAS ABERTOS
Adriano Rausch Souto


Introdução
Os estudos preliminares com utilização de microalgas ini-
ciaram em 1955, de acordo com o relatório do Departamento
Nacional de Energia dos Estados Unidos (DOE) (SHEEHAN et
al., 1998). Em um extenso relatório deste departamento, estão
descritas varias metodologias, resultados e conclusões de um
programa internacional de pesquisa composto por Estados
Unidos da América, Israel e Japão, visando à produção de gás
metano e óleo combustível a partir da biomassa de algas. Diver-
sos projetos se iniciaram na década de 1980 e os resultados
apontaram para um uso potencial, com viabilidade econômica
em larga escala e uma produtividade média de 70 t ha-1 ano-1.
Os principais fatores limitantes relacionados ao controle
da produção de biomassa de microalgas em grandes tanques
abertos são descritos por Sheehan et al. (1998). Estes fatores
referem-se à contaminação, às dificuldades com a colheita, a
alta influência das condições climáticas, bem como, a tempe-
ratura. Além disso, fatores químicos presentes no meio de cul-
tivo, tais como teor de dióxido de carbono e potencial hidroge-
niônico, influenciam grandemente o crescimento microbiano.
No entanto, tais parâmetros químicos podem ser regulados de
acordo com as necessidades de crescimento das microalgas.
Na operacionalização da produção de biomassa de microal-
gas, o baixo custo no processo está diretamente relacionado ao
planejamento da planta piloto, pois, envolve desde o tamanho
e forma dos tanques, tipos de cobertura, até os mecanismos de
iluminação e controle de temperatura. Outro ponto importante
a ser considerado é a água. De acordo com o relatório do DOE,
a água é o componente majoritário do cultivo de microalgas,
sendo que sua captação, adução e armazenamento deverão pas-
sar por um controle rigoroso, além disso, não pode possuir cloro.
Diversos sistemas de cultivos de microalgas têm sido rea-
lizados visando à produção de biomassa, tanto para uso na
elaboração de alimentos, quanto para a obtenção de produtos
naturais com alto valor no mercado mundial. O potencial bio-
tecnológico das microalgas, principalmente a sua capacidade

fotossintética, alta taxa de crescimento, além da produção de

diversas substâncias de interesse para o uso como matéria-
-prima de biocombustíveis, ração na alimentação animal, pig-
mentos pode ser observado em diversos trabalhos (DERNER et
al., 2006; DEL CAMPO et al., 2007; LI et al., 2008).
As microalgas, quando comparadas com as plantas oleagi-
nosas tradicionais, apresentam uma elevada produção, como
observado por Chisti (2007) e apresentado na Tabela 7.1, onde
é possível observar uma produtividade em óleo muito supe-
rior às demais culturas. No Brasil, a soja é a principal matéria-
-prima para a produção do biodiesel, sendo que sua produtivi-
dade é relativamente baixa, variando de 400 a 600 kg de óleo
por hectare e tem apenas um ciclo anual. Já o girassol pode
produzir um pouco mais, de 630 a 900 kg de óleo por hectare.
Tabela 7.1. Comparação entre algumas fontes de biodiesel. Fonte:

Chisti (2007).
Área de cultivo
Produção de óleo Área necessária
Cultura nos EUA
(L ha-1) (M ha)
(%)
Milho 172 1.540 846
Soja 446 594 326
Canola 1190 223 122
Pinhão manso 1.892 140 77
Coco 2.689 99 54
Palma 5.950 45 24
Microalga a 136.900 2 1,1
Microalga b 58.700 4,5 2,5

a
70% em óleo em biomassa; b 30% em óleo em biomassa.

Lourenço (2006) indica que microalgas encontradas no

litoral brasileiro têm potencial para produzir 90.000 kg de óleo
por hectare. Em uma área equivalente a um hectare, por exem-
plo, as microalgas têm capacidade de produzir 100 vezes mais
óleo que a soja. Além disso, as formas de óleos encontradas
nas microalgas possuem características físico-químicas simila-
res aos demais óleos vegetais, sendo uma matéria-prima com
potencial para a produção de biodiesel.
Outra possibilidade de utilização das microalgas é a fixa-
ção biológica de dióxido de carbono (CO2), processo de grande
importância frente à problemática ambiental, uma vez que
a elevação da concentração desse gás na atmosfera terrestre
é considerada uma das principais causas do agravamento do
aquecimento global. Segundo Chisti (2007) a sinergia entre os
sistemas biológicos de captação de CO2 de algumas espécies de
microalgas encontradas no meio marinho, em água doce e no
solo, é responsável por pelo menos 60% da fixação deste gás.
Em diversas partes do mundo, as pesquisas realizadas
apontaram como vantajoso o uso de microalgas para produção
de biomassa, devido a apresentarem alta produtividade, o que
representa menor gasto de área para o cultivo (TEIXEIRA et al.,
2006). Além disso, a região de cultivo de microalgas pode ser
árida e o solo pode estar degradado, pois o mesmo é somente
utilizado como suporte para o sistema. Outro ponto positivo é
que a produção da biomassa é contínua, não seguindo o regime
de safras. Em geral, o meio de cultivo para microalgas é aquoso
e pode ser reaproveitado como fonte de nutrientes para culti-
vos posteriores. Também é possível utilizar o CO2 residual de
processos fabris e resíduos orgânicos como fonte de nutrien-
tes para o cultivo de microalgas (VICHEZ et al., 1997; BENE-
MANN, 2009).
Tanto no ambiente natural quanto nos cultivos feitos pelo
ser humano, o crescimento de uma população de microalgas é
resultado da interação entre diversos fatores biológicos, quími-

cos e físicos (RAVEN et al., 2001). Os biológicos estão relacio-

nados às próprias taxas metabólicas da espécie cultivada, bem
como, com a possível influência de organismos contaminantes.
No que se refere aos fatores físicos e químicos que afetam o
crescimento das microalgas, podemos elencar a luz, a tempera-
tura, a salinidade e a disponibilidade de nutrientes (GUILLARD
et al., 1975; RICHMOND, 1992; RICHMOND et al., 2001).
Com o objetivo de facilitar a entrada e saída de meio
líquido no sistema de Fotobiorreatores hexaédricos fechados
(FHF) para o cultivo de microalgas, bem com a quantificação
dos volumes de descarga dos meios o modelo desenvolvido no
projeto microalgas é apresentado. Tendo em vista o potencial
de utilização de cultivos abertos para microalgas, outro obje-
tivo neste capítulo é descrever a construção dos sistemas de
produção de biomassa, composta por uma plataforma de foto-
biorreatores abertos, no município de Londrina, Paraná.
7.1 Classificação e Componentes para

Produção Massal de Microalgas em
Sistemas Fechados e Abertos
As tecnologias de produção de biomassa de microalgas
podem ser classificadas quanto às vias metabólicas predomi-
nantes em: autotrófica, heterotrófica e mixotrófica. A produção
autotrófica baseia-se na fotossíntese, neste processo, a micro-
alga utiliza a radiação luminosa, primordialmente solar, como
fonte de energia e o gás carbônico; como fonte de carbono. Na
produção heterotrófica, a microalga faz uso de componentes
orgânicos, como fonte de carbono e energia. Já na produção
que se baseia no metabolismo mixotrófico, a microalga rea-
liza fotossíntese, porém componentes orgânicos nos meios de
cultivo também podem ser utilizados como fonte de energia
(REDAELLI et al., 2010).

A energia capturada pelas microalgas através da fotossín-

tese pode provir da radiação solar ou artificial. A solar é um
recurso natural, no entanto, varia com o ciclo diário. Para con-
tornar estas limitações do uso da luz natural no crescimento
das microalgas, pode-se recorrer à iluminação artificial, a qual
possibilita a produção diária e contínua, mas, requer investi-
mentos. Uma opção seria utilizar um sistema de iluminação
com lâmpadas de LED, que não esquentam e têm menor gasto
energético. A influência da luz no cultivo está relacionada ao
tempo de exposição e a sua intensidade. Utilizando-se este sis-
tema, pode-se até controlar períodos de claro e escuro, ligando-
-a a um temporizador. Para aumentar a eficiência de captura
da luz um modelo de fotobiorreatores em painel foi sugerido
por Zijffers et al. (ZIJFFERS et al., 2008). Para o cultivo massal
de microalgas, além de utilizar a luz solar pode ser utilizado.
A temperatura é outro fator importante ao crescimento
microalgal, pois exerce forte influência sobre as reações meta-
bólicas e, consequentemente, sobre a taxa de crescimento
(PEQUENO, 2010). Ao analisarem o efeito da temperatura e
pH no cultivo de Spirulina major, Karam e Soccol (2007) con-
cluíram que a temperatura ótima foi de 30ºC e o pH de 8,0,
produzindo uma biomassa de 1,17 g L-1.
Quanto à nutrição, as microalgas necessitam de uma série
de nutrientes para seu crescimento, em destaque o nitrogênio,
o fósforo, o ferro e, em alguns casos, o silício (CHISTI, 2007).
O nitrogênio é o componente básico na formação de proteínas,
ácidos nucléicos e pigmentos fotossintetizantes, este nutriente
pode ser encontrado em concentrações variáveis no interior
das células algáceas. Os compostos de nitrogênio são assimila-
dos, preferencialmente, na forma amoniacal (NH3 e NH4+), mas
também podem ser utilizados nas formas de nitrogênio gasoso
ou molecular de nitrato (NO3-) e de nitrito (NO2-). As principais
fontes de nitrogênio são os sais de nitrato, sais de amônio e
ureia. Algumas microalgas conseguem fixar N2 atmosférico em
NOx e utilizá-lo.
O fósforo é um elemento importante na regulação do
metabolismo celular, na síntese de lipídeos e carboidratos, no

fornecimento de fosfatos para a geração de energia e consti-

tuição de moléculas estruturais (PEQUENO, 2010). O silício
é um componente da estrutura de revestimento externa das
microalgas diatomáceas, sendo que em cultivos dessas espé-
cies a baixa demanda desse elemento provoca diminuição da
espessura da parede celular destas microalgas (BRANCO, 1978;
LOURENÇO, 2006).
Segundo Melo (2010), as microalgas conseguem fixar o
carbono atmosférico de dez a vinte vezes mais do que o absor-
vido por outros tipos de cultura, como as oleaginosas, sendo
que cada tonelada de biomassa produzida consome cerca de
1,83 t de dióxido de carbono, o que torna bastante interessante
testar o efeito deste gás na produtividade. Borghetti (2009)
esclarece também que, em alguns cultivos se faz necessário à
adição de CO2, pois no ar existem somente 0,03% deste gás.
A injeção de CO2 pode ser feita por um sistema semelhante
ao de injeção de ar por bombeamento, porém, recomenda-se
que não seja feita em conjunto. A ideia de separar a injeção
de CO2 da aeração é porque necessitaria de muito dióxido de
carbono para ser injetado junto com o ar, visto que é necessá-
ria uma agitação considerável do meio de cultivo. Além disso,
é mais fácil controlar estes dois parâmetros se eles estiverem
em sistemas separados. Bjerk (2012) descreve que o cilindro
de CO2 deve ser equipado com uma bomba solenoide, a qual
deverá estar programada para uma injeção na vazão de 3 L h-1,
durante o período de maior intensidade luminosa natural, cor-
respondendo ao período das 07:00 às 19:00 horas.
Para automatizar a entrada de CO2 no sistema, deve se
estudar as seguintes possibilidades:
• Injeção de CO2 em função do tempo de cultivo, com

base na curva de crescimento da microalga.
• Utilização de sensores aquáticos de CO2, o que seria
uma forma eficiente de controle, porém apresenta
elevado custo de implantação.

7.2 Tipos e os Métodos de Cultivo Massal

de Microalgas
O desenvolvimento do cultivo de microalgas depende da
finalidade da atividade. Diante disto, os métodos de produção
de biomassa devem apresentar baixo custo em larga escala ou,
resultar em produtos com alto valor agregado, nos casos de
pequena produtividade.
Entre as diferentes formas de cultivo, estas podem ser:
monoalgáceo ou misto. O monoalgáceo refere-se a uma única
espécie, sendo amplamente utilizado na pesquisa, produ-
ção comercial e manutenção de cepas, pois proporciona um
maior controle do processo de crescimento e de produção da
biomassa. Os cultivos mistos envolvem, na mesma unidade de
cultivo, duas ou mais espécies de microalgas, no entanto, pode
ocorrer a dominância de certas espécies, que inibem as outras
(LOURENÇO, 2006). Nestas condições mistas, as aplicações da
biomassa são mais restritas e, geralmente, envolvem mais pes-
quisa científica, como o estudo da competição entre duas espé-
cies por determinado recurso ambiental.
Os métodos de cultivo estão relacionados quanto à forma
de produzir microalgas e podem ser: em batelada ou estanques;
semicontínuo ou contínuo. No sistema de cultivo estanque, as
células são inoculadas no meio de cultivo e nenhum outro com-
ponente é adicionado ao longo de seu desenvolvimento. Este
processo resulta em mudanças expressivas na densidade das
células, que tende a aumentar assim como os nutrientes dis-
solvidos tendem a diminuir ao longo do tempo, podendo che-
gar à exaustão completa. Além disso, a disponibilidade de luz
também sofre variações, quer de intensidade ou de qualidade,
característico de cada profundidade e que varia também com
a quantidade e a natureza das substâncias que existem em sus-
pensão ou solução na água (BRANCO, 1978).
O regime contínuo é um processo permanente de saída de

cultura com células de microalgas e entrada de meio esteri-

lizado, sendo que o crescimento das células é caracteristica-
mente balanceado, conduzido 24 horas por dia (GARCIA et al.,
1999). O sistema semicontínuo proporciona grande produção
de células por intervalo de tempo. Neste processo, uma parcela
do meio de cultivo com algas é retirada e substituída por meio
de cultura nova, sem células. Isto pode ser realizado em qual-
quer momento durante o desenvolvimento do cultivo, porém,
geralmente é feito quando já se formou uma biomassa relati-
vamente grande (fase log do crescimento). Este procedimento
acarreta curvas de crescimento como variações bruscas de den-
sidade de células, devido ao efeito da diluição da cultura.
7.3 Fotobiorreatores Fechados e

Sistemas Abertos
A produção de microalgas pode ocorrer em sistemas fecha-
dos, denominados fotobiorreatores, e abertos, sendo os mais
comuns denominados de “raceways” (PULZ, 2001; ANDERSEN
et al., 2005).
Os sistemas abertos de cultivo geralmente são de grande
porte e permitem a produção de elevada quantidade de bio-
massa. Estes sistemas devem ter pequena profundidade,
variando de 15 a 30 cm, visando com isso assegurar adequada
incidência de luz solar em todo o seu volume (PULZ, 2001;
CHISTI, 2007). O revestimento pode ser de qualquer material
impermeável e liso para evitar aderência, incluindo plástico,
concreto, fibra de vidro, alvenaria ou laminados. Estes siste-
mas abertos foram amplamente utilizados em escala industrial
em muitos países, porém apresentam alguns gargalos técnicos
para o perfeito funcionamento (PUSHPARAJ et al., 1997).
Dentre outras desvantagens, aos sistemas abertos rela-
cionam-se as seguintes (PULZ, 2001; REDAELLI; MARCILIO;
RECH, 2010):

• susceptibilidade à contaminação por microrganismos

heterotróficos e outras espécies de algas;
• baixa produtividade de biomassa;
• alta taxa de evaporação da água;
• dificuldades de controlar variáveis tais como pH,
temperatura e oxigênio.
Durante o inverno, em regiões temperadas e subtropi-

cais, pode ser necessário cobrir os tanques para evitar varia-
ções bruscas de temperatura, bem como impedir que a camada
superficial do meio de cultura congele. Chisti (2007) alerta que
a temperatura deve permanecer na faixa entre 20°C a 30°C.
Diante das limitações do cultivo aberto, foram desenvol-
vidos os sistemas fechados, conhecidos como fotobiorreatores
fechados (SOARES, 2010). Esses cultivos são realizados em
recipientes fechados de plástico, vidro ou policarbonato, sendo
necessária a introdução nas unidades, dos nutrientes que as
microalgas precisam para crescer (PÉREZ, 2007). As unida-
des de configuração fechada reduzem o efeito da contamina-
ção e da evaporação, favorecendo o crescimento das células,
sendo possível maior controle da temperatura e da intensidade
luminosa (FRANCISCO, 2010; REDAELLI; MARCILIO; RECH,
2010). No entanto, ainda existem problemas que incluem: o
superaquecimento, o entupimento, a acumulação de oxigênio,
o alto preço de instalação, de funcionamento e de manutenção
do cultivo (JACOME-PILCO et al., 2009; PEQUENO, 2010).
Estes sistemas fechados podem ser instalados ao ar livre ou
em ambiente coberto. No caso de cultivos em locais abertos, a
luz solar é aproveitada para o crescimento das microalgas. No
caso de ambientes fechados, há duas possibilidades: através do
uso de casas de vegetação, cujo teto e as paredes laterais são
transparentes, permitindo o aproveitamento da energia solar,
que pode ou não ser reforçada pela ação de lâmpadas fluores-
centes; em locais opacos à penetração de luz solar, nos quais

a energia luminosa é inteiramente artificial, provenientes de

lâmpadas fluorescentes (LOURENÇO, 2006).
Nos cultivos em sistemas fechados, os custos de ajuste e
operação são mais elevados do que as lagoas abertas, mas a
eficiência e o rendimento em biomassa são significativamente
maiores, ou seja, esta desvantagem inicial no custo é dissipada
no médio e longo prazo, podendo viabilizar assim a produção
comercial (PÉREZ, 2007).
Os sistemas de produção híbrida combinam o cultivo
fechado com o aberto, em dois estágios distintos. No primeiro,
as algas crescem num ambiente controlado em fotobiorreato-
res, evitando assim a contaminação e favorecendo a divisão
celular. O segundo estágio, refere-se à transferência das células
para os sistemas abertos.
7.4 Fotobiorreatores em Bancada

em Casa de Vegetação
No projeto Microalgas, uma grande variedade de mode-
los de fotobiorreatores (FBRs) foi adaptada para utilização
em bancada e casa de vegetação, para atender a necessidade
da produção de microalgas em pequena e em média escala.
Para isto, ao longo do período de desenvolvimento do projeto,
foram utilizados os mais diferentes tipos de fotobiorreatores. A
confecção dos modelos dos fotobiorreatores fechados foi reali-
zada conforme o objetivo da atividade desenvolvida, o volume
de biomassa que se pretendia obter, a quantidade de fotobior-
reatores que seria necessária com base nos tratamentos e repe-
tições. Estes FBRs são demonstrados na Figura 7.1.

Figura 7.1. Fotobiorreatores adaptados para cultivo de microalgas

durante o Projeto Microalgas, conforme objetivo do cul-
tivo. (a) Erlenmeyers de vidro (500 mL) com aeração;
(b) tubos de ensaio, (c) vidros DURAN; (d) erlenmeyers
de 250 mL sem aeração; (e) aquários de vidro; (f) garra-
fas PET; (g) garrafas de vidro.

7.5. Fotobiorreatores hexaédricos fechados

A concepção do sistema de Fotobiorreatores hexaédricos
fechados (FHF) para o cultivo de microalgas iniciou-se através
da identificação dos mecanismos a serem utilizados tanto para
alimentação do sistema fechado de produção de microalgas,
bem como, a quantificação dos volumes de descarga das uni-
dades, possibilitando assim seu balanço volumétrico. Para isso
construiu-se três unidades em vidro, com volume total de 50 L
e útil de 35 L (Figura 7.2a).
7.5.1. Alimentação e dispositivo de coleta

Para o fornecimento do meio de cultivo dos fotobiorrea-
tores, foi utilizados equipos médico-hospitalares, os quais pos-
sibilitam a inserção de líquidos em unidades fechadas. Para a
quantificação das descargas, já que a proposta foi avaliar um
sistema semicontínuo, utilizaram-se os equipamentos denomi-
nados pluviógrafos, que registram continuamente os volumes
descartados (Figura 7.2b). As cubas sifonadas responsáveis
pelo armazenamento temporário, por serem de metal, passa-
ram por um tratamento com pintura eletrostática, as quais a
impermeabilizaram, eliminando assim, qualquer contato.
Para possibilitar todo este fluxo de líquidos nas três (3)
unidades, construiu-se uma estrutura metálica para servir
de suporte dos diferentes componentes dos fotobiorreato-
res hexaédricos fechados (FHF), o que permite sua repetição.
Para isto, as unidades foram dispostas lado a lado, a qual era
compota por três níveis: o superior, que comportam recipien-
tes contendo os meios de cultura para alimentação dos FHF;
o intermediário onde estavam localizados os fotobiorreatores
hexaédricos fechados e, o inferior equipado com pluviógrafos
para coleta e quantificação das descargas.
Neste fotobiorreator, adotou-se o cultivo semicontínuo, no
qual uma parcela do meio com microalgas é removida e subs-

tituída por um novo meio de cultura. Desta maneira, o cultivo

que permanece no fotobiorreator serve como inóculo para o
cultivo seguinte, o que tende a diminuir o tempo de produ-
ção de biomassa, sendo que a porcentagem retirada, em geral,
variou entre 10 a 50% do volume do meio de cultivo. Além
disso, estudou-se a remoção de diferentes percentuais, bem
como, os intervalos de tempo; como descrito no item 7.5.2.
A alimentação dos fotobiorreatores fechados foi através
de reservatórios, posicionados acima das unidades, onde os
nutrientes foram encaminhados por bombas de infusão volu-
métricas universais, utilizando equipamentos de soro padrão,
que controlam os líquidos que são infundidos nos FHF, como
apresentado na Figura 7.2a.
Figura 7.2. (a) Fotobiorreatores hexaédricos fechados compostos

de três níveis: o superior, que comportam recipientes
contendo os meios de cultura para alimentação dos
FHF; o intermediário que suporta os fotobiorreatores
e, o inferior equipado com pluviógrafos para coleta e
quantificação das descargas. (b) Detalhe dispositivo de
coleta da descarga com registro do sistema fechado de
produção de microalgas

7.5.2 Produção de biomassa de Chlorella vulgaris

em fotobiorreatores fechados
Foram avaliadas três diferentes condições de cultivo nos
fotobiorreatores hexaédricos fechados (FHF), no regime semi-
contínuo. A coleta das microalgas foi realizada no lado oposto
do sistema de entrada dos nutrientes, através de um registro
esfera e um coletor, para descarga do material extraído. Para
sua quantificação foram instalados equipamentos que regis-
tram continuamente os volumes coletados da biomassa, sendo
que estes foram direcionados para uma cisterna, onde se pro-
cessa o sifonamento automático, com o registro gráfico, como
pode ser observado na Figura 7.2b.
Diante disto, este trabalho teve como objetivo cultivar a
microalga Chlorella vulgaris em fotobiorreatores hexaédricos
fechados (FHF), em regime hidráulico semicontínuo, com per-
centuais distintos de coleta da biomassa. Para isso, foram uti-
lizadas três unidades de FF confeccionados em vidro, com sis-
temas de alimentação para reposição de nutrientes e descarte
quantificado. As condições de cultivo foram as seguintes:
a) FHF-1: meio de cultura BBM, cuja composição foi de

50% do meio original, com descarte semanal de 2,5%
do volume útil e, posterior reposição de meio novo,
não sendo controladas as condições de temperatura e
luminosidade;
b) FHF-2: meio BBM, composição de 50% do original,
com temperatura de 27°C e fotoperíodo de 12h/12h
(claro/escuro) mantido por lâmpadas fluorescentes de
40 W, mas com retirada semanal de 5% do volume,
seguido da reposição;
c) FHF-3: nesta composição, utilizou-se o meio Oligo,
sem controle de temperatura e luminosidade, com re-
tirada de 5% do cultivo.

Salienta-se que o inóculo inicial foi de 10% para as três

condições testadas. Para monitoramento do sistema, foram
avaliados o pH, a densidade óptica e contagem de células, uti-
lizando a câmara de Neubauer. As produções de biomassa seca
nas unidades 1, 2 e 3 foram: 2, 4 e 3 mg L-1 dia-1, respectiva-
mente. O meio de cultura BBM para FHF-1 foi menos eficiente
que o meio Oligo em FHF-3, tal fato pode estar associado à
deficiência de nutrientes apresentadas pelo meio BBM.
7.6 Construção de Sistema Aberto de Cultivo

de Microalgas no Norte do Paraná
Um dos sistemas de cultivo aberto mais comuns de microal-
gas é a lagoa tipo pista de corrida, denominada “raceway”.
Este sistema é um canal de recirculação composto por uma
volta fechada, onde podem ser utilizadas pás rotativas, as quais
permitem o controle da velocidade e da direção do fluxo do
cultivo. A quantidade de pás que compõem o sistema depende
das dimensões do tanque, girando em torno de 10-15 rotações
por minuto (LOURENÇO, 2006; BLANCO et al., 2007; CHISTI,
2007).
Para um bom cultivo, a agitação é um fator muito impor-
tante a fim de homogeneizar o meio e para evitar a sedimenta-
ção das microalgas. Usa-se o termo agitação mecânica quando
o sistema possui um equipamento que pode ser definido como
um elemento rotatório, normalmente montado em eixo hori-
zontal centrado, o qual promove também o escoamento do
fluído.
A agitação também pode ser feita por meio do bombea-
mento de ar para o interior do meio de cultivo. A aplicação de
ar aos cultivos proporciona uma difusão efetiva dos nutrientes,
um aporte parcial de CO2 inorgânico, uma estabilidade do pH,
a manutenção das microalgas em suspensão e o cultivo uni-

formemente distribuído (COLLA et al., 2002). Para análise do

desempenho da agitação mecânica, devem-se levar em consi-
deração algumas variáveis como, por exemplo: tipo, forma e
quantidade de pás rotativas, relações geométricas, formação
de vórtices, velocidade de rotação do agitador, concentração e
densidade da mistura, granulometria da partícula, velocidade
de sedimentação.
Tendo em vista que um dos objetivos do Projeto Microal-
gas era a construção de sistemas abertos, apresenta-se neste
item, o sistema aberto do tipo “raceway” que foi desenvolvido
e construído, servindo como base para os ensaios de cultivo
massal conduzidos no projeto.
7.6.1 Infraestrutura de apoio

O cultivo massal de microalgas necessita além dos sistemas
de produção de uma infraestrutura de apoio laboratorial, com-
posta por salas climatizadas com câmaras de fluxo laminar.
Nestas estruturas de apoio são realizadas as transferências de
alíquotas do cultivo em incubadoras, além de outras análises
do processo de produção. A planta do laboratório construído
anexo ao “raceway” do projeto, bem como algumas fotos do
local são apresentadas na Figura 7.3.

Figura 7.3. a, b) Laboratório de Microalgas do Instituto Agronômico

do Paraná, Londrina- PR; c) Planta baixa; d) Câmara cli-
matizada para manutenção das cepas.
7.6.2 Escolha da área, preparo do terreno e

fundações
A área para instalação do sistema aberto foi escolhida em
função da proximidade com o Laboratório de Microalgas, além
de estar posicionada no sentido leste e oeste, corroborando com
a posição do sol ao longo do dia, visando possibilitar melhor
aproveitamento da luz solar para o crescimento das microalgas.
Entre as ações para a instalação destas unidades, realiza-
ram-se: limpeza do local, escavação, transporte e compacta-
ção do solo, atividades estas que foram realizadas com uma
retroescavadeira. A quantificação dos volumes do corte e aterro
é apresentada na Tabela 7.2.

Tabela 7.2. Quantificação dos volumes de corte e aterro.
Atividade Volume (m3)
Corte 211,20
Aterro 64,80
Total 276,00
Após o término da movimentação de terra, corte e aterro,

iniciaram-se as atividades com a execução das fundações, utili-
zando um gabarito para locação das unidades na área. Para as
fundações do muro do entorno foram realizadas escavações de
uma viga baldrame, com as dimensões de 20 x 20 cm, em todo
o perímetro, aliado a 24 brocas, com trado manual diâmetro
20 cm, com profundidade de 1,0 metros. Após isto, foi reali-
zada a disposição de uma camada de brita no substrato de toda
viga do muro de aproximadamente 5 cm.
Finalizadas estas tarefas, foram realizadas a concretagem
das fundações e vigas baldrame armadas, para posterior assen-
tamento de tijolos de seis (6) furos e disposição de brita nas
laterais da viga, visando promover a drenagem das águas plu-
viais. Todo o material escavado manualmente foi depositado
no canteiro de obras, para posterior remoção e disposição para
readequação do canal de águas pluviais entre a plataforma do
“raceway” e o laboratório de microalgas. Da mesma forma, para
as fundações e a estrutura de suporte foram executadas trinta
(30) brocas, com trado manual, diâmetro 20 cm, com profundi-
dade entre 1,0 e 1,5 metros, além da escavação manual da viga
baldrame armada, com as dimensões de 20 x 20 cm, em todo o
perímetro das unidades.
Posteriormente, foram realizadas a confecção, montagem
e colocação das armaduras, para posterior preparo e instalação
das formas de madeira e, por fim, a concretagem das brocas e

das vigas baldrames. Após a retirada das formas de madeira,

iniciou-se o assentamento de tijolos para execução das pare-
des e as estruturas armadas dos pilares e lajes para suporte
das unidades. As imagens referentes às bases das unidades são
apresentadas na Figura 7.4.
Figura 7.4. a) Fundações; b) Caixaria e armaduras para as vigas

baldrame; c, d) Alvenaria de tijolos, para composição
da plataforma dos “raceways”. Instituto Agronômico do
Paraná, Londrina- PR.
7.6.3 Execução do sistema de produção aberto

Com o término das obras civis da plataforma dos “race-
ways” para produção de microalgas em grande escala, estas
foram devidamente pintadas, com acabamento interno das uni-
dades em manta de vinil, visando sua impermeabilização. Após

esta etapa, iniciaram-se os trabalhos de instalação da rede elé-

trica e hidráulica, bem como, dos equipamentos, composto
pelas pás rotativas, tanques de recirculação, reservatórios de
água potável, de meio de cultivo e de água clorada para assep-
sia, bem como, cilindros de CO2. Os motores e bombas são
independentes, possuindo acionamento elétrico com partida
automática, a partir do quadro de comando elétrico.
Na rede hidráulica, o escoamento de qualquer fluido em
uma tubulação resulta sempre em certa perda de energia do
fluído, devido à resistência imposta ao escoamento e, que final-
mente é dissipada sob a forma de calor. Diante disto, foram cal-
culadas as perdas de carga nas tubulações e acessórios, tanto na
distribuição realizada por meio de escoamento por gravidade,
como por bombeamento. No caso dos reservatórios apoiados e
enterrados, foram instalados válvulas de retenção e registros.
Visando eliminar o efeito da precipitação direta nas uni-
dades, realizou-se a cobertura dos “raceways”, utilizando uma
estrutura metálica e uma manta transparente. Além disso,
foram criadas condições básicas para recirculação do ar, com a
saída do ar aquecido pela cumeeira, promovendo a renovação
do ar de maneira eficiente.
Salienta-se ainda que, em toda área ao redor das unidades
foi disposta uma camada de Brita no. 02, com 30 de espes-
sura, visando à drenagem das águas pluviais. Para as áreas do
entorno da plataforma foram plantadas gramas, para evitar os
efeitos da erosão no solo.
Os sistemas abertos para produção de microalgas, “race-
ways” foram construídos em forma alongada, cantos arredon-
dados, sendo composto por quatro (4) unidades, sendo duas de
1.500 L e duas de 3.000 L, como apresentado na Tabela 7.3.

Tabela 7.3. Dimensões dos sistemas abertos de produção de microalgas.
Sistema aberto No. 01 No. 02
Quantidade (unidade) 02 02
Comprimento reto útil (m) 2,20 3,50
Raio cilindro circular (m) 0,60 0,80
Comprimento total (m) 3,40 5,10
Largura útil (m) 0,60 0,80
Nível de água (m) 0,40 0,40
Altura (m) 0,70 0,70
Volume curva (m3) 0,45 0,80
Volume central (m3) 0,90 1,61
Volume de uma unidade (m3) 1,50 3,00
Volume de duas unidades (m3) 3,00 6,00
7.6.4 Layout da plataforma de “raceways”

O detalhamento do sistema aberto para produção de micro-
algas é apresentado nas Figuras 7.5, 7.6 e 7.7.
As imagens referentes à plataforma de “raceways” são
apresentadas na Figura 7.8.

Figura 7.5. Implantação do sistema aberto de produção de microal-

gas e laboratório.

Figura 7.6. Layout da plataforma do sistema aberto de produção de

microalgas.
Figura 7.7. Cortes da rede de abastecimento de água, CO2 e nutrien-

tes.

Figura 7.8. a, b) Vista lateral e frontal da plataforma de “raceways”;

c) Rede hidráulica e CO2; d) Quadro de comando elétri-
co; e, f) Pás rotativas g) Reservatório de água; h) Tanque
de recirculação. Instituto Agronômico do Paraná, Lon-
drina- PR.

7.6.5 Validação do sistema de produção

Os testes para verificação das condições operacionais do
sistema de cultivo aberto foram realizados com sucesso.
Para validação do sistema de produção massal de microal-
gas, realizaram-se o cultivo de microalgas, de acordo com os
seguintes procedimentos:
• Os inóculos iniciais foram preparados em sacos plás-

ticos transparentes, com volume de 50 L, utilizando o
meio BBM, visando acelerar o crescimento e certificar-
-se de que o inóculo proveria elevada densidade de
células;
• Para aclimatação dos inóculos, estes permaneceram
por um período de 10 dias de crescimento em local
aberto;
• O inóculo foi transferido para os raceways com volu-
me de 1.500 L;
• Após 7 dias, parte do cultivo dos raceways com volu-
me de 1.500 L serviu como inóculo para os raceways
com volume de 3.000 L.
7.6.6 Coleta da biomassa algal, lavagem e

desinfecção do sistema de cultivo
• A coleta da biomassa microalgal é outro ponto crítico

no que tange o contato direto entre os componentes
do mecanismo de coleta e o cultivo, evitando assim
sua contaminação. Para isto, as partes internas das
tubulações de descarga do sistema de cultivo devem
encontrar-se desinfectadas, sendo que, para isto, toda
rede coletora deve ser submersa em solução de cloro
até no máximo de 50 mg L-1;
• Após esta etapa de desinfecção, deve-se realizar o
enxágue da tubulação e de toda a rede hidráulica,

através da aplicação de jatos de água, proveniente de

um reservatório de água potável. Finalizado o enxá-
gue com água pura das tubulações, são iniciados os
trabalhos de coleta, os quais podem ser realizados com
a ajuda de polímeros que promovem a sedimentação
da biomassa, após o desligamento das pás rotativas.
Nesta fase, o meio de cultivo pode ser retirado dos
sistemas de cultivo e ser encaminhado para os tanques
de recirculação, com posterior reaproveitamento;
• Com o fim da coleta de todo material, independen-
temente do tipo de sistema de cultivo, são necessá-
rias algumas operações específicas, como fechamen-
to do registro na linha de descarga, visando eliminar
todos os resíduos de biomassa, através de sua lavagem
e desinfecção, para dar início a uma nova linha de
produção de biomassa microalgal;
• Toda a rede hidráulica dos sistemas de produção
massal de microalgas, seja ela para abastecimento de
água e/ou meio de cultivo, alimentação, derivação,
recirculação e coleta, deverá ser identificada, visando
o seu correto ordenamento de abertura e fechamen-
to dos registros, evitando assim qualquer problema
operacional.
7.6.7 Cultivo de Chlorella sorokiniana e Neochloris

oleoabundans em “raceways”
O cultivo das estirpes de microalgas Chlorella sorokiniana
(IPRChs7107) e Neochloris oleoabundans (UTEX LB1185) foi
realizado em fotobiorreatores abertos do Projeto Microal-
gas, durante o inverno (Gatti et al.,2013). Para minimizar
os custos de produção de biomassa de microalgas utilizou-
-se como fonte de nitrogênio a ureia ((NH2)2CO), como fonte
de fósforo o superfosfato simples Ca(H2PO4) e como fonte de
ferro o cloreto de ferro (FeCl3). Além disso, utilizou-se EDTA
(C10H14N2Na2O8.2H2O) como estabilizante. O meio de cultivo

foi feito com água não estéril, com pH inicial de 6,8. O inóculo
inicial foi preparado em sacos plásticos transparentes, manti-
dos em ambiente externo ao laboratório, sem controle de tem-
peratura ou luminosidade. Para cada um dos “raceways” foi
utilizada uma espécie de microalgas. A concentração de cada
inóculo foi de 9,68 105 cél mL-1 de C. sorokiniana e de 4,96
105 cél mL-1 de N. oleoabundans. Após 7 dias de cultivo, foram
transferidos 600 L de cada fotobiorreator de 1.500 L para os
“raceways” de 3000 L através de um sistema de hidráulico.
O experimento foi conduzido sob luminosidade e tempera-
tura ambiente, sendo mantida a agitação por bomba de água
submersa, com fluxo máximo de 2.800 L por hora. Após 18
dias de cultivo, realizou-se a amostragem para avaliação dos
seguintes parâmetros: pH, contagem de células em câmara de
Neubauer, determinação da densidade óptica por espectrofo-
tometria a 670nm e quantificação da biomassa seca a 60oC em
estufa com ventilação forçada e o teor de lipídeos por extração
com clorofórmio e metanol.
O número de células inicial das microalgas C. sorokiniana
e N. oleoabundans foi comparada com o número de células no
18º dia de cultivo (Tabela 7.4), bem como, os resultados do
pH, densidade óptica, biomassa.
Tabela 7.4. Determinação de pH, densidade óptica, biomassa e teor

de lipídeos.
Análises C. sorokiniana N. oleoabundans
pH final 9,82 10,87
DO670 nm final 0,12 0,13
Biomassa final (g L-1) 0,10 0,09
Número de células
9,68 4,96
inicial (x 105 m L-1)
Número de células
11,50 16,00
final x (x 105 m L-1)

Neste trabalho constatou-se que é de fundamental impor-

tância aperfeiçoar as condições de cultivo utilizando meios de
baixo custo, para que se mantenham valores significativos de
produção massal.
7.6.2 Composição da biomassa da Chlorella

sorokiniana após extração de lipídeos totais
Após a extração de lipídeos, a biomassa residual, rica em
nutrientes, pode ser utilizada como biofertilizante. Gatti et al.
(2013) reportaram os resultados de um trabalho que foi con-
duzido em tanques abertos, do projeto Microalgas, com o obje-
tivo de caracterizar a composição da biomassa microalgal após
a extração de lipídeos totais. Os autores utilizaram Chlorella
sorokiniana (IPR-Chls7107) para o cultivo em sistema aberto
com capacidade de 1.500 L em meio Bold’s Basal Medium
(BBM), por aproximadamente 60 dias. Após este período, a
biomassa foi separada do meio de cultivo pela adição de poli-
cloreto de alumínio. Os lipídeos foram extraídos da biomassa
seca a 50°C sob refluxo de hexano em extrator do tipo Sohxlet
por 8 horas. A biomassa foi levada novamente à estufa por 2 h
a 60oC. Os teores de nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, mag-
nésio, carbono, cobre, manganês e ferro foram determinados
antes e após a extração dos lipídeos. A proteína e os pigmen-
tos (clorofila a, feofitina a e carotenoides) foram determinados
pela técnica de extração com acetona, seguida de leitura em
espectrofotômetro em diferentes comprimentos de onda, obe-
decendo à mesma sequencia de análise.
Os nutrientes foram reduzidos na biomassa, variando na
ordem de 34,5% para o carbono, até 89,4% no cálcio, após
a extração de lipídeos, bem como a proteína que apresentou
redução em torno de 14,1%. As variações na concentração
de feofitina a, clorofila a, carotenoides totais e feofitina a são
apresentados na Tabela 7.5.

Tabela 7.5. Concentração (mg L-1) na concentração de clorofila-

-a, feofitina-a e carotenoides totais na biomassa da
microalga IPR-Chls7107 (Chlorella sorokiniana), antes
e depois da extração de lipídeo.
Antes Depois
Características
(μg L-1)
Clorofila-a 258,39 147,02
Feofitina-a 187,11 298,48
Carotenoides totais 209,46 103,54
Portanto, a composição da biomassa de Chlorella sorokiana

após extração de lipídeos totais ainda possui nutrientes.
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PARTE 3
DESAFIOS PARA O
ISOLAMENTO, MANUTENÇÃO
E CARACTERIZAÇÃO
DE MICROALGAS

CAPÍTULO 8
COLETA, ISOLAMENTO,
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA
E MANUTENÇÃO IN VIVO DE
MICROALGAS DA COLEÇÃO IPR
Diva Souza Andrade
Alexandra Scherer

Introdução
Microalgas são organismos microscópicos que primaria-
mente apresentam clorofila em sua constituição e, por isso, são
capazes de realizar fotossíntese. Além disso, produzem uma
série de compostos de grande interesse comercial e para a pes-
quisa. Na área comercial, os compostos da biomassa microal-
gal possuem uma variedade de aplicações, seja na alimenta-
ção humana e de animais, na extração de compostos químicos
finos, como pigmentos ou na produção de energia renovável.
No campo da pesquisa destacam-se estudos sobre a ocorrên-
cia, distribuição e descrição de novas espécies. Além disso, as
microalgas nativas ou naturalizadas apresentam grande poten-
cial de uso biotecnológico (AMARO et al., 2011).
Diversas espécies de microalgas como Botryococcus brau-
nii, Neochloris oleoabundans, Chlorella spp. Chaetoceros mulleri,
Chaetoceros calcitrans, Chlorococcum spp., entre outras, produ-
zem altas concentrações de lipídeos, que pode ser utilizado
para a produção de biodiesel, apresentando grande poten-
cial de utilização prática (CHISTI, 2007; BALIGA et al., 2010;
MATA et al., 2010; CHEN et al., 2013). Devido ao interesse por
fontes renováveis de energia, pesquisas têm sido voltadas para
a produção simultanêa de biodiesel, bioetanol e metano a par-
tir de matéria-prima de microalgas. A partir de um diagnóstico
tecnológico, sobre o potencial das microalgas para produção
de biocombustível, Antunes e Silva (2010) concluíram que por
se tratar de área tecnológica com empresas diretamente envol-
vidas com combustíveis, a proteção de patentes tecnológicas,
nesta área no Brasil, tende a crescer.
Afora os biocombustíveis, ainda existe uma demanda alta
de matéria-prima de microalgas, por exemplo, espécies de Hae-
matococcus pluvialis, Muriellopsis sphaerica, Arthrospira platen-
sis e Chlorella sp. para produção biotecnológica de compostos
como os pigmentos, suplementos proteicos, compostos com
atividade antioxidante e promotores de crescimento (MARGA-

LITH, 1999; DEL CAMPO et al., 2007; AMIN et al., 2009; FUJII
et al., 2010; FASSETT et al., 2011; ABURAI et al., 2013).
As microalgas são encontradas em diversos ambientes
aquáticos, tanto marítimos como em águas continentais ou de
interiores, e também em ambiente terrestre, diretamente no
solo ou em associação com plantas e animais. Para estudos ex
situ, existem diversos métodos de coleta (BICUDO et al., 2006),
bem como de isolamento de microalgas do ambiente, como o
uso de meio de cultivo enriquecido, isolamento de células utili-
zando micropipetas, isolamento em meio de cultivo agarizado,
diluição, separação por gravidade e fototaxia (ANDERSEN et
al., 2005; LOURENÇO, 2006). A escolha dos métodos de iso-
lamento depende do objetivo da coleta e de fatores como a
disponibilidade de equipamentos do laboratório.
A Coleção IPR de Microalgas foi formada para atender a
demanda do projeto de pesquisa intitulado Microalgas, resul-
tado de um Convênio entre o Instituto Agronômico do Paraná
(IAPAR), a Companhia Paranaense de Energia (COPEL) e a
Fundação de Apoio à Pesquisa e ao Desenvolvimento do Agro-
negócio (FAPEAGRO). O principal objetivo das coletas foi esta-
belecer uma coleção de trabalho composta por espécimes nati-
vos de ambientes aquáticos continentais do Estado do Paraná,
visando a seleção de microalgas com potencial para aplicação
na produção de biocombustível. Após a coleta, foram realizadas
as análises morfológicas, fisiológicas e genéticas nos espécimes,
que possibilitaram sua caracterização, identificação e seleção
prévia. Neste capítulo são abordadas de maneira sucinta as
metodologias utilizadas para coleta, isolamento, caracteriza-
ção morfológica (celular e colonial) e preservação das estirpes
para manutenção da Coleção de microalgas IPR. Esta coleção
encontra-se alocada no IAPAR, sendo composta de espécimes
de microalgas do grupo cianófitas (Filo Cyanobacteria) e cloró-
fitas (Divisão Chlorophyta).

8.1 Coleta e Preparo de Amostras para

Isolamento de Microalgas ex situ
8.1.1 Coleta de material biológico

A escolha do local e dos métodos está relacionada aos
objetivos da coleta, ou seja, o tipo de microalga a ser isolada
e o estudo a ser realizado. O objetivo da formação da Cole-
ção IPR, no projeto Microalgas foi obter diversidade quanto às
características de teores de lipídeos, pigmentos e adaptabili-
dade às diferentes condições climáticas. A coleta de amostras
de material biológico aquoso foi realizada em lagoas fotossin-
téticas (sedimentação de resíduos), reservatórios de água doce,
lagoas naturais e tanques de piscicultura, em diferentes regiões
do estado do Paraná (Figura 8.1A e B).
As coletas de amostras foram em lagoas fotossintéticas e
de criação de peixes, em regiões representativas de diferentes
condições climáticas do Estado do Paraná. A descrição dos 10
locais de coleta nos diversos municípios, ambientes, climas e
coordenadas geográficas estão na Tabela 8.1.
Uma vez definido o objetivo e os locais de coleta de amos-
tras, todo o material de laboratório utilizado na sua realiza-
ção deve ser previamente higienizado por meio de lavagens e
esterilizado com calor úmido (autoclave), calor seco (estufas),
agentes químicos ou radiação ultravioleta, conforme descrito
por Lourenço (2006). Os dados de coleta de cada local devem
ser registrados na caderneta de campo, incluindo coletor, data,
local e coordenadas geográficas, bem como outras indicações
consideradas relevantes para a codificação e identificação das
estirpes de microalgas isoladas (BICUDO; MENEZES, 2006).
Valores de alguns parâmetros da água, tais como: profundi-
dade de amostragem, potencial hidrogeniônico (pH), tempe-
ratura, condutividade e teor de oxigênio dissolvido, podem
ser incluídos, caso existam aparelhos de campos devidamente

calibrados. Este procedimento é importante para a caracteriza-

ção inicial da espécie e posterior depósito em uma Coleção de
microrganismos. Essas informações também ajudam na esco-
lha dos meios de cultivo utilizados no processo de isolamento,
pois os espécimes podem apresentar diferentes requerimentos
nutricionais, bem como a necessidade de enriquecimento adi-
cional (carboidratos, vitaminas, etc.) do meio para que ocorra
um bom desenvolvimento celular, mesmo fora do seu ambiente
natural (BARSANTI et al., 2006).
Para a Coleção IPR, as amostragens foram feitas em dupli-
cata, a uma profundidade aproximada de 20 a 30 cm e coloca-
das em frascos de 1 L esterilizados, identificados com o local,
um número arábico e data. Os frascos foram armazenados em
caixas de isopor e encaminhados ao laboratório para as análi-
ses e isolamentos. No laboratório, as identificações das amos-
tras foram registradas no caderno da Coleção de Microalgas,
conforme padrão segundo a Federação das Coleções de Cultu-
ras Mundial (2010). O pH das amostras foi determinado, ano-
tado e as mesmas mantidas em temperatura entre 4°C e 8°C por
24-72 h, até o seu processamento.

Figura 8.1. Tipo de lagoa e locais de coleta de amostras para for-

mação da Coleção IPR de microalgas no projeto Convê-
nio Copel/Fapeagro/IAPAR. (A) Lagoa fotossintética; (B)
municípios do estado do Paraná, onde foram realizadas
coletas das amostras de água. Fonte: Mapa elaborado por
João Henrique Caviglione.

312
Tabela 8.1. Localidades e características dos pontos de coleta de amostras de água no estado do Paraná para

o estabelecimento da Coleção IPR de Microalgas.
Clima Altitude
Município Ambiente Latitude Longitude
(Köppen) (m)
Lagoa
*Guarapuava Cfb 963 25° 23′ 19″ Sul 51° 32′ 45″ Oeste
natural
Lagoa
*Pato Branco Cfa 704 26° 07′ 26″ Sul 52° 38′ 58″ Oeste
natural
Lagoa
*Palotina Cfa 269 24° 18′ 27″ Sul 53° 54′ 15″ Oeste
natural
São Mateus Lagoa

Cfb 761 25° 50’ 53” Sul 50° 23 ’33” Oeste
do Sul natural
Fernandes Lagoa
Cfb 805 25° 25’ 12” Sul 50° 32’ 52” Oeste
Pinheiro natural
Pesqueiro-
Tapejara Cfa 494 23° 44’ 01” Sul 53° 55’ 01” Oeste
lagoa
Umuarama* Represa Cfa 447 23° 47’ 44’ Sul 53° 15’ 15” Oeste
30/07/2014 09:47:36
Resíduo
Arapongas Cfa 804 23° 25′ 00″ Sul 51° 25′ 00″ Oeste
suíno
Porecatu Vinhaça Cfa 364 22º 45’ 00” Sul 51° 22’ 00” Oeste
Lagoa
industrial
Londrina e Chorume Cfa 550 23° 17′ 00″ Sul 51° 10′ 00″ Oeste
de lixo
urbano
*Estação experimental do IAPAR.
313
30/07/2014 09:47:36
8.1.2 Preparo de amostras para isolamento

Nesta etapa do isolamento é possível selecionar grupos
de microalgas quanto a nutrição, se autotrófico, fotoautotró-
fico ou mixotrófico, por exemplo. Também o procedimento
de centrifugação (gravimétrica) permite separar as microalgas
por tamanho de células e ou ausência de flagelos. No projeto
Microalgas estes procedimentos foram testados.
Estudos têm destacado a importância dos cultivos hete-
rotróficos ou mixotróficos de diversas espécies de microalgas
como uma alternativa aos cultivos fotoautotróficos convencio-
nais (GRAVERHOLT et al., 2007; LI et al., 2007; ANDRADE et
al., 2008; LIANG et al., 2009; AZMA et al., 2011; CHEN et al.,
2011; FENG et al., 2011; MORALES-SÁNCHEZ et al., 2013)
(DAY et al., 1991). Os cultivos mixotrófico e heterotróficos ten-
dem a apresentar maior eficiência na produção de biomassa
em microalgas de determinadas espécies. Assim, a estratégia
adotada para isolar microalgas heterotróficas, mixotróficas e
fotoautotróficas, presentes na mesma amostra, foi a divisão do
isolamento em duas etapas. Na primeira etapa alíquotas das
amostras originais foram inoculadas simultaneamente em dois
meios líquidos de cultivo contendo sais minerais: o meio de
cultura BG -11, que é recomendado e com certa especificidade
para microalgas cianófitas, (ALLEN, 1968; ALLEN et al., 1968;
RIPPKA, 1988) e o meio BBM (Bold Basal Medium) no qual se
desenvolvem tanto cianófitas quanto clorófitas (BOLD, 1949;
BISCHOFF et al., 1963).
Na segunda etapa do processo de isolamento, alíquotas das
amostras originais foram inoculadas em meio de cultura mine-
ral líquido BG-11 e BBM enriquecido com glicose como fonte
de carbono, na concentração de 5 g por litro (subamostras).
Para o desenvolvimento de microalgas, todas as amostras em
meios de cultura (BG-11 e BBM) e subamostras desses meios
com adição de 5% de glicose foram incubadas por duas sema-
nas sob condições de luz controlada para, aproximadamente,
80 μmol de fótons m-2 s-1 e temperatura de 28 ± 2°C. A partir
desses cultivos líquidos ex situ foram testadas duas formas de

isolamento simultaneamente: em tubos/frascos de 10 mL con-

tendo os meios de cultura líquidos (BG -11 e BBM) e em placas
de petri contendo os mesmos meios de cultura acrescidos de
1,0% (v/m) de ágar.
Para obter microalgas com tamanho maior de células o
preparo das amostras para isolamento por gravimetria foi de
acordo com procedimento descrito por Lourenço (2006). Neste
terceiro procedimento, alíquotas de 100 mL de cada amostra
de água foram transferidas para frascos contendo 100 mL de
meio de cultura BBM e mantidos em câmara de crescimento
a 28 ± 2°C e fotoperíodo de 12 h durante 15 dias. Após este
período alíquota de 1 mL dos cultivos foi transferida para
microtubos, centrifugadas a 2.000 g por 1 min e descartado
o sobrenadante. O pellet foi ressuspendido em meio BBM e
novamente inoculado em 100 mL dos meios BBM e BG-11, em
duplicata para cada meio. Os frascos foram então incubados
em câmara de crescimento a 26 ± 2°C e fotoperíodo de 12 h
por 15 dias. Ainda no isolamento por gravimetria pode se uti-
lizar se o procedimento da decantação e sifonamento do sobre-
nadante da amostra por 2 a 24 h para separar células de baixa
densidade e tamanho menor de células grandes, não móveis e
de alta densidade.
8.2 Métodos de Isolamento para Obtenção de

Culturas Axênicas
A escolha do procedimento metodológico para o isola-
mento de microalgas depende da infraestrutura e disponibili-
dade de equipamentos, vidrarias e reagentes consumíveis do
laboratório.
8.2.1 Isolamento em meio de cultivo sólido

As variações dos procedimentos de isolamento em meios
de cultura sólidos são diversas, por exemplo, o da difusão em

ágar (BANERJEE et al., 2012), o espalhamento na superfície

com inclusão de compostos antimicrobianos para reduzir os
riscos de contaminações.
Para evitar o crescimento de contaminantes, entre os agen-
tes antifúngicos recomenda-se a Ciclohexamida, a Nistatina e a
Anfotericina B. Existe relato de sucesso do uso de combinação
(coquetel) de antibióticos para descontaminação de culturas de
Pyrodinum (SANTOS et al., 2011). Na formação da Coleção IPR
de microalgas esta estratégia também foi utilizada nos proce-
dimentos de isolamento.
Além dos meios de cultura BG-11 e BBM sem antimicro-
bianos, também foram utilizados meios adicionados de uma
combinação dos antimicrobianos ciclohexamida (100 μg mL-1)
e estreptomicina (50 μg mL-1).
Alíquotas de cada amostra foram inoculadas por espalha-
mento em placas de Petri, as quais foram mantidas em câmara
de crescimento sob condições controladas. Um sumário das
etapas de isolamento em meio de cultivo sólido pode ser visua-
lizado no esquema apresentado na Figura 8.2.

Figura 8.2. Representação das etapas do isolamento de microalgas

em meio mineral sólido: (A) amostra coletada cultivada;
(B e C) crescimento massal em meio agarizado; (D) ob-
tenção de colônia isolada da microalga; (E, F e G) foto-
micrografia de células de microalgas; (H) tubos contendo
microalgas em BOD da Coleção IPR de Microalgas in vivo.

Para certificar da pureza dos isolamentos, após a visua-

lização das primeiras colônias na superfície do meio sólido
procedeu-se a repicagem para outra placa de petri contendo
os respectivos meios de cultura, Destaca-se que estas colônias
apresentavam características típicas de microalgas, por exem-
plo, a presença de clorofila caracterizada pela coloração verde
(Figura 8.3A). A repicagem, ou seja, a transferência das colô-
nias isoladas para novas placas contendo meio sólido, com ou
sem glicose, foi realizada de acordo com a origem do meio de
cultivo do qual a microalga foi isolada.
De maneira geral, as microalgas cresceram melhor em
meios sem adição de glicose, possivelmente porque nestes
meios também foi verificado menor número de contaminantes
como fungos e bactérias (Figura 8.3A). A adição de estrepto-
micina retardou o crescimento das microalgas, mas não impe-
diu seu desenvolvimento, embora a concentração utilizada não
tenha sido suficiente para inibir o crescimento de bactérias.
Contudo, a ciclohexamida além de inibir o crescimento de fun-
gos, também inibiu o crescimento de algumas das estirpes de
microalgas, nos meios nos quais foi adicionada este fungicida
na concentração de 100 μg mL-1. Este resultado leva a conside-
rar o uso da ciclohexamida com cautela, no caso de isolamen-
tos ou mesmo de manutenção de microalgas clonais (Figura
8.3A, B, C e D).
Após em média dez dias foram observados diferentes tipos
de crescimento dos isolados em meio de cultura sólido. Os iso-
lados microbianos apresentaram aspectos de colônias com dife-
rentes colorações, além da formação de bolhas no meio solidi-
ficado com ágar, característico da produção de gases (Figura
8.4).
O isolamento de microalgas em meio sólido apresenta
facilidades para e visualização do aparecimento das primei-
ras colônias, bem como para verificar a presença de contami-
nantes microbianos e, portanto, facilita a obtenção de colô-

nias isoladas. Porém, nem todas as espécies de microalgas são

capazes de se desenvolverem em meio de cultura agarizado,
assim, o procedimento de isolamento em meio líquido foi rea-
lizado também para cada amostra coletada, conforme descrito
a seguir no item 8.2.2.
Figura 8.3. Placas de petri contendo meio de cultura para o isola-

mento de microalgas: (A) meio de cultura sem adição
de fonte de carbono. (B) Meio de cultura com adição
de glicose; (C) meio de cultura com glicose e acrescido
de ciclohexamida; (D) meio de cultura com glicose e
acrescido de estreptomicina, setas indicando o cresci-
mento de microalgas.

Figura 8.4. Aspectos visuais do crescimento dos isolados de microal-

gas em meio de cultura sólido em placa de petri.
8.2.2 Isolamento em meio de cultivo líquido

Para o isolamento em meio de cultura líquido, foi reali-
zado um esquema de diluição em série das amostras, no qual
a cada transferência de alíquota para o próximo tubo, a densi-
dade celular é reduzida em 10X. Inicialmente, foi realizada a
contagem da densidade populacional dos cultivos em câmara
de Neubauer sob microscópio óptico, o que permitiu calcular a
quantidade de diluições decimais necessárias para a obtenção
de um tubo de ensaio com uma célula.
Os tubos com as estirpes isoladas foram mantidos em
estufas nas mesmas condições das placas e, após cerca de três
dias, foi observado o crescimento das culturas. Foram obser-
vados diferentes hábitos dos isolados no crescimento em meio
líquido, desde divisão na coluna de líquido (Figura 8.5A) até
crescimento floculado (Figura 8.5B) e a formação de gases
(Figura 8.5C).

Figura 8.5. Frascos de cultivos mostrando os aspectos do crescimento

de isolados de microalgas em meio líquido: (A) crescimen-
to em divisão na coluna de líquido; (B) crescimento flocu-
lado e (C) cultivo em que ocorre a formação de bolhas de
gases.

Porém, nos cultivos em meio de cultura líquido, diferente

do que ocorre nos cultivos em meio sólido, os contaminan-
tes são de difícil visualização (LOURENÇO, 2006). Assim, para
garantir a pureza dos cultivos, lâminas foram preparadas e
observadas sob microscópio óptico.
Ainda para comprovar a pureza dos cultivos de microalgas,
que visualmente aparentavam sem contaminantes, um novo
crescimento destes foi realizado em meios de cultura específi-
cos para fungos e bactérias. O meio de cultura utilizado para
estimular o crescimento de bactéria foi o de glicose-peptona,
K2HPO4, MgSO4, Fe2(SO4)3.9H2O, água destilada, ciclohexamida
e ágar. Para o crescimento de possíveis fungos foi utilizado o
meio Martim, contendo glicose, peptona, MgSO4, K2PO4, rosa
bengala, água destilada, estreptomicina e ágar. As placas de
petri com isolamentos que não apresentaram crescimento de
fungos ou bactérias nestes meios específicos foram considera-
dos isolados puros de microalgas e foram incluídos na Coleção
IPR.
8.3 Caracterização Morfológica

Para caracterização dos isolados microalgais, foram utili-
zadas as metodologias descritas na literatura (BICUDO; MENE-
ZES, 2006; GUIMARÃES et al., 2009). A caracterização de
cada estirpe de uma coleção de microalgas é etapa essencial e
pode ser realizada com base em métodos morfofisiológicos e/
ou moleculares. A caracterização morfológica das microalgas
isoladas é o primeiro critério utilizado para identificação taxo-
nômica. A caracterização morfológica colonial e celular das
172 estirpes de microalgas foi realizada em vidraria e meios
de cultura esterilizados e as colônias analisadas em câmaras
assépticas evitar contaminações. Para a padronização da idade
das células, as estirpes de microalgas foram inoculadas em
meio de cultura líquido (BBM ou BG11) e mantidas em cresci-

mento sem agitação por 12 dias, em câmara de crescimento a

28 ± 2°C e fotoperíodo de 12 h. Na Figura 8.6 é apresentado
o esquema geral das etapas da caracterização de microalgas.
As estirpes IPR de microalgas foram observadas em relação à
morfologia celular, tipo de talo, tamanho, cor e as informações
estão apresentados no Volume III desta coleção. As característi-
cas de morfologia de colônias em meio agarizado e as de célu-
las das estirpes de microalgas da Coleção IPR são apresentadas
no Volume III desta coleção.
Figura 8.6. Esquema geral de caracterização: (A) celular e (B) de

colônias em meio de cultura sólido das microalgas da
Coleção IPR.

8.3.1 Morfologia de colônias de microalgas em

meio sólido
A morfologia das colônias das estirpes de microalgas, cia-
nobactérias e clorófitas, com capacidade de crescerem em meio
agarizado foi realizada com base nos critérios de caracteriza-
ção de colônias bacterianas, sendo estas características obser-
vadas ao microscópio estereoscópico (aumento de 16X). Este
tipo de caracterização colonial em meio de cultivo sólido não
foi descrito para microalgas, contudo esta análise pode contri-
buir como mais um fator para a diferenciação entre estirpes.
Foram observadas colônias com diâmetro variando de 1 a
2 mm; em formato puntiforme, irregular e circular; com eleva-
ção convexa ou plana; com borda inteira ou denteada, ondu-
lada e irregular; superfície lisa e rugosa, de consistência úmida
e seca; mucosa e não-mucosa, translúcida e opaca e de colora-
ção verde e amarela.
8.3.2 Caracterização morfológica celular

A caracterização celular foi realizada a partir do cultivo de
microalgas em meio BG-11 líquido (pH 7,0), cultivadas entre
5-10 dias, com fotoperíodo de 12 h (lâmpadas Osram 65W luz
fria e 20W luz do dia) e temperatura média de 27°C.
Lâminas das estirpes IPR foram montadas, observadas e
fotografadas ao microscópio óptico (aumento de 100X).
A observação de cada isolado foi realizada sob microscó-
pio, utilizando-se protocolos e chaves para identificar e des-
crever microalgas (BICUDO; MENEZES, 2006; GUIMARÃES;
AMARAL; SANTOS; SANTOS, 2009). As características celu-
lares avaliadas foram: presença ou ausência de núcleo organi-
zado; estrutura do talo (unicelular, colonial ou filamentosa);
forma da célula (circular, oval, cilíndrica, elipse, fusiforme,
etc.); cor e tamanho (μm).
Os formatos predominantes de células das estirpes IPR
foram esféricas, elipsoides, falcadas e algumas fusiformes com

dimensões variando de 1 a 20 μm de comprimento e com lar-

gura de 0,2 a 6 μm. A estrutura de talo predominante foi unice-
lular com ocorrência de talos coloniais e cenobial. Os isolados
com ausência de núcleo, Divisão Cyanophyta, foram aproxima-
damente 30%, enquanto a grande maioria (70%) pertencente
ao grupo Chlorophyta, com presença de núcleo. A diversidade
de talos e formatos celulares observada nos dois grupos é des-
crita na Figura 8.7. Mais detalhes das estirpes da coleção são
apresentados no Volume III desta coleção.
Figura 8.7. Diversidade fenotípica de microalgas isoladas de águas

continentais no estado do Paraná.
Adicionalmente, para manter o material fixado para outras

observações, 50 mL do meio de cultivo foi fixado com For-
malina- álcool- ácido acético (FAA). A escolha do método foi
devido às vantagens deste agente químico, o qual é um bom
fixador, que preserva flagelos. Porém, esta combinação de
compostos químicos não é recomendada para espécimes de
algas calcificadas, tais como Acetabularia. A Coleção IPR de
microalgas não contempla este gênero.

8.3.3 Análise de diversidade morfológica de

colônias e celulares
No início da formação da Coleção IPR, sessenta isolados
de microalgas provenientes de lagoas e pesqueiros foram obti-
dos e caracterizados como dos grupos de procariotos (Divisão
Cyanophyta) e eucariotos (Divisão Chlorophyta). Com base nas
características celulares foi verificado que esses isolados apre-
sentavam uma elevada diversidade. Quarenta e uma amostras
foram identificadas ao nível de gênero. Entre as microalgas
Chlorophytas, 26 isolados foram identificados como Chlorella
sp., sete isolados como Scenedesmus sp. e quatro isolados como
Chlamydomonas sp. Dois isolados de Cyanophyta foram identi-
ficados como pertencentes ao gênero Synechocystis. A diversi-
dade da coleção pode ser observada no dendrograma da Figura
8.8, o qual apresenta o agrupamento das microalgas Chloro-
phytas, de acordo com as análises morfológicas coloniais e
celulares.
Os índices de dominância, de diversidade (Simpson e Shan-
non) e de riqueza (Menhinick e Margalef) foram calculados
de acordo com o número de estirpes presentes em cada grupo
formado com base no polimorfismo do perfil fenotípico. Para o
cálculo, foi utilizado o programa Past versão 2.17c (HAMMER
et al., 2001). Com base nas características fenotípicas foi possí-
vel realizar a análise de agrupamento estirpes IPR de microal-
gas da distancia Euclidiana (Figura 8.9). Os índices de diver-
sidade foram: Shannon= 2,18; Simpson= 0,85; o de riqueza
de Margalef=2,91; equitabilidade=0,85 e Menhinick= 1,65.

Figura 8.8. Dendrograma representando a diversidade fenotípica

de estirpes de microalgas da Coleção IPR (Cyanophyta
e Chlorophyta), isoladas de águas continentais no esta-
do do Paraná. Letra após número da estirpe identifica
a localidade de origem do isolamento. U=Umuarama,
T=Tapejara, L=Londrina.
8.4 Preservação dos Cultivos Unialgais ex situ

A preservação de cultivos unialgais é condição essencial
para a continuidade dos estudos com espécies de microal-

gas. Com base na literatura, alguns testes foram conduzidos

com os isolados da Coleção IPR. Day e Stacey (2008) desta-
caram procedimentos essenciais para a eficácia de depósitos
de material biológico de valor nas Coleções, ou como atual-
mente são denominadas: “Biobancos” ou “Centro de Recursos
Biológicos”. Entre estes procedimentos destacam-se: obtenção
e manutenção de material puro; autenticidade do material, isso
é, a correta identificação de cada estirpe; número de acesso
que inclua a afiliação taxonômica; estabilidade e qualificação
dos dados diretamente relacionados a cada material estocado.
Estes requisitos facilitam a manutenção da qualidade e a acre-
ditação de uma Coleção ou “Biobanco”.
8.4.1 Cultivos de microalgas in vivo

Após o isolamento e sucessivas repicagens para obter estir-
pes unimicroalgais, essas são mantidas em duplicata em tubos
de vidro com rosca com meio sólido (0,9 a 1,0% de ágar) e em
triplicata em tubos contendo meio líquido (Figura 8.9).
Figura 8.9. Imagem da parte interna da câmara de crescimento com

os tubos da Coleção IPR de microalgas. Iluminação de
12 h com lâmpadas de 20W e temperatura de 18 a 20°C.

As estirpes de microalgas identificadas como pertencentes

à Divisão Cyanophyta são mantidas em meio de cultivo BG -11
e as estirpes pertencentes à Divisão Chlorophyta são mantidas
em meio de cultivo BBM.
Conforme a revisão apresentada no capítulo 2 do Volume I
desta obra, a conservação de espécies de microalgas ex situ em
coleção em condições de cultivo requer tempo e pessoal trei-
nado para observação constante. Na manutenção das estirpes
da coleção IPR foram adaptados muitos dos protocolos des-
critos na literatura (LORENZ et al., 2005; LOURENÇO, 2006).
Para evitar o rápido crescimento das microalgas isoladas, os
tubos são mantidos em condições subótimas, em incubadora
com fotoperíodo de 12 h, lâmpadas de 20W, a 18 a 20°C. Estes
são periodicamente observados para verificação de ocorrência
de contaminantes e ou necessidade de repicagem em função
da idade do cultivo. Aqueles com contaminação e/ou com
idades superior a seis meses são submetidos ao processo de
descontaminação por repicagem sucessiva e ou lavagem de
células.
Na inspeção periódica dos tubos da Coleção, a visualiza-
ção de contaminantes nos cultivos implica na repicagem em
placas contendo meio de cultura BBM ou BG-11 agarizado e
recuperação da célula algal original. Em casos de grande con-
taminação do isolado, quando não é possível a recuperação do
cultivo pela obtenção de uma colônia isolada na placa, outras
metodologias envolvendo antimicrobianos/lavagem de células
precisam ser empregadas. Os procedimentos metodológicos
são descritos a seguir:
1. Alíquotas do tubo original são acondicionadas em

microtubos e centrifugadas para a concentração das
células. Estas são lavadas duas vezes com o respec-
tivo meio de cultivo para eliminação de metabólitos
celulares e parte dos microrganismos contaminantes.

Em seguida, as células são ressuspendidas em meio

contendo fungicidas e/ou bactericidas, de acordo com
o contaminante encontrado. Depois de incubadas por
48 h sob condições ótimas de cultivo, as células são
novamente lavadas com meio de cultivo e inoculadas
em placas contendo meio sólido para verificação da
pureza. Colônias isoladas são então transferidas para
tubos contendo meio de cultura específico (BG – 11 ou
BBM), em triplicata.
2. Nos casos em que o uso de um único antimicrobiano
não é suficiente para descontaminação e posterior ob-
tenção de colônias isoladas de microalgas, são neces-
sárias incubações em série, com diferentes antimicro-
bianos e, consequentemente, sucessivas repicagens em
placas com meio de cultivo específico. Assim, como
o tempo de visualização de colônias em meio sólido
é em média de seis dias, a descontaminação de um
único isolado pode durar semanas. Em função disso,
metodologias adicionais de preservação foram testa-
das para uma manutenção menos trabalhosa e mais
eficiente da coleção de microalgas.
A utilização de condições de cultivo subótimas, com tem-

peraturas menores do que 20°C e luminosidade menores do
que 20 μm fótons m-2, não foram suficientes para retardar a
multiplicação celular tanto quanto o desejado. Considerando
as replicatas e backup necessários, o número de isolados da
Coleção IPR, mais de 150 estirpes, a exigência da verificação
semanal de cada um dos tubos e transferências para novos
meios de cultivos, o trabalho para manutenção da coleção é
considerável.
Para aumentar o intervalo de tempo entre as repicagens
de microalgas da Coleção, adicionou-se uma nova variável que
foi diminuir a disponibilidade de nutrientes no meio de cul-

tivo, além de reduzir luminosidade e temperatura. Com este

objetivo, quatro estirpes morfologicamente diferentes: Pseu-
dochlorella pyrenoidosa (IPR-Psep7036), Desmodesmos opolien-
sis (IPR-Deso7045), IPR-7060 e IPR-7007 foram cultivadas em
meio de cultura contendo 25 e 50% dos nutrientes originais
do meio BBM. Ao longo de 90 dias foram determinados o pH,
concentração celular por contagem em câmara de Neubauer e
biomassa seca, este último parâmetro apenas ao final do expe-
rimento.
Para a estirpe IPR 7007, a fase de declínio no desenvolvi-
mento das células começou a ser observada a partir do 45° dia
após a inoculação, mas predominantemente no 60° dia para as
demais estirpes, independente da concentração de nutrientes
no meio de cultivo (Figura 8.10). Maior número de células foi
observado para a estirpe IPR-7060 no meio BBM 25% aos 45
dias.
Figura 8.10. Curvas de desenvolvimento de microalgas estirpes,

IPR-M7007, -7036, -7045 e 7060) cultivadas em três
concentrações de Meio Basal de Bold.

De maneira geral, o pH dos cultivos variou de 6,8 a 9,1,

com maior alcalinização entre 30 e 60 dias após a inoculação,
seguido de retorno do pH entre 7,5 e 8,0 a partir do 75° dia
após a inoculação. Em relação à biomassa obtida nos diferentes
cultivos, a Figura 8.11 mostra que na concentração de 50% de
nutrientes apenas a estirpe IPR-Psep7036 apresentou biomassa
menor que o meio controle (100%).
Figura 8.11. Biomassa de células de microalgas (g L-1) de estirpes

IPR em Meio Basal de Bold com diferentes concentra-
ções de nutrientes após 90 dias de cultivo.
Concluiu-se então que é possível utilizar o meio de cul-

tivo BBM diluído para manutenção de estirpes de microalgas
por longo período de tempo, sem prejuízo na viabilidade das
células. Embora a menor concentração de nutrientes no meio
de cultura não tenha possibilitado a redução do intervalo de
tempo entre as repicagens, possibilita a economia de reagentes
utilizados na manutenção das microalgas da coleção.
A reciclagem de meios de cultura pode ajudar a diminuir
os custos de cultivo, uso de nutrientes valiosos que podem
ainda permanecem no meio após o uso e torná-lo um sistema
de produção sustentável. Todavia, em trabalho recente, Rocha

e colaboradores (ROCHA et al., 2014) relataram os efeitos do

reuso de meios de cultura em até três vezes para crescer Scene-
desmus quadricauda com suplementação ou não de nitrogênio
e fósforo ou com todos os nutrientes da composição do meio.
Os resultados mostraram que todos os nutrientes devem ser
adicionados ao meio, em cada nova inoculação. De acordo com
os resultados apresentados, pelo menos três usos do meio de
cultura podem ser realizados sem afetar a produção de bio-
massa, e a reutilização do meio pode ser tão promissora quanto
a utilização do meio fresco, mas os autores recomendaram cui-
dados especiais na reutilização em aplicações biotecnológicas
para produção de determinados compostos devido alterações
da composição bioquímicas das células de Scenedesmus quadri-
cauda.
8.4.2 Cultivos in vivo por congelamento a

ultrabaixas temperaturas
O processo de manutenção contínua de estirpes unialgais
crescendo ativamente durante longos períodos de tempo é mui-
tas vezes dispendioso e demorado. O congelamento de micror-
ganismos, nas suas diferentes variações, é uma alternativa, pois
permite mantê-los em um estado estacionário de desenvolvi-
mento, possibilitando maiores intervalos entre as replicações
das culturas.
O método de congelamento mais citado na literatura para
preservar microalgas viáveis é o de criopreservação com nitrogê-
nio liquído a ultra-baixas temperaturas (HUBÁLEK, 2003; PONCET
et al., 2003; DAY et al., 2007; ZHANG et al., 2009). Porém este é
também o método mais oneroso, desta maneira, optou-se por testar
métodos de congelamento mais simples com temperaturas de -80°C.
Há vários desafios que afetam a eficácia dos processos de con-
gelamento de microrganismos, destacando-se o congelamento das
estruturas celulares, o que pode levar à lise celular e consequente

perda da viabilidade. Para minimizar este efeito, diferentes protetores

celulares foram extensivamente estudados (HUBÁLEK, 2003; PON-
CET; VÉRON, 2003; DAY; LORENZ; WILDING; FRIEDL; HARDING;
PRASCHOLD; BRENNAN; MÜLLER; SANTOS; SANTOS; OSÓRIO;
AMARAL; LUKEÄOVÃ¡; HROUZEK; LUKEÅ¡; ELSTER; LUKAVSKY;
PROBERT; RYAN; BENSON, 2007; ZHANG; ZHANG; WANG; YANB;
WANG, 2009). Para a criopreservação das estirpes na Coleção IPR
foram adotadas algumas considerações práticas apresentadas para
eucariotos (REED, 2008).
Assim, para facilitar a manutenção da Coleção IPR estabelecida
ao longo do projeto, foram testados o congelamento, com criopro-
tetores a -80°C, e a liofilização. Os testes foram feitos com grupos
representantivos das estirpes de microalgas isoladas. Foram testados
crioprotetores em diferentes concentrações, bem como a preservação
de cultura em diferentes estágios celulares.
Para os testes de preservação, as estirpes de microalgas
clorófitas foram cultivadas em meio de cultura BBM líquido
e sólido (pH 6,8), a 25 ± 2°C e fotoperíodo de 12 h. Os tes-
tes foram realizados com células microalgais em diferentes
fases do desenvolvimento, entre 10 e 18 dias. Para os testes
de congelamento das estirpes da Coleção IPR, a escolha dos
crioprotetores foi com base em diversos resultados para micro-
algas, incluindo cianobactérias e eucariotos (DAY et al., 1999;
TAYLOR et al., 1999; PONCET; VÉRON, 2003; DAY; JOHN et
al., 2007; CHETVERIKOVA, 2012; RASTOLL et al., 2013). Nos
testes com as estirpes IPR, os criopreservantes utilizados foram
Metanol (MeOH) e Dimetilsulfóxido (DMSO), nas concentra-
ções finais de 5% e 10%, em meio de cultura BBM líquido.
Para o teste de liofilização, foi usada suspensão de leite des-
natado 10%, autoclavado. As etapas dos protocolos de pré e
pós-congelamento foram adaptadas da metodologia publicada
no site da Coleção UTEX (http://web.biosci.utexas.edu/utex/
protocols.aspx) e estão descritas na Tabela 8.2.

Tabela 8.2. Protocolos de preservação de células por congelamento

a ultrabaixas temperaturas utilizados.
Etapas da Forma de preservação das células algais

preservação e
recuperação
Cultivo em Suspensão Cultivo em meio
das células Liofilização
meio líquido de colônia sólido inclinado
microalgais
Meio de
cultivo/
período
BBM líquido BBM sólido BBM sólido BBM líquido

30 dias 10 dias 15 dias 10 dias
Concentração
de células
Coleta de
células
Centrifugação e lavagem por

-
com meio centrifugação
e lavagem
com meio.
Leite
Preservante
MeOH e DMSO MeOH e DMSO desnatado

5% e 10% 5% e 10% 10%
Repouso 30 min Repouso 30 min Repouso 30
min.
Congelamento
-20°C/ 18 h e -20°C/ 18 h e -20°C/ 18 h e

-80°C -80°C liofilização
Descongelamento
Gradual até o
Banho-maria a 37°C/ 2
descongelamento
min. e sob leve agitação. -
em banho de gelo
Após 25 dias.
após 70 dias

1. Descarte
de meio com
preservantes e
1. Centrifugação e lavagem adição
com meio fresco; de meio fresco;
2. Repouso por cerca de 3 2. Repouso por 1. Adição
Preparo para h sob penumbra; cerca de 3 h sob de meio nas
Cultivo. 3. Centrifugação e lavagem penumbra; ampolas
com meio fresco; 3. Incubação e contato
4. Adição de meio às a 25 ± 2°C e durante 2 h.
células lavadas. fotoperíodo
de 12 h para
recuperação do
tapete de células.
1.
Transferência
dos “plugs”
de algodão
para placas
1. Inoculação em
1. Inoculação em BBM de petri
BBM sólido;
sólido líquido fresco em contendo
Forma de 2. Incubação
maiores volumes; meio de
cultivo. a 25 ± 2°C e
2. Incubação a 25 ± 2°C e cultura BBM
fotoperíodo de
fotoperíodo de 12 h. sólido;
12 h.
2. Incubação
a 25 ± 2°C e
fotoperíodo
de 12 h por
45 dias.
A percentagem de estirpes IPR recuperadas, após preser-

vação durante 25 dias de congelamento a -80°C é apresentada
na Tabela 8.3.
As células viáveis das quatro estirpes testadas, IPRPse
p-7036; IPR Des o 7045; IPR M 7060; e, IPR 7007 foram recu-
peradas tanto das culturas descongeladas como dos subcultivos
em meio BBM obtidos a partir delas 15 dias após a inocula-
ção (Tabela 8.3). As fotos de cada etapa dos procedimentos

de preservação e recuperação de células algais, submetidas a

congelamento a ultrabaixas temperaturas, são apresentadas na
Figura 8.12.
Tabela 8.3. Porcentagem de recuperação de estirpes de microalgas

da Coleção IPR que foram congeladas/liofilizadas para
preservação.
IPR Pse p IPR Des o IPR M IPR M

Condição
70361 70452 70603 70073
Crioprotetor (%) Crescimento (%)
5 0 0 100 100
MeOH
10 0 0 50 100
Cultivo em
meio líquido
5 0 0 100 100
DMSO
10 0 0 100 100
5 0 100 100 100

MeOH
10 0 100 100 100
Suspensão
de colônia
5 100 100 100 100
DMSO
10 100 100 100 100
5 0 0 50 100
MeOH
10 0 0 100 100
Cultivo em
meio sólido
5 0 33,3 * 100
DMSO
10 0 100 * *
Leite
Liofilização 10 0 66,3 33,3 33,3
desnatado
1
Pseudochlorella pyrenoidosa, 2Desmodesmos opoliensis, 3Não determinado. *Ausência de crescimento
completo do tapete de células antes do congelamento.

Figura 8.12. Representação com fotos das etapas da recuperação de

células microalgais criopreservadas: a) placas de petri
com colônias de microalgas recuperadas de congela-
mento com criopreservantes a partir do tubo descon-
gelado; b) após 15 dias de subcultivo em BBM líquido;
c) microtubos com BBM sólido contendo microalgas na
superfície do meio e cobertos com meio líquido adicio-
nado de criopreservantes; d) ampolas com microalgas
liofilizadas e em contato com meio BBM líquido, para
verificação da viabilidade celular; e) placas de petri
contendo BBM sólido após recuperação das microalgas
liofilizadas.

A recuperação de células viáveis de cada estirpe de microal-

gas preservada por congelamento a partir de tapete de células
coberto com BBM líquido adicionado de criopreservantes foi
possível para três das estirpes testadas (Tabela 8.3).
A recuperação de células viáveis após a liofilização não
foi possível somente para a estirpe IPRPsc7036. Contudo, foi
observado recuperação de cerca de 70% para a estirpe IPR-
Deso7045, indicando que a morfologia e o arranjo estrutural
das células podem influenciar na escolha do processo de pre-
servação.
Foi observado regeneração das células microalgais nos
quatro tratamentos de preservação testados. Maior quantidade
de tubos contendo culturas regeneradas foi constatada para o
isolado IPR M7007. Porém, para a estirpe IPR Pse7036 não
houve regeneração de células em nenhum tratamento. Todos
os crioprotetores testados neste trabalho foram eficazes para
manter a viabilidade das estirpes representativas de gêneros
como Desmodesmus e Pseudochlorella, após diferentes tempos
de congelamento. Até o momento, a preservação usando o
congelamento a -80°C em meio líquido, acrescido de criopre-
servantes na suspensão de células a partir de colônia isolada
mostrou-se mais eficiente.
Os criopreservantes DMSO e MeOH não causaram efeitos
deletérios nas estirpes dos gêneros Desmodesmus e Pseudochlo-
rella, após diferentes tempos de congelamento. Contudo visando
diminuir os riscos de perda dos isolados pelo congelamento, os
métodos devem ser escolhidos de acordo com as características
biológicas de cada isolado ou estirpe de microalga. Dado que
o método de preservação deve ser escolhido de acordo com
características biológicas de cada estirpe, este estudo deve ser
uma rotina em uma coleção de microalgas.
Para aumentar a estabilidade de microalgas, outros trata-
mentos nos cultivos de células podem ser administrados. Nas
estirpes da Coleção IPR não foi testado o tratamento com emul-

sões de água e óleo. Todavia, é um procedimento útil e de

baixo custo (FERNÁNDEZ et al., 2014). Esses autores relataram
também que que a viabilidade das células de C. sorokiniana,
que receberam um tratamento de aclimatação de 24 h, entre
a separação das células do meio de cultivo e a emulsificação,
sobreviveram em média acima de 100 dias a mais do que as
células que não receberam a aclimatação. As emulsões prepa-
radas com C. sorokiniana cresceram em meio contendo 29,7
mM de KNO3, 1,66 mM de MgSO4 7H2O, 0,85 mM de FeSO4 e
2H2O, com densidades de células viáveis mais elevados depois
de 100 dias de armazenamento em comparação com células
cultivadas em meio contendo 9,90 mM de KNO3 e 0,20 mM
MgSO4 7H2O sem FeSO4 2H2O.
8.6 Viabilidade Celular, Uso de Corantes Vitais

e Contagem nas Células Viáveis
Na manutenção da Coleção de Microalgas, a verificação da
viabilidade das células é uma atividade que facilita o estabele-
cimento da época de repicagem dos cultivos. Para determinar
o número de células viáveis/inviáveis nos cultivos de microal-
gas, as contagens de células de microalgas, coradas ou não,
foram realizadas sob microscopia em câmara de Neubauer.
8.6.1 Contagem de células viáveis de microalgas

Para medidas de crescimento microalgal, Lourenço (2006)
descreve em detalhes os diversos métodos de contagem direta
por microscopia, com auxilio de equipamentos contadores
automaticos de particulas entre outros procedimentos alterna-
tivos.
No geral, o método da gota na placa (Drop plate) pode ser
usado para determinar o número de células viáveis de micror-
ganismos em suspensão em um volume conhecido. Com a dis-

tribuição da amostra em gotas, a contagem de colônia pode ser

feito de forma mais rápido e com mais precisão. Algumas téc-
nicas utilizam diluições decimais, outras usam dupla, com pos-
terior espalhamento da amostra diluída em um volume total
de 0,1 mL ou 0,2 mL por placa. Assim para essa metodologia,
Herigstad e colaboradores (2001) determinaram:
i) o desvio padrão da estimativa da densidade bacteria-

na;
ii) o custo de realizar o processo de placa de gota;
iii) o delineamento ótimo da placa de gota;
iv) as vantagens do método da gota em comparação com
o método padrão de espalhamento em placa.
Os autores concluiram que a metologia foi adequada. Nos

diversos experiementos conduzidos com contagem de células
viaveis no projeto Microalgas, optou se pela metodologia de
contagem de células (UFC) e o procedimento de placa de gota
(Drop plate) por economizar material e tempo.
8.6.2 Testes de viabilidade celular de microalgas

com corantes azul metileno
Nos estudos com microrganismos procariontes e eucarion-
tes, a quantificação de células viáveis é uma etapa crítica. Os
métodos desenvolvidos até agora para diferenciar células viá-
veis e não viáveis apresentam limitações importantes, como:
longo tempo de execução, resultados imprecisos e ainda alto
custo.
Determinados corantes agem apenas sobre as células vivas
e este procedimento pode ser utilizado para visualizar e quan-
tificar células viáveis. Os métodos para quantificar células
viáveis com base na redução do corante azul de metileno em
culturas de células têm sido voltados para microrganismos pro-

cariotos. Embora o teste de redução do azul de metileno seja

bastante conhecido para verificar a carga bacteriana no leite,
a sua aplicação na quantificação de células viáveis de forma
mais ampla ainda não tem sido relatada.
O azul de metileno é um corante básico que torna-se inco-
lor na presença de enzimas ativas, ou seja, em células vivas,
que adquirem uma coloração amarelada, podendo ser absor-
vido pelas células mortas ou severamente danificadas, mas não
por células vivas. Contudo, se a célula permanecer azul não
significa que está morta, mas que as enzimas podem estar inati-
vas/desnaturadas (BONORA et al., 1982; SMART et al., 1999).
Estes autores relataram a aplicação de uma metodologia sim-
ples para quantificar células viáveis que permite determinações
quantitativas de células lesadas em populações de microrganis-
mos tais como Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula glutinis e
Euglena gracilis. A porcentagem de células danificadas foi deter-
minada através da medição, a 664 nm, da densidade óptica
da suspensão de células pré-tratadas com 0,15 mM de azul de
metileno, durante 6 min, uma condição que não afeta a inte-
gridade das células, conforme determinado pelo consumo de
oxigênio e de liberação de íons de potássio. Esta técnica é mais
rápida e mais simples do que os métodos clássicos de tintura-
-exclusão e de contagem em placa.
A técnica de observar a viabilidade celular mais ampla-
mente utilizada para células eucariotas consiste em usar o
corante azul de Tripan com assistência da câmara de Neubauer
sob microscópio. Para avaliar a viabilidade celular de euca-
riontes, Guilherme et al. (2007) utilizaram o corante azul de
Tripan, comparando-se com a marcação com aneura v e iodeto
de propídeo, bem como por meio da análise com citometria
de fluxo. Estes autores constataram que não houve diferença
significativa entre os métodos pelo teste não paramétrico de
Mann-Witney (p < 0,05) (GUILHERME et al., 2007). De qual-
quer forma, o cálculo do percentual de células viáveis no tubo

da coleção auxilia na tomada de decisão de qual é a época

apropriada para a repicagem do cultivo para que não ocorra a
perda da estirpe. Na Coleção IPR de microalgas, para verificar
a densidade dos cultivos das estirpes armazenadas in vivo, no
procedimento de contagem foi adotado a metodologia com o
azul de metileno como indicador da viabilidade celular (Figura
8.13).
Figura 8.13. Fotomicrografias de células de microalgas tratadas

com o corante azul de metileno a 1%. Células viáveis
apresentam coloração amarela enquanto as mortas
apresentam coloração azul (indicadas pelas setas).
8.6.3 Medidas de viabilidade e observações

microscópicas
Quando se trabalha com microrganismos, na maioria das
vezes deseja se determinar a concentração de células da sus-
pensão preparada. Uma das formas mais comuns de se obter

esta estimativa é através da contagem ao microscópio, utili-

zando-se uma Câmara de Neubauer, também conhecida como
Hemacitômetro, Câmara de Contagem ou Câmara de Petroff-
-Hausser. No caso das microalgas do projeto a opção foi pela
Câmara de Neubauer de 0,1mm que atende os tamanhos dos
espécimes da Coleção IPR.
A estimativa da viabilidade é uma medida fisiológica. A
integridade da membrana plasmática pode ser utilizada como
um indicador de viabilidade de culturas após criopreservação.
Com base neste conceito, no procedimento metodológico uti-
liza se volumes iguais de cultura de microalgas e corante azul
de Evans em água 0,1% (m/v). Nesta metodologia, a água e o
corante são combinados e deixados em repouso em um tubo
criogênico por 5 min. Posteriormente, uma alíquota desta mis-
tura é transferida para um hemocitômetro (Câmara de Neu-
bauer melhorada), para facilitar a contagem sistemática. A
percentagem de células observadas que retiveram a sua cor
verde original foi calculada e relatado como a porcentagem da
viabilidade da cultura (CRUTCHFIELD et al., 1999). Estes auto-
res relataram ainda a técnica do espalhamento em placas de
petri com meio de cultura com 2% de ágar. Alíquotas de 250
μL de suspensões de culturas de Chlamydomonas sp. com con-
centração de 4x103 células mL-1 foram espalhadas no meio de
cultura. Colônias tornaram-se suficientemente visíveis a olho
nu dentro de 2 semanas após a inoculação. Esse procedimento
metodológico simples é de baixo custo e pode ser aplicado roti-
neiramente na maioria dos laboratórios para a manutenção de
uma Coleção de Microalgas.

8.7 Registro/Depósito das Estirpes para

o Estabelecimento da Coleção IPR
de Microalgas
O processamento das amostras coletadas em águas con-
tinentais do estado do Paraná resultou na obtenção de mais
de 150 estirpes isoladas. Estas passaram a compor a Coleção
de Microalgas do Laboratório de Microbiologia de Solos do
IAPAR. Ao longo do tempo cerca de 9% destes isolados perdeu
a viabilidade, percentual aceitável para coleções de microrga-
nismos, desta maneira, a coleção atualmente conta com apro-
ximadamente 136 estirpes IPR.
Para fins de comparação nos diversos estudos e testes rea-
lizados no Projeto Microalgas, foram adquiridas estirpes da
Coleção de Algas da Universidade do Texas, EUA. As estirpes
adquiridas foram: Botryococcus braunii (UTEX572), Chlorella
protothecoides (UTEXB25), Chlorella minutissima (UTEX2219)
e Neochloris oleabundans (UTEX1185), conhecidas pela capa-
cidade de produção de lipídeos, e Haematococcus pluvialis
(UTEX2505) e Muriellopsis sphaerica (UTEX2920), pela capaci-
dade de produção de pigmentos.
As microalgas isoladas foram inicialmente identificadas
pela sigla (acronomin) IPR- seguido da letra M de microalga,
porque a Coleção foi incluída no Biobanco de microrganismos
de interesse do Agronegócio Biotecnológico do Instituto Agro-
nômico do Paraná, seguido do numeral arábico sequencial ini-
ciando em 7000. Após a identificação taxonômica das estirpes,
foram incluídas as duas letras ou três iniciais do gênero, uma
ou duas para a espécie quando identificada. Concomitante-
mente, as informações referentes a cada estirpe da Coleção IPR
de microalgas foram apresentadas em um catálogo impresso
(Volume III desta coleção) e disponibilizadas online em www.
iapar.br > Coleção IPR de Microalgas.

Os maiores desafios para isolamento de microalgas são
obter estirpes unialgais e manter nestas condições sem conta-
minantes por longos períodos.
A análise da morfologia celular permite identificar e pelo
menos separar estirpes de microalgas pertencentes aos grupos
Cyanophyta e Chlorophyta.
Testes com diferentes antibióticos e concentrações deverão
ser conduzidos como uma prática de rotina, em uma Coleção
de microalgas, considerando que a sensibilidade ou tolerância
é uma característica de cada estirpe e não apenas do gênero e/
ou espécie.
Exame sistemático dos espécimes de uma Coleção in vivo
de microalgas exige alguns pré-requisitos, para viabilizar o
trabalho rotineiro e não perder material genético importante.
Uma destas exigências é a padronização de protocolos para
facilitar a verificação da densidade de células viáveis e sem
danos fisiológicos de estirpes criopreservadas.
A meta no Projeto Microalgas de estabelecer uma coleção
de espécies adaptadas às condições paranaenses foi alcançada.
Algumas dessas estirpes podem ser novas espécies e após des-
crição completa serão disponibilizadas e/ou depositadas em
coleções internacionais.
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CAPÍTULO 9
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
DE MICROALGAS
Diva Souza Andrade

Juscélio Donizete Cardoso
Kelly Campos Guerra Pinheiro de Goes Olivieri
Rafael Bruno Guayato Nomura
Krisle da Silva

Introdução
O nome Microalgas genericamente designa membros de
um grupo diverso de microrganismos (eucariotos e procario-
tos) que realizam a fotossíntese oxigênica e têm ocorrência
generalizada em ambientes aquáticos e, também, em ambiente
terrestre. O recente aumento no interesse pela exploração bio-
tecnológica das microalgas como fonte de matéria prima para
produção de bioenergia decorre de uma série de vantagens,
tais como: o crescimento rápido desses microrganismos, a alta
produtividade de biomassa com acúmulo de lipídeos e a produ-
ção de pigmentos e proteínas de qualidade. Os avanços atuais
nas técnicas moleculares têm permitido caracterizar e iden-
tificar estirpes de microalgas visando selecionar e explorar o
potencial para produção de biocombustíveis, como também na
busca de novos produtos biotecnológicos.
Na caracterização das estirpes de microalgas da Coleção
IPR, a abordagem polifásica foi adotada. Nessa abordagem são
usados não apenas métodos citológicos, mas também técnicas
moleculares, como ferramentas auxiliares na análise genética
dos espécimes. Entre as técnicas moleculares empregadas na
caracterização de microalgas destacam-se amplificações por
reação da polimerase em cadeia (PCR) com iniciadores uni-
versais para os genes ribossomais 16S e 18S rRNA, para regi-
ões repetitivas e conservadas do DNA por BOX-PCR e por
sequenciamento parcial dos genes ribossomais. Essas técnicas
foram utilizadas para determinar a ocorrência e diversidade
de espécies de microalgas isoladas de águas continentais no
estado do Paraná. Assim, a ênfase neste capítulo é discutir os
resultados obtidos com a aplicação de algumas destas meto-
dologias para a caracterização genética de estirpes dos gru-
pos de cianobactérias e o de clorófitas. Índices de diversidade,
calculados com base da análise do perfil de polimorfismo do
PCR-BOX, são apresentados para cada localidade de coleta de
material biológico aquoso utilizado no isolamento das estirpes
de microalgas IPR.

9.1 Caracterização das Estirpes da Coleção

IPR de Microalgas
Após o isolamento e purificação dos isolados unialgais e
análises de morfologia celular da Coleção IPR, procederam-se
aos estudos de caracterização genética e análise da diversi-
dade. Nestes estudos genéticos foram caracterizadas 150 estir-
pes entre procariotos e eucariotos da Coleção de Microalgas,
provenientes de material coletado em lagoas localizadas em
nove municípios do estado do Paraná.
Em relação aos estudos genéticos, as estirpes da Coleção
IPR foram caracterizadas, utilizando-se a técnica de análise do
PCR-BOX, além do sequenciamento de genes ribossomais de 35
destas microalgas. Este capítulo tem por objetivo apresentar os
principais resultados destes estudos básicos sobre as caracterís-
ticas genéticas das estirpes da Coleção de Microalgas IPR.
9.1.1 Análise BOX-PCR para caracterizar estirpes

de microalgas
Os métodos moleculares permitem gerar uma grande
quantidade de informações sobre a identidade genética, diver-
sidade, relações filogenéticas, entre outros. Essas informações
são de fundamental importância para cada microrganismo em
uma Coleção. Com o advento de técnicas de Biologia Molecu-
lar, principalmente a partir da década de 1970, a caracteriza-
ção genotípica passou a ser utilizada nos estudos de caracteri-
zação de microrganismos. Os métodos moleculares permitiram
um grande avanço nos estudos sobre genética e taxonomia dos
microrganismos, incrementando a velocidade de obtenção dos
resultados e o nível de precisão dos dados (VARGAS et al.,
1997; ABOU-SHANAB et al., 2011). Dentre esses métodos, é
possível destacar a amplificação do DNA com iniciadores espe-
cíficos pela técnica de PCR.
No cromossomo bacteriano, são encontradas regiões inter-
gênicas de DNA repetitivo, denominadas BOX, os quais podem

ser REP (Repetitive Extragenic Palindromic) ou ERIC (Enterobac-

terial Repetitive Intergenic Consensus). A região BOX é composta
pelas subunidades A, B e C que quando amplificada, resulta em
padrões com maior quantidade de fragmentos, que pode ser
obtida pela amplificação por PCR utilizando o iniciador BOX-
-A1R (LOUWS et al., 1994; VERSALOVIC et al., 1994). Essa
característica representa um importante marcador molecular.
Portanto, o DNA de cada estirpe de microalga, quando amplifi-
cado com esse iniciador, apresenta um perfil genético distinto.
Este polimorfismo pode ser visto na Figura 9.1.
Figura 9.1. Perfil eletroforético do DNA de microalgas da Coleção

IPR, isoladas de águas continentais de diversas regiões
do Paraná, amplificado pela PCR com o iniciador BOX-
-A1R. Linhas 1 a 34 representam perfil das estirpes IPR-
7001; -7002; -7003; -7004; - 7005; -7006; -7007; -7008;
-7009; -7010; -7175 (12); -7176 (13); -7177 (14); -7019;
-7020; -7021; -7178 (22); -7179 (23); -7033; -7048;
-7053; -7055; -7057; -7187 (59); -7060; -7061; -7062;
-7067, -7068, -7188 (69), -7070, Marcador Molecular 1
Kb Plus DNA Ladder e a microalga Neochloris oleoabun-
dans (UTEX1185).

O dendrograma resulta de uma análise estatística de deter-

minados dados, em que se emprega um método quantitativo
que leva ao agrupamento das estirpes. Os resultados dos per-
fis de bandas amplificados podem ser expressos em forma de
um dendrograma genético, que organiza determinados fatores
e variáveis, facilitando as interpretações. Para o agrupamento
das estirpes de microalgas pertencentes à coleção IPR, foram
utilizados os perfis genéticos obtidos na eletroforese dos produ-
tos amplificados com o iniciador BOX-A1R. Foi utilizado o pro-
grama BioNumerics (Applied Mathematics, Kortrijk, Belgium, v.
4.6), usando o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J)
(SNEATH et al., 1973) e tolerância de 2% para gerar o dendro-
grama do BOX-PCR (Figura 9.2).
Para a análise de agrupamento com base no perfil do PCR-
-BOX das estirpes IPR de microalgas clorófitas e cianobactérias,
uma estirpe de Neochloris oleabundans-(UTEX1185) foi incluída
como referência. Neste grupo de 98 estirpes IPR, isoladas de
águas continentais de nove localidades do Paraná, observa se
grande diversidade genética (Figura 9.2).
No dendrograma foi possível observar a tendência de agru-
pamento das estirpes de acordo com a origem de isolamento,
destaque para as estirpes isoladas de lagoas de Palotina, Tape-
jara, Fernandes Pinheiro, Londrina, Umuarama e Pato Branco,
observadas nos clusters.

Figura 9.2. Dendrograma com base no perfil eletroforético obtido

pela análise de BOX-PCR de microalgas da Coleção IPR,
isoladas de águas continentais no Paraná.

A análise de agrupamento das estirpes de microalgas com

ausência de núcleo organizado (procariotos) resultou na for-
mação de dois grupos. Com a linha de corte em 75% de simi-
laridade, com base no perfil de bandas de cada estirpe gerados
através de BOX-PCR foi observada a formação de quatorze sub-
grupos, todos compostos por menos de duas estirpes (Figura
9.3). Não foi observado nenhum agrupamento com 100% de
similaridade dentro dos grupos, o que representaria isolados
idênticos, mas apenas agrupamentos de estirpes em diferentes
níveis de similaridade, de acordo com a localidade de origem
das amostras (Palotina, Tapejara e Pato Branco, PR).
Essa ferramenta de BOX-PCR possibilitou obter os perfis
genéticos das estirpes de cianobactérias, que podem ser utili-
zados como marcadores para auxiliar na caracterização destas
e monitorar possíveis contaminações na Coleção. Entretanto,
para a identificação correta de um microrganismo devem-se
considerar abordagens complementares, por exemplo, análise
com marcadores quimiotaxonômicos (lipídeos, pigmentos e
ácidos graxos) e fisiológicos, para auxiliarem no agrupamento
de estirpes/isolados que apresentam elevada diversidade mor-
fológica e genotípica.
O resultado do agrupamento das estirpes eucariontes
resultou na formação de quatro agrupamentos, sendo que um
deles se destacou pela elevada quantidade de estirpes (Figura
9.4). Com 75% de similaridade com base no perfil de bandas,
foi observada a formação de quarenta e nove grupos, todos
contendo poucas estirpes. Não foi observado agrupamento
com 100% de similaridade dentro dos agrupamentos. Algu-
mas estirpes foram agrupadas em diferentes níveis de simila-
ridade, de acordo com a localidade de origem do isolamento,
com destaque para as microalgas provenientes de Umuarama
e Tapejara, que apresentaram uma maior similaridade e, por-
tanto, tendência para maior agrupamento. Na caracterização
fenotípica essas estirpes IPR, também se agruparam com base
nas análises morfológicas celular e fisiológicas (SILVA, 2010;
SCHERER et al., 2013).

Figura 9.3. Dendrograma genético do agrupamento das estirpes IPR

categorizadas como cianobactérias e amplificadas pela
técnica de BOX-PCR. Estirpes codificadas com o número
IPR da coleção e o local de origem da amostra.
Trabalhos de caracterização fenotípica são fundamentais

para a classificação de cianobactérias. Rippka et al. (1979)
realizaram um estudo comparativo de 178 estirpes de ciano-
bactérias com material depositado na American Type Culture
Collection (ATCC) e propuseram definições de 22 gêneros, clas-
sificados em cinco seções. Com a utilização de técnicas mole-
culares Bittencourt-Oliveira e Piccin-Santos (2012) propuse-
ram que a identificação de espécies de cianobactérias não deve
ser apenas com o uso de caracteres morfológicos. Isso reforça
a necessidade do uso de análises moleculares como uma fer-
ramenta associada a características morfofisiológicas para a
identificação de espécies de microalgas.

Figura 9.4. Dendrograma construído com base no perfil eletrofo-

rético do DNA das estirpes de microalgas (eucariotos)
da Coleção IPR amplificados pela técnica de BOX-PCR.
Estirpes codificadas pelo número IPR da Coleção e de
acordo com o local de origem da amostra.

Assim como observado para cianobactérias, a análise BOX-

-PCR possibilitou obter os perfis genéticos das estirpes de micro-
algas eucariontes, apresentando a mesma característica de ser
um marcador molecular, podendo ser incluída na caracteriza-
ção polifásica. Técnica similar com iniciadores ERIC e REP foi
utilizada por Rasmussen et al. (1998) em estudos genéticos
com cianobactérias filamentosas dos gêneros Nostoc e isolados
simbiontes da angiosperma Gunnera sp. Os autores concluíram
que o método é adequado como fingerprint para agrupar estir-
pes entre e intraespécies; todavia, devido à presença comum
dessas sequências em muitas bactérias, culturas axênicas são
requeridas para utilizar os iniciadores ERIC e REP.
Entretanto, vale destacar a necessidade de otimizar e
padronizar os procedimentos e variáveis quando se utiliza a
técnica do BOX-PCR, por exemplo, a quantificação do DNA, a
temperatura de anelamento do termociclador, o tempo e volta-
gem de corrida eletroforética e a concentração da agarose no
gel. Para o rastreamento da possível contaminação microbiana
com Escherichia coli em fontes de água, Yang e colaboradores
(2012) sugeriram a otimização do BOX-PCR com diferentes
concentrações de DNA e a adição de albumina de soro bovino
(BSA). Essas são alternativas que podem ser aplicadas na otimi-
zação da técnica de BOX-PCR de coleções de microalgas.
Chakdar e colaboradores (2012) estudaram parâmetros
morfológicos de vinte estirpes de Nostoc. O RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA Multiplex), que consiste na amplifi-
cação do DNA com iniciadores com poucas bases e que ampli-
ficam regiões aleatórias do genoma, produziu perfis de ampli-
ficação reprodutíveis e polimórficos para as estirpes, incluindo
algumas bandas únicas e específicas, úteis para a identifica-
ção de estirpes. Os autores relataram grande heterogeneidade
entre as estirpes de Nostoc, porém, em geral não foram obser-
vados agrupamentos específicos com base na origem geográ-
fica, exceto para algumas estirpes. Observou-se, também, que

os dados morfológicos não correspondem necessariamente aos

dados genéticos na maioria dos casos e a análise de agrupa-
mento com base em RAPD multiplex, isto é, com mais de um
iniciador, mostrou um bom ajuste, revelando o poder discrimi-
natório desta técnica.
Valério e colaboradores (2009) observaram uma associa-
ção altamente congruente entre os agrupamentos em STTR e
LTRR (Short and Tandemely Long Repeated Repetitive Sequences)
e a afiliação taxonômica de 118 isolados, representativos de
três ordens de cianobactérias: Chroococcales, Oscillatoriales
e Nostocales. Os autores ainda sugerem padrões de perfis de
ERIC-PCR para a identificação de cianobactérias e rastreabili-
dade destes microrganismos dentro de um reservatório de água,
indicando o seu potencial para uso como um controle de gestão
da qualidade. No Brasil, a metodologia do BOX-PCR utilizando
o oligonucleotídeo A1R é recomendada para identificar rizó-
bios utilizados como inoculantes no Brasil, conforme Instrução
Normativa 13 do Ministério da Agricultura e Pecuária.
9.1.2 Diversidade genética de estirpes

de microalgas
Os índices de dominância, de diversidade (Simpson e Shan-
non) e de riqueza (Menhinick e Margalef) foram calculados
de acordo com o número de estirpes presentes em cada grupo
formado com base no polimorfismo do perfil eletroforético do
BOX-PCR para cada local de coleta de microalgas. Para o cál-
culo foi utilizado o programa Past versão 2.17c (HAMMER et
al., 2001). Os valores médios dos índices são apresentados na
Tabela 9.1.
Tabela 9.1. Índices de diversidade e riqueza de estirpes da Coleção

de Microalgas IPR.
Índices
N*
Grupos
Margalef
Simpson_1
Menhinick
Shannon_H
Localidades
Dominância
Fisher_alpha
Equitabilidade_J
Tapejara B 4 27 0,5364 0,4636 0,8744 0,7698 0,9102 0,6308 1,298
Menor 2 27 0,3937 0,2606 0,4792 0,3849 0,3034 0,4577 0,4988
Maior 4 27 0,7394 0,6063 1,106 0,7698 0,9102 0,8528 1,298
Pato
A 3 11 0,686 0,314 0,6002 0,9045 0,8341 0,5463 1,359
Branco
Menor 1 11 0,405 0 0 0,3015 0 0 0,2673
Maior 3 11 1 0,595 0,9949 0,9045 0,8341 0,9056 1,359
Palotina A 4 10 0,3 0,7 1,28 1,265 1,303 0,9232 2,471
Menor 2 10 0,26 0,46 0,673 0,6325 0,4343 0,7298 0,7517

365
30/07/2014 09:47:40
366
Maior 4 10 0,54 0,74 1,366 1,265 1,303 0,9912 2,471

Umuarama A 5 17 0,308 0,692 1,365 1,213 1,412 0,8484 2,387
Menor 3 17 0,2318 0,4637 0,8083 0,7276 0,7059 0,6608 1,057
Maior 5 17 0,5363 0,7682 1,53 1,213 1,412 0,9664 2,387
Nova
A 4 12 0,3472 0,6528 1,199 1,155 1,207 0,8648 2,101
América
Menor 2 12 0,2639 0,375 0,5661 0,5774 0,4024 0,65 0,6853

Maior 4 12 0,625 0,7361 1,358 1,155 1,207 0,9808 2,101

N*= número de estirpes de microalgas formado em cada grupo.
30/07/2014 09:47:40
Os maiores índices de Shannon 1,37; 1,53 e 1,358 foram

observados nas localidades de amostragem Palotina, Umua-
rama e Nova América, respectivamente. A equitabilidade
variou de 0,54 na subpopulação de Pato Branco a 0,92 em
Palotina (Tabela 9.1). A relação entre a diversidade genética
(BOX-PCR) com a diversidade citológica não foi alta.
Pela análise de morfologia celular foram observadas gran-
des diferenças com alta diversidade fenotípica em um grupo
de microalgas, cianobactérias e clorófitas desta Coleção IPR
(SILVA, 2010; SCHERER et al., 2013). Valério e colaborado-
res (VALÉRIO; CHAMBEL; PAULINO; FARIA; PEREIRA; TEN-
REIRO, 2009) aplicaram técnicas moleculares em 118 ciano-
bactérias, provenientes na maior parte de reservatórios de
água doce portuguesas. A identificação molecular, em nível de
espécie, foi obtida ou confirmada por posicionamento filoge-
nético utilizando o gene 16S rRNA e o gene rpoC1. Baseado
em número de isolados por agrupamento hierárquico de M13
e ERIC-PCR, os índices de Simpson (D) e Shannon-Wiener (J’)
mostraram uma elevada diversidade dentro de todas as espé-
cies, sendo Planktothrix agardhii com índices de diversidade
mais baixos (D = 0,83, J’ = 0,88) e Aphanizomenon flos-aquae
os mais elevados (D = J ‘= 0,99).
9.2 Agrupamento de Estirpes de Microalgas

pela Técnica PCR-RFLP
Outra possibilidade de agrupamento dos isolados de
microalgas é o emprego da técnica de PCR-RFLP (Restriction
Fragment Lenght Polymorphism) que é baseada na restrição de
um fragmento de DNA por endonucleases. Essa metodologia
tem sido associada a PCR, conhecida como PCR-RFLP, que é
baseada na amplificação de um fragmento específico do DNA e
a sua subsequente restrição com enzimas que clivam esta molé-

cula em sítios específicos de reconhecimento, conhecidos como

sítios de restrição. Essa técnica para detecção de polimorfismo
já vem sendo aplicada para estudos filogenéticos de cianobac-
térias (LU et al., 1997; BOLCH et al., 1999; LYRA et al., 2001;
ITEMAN et al., 2002; BITTENCOURT-OLIVEIRA et al., 2009).
Para testar a eficiência da técnica de PCR-RFLP para
microalgas, um grupo de 16 estirpes de microalgas com pre-
sença de núcleo, da Coleção IPR, foi selecionado com base nas
análises citológicas. Foram utilizados os iniciadores que ampli-
ficam o gene 18S rDNA: 18S-18N1 (5’-ACCTGGTTGATCCTGC-
CAGT-3’) e 18N11R (5’-TGATCCTTCGCAGGTTCAC-3’) (SHAO
et al., 2002). Os produtos de PCR obtidos foram digeridos com
a endonuclease de restrição MspI (= Hpall) (5 ‘- C/CGG-3’) e
o perfil de polimorfismo de cada estirpe pode ser visualizado
na Figura 9.5.
Figura 9.5. Perfil de restrição do gene 18S rDNA de 16 microalgas

da coleção pela enzima Msp I, gel de agarose 2%. M
=marcador -1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen™). Li-
nha 1 = IPR-7002; 2=-7002; 4=-7004; 6=-7006; 7=
-7007.

Com base na técnica de PCR-RFLP do gene 18S rRNA, essas

16 estirpes de microalgas da Coleção IPR foram agrupadas
em três grupos principais e cinco subgrupos (Figura 9.6). Seis
estirpes apresentaram 100% de similaridade, distribuídos aos
pares em três grupos distintos. A estirpe IPRM 7002 separou-se
das demais. Cabe salientar que tanto o 16S, quanto o 18S rDNA
permite o agrupamento das microalgas em nível de gênero ou,
no máximo, espécie, enquanto o BOX-PCR e o RAPD fornecem
uma identificação individual de cada isolado.
Figura 9.6. Representação gráfica da análise de agrupamento das

estirpes de microalgas com base no perfil eletroforético
do produto amplificado do 18S rDNA (PCR-RFLP) di-
gerido com a enzima de restrição MspI. Dendrograma
genético gerado no BioNumerics, com coeficiente de
Jaccard e algoritmo UPGMA, 1% de tolerância.

LYRA et al. (1997) estudaram estirpes tóxicas e não tóxicas

de cianobactérias filamentosas, de diferentes gêneros. Nesse
estudo, as cianobactérias foram caracterizadas por perfil de
proteínas SDS-PAGE de células inteiras e de PCR/RFLP do gene
16S rRNA. O RFLP do gene 16S rRNA com estirpes de referên-
cia mostrou ser um bom método para a taxonomia de ciano-
bactérias, separando estirpes sem heterocistos das estirpes com
heterocistos, que são as fixadoras de nitrogênio.
Em busca de marcadores moleculares universais, pesqui-
sadores demonstraram a utilidade do RNA ribossomal, especi-
ficamente da subunidade menor do ribossomo de procariotos
e eucariotos. Os principais motivos dessa escolha se devem ao
fato de que estes genes são encontrados em todos os organismos
vivos, uma vez que a síntese de proteínas ribossomais é essen-
cial. Além disso, estes genes expressam estruturas secundárias
altamente conservadas, que são consideradas para o alinha-
mento correto das sequências destes genes. São componentes
principais da estrutura dos ribossomos e, portanto, abundantes
nas células, facilitando a sua identificação. Posições diferen-
tes das sequências nesses genes evoluíram em taxas diferen-
tes, permitindo que análises filogenéticas fossem realizadas em
vários níveis de resolução taxonômica (WOESE et al., 1977;
WOESE et al., 1990).
JAANA LEHTIMA$KI et al. (2000) utilizaram uma abor-
dagem polifásica para caracterizar estirpes de Nodularia,
incluindo RFLP de genes 16S rRNA amplificados por PCR,
sequenciamento de 16S rRNA, Southern blotting do DNA total,
REP- e ERIC-PCR, ribotipagem e testes fenotípicos. Os grupos
genéticos foram apoiados por uma propriedade fenotípica, a
capacidade de produzir nodularina. Em contraste, os tamanhos
de célula das estirpes não foram diferentes nos dois grupos
genéticos. Sequências do gene 16S rRNA indicaram que todas
as estirpes de Nodularia estavam fortemente relacionadas, ape-
sar de suas diferentes origens.

9.3 Análise de Genes Específicos

Genes codificados em cloroplastos (matK e rbcL) foram
propostos para a identificação de embriófitas em sistemas de
identificação microgenômica, denominada de DNA barcoding.
Estender tal protocolo para Clorófitas, no entanto, reflete pro-
blemas, incluindo a não homologia (matK) e heterogeneidade
que impede a criação de um kit de ferramentas universal de
PCR (rbcL). Alguns autores têm defendido o uso do espaçador
interno transcrito dois (ITS2) como uma alternativa para os
marcadores de cloroplasto tradicionais. No entanto, o ITS2 é
amplamente visto como sendo insuficientemente conservado,
ou por ser confundido com introgressão ou com padrões de
herança biparentais, impossibilitando o seu amplo uso na
reconstrução filogenética, ou como um código de barras de
DNA (BUCHHEIM et al., 2012).
Um crescente corpo de evidências tem mostrado que a
análise simultânea de dados de nucleotídeos com as informa-
ções da estrutura secundária pode superar pelo menos algumas
das limitações do ITS2 (BUCHHEIM et al., 2011). Os resultados
das análises dos dados ITS2 foram robustos em vários nós e
mostraram uma congruência considerável com os resultados
de análises filogenéticas publicados, que sugeriram as sequên-
cias de análises de ITS2 para reconstruir filogenias em nível
filo das microalgas verdes e validaram esta abordagem para
avaliar a diversidade de grandes conjuntos do táxon Clorófita.
Além disso, os resultados indicam que as objeções ao uso de
ITS2 como DNA barcoding devem ser pesadas contra a utilidade
de uma abordagem de análise de dados automatizados, com
o poder demonstrado para reconstruir padrões evolutivos de
linhagens altamente divergentes.
Para complementar o exame morfológico da Thalassiosira
weissflogii, uma diatomácea, Snapin e colaboradores (2011)
utilizaram iniciadores específicos para genes de DNA ribosso-
mal (3’ do rDNA 18S e 5’ de 28S rDNA, ITS1-FD/ITS1-RD),

abrangendo dois espaçadores internos transcritos. O resultado

do nested-PCR obtido com iniciadores 18SF/28SR1 revelou
especificidade na detecção, distinguindo T. weissflogii de T.
pseudonana, Cyclotella meneghiniana e Chaetoceros sp.
Buchheim e colaboradores (2012) relataram que existe
diversidade molecular nas cinco ordens (Chlamydomonada-
les, Sphaeropleales, Chaetephorales, Chaetopeltidales e Oedo-
goniates) e observaram ainda que há evidências de que pelo
menos duas linhagens adicionais devem existir dentro da classe
Chlorophyceae.
DALL’AGNOL et al., (2012) analisaram a diversidade e a
filogenia do grupo Synechococcus, presente no reservatório da
Estação Hidrelétrica de Tucuruí (HPS), no leste da Amazônia
brasileira, por meio da amplificação de três loci diferentes:
o gene rpoC1, o 16S-23S rRNA espaçador transcrito interno
(ITS) e o operon cpcBA-IGS, comparando-os com o gene de 16S
rRNA. Os autores observaram seis grupos de Synechococcus no
reservatório e concluíram que as sequências ITS são análises
complementares e úteis em estudos de diversidade desse grupo
de cianobactérias. Os genes do operon cpcBA têm um bom sinal
filogenético e resolução ao longo de vários níveis taxonômicos,
permitindo a correlação entre a sequência e a pigmentação
fisiológica.
Para estudos de filogenia e taxonomia de microalgas, Buch-
heim e colaboradores (2012) recomendaram utilizar o ITS2.
Estudos dos genes ITS2 e 18S rRNA de estirpes de microalgas
resultou na descrição de um novo gênero, Jenufa, representado
por duas espécies distintas em uma nova linhagem da classe
Chlorophyceae. Pelas análises de sequências ambientais publi-
cadas anteriormente, uma provável terceira espécie do gênero
Jenufa existe em comunidades endolíticas nos Alpes, com
isso os autores sugeriram que Jenufa não é restrito às regiões
tropicais (NEMCOVA et al., 2011).

9.4 Sequenciamento dos Genes 16S e 18S RNA

das Microalgas
Os genes ribossomais (16S e 18S), foram utilizados para
formar uma árvore filogenética universal, onde os organismos
foram agrupados nos domínios Bacteria, Archaea e Eukarya.
Houve, então, a criação de um banco público onde se pode
depositar e consultar sequências de DNA. Com isso, pode-se
identificar rapidamente um microrganismo pela sequência do
seu gene ribossomal 16S ou 18S. Quando a similaridade entre
a nova sequência e a estirpe tipo depositada é superior a 97%,
indica que são pertencentes à mesma espécie (GEVERS et al.,
2005).
Tendo em vista as aplicações do sequenciamento parcial
dos genes ribossomais, foi feito um estudo com um grupo de 45
estirpes de microalgas da Coleção IPR, caracterizadas morfolo-
gicamente. Inicialmente, foi realizada a extração do DNA genô-
mico e a amplificação com iniciadores universais da região do
DNA que codifica o gene 16S rDNA, como os iniciadores fD1
(5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) e rD1 (5’-AAGGAGGT-
GATCCAGCC-3’), descritos por Weisburg et al. (1991). Tam-
bém foi amplificado o gene 18S rDNA, utilizando-se os ini-
ciadores 18S-18N1 (5’-ACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’) e
18N11R (5’-TGATCCTTCGCAGGTTCAC-3’), descrito por Shao
et al. (2002). Esse procedimento permitiu confirmar as estirpes
de microalgas pertencentes à cianobactérias (procariotos) ou
clorófitas (eucariotos), conforme fragmento amplificado visua-
lizado no gel de agarose apresentado na Figura 9.7.
A amplificação do gene 16S rDNA de cianobactérias com
os iniciadores universais fD1 e rD1 apresentou um fragmento
de aproximadamente 1.600 pares de bases para cada isolado.
No entanto, a amplificação do gene 18S rDNA de clorófitas
com os iniciadores universais 18S-18N1 e 18NR11 apresentou
fragmentos com tamanho aproximado que variou de 1.800 a

2.000 pares de bases (Figura 9.7). Como os ribossomos pro-

carióticos e eucarióticos possuem números de pares de bases
distintos, foi possível separar esse dois grupos de microalgas
utilizando os iniciadores universais.
Figura 9.7. Produtos de PCR amplificados com os iniciadores univer-

sais fD1 e rD1; 18-18N1 e 18NR11, em gel de agarose
1%, dos genes ribossomais de estirpes de microalgas.
M =marcador 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen™),
N-controle negativo.
No IAPAR, o sequenciamento parcial de genes ribossomais

da região do 16S permitiu identificar três estirpes de cianobac-
térias em nível de gênero (Figura 9.8).
Neste pequeno grupo de três cianobactérias, foi observado
que existe diversidade genotípica entre as estirpes da Coleção
IPR de águas continentais, águas residuais industriais e lagoas
da pesca. Na árvore filogenética, ocorreu o agrupamento das
estirpes IPRM (7061 e 7062) com Synechocystis e a estirpe
IPRM (7070) com Leptolyngbya (Figura 9.8).

Figura 9.8. Árvore filogenética baseada nas sequências parciais do

16S rDNA, de estirpes de cianobactérias isoladas de
águas continentais no Paraná. A árvore foi obtida pelo
método do “neighbor-joining” com 1000 repetições, ali-
nhamento de 809 bases. Out-group sequência do gene
18S rRNA de Chlorella vulgaris AG-35_ZF1.
Galhano et al. (2011) obtiveram informações moleculares

sobre o gene 16S rRNA e os genes hetR e nifH de cianobactérias
filamentosas isoladas de ecossistemas de água doce em Portu-
gal, um lago raso eutrófico e de campos de arroz. Os autores
utilizaram abordagens genéticas, morfológicas e bioquímicas
para a caracterização de estirpes. Eles confirmaram a identi-
ficação de isolados como Aphanizomenon gracili com 99% de
similaridade, Anabaena flosaquae (99%) e Nostoc sp. (98%).
Já os fragmentos dos gene hetR com aproximadamente 450
pb apresentaram similaridade com Aphanizomenon sp. TR183
(97%), Anabaena flosaquae SAG 30.98 (98%) e Nostoc PCC
7906 (100%). Nos estudos de BERRENDERO et al., (2011), a
análise filogenética a partir de sequências do gene 16S rRNA
de cianobactérias Calothrix e Tolypothrix foi congruente com
a caracterização fenotípica. Estas cianobactérias apresentam
heterocistos e foram isoladas de amostras ambientais. Observa-
-se que os morfotipos Tolypothrix e Calothrix foram claramente
separados.
Estudos moleculares de amostras de zonas afóticas indi-
caram a presença de linhagens filogeneticamente classificadas

como membros de cianobactérias. Com base na recuperação

de genomas de populações de intestino humano, de amostras
subterrâneas e de biorreatores, uma dessas linhagens, Melaina-
bacteria, foi proposta como uma classe filogeneticamente defi-
nida. A proposição foi feita com base em traços de monofilia
dos ancestrais e compartilhamento robusto com representantes
fotossintéticos. Os dados estão de acordo com a teoria que a
fotossíntese nas Cianobactérias envolveu extensa transferên-
cia lateral de genes e estende a funcionalidade reconhecida a
membros deste filo (SOO et al., 2014).
9.4 Ocorrência de Gêneros de Microalgas em

Águas Continentais do Paraná
A ocorrência dos diversos gêneros de microalgas no grupo
de estirpes isoladas em diversas localidades do Paraná foi ana-
lisada por sequenciamento parcial do gene 18S rRNA. Neste
estudo foram utilizadas 32 estirpes de microalgas pertencentes
à Coleção de Microrganismos do Laboratório de Microbiologia
do Solo do IAPAR, Londrina, PR.
Após a extração do DNA genômico de cada estirpe, foram
realizadas amplificações do DNA utilizando os iniciadores
18S-18N1 e 18N11R. Os produtos de PCR foram purificados
e sequenciados em sequenciador capilar, utilizando apenas o
iniciador 18N1. As sequências foram avaliadas no programa
BioEdit Version 2.2 e alinhadas com o algoritmo ClustalX. As
sequências obtidas apresentaram tamanho variável entre 471
pb e 679 pb. Para a identificação das espécies, as sequências
foram comparadas com sequências depositadas no banco de
dados público NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Os resul-
tados mostraram a ocorrência das espécies Ankistrodesmus
bibraianus, Chlamydomonas moewusii, Chlorella sorokiniana,
Chlorococcum sp., Monoraphidium sp., Gonium multicoccum,

Ankistrodesmus falcatus, Neodesmus sp., Scenedesmus pupuken-

sis e Characium saccatum. Das 32 estirpes, 16 foram identifica-
das como Chlorella sorokiniana e seis como Monoraphidium sp.,
representando 68% de todas as estirpes analisadas.
9.5 Sequenciamento de Microalgas

A análise de sequenciamento das microalgas do grupo dos
eucariotos mostrou que pelo menos nove gêneros de microal-
gas ocorrem nas amostras coletadas de águas em diferentes
localidades no Paraná (Figura 9.9).
Figura 9.9. Proporção de gêneros de microalgas do grupo dos euca-

riotos e prováveis espécies encontradas entre as amos-
tras coletadas de águas em diferentes localidades no
Paraná.
Na Figura 9.10 podem ser visualizados os resultados da

análise filogenética de 32 estirpes de microalgas da Coleção
IPR. A árvore foi construída baseada nos resultados obtidos
pela submissão das sequências do gene 18S rRNA no banco de
dados de sequências, GenBank (NCBI), com auxilio do Software
MEGA, versão 5.2 (TAMURA et al., 2011).

Figura 9.10. Árvore filogenética da máxima-parsimônia construída

com as sequências parciais do gene 18S rRNA (610 bp)
de estirpes da Coleção IPR de microalgas (sequências
com número acesso/GenBank).
Glycine max, sequência gi|18729, foi utilizada como grupo

externo (outgroup). Percentagens de 1.000 repetições (boots-
traps) são indicadas próximas aos nós (apenas valores superiores
a 50% são mostrados), de acordo com o algoritmo Neighbour-
-Joining (NJ) e máxima-parsimônia/posterior probabilidade. A
barra de escala representa o número de nucleotídeos modifica-
dos por sítio.
A análise do agrupamento possibilitou a proposta de clas-
sificação em nível de gênero e, para algumas estirpes, fortes

indicações de espécie. As 16 estirpes foram agrupadas em

cinco grupos filogenéticos. O primeiro grupo reuniu a maioria
das estirpes sequenciadas (-7023, -7032, -7033, -7034, -7035,
-7040, -7042, -7049, -7071, -7179, -7181, -7182, -7186, -7187,
-7188, -7192) com o gênero Chlorella com bootstraps variando
de 66 a 99% de similaridade. O grupo dois agrupou as estirpes
-7176 com Ankistrodesmus falcatus com bootstrap de 63%. O
grupo três reuniu as estirpes -7047, -7056, -7185, -7189, -7190
e -7191 com o gênero Monoraphidium sp. com bootstrap de 89%.
No grupo quatro, duas estirpes (IPRM-7043, -7044) agruparam
com os gêneros Chlamydomonas e a -7183 com Gonium sp., com
suporte bootstrap de 83%. No quinto grupo foram agrupadas a
estirpe 7068 com Characium saccatum, as estirpes 7180 e 7184
com Chlorococcum sp., 7177 com o gênero Neodesmus danuali-
bis e 7055 com Scenedesmus pupukensis.
As pesquisas com o objetivo de identificar estirpes nativas
têm ganho destaque. Um exemplo foi o trabalho de Zhang e
colaboradores (2014), que selecionaram estirpes de microalgas
pela elevada produção de biomassa e teor de lipídeos. Estas
foram identificadas como Tetranephris brasiliensis DL12, Ankis-
trodesmus sp. CJ02, A. gracilis DL25, A. gracilis CJ09, Desmodes-
mus subspicatus WC01, Chlorella vulgaris CJ15, Desmodesmus sp.
WC08, Chlorella sorokiniana XS04 com base na morfologia e na
análise das sequências do 18S rDNA.
9.6 Sequenciamento do Genoma

de Microalgas
Em 2005, uma nova tecnologia referida como “sequencia-
mento de nova geração (NGS)” começou a ser utilizada em
análises genéticas, o que permitiu a determinação de milhares
de sequências de DNA em um único processo, com custo rela-
tivamente reduzido. Muitas plataformas de sequenciamento

foram lançadas e se baseiam em métodos diferentes de sequen-

ciamento:
• o 454 Genome Sequencer (http://www.454.com);

• Illumina Genome Analyser;
• HiSeq e MiSeq (http://www.illumina.com);
• SOLiDTM Genome Sequencer (http://www.lifetechno-
logies.com);
• Ion Personal Genome Machine (PGM);
• Ion Proton (http://www.lifetechnologies.com/us/en/
home/brands/ion-torrent.html).
Essas plataformas NGS fornecem leituras curtas (50-700

pares de bases), mas geram uma quantidade expressiva de
dados. Esses avanços em equipamentos têm levado ao cresci-
mento acelerado das publicações de microalgas nesta área de
pesquisa.
Devido a sua proximidade filogenética com as plantas
terrestres, a microalga clorófita Chlamydomonas reinhardtii
foi escolhida como modelo entre os organismos fotossintéti-
cos (CADORET et al., 2012). O sequenciamento do genoma
nuclear de C. reinhardtii foi concluído em 2007 (MERCHANT et
al., 2007; CADORET; GARNIER; SAINT-JEAN, 2012).
O desenvolvimento simultâneo da biologia de sistemas e
ferramentas genéticas tem resultado nos avanços de diversas
linhas, incluindo os estudos de proteômica que têm uma contri-
buição importante em pesquisas nas áreas da fotossíntese, bio-
logia molecular e evolução das algas (ROLLAND et al., 2009).
Foram conduzidos, por exemplo, estudos de adaptação das
microalgas às alterações ambientais, de temperaturas (MÜH-
LHAUS et al., 2011), à presença de metais pesados, utilizando
a estratégia de análises proteômicas - MALDI-TOF com uma
estirpe acidófila de Chlamydomonas sp., isolada do rio Tinto
na Espanha (CID et al., 2010), bem como em um estudo para

entender o envolvimento no metabolismo de lipídeo da Chla-

mydomonas reinhardtii (NGUYEN et al., 2011).
Estudos de proteômica visando determinar a rota biossin-
tética do triacilglicerol na microalga oleaginosa Chlorella vul-
garis, ainda não sequenciada, indicaram regulação positiva dos
ácidos graxos e triglicerídeos, demonstrando a utilidade de um
transcriptoma montado como um modelo de pesquisa para a
análise proteômica de uma microalga, sem sequenciamento do
genoma (GUARNIERI et al., 2011).
O conteúdo genético de microalgas está começando a ser
explorado. Genomas de microalgas podem ser estruturalmente
complexos e os tamanhos variam de 12,6 Mbp para a clorófita
Ostreococcus tauri a 168 Mbp para Emiliania huxleyi até uma
estimativa de 10.000 Mbp para Karenia brevis. Considerando
as dificuldades de um sequenciamento completo, devido ao
grande tamanho dos genomas, o uso de sequenciamento do
transcriptoma para construção de catálogos de genes tem sido
recomendado (CADORET; GARNIER; SAINT-JEAN, 2012).
A microalga Botryococcus braunii (Chlorophyta, Botryococ-
caceae) possui três linhagens (A, B e L) classificadas de acordo
com os tipos de hidrocarbonetos líquidos que produzem. A
análise de citometria de fluxo de duas estirpes, linhagens A e
L, indicou dois tamanhos de genoma, de 166,0 ± 0,4 Mb para
a estirpe da linhagem A, enquanto o da linhagem L apresen-
tou um tamanho superior, com 211,3 ± 1,7 Mb (WEISS et al.,
2010). Os autores ainda sugerem que, de acordo com a aná-
lise filogenética, a relação da evolução entre as duas linhagens
de B. braunii correlaciona se com os tipos de hidrocarbonetos
líquido que elas produzem.
Assim, as tecnologias de sequenciamento de nova geração
de genomas, possibilitam grandes avanços sobre a taxonomia,
filogenia e história evolutiva dos eucariotos fotossintéticos
(KIM et al., 2014).
Através de caracterizações prévias, a microalga identifi-

cada como Chlorella sorokiniana (IPR-Chls7107), isolada em

água doce no Paraná teve seu DNA total extraído e submetido
ao sequenciamento no Ion Torrent. Com base no sequencia-
mento do genoma da estirpe IPR-Chls7107, nas Figuras 9.11 a
9.13 são apresentadas os resultados das análises preliminares.
Na Figura 9.11 pode se observar que os fragmentos sequen-
ciados apresentam sua maior concentração em torno de 200
pb. O genoma com os contigs montados e anotados será subme-
tido ao GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
Figura 9.11. Distribuição dos tamanhos dos fragmentos do genoma

da estirpe de microalga IPR-Chls7107.
É interessante verificar que o quality score obtido com o

sequenciamento do genoma completo da estirpe de micro-
alga foi adequado, mostrando a qualidade excelente das bases
mesmo nos fragmentos mais longos (Figura 9.11).
O conteúdo de guanina (G) e citosina (C) que compõem
o genoma da microalga IPR Chls7107 está representado na
Figura 9.12.

Figura 9.12. Distribuição em porcentagem das bases guanina e ci-

tosina (GC) na sequência do genoma da estirpe de
microalga IPR-Chls7107.
Figura 9.13. Qualidade das sequências da estirpe IPR Chls7107 no

“Phred Score”.

A porcentagem de GC está dentro do teórico (distribuição

esperada), porém, observa-se um pico com uma quantidade em
torno de 51%, indicando que pode haver mais de um genoma
(Figura 9.12). Outra possibilidade é a grande quantidade de
genoma do Chloroplasto. Entretanto, no caso de eucarioto
o genoma possui sequências repetitivas que serão objeto de
estudo.
O quality score dos reads foi adequado, ficando a “MODA”,
que representa a qualidade dos reads e mede a qualidade das
sequências em torno de 30 (Figura 9.13). Valores acima de
20 são considerados bons. As próximas atividades, depois dos
contigs já montados com as sequências utilizando os programas
Velvet e MIRA3 será realizar a anotação no programa Artemis.
O processo de anotação consistirá em quatro passos:
1. Predição das ORFs (Open Read Frames), identificar as

sequências que codificam as proteínas;
2. Comparar as sequências contra bancos biológicos;
3. Comparar os resultado de cada ORF contra os ban-
cos, verificar a similaridade com sequências que já es-
tão depositadas ou publicadas e atribuir a função que
cada ORF que está sendo anotada;
4. Submeter todas as ORFs anotadas e a sequência do
genoma completo para o NCBI.
5. Após a anotação das sequências do genoma da estirpe
IPR-Chls7107, e com os dados da literatura, procederá
à publicação dos dados.
O sequenciamento completo de um genoma fornece exten-

sas informações sobre a evolução das espécies, ajuda a iden-
tificar as vias metabólicas e genes específicos e esclarecer
processos envolvidos nos ciclos de ferro, cálcio, sílica, ureia
e nitrogênio. Além disso, dados das sequências fornecem refe-
rências essenciais para combinar com as investigações pós-
-genômica, incluindo análises de transcriptoma e proteoma

(CADORET; GARNIER; SAINT-JEAN, 2012).

A filogenia do genoma plastídeo da Chlorella (ArM0029B)
revelou uma estreita relação entre Chlorella, Parachlorella e
Oocystis dentro de Chlorellales. Análises filogenómica mito-
condriais, no entanto, indicaram que ArM0029B mostra uma
maior afinidade para MX-AZ01 e Coccomyxa do que com o
grupo Helicosporidium-Prototheca, embora as relações filogené-
ticas detalhadas entre os três taxa ainda precisem ser escla-
recidas. Os autores concluiram que o genoma dos plastos de
ArM0029B é semelhante ao de C. variabilis. A filogenia do
genoma de Chloroplasto suporta a monofilia dos sete membros
investigados de Chlorellales. A presença do intron cox1 a 721
em todos os quatro taxa Chlorellales investigados indica que o
intron cox1 tinha sido inicialmente introduzido em Chorella-
les como uma forma cis-splicing e que o cis-splicing do intron
foi herdado em Chlorellales e foi recentemente introduzido por
trans-splicing em Helicosporidium (JEONG et al., 2014).
Para melhor entendimento dos processos metabólicos de
Nannochloropsis salina, a análise pangenômica comparativa do
cloroplasto e genomas mitocondriais de Nannochloropsis salina
CCMP1776 foi realizada. O cloroplasto e genomas mitocondriais
de N. salina são 98,4% e 97% idênticos aos seus homólogos
na Nannochloropsis gaditana, respectivamente Comparação da
pangenoma de Nannochloropsis para outras algas dentro e fora
do mesmo filo revelou regiões de divergência genética signi-
ficativa nos genes-chave que codificam proteínas necessárias
para a regulação da síntese de cadeia ramificada amino (sin-
tase acetohidroxiácido), fixação de carbono (RuBisCO ativase),
conservação de energia (ATP sintetase), a síntese de proteínas
e homeostase (CLP protease, ribossomo). Os autores concluí-
ram que muitas modificações genéticas organelares em Nanno-
chloropsis são únicas. A semelhança excepcional dos genomas
organelares da N. salina e N. gaditana sugere que N. gaditana
pode ser reclassificada como uma linhagem de N. salina (STA-
RKENBURG et al., 2014).

É de conhecimento geral que, nos ambientes aquáticos e
terrestres, existe grande diversidade de microrganismos, muitos
desses de interesse biotecnológico, como por exemplo, as
microalgas. No entanto o potencial biotecnológico só pode ser
explorado com o conhecimento da máxima capacidade destes
microrganismos. Para isso, é importante realizar o isolamento
e estabelecer uma Coleção ex situ e manter in vivo esses espé-
cimes para ter acesso a essa diversidade. Nesse contexto, o uso
da abordagem polifásica é fundamental para a identificação
taxonômica de microalgas de uma Coleção e, consequente-
mente, para a elucidação da diversidade.
Considerando o apresentado nesse capitulo, o perfil eletro-
forético da análise do BOX-PCR permitiu caracterizar as micro-
algas e, por meio de dendrogramas genéticos, foi possível rea-
lizar o agrupamento pela similaridade. Esta técnica também
mostrou que existe grande diversidade genética de estirpes de
microalgas em lagoas no estado do Paraná. Já com o sequen-
ciamento, de genes ribossomais, foi possível realizar as identi-
ficações de gêneros e até de espécies das microalgas. As novas
tecnologias de sequenciamento e os avanços da bioinformática,
permitiram a geração e montagens de novos genomas. Com as
informações contidas nessas sequências, aliadas a estudos fisio-
lógicos e bioquímicos, será possível maximizar a exploração da
capacidade biotecnológica desses microrganismos.
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PARTE 4
MICROALGAS: COPRODUTOS
DA BIOMASSA E POTENCIAL
USO COMO BIOFERTILIZANTES

CAPÍTULO 10
PRODUÇÃO DE LIPÍDEOS PELAS

MICROALGAS DA COLEÇÃO IPR
Diva Souza Andrade

Maria Aparecida de Matos
Fernanda de Almeida Fin de Lima

Introdução
O elevado consumo mundial de energia oriunda principal-
mente da queima de combustíveis fósseis representa grandes
riscos à sobrevivência humana, devido não apenas ao esgo-
tamento das reservas mundiais de petróleo, mas, também aos
conflitos geopolíticos por recursos cada vez mais escassos.
Aliado a estes problemas surge o risco das mudanças climáti-
cas em todo o globo com o aumento da concentração de CO2 na
atmosfera devido à queima de combustíveis fósseis. Segundo
Ritmann (2008), a necessidade de redução da dependência de
uso de combustíveis derivados do petróleo bem como o inte-
resse em desenvolver ferramentas que apoiem a redução do
aquecimento global fez aumentar o interesse na produção de
biocombustíveis obtidos a partir de microalgas.
A determinação da biomassa, com os resultados expres-
sos em massa seca ou úmida, é um dos métodos de avaliar o
desenvolvimento de microalgas. Essa abordagem consiste em
recolher alíquotas dos cultivos, concentrar células por centri-
fugação, filtração ou floculação e assim obter a biomassa. O
método mais adequado para secagem, no caso de determina-
ção da biomassa seca é a liofilização, pois preserva as carac-
terísticas químicas das microalgas. Além de ser um parâmetro
para avaliar o crescimento das células, a biomassa é importante
por conter as substâncias de interesse tecnológico produzidas
durante o cultivo das microalgas.
Existe um grande número de espécies de microalgas pro-
missoras como fonte de lipídeos para a produção de biocombus-
tíveis devido à sua rápida multiplicação, alto conteúdo lipídico
e por permitir que seu cultivo se realize em terras não aráveis.
Diferentes espécies de microalgas podem produzir diferentes
tipos de lipídeos. Embora comumente quase toda microalga
possua lipídeo em sua célula, nem todo lipídeo de fonte algal
pode ser convertido a biodiesel (CHISTI, 2007). Diversos fato-
res influenciam a produção de lipídeos por microalgas, como a

intensidade luminosa, o aumento de temperatura e os nutrien-

tes adicionados ao cultivo. Dentre os nutrientes estão o nitro-
gênio e o enxofre os quais são usados pelas microalgas na sín-
tese de aminoácidos e ácidos graxos (RADMANN et al., 2008).
Sabe-se que para constituir fonte de matéria prima de bio-
diesel, esta deve ser rica em ácido graxo. Uma microalga com
um teor de proteína muito alto e baixo teor de lipídeos não
seria útil como matéria prima dos biocombustíveis. Segundo
Gama e colaboradores (2010) a maior parte do óleo produzido
por microalgas está na forma de triacilgliceróis o que favorece
a produção de biodiesel, que é constituído de ésteres de alquila,
usualmente produzidos através da reação de transesterificação
de um triacilglicerol com álcool, geralmente metanol ou etanol
anidro, na presença de catalisador homogêneo ou heterogêneo.
As microalgas conservadas in vivo em Coleção devem ser
também caracterizadas quanto aos seus componentes de4 sua
biomassa além da identificação taxonômica. Na Coleção for-
mada no projeto Microalgas, em função de seus objetivos o teor
de lipídeos foi uma das características avaliadas. Para a seleção
de estirpes de microalgas com altas produtividades de lipídeos,
uma etapa fundamental é a determinação do teor deste com-
posto na biomassa. Nessa análise, o grupo de isolados deve ser
preferencialmente grande e diversificado em termos de espé-
cies para aumentar a probabilidade de encontrar microalgas
com potencial produtivo em termos de lipídeos.
Dessa forma, neste capítulo, a proposta é mostrar os resul-
tados de produção de biomassa e de lipídeos de 152 estirpes
da Coleção IPR, visando a seleção de microalgas estirpes com
destaque nessas características .
10.1 Cultivo das Microalgas

As determinações da produção de biomassa e de lipídeos
foram realizadas utilizando-se alíquotas dos mesmos cultivos

de microalgas conduzidos em meio de cultura esterilizado em

autoclave e com pH 7,0, em frascos de vidro transparente con-
tendo 150 mL. Para obter esses cultivos, as estirpes de cia-
nobactérias foram inoculadas em meio de cultura (BG-11)
(ALLEN, 1968; ALLEN et al., 1968; RIPPKA, 1988) e as cloró-
fitas em meio de cultura nominado Bold Basal Medium (BBM)
(BOLD, 1949; BISCHOFF et al., 1963). Cada estirpe de micro-
alga da Coleção IPR foi inoculada em BG11 ou BBM com inó-
culo de 10% (v/v) e com densidade inicial padronizada para
aproximadamente 1 105 UFC mL-1. Os frascos de cultivos foram
mantidos estáticos em câmara de crescimento a temperatura
de 28 ± 2°C com fotoperíodo de 12 h e luminosidade em torno
de 80 a 100 μm fótons m-2 s-1, durante 12 dias. Após esse perí-
odo, foram retiradas alíquotas de 30 mL de cada cultivo para
as determinações da biomassa.
10.2 Produção de Biomassa pelas Microalgas

A biomassa microalgal é composta de grande parte de
água e material volátil representando aproximadamente 98%
do total. A determinação da biomassa de 158 estirpes da Cole-
ção IPR foi realizada pela centrifugação de alíquotas de 30 mL
de cultivo. Os tubos contendo os pellets foram mantidos em
estufa a 70°C por 24 h e posteriormente pesados até a obtenção
do peso constante da massa. A biomassa foi calculada pela dife-
rença entre os pesos do tubo com a massa seca e do tubo vazio.
Os valores da biomassa foram expressos em mg L-1 e trans-
formados em produtividade diária (mg L-1 dia-1). Os dados de
biomassa seca foram submetidos à análise de variância e apli-
cado o teste de médias Scott-Knott para agrupamento das estir-
pes, devido o alto número de tratamentos (Figura 10.1a e b).
A produção diária de biomassa das cianobactérias apresentou
valores médios de 15,71 mg L-1 dia-1. Quatro grupos foram for-
mados e a maioria das estirpes (86%) apresentou produção de

biomassa menor do que 16,65 mg L-1 dia-1. O grupo A repre-

sentado pela estirpe IPR7145 se destacou com valor médio de
64,23 mg L-1 dia-1 de produção de biomassa, sendo significati-
vamente superior aos das demais grupos de estirpes. O grupo
B apresentou valor médio de produtividade de 36,53 mg L-1
dia-1 e agrupa seis estirpes (IPR7138, 7006, 7070, 7162, 7146
e 7174) (Figura 10.1a).
Para o grupo das estirpes de microalgas clorófitas os pro-
cedimentos de análises foram os mesmos adotados para as cia-
nobactérias. Os resultados da produtividade de biomassa das
109 estirpes de cada grupo são apresentados na Figura 10.1b.
A produção diária de biomassa das clorófitas apresentou
valor médio de 14,76 mg L-1 dia-1, sendo esse resultado seme-
lhante aos das cianofíceas. A produtividade de biomassa das
109 estirpes de clorófitas resultou na formação de oito gru-
pos conforme semelhança estatística pelo teste Scott-Knott
(Figura 10.1b). O grupo A é composto pela estirpe IPR7002,
que apresentou maior produtividade de biomassa com valor
médio de 86,18 mg L-1 dia-1, diferindo-se estatisticamente dos
demais grupos. O grupo B é composto pela estirpe IPR7171,
que apresentou valor médio de 57,73 mg L-1 dia-1 de biomassa.
No grupo C foram agrupadas as estirpes IPR7132, 7151 e a
7161, cujo valor médio foi de 40,89 mg L-1 dia-1 de produção de
biomassa. Os grupos D e E são compostos por 95% das estirpes
e apresentaram valor médio de biomassa inferior a 28,92 mg
L-1 dia-1 (Figura 10.1b).

100
90
1
1d 80
70 n 1
60
m
0
sec
40 n 6
om ss
20 n 17
10 n 2
0
A
ru os de est r es de c no ct r s d oe o
12
n 6
10 n 9
n 1
n 1
8 n
0
A
Figura 10.1. Biomassa de células de 49 estirpes IPR de cianobac-

térias (a) e 109 de clorófitas (b). n= número de estir-
pes em cada grupo pelo teste de médias Scott-Knott (p
< 0,05). CV (%) = 31,62 para cianobactérias e 22,41
para clorófitas.
10.3 Alteração do pH e a relação entre

biomassa e densidade ótica do cultivo
Para determinar alterações nos cultivos das microalgas da
Coleção IPR, no décimo segundo dia após a inoculação foram
verificados o pH, em pHmetro. Todas as determinações foram
realizadas em triplicata.

Os dados de pH dos cultivos foram submetidos à análise de

variância e aplicado o teste de médias Scott-Knott para agrupa-
mento das estirpes (Figura 10.2a e b).
A estirpe IPR7145 alterou o pH do meio de cultivo para
9,3 e foi uma das que apresentou maior produção de biomassa,
cerca de 60 mg L-1 dia-1. No grupo da clorófitas, a IPR7171 com
pH 10,78 também ficou no grupo das estirpes com potencial
para produção de biomassa.
12
n 6
10 n 9
n 1
n 1
8 n
0
A
12
n 6
n
n 12
10 n 1
n 20
n 22
8 n 24
0
A
ru os de est r es de c or t s
Figura 10.2. Medida de pH do cultivo de 46 estirpes IPR de ciano-

bactérias (a) e 109 de clorófitas (b). n= número de
estirpes em cada grupo pelo teste de médias Scott-
-Knott (p < 0,05). CV (%) = 3,92 para cianobacté-
rias e 3,41 para clorófitas.

A densidade ótica dos cultivos de microalgas em meio de

cultura foi determinada pela leitura da absorbância em espec-
trofotômetro Genesis e no comprimento de onda de 670 nm.
O valor médio de DO670 de cada estirpe de microalga em cada
grupo de microalgas (cianobactéria e clorófita) foi relacionado
com os dados de biomassa microalgal (Figuras 10.3a e 10.3b).
Figura 10.3. Relação entre densidade ótica (DO670) e biomassa de

microalgas: (a) cianobactérias totalizando 49 estirpes
e (b) microalgas clorófitas, totalizando 109 estirpes da
Coleção IPR.

Nota se que muitos pontos da curva ficaram fora das linhas

do intervalo de confiança (95%). A regressão linear entre bio-
massa de microalgas clorófitas (em g por litro) e a densidade
ótica (em unidades de absorbância) apresentou R2 = 0,182 (p
< 0,001) e R2 = 0,13 (p < 0,01) para as cianófitas. Portanto,
para utilizar a equação da DO para calcular a biomassa o ideal
é o ajuste da curva para cada estirpe de microalga.
Os cultivos das microalgas apresentaram densidade ótica
(DO670) com menor valor no grupo da cianobactérias, a estirpe
IPR7155 apresentou DO de 0,001 e contagem de células em
log10 de 5,95. No grupo de clorófitas para a estirpe IPR7108
mostrou maior valor com DO de 1,644 e o valor médio do
número de células em log10 de 7,16 no cultivo de 12 dias.
10.4 Lipídeos em Microalgas

As estirpes de microalgas que compõem a Coleção IPR de
Microalgas isoladas de águas continentais no Paraná são alvo
de pesquisas do projeto Copel/IAPAR/Fapeagro. Um dos obje-
tivos do projeto foi o de avaliar a produção de lipídeos. Diante
da necessidade do laboratório em adotar um método para ava-
liar a produção de lipídios pelas microalgas, previamente foram
realizados ensaios para a escolha do método. Assim, foram tes-
tados os métodos de Folch, Bligh e Dyer e de espectroscopia de
fluorescência em análises de amostras cujos teores de lipídios
já são conhecidos.
Os principais métodos gravimétricos utilizados para quan-
tificação de lipídeos são os de Soxhlet (1879), Folch et al.
(1957) e Bligh e Dyer (1959). Esses métodos foram utilizados
por diversos pesquisadores para determinar os teores de lipí-
deos totais na biomassa de microalgas.
A quantificação dos lipídeos por Soxhlet, um processo con-
tínuo e sob aquecimento, utiliza grandes quantidades de sol-
ventes orgânicos e de amostra seca (IQBAL et al., 2013), o que

inviabiliza seu uso na determinação dos lipídeos em microalgas.

Folch e colaboradores (FOLCH et al., 1957) desenvolveram um
método para quantificação de lipídeo total, cujo procedimento
consiste em homogeneizar a amostra com mistura de solventes
clorofórmio/metanol (2:1 v/v) e lavagem por adição de clo-
reto de potássio para separação das fases. Uma modificação
desse método foi proposta por Bligh et al. (1959), utilizando a
mistura de solventes clorofórmio:metanol:água (2:1:0,8; v/v).
Além de ser um processo a frio e não causar alteração para
posterior análise do perfil das frações lipídicas, esse método
modificado tem a vantagem da rapidez, baixo custo e uso de
quantidades mínimas de solventes e de amostra.
No projeto foi adotado um método para microdetermi-
nação de lipídeos em amostras de microalgas cultivadas em
laboratório. Os lipídeos foram extraídos de amostras secas de
biomassa de Chlorella vulgaris, utilizando-se como solvente
uma mistura de clorofórmio e metanol 2:1 (v/v) e a quanti-
dade de lipídeos extraídos foi determinada por gravimetria. Os
resultados obtidos por esse método foram comparados com os
resultados obtidos na extração contínua em aparelho Soxhlet
(OHARA et al., 2014).
O método colorimétrico de microplacas utiliza pequena
quantidade (menos de 100 μL) de amostra por microplaca,
ácido sulfúrico, incubação a 90°C, resfriamento em banho de
água com gelo e leitura da absorbância a 540 nm (CHENG et
al., 2011). Outro método quantitativo colorimétrico que usa
sulfo-fosofo-vanilina em microplacas de 96 poços e leitura da
absorbância a 540 nm foi testado para microalgas (CHENG;
ZHENG; VANDERGHEYNST, 2011). A escolha do método
depende também da disponibilidade de infraestrutura no labo-
ratório, como equipamentos e reagentes.
Outro método usado na quantificação de lipídeos emprega-
-se o corante vermelho do Nilo (Nile Red) para fluorescência
(COOKSEY et al., 1987; LEE et al., 1998; BERTOZZINI et al.,

2011). A mistura do corante com as células de microalgas des-

taca as partes da célula que contém os lipídeos. Este método
tem sido usado para contagem de bactérias que acumulam
compostos tais como lipídeos (SPIEKERMANN et al., 1999). O
Vermelho do Nilo, ou “Nile Red” (9-dietilamino-5H-benzo [α]
Fenoxazina-5-one) é um corante que fluoresce a comprimentos
de onda definidos, dependendo da polaridade do meio envol-
vente e tem sido proposto para determinar o teor de lipídeos
neutros de células de microalgas. Essa metodologia é descrita
em diversos trabalhos com microalgas (LEE; YOON; OH, 1998;
LEE et al., 2010) e também por outros pesquisadores (COOK-
SEY; GUCKERT; WILLIAMS; CALLIS, 1987; ELSEY et al., 2007;
WEI et al., 2009; CHEN et al., 2011).
No caso das microalgas, em algumas espécies o conteúdo
de lipídeos é determinado com sucesso, mas em outras os teo-
res de lipídeos obtidos por fluorescência e por gravimétrica
diferem. Em algumas espécies ocorre dificuldade do corante
em penetrar as paredes das células. Para eliminar este pro-
blema, Chen et al. (2009) utilizaram diferentes concentrações
de dimetil sulfóxido (DMSO, (CH₃)₂SO), um composto organo
sulfuroso, em temperaturas elevadas para favorecer a passa-
gem do corante (Nile Red) pela parede celular da microalga e
possibilitar a quantificação de lipídeos neutros na biomassa.
Para aumentar a eficiência do procedimento na técnica por
fluorescência com Nile Red foi proposto também utilizar o gli-
cerol ou dimetil sulfóxido DMSO em culturas de microalgas
de Nannochloropsis sp. (DOAN et al., 2010). A quantificação
de lipídeos usando fluorescência tem a vantagem de dispensar
a extração, mas o uso de corante (Nile Red) e de outros não
garante que só os lipídeos neutros sejam quantificados, e tam-
bém, que o corante possa atingir inteiramente todas as partes
internas da célula (CHEN; SOMMERFELD; HU, 2011). A meto-
dologia por fluorescência com vermelho do Nilo (Nile Red) foi
adotada para quantificar a produção de lipídeos neutros da

biomassa por ser amplamente utilizada para caracterizar lipí-

deo não polar de microalgas (SMITH-BADORF et al., 2013).
Para este projeto essa técnica foi adaptada e utilizada para
a caracterização do teor de lipídeos de microalgas em parceria
com o Laboratório de Fluorescência e Ressonância Paramagné-
tica Eletrônica (LAFLURPE) do Departamento de Química da
Universidade Estadual de Londrina - UEL, Londrina, PR. Em
face da grande quantidade de estirpes da coleção de microal-
gas do projeto foi necessário utilizar uma técnica que utilizasse
pouca quantidade de biomassa e de solvente. Sendo assim, a
técnica de fluorescência de lipídeos com Nile Red atendeu essa
necessidade.
Nessa técnica, após a coleta das amostras de microalgas
realizou-se o pré-tratamento, quando se avaliou a densidade
óptica (D.O.) em espectrofotômetro a 670 nm para efetuar as
devidas diluições das amostras que excederam a absorbância
de 0,06 (fator limite para esta análise). As amostras que apre-
sentaram D.O. superior a 0,06 foram diluídas com água desti-
lada e os volumes inicial da amostra (2 mL) e final da diluição
foram considerados no cálculo do fator de diluição.
Na análise alíquotas de 1,5 mL da amostra previamente
diluída foram transferidas para microtubos e centrifugadas
durante 5 minutos a 7000 g. O sobrenadante foi descartado
e as amostras foram mantidas em ultrafreezer à -80ºC por no
mínimo 24 h para rompimento das células. Posteriormente,
para medir a intensidade de fluorescência o volume da amostra
foi completado para 1,5 mL com acetona. A curva de calibração
foi preparada com trioleína (padrão de lipídeo neutro) a partir
de uma solução de concentração 0,5 mg mL-1 da qual foram
preparadas diluições com 4 mL de acetona para se obter uma
curva com cinco pontos na faixa ente 0,8 a 2,0 μg mL-1. A solu-
ção do corante Nile Red foi preparada na concentração de 0,05
mg mL-1 (nesta concentração a coloração é rosa). Para cada um
mL de solução final (acetona + trioleína) foram adicionadas

alíquotas de 5 μL da solução do corante Nile red. Todas as solu-

ções foram preparadas e mantidas ao abrigo da luz.
Para a reação, foram tomadas alíquotas de 1,0 mL das
amostras contidas nos microtubos, transferidas para tubos de
ensaio e adicionadas de 3 mL de acetona. O Nile Red fo

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Esta publicação, Microalgas de Águas Continentais: Potencialidades e Desafios do

microalgas como fonte alternativa de energia e de coprodutos de valor agregado

PRODUÇÃO DE BIOMASSA E COPRODUTOS

Diva Souza Andrade e Arnaldo Colozzi Filho | Editores

Capa 2 - Alisson.indd 1 15/08/2014 16:46:08

NORBERTO ANACLETO ORTIGARA

INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ - IAPAR

ARMANDO ANDROCIOLI FILHO

ALTAIR SEBASTIÃO DORIGO

ADELAR ANTONIO MOTTER

MARCOS VALENTIN FERREIRA MARTINS

Capa 2 - Alisson.indd 2 15/08/2014 16:46:09

INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ

5 Livro Microalgas V2.indb 1 30/07/2014 09:46:55

Esta publicação, MICROALGAS DE ÁGUAS CONTINENTAIS: PRODUÇÃO DE BIO-

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

M626 Microalgas de águas continentais / editores: Diva Souza

1. Microalga – Cultivo. 2. Microalga – Biotecnologia. I.

Impresso no Brasil / Printed in Brazil

5 Livro Microalgas V2.indb 2 30/07/2014 09:46:56

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5 Livro Microalgas V2.indb 1 30/07/2014 09:46:56

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Arnaldo Colozzi Filho

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Diva Souza Andrade

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Fernanda de Almeida Fin de Lima

Freddy Zambrano Gavilanes

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5 Livro Microalgas V2.indb 4 30/07/2014 09:46:56

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Helder Rodrigues da Silva

Iara Cintra de Arruda Gatti

João Henrique Caviglione

Juscélio Donizete Cardoso

5 Livro Microalgas V2.indb 5 30/07/2014 09:46:56

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5 Livro Microalgas V2.indb 15 30/07/2014 09:46:56

5 Livro Microalgas V2.indb 16 30/07/2014 09:46:56

Ricardo Silva Araujo, Ph.D.

5 Livro Microalgas V2.indb 17 30/07/2014 09:46:56

ESTADO DA ARTE SOBRE O CULTIVO DE MICROALGAS ......... 33

1.1 Plataformas de Dados Bibliográficos Online ................ 39

1.2 Metodologia de Busca .............................................. 41

1.6 Busca Utilizando o Termo Microalgae and Biofuel* ...... 52

5 Livro Microalgas V2.indb 19 30/07/2014 09:46:56

MINERAÇÃO TEXTUAL DE ARTIGOS SOBRE O CULTIVO

2.3 Publicações Sobre Cultivo Heterotrófico de Microalgas . 66

5 Livro Microalgas V2.indb 20 30/07/2014 09:46:56

VANTAGENS E DESAFIOS DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL