Dissertacao Rykelly F Campos

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE ENGENHARIA CIVIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM ENGENHARIA DO
MEIO AMBIENTE
RYKELLY FARIA CAMPOS
ESTUDO DO POTENCIAL DE REMOÇÃO DE SUBSTÂNCIAS

HÚMICAS NA ÁGUA COM APLICAÇÃO DE ENZIMAS
FÚNGICAS
GOIÂNIA – GO
2011
ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE ENGENHARIA CIVIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM ENGENHARIA DO
MEIO AMBIENTE
ESTUDO DO POTENCIAL DE REMOÇÃO DE SUBSTÂNCIAS

HÚMICAS NA ÁGUA COM APLICAÇÃO DE ENZIMAS
FÚNGICAS
Dissertação apresentada no Programa de Pós-Graduação

Stricto Sensu em Engenharia Civil da Universidade
Federal de Goiás, como requisito para obtenção de Mestre
em Engenharia do Meio Ambiente
Área de Concentração: Recursos Hídricos e Saneamento
Ambiental.
Orientadora: Prof. Dra. Mariângela Fontes Santiago.
GOIÂNIA – GO
2011

iii

FICHA AVALIATIVA DE APROVAÇÃO
ESTUDO DO POTENCIAL DE REMOÇÃO DE SUBSTÂNCIAS HÚMICAS NA

ÁGUA COM APLICAÇÃO DE ENZIMAS FÚNGICAS
Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação Stricto Sensu em Engenharia do
Meio Ambiente da Escola de Engenharia Civil da Universidade Federal de Goiás, para
obtenção do grau de mestre, defendida e aprovada em 02/09/2011, pela Banca
Examinadora constituída pelos professores.
Profa. Dra. Mariângela Fontes Santiago

Presidente da banca (orientadora) – PPGEMA/UFG – GO
Prof. Dr. Edson Pereira Tangerino

UNESP – SP
Profa. Dra. Kátia Alcione Kopp

PPGEMA/UFG –GO
Warde Antonieta de Fonseca Zang
IFG – GO

v

Dedico este trabalho:

Ao Nosso Senhor Deus pai todo poderoso que amo acima de tudo.
Sem ele nada disso teria sido possível.
Aos meus Pais, LUZIA HELENA e AFONSO CAMPOS pela educação

e o grande amor que me proporcionaram, eternos agradecimentos à
vocês, por seus esforços imensuráveis, que favoreceram minha
chegada até aqui! Amo muito vocês!!!
Ao meu namorado Guilherme Rodrigues, por fazer parte da minha

vida e alegrar meus dias...
Sem você, minha vida perde toda a graça.
Perfeito, muito obrigado por tudo!

vi

AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus pelo seu amor, sabedoria, saúde e paz tão necessários para a
realização deste trabalho.
À FAPEG – GO, pelos oito meses de bolsa de estudos e pelo apoio financeiro.
A equipe do Laboratório de Enzimologia e Biocatálise da Faculdade de Farmácia da
UFG;
A equipe do laboratório de Controle de qualidade de medicamentos da faculdade de
farmácia da UFG– LCQM, em especial a Viviane e ao Elvis pela grande colaboração
nas análises;
Ao professor José Realino, pela colaboração e ajuda;
A minha orientadora, professora Mariângela, pela motivação e ensinamentos;
A Vilma e Luciana pelo apoio nos ensaios realizados na SANEAGO;
Aos amigos e colegas de mestrado, em especial a amiga Karina, pelas maravilhosas
horas de descontração e companherismo;
Aos professores do programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Engenharia do Meio
Ambiente (PPGEMA).
Aos meus familiares, meu pai Afonso Campos, minha mãe Luzia Helena, minhas irmãs,
Rykeny, Rykeyla, Reylla, meus sobrinhos lindos e ao meu namorado e amigo
Guilherme Rodrigues pelo amor, dedicação e paciência.
Meus sinceros agradecimentos.

vii

CAMPOS, R. F. ESTUDO DO POTENCIAL DE REMOÇÃO DE SUBSTÂNCIAS

HÚMICAS NA ÁGUA COM APLICAÇÃO DE ENZIMAS FÚNGICAS.
Dissertação (Mestrado em Engenharia do Meio Ambiente) – Escola de Engenharia
Civil, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Engenharia do Meio Ambiente,
Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2011.
RESUMO
As substâncias húmicas (SHs), matéria orgânica em diferentes estágios de degradação

são formadas, durante o processo de decomposição de resíduos vegetais e animais
presentes no ambiente, sendo importante a sua remoção já que elas podem conferir
características indesejáveis à água distribuída. A utilização de microrganismos como os
fungos, para essa remoção é de extrema importância, pois estes exercem papel
importante dentro do saneamento atuando nos processos de transformação dos resíduos
orgânicos, onde funcionam como recicladores de matéria nos diversos ecossistemas. O
trabalho teve o objetivo de estudar a produção de enzimas fenoloxidases e peroxidases
por fungos de decomposição branca (Trametes villosa e Pycnosporus sanguineus) para
a remoção das SHs na água. O trabalho foi divido em partes: extraiu, purificou e
caracterizou-se os ácidos húmicos e fúlvicos. Em seguida, colocou-se as SHs em água e
utilizou-se as enzimas fúngicas para a sua remoção, também foram realizados ensaios
em reator estático (Jar Test). A análise da composição das SHs (caracterização) e
verificação de degradação foi realizada por espectrofotometria na região do ultravioleta
e visível, e espectroscopia de infravermelho e através da determinação da produção
enzimática. O método de extração utilizado foi eficaz nas separações dos ácidos
húmicos e fúlvicos; os espectros dos ácidos húmicos extraídos apresentaram grupos
carboxílicos, alquílicos, aromáticos, alcoólicos, fenólicos e carboidratos. A enzima
predominante em todas as espécies fúngicas utilizadas foi a lacase (Lcc); as amostras
analisadas de Trametes villosa foram as que apresentaram maior diminuição nas
absorbâncias em vários comprimentos de ondas nos espectros de ultravioleta/visível
(UV-Vis), medida indireta de degradação. As amostras contendo o fungo de Trametes
villosa também foram as que obtiveram uma maior produção enzimática de lacase, na
maioria dos ensaios, chegando a uma produção de 3,48 U.mL-1 com ácido húmico da
marca Sigma-Aldrich® e 2,61 U.mL-1 para o ácido húmico extraído e obtendo um
índice percentual de remoção de 56% e 42% destes ácidos respectivamente. Nos ensaios
com ácido fúlvico e fungos em diferentes pHs (3,0, 5,0 e 7,0), todos apresentaram
diminuição do espectro de UV/Vis com índices percentuais de remoção de 92%. T.
villosa foi o que apresentou índices maiores de adsorção comprovados por espectro no
UV-Vis, ainda que em menor proporção que os tratados com enzimas, seu maior índice
percentual de adsorção foi de 86%. Os fungos do presente estudo apresentam grande
potencial de remoção e de adsorção das substâncias húmicas presentes na água.
Palavras-chave: ácidos húmico, ácidos fúlvico, fungos de decomposição branca

viii

CAMPOS, R. F. STUDY OF POTENTIAL REMOVAL OF HUMIC

SUBSTANCES IN THE WATER WITH APPLICATION FUNGAL ENZYMES. 2011.
132 f. Dissertation (Masters of Environmental Engineering) - Civil Engineering
College, Post-Graduation Stricto Sensu Program in Environmental Engineering -
Federal University of Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil, 2011.
ABSTRACT
The humic substance (SHs), organic matter in different stages of degradation are formed
during the decomposition of plant and animal residues in the environment, it is
important to remove them, as they can give undesirable characteristics to the water
distributed. The use of microorganisms such as fungi, for this removal are extremely
important, since their role in sanitation is to act on processing organic waste, where they
function as recyclers of matter in different ecosystems. This work aimed to study the
production of phenol oxidase enzymes, peroxidases white decomposition by fungi
(Trametes villosa and Pycnoporus sanguineus) for the removal of HSs in the water. The
work was divided into parts: extracted, purified and characterized the humic and fulvic
acids, was placed just after the HSs in water and we used the fungal enzymes for their
removal, tests were also performed in the Jar Test. Analysis of the composition of HSs
(characterization) and verification of degradation was performed by spectrophotometry
in the ultraviolet and visible region, and infrared spectroscopy, by determining the
enzyme production. The extraction method used was effective in the separation of
humic and fulvic acids, the spectra of extracted humic acids showed carboxylic groups,
alkyl, aromatic, alcohol, phenol and carbohydrates. The predominant enzyme in all
fungal species used was laccase (Lcc); analyzed samples of Trametes villosa showed the
largest decrease in absorbance at several wavelengths in the ultraviolet / visible (UV-
Vis) spectra, an indirect measure of degradation. The samples containing the fungus
Trametes villosa were also those that had a higher laccase enzyme production in most
trials, reaching a production of 3.48 mL-1 with humic acid from Sigma-Aldrich® brand
and 2.61 U.mL-1 for humic acid extracted and getting a percentage rate of removal of
56% and 42% respectively of these acids. In tests with fulvic acid and fungi at different
pHs (3.0, 5.0 and 7.0), all has decreased range of UV/Vis with percentage removal rates
of 92%. T villosa showed the higher rates of adsorption evidenced byUV-Vis spectrum,
albeit to a lesser extent than those treated withenzymes, their highest percentage
of adsorption was 86%. Fungi in this study have great potential for degradation and
adsorption of humic substances present in water.
Key Words: humic acid, fulvic acid, white decomposition by fungi.

ix

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 (A): Estado da arte do conceito estrutural de um ácido húmico (A)-----------29

Figura 1 (B): Estrutura proposta de um ácido fúlvico (B)----------------------------------29
Figura 2: Fluxograma da metodologia utilizada ---------------------------------------------61
Figura 3: Solo sendo tratado como solução de HCl a 0,5 mol/L para eliminação dos
carbonatos e íons metálicos fracamente ligados, deixado em decantação (A), o conteúdo
do Becker, contendo o solo foi transferido para um Becker de material plástico para
receber tratamento com o líquido extrator, solução de NaOH 0,5 mol/L (B) e ao lado a
mesma solução com NaOH a 0,5 mol/L, após 24 horas (C)---------------------------------63
Figura 4: Solução no instante que recebeu o ácido HCl a 6 mol/L (A) e depois de 48
horas de decantação (B)--------------------------------------------------------------------------63
Figura 5 (A): Espectroscopia do ácido húmico extraído no espectrofotômetro de
Infravermelho--------------------------------------------------------------------------------------65
Figura 5 (B): Espectroscopia do ácido húmico da Sigma-Aldrich® no
espectrofotômetro de Infravermelho------------------------------------------------------------66
Figura 5 (C): Espectroscopia do ácido fúlvico extraído no espectrofotômetro de
Infravermelho--------------------------------------------------------------------------------------66
Figura 6: Espectro do ácido húmico extraído na região do Ultravioleta e visível-------67
Figura 7: Determinação da atividade enzimática (U.mL-1) da Lacase de Pycnoporus
sanguineus em todas as amostras no 10º e 15º dia para os ensaios com ácido fúlvico-----
-------------------------------------------------------------------------------------------------------68
Figura 8: Determinação da atividade enzimática (U.mL-1) da Lignina peroxidase de
Pycnoporus sanguineus em todas as amostras no 10º dia para os ensaios com ácido
fúlvico----------------------------------------------------------------------------------------------69
Figura 09: Determinação da atividade enzimática (U.mL-1) da Manganês peroxidase de
fúlvico----------------------------------------------------------------------------------------------70
Figura 10 (A): Determinação atividade enzimática (U.mL-1) da Lacase de Trametes
villosa em todas as amostras no 10º dia para os ensaios com ácido fúlvico--------------71
Figura 10 (B): Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) da Lacase de
Trametes villosa em todas as amostras do 15º dia para os ensaios com ácido fúlvico---71
Figura 11: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) da LiP de Trametes
villosa em todas as amostras do 10º dia para os ensaios com ácido fúlvico.--------------72

x

Figura 12: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) da Lacase de Trametes

villosa em todas as amostras do 10º e 15º dia nos ensaios com os ácidos húmicos------75
Figura 13: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) da Lignina Peroxidase de
Trametes villosa em todas as amostras do 10º dia nos ensaios com os ácidos húmicos----
-------------------------------------------------------------------------------------------------------76
Figura 14: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) da Manganês Peroxidase
de Trametes villosa em todas as amostras do 10º dia nos ensaios com os ácidos húmicos
-------------------------------------------------------------------------------------------------------76
Figura 15: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) da Lacase de
Pycnoporus sanguineus em todas as amostras do 10º e 15º dia nos ensaios com os
ácidos húmicos ------------------------------------------------------------------------------------77
Pycnoporus sanguineus em todas as amostras do 10º dia nos ensaios com os ácidos
húmicos --------------------------------------------------------------------------------------------78
de Pycnoporus sanguineus em todas as amostras do 10º dia nos ensaios com os ácidos
húmicos --------------------------------------------------------------------------------------------78
Figura 18: Fotografias dos erlenmeyers contendo as amostras de Trametes villosa com
ácido fúlvico em pH 3,0 (A), pH 5,0 (B), pH 7,0 (C) no 15º, após os ensaios na Shaker
-------------------------------------------------------------------------------------------------------80
Figura 19: Fotografias dos erlenmeyers contendo as amostras de Pycnoporus
sanguineus com ácido fúlvico em pH 3,0 (A), pH 5,0 (B), pH 7,0 (C) no 15º, após os
ensaios na incubadora agitadora Shaker-------------------------------------------------------80
Figura 20: Fotografias dos erlenmeyers contendo as amostras de Trametes villosa com
ácido húmico extraído (A), Pycnoporus sanguineus com ácido húmico extraído (B), no
15º, após os ensaios na incubadora agitadora Shaker----------------------------------------80
Figura 21: Espectros de ultravioleta e visível (UV-vis) das amostras de Pycnoporus
sanguineus para controle no 10º dia antes de colocar água destilada e autoclavada (A),
com água autoclavada no 10º dia (B) e com água autoclavada no 15º(C) dia
respectivamente-----------------------------------------------------------------------------------82
sanguineus ainda sem o ácido fúlvico em pH 3,0 no 10 º dia (A) com ácido fúlvico em
pH 3,0 no 10º dia (B) e com a presença de ácido fúlvico em pH 3,0 no 15º dia (C)-----83

xi


sanguineus ainda sem o ácido fúlvico em pH 5,0 no 10 º dia (A) com ácido fúlvico em
pH 5,0 no 10 º dia (B) e com a presença de ácido fúlvico em pH 5,0 no 15º dia (C)----84
sanguineus ainda sem o ácido fúlvico em pH 7,0 no 10 º dia (A) o com ácido fúlvico em
pH 7,0 no 10 º dia (B) e com a presença de ácido fúlvico em pH 7,0 no 15º dia (C)----85
Figura 25: Espectros de ultravioleta e visível (UV-Vis) das amostras de Trametes
villosa para controle sem água no 10 º dia (A) com água autoclavada no 10 º dia (B)
com água autoclavada 15º dia (C)--------------------------------------------------------------87
villosa sem o ácido fúlvico em pH 3,0 no 10 º dia (A) com ácido fúlvico em pH 3,0 no
10 º dia (B) e com a presença de ácido fúlvico em pH 3,0 no 15º dia (C)-----------------88
Figura 29: Espectros de ultravioleta e visível (UV-Vis) das amostras de Pycnoporus
sanguineus sem o ácido húmico da Sigma-Aldrich® no 10 º dia (A) com ácido húmico
da Sigma-Aldrich® no 10 º dia (B) com ácido húmico da Sigma-Aldrich® no 15º dia
(C)---------------------------------------------------------------------------------------------------92
sanguineus sem o ácido húmico extraído no 10 º dia (A) com ácido húmico extraído no
10 º dia (B) com ácido húmico extraído no 15º dia (C)--------------------------------------93
villosa ainda sem o ácido húmico da Sigma-Aldrich® no 10 º dia (A) com ácido húmico
da Sigma-Aldrich® no 10 º dia (B) com ácido húmico da Sigma-Aldrich® no 15º dia
(C)---------------------------------------------------------------------------------------------------94
villosa ainda sem o ácido húmico extraído no 10 º dia (A) com ácido húmico extraído
no 10 º dia (B) com ácido húmico extraído no 15º dia (C)----------------------------------95

xii


sanguineus autoclavado com ácido fúlvico em pH 3,0 no 10º(A) e 15º(B) dia
villosa autoclavado e adicionado o ácido fúlvico em pH 3,0, no 10º e 15º dia
sanguineus autoclavado e adicionado o ácido fúlvico em pH 5,0, no 10º(A) e 15º(B) dia
villosa autoclavado com ácido fúlvico em pH 5,0 no 10º(A) e 15º(B) dia
sanguineus autoclavado e adicionado o ácido fúlvico em pH 7,0 no 10º e 15º dia
villosa autoclavado e adicionado o ácido fúlvico em pH 7,0 no 10º(A) e 15º(B) dia
sanguineus autoclavado com ácido húmico da Sigma-Aldrich® no 10º(A) e 15º(B) dia
respectivamente----------------------------------------------------------------------------------101
villosa autoclavado com ácido húmico da Sigma-Aldrich® no 10º(A) e 15º(B) dia
sanguineus autoclavado com ácido húmico extraído no 10º(A) e 15º(B) dia
villosa autoclavado com ácido húmico da extraído no 10º(A) e 15º(B) dia
Figura 43: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) de Pycnoporus
sanguineus de todas as amostras do 10º dia e 24h nos testes com o ácido fúlvico-----103
sanguineus de todas as amostras do 10º dia e 24h nos testes com o ácido húmico-----103

xiii

Figura 45: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) de Trametes vilosa de

todas as amostras do 10º dia e 24h nos testes com o ácido fúlvico-----------------------104
todas as amostras do 10º dia e 24h nos testes com o ácido húmico-----------------------104
Figura 47: Fotografias da utilização do Jar Test contendo as amostras de Trametes
villosa com ácido fúlvico e Pycnoporus sanguineus; (A) os dois primeiros jarros são de
Trametes villosa, e os dois últimos de Pycnoporus sanguineus (A) – fotografia da
utilização do Jar Test (B) fotografias do final do uso do Jar Test (30 min. depois do
início do experimento) o primeiro jarro com as amostras de Trametes villosa e o
segundo com amostras contendo Pycnoporus sanguineus---------------------------------106
sanguineus com ácido fúlvico no 10º dia, após a utilização do reator estático (Jar Test)
(A), após 10 min. da finalização dos experimentos (B) e 24 horas após o finalização dos
experimentos com o reator estático (Jar Test) (C)------------------------------------------107
villosa com ácido fúlvico no 10º dia (A), após a utilização do reator estático (B) e 24
horas após a utilização do reator estático (C)------------------------------------------------108
Figura 50: Fotografias dos experimentos em reator estático (Jar Test) contendo as
amostras de Trametes villosa com ácido húmico e Pycnoporus sanguineus; (A) os três
primeiros jarros são de Trametes villosa, e os três últimos Pycnoporus sanguineus (A) –
fotografia no momento do experimento, (B) fotografia do final do experimento em
reator estático (Jar Test) (30 min. depois do início do ensaio) (C) fotografia comparando
o primeiro jarro com as amostras de Trametes villosa e o segundo com amostras
contendo Pycnoporus sanguineus no final do experimento em reator estático (Jar Test)
(30 min. depois do início do experimento)---------------------------------------------------109
villosa com ácido húmico extraído no 10º dia após experimento em reator estático (Jar
Test) (A), 10 min. após o final do experimento (B) e 24 horas após o final do
experimento (C) em Jar Test respectivamente-----------------------------------------------110
sanguineus com ácido húmico extraído no 10º dia após experimento em reator estático
(Jar Test) (A), após 10 min. da finalização dos experimentos (B) e 24 horas após o final
do experimento em reator estático (C) respectivamente------------------------------------111

xiv

LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Enzimas fúngicas estudadas-------------------------------------------------------41

Quadro 2: Principais grupos de absorção no infravermelho para SHs--------------------52
Quadro 3: Meios de Cultura -------------------------------------------------------------------53
Quadro 4: Teste de Tukey para amostras das atividades enzimáticas de LiP por
Trametes villosa no 10º dia----------------------------------------------------------------------73
APÊNDICE A – LISTA DE QUADROS
Quadro A – 01: Atividade enzimática do Pycnoporus sanguineus com ácido fúlvico

-----------------------------------------------------------------------------------------------------122
Quadro A – 02: Atividade enzimática do Trametes villosa com ácido fúlvico--------124
Quadro A – 03: Atividade enzimática do Pycnoporus sanguineus com ácido húmico da
Sigma-Aldrich®---------------------------------------------------------------------------------126
Quadro A – 04: Atividade enzimática do Pycnoporus sanguineus com ácido húmico
extraído--------------------------------------------------------------------------------------------127
Quadro A – 05: Atividade enzimática do Trametes villosa com ácido húmico da
Sigma-Aldrich®---------------------------------------------------------------------------------128
Quadro A – 06: Atividade enzimática do Trametes villosa com ácido húmico extraído
-----------------------------------------------------------------------------------------------------129
Quadro A – 07: Análise de variância - Teste ANOVA da atividade enzimática do
Pycnoporus sanguineus com ácido fúlvico--------------------------------------------------130
Trametes villosa com ácido fúlvico-----------------------------------------------------------131
Quadro A – 09: Análise de variância – Teste Tukey da atividade enzimática do
Quadro A – 10: Análise de variância – Teste T Pareado da atividade enzimática do
Pycnoporus sanguineus com ácido fúlvico--------------------------------------------------132

xv

Quadro A – 12: Análise estatística descritiva de Trametes villosa com ácido fúlvico no
reator estático (Jar Test) ------------------------------------------------------------------------133
Quadro A – 13: Análise estatística descritiva de Pycnoporus sanguineus com ácido
húmico no reator estático (Jar Test) ----------------------------------------------------------133
Quadro A – 14: Análise estatística descritiva de Trametes villosa com ácido húmico
nos ensaios no reator estático (Jar Test) -----------------------------------------------------133
Sigma-Aldrich®ͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲͲ134
Extraído-------------------------------------------------------------------------------------------134
Quadro A – 17: Análise estatística descritiva de Trametes villosa com ácido Húmico
Sigma-Aldrich®---------------------------------------------------------------------------------134
extraído--------------------------------------------------------------------------------------------134
Sigma-Aldrich®---------------------------------------------------------------------------------135
extraído -------------------------------------------------------------------------------------------135
húmico Sigma-Aldrich®------------------------------------------------------------------------135
húmico extraído----------------------------------------------------------------------------------135
húmico extraído----------------------------------------------------------------------------------136
Quadro A – 25: Análise estatística descritiva de do Pycnoporus sanguineus com ácido
Húmico Extraído---------------------------------------------------------------------------------136

xvi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
SHs Substâncias húmicas

SHAs Substâncias húmicas aquáticas
MON Matéria orgânica natural
AHs Ácidos Húmicos
AFs Ácidos Fúlvicos
Lcc Lacase
MnP Manganês Peroxidase
LiP Lignina Peroxidase
BGA Batata, Glicose e Ágar
RPM Rotação por minuto
pH Potencial Hidrogeniônico
UFG Universidade Federal de Goiás
FF Faculdade de Farmácia
CONAMA Conselho Nacional de Meio Ambiente
UV Ultravioleta
UV-vis Ultravioleta e visível
COD Carbono orgânico dissolvido
THM Trihalometanos
DQO Demanda Química de Oxigênio

17
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO--------------------------------------------------------------------------------20
2 JUSTIFICATIVA-----------------------------------------------------------------------------23
3 OBJETIVOS-----------------------------------------------------------------------------------25
3.1 OBJETIVO GERAL-------------------------------------------------------------------------25
3.1.1 Objetivos específicos-------------------------------------------------------------------25
4 REVISÃO DE LITERATURA-------------------------------------------------------------26
4.1 SUBSTÂNCIAS HÚMICAS---------------------------------------------------------------26
4.1.1 Composição das substâncias húmicas-------------------------------------------------27
4.1.2 Fracionamento das substâncias húmicas---------------------------------------------30
4.1.3 Medidas indicadoras de substâncias húmicas na água----------------------------30
4.1.4 Extração e purificação das substâncias húmicas-----------------------------------32
4.1.5 Remoção de substâncias húmicas------------------------------------------------------33
4.1.6 Interação das substâncias húmicas com metais-------------------------------------34
4.1.7 Relação da cor nas águas de abastecimento e as substâncias húmicas---------36
4.2 FUNGOS--------------------------------------------------------------------------------------38
4.2.1 Fungos Basidiomicetos-------------------------------------------------------------------38
4.2.1.1 Sistemas enzimáticos encontrados em fungos basidiomicetos---------------------40
4.2.1.1.1 Enzima lignina peroxidase (LiPs)---------------------------------------------------41
4.2.1.1.2 Enzima manganês peroxidase (MnPs)----------------------------------------------42
4.2.1.1.3 Enzima lacase --------------------------------------------------------------------------43
4.2.1.2 Utilização de fungos de decomposição branca---------------------------------------44
5 MATERIAIS E MÉTODOS----------------------------------------------------------------48
5.1 CARACTERÍSTICAS DO LOCAL DA COLETA DAS AMOSTRAS--------------48
5.2 MÉTODO DE COLETA E PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS --------------------48
5.3 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DOS ÁCIDOS HÚMICOS E FÙLVICOS-------49
5.3.1 Extração dos ácidos húmicos e fúlvicos-----------------------------------------------49
5.3.2 Purificação em cromatografia de trocas iônicas utilizando colunas
cromatográficas----------------------------------------------------------------------------------49
5.3.2.1 Tratamento da resina de troca iônica na purificação dos ácidos húmicos--------49
5.3.3 Teste de purificação do ácido húmico-------------------------------------------------50
5.4 CARACTERIZAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS HÚMICAS----------------------------50
5.4.1 Espectroscopia na região do ultravioleta e visível----------------------------------50
5.4.2 Espectroscopia na região do infravermelho-----------------------------------------51
18

5.5 MICRORGANISMOS E PREPARO DO MEIO DE CULTURA---------------------52

5.5.1 Meio de Cultura---------------------------------------------------------------------------53
5.5.2 Manutenção dos microrganismos------------------------------------------------------53
5.5.3 Cultivo em meio líquido-----------------------------------------------------------------54
5.5.4 Adição dos ácidos húmicos da Sigma-Aldrich® e extraídos e dos ácidos
fúlvicos na água ---------------------------------------------------------------------------------54
5.5.5 Teste de Adsorção-------------------------------------------------------------------------55
5.5.6 Uso do reator estático (Jar Test)-------------------------------------------------------56
5.5.6.1 Preparação da Amostra para uso no reator estático (Jar Test)---------------------56
5.5.6.2 Coleta para realização das análises enzimáticas e de espectrofotometria de
ultravioleta e visível (UV-vis) e infravermelho-----------------------------------------------57
5.6 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA---------------------------------57
5.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA------------------------------------------------------------------58
5.8 CÁLCULOS DOS ÍNDICES DOS PERCENTUAIS DE REMOÇÃO DOS
ÁCIDOS E DE ADSORÇÃO-------------------------------------------------------------------59
5.9 FLUXOGRAMA DAS ATIVIDADES E MÉTODOS UTILIZADOS---------------61
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO------------------------------------------------------------62
6.1 EXTRAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS HÚMICAS, PUFICAÇÃO E

CARACTERIZAÇÃO DOS ÁCIDOS HÙMICOS------------------------------------------62
6.1.1 Extração das substâncias húmicas-----------------------------------------------------62
6.1.2 Purificação dos ácidos húmicos--------------------------------------------------------64
6.1.3 Características das substâncias húmicas pelo exame no infravermelho e
ultravioleta e visível-----------------------------------------------------------------------------64
6.2 ANÁLISES DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS-------------------------------------67
6.2.1 Resultado da atividade enzimática de Pycnoporus sanguineus no ensaio com o
ácido fúlvico na agitadora Shaker ----------------------------------------------------------68
6.2.2 Resultado da atividade enzimática de Trametes villosa no ensaio com o ácido
fúlvico na agitadora Shaker -------------------------------------------------------------------70
6.2.3 Teste de Tukey da avaliação da atividade enzimática de Trametes villosa na
produção de LiP----------------------------------------------------------------------------------73
6.2.4 Teste T Pareado da atividade enzimática de Pycnoporus sanguineus e de T.
villosa com Ácido Fúlvico----------------------------------------------------------------------74

19

6.2.5 Resultado da produção enzimática por Pycnoporus. sanguineus e Trametes

villosa na presença de ácido húmico adquirido da Sigma-Aldrich® e do ácido
húmico extraído----------------------------------------------------------------------------------75
6.2.6 O crescimento da massa fúngica-----------------------------------------------------------------79
6.2.7 Resultados das análises com o espectrofotômetro ultravioleta e visível (UV-
vis) para as amostras de P. sanguineus e T. villosa em presença de ácido fúlvico e
sua correlação com a produção enzimática------------------------------------------------81
6.2.8 Análises de ultravioleta e visível para as amostras de fungos em presença de
ácido húmico e as correlações com a suas produções enzimáticas.--------------------91
6.2.9 Teste de adsorção por T. villosa e P. sanguineus com o ácido fúlvico---------95
6.2.10 Teste de adsorção por P. sanguineus e T. villosa com o ácido húmico da
Sigma-Aldrich® e o ácido húmico extraído-----------------------------------------------100
6.3 PRODUÇÃO ENZIMÁTICA E UTILIZAÇÃO DO REATOR ESTÁTICO (JAR
TEST)---------------------------------------------------------------------------------------------102
6.3.1 Resultado da produção enzimática com a utilização do reator estático (Jar
Test) das amostras de P. Sanguineus e T. villosa ----------------------------------------102
6.3.2 Resultados de espectrofotometria de ultravioleta e visível (UV-vis) dos experimentos
no reator estático (Jar Test)---------------------------------------------------------------------------105
7 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES-----------------------------------------------112
REFERÊNCIAS--------------------------------------------------------------------------------114
APÊNDICE A- ATIVIDADE ENZIMÁTICA-------------------------------------------121

20

1 INTRODUÇÃO
Os problemas ambientais existentes no mundo de hoje são extremamente

preocupantes, desafiam a inteligência humana e ameaçam a existência terrestre. A água
é um recurso ambiental renovável que vem sendo amplamente degradada e esgotada.
Isso ocorre devido à urbanização crescente e de forma desordenada o que
agrava e compromete os recursos hídricos, trazendo danos aos sistemas públicos de
tratamento já implantados promovendo a sua sobrecarga e gerando operações com
deficiências (MIRANDA e TEIXEIRA, 2004).
Somente combinando pesquisas e estudos sobre tratamento de água e pré –
tratamento, é que poderemos minimizar o comprometimento dos recursos hídricos como
desenvolver medidas mitigadoras que poderão evitar a diminuição dos recursos hídricos
como garantir o abastecimento e a qualidade da água tratada.
Conforme a resolução 357 – CONAMA, existem cinco classificações em
ordem decrescente de qualidade da água. Considera-se ainda que este enquadramento
esteja baseado não necessariamente no estado atual do corpo d’água, mas nos níveis de
qualidade que deveriam possuir para atender às necessidades da comunidade. A Classe
2, diz respeito às águas que podem ser destinadas ao abastecimento para consumo
humano, após tratamento convencional, tratamento este que deve deixar a água própria
para o consumo humano e promova a remoção da cor.
A cor que quando presente em águas brutas é geralmente ocasionada pela
presença de substâncias húmicas (SHs). As Substâncias húmicas (SHs), matéria
orgânica em diferentes estágios de degradação, são definidas como macromoléculas e
formadas pela transformação de biomoléculas, durante o processo de decomposição de
resíduos vegetais e animais presentes no ambiente, representando os componentes mais
estáveis da matéria orgânica. Suas propriedades de complexação, biodisponibilidade de
metais, transporte, aumento da solubilidade e disponibilidade de nutrientes, alta
capacidade de retenção de água, conservação do solo e interações com pesticidas
desempenham importante papel nas propriedades químicas e físicas do solo e têm sido
objeto de estudos (ROSALES et al., 1999; ROCHA et al., 2000; SARGENTINI
JUNIOR et al., 2001).

21

As SHs possuem natureza heterogênea e complexa. Pouco se sabe sobre sua

estrutura química e apresentam-se como misturas heterogêneas de moléculas
polidispersas com elevada massa molar. Possuem alto teor de grupos funcionais
contendo oxigênio na forma de carboxilas, hidroxilas fenólicas e carbonilas
(SARGENTINI JUNIOR et al., 2001).
Devido suas características estruturais as SHs podem interagir com metais e
compostos orgânicos como, por exemplo, pesticidas presentes no ambiente. Para
compreender o comportamento das SHs no ambiente, estas têm sido estudadas sob
diferentes aspectos: caracterização de estruturas parciais, determinação de constantes de
equilíbrio de espécies metal-SHs, acidez e labilidade relativa de metais (SARGENTINI
JUNIOR et al., 2001).
Entretanto, para trabalhar com SHs procedimentos adequados para extração
e fracionamento são de fundamental importância. Fracionamentos baseados em
diferenças de solubilidade, tamanho molecular, densidade de carga, precipitações com
íons metálicos e características de adsorção são adequados para separar SHs em
diferentes frações (ROCHA et al., 2000).
Estas SHs são as principais causas da cor na água, possuem características
hidrofílicas e compreendem os ácidos húmicos e fúlvicos. Em termos de propriedades
químicas e implicações para o tratamento de água, a fração da matéria orgânica
designada como SHs é considerada mais importante (WIECHETECK, et al., 2004).
A importância da remoção das SHs se deve ao fato delas conferirem
características indesejáveis à água distribuída, com possibilidade de formação de
subprodutos da pré-oxidação e desinfecção, complexar-se com metais pesados e
micropoluentes orgânicos e causar cor, ou podem ser associados à presença de
compostos orgânicos em águas destinadas ao uso doméstico ou industrial. Estes
compostos complexam-se facilmente com óxidos e interagem com argilo-minerais,
ácidos graxos e pesticidas, promovendo sua solubilização. Por estarem envolvidos com
o metabolismo e respiração celular, alteram significativamente o ambiente. Certos
compostos orgânicos, quando presentes em águas de abastecimento, podem causar
sabor e odor, e proporcionar condições para o desenvolvimento de microrganismos,
prejudicando a qualidade bacteriológica da água distribuída (JULIO et al., 2006).
Quando compostos orgânicos não são removidos no tratamento de água,
eles reagem com o cloro, que é adicionado na etapa de pré-desinfecção, gerando os
compostos organoclorados que são extremamente prejudiciais à saúde. Novas

22

tecnologias e processos de tratamento para a remoção de matéria orgânica vêm sendo

estudados, objetivando a redução ou eliminação de SHs e proporcionando maior
biodegradabilidade das frações orgânicas (WIECHETECK, et al., 2004). Dentre estes
estudos, os com microrganismos tem obtido papel de destaque, principalmente aqueles
em que os microrganismos são fungos.
Os fungos exercem papel importante dentro do saneamento, pois atuam nos
processos de transformação dos resíduos orgânicos, onde funcionam como recicladores
de matéria nos diversos ecossistemas. O potencial fúngico para degradar polímeros tem
sido amplamente estudado e em muitos casos aplicado para remoção de compostos de
difícil degradação, podendo promover a degradação de compostos aromáticos, através
de sistemas enzimáticos. E algumas espécies ainda podem ser utilizadas para degradar
xenobióticos, deslignificar e descolorir (SAMPAIO et al., 2004).
As transformações da SHs ainda não são bem compreendidas na presença
de microrganismos do solo. Estes microrganismos, como os fungos da podridão-branca,
podem transformar as substâncias húmicas e até descolorir, modificando as
propriedades dos ácidos húmicos (REZACOVA E GRYNDLER, 2006). Devido a estes
fatores e que o tratamento de água com enzimas fúngicas bem como a extração e
caracterização das SHs e o método de atuação destas enzimas fúngicas na remoção das
substâncias húmicas na água será o enfoque dado a este trabalho.

23

2 JUSTIFICATIVA
Devido a enorme necessidade de sistemas de tratamento de água serem alto

sustentáveis e que não gerem resíduos e que evitem a formação de subprodutos como
também promovam a melhoria da água tratada apresentando potabilidade adequada e o
mais importante com baixo custo operacional, foi que se pensou na utilização de
enzimas fúngicas para a realização do estudo de remoção das substâncias húmicas, já
que estas além de não gerarem resíduos são biodegradáveis e não formam compostos
indesejáveis.
Os processos convencionais de tratamento de água podem apresentar
limitações e inconvenientes, como a necessidade de grandes áreas de instalação e altos
custos para implementação. Por isso, ao longo das últimas décadas, pesquisadores têm
desenvolvido métodos e técnicas alternativas, como o tratamento com microrganismos,
que usa o potencial biológico para o pré-tratamento da água. Esta técnica, se bem
estudada, pode contribuir como tratamento alternativo ou complementar aos sistemas
convencionais (físico-químicos).
As maiores vantagens dos sistemas biológicos são a portabilidade, o uso de
pequenos espaços para a instalação, mas também apresenta desvantagens como
necessidade de integrar esses sistemas a outros tratamentos convencionais.
Juntamente com essa necessidade de se conseguir técnicas de tratamentos de
água alternativos, a remoção das substâncias húmicas também se faz necessária, mesmo
sendo gerada de uma fonte natural. As substâncias húmicas são indesejáveis pelas
seguintes razões: (1) elas são irritantes esteticamente; (2) elas podem facilmente formar
complexos com metais pesados e poluentes orgânicos hidrofóbicos, tais como
pesticidas, por causa de sua alta concentração de grupos funcionais ácidos e tamanho
molecular grande, podendo alterar a toxicidade e potencial de bioacumulação desses
poluentes; (3) podem formar compostos cancerígenos, como compostos orgânicos
halogenados formados durante a cloração da água potável, como resultado de reações
entre o material húmico e cloro (ZHOU E BANKS, 1993).
O abastecimento de água com a presença das substâncias húmicas, pode pôr
em risco a vida das pessoas, pois estes não estão consumindo só o material orgânico de
cor, mas também metais pesados e poluentes hidrofóbicos associados com compostos

24

húmicos. Sendo, portanto essencial que as substâncias húmicas sejam removidas da

água antes da distribuição da água potável (ZHOU E BANKS, 1993).
A crescente demanda por tecnologias eficazes e econômicas para remoção
de cor levou à investigação de um processo biológico, que utilizasse a capacidade de
degradação e de adsorção do material biológico para a remoção das substâncias húmicas
bem como de uma nova técnica no pré-tratamento de água.
O processo que ainda está sendo usado no tratamento da água para a
remoção de ácidos húmicos e da cor que ele promove é a coagulação, que possui certas
desvantagens. A quantidade de coagulantes utilizado é excessivo, o lodo resultantes em
certas ETAs não tem um destino final adequado, a concentração elevada de alumínio em
águas tratadas é também motivo de preocupação por causa de seus efeitos adversos à
saúde, especialmente para crianças. Técnicas mais avançadas como adsorção com
carbono ativado são de eficácia limitada na remoção de substâncias húmicas de água,
além disso, o carvão ativado tem um custo muito alto de fabricação e também um custo
altíssimo para ser regenerado (ZHOU E BANKS, 1993).
Um processo bastante utilizado para estas remoções são os processos
biológicos, que são extremamente fundamentais, pois são métodos baratos e de fácil
acesso. Os microrganismos responsáveis por este tratamento produzem enzimas que
degradam substâncias, por isso tem se tornando um método cada vez mais viável.
Apesar disso, antes de sua utilização, deve ser feito um estudo de viabilidade para cada
situação, já que ainda não há um tratamento padrão que possa ser utilizado para a
maioria dos casos.
O emprego de enzimas fúngicas na área de saneamento tem sido de
fundamental importância, já que os fungos possuem vantagens se comparados aos
sistemas químicos e físicos que requerem manutenção e mão de obra qualificada e de
constantes reparos, além de ser um processo natural e que não gere nenhum subproduto
poluente.
O enfoque dado a este trabalho é o tratamento de água por enzimas
fúngicas.

25

3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL

Produzir enzimas fenoloxidases, peroxidases por fungos de decomposição,
para serem utilizados na remoção e ou na degradação das substâncias húmicas, extraídas
do solo, e adicionadas à água de estudo.
3.1.2 Objetivos específicos:
• Extrair, purificar ácidos húmicos e fúlvicos de amostras de solo de uma área do
município de Goiânia – GO;
• Caracterizar os ácidos húmicos destas amostras de solo;
• Solubilizar os ácidos húmicos e fúlvicos em água para tratamento com fungos;
• Determinar enzimas fúngicas (peroxidases e fenoloxidases) que são responsáveis
pela degradação dos ácidos húmicos e fúlvicos;
• Verificar a viabilidade de tratamento (degradação) destas substâncias por meio
das enzimas fúngicas;
• Verificar quais dos fungos utilizados no estudo são melhores produtores
enzimáticos e melhor consegue remover os ácidos húmicos extraídos e
adquiridos da Sigma-Aldrich® e o ácido fúlvico;
• Avaliar se houve adsorção fúngica dos ácidos húmicos e fúlvicos;
• Verificar a eficácia do tratamento com enzimas fúngicas na remoção dos ácidos
em estudo com o uso de reator estático (Jar Test);

26

4 REVISÃO DE LITERATURA
4.1 SUBSTÂNCIAS HÚMICAS
A água para abastecimento humano requer tratamento, este por sua vez
depende de fatores bióticos e abióticos que regem o funcionamento dos ecossistemas
aquáticos, que influenciam diretamente na qualidade do corpo d’água. Um composto
que pode influenciar na qualidade das águas após tratamento é oriundo da degradação
biológica do material orgânico tanto de origem vegetal ou animal depositado nos solos e
nas águas que são conhecidas como SHs (SANTOS et al., 2008).
A matéria orgânica natural (MON) é formada por processos biológicos
naturais e provém de reações químicas, biológicas e fotoquímicas, que ocorrem devido à
presença de subprodutos da decomposição de animais e vegetais. Muitos constituintes
da água natural constituem uma coleção de ácidos orgânicos polimerizados, chamados
de substâncias húmicas, e outros tipos de compostos como ácidos carboxílicos,
aminoácidos e carboidratos (TANGERINO E DI BERNARDO, 2002).
Em termos de propriedades químicas e implicações para o tratamento de
água, a fração da MON designada como substância húmica é considerada mais
importante (WIECHETECK et al., 2004). SHs são formadas pela transformação de
biomoléculas, durante o processo de decomposição de resíduos vegetais e animais
presentes no ambiente (SARGENTINI JUNIOR et al., 2001).
Nos últimos anos, o estudo da matéria orgânica do solo tem ganhado
destaque devido à crescente preocupação existente com a qualidade do meio ambiente e
que incentiva o estudo da matéria orgânica devido ao seu papel decisivo em diversos
aspectos relacionados ao solo e à água (LOSS et al., 2006). Ela é naturalmente
decomposta por processos bioquímicos e de biossíntese, envolvendo microrganismos
diversos. Desta decomposição, resultam dois tipos de substâncias: substâncias não
húmicas (proteínas, aminoácidos, polissacarídeos, etc.) e as SHs que são divididas em
ácidos húmicos (AHs), ácidos fúlvicos (AFs) e huminas (SIMÕES et al., 2006;
MEDEIROS E BROCCHI, 2007).
A MON em sistemas aquáticos também é constituída principalmente por
substâncias húmicas (SHs), que também são formadas através da decomposição
microbiológica de resíduos de plantas e animais e de sua interação com argila e demais
constituintes do solo, como também pela atividade biológica de algas e outros

27

microrganismos (TANGERINO E DI BERNARDO, 2005, ZÚÑIGA et al., 2006). As

SHs representam a parte mais dinâmica e abundante da MON, apresentando na sua
estrutura partes alifáticas e aromáticas que variam em função de diversas variáveis
como origem, clima, etc. (ZÚÑIGA et al., 2006).
4.1.1 Composição das substâncias húmicas
A crescente demanda de consumo de água proveniente do abastecimento

tem aumentado a procura por novas fontes de captação de água, próximos aos centros
consumidores, em lagos ou represas de áreas degradadas que apresentam substâncias
húmicas dissolvidas (SANTOS E MATSUMOTO, 2002).
A MON é amplamente distribuída nos solos, águas naturais e sedimentos.
Mudanças hidrológicas e da composição do solo influenciam na quantidade de matéria
orgânica em ambientes aquáticos e na sua natureza química, podendo provocar
diferentes efeitos biogeoquímicos no ecossistema (AZEVEDO et al., 2006; AZEVEDO
E NOZAKI, 2008). Assim, as características químicas da MON são influenciadas pela
fonte do material (alóctones ou autóctones) e pelos processos biogeoquímicos
envolvidos no ciclo do carbono nos sistemas terrestres e aquáticos (AZEVEDO et al.,
2006).
Os ácidos fúlvicos, ácidos húmicos e humina são as três frações principais
do carbono orgânico total do solo, sendo a humina representada por cerca de 30 a 80%.
Estas frações interagem com o material mineral, interferindo, assim, na dinâmica de
nutrientes no sistema solo-planta, e exercendo um papel primordial na manutenção da
fertilidade do solo (LOSS et al., 2006).
A humina é a fase sólida do solo enquanto que os ácidos são obtidos numa
mistura líquida. Os ácidos fúlvicos e húmicos possuem grande quantidade de grupos
funcionais, o que facilita a interação deles com o meio no qual estão inseridos (POLLI
et al., 2008).
Assim, a caracterização de importantes propriedades físicas e químicas das
SHs dissolvidas tais como solubilidade, comportamento de adsorção, acidez, capacidade
complexante com íons metálicos, distribuição de grupos funcionais/estruturas reativas
etc. pode ser feita em função da distribuição dos diferentes tamanhos moleculares
(ROCHA et al., 2000).

28

As SHs são macro-moléculas complexas, constituídas de diferentes

estruturas aromáticas e alifáticas, ricas em grupos funcionais, contendo oxigênio. Estas
estruturas estão ligadas a peptídeos e a outros compostos contendo nitrogênio e
carboidratos em pequenas quantidades (AZEVEDO E NOZAKI, 2008).
Devido à natureza heterogênea e complexa das SHs, pouco se sabe sobre
sua estrutura química e apresentam-se como misturas heterogêneas de moléculas
polidispersas, constituídas de uma grande porção do carbono orgânico total presentes
nos ambientes aquáticos e terrestres, definidas como macromoléculas com elevada
massa molar e estruturas complexas e variadas (SARGENTINI JUNIOR et al., 2001;
MOREIRA et al., 2008).
As SHs são associações supramoleculares de moléculas heterogêneas
relativamente pequenas. Este agregado não está associado por ligações covalentes, mas
por interações mais fracas como as de Van der Waals e pontes de hidrogênio
(AZEVEDO E NOZAKI, 2008).
Para compreender o comportamento das SHs no ambiente, estas têm sido
estudadas sob diferentes aspectos: caracterização de estruturas parciais, determinação de
constantes de equilíbrio de espécies metal-SH, acidez, labilidade relativa de metais, etc.
As SHs são moléculas grandes com diversos grupos funcionais, como
carbonilas, carboxilas e outros, e se dividem em ácidos fúlvicos (solúvel), ácidos
húmicos (solúvel, se pH>2) e humina (insolúvel), sendo resultantes de reações
químicas, fotoquímicas e microbiológicas que ocorrem durante a degradação da matéria
vegetal e animal. As SHs têm sido usadas para representar os componentes orgânicos
naturais presentes na água, em virtude de sua origem natural e de sua alta concentração
na água. Elas apresentam características muito variáveis, mas em geral são compostas
principalmente de carbono orgânico húmico, ácidos húmicos (figura 1 – A) ácidos
fúlvicos (figura 1 – B) em porcentagens variáveis, dependendo do local de origem
(TANGERINO E DI BERNARDO, 2005; MEDEIROS E BROCCHI, 2007).

29

Figu
ura 1 (A): Estado
E da arte
a do concceito estrutu
ural de um ácido húmiico (A) (BR
RUM,
20055).
Figu
ura 1 (B): Estrutura
E pro
oposta de um
m ácido fúlv
vico (B) (ST
TEFFEN, 22003).
As SHs
S interagem facilmeente com esp
pécies metáálicas e alguumas espéciies de
comppostos orgâânicos. Entrretanto, essaas interaçõees são fortemente depeendentes dee suas
caraccterísticas estruturais e dos tamanhhos molecullares. Por issto, para trab
abalhar com
m SHs,
proceedimentos adequadoss para exttração e fracionameento são dde fundam
mental
impoortância paraa o seu enteendimento ((MOREIRA
A et al., 2008
8).

30

4.1.2 Fracionamento das substâncias húmicas
A MON do solo constitui o maior reservatório de carbono da superfície

terrestre. Este reservatório é dinâmico, podendo variar em decorrência de práticas de
manejo. O fracionamento químico da MON do solo é normalmente utilizado para
quantificar as frações húmicas do solo, sendo este um procedimento bastante conhecido
(LOSS et al., 2006).
As frações das SHs como os ácidos fúlvicos (AFs) são originados,
principalmente, pela associação de pequenas moléculas hidrofílicas que apresentam
grupos funcionais ácidos, os quais mantêm seus constituintes solúveis em qualquer
faixa de pH. Já os ácidos húmicos (AHs) são originados, principalmente, pela
associação de compostos hidrofóbicos, que são estáveis em pH neutro devido às forças
dispersivas hidrofóbicas. Com a diminuição do pH, ocorre aumento progressivo da
estrutura molecular dos AHs, através das interações por pontes de hidrogênio, até
ocorrer sua floculação em baixos valores de pH (AZEVEDO E NOZAKI, 2008).
O fracionamento químico da matéria orgânica com base na sua solubilidade
em meio ácido e alcalino permite separar e quantificar estas frações, as quais
posteriormente podem ser caracterizadas quanto à composição química (ANTUNES et
al., 2007).
Quando as SHs são fracionadas, de acordo com sua massa molecular,
diferenças na absorbância são observadas; em particular, frações de menor massa molar
apresentam maior intensidade de fluorescência e menor absorbância que as frações de
maior massa molar, sendo uma possível explicação para este fenômeno o fechamento da
posição das subunidades hidrofóbicas, dentro do esqueleto estrutural da macromolécula,
mascarados pelos grupos hidrofílicos (AZEVEDO et al., 2006).
4.1.3 Medidas indicadoras de substâncias húmicas na água
A concentração de carbono orgânico dissolvido na água, a capacidade de

absorbância UV 254 nm e a potencialidade de formação de trihalometanos são medidas
indiretas indicadoras da presença de substâncias húmicas na água (WIECHETECK et
al., 2004). A caracterização analítica das substâncias húmicas baseia-se na distribuição
do peso molecular aparente e na composição dos grupos carboxílicos e fenólicos
(WIECHETECK et al., 2004).

31

As técnicas espectroscópicas de absorbância (UV-Vis) têm sido aplicadas,

nas últimas décadas, para caracterizar, diferenciar e classificar a matéria orgânica
natural (AZEVEDO E NOZAKI, 2008). Apesar de que os espectros de absorção das
substâncias húmicas na região do ultravioleta e visível serem poucos característicos
(PAULA, 1992).
Por sua estrutura complexa e variável, as SHs apresentam importante papel
ambiental na biodisponibilidade de metais, no transporte, acúmulo e concentração de
espécies metálicas; na interação com compostos orgânicos antropogênicos; na cadeia
alimentar planctônica, através da alteração da turbidez e da interação com nutrientes,
modificando a produção primária; como fonte de carbono para a cadeia alimentar e,
também, na alteração da zona fótica (AZEVEDO E NOZAKI, 2008).
Normalmente, as SHs em lagos são de origem terrestre, mas podem ser
provenientes de plantas aquáticas da região litorânea (macrófitas aquáticas) ou do
fitoplâncton. A principal diferença é a presença de lignina modificada existente nas SHs
derivadas do solo, apresentando grande quantidade de anéis aromáticos e grupos
contendo oxigênio. Já as SHs derivadas das algas apresentam maior quantidade de
carbono alifático. Estas diferenças estruturais são as principais responsáveis pelas
diferenças nas análises espectroscópicas na região do ultravioleta e visível e na emissão
de fluorescência (AZEVEDO E NOZAKI, 2008).
As substâncias húmicas são constituídas por ácidos húmicos e fúlvicos que
provêem da degradação química e biológica das plantas e resíduos animais, e da
atividade de síntese microbiana, e representam uma fração importante da matéria
orgânica natural (MON) dissolvida presente em ambientes aquáticos. A MON é
constituída por 40% de ácidos fúlvicos, 10% de ácidos húmicos e 50% de produtos
indefinidos dos quais 40% são ácidos hidrofílicos. A importância relativa da fração
húmica está na estimativa da absorbância específica a UV 254 nm (SUVA), definida
como a razão entre a absorbância ao UV 254 nm, em m-1 (que quantifica as substâncias
húmicas), por unidade de carbono orgânico dissolvido (COD), em mg C/L (que
quantifica a matéria orgânica dissolvida) (TEIXEIRA et al., 2001).

32

4.1.4 Extração e purificação das substâncias húmicas
A primeira etapa necessária para o estudo das substâncias húmicas é a sua

extração. Vários fatores influenciam no procedimento de extração e muitas questões
ainda estão por ser respondidas (ROSA et al., 2000).
Das condições experimentais utilizadas no procedimento de extração
dependerão as futuras interpretações. Assim, é importante o desenvolvimento de
métodos analíticos que permitam extrair SHs de solos, com mínimas alterações nas
estruturas originais, em tempo relativamente curto, elevado rendimento e baixo teor de
contaminantes (ROSA et al., 2000).
Para a purificação das SHs usa-se a cromatografia de trocas iônicas. As
razões que fazem da cromatografia de troca iônica uma técnica de separação eficiente
são sua ampla aplicabilidade, seu alto poder de resolução, sua alta capacidade e a
simplicidade e facilidade de controlar o método (LIMA, 2001).
Santos et al. (2008) utilizou para extração e purificação das SHs a resina
Amberlite XAD-7 (Merck), de estrutura macromolecular não-iônica, sendo uma das
técnicas mais empregada. É usualmente usada em condições isocráticas, onde as
concentrações da solução permanecem constante.
Na literatura existem diversos procedimentos descritos sobre extração de
SHs de solos. Entretanto, ainda não existe uma metodologia oficialmente adotada
(ROSA et al., 2000; BOTERO et al., 2009). A Sociedade Internacional de Substâncias
Húmicas (IHSS) tem recomendado para extração de SH de solos um procedimento
padrão baseado em 4 horas de extração com solução de NaOH 0,1 mol/L à temperatura
ambiente na razão solo/extrator 1:10 (m/v), sob atmosfera de nitrogênio (ROSA et al.,
2000; BOTERO et al., 2009).
A maioria dos métodos de extração de SHs do solo se baseia em diferenças
na solubilidade das mesmas em soluções ácidas ou alcalinas e posterior obtenção de três
principais componentes: ácido húmico (FAH), que é solúvel em extrato alcalino, mas
precipita-se sob acidifição; ácido fúlvico (FAF), que é a fração que permanece em
solução quando o extrato alcalino é acidificado, e humina (HUM) que é a fração que
não pode ser extraída de solos e sedimentos por diluição ácida ou básica, ou seja, é o
resíduo que sobra da separação das outras duas frações (LOSS et al., 2006).
Para melhor compreender o comportamento das SHs, estas têm sido
estudadas sob diferentes aspectos: caracterização de estruturas parciais, determinação de

33

constantes de equilíbrio de espécies metal-SHs, labilidade relativa de metais etc. (ROSA

et al., 2000).
Diferentes técnicas têm sido aplicadas para caracterizar, diferenciar e
classificar a matéria orgânica natural, entre elas as SHs (AZEVEDO et al., 2006).
Conseqüentemente, amostras extraídas por métodos diferentes geralmente não são
comparáveis (SARGENTINI JUNIOR et al., 2001). Como também por diferentes
extratores. Alguns autores têm utilizado extratores brandos como pirofosfato de sódio,
agentes complexantes, ácido fórmico, misturas ácidas e solventes orgânicos (ROSA et
al., 2000).
4.1.5 Remoção de substâncias húmicas
A importância do estudo da remoção de MON, designadamente das

substâncias húmicas, deve-se à sua presença na água poder afetar a qualidade desta de
várias formas: cor indesejável, complexação com metais e produção de concentrações
de metais que excedem a solubilidade normal, e reação com o cloro para produção de
trihalometanos (THM), com implicações na saúde pública. As SHS são ainda agentes
colmatantes das membranas de Ultra Filtração (TEIXEIRA et al., 2001).
Novas tecnologias e processos de tratamento para a remoção de MON vêm
sendo estudados, objetivando a redução ou eliminação de substâncias húmicas e
proporcionando maior biodegradabilidade das frações orgânicas (WIECHETECK et al.,
2004).
A coagulação é o principal mecanismo de remoção de substâncias húmicas
por neutralização de cargas e depende da dosagem de coagulante e do pH de coagulação
(WIECHETECK et al., 2004).
A medida de remoção de substâncias húmicas é difícil de ser efetuada. É
normalmente feita através de parâmetros substitutivos como cor verdadeira, absorbância
254 nm, COD, etc. (TANGERINO E DI BERNARDO, 2005). As Substâncias húmicas
aquáticas (SHA) compreendem cerca de um terço até a metade do carbono orgânico
dissolvido (COD) na água e são constituídas em sua maior parte por ácidos hidrofóbicos

34

4.1.6 Interação das substâncias húmicas com metais
O interesse tecnológico pelas SHs se justifica em função das propriedades

destas substâncias tanto como agentes fertilizantes como por adsorverem substâncias
tóxicas, como pesticidas e metais pesados, pois devido as suas características estruturais
as SHs podem interagir com metais e compostos orgânicos presentes no ambiente. Por
isso, estes compostos vêm sendo alvo de diversos estudos também no âmbito da
Engenharia Ambiental (ROSA et al., 2000; MEDEIROS E BROCCHI, 2007).
Quando compostos orgânicos não são removidos no tratamento de água,
eles reagem com o cloro, usualmente adicionado na etapa de desinfecção, gerando os
compostos organoclorados que são extremamente prejudiciais à saúde (WIECHETECK
et al., 2004). Podendo produzir trihalometanos (THMs), ácidos haloacéticos (HAAs) e
uma variedade de outros subprodutos de desinfecção (SPD). Subprodutos estes que tem
mostrado causar câncer de bexiga e do trato digestivo em animais de laboratório
(CAMPOS et al., 2006).
SHAs com estruturas poliméricas e massa molar variável que contem à
presença de radicais cetonas podem produzir halofómios também conhecidos como
trihalometanos que são substâncias cancerígenas, e são produzidos quando há a
interação com compostos halogenados oriundos da pré-cloração da água (SANTOS et
al., 2008).
A importância da remoção das SHs se deve ao fato de elas conferirem
características indesejáveis à água distribuída, destacando-se, a possibilidade de
formação de subprodutos da pré-oxidação e desinfecção, complexar-se com metais
pesados e micropoluentes orgânicos e causar cor (JULIO et al., 2006).
Outros problemas ainda podem ser associados à presença de compostos
orgânicos em águas destinadas ao uso doméstico ou industrial. Estes compostos
complexam-se facilmente com óxidos e interagem com argilo-minerais, ácidos graxos e
pesticidas, promovendo sua solubilização. Por estarem envolvidos com o metabolismo e
respiração celular, alteram significativamente o ambiente. Certos compostos orgânicos,
quando presentes em águas de abastecimento, podem causar sabor e odor, e
proporcionar condições para o desenvolvimento de microrganismos, prejudicando a
qualidade bacteriológica da água distribuída. Sua presença também tem sido relacionada
com problemas de corrosão em sistemas de distribuição e interferem nos processos de
desmineralização, proporcionando saturação acelerada das resinas trocadoras de íons ou

35

colmatação das membranas. As SHs são também fortemente adsorvidas em carvão

ativado reduzindo seu tempo de vida e tornando-o sem utilidade para a remoção de
poluentes (JULIO et al., 2006).
As SHs podem reagir com o ozônio e formar espécies radicalares em
solução aquosa, como radicais hidroxilas (OH), aldeídos, cetoácidos e ácidos
carboxílicos que contribuem para biodegradabilidade do carbono orgânico contido na
água. Se a formação desses produtos de oxidação não for apropriadamente controlada
pode levar à formação de biofilmes e o reaparecimento de microrganismos no sistema
de distribuição de água (CAMPOS et al., 2006).
As SHs são formadas a partir da biodegradação de materiais orgânicos
(animal e vegetal) no solo (POLLI et al., 2008). As SHs são formadas por compostos
mais estáveis, de maior complexidade química e elevados pesos moleculares
denominados fração ácidos húmicos (AH) e fração ácidos fúlvicos (AF) (ANTUNES et
al., 2007). Podem ser divididas quanto ao seu grau de solubilidade frente a diferentes
valores de pH em: ácidos húmicos, ácidos fúlvicos e humina (POLLI et al., 2008).
SHs estão presentes na água, solos e sedimentos e são de fundamental
importância para o crescimento de plantas e para o controle bioquímico do carbono
orgânico no ecossistema global (CAMPOS et al., 2007)
Dentre as várias pesquisas existentes duas teorias a respeito da estrutura das
SHs se destacam; uma acredita que as SHs são formadas por macromoléculas enquanto
a outra supõe que seriam formadas por pequenas e heterogêneas moléculas de várias
origens que se auto-organizam em uma supramolecular conformação (CAMPOS et al.,
2007).
As substâncias húmicas são caracterizadas pela sua solubilidade em água a
um determinado pH. Os ácidos húmicos e os ácidos fúlvicos são polieletrólitos
aniônicos com grau de ionização dependente do pH. Os autores relatam que
pesquisadores realizaram uma titulação potenciométrica em soluções de ácidos húmicos
e ácidos fúlvicos e observaram dois pontos de inflecção, características dos grupos
fenólicos (pH 8,0 a 8,2) e dos grupos carboxílicos (pH 4,6 a 4,9) (WIECHETECK et al.,
2004).
As substâncias húmicas podem ser definidas operacionalmente de acordo
com sua solubilidade em água. O ácido húmico (AH) é insolúvel em condições ácidas
(pH < 2); o ácido fúlvico (AF) é solúvel em toda a faixa de pH e a humina é insolúvel
em qualquer valor de pH. As SHs são de ocorrência natural (biogênicas), heterogêneas,

36

apresentam coloração escura, são refratárias e com elevada massa molecular

(AZEVEDO E NOZAKI, 2008).
Substâncias húmicas são formadas pela transformação de biomoléculas,
durante o processo de decomposição de resíduos vegetais e animais presentes no
ambiente e devido à natureza heterogênea e complexa das SHs pouco se sabe sobre sua
estrutura química e apresentam-se como moléculas polidifusas com elevada massa
molar. Possuem alto teor de grupos funcionais contendo oxigênio na forma de
carboxilas, hidroxilas fenólicas e carbonilas. Operacionalmente as SHs são fracionadas
em função de sua solubilidade a diferentes valores de pH em: ácidos húmicos, ácidos
fúlvicos (AF) e humina (ROSA et al., 2000).
Quando as macromoléculas húmicas interagem com íons metálicos formam
diferentes espécies, devido a rearranjos inter e/ou intramoleculares, o complexo metal-
SHA tende a se estabilizar em função do tempo e, conseqüentemente, a labilidade
relativa dos íons metálicos diminui. Assim, em águas com elevada concentração de
matéria orgânica como as do Rio Negro, as substâncias húmicas aquáticas podem agir
como “um tampão”, diminuindo a disponibilidade de íons metálicos para participar de
outras reações no ambiente aquático (SARGENTINI JUNIOR et al., 2001).
4.1.7 Relação da cor nas águas de abastecimento e as substâncias húmicas
A MON em águas de abastecimento tem recebido a atenção de diversos

pesquisadores desde a década de 70. A presença elevada de MON em mananciais para
abastecimento público apresenta aspectos negativos, dentre os quais se podem citar:
confere cor elevada à água bruta, dependendo dos compostos orgânicos presentes, pode
causar odor e sabor, pode gerar subprodutos ao ser exposta a agentes oxidantes e
desinfetantes, como, cloro, dióxido de cloro, ozônio, cloraminas, radiação ultravioleta,
etc., que podem ser tóxicos, cancerígenos, mutagênicos ou teratogênicos e que em
elevadas concentrações e longos períodos de exposição podem causar danos à saúde
pública (TANGERINO E DI BERNARDO, 2005).
A presença de compostos proveniente da decomposição da matéria orgânica
natural (MON) em águas superficiais agrupados em substâncias não húmicas e húmicas,
é a principal causa da cor na água (WIECHETECK et al., 2004). As substâncias
húmicas (SH) são as causadoras da cor amarela ou marrom das águas. Estas substâncias
podem interagir fortemente com uma variedade de oxidantes e desinfetantes que são

37

usados para a purificação da água para consumo humano, particularmente o cloro

A cor das águas naturais é provocada em grande parte pela presença de
compostos orgânicos de origem vegetal, decompostos pela atividade de microrganismos
originando as SHs, como também pode ser devido à presença de metais como, ferro e
manganês (CAMPOS et al., 2006; JULIO et al., 2006). De modo geral, pode-se dizer
que as SHs são uma mistura heterogênea de substâncias de natureza química diversa,
constituídas de ácidos amorfos, predominantemente aromáticos, hidrofílicos, com
cadeias polieletrolíticas. Para os valores de pH comumente encontrados em águas
naturais, as SHs apresentam carga superficial negativa e a cor de uma amostra depende
do pH do meio, verificando-se uma diminuição da cor com aumento do pH (JULIO et
al., 2006).
Para o estudo de remoção de cor, as SHs são amplamente empregadas para
preparar águas de estudo. A justificativa em seu uso pode ser encontrada no fato de que
cerca de 50 a 70% de todo carbono dissolvido em águas naturais não poluídas, seja
devido a sua presença. As SHs empregadas em estudos podem ser originadas de
diferentes matrizes (solo, turfa e aquática) o que torna essencial a determinação de
algumas de suas principais características para que os resultados possam ser
comparados com outros estudos (CAMPOS et al., 2000).
Quanto maior for à porcentagem de grupamentos contendo oxigênio, na
estrutura das SHs empregadas para dar cor à água, maior será a dificuldade de sua
remoção quanto menor a massa molecular das moléculas de substâncias húmicas,
maiores foram às quantidades de ácidos fúlvicos e quanto maior foi à porcentagem de
ácidos fúlvicos presente nas frações de SHs que causam cor a água, também maior foi à
dificuldade de sua remoção. Estes resultados são importantes para melhorar o
entendimento a respeito da remoção de cor de águas, o que hoje se torna muito relevante

38

4.2 FUNGOS
Os fungos vêm se mostrando hábeis em degradação de produtos tóxicos,

sobrevivendo e crescendo em meios com concentrações elevadas de compostos
recalcitrantes. Isto é possível porque os fungos produzem enzimas extracelulares
oxidativas capazes de quebrar compostos policíclicos aromáticos de cadeia longa em
compostos assimiláveis ao seu metabolismo, atividade que pode ser intensificada com a
adição da glicose um substrato primário, de fácil assimilação, sendo os fungos
filamentosos os mais eficientes na produção de enzimas extracelulares oxidativas
(FREITAS NETO et al., 2007).
Os fungos ainda apresentam uma série de características que os tornam
interessantes para aplicação em sistemas de biorremediação. Eles são capazes de crescer
sob as condições de estresse ambiental que limitam o crescimento bacteriano. E ainda, o
modo de crescimento dos fungos – induzido quimiostaticamente em direção à fonte de
carbono orgânico, através do alongamento e ramificação das hifas – permite a
colonização de grandes áreas. Desta forma, o contato superficial com o contaminante é
otimizado, aumentando sua biodisponibilidade e, conseqüentemente, sua biodegradação
(MOREIRA NETO, 2006).
O uso do tratamento biológico na água utilizando fungos têm por base a
inoculação de microrganismos como fungos basidiomicetos que atuam sobre o
substrato. Estes processos apresentam segurança do ponto de vista ambiental,
principalmente por não utilizarem substâncias químicas durante o processo (SOUZA E
ROSADO, 2009).
4.2.1 Fungos Basidiomicetos
Apesar de existirem formas físicas e químicas para o tratamento de água, os

microrganismos têm sido intensamente estudados com a finalidade de remover
compostos tóxicos do meio ambiente. Estudos indicam fungos basidiomicetos
degradadores de lignina como eficientes na degradação de diversos compostos e de
corantes, além do alto potencial de ação na recuperação de ambientes contaminados.
Estes fungos também conhecidos como fungos da podridão branca, atualmente estão
sendo utilizados em tratamentos de biorremediação, na degradação de poluentes

39

ambientais recalcitrantes e em tratamentos de efluentes industriais (SOUZA E

ROSADO, 2009).
Existem aproximadamente cerca de 25.000 espécies de fungos
basidiomicetos. Estes são conhecidos popularmente por formarem corpos de
frutificação, como cogumelos e orelha-de-pau. Sua fase vegetativa é chamada de
micélio, formado por vários filamentos septados chamados de hifas. Estes fungos
podem ser distinguidos por possuírem basídio, uma estrutura reprodutiva onde ocorre a
meiose (SOUZA E ROSADO, 2009).
Os fungos basidiomicetos são classificados de acordo com as diferenças de
padrões de degradação da madeira que apresentam, levando-se em conta a característica
macroscópica da degradação. Desta forma podem ser divididos em fungos de
degradação ou podridão branca, podridão parda e podridão mole. Os fungos de podridão
branca degradam três componentes principais da madeira: a celulose, a hemicelulose e a
lignina, proporcionando coloração clara na sua degradação (SOUZA E ROSADO,
2009).
Há evidências de que nos basidiomicetos os mecanismos que atuam na
regulação do sistema ligninolítico são os mesmos que atuam na degradação dos
xenobióticos e, portanto podem ser também estimulados pela variação das condições de
cultivo dos fungos. A capacidade de degradação de diferentes classes de xenobióticos
por basidiomicetos ligninolíticos está associada à natureza inespecífica do sistema
enzimático ligninolítico e permite que até mesmo misturas complexas de poluentes
sejam degradadas (MOREIRA NETO, 2006).
A degradação da lignina, de compostos recalcitrantes e de poluentes
orgânicos por fungos da podridão branca como os basidiomicetos constitui um processo
oxidativo, extracelular e relativamente inespecífico, sendo os mais eficientes na
produção de enzimas extracelulares oxidativa (MOREIRA NETO, 2006; FREITAS
NETO et al., 2007). A degradação consiste em um processo multienzimático resultante
da ação coordenada de uma série de enzimas do grupo das oxidoredutases,
representadas principalmente por lacases (Lcc), manganês peroxidases (MnP), lignina
peroxidases (LiPs) e outras oxidases produtoras de peróxido de hidrogênio e de
compostos metabólitos intermediários de baixa massa molecular e outras peroxidases
com ampla atuação, principalmente na atuação de degradação de compostos
recalcitrantes. Os fungos diferem na habilidade de degradação destas substâncias,

40

devido às características individuais qualitativas e quantitativas de suas enzimas

(MOREIRA NETO, 2006; SOUZA E ROSADO, 2009).
Estes fungos secretam enzimas que convertem polímeros externos em
moléculas menores, que são assimiladas e utilizadas como nutrientes. A secreção de
proteínas ocorre durante o crescimento apical das hifas, sendo liberadas pela parede
celular recém-sintetizada (MOREIRA NETO, 2006; SOUZA E ROSADO, 2009).
Um fungo basidiomiceto ligninolítico seletivo intensamente estudado é o
Trametes versicolor, que degrada a lignina não seletivamente. A lignina, constituinte da
parede celular de todas as plantas vasculares, é uma estrutura extremamente complexa.
Na madeira, a lignina pode ser encontrada nas paredes primárias e secundárias das
células, como também nos espaços intercelulares, sendo uma de suas funções a proteção
a planta contra a degradação de suas paredes por microrganismos, função que se deve às
características recalcitrantes, ou seja, de difícil biodegradação (SOUZA E ROSADO,
2009).
Estudos sobre a degradação da lignina por basidiomicetos ligninolíticos
fornecem informações para a aplicação destes fungos em inúmeras pesquisas
envolvendo a biodegradação de diversos xenobióticos (SOUZA E ROSADO, 2009).
4.2.1.1 Sistemas enzimáticos encontrados em fungos basidiomicetos
Enzimas são proteínas com atividade catalítica, constituídas por uma parte
protéica, porém podem estar integradas a outras moléculas, como carboidratos e
lipídeos. Existe uma grande variedade de enzimas, sendo a maioria encontrada em
pequenas quantidades. Algumas enzimas extracelulares são produzidas em grandes
quantidades por certos organismos e são capazes de digerir materiais nutritivos
insolúveis, como celulose, proteínas e amido. Sua utilização é feita em processos
biotecnológicos industriais, ajudando a reduzir a poluição do meio ambiente (SOUZA E
ROSADO, 2009). As enzimas estudadas neste trabalho encontram-se resumidas no
quadro 1, a seguir.

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Quadro 1: Enzimas fúngicas estudadas

Enzimas Catalizador Atuação
Lacase Oxigênio Destoxificação de contaminantes fenólicos;
Polimerizam lignosulfonatos de efluentes sulfito
Lignina Peróxido de Promove reações de desaminação de ácidos
peroxidase hidrogênio aminoaromáticos; Degradação da lignina
Mangânes Peróxido de degradação de xenobióticos recalcitrantes;

peroxidase hidrogênio peroxidação lipídica; Pro-oxidante
Estudos com estas enzimas ligninolíticas torna-se extremamente importante

caracterizar as atividades ligninolíticas presente em determinadas condições de
crescimento do fungo. Alguns parâmetros como: o pH ótimo de atividade e os limites
em que ele se encontra; a temperatura ótima de atividade e estabilidade à temperatura,
assim como, as propriedades cinéticas (Km aparente) são fundamentais para se conhecer
as condições ótimas de atuação destas enzimas (MOREIRA NETO, 2006).
4.2.1.1.1 Enzima lignina peroxidase (LiPs)
A descoberta desta enzima se deu em 1983, quando foi descrita como uma
glicoproteína contendo ferro como grupo prostético, necessitando de peróxido de
hidrogênio (H2O2) para sua atividade. O H2O2 primeiramente oxida a enzima e o
intermediário oxidado, retira um elétron, de núcleos aromáticos formando radicais aril,
que se decompõem espontaneamente via reação de caráter radicalar (SOUZA E
ROSADO, 2009).
Acredita-se que a LiPs pode ter sido formada durante a evolução dos fungos
degradadores de lignina, promovendo reações de desaminação de produtos de ácidos
aminoaromáticos, posteriormente o mecanismo extracelular, com a presença da LiPs,
possibilitou a degradação da lignina (MOREIRA NETO, 2006).
Lignina peroxidase tem a capacidade de degradar diversos compostos
fenólicos e não fenólicos, metoxiladas, que as demais enzimas como lacase e Manganês
peroxidase não são capazes de oxidar como também alcoóis benzílicos e dimetila, e
provoca rearranjos intramoleculares. Avalia-se que o melhor pH para a remoção de
fenóis desta enzima seja 4, sendo controlado preferencialmente pelo H2O2 (SOUZA E
ROSADO, 2009).

42

Este tipo de enzima tem sido relatado em um grande número de fungos,

como Trametes versicolor.
4.2.1.1.2 Enzima manganês peroxidase (MnPs)
A produção de manganês peroxidase é aparentemente limitada a certos

fungos basidiomicetos. Ainda não se evidenciou qualquer bactéria e levedura capaz de
produzir esse tipo de enzima (MOREIRA NETO, 2006; SOUZA E ROSADO, 2009).
O peso molecular de MnPs varia de 38 a 62,5 kDa, mas a maioria das
enzimas purificadas tem peso molecular próximo a 45 kDa (MOREIRA NETO, 2006).
Esta enzima é uma glicoproteína que atua com isoenzimas, oxidando
diretamente Mn (II) a Mn (III), que atua como espécie ativa nos processos de oxidação
catalítica; este é quelado por ácido orgânicos como o oxalato, formando um complexo
estável de alto potencial de oxidorredução, porém a MnPs oxida somente estruturas
fenólicas. A MnPs assemelha-se à LiPs pela presença do grupo heme, também
dependente de peróxido de hidrogênio (H2O2) para sua atividade. Sua produção se dá
juntamente com a LiPs durante o metabolismo secundário, porém a regulação é
realizada pela concentração de carbono e nitrogênio do meio (SOUZA E ROSADO,
2009). Lembrando que o metabolismo primário é o período em que ocorre a degradação
de fontes de carbono primárias, como os açúcares existentes no substrato degradado
pelo fungo, já o metabolismo secundário ocorre após a diminuição de fontes de
nutrientes primárias, sendo utilizadas o carbono dos polissacarídeos e da lignina como
fonte de alimento (SOUZA E ROSADO, 2009).
A atuação de MnPs durante a peroxidação lipídica está envolvida na
degradação de compostos xenobióticos recalcitrantes. Assim, a avaliação da capacidade
de culturas fúngicas para promover a peroxidação lipídica é de grande importância. O
estímulo da peroxidação de ácidos graxos insaturados com concomitante produção de
radicais lipídicos é reconhecido como atividade pro-oxidante (MOREIRA NETO,
2009).
A importância da MnPs na degradação da madeira se deve ao seu sistema
enzimático, que gera espécies oxidantes pequenas e de fácil penetração. Por essas
qualidades, estas iniciam a penetração na madeira, porém a característica de oxidação
apenas de estruturas fenólicas limita sua capacidade de degradar integralmente lignina
de alta massa molecular (SOUZA E ROSADO, 2009).

43

As enzimas peroxidases (LiPs e MnPs) são mais conhecidas pela capacidade

de remoção de grupamentos fenólicos e aminas aromáticas de soluções aquosas e
também de descoloração de efluentes da indústria têxtil, tendo como pressuposto que
muitos corantes empregados em indústrias têxteis possuem grupamentos fenólicos em
sua estrutura química (SOUZA E ROSADO, 2009).
4.2.1.1.3 Enzima lacase
As lacases são glicoproteínas que contêm cobre no seu sítio ativo,

constituindo um grupo de enzimas encontradas principalmente em fungos e plantas
superiores (SOUZA E ROSADO, 2009). As reações de acoplamento oxidativo das
lacases resultam na destoxificação de contaminantes fenólicos. Em meio líquido aerado,
as lacases conseguem polimerizar lignosulfonatos de efluentes sulfito (MUNARI et al.,
2003).
A produção de lacase é afetada por muitos fatores durante o
desenvolvimento fúngico, como a composição do meio de cultura onde atua a relação
do carbono e nitrogênio, pH, temperatura e taxa de aeração (MOREIRA NETO, 2009).
Elas podem ser consideradas uma oxidase que catalisa reações de oxidação,
na ausência de H2O2, utilizando O2 como oxidante, sendo reduzido a H2O em um
processo de oxidação, envolvendo quatro elétrons. As lacases são enzimas que não
apresentam especificidade restrita quanto à estrutura do substrato, podendo catalisar a
oxidação de várias estruturas aromática, como as fenólicas (mono, di e polifenóis).
Alguns estudos recentes também mostram que a lacase também pode degradar
compostos não fenólicos na presença de mediadores específicos (SOUZA E ROSADO,
2009).
Lacases e peroxidases oxidam uma ampla série de fenóis substituídos
transformando radicais fenólicos em radicais aril-oxi, que se polimerizam
espontaneamente e formam complexos insolúveis; estes podem ser removidos por
precipitação, filtração ou centrifugação (MUNARI et al., 2003).
A aplicação de lacases em sistemas de tratamento de efluentes pode ser de
interesse, visto que apenas o oxigênio molecular é necessário como aceptor de elétrons
para a reação enzimática (MUNARI et al., 2003). A lacase é uma polifenoloxidase
produzida por diversos fungos, plantas e bactérias (BARBOSA E SANTIAGO, 2005).

44

O pH ótimo para a atividade das lacases depende do tipo de substrato

utilizado. No caso dos fenóis, consideram-se pH ótimo quando contido no intervalo
entre 3 e 7 para lacases fúngicas e 9 para lacases de plantas. A maioria das lacases
isoladas atuam em zonas ácidas, com os valores ótimos variando entre 5 e 6 (SOUZA E
ROSADO, 2009).
As Lccs fúngicas estão recebendo grande atenção em várias aplicações
industriais, devido à capacidade de catalisar a oxidação de fenóis e outros compostos
aromáticos, como a deslignificação, produção de etanol, modificação de fibras da
madeira, clareamento de corantes e remediação de solos e águas contaminados
(MOREIRA NETO, 2006). Estas também têm sido utilizadas em processos de
branqueamento e despolpação para remoção de componentes fenólicos de efluentes,
sucos de fruta, uva e vinho, devido ao seu potencial ligninolitico, sendo capazes de
oxidar corantes azo fenólicos. A ação da lacase pode desintoxicar corantes azóicos,
devido à sua reação que libera as ligações azo sob forma de nitrogênio molecular, não
permitindo a formação de aminas aromáticas potencialmente carcinogênicas (SOUZA E
ROSADO, 2009).
Experimentos de descoloração de efluentes alcalinos com lacase de fungos
realizados por MUNARI et al., (2003) demonstraram que a atividade de lacase precede
a descoloração de efluentes da indústria de papel por um pequeno período de tempo,
resultado este que sustenta a hipótese do envolvimento da enzima com a perda de cor do
efluente.
O Trametes versicolor têm sido intensamente estudados para processos de
degradação de corantes. Caracterizam-se por serem bons produtores de lacases. A
capacidade de catalisar reações de desmetilação é uma característica bastante
promissora, uma vez que é o passo inicial para a biodegradação de cadeias polimétricas,
com subseqüente decomposição de macromoléculas de lignina pelo rompimento dos
anéis aromáticos em estruturas fenólicas (SOUZA E ROSADO, 2009).
4.2.1.2 Utilização de fungos de decomposição branca
Desde a década de 90, a possibilidade de utilizar fungos da degradação

branca para estratégias de biorremediação tem motivado muitas pesquisas de nível
acadêmico, industrial e governamental. O interesse neste assunto provém da habilidade
apresentada pelos fungos deste grupo em metabolizar uma grande diversidade de

45

poluentes muito persistentes ou tóxicos para o meio ambiente. Fungos de degradação

branca são capazes de metabolizar uma variedade de poluentes xenobióticos, como
bifenóis policlorados, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, corantes industriais e
pesticidas (MUNARI et al., 2003).
O início dos estudos sobre estes fungos em processos de biorremediação se
deve à presença de seus complexos enzimáticos, capazes de degradar uma grande
variedade de compostos (SOUZA E ROSADO, 2009). A vantagem na utilização de
fungos da degradação branca no processo de tratamento de efluentes é de baixo custo,
comparado com a utilização da enzima fenoloxidases purificadas (MUNARI et al.,
2003).
Fungos da decomposição branca são bastante conhecidos pelas habilidades
de produzir enzimas extracelulares oxidativas que iniciam o processo de
despolimerização ligninolítica. Esta capacidade permite a sua aplicação em uma série de
processos biotecnológicos, baseados na degradação das estruturas de diversos
compostos aromáticos (SOUZA E ROSADO, 2009).
O uso de fungos capazes de degradar compostos orgânicos parece ser um
método bastante promissor para o tratamento de água quanto de resíduos, em particular,
os fungos de decomposição branca que possuem um sistema enzimático capaz de tolerar
altas concentrações de poluentes tóxicos (BARBOSA E SANTIAGO, 2005). Desta
forma, os fungos consideram-se mais eficientes sob condições adversas: solos com
valores extremos de pH, limitação de nutrientes e com baixo teor de umidade
(MACEDO et al., 2002).
Estudos realizados com fungos basidiomicetes da podridão branca, visando
à descoloração e degradação de efluentes têxteis, obtiveram resultados positivos.
Observou-se a habilidade de degradação de poluentes recalcitrantes orgânicos como
hidrocarbonetos, poliaromáticos, clorofenóis e bifenilas policlorados (SOUZA E
ROSADO, 2009).
O sistema ligninolítico de alguns fungos são compostos de enzimas
oxidativas não-específicas, as lacases e peroxidases, que apresentam potencial para
aplicação na descoloração e desintoxificação de organopoluentes recalcitrantes
(MUNARI et al., 2003).
A capacidade dos microrganismos de degradar compostos orgânicos é
cientificamente reconhecida, e a utilização de fungos ligninolíticos em bioprocessos
envolvendo descontaminação ambiental, principalmente basidiomicetes degradadores

46

da podridão branca, vem crescendo grandemente nos últimos tempos, no que se refere à
utilização de sistemas enzimáticos, devido às suas vantagens. Entre essas vantagens
pode-se destacar a diminuição de compostos tóxicos durante o processo de
descontaminação, uma vez que se trata de um processo natural, não necessitando de
substâncias químicas e que podem ser utilizados em processos de tratamento biológico
de efluentes líquidos e de resíduos sólidos (MACEDO et al., 2002; SOUZA E
ROSADO, 2009).
Vários estudos têm sido realizados com fungos com capacidade de degradar
corantes têxteis. As principais vantagens da utilização de sistemas enzimáticos em vez
de tratamentos convencionais em efluentes têxteis são a sua aplicação em materiais
recalcitrantes, atuação em altas e baixas concentrações de compostos tóxicos
contaminantes, atuação em amplo espectro de pH, temperatura e salinidade, fácil
processo de controle, entre outros. A crescente utilização de enzimas em tratamento de
poluentes específicos tem possibilitado a produção de enzimas mais baratas e facilmente
disponíveis (SOUZA E ROSADO, 2009). Os fungos suportam grandes variações de pH,
luz, umidade e oxigênio, além da grande capacidade de produção de enzimas
extracelulares que atuam rompendo ligações químicas de moléculas grandes,
transformando-as em moléculas menores fáceis de serem absorvidas e metabolizadas
(SILVA et al., 2008).
Outro mecanismo que melhora a eficiência de remoção de compostos
tóxicos por fungos é a aplicação deste com células imobilizadas. Pesquisas
desenvolvidas com fungos e a utilização de reatores com biofilme aderido têm mostrado
que esta configuração oferece grande eficiência e estabilidade, principalmente quando
da necessidade de alta taxa de degradação (FREITAS NETO et al., 2007).
A vantagem de se trabalhar com tratamentos biológicos na remoção de
produtos na água é relevante já que na remoção de efluentes o conteúdo pode ser
altamente variável quanto às características químicas e físicas, o que torna o processo de
tratamento biológico bastante restrito. Fungos como o Trametes versicolor, Pycnoporus
sanguineus mostraram-se eficientes em processos de biodegradação e descoloração de
efluentes têxteis, porém estudos complementares devem ser realizados para melhor
entendimento da reação das enzimas ligninolíticas em compostos presentes em efluentes
têxteis, bem como estudos de outros fungos degradadores da podridão branca, a fim de
encontrar o organismo com maior adaptação e, conseqüentemente, maior produção de
enzimas ligninolíticas capazes de degradar estes tipos de resíduo. Isto se deve à

47

fragilidade de produção de enzimas ligninolíticas, que necessitam de controle e

manutenção das propriedades do meio de cultivo para o seu crescimento (SOUZA E
ROSADO, 2009). Os fungos filamentosos são os mais eficientes na produção dessas
enzimas. Podendo remover eficientemente a DQO (demanda químicas de oxigênio) de
diversos efluentes (SILVA et al., 2008). Sendo na maioria das vezes, os responsáveis
pelo desaparecimento dos contaminantes (MACEDO et al., 2002).
Graças a essas habilidades têm sido desenvolvidos processos
biotecnológicos destinados a diversas finalidades, dentre os quais se destacam a
degradação de poluentes, a lixiviação de minerais, a desobstrução de poços de petróleo
e a recuperação de locais contaminados - solo, águas superficiais e subterrânea
(MACEDO et al., 2002).
Experimentos mostram que em incubações prolongadas com os fungos
Pycnoporus sanguineos e o Trametes versicolor em geral, foi alcançado 70-80% de
descoloração, índice cerca de 25% maior do que o alcançado com o melhor tratamento
enzimático (48% de remoção em 72 h por lacase imobilizada) (MUNARI et al., 2003).
Os fungos, de um modo geral, promovem degradação de compostos
aromáticos, através dos sistemas enzimáticos citocromo, monoxigenase e lignolítico.
Algumas espécies fúngicas têm sido bastante empregada em xenobióticos para
deslignificar e descolorir devido sua habilidade em produzir enzimas oxidativas
extracelulares, que despolimerizam lignina (SAMPAIO et al., 2004; SANTOS et al.,
2006).
Entre os microrganismos que podem ser utilizados para o tratamento
biológico de águas residuárias de refinarias de petróleo, os fungos vêm se mostrando
hábeis em degradar efluentes tóxicos, sobrevivendo e crescendo em meios com
concentrações elevadas de compostos recalcitrantes (FREITAS NETO et al., 2007).

48

5 MATERIAIS E MÉTODOS
A pesquisa foi desenvolvida no laboratório de Enzimologia e Biocatálise

Ambiental na Faculdade de Farmácia – UFG
5.1 CARACTERÍSTICAS DO LOCAL DA COLETA DAS AMOSTRAS
A amostra de solo contendo as substâncias húmicas, foi coletada em um

único ponto da cidade de Goiânia, no Sindicado dos funcionários da UFG localizado no
campus samambaia/Sint-UFG a altura 689 m acima do nível do mar, com as
coordenadas 16º 36' 33,7'' latitude sul, 49º 16' 54,3” latitude oeste.
A área de coleta é uma região formada de brejo ou pântano.
Internacionalmente, são conhecidos como “wetlands” (terras úmidas ou terras
alagadiças). O terreno possui pouca inclinação, o que retarda o escoamento das águas.
Encontrando-se na planície adjacente ao rio Meia Ponte, em uma região de depressão,
recebendo as águas fluviais nos períodos de cheia.
5.2 MÉTODO DE COLETA E PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
Foram perfuradas três aberturas na área com 0,5 m2 cada, onde foram
coletados solos de uma profundidade a partir de 20 cm (figura 2), foi coletada uma
alíquota de 1 kg de solo da área de cada abertura. Sendo três amostras de aberturas
diferentes.
As amostras foram armazenadas em sacos de polietileno até a chegada ao
Laboratório de Enzimologia e Biocatálise Ambiental na Faculdade de Farmácia da
UFG. O solo foi secado ao ar até que não houvesse nenhum indício de água no mesmo,
foi desagregado com almofariz e passado em tamiz de malha 60. O restante foi
armazenado em sacos de polietileno por 60 dias como fonte reserva caso ocorresse
algum evento desfavorável durante o período de extração. Após o uso na extração dos
ácidos o restante da amostra do solo foi descartado.

49

5.3 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DOS ÁCIDOS HÚMICOS E FÚLVICOS
5.3.1 Extração dos ácidos húmicos e fúlvicos
Foram pesados 300 g de solo em balança eletrônica semi-analítica com

precisão de 0,1 g. Logo depois o solo foi reidratado com 200 mL de água destilada e
deionizada, adicionando solução de 600 mL de HCl a 0,5 mol/L, para eliminação dos
carbonatos e íons metálicos fracamente ligados.
Em seguida o solo foi lavado com água destilada e deionizada até atingir o
pH neutro. Em seguida houve à extração do ácido húmico e do ácido fúlvico utilizando
600 mL de NaOH a 0,5 mol/L como líquido o extrator e após 24 horas o extrato alcalino
dissolvido foi transferido para Becker de vidro onde foi acidificado com 600 ml HCL a
6 mol/L a pH 2,0, para que ocorresse a precipitação do ácido húmico e no sobrenadante
ficasse o ácido fúlvico. Depois o ácido húmico e fúlvico foram redissolvido em
NH4OH até o pH chegar à neutralidade. Os ácidos foram separados manualmente,
sendo que as interfases entre o ácido húmicos e fúlvicos foram descartadas e o restante
dos ácidos reservados em fracos de vidros devidamente tampados e levados a geladeira
a uma temperatura de 2 ºC podendo variar até 3,9 ºC. Depois de feitas as extrações das
coletas das diferentes amostras, todas elas foram homogeneizadas
5.3.2 Purificação em cromatografia de trocas iônicas utilizando colunas

cromatográficas
Para purificação do ácido húmico o mesmo foi eluído e inserido em colunas

de vidro com resinas trocadoras de íons a Amberlite IR 120 que é uma resina catiônica
adquiridas dos laboratórios Sigma-Aldrich® e Veteq. A Amberlite IR 120 apresenta
capacidade de troca em volume de 2,2 meq/mL e de limite mínimo de 2,000 meq/mL,
com características físicas de micropérolas amarelas. A cromatografia de trocas iônicas
foi feita em colunas cromatográficas.
5.3.2.1 Tratamento da resina de troca iônica na purificação dos ácidos húmicos
Para ativação da IR 120 a mesma foi agitada por uma hora em ácido
clorídrico 2 mol/L.

50

Para tratar a IR 120 a mesma foi lavada com NaOH a 1 mol/L sob agitação
por uma hora e depois foi trocada a solução e aquecida até 50º C por mais uma hora, no
final foi colocado 5 mL de água oxigenada (para 500 mL de resina).
Depois de lavada novamente com água destilada a resina foi deixada sob
agitação por mais uma hora em ácido clorídrico a 2 mol/L, após esse procedimento foi
lavada até pH quase neutro. A resina foi empacotada em colunas de vidro A resina foi
utilizada até que se percebeu que parte dos grânulos da resina foram destruídos, quando
a resina foi utilizada várias vezes e não apresentava o mesmo rendimento quanto ao
inicialmente. Observando isso a resina foi descartada.
5.3.3 Teste de purificação do ácido húmico
O teste para verificação da pureza do acido húmico que foi eluido nas
colunas cromatográficas foi feito através da verificação do teor de cinzas e com teste
com o reagente de nitrato de prata (AgNO3) a 0,1 mol/L.
Logo após a cromatografia de trocas iônicas o ácido húmico e o fúlvico
foram congelados. O ácido húmico purificado foi colocado em mufla a 500 oC por 2
horas para assim verificar o teor de cinzas como indicativo do grau de pureza do
material em relação aos constituintes inorgânicos e ao processo de extração e
purificação da amostra. A seguir foi feito o teste como o nitrato de prata para
verificação do teor de metais do ácido húmico.
5.4 CARACTERIZAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS HÚMICAS
A análise da composição das substâncias húmicas (caracterização) foi

realizada por espectroscopia na região do ultravioleta e visível utilizando um
espectrofotômetro de varredura UV/Vis, e a espectroscopia na região do infravermelho,
utilizando um espectroscópio de varredura de infravermelho.
5.4.1 Espectroscopia na região do ultravioleta e visível
Foram feitas varreduras no espectrofotômetro entre os comprimentos de

onda de 200 nm a 900 nm, para determinar as características tanto dos ácidos fúlvicos e

51

húmicos extraídos, e uma absorbância de 0 a 1. A varredura também foi utilizada para

verificar se houve ou não degradação dos ácidos em estudo.
Também foi utilizada a razão entre as absorbâncias a 465 e 665 nm
(usualmente referida como razão E4/E6) para fins de caracterização. Tal razão
geralmente apresenta valores entre 3 e 5 para o ácido húmico e 6 a 8,5 para o ácido
fúlvico (PAULA, 1992, ROSA et al., 2000) A razão E4/E6 está diretamente relacionada
à condensação estrutural, sendo indicativo do grau de humificação, aromaticidade, peso
molecular e conteúdo ácido das SH. Os valores diminuídos da razão E4/E6 indicam
maior condensação enquanto que maiores razões estão associadas a estruturas menos
condensadas (ROSA et al., 2000).
A espectroscopia de ultravioleta e visível (UV-vis) utilizada nos
experimentos das análises enzimáticas obedeceram a diferentes comprimentos de ondas,
necessárias para cada experimento, descritas a seguir no item – Determinação
enzimática.
Foi utilizado um espectrofotômetro da Marca Varian UV- visible, modelo
Cary 50 Bio spectrophotometer do Laboratório LCQM (Laboratório de Controle de
Qualidade de Medicamentos) da Faculdade de Farmácia da UFG.
5.4.2 Espectroscopia na região do infravermelho
As bandas de absorção geralmente são largas devido à sobreposição de

absorções individuais. O espectro reflete a predominância de grupos funcionais
contendo oxigênio, tais como: COOH, OH, C=O no material húmico (PAULA, 1992).
O quadro 2, mostra os principais grupos de absorção no infravermelho para
SHs segundo dados de Di Bernado et al. (2005) e que serão avaliadas neste trabalho.

52

Quadro 2- Principais grupos de absorção no infravermelho para SH
Freqüência (cm-1) Atribuições

3.395-3.400 Estiramento OH ligado e estiramento N-H
2.930 Estiramento CH alifático
1.705-1.716 Estiramento C=O de acetona e de ácidos COOH
1.630-1.650 Estiramento assimétrico C-O dos íons carboxilato COO-,
estiramento C=C dos anéis aromáticos, estiramento C=O e
deformação N-H das amidas primárias
1.510 Deformação N-H de amida secundária e estiramento C=C dos
aminoácidos
1.450 Deformação C-H dos –CH2 e –CH3
1.420 Assimétrico C-O, deformação O-H e deformação C-O-H dos
COOH e estiramento simétrico dos íons COO-
1.230 Estiramento simétrico C-O e deformação OH dos COOH
1.125 Estiramento C-O de alcoóis, éteres, ésteres e COOH
1.035 Estiramento C-O de polissacarídeos
Fonte: Di Bernado et al. (2005).
Os espectros infravermelhos foram obtidos em um equipamento Perkin Elmer

Spectrum BX FT-IR System, com resolução de 4 cm-1 na faixa de 4000-550 cm-1, de 0 a
100% pela técnica de transmitância, o que necessariamente dispensa o uso da pastilha
de KBr, já que as amostras estavam em meio líquido. O equipamento foi calibrado a
uma freqüência de 16 leituras simultâneas, para cada amostra lida. As análises foram
feitas no Laboratório LCQM (Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos)
da Faculdade de Farmácia da UFG.
5.5 MICRORGANISMOS E PREPARO DO MEIO DE CULTURA
Os microrganismos utilizados nos experimentos foram fornecidos pela Fundação

Tropical André Tosello, Campinas (SP) e fazem parte da coleção do Laboratório de
Enzimologia e Biocatálise da Faculdade de Farmácia – FF, da Universidade Federal de
Goiás – UFG e correspondem as seguintes espécies: Pycnoporus sanguineus - PS (CCT
- 4518), Trametes villosa – Tvi (CCT - 5567) pertencentes à ordem dos Polyporales
e família Polyporaceae. Estas cepas foram as escolhidas por estarem disponíveis no
Laboratório.

53

5.5.1 Meio de Cultura
O meio de cultura do tipo BGA (Batata, Glicose, Ágar) foi utilizado como meio
para o desenvolvimento dos cultivados fúngicos para a manutenção das cepas, este
sendo um meio sólido. Já o meio de cultura BGC (Batata, Glicose, Caldo) foi utilizado
como meio para o desenvolvimento dos cultivados fúngicos dos experimentos, este
sendo um meio líquido. Sendo dados de Melo e Sanhueza (1995) os componentes dos
meios sólidos e líquidos encontram-se no quadro 3.
Quadro 3: Meios de Cultura

COMPONENTES MEIO SÓLIDO MEIO LÍQUIDO
Água destilada Completar para 250 mL Completar para 1000mL
Ágar 3,750g Ausente
Caldo de Batata 50 mL 200 mL
Glicose 5g 20g
Recomendações Esterilizar-se a 121º C durante Esterilizar-se a 121º C durante
15 minutos 15 minutos.
Fonte: Melo e Sanhueza (1995).
O caldo de batata é obtido pelo cozimento de 1kg de batatas inglesas

descascadas obtidas comercialmente em 1 L de água, por uma hora (Melo e Sanhueza,
1995).
5.5.2 Manutenção dos microrganismos
Para a manutenção das cepas de fungos em estudo foi utilizado o meio de

cultura sólido, através do cultivado em placas de Petri e replicados trimestralmente.
Conforme metodologia proposta por Castellani (1967), o meio de cultura foi
autoclavado em temperatura de 120ºC por 20 min. e distribuídos em placas de Petri
com volume de aproximadamente 15 a 20 mL por placa. Todos os procedimentos de
inoculação aconteceram em capela de fluxo laminar, sendo inserido em cada placa um
disco de inóculo do tamanho referente à abertura maior de uma ponteira de 1 mL de
pipetador automático. Estes foram armazenados em estufa incubadora para BOD
(Demanda Bioquímica de Oxigênio) LS 334 – 300 L. Foi padronizado um período de

54

sete dias para o crescimento e desenvolvimento das cepas e posteriormente a retirada

das placas de Petri da estufa incubadora para BOD e colocadas em geladeira a
temperatura variando de -1 ºC à -3º C.
5.5.3 Cultivo em meio líquido
Todos os procedimentos microbiológicos de inoculação no meio líquido

como a adição dos ácidos húmicos e fúlvicos foram realizados dentro da capela de fluxo
laminar, a fim de manter as condições estéreis, de acordo com a metodologia
apresentada por Castellani, 1967.
Após o crescimento dos fungos em meio solido rico em BGA, foram
retirados seis discos dos fungos, da placa de Petri, área conhecida como de crescimento
ativo da colônia, discos cujo diâmetro corresponde ao tamanho da abertura maior de
uma ponteira de 1 mL de um pipetador automático. Estes discos foram incubados
durante 15 dias em frascos tipo erlenmeyers de 250 mL, a 28ºC em condições de
agitação a 140 RPM, em crescimento em escuro. O conteúdo de cada erlenmeyers foi de
25 mL de BGA e 25 mL de água deionizada, destilada e autoclavada para manter as
condições estéreis do meio.
A adição de água deionizada, destilada e autoclavada foi necessária para que
não houvesse interferência nas análises de espectrofotometria de infravermelho, já que
uma maior quantidade de meio de cultura poderia interferir nos resultados e na leitura
das bandas pelo espectrofotômetro.
5.5.4 Adição dos ácidos húmicos da Sigma-Aldrich® e extraídos e dos ácidos

fúlvicos na água
No 10º dia houve a adição de 1g de ácido húmico extraído dissolvido em

água destilada e deionizada e autoclavada completando um volume de 50 mL, nos
erlenmeyers. Também foram feitos ensaios com o ácido húmico comprado do
laboratório da Sigma-Aldrich® a afim de comparação com o ácido húmico extraído. A
solução com o ácido húmico do laboratório Sigma-Aldrich® foi produzida a partir de
um 0,2g, sendo dissolvido em água destilada deionizada e autoclavada até formar uma
solução de 50 mL, optou-se por esta concentração menor já que o ácido húmico
adquirido do Laboratório Sigma-Aldrich® estava em pó, liofilizado e com um grau de

55

pureza e concentração maior, pois a empresa segue normas na produção e venda do

ácido.
Para os ensaios feitos com o ácido fúlvico foi adicionado o ácido sem
dissolução, já o ácido fúlvico extraído foi utilizado em solução aquosa. Foram
adicionados 50 mL de ácido fúlvico nos erlenmeyers. Para fins de experimentação o
ácido fúlvico teve seu pH controlado durante os ensaios. Os ácidos fúlvicos adicionados
tiveram pH 3, pH 5 e pH 7. O tratamento foi determinado pela mesma metodologia de
caracterização, ou seja, os espectros antes deste tratamento foram comparado com os
espectros das substâncias húmicas (ácidos húmicos e fúlvicos) após a atuação das
enzimas fúngicas.
A incubação para a produção das enzimas aconteceu sob agitação de 140
RPM e temperatura de 28oC, por 15 dias, sendo que no 10º e 15º dia foram analisadas
amostras para a determinação da lacase (fenoloxidades) e peroxidases.
Para padronização dos experimentos em meio liquido adotou-se: (1)
realização dos ensaios em triplicatas, (2) retirada de 5 ml de alíquotas, no 10º e 15º dias
para a dosagem enzimática; perfazendo um total de 2 coletas, (3) as dosagem
enzimáticas foram realizadas em duplicatas, (4) também foram coletadas e separadas no
10º dia, amostras sem os ácidos e com a presença do ácidos e no 15º dia, para análise de
varredura nos espectros de ultravioleta e visível (UV- vis). Estas amostras devidamente
identificadas, foram mantidas sob condição de congelamento em frasco âmbar do tipo
criogênico.
5.5.5 Teste de adsorção
O Teste de adsorção tem como princípio verificar se houve ou não a

adsorção pelos micélios fúngicos dos ácidos em estudo. O Teste de Adsorção é
realizado como uma análise complementar as análises de atividade enzimática.
O procedimento para o Teste de adsorção são os mesmos utilizados para o
cultivo em meio líquido, mudando apenas o procedimento no 10º dia, momento em que
os erlemneys são levados a autoclave. A autoclave mata os fungos e assim não ocorrerá
produção de enzimas pelo fungo.
Os procedimentos de coleta das amostras são os mesmos utilizados nas
análises anteriormente citadas.

56

5.5.6 Uso do reator estático (Jar Test)
As amostras contendo os fungos em crescimento foram levadas para a

utilização do reator estático (Jar Test) na ETA Jaime Câmara - Sistema Produtor João
Leite no município de Goiânia localizada no setor Negrão de Lima, os ensaios foram
realizados no Laboratório de Controle Operacional sob a supervisão das Biólogas,
Luciana de Souza Melo Machado, coordenadora da Produção de Água Tratada - ETA
Jaime Câmara na Companhia de Saneamento de Goiás S/A – SANEAGO e da Wilma
Gomes da Silva Carmo, Técnica Industrial em Saneamento na Supervisão do Sistema
Produtor João Leite na Companhia de Saneamento de Goiás S/A –SANEAGO.
5.5.6.1 Preparação da Amostra para uso no reator estático (Jar Test)
Foram preparados 200 mL de caldo BGC puro e colocados nos erlemneyers,

onde foram adicionados 48 discos de fungos provenientes das placas de Petri (tudo
proporcional aos ensaios anteriormente realizados em meio agitado). As inoculações
aconteceram nas mesmas condições anteriormente citadas; na capela de fluxo laminar e
autoclavadas para manutenção estéril do conteúdo de cada erlenmeyer,
Depois estes foram deixados sobre agitação durante 10 dias na incubadora
Shaker a 28º a 140 RPM. No 10º dia as amostras contendo os fungos em crescimento
foram levadas para a realização dos ensaios do Jar Test na ETA Jaime Câmara.
Foram feitos dois testes, um com ácido húmico extraído e o outro com ácido
fúlvico em dias alternados, por isso a inoculação dos fungos aconteceu em dias
diferentes para que os ensaios fossem necessariamente feitos no 10º dia do crescimento
do fungo. Em todos foram utilizados os seis jarros de 2 Litros em reator estático (Jar
Test), marca Nova ética, modelo 218 LDB, onde foram colocados 200 mL de água
destilada, 200 mL do conteúdo dos erlenmeyrs contendo o caldo com o fungo em
crescimento.
Em seguida foi adicionado ao mesmo instante em cada jarro 400 mL do
ácido em estudo, sendo que durante o ensaio do ácido húmico foram dissolvidos 8g de
ácido extraído e purificado e completado o volume de 400 mL e no ensaio com o ácido
fúlvico foram utilizados 400 mL do ácido em solução.
No reator estático (Jar Test) a solução obtida foi colocada sobre agitação
constante de 140 RPM durante 20 min. e deixado sobre decantação por um período 10

57

min. e por mais 24h. O mesmo procedimento foi feito com o acido fúlvico que foi
adicionado em solução com as mesmas proporções em pH 4,0. A temperatura e o pH foi
monitorada antes e após o termino do ensaio.
5.5.6.2 Coleta para realização das Análises enzimáticas e de Espectrofotometria de

ultravioleta e visível (UV-vis) e infravermelho
Foram retiradas 6 mL de alíquotas para análises no 10º dia depois da

solução feita entre caldo com fungo e a água destilada e depois de 10 min. de
decantação depois do ensaio, como modelo do procedimento realizado nos ensaios
padronizados da ETA com o uso de coagulantes e depois de 24 horas do início do
ensaio no Jar Test, .
Durante a Análise das atividades enzimáticas, o grau de diluição do material
levado para as análises foram consideradas, as amostras de 24 horas e de 10 min. do fim
do ensaio foram calculadas conforme o grau de diluição.
5.6 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA.
A atividade enzimática da lacase (Lcc) foi determinada através da

oxidação da seringaldazina (H525nm = 65000 mmol.L-1.cm-1). Sendo conduzida numa
mistura de reação que continha 0,6 ml do extrato bruto do caldo de fungos, 0,2 ml do
tampão acetato de sódio 50 mmol.L-1 (pH 5,0) e 0,1 ml de seringaldazina 1,0 mmol.L-1
preparada em etanol. A reação é iniciada pela adição da seringaldazina e a velocidade
desta reação foi acompanhada por 10 minutos. As leituras da atividade enzimática
foram realizadas em espectrofotômetro. Uma unidade de atividade enzimática (U) é a
quantidade de enzima capaz de oxidar 1 µmol de substrato por minuto em 1 mL de
mistura de reação (SZLARZ et al., 1989).
Para manganês peroxidase (MnP) os componentes da mistura foram: 0,5mL
do extrato bruto do caldo de fungos, 0,1 mL de lactato de sódio, 0,2 mL de albumina
bovina 0,5%, 0,05 mL de MnSO4 2,0 mmolL-1, 0,05 mL de solução de H2O2, 2,0
mmolL-1 em tampão de succinato de sódio 0,2 molL-1 e 0,1 mL de vermelho de fenol
0,1%. A mistura foi incubada por 5 minutos a 30oC em banho-maria e a reação
interrompida pela adição de 40 µL de NaOH 2,0 mmolL-1. A leitura da atividade
enzimática foi realizada em espectrofotômetro e é determinada pela oxidação do

58

vermelho de fenol. A absorbância para leitura foi 610nm e a atividade de MnP expressa
como 'Abs/mL.min. (KUWAHARA et al., 1984).
A atividade enzimática de lignina peroxidase, onde os componentes para a
mistura da reação foram: 0,6 do extrato bruto do caldo de fungos, 0,2 mL de H2O2, 2,0
mmolL-1 de solução de álcool veratrílico (H310nm = 93000 mmol.L-1.cm-1), 2,0 mmolL-1
em tampão de tartarato de sódio 0,4 molL-1 (pH 3,0). A reação foi iniciada pela adição
de H2O2 e a leitura foi feita a partir do aldeído formado dessa reação medindo a 310
nm. A atividade de LiP é expressa em U/mL Uma unidade de atividade enzimática (U) é
a quantidade de enzima capaz de oxidar 1 µmol de substrato por minuto em 1 mL de
mistura de reação. (TIEN e KIRK, 1984 – modificado).
Para determinação do cálculo enzimático utilizou-se a equação conforme a metodologia
de Leonowick e Grzywnowick, (1881).
A atividade enzimática foi calculada de acordo com a seguinte fórmula:
U = 106 x'( /HxRx't
Onde:
Hcoeficiente de extinção molar de cada substrato, conforme dados da literatura;
'(: Absorbância em comprimento de onda específico;
't: Tempo de reação em minutos;
R: Quantidade de caldo enzimático em mL;
Uma unidade U é definida como a quantidade de enzima necessária para oxidar 1 µmol
de substrato por minuto. O resultado é expresso em U. mL-1.
5. 7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados das atividades enzimáticas obtidos nos experimentos foram

tratados estatisticamente. O programa Microsoft® Excel 2007 foi utilizado para
tabulação dos dados e a análise estatística foi realizada pelo programa SPSS® for
Windows®, versão 15.0.
Para comparação das atividades enzimáticas do Pycnoporus sanguineus e
atividades enzimáticas do Trametes villosa foram utilizados o Teste ANOVA e para
confirmação da significância o Teste Tukey.
O Teste ANOVA compara grupos que possuem distribuição normal, e
mostra o grau de significância da amostra. Então se p for <0,05 ele é significativo se p

59

for >0,05 não possui significância estatística. O Nível de significância é de 5%

(p<0,05).
O Teste Tukey, foi utilizado para comparar o intervalo das atividades
enzimáticas dois a dois para confirmação da significância. O Teste Tukey é um dos
testes de comparação de média mais utilizados, por ser bastante rigoroso e de fácil
aplicação, mas não permite comparar grupos de tratamentos entre si, sendo utilizado
para testar toda e qualquer diferença entre duas médias de tratamento e é aplicado
quando o teste para ANOVA for significativo ou seja p menor que 0,05.
Teste T Pareado foi utilizado para comparar os dois grupos no mesmo
momento (se mede uma variável antes e depois de um evento).
5.8 CÁLCULOS DOS ÍNDICES DOS PERCENTUAIS DE REMOÇÃO DOS

ÁCIDOS E DE ADSORÇÃO
O índice de remoção dos ácidos em incubadora Shaker:
1) Foi medido à distância do espectro obtido em todos os eixos da solução
em estudo no 10º sem ácido;
2) Foi medido à distância do espectro obtido em todos os eixos da solução
em estudo no 10º com o ácido;
3) Foi medido à distância do espectro obtido em todos os eixos da
solução em estudo no 15º com o ácido;
Depois foram feitos os cálculos onde foram obtidos os índices de remoção.
Os índices foram calculados através dos espectros do 15º dia de estudo em
presença dos ácidos considerando como índice de remoção. Quanto maior o índice de
remoção encontrado os espectros foram iguais às soluções apresentadas no 10º dia sem
a presença dos ácidos em estudos, já quanto menor for o índice de remoção mais o
espectro do 15º se aproximou do espectro apresentando no 10º dia quando à solução
recebeu o ácido. Sendo então o ponto máximo de remoção quanto mais o espectro foi se
aproximando ao espectro do 10º dia sem o ácido e o ponto mínimo de remoção quanto
mais os espectros foram aproximados dos espectros do 10º dia em presença dos ácidos.
Para o cálculo do índice do percentual de adsorção dos espectros obtidos
nos ensaios na incubadora Shaker com os ácidos em estudo, foi utilizada à fórmula:
E2- E1= R1
E3- E1= R2
(100: R1)x R2= R3

60

R3-100%= In%
Onde:
E1= Espectro do 10º dia da solução sem o ácido em estudo;
E2= Espectro do 10º dia da solução com o ácido em estudo;
R1= Resultado 1 (diferença entre o espectro do 10º dia da solução com o
ácido em estudo e o espectro do 10º dia da solução sem o ácido em estudo);
R2= Resultado 2 (diferença entre o espectro do 15º dia da solução com o
ácido em estudo e o espectro do 10º dia da solução sem o ácido em estudo);
R3= Resultado 3;
In%= porcentagem do índice de remoção.
Para o cálculo do índice do percentual de adsorção nos espectros obtidos

nos ensaios na incubadora Shaker com os ácidos em estudo, foi utilizada à fórmula:
(100: E1)x E2= R1
R1-100%= In%
Onde:
E1= Espectro de adsorção do 10º dia da solução com o ácido em estudo;
R1= Resultado 1;
R2= Resultado 2;
In%= Porcentagem do índice de remoção.
Para o cálculo do índice de percentual de remoção dos ácidos em estudo nos

experimentos em reator estático foram utilizadas às fórmulas:
E1:100= R1
R1x E2= R2
(100% - R 2)= In1%
E1:100= R1
R1x E3= R3
(100% - R3)= In2%
Onde:

61

E1= Espectro do final do experimento em reator estático;

E2= Espectro 10 min. depois do final do experimento em reator estático;
E3= Espectro 24 horas depois do final do experimento em reator estático;
R1= Resultado 1;
R2= Resultado 2;
In1%= Porcentagem de índice de remoção após 10 min. da finalização dos
experimentos;
In2%= Porcentagem de índice de remoção após 24 horas da finalização dos
experimentos.
Em todos os cálculos dos índices de percentuais de remoção e de adsorção
forma utilizados duas análises para facilitar o cálculo dos índices. A análise do primeiro
trecho que corresponde a média dos espectros de 200 a 400 nm e do segundo trecho que
corresponde a média dos espectros de 400 a 800 nm.
5.8 FLUXOGRAMA DAS ATIVIDADES E MÉTODOS UTILIZADOS
Coleta da
amostra
do solo
Tratamento das Determinações das

SHs (ácidos atividades enzimática
Extração, purificação e
húmicos e (fenoloxidases e
caracterização das SHs
fúlvicos) em peroxidases) .
(ácidos húmicos e
meio líquido com
fúlvicos) do solo
fungos na
incubadora
shaker
Análises Análises
espectrofotométricas/UV- Correlação entre estatísticas
Vis e em infravermelho atividade enzimática X
degradação das SHs
Figura 2: Fluxograma das atividades e dos métodos realizados.

62

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O trabalho foi dividido em 5 partes:

1) Extração das substâncias húmicas, purificação e caracterização dos ácidos
húmicos;
2) Análises das atividades enzimáticas;
3) Crescimento da massa fúngica;
4) Redução das substâncias húmicas por enzimas;
5) Uso do reator estático (Jar Test).
6.1 EXTRAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS HÚMICAS, PURIFICAÇÃO E

CARACTERIZAÇÃO DOS ÁCIDOS HÚMICOS.
6. 1. 1 Extração das substâncias húmicas
As porções das substâncias húmicas extraídas foram satisfatórias,

apresentando bons resultados na composição da matéria orgânica extraída.
A figura 3 (A) mostra o solo sendo tratado com a solução de HCl a 0,5
mol/L para eliminação dos carbonatos e íons metálicos fracamente ligados, deixado em
decantação.
A figura 3 (B) mostra quando o conteúdo do Becker foi transferido para um
Becker de material plástico para receber tratamento com o líquido extrator (solução de
NaOH 0,5 mol/L) e ao lado a figura 3 (C) mostra o líquido extrator depois de 24 horas.

63

A B C
Figu
ura 3: Solo sendo trataado como ssolução de HCl a 0,5 mol/L paraa eliminação dos
carboonatos e íonns metálicoss fracamentte ligados, deixado
d em decantaçãoo (A), o conteúdo
do B
Becker, conttendo o sollo foi transsferido paraa um Beckeer de materrial plástico
o para
recebber tratamennto com o líquido
l extrrator, soluçãão de NaOH
H 0,5 mol/L
L (B) e ao lado a
mesm
ma solução com NaOH
H a 0,5 mol/L
L, após 24 horas
h (C).
Deppois de 24 horas
h o líquuido sobren
nadante foi transferido
t para um Becker
sem que se deixxasse passarr a interfacee que foi deescartada jun
ntamente coom o restan
nte do
decanntado. Postteriormente o líquido foi acidificcado com solução
s de HCl a 6 mol/L
m
(figuura 4(A)), paara a separaação dos áciidos húmico
os e fúlvicoss (figura 4 ((B)).
A B
Figu
ura 4: Soluçção no instaante que reccebeu o áciido HCl a 6 mol/L (A)
A) e depois de
d 48
horass de decantaação (B).
Perccebeu-se a precipitação
p o do ácido húmico
h umaa cor marroom a preto e uma
soluçção contenddo o ácido fúlvico
f de coor amarelad
da e marrom
m. Campos et al., (2007
7) em
um de seus esstudos lemb
bra que ass cores maarrom e am
marela, sãoo resultadoss que
firmam a presença
confi p dee ácidos fúúlvicos; e conforme
c estudos
e de Brum (200
05) a

64

coloração da solução contendo ácido húmico (AH) varia de amarelo escuro a preto em
função da concentração.
6.1.2 Purificação dos ácidos húmicos.
Para a purificação dos ácidos húmicos usou-se a resina de troca iônica IR

120 que é uma resina catiônica colocada em colunas cromatográficas.
Depois dos ácidos purificados, algumas amostras foram levadas a mufla,
realizando-se o teste para verificação do teor de cinzas, onde o valor encontrado foi de
3,1% considerado um ótimo valor, já que se espera que o teor de cinzas seja menor que
5%.
A vantagem de extrair SHs com baixo teor de cinzas é diminuir etapas de
purificação as quais sempre causam perda de material e possibilitam modificações
estruturais nas SHs (ROSA et al., 2000).
Foram realizados testes com o nitrato de prata a 0,1 mol/L para verificação
da presença de metais. No teste realizado, não houve reação com o nitrato de prata
reafirmando que o ácido extraído foi realmente purificado com a resina.
6.1.3 Características dos ácidos húmicos pelo exame no infravermelho e

ultravioleta e visível (UV-vis)
O ácido húmico extraído e o ácido húmico Sigma-Aldrich® apresentaram

bandas de absorção na mesma região. A figura 5 mostra o ácido húmico extraído,
(figura 5 – A) o ácido húmico Sigma-Aldrich® (figura 5 – B) e o ácido fúlvico extraído
(figura 5 – C) através da espectroscopia no espectrofotômetro de Infravermelho.
Todas as frações apresentam uma banda de absorção na região de 3.300 a
-1
3.400 cm devido ao estiramento OH, NH. As bandas na região de aproximadamente
-1
2.900 cm também aparecem em todos os espectros. Essas bandas são atribuídas ao
estiramento simétrico de C-H alifático (-CH, -CH2, -CH3) dos grupos metil e/ou
metileno alifáticos. Na região entre 2.400 a 2.700 aparecem bandas características de

estiramento O-H de H ligado fortemente a grupos carboxílicos (COOH). Na região de
-1
aproximadamente 1.600 cm observa-se nos espectros, uma banda característica de
aromáticos. Essas bandas são atribuídas ao estiramento C=C do anel aromático, isto é,

65

as viibrações dee anel arom

mático conjjugado com
m C=O (deformação C
C=O de ceetonas
-
conjuugadas) e/oou COO . Também
T poddem ser deevido ao estiramento aanti-simétricco do
grupoo carboxilaato e ao estiramento C=
=O do grup
po COOH, devido
d ao hhidrogênio ligado
a gruupo OH em posição ortto, como noo ácido salicílico Entree 1.370 e 1..440 cm-1 no
otam-
se baandas provenientes dee grupos C -H alifático
os, deformaação O-H ee/ou estiram
mento
OO- de ácidos carboxíliicos. Na reg
simétrico do CO gião entre 1.100
1 e 9500 cm-1 obserrva-se
banddas que podem ser atribuídas
a a estiramen
nto C-O dee alcoóis ee/ou fenóis e/ou
carbooidratos. Todos
T Di Bernado et al.
estes resultados ttambém forram encontrrados por D
(2005) e Paula (1992),
( em seus
s trabalhhos com a ex
xtração das SHs.
Figuura 5 (A): Espectrosccopia do áácido húmico extraído

o no especctrofotômetrro de
Infraavermelho.

66

Figu
ura 5 (B B): Especttroscopia do ácido húmico da Sigm
ma-Aldrich®
® no
especctrofotômettro de Infrav
vermelho.
Figuura 5 (C): Espectrosccopia do áácido fúlvicco extraído

o no especctrofotômetrro de
Infraavermelho.

67

Na Figura
F 6, ob
bserva-se o espectro do
d ácido hú
úmico extraíído na regiãão do
UV-V
Vis obtido entre
e 200 e 900 nm atraavés de uma cubeta de quartzo. Obbserva-se que
q no
compprimento de
d onda em
m torno dee 250 nm o ácido húmico
h aprresenta picco de
absorrbância, esttando de acordo com o estudo de Brum (200
05). Segunddo Wiecheteeck et
al. (22004) a capaacidade de absorbância
a a UV 254 nm
m são mediidas indiretaas indicadorras da
preseença de subbstâncias hú
úmicas na áágua. Este fenômeno
f é devido à ppresença dee uma
varieedade de gruupamentos que mascarram a contrribuição de um compossto único (B
Brum,
20055).
Figu
ura 6: Especctro do ácid
do húmico eextraído na região
r do ulltravioleta e visível
6. 2 A
ANÁLISES
S DAS ATIIVIDADES
S ENZIMÁ
ÁTICAS
Paraa os cálculo m feitas corrreção do grau de

os das análiises enzimááticas foram
diluiçção das am m utilizadass as médias das
mostras. Paara os cálcuulos estatísticos foram
alíquuotas (repetiições) coletaadas.
Todos os resu
ultados, asssim como os cálculos estatístic os da ativ
vidade
enzim
mática se enncontram no
o final da diissertação no
n apêndice A.
As variáveis
v an
nalisadas nnos gráficoss foram nom
meadas de amostras de
d pH
3,0, ppH 5,0 e pH
H 7,0 pois foram
f adicioonadas as amostras
a no 10º dia, sooluções de ácidos
á
fúlvicos com esttes respectiv
vos pHs, ficcando as solluções em pH
p 3,0, 5,0 e 7,0.
Lem
mbrando quee as coletas das alíquottas feitas no
o 10º dia não
ão tinham aiinda a
preseença de áciddo fúlvico com
c estes reespectivos pHs.
p

68

6. 2. 1 Resultado da atividade enzimática de Pycnoporus sanguineus no ensaio com

o ácido fúlvico na incubadora agitadora Shaker
A figura 7 mostra a produção da atividade enzimática da Lcc de P.

sanguineus no 10º dia lembrando que a amostra que recebeu o ácido fúlvico de pH 3,0
teve uma maior atividade com 1,79 U.mL-1. De acordo com trabalho de Garcia (2006)
que avaliou o pH na atividade enzimática de P. sanguineus, verificou-se, produção
enzimática entre a faixa de 2,0 a 7,0, mas o pH ótimo de atuação ficou entre 4,0 e 5,0.
A atividade enzimática de P. sanguineus na produção da Lcc no 15º dia foi
maior na amostra que recebeu a solução de ácido com pH 3,0 confirmando o que tinha
ocorrido no 10º dia (figura 7).
2,50
1,79 1,61
2,00
Atividade Enzimática (U.mL-1)
1,34
1,50
10 dias
15 dias
Lcc
1,00
0,50
0,10 0,04 0,05
0,00
pH 3,0 pH 5,0 pH 7,0
pH das amostras
Figura 7: Determinação da atividade enzimática (U.mL-1) da Lacase de Pycnoporus

sanguineus em todas as amostras no 10º e 15º dia para os ensaios com ácido fúlvico
No Teste de ANOVA para a Lcc do P. sanguineus realizado entre as

amostras analisadas do 10º dia e aquele realizado entre as amostras do 15º dia, não
houve significância estatística já que p foi maior que 0,05.
A Produção de LiP foi baixa, conforme os resultados obtidos tanto na
produção do 10º dia (figura 8) quanto no 15º dia. A atividade da LiP ficou em 0,34
U.mL-1, no 10º dia e 0,001 U.mL-1 no 15º dia, sendo a maior atividade da LiP 0,38
U.mL-1, encontrada em pH 5,0 no 10º dia. Dependendo da substância que se deseja

69

remover ou degradar e branquear a LiP em comparação com a Lcc são os

biocatalisadores de escolha para o branqueamento e diminuição da cor (MACIEL et al.,
2010.)
0,45
0,32 0,38 0,32
0,40
0,35
0,30
0,25
10 dias
0,20
LiP
0,15
0,10
0,05
0,00
pH 3,0 pH 5,0 pH 7,0
Amostras Analisadas
Figura 8: Determinação da atividade enzimática (U.mL-1) da Lignina peroxidase de

fúlvico.
O Teste de ANOVA para a produção enzimática de LiP de P. sanguineus

realizado entre as amostras analisadas do 10º dia e entre as amostras analisadas do 15º
dia não apresentou significância estatística nem entre as amostras analisadas do 10º dia,
nem entre as amostra do 15º dia, já que p foi maior que 0,05.
A Produção de MnP foi baixa, conforme os resultados obtidos tanto na
produção do 10º dia e ainda menor no 15º dia, sendo zero (figura 9).

70

0,34
0,50

0,45
0,31
0,40
0,24
0,35
0,30
0,25 10 dias
MnP
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
pH 3,0 pH 5,0 pH 7,0
amostras analisadas
Figura 09: Determinação da atividade enzimática (U.mL-1) da Manganês peroxidase de

fúlvico.
A produção da MnP ficou em 0,3 U.mL-1, no 10º dia e 0 U.mL-1 no 15º dia,
sendo a maior atividade encontrada em pH 3,0 no 10º dia.
No Teste de ANOVA para a produção enzimática de MnP do P. sanguineus
entre as amostras analisadas do 10º dia não apresentaram significância estatística, já que
p foi maior que 0,05. O mesmo ocorreu entre as amostras analisadas do 15º dia.
Nos ensaios para verificação da produção enzimática a enzima Lcc
apresentou uma produção maior que as outras enzimas analisadas, confirmando a
observação de Garcia (2007), de que o gênero Pycnoporus é capaz de produzir várias
enzimas com aplicação industrial, mas a característica mais relevante do gênero e
produzir Lcc.
6.2.2 Resultado da Atividade Enzimática de Trametes villosa no ensaio com o ácido

fúlvico no Shaker
A figura 10 (A), mostra à produção da atividade enzimática da Lcc de T.

villosa no 10º dia, a amostra que recebeu o ácido fúlvico de pH 5,0 obteve uma maior
atividade, com produção de 2,35 U.mL-1.
Estes resultados são considerados bons, ainda mais que a Lcc é uma enzima
muito utilizada em descoloração e degradação; de acordo com Pointing e Vrijmoed
(2000), a descoloração baseada nos tratamentos da Lcc são potencialmente vantajosas,

71

uma vez que a enzima é produzida em maiores quantidades e é freqüentemente

produzida constitutivamente ou requer menores condições de indução do que as
requeridas para a produção de LiP ou MnP.
Claus e Filip (1998) em seu trabalho obtiveram uma descoloração de até
50% na solução contendo substancias húmicas com fungos, mas isso foi observado
quando se utilizou uma preparação de Lcc de Trametes versicolor, e, especialmente, na
presença de um mediador redox.
2,35
3,00
2,30
1,99
Atividades Enzimáticas (U.mL-1)
2,50
2,00
Lcc
1,50 10 dias
1,00
0,50
0,00
pH 3,0 pH 5,0 pH 7,0
Amostras Analisadas A
Figura 10 – A: Determinação atividade enzimática (U.mL-1) da Lacase de Trametes

villosa em todas as amostras no 10º dia para os ensaios com ácido fúlvico.
0,024
0,040 0,029
)
0,028
-1
0,035
Atividade Enzimática (U.mL
0,030
0,025
Lcc
0,020 15 dias
0,015
0,010
0,005
0,000
pH 3,0 pH 5,0 pH 7,0
Amostras Analisadas
B
Figura 10 – B: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) da Lacase de

Trametes villosa em todas as amostras do 15º dia para os ensaios com ácido fúlvico.

72

A atividade enzimática da Lcc de T. villosa no 15º dia (figura 10 (B)) foi

maior na amostra que recebeu o ácido de pH 7,0, diferente do que tinha ocorrido no 10º
dia.
No Teste de ANOVA para a Lcc do T. villosa tanto das amostras analisadas
do 10º, como na análise estatística das amostras do 15º dia, não apresentou significância
estatística já que p foi maior que 0,05. O valor de p foi igual a 0,495 no 10º dia e 0,775
no 15º dia.
A atividade enzimática da LiP ficou em 0,12 U.mL-1, no 10º dia e bem
diferente do valor encontrado para P. sanguineus nas mesmas condições. A atividade
enzimática da LiP para T. villosa no 15º dia não foi significativo já que a maioria dos
valores foram iguais a 0.
A produção enzimática mais alta da LiP pelo T. villosa foi encontrada na
amostra que recebeu o ácido fúlvico com pH 5,0 no 10º dia (figura 11). É surpreendente
a pequena produção de LiP e MnP, nestes ensaios, já que estas enzimas foram relatados
como eficazes nas descoloração de efluentes de fábricas de celulose, segundo estudos de
Maciel et al. (2010).
0,16 0,14
0,14 0,11 0,10

0,12
0,10
0,08
LiP
10 dias
0,06
0,04
0,02
0,00
pH 3,0 pH 5,0 pH 7,0
Amostras Analisadas
Figura 11: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) da LiP de Trametes

villosa em todas as amostras do 10º dia para os ensaios com ácido fúlvico.

73

No Teste de ANOVA para a produção enzimática de LiP do T. villosa entre

as amostras do 15º dia não apresentaram significância estatística já que p foi >0,05. O
teste ANOVA realizado entre as amostras do 10º dia na produção de LiP de T. villosa
apresentou significância estatística onde, p foi <0,05.
Isso mostra que as amostras no 10º dia não mostraram uma homogeneidade,
por isso as amostras de produção de LiP por T. villosa foram submetidas ao Teste de
Tukey para verificar quais as amostras que interferiram no resultado.
A Produção de MnP para T. villosa foi baixa, conforme os resultados
obtidos tanto na produção do 10º dia e no 15º. No Teste de ANOVA para a produção
enzimática de MnP do P. sanguineus tanto entre as amostras do 10º dia e entre as
amostras do 15º dia não apresentaram significância estatística já que p foi > 0,05.
6.2.3 Teste de Tukey da avaliação da atividade enzimática de T. villosa na

produção de LiP
O teste de Tukey tem como base a diferença mínima significativa. O teste

ANOVA realizado apresentou significância na produção enzimática por T. villosa da
LiP no 10º dia, e através do Teste de Tukey foi possível achar a média da amostra que
interferiu na significância estatística. O quadro 4, mostra o resultado do teste de Tukey.
Quadro 4: Teste de Tukey para amostras das atividades enzimáticas de LiP por
Trametes villosa no 10º dia.
LiP
10 dias p
pH 3,0 pH 5,0 0,117
pH 3,0 pH 7,0 0,551
pH 5,0 pH 7,0 0,030
Ao se comparar a amostra chamada de pH 3,0 com as de pH 5,0 e 7,0 não

foi encontrado nenhuma significância estatística, mas ao se comparar as amostras
chamadas de pH 5,0 com as de pH 7,0 verificou-se que houve uma significância
estatística de p obteve um valor abaixo de 0,05.
Ao observar o apêndices A, pode se notar que o motivo desta significância
estatística ocorreu pela queda da produção de LiP de T. villosa no 10º dia das amostras

74

de pH 5,0 para as de pH 7,0 onde o pH 5,0 obteve uma produção enzimática de 0,14
U.mL-1 enquanto a amostra chamada de pH 7,0 obteve no 10º dia uma produção de 0,10
U.mL-1.
Essa diferença nas médias foi que deixou o valor de p menor que 0,05
provocando a significância estatística.
Se fizermos uma comparação da produção enzimática com os pHs podemos
perceber que amostras chamadas de pH 3,0 e 5,0 obtiveram uma maior produção, sem
diferenças significativas entre eles e uma menor produção ocorreu em pH 7,0. Apesar
de que todas as amostras dos diferentes pHs obtiveram produção de Lcc. O que
corrobora com resultados de Garcia (2005) que mostrou atividade de Lcc entre 3,0 e
7,0.
6.2.4 Teste T Pareado da atividade enzimática de Pycnoporus sanguineus e de

Trametes villosa com Ácido Fúlvico
O teste T Pareado é um teste estatístico para definir o nível de semelhança

ou diferença entre dois momentos de uma mesma amostra. Ao contrário do Teste de
Tukey comum, que compara as médias e as variâncias, esse teste estuda as diferenças
entre duas situações de uma mesma amostra. Este teste foi utilizado para analisar as
amostras das atividades enzimáticas da Lcc, LiP e de MnP no 10º dia com o 15º dia.
Em P. sanguineus e em T. villosa nas amostras comparadas do 10º com a do
15º dia tanto de Lcc, LiP e MnP apresentaram um valor de p menor que 0,05. Esta
significância estatística foi promovida pelas quedas enzimáticas que ocorreram nas
amostras do 10º para o 15º dia.
O potencial redox do sistema da MnP é menor do que a da LiP e tem
mostrado capacidade para oxidar substratos fenólicos in vitro. Por outro lado ao
contrário da LiP, MnP pode oxidar sem H2O2 (MACIEL et al., 2010).
Estas quedas das atividades enzimáticas podem ter ocorrido devido a uma
menor adaptabilidade do fungo ao pH da solução de ácido colocada em contato com o
fungo no 10º dia.
Já no caso de T. villosa as amostras comparadas no Teste T pareado do 10º
com a do 15º dia de MnP apresentaram um valor de p maior que 0,05. Isso pode ser
explicado pelo valor baixo de produção enzimática de LiP no 10º dia, devido essa
produção ter sido extremamente baixa, ela não se diferenciou da produção do 15º dia, o

75

que provocou um valor de p maior que 0,05, não provocando assim a significância
estatística.
6.2.5 Resultado da produção enzimática por P. sanguineus e T. villosa na presença

de ácido húmico adquirido do laboratório da Sigma-Aldrich® e do ácido húmico
extraído
Pelas análises estatísticas descritivas da produção enzimática de T. villosa

foi possível notar que a produção enzimática para o ensaio com o ácido húmico da
enzima Lcc (figura 12) foi maior do que os outros índices encontrados nos ensaios com
o ácido fúlvico.
Houve uma diminuição significativa da atividade da Lcc de T. villosa do 10º
para o 15º dia, assim como também uma queda brusca na produção de LiP e MnP, tanto
no 10º como no 15º (figura 13, 14). Minussi et al. (2001) em seu trabalho com enzimas
fúngicas obteve resultados que mostraram baixa atividade das peroxidases, LiP e MnP
para as 19 espécies de fungos utilizados.
3,48
4,50
4,00
2,61
3,50
3,00
2,50 10 dias
2,00 15 dias
Lcc
1,50
1,00
0,50
0,00
Ácido Húmico Sigma Ácido Húmico
Extraído
Amostras Analisadas
Figura 12: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) da Lacase de Trametes
villosa em todas as amostras do 10º e 15º dia.

76

0,15
0,25 0,13

0,20
0,15
10 dias
LiP
0,10
0,05
0,00
Ácido Húmico Sigma Ácido Húmico Extraído
Amostras Analisadas

Trametes villosa em todas as amostras do 10º dia.
0,35 0,21
-1
)
0,30
0,25 0,14
0,20
MnP
10 dias
0,15
0,10
0,05
0,00
Amostras Analisadas

de Trametes villosa em todas as amostras do 10º dia.
T. villosa foi quem obteve uma maior produção de Lcc de 3,48 U.mL-1 na
produção para os ensaios com ácido húmico Sigma-Aldrich® e 2,61 U.mL-1 na
produção para os ensaios com o ácido húmico extraído se comparado com a produção
de P. sanguineus (figura 15) que produziu 3,28 U.mL-1 para o ensaio com o ácido
húmico da Sigma-Aldrich® e 2,41 U.mL-1 produzido para o ensaio com ácido húmico
extraído. De acordo com estudos realizados por Duarte (2009) a cepa de P. sanguineus
– CCT- 4518 e muito conhecida pela grande produção de Lcc.

77

Ambos os fungos T. villosa e P. sanguineus obtiveram uma baixa produção

de Lcc no 15º, isso pode ter ocorrido devido à concentração alta dos ácidos o que pode
ter levado a uma intoxicação fúngica, pois a quantidade de nutrientes foi bastante alta.
Em relação a aspectos enzimáticos, há poucas informações sobre as mudanças químicas
e físicas sofridas pelas substâncias húmicas durante a biodegradação devido a sua
complexidade estrutural, isso faz com que a detecção analítica de suas mudanças seja
extremamente difícil (Grinhut et al., 2007).
Nenhum dos resultados da produção enzimática tanto da LiP como de MnP,
nos ensaios com ácido húmico extraído como para os ensaios com ácido húmico da
Sigma-Aldrich® foram significativos. As figuras 16, 17 mostram a produção de LiP e
MnP de P. sanguineus.
Steffem, (2003) em seu trabalho com algumas espécies de basidiomicetos
para degradação de substâncias húmicas concluiu que a degradação resultou na
formação polar, de menor massa molecular de ácidos fúlvicos (AFs) e dióxido de
carbono, e que a decomposição dos ácidos húmicos foi consideravelmente reforçada na
presença de Mn2+, papel de MnP. Diferente do que aconteceu em nossos ensaios, já que
a produção de MnP foi baixa e provavelmente não colaborou para a degradação dos
ácidos húmicos.
4,50
3,28
-1
)
4,00
3,50 2,41
3,00
2,50 10 dias
Lcc
2,00 15 dias
1,50
0,43
1,00 0,12
0,50
0,00
Amostras Analisadas
Figura 15: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) da Lacase de

Pycnoporus sanguineus em todas as amostras do 10º e 15º dia.

78

0,40 0,34
Atividade Enzimática (U.mL -1)

0,39
0,34
0,38
0,37
0,36
10 dias
LiP
0,35
0,34
0,33
0,32
0,31
Amostras Analisadas

Pycnoporus sanguineus em todas as amostras do 10º dia.
0,35 0,21
-1
)
0,30
0,25 0,14
0,20
MnP
10 dias
0,15
0,10
0,05
0,00
Amostras Analisadas

de Pycnoporus sanguineus em todas as amostras do 10º dia.
A predominância de produção enzimática foi sem dúvida da enzima Lcc,

assim como na pesquisa de Jardim (2010) onde a enzima predominante em T. villosa e
P. sanguineus também foi a Lcc. Já no trabalho realizado por Minussi (2002) a maior
atividade de Lcc foi obtida com o fungo Trametes versicolor cultivados em meio
líquido na presença de xilidina e cobre como indutores.

79

6.2.6 O crescimento da massa fúngica
O crescimento e desenvolvimento da biomassa, apresentada nas figuras

seguintes mostra a formação em “pellets” e massa amorfa. As fotografias foram tiradas
no 15º dia de cultivo do fungo e estão apresentadas nas figuras 18 e 19.
Observa-se que no Grupo de T. villosa e P. sanguineus com presença de
ácido fúlvico os “pellets” estão pouco definidos e com formação de massa amorfa
(figura 19, 20).
Estes mesmos fungos com presença de ácido húmico também apresentaram
massa micelial irregular, mas com aspectos mais definidos, havendo uma formação
gelatinosa em torno do ácido húmico o que provocou uma coagulação do ácido. Em
estudo de Jardim (2010) para remoção de acefato o fungo P. sanguineus teve maior
crescimento e desenvolvimento na presença de acefato a 50%.
Ao final dos ensaios, é possível notar que o sobrenadante apresentou
aspecto mais límpido. As amostras com presença de ácido húmico (figura 21) ainda
apresentaram uma formação “gelatinosa” que envolveu o ácido húmico como se um
coagulante produzido pelos fungos em presença do ácido húmico.
Os fungos em estudo cresceram em temperatura de 28º C e em 15 dias, mas
segundo Garcia (2006), P. sanguineus cresce melhor a 37ºC, atingindo um bom
crescimento já no 5º dia. Talvez em maior temperatura os fungos em estudo teriam tido
um maior crescimento.

80

A
A B C
Figu
ura 18: Fotoografias doss erlenmeyeers contendo
o as amostrras de Tram a com
metes villosa
ácidoo fúlvico dee pH 3,0 (A)), pH 5,0 (B
B), pH 7,0 (C
C) no 15º, após
a os ensaaios no Shak
ker.
A
A B
C
Figuura 19: Footografias dos erlenm meyers con ntendo as amostras de Pycnop porus
sangguineus comm ácido fúlv
vico de pH 3,0 (A), pH
H 5,0 (B), pH
p 7,0 (C) no 15º, ap
pós os
ensaiios no Shakker.
A B
Figu
ura 20: Fotoografias doss erlenmeyeers contendo
o as amostrras de Tram a com
metes villosa
ácidoo húmico exxtraído (A),, Pycnoporuus sanguineeus com áciido húmico extraído (B
B), no
15º, aapós os ensaios no Shaaker.

81

6.2.7 Resultados das análise com o espectrofotômetro ultravioleta e visível (UV-

Vis) para as amostras de P. sanguineus e T. villosa em presença de ácido fúlvico e
sua correlação com a produção enzimática
Foram obtidos espectros de amostras utilizadas como controle que não

receberam ácidos, tanto de P. sanguineus (figura 21) como de T. villosa para método de
comparação com outras amostras. Badis et al. (2009) utilizaram este procedimento em
seus estudos através da quantificação de ácidos húmicos em meio de cultura como a
degradação (e, portanto, descoloração) dos ácidos húmicos e depois se mediu a taxa de
diminuição da absorbância em comparação com as culturas não-inoculadas.
Os resultados das amostras de P. sanguineus em presença de acido fúlvico
em pH 3,0 (figura 22) para teste de degradação foram favoráveis, pois é possível notar
pelos espectros obtidos no espectrofotômetro que houve uma redução da absorbância
em relação ao comprimento de onda na região do UV como também da região visível. O
índice de percentual de remoção no primeiro trecho foi de 93%, sendo menor no
segundo trecho onde foram obtidos um índice percentual de 88%. Estudos realizados
por Steffen (2003) com fungos basidiomicetos para degradação de substâncias húmicas
indicam que basidiomicetos colonizam solos e estão envolvidos no volume de húmus
através da reciclagem de alta massa molecular das substâncias húmicas. A figura 23
mostra as diferenças entre o gráfico da amostra do 10º dia sem o ácido com o ácido no
10º e com o ácido no 15º dia.
Houve diminuição do espectro da amostra de P. sanguineus em presença de
acido fúlvico em pH 5,0 (figura 23) para teste de degradação, mas se comparado ao pH
3,0 a redução foi menor, foi encontrado um índice de percentual de remoção no
primeiro trecho de 69% e um índice percentual no segundo trecho de 25%. A amostra
contendo ácido fúlvico em pH 7,0, também apresentou uma diminuição da absorbância
em relação ao comprimento de onda, mas essa diminuição foi mais significativa no
primeiro trecho dos espectro, onde foi encontrado índice de percentual de remoção 60%.
No segundo trecho o índice percentual foi de 20% (figura 24).
Se correlacionarmos com a atividade enzimática é possível notar que a
amostra de P. sanguineus que mais produziu Lcc foi à amostra de pH 3,0 sendo também
aquela que apresentou maior diminuição do espectro do 10º para o 15º dia e apresentou
maior índice percentual de remoção. Sendo a Lcc portanto responsável pela diminuição
da cor desta amostra, pois segundo Maciel et al., (2010) as Lccs possuem um poder de

82

descooloração muuito grande sendo usadda em certoss processos para melhoorar ou mod
dificar
a apaarência de cor de alim
mento ou bbebida para a eliminaçção de com
mpostos fenó
ólicos
indessejáveis, reesponsável pelo escurrecimento da cerveja,, a formaçção de név
voa e
turbiidez em suco de fruta claro, e vinhho.
Figu
ura 21: Esppectros de ultravioleta
u e visível (UV-vis)
( daas amostrass de Pycnop
porus
sangguineus paraa controle no
n 10º dia anntes de colo
ocar água destilada
d e aautoclavada (A) ,
om água autoclavada no 15º(C) dia
com água autooclavada no 10º dia (B) e co
respeectivamentee.

83

Figu
porus
m o ácido fúlvico em pH
sangguineus sem H 3,0 no 10
0 º dia (A) o com ácido
do fúlvico em
m pH
3,0 nno 10º dia (B
B) e com a presença
p dee ácido fúlviico em pH 3,0
3 no 15º ddia (C).

84

Figu
porus
sangguineus sem
m o ácido fúllvico em pH
H 5,0 no 10 º dia (A) co
om ácido fúúlvico em pH 5,0
no 100 º dia (B) e com a pressença de ác ido fúlvico em pH 5,0 no 15º dia ((C).

85

Figu
porus
sangguineus sem
m o ácido fúllvico em pH
H 7,0 no 10 º dia (A) co
om ácido fúúlvico em pH 7,0
no 100 º dia (B) e com a pressença de ác ido fúlvico em pH 7,0 no 15º dia ((C).
As análises
a reaalizadas nass amostras de controle de T. villlosa (figurra 25)
mosttraram um aumento da
d absorbânncia em reelação ao compriment
c nto de ondaa das
amosstras do 15ºº dia, se com
mparadas coom aquelas amostras obtidas no 1 0º dia. Isso pode
ter oocorrido devido a algu
uma substâância produ
uzida pelo fungo com
mo pigmento
os ou
outroos resíduos derivado do
o fungo.
Os resultados
r com
c o T .v illosa em presença
p de acido fúlvvico com pH
H 3,0
(figuura 26) paraa teste de degradaçãoo foram exttremamente favoráveiss, Minussi et al.
(2001) encontroou resultados semelhanttes com T. villosa
v ondee observou se a atividaade de
Lcc eem placas para
p descolo
oração.

86

Os resultados com o T .villosa em presença de ácido fúlvico com pH 3,0

foram significativos, assim como ocorreu com P. sanguineus nas mesmas condições.
Houve redução maior do espectro no primeiro trecho, que atingiu um índice de
percentual de remoção de 52%, já no segundo trecho índice percentual de remoção foi
menor onde foi obtido 38%. A redução da absorbância em relação ao comprimento de
onda, aconteceu principalmente na região entre 200 e 400 nm. Já na amostra de T.
villosa em presença de ácido fúlvico de pH 5,0 (figura 27). O índice de percentual de
remoção no primeiro trecho foi de 65 % e no segundo trecho o índice percentual foi de
55%.
Nas amostras analisadas de T. villosa com ácido de pH 7,0 (figura 28) a
redução na absorbância em relação ao comprimento de onda obtiveram um percentual
de remoção parecidos com um índice de percentual de remoção no primeiro trecho de
44%, e no segundo trecho de 42%.
Esses resultados podem ocorridos em conseqüência do pH da solução obtida
juntamente com o ácido fúlvico em estudo ou provenientes da quantidade de dias
(somente 15 dias) em que o fungo ficou em contato com a solução contendo o ácido a
28º C, o que pode ter melhorado a atuação fúngica no processo de degradação das
soluções ácidas em diferentes pHs. Badis et al. (2009) em um dos seus trabalhos com
actiomicetos conseguiram a máxima descoloração de água com substâncias húmicas em
28 dias a 30°C com cultura sob agitação.

87

Figu
ura 25: Esppectros de ultravioletaa e visível (UV-Vis) das amostrras de Tram
metes
villossa para conntrole sem água
á no 10 º dia (A) com
c água autoclavada
a a no 10 º diia (B)
com água autocllavada 15º dia
d (C).

88

Figu
metes
villossa sem o áccido fúlvico
o em pH 3,00 no 10 º diia (A) com ácido fúlvicco em pH 3,0
3 no
10 º ddia (B) e coom a presença de ácidoo fúlvico em
m pH 3,0 no 15º dia (C) .

89

Figu
metes
5 no

90

Figu
metes
7 no
Os fungoos de decom
mposição braanca poderiiam aumentar sua produução enzim
mática,
caso ficassem em
m um maio m contado com as SHss, pois seriia permitido
or período em o uma
maioor adaptabiliidade destes fungos aoo substrato. Segundo Onneby,
O Jonnsson e Sten
nstron
(20100), provaraam em seu
us estudos que a degradação pode
p ser tootal, quand
do os
microorganismoss estão adaaptado ao aambiente, daí
d a impo
ortância do isolamento
o dos
microorganismoss de locais contaminado
c os, com as substâncias
s que se preteende estudaar.

91

6.2.8 Análises de ultravioleta e visível para as amostras de fungos em presença de

ácido húmico e as correlações com a suas produções enzimáticas.

Para interpretação dos resultados, as análises das amostras do 10º dia em
presença dos ácidos húmicos da Sigma-Aldrich® e extraído foram comparados com as
análises espectrofotométrica do 15º dia. Este método de comparação serve como
medida indireta de degradação pois se há a diminuição da absorbância em relação ao
comprimento de onda há indícios da diminuição de cor e conseqüentemente da
degradação das substâncias em estudo. Assim como Badis et al. (2009) que em seu
trabalho com substâncias húmicas compararam as estruturas iniciais e finais de SHAs
após incubação (28 dias), e com as mudanças estruturais no espectro e produtos
metabólito analisados por HPLC. Os espectros foram utilizados como indicativos da
capacidade de actiomicetos em degradar substâncias húmicas e desempenhar um papel
na degradação da lignina e diminuir o volume de húmus em solos locais.
Os resultados das análises de Ultravioleta e visível (UV-Vis) das amostras
contendo o P. sanguineus (figura 29) em presença de ácido húmico da Sigma-Aldrich®
para teste de absorbância se mostraram favoráveis, havendo mudança nos espectros do
10º para o 15º dia, havendo uma redução da absorbância em relação ao comprimento de
onda das regiões do UV como também da região visível, de forma suave sem nenhuma
queda brusca da absorbância. O índice de percentual de remoção no primeiro trecho foi
de 44%, e de 38% no segundo trecho.
Esses resultados já eram esperados, pois há muitos relatos na bibliografia,
sobre a capacidade degradativa destes fungos e principalmente de P. sanguineus, como
no estudo de Machado et al. (2006) estudaram a capacidade degradativa de corantes de
indústria têxtil por basidiomicetes, e apontou Trametes versicolor e P. sanguineus como
alternativas na biorremediação de cor de efluentes.
Já em presença do ácido húmico extraído (figura 30) a diminuição no
espectro da absorbância do 10º para o 15º dia ocorreu entre as regiões 400 a 800 nm. O
índice de percentual de remoção no primeiro trecho foi insignificante, já que este índice
apresentou um valor menor que 1%, sendo maior no segundo trecho onde foi obtido um
índice percentual de 42%. Isso condiz com a produção enzimática da Lcc do 10º dia que
foi mais alta nas amostras que receberam o ácido húmico da Sigma-Aldrich®.

92

Peloos resultado
os estatístic os fica clarro que tantto a LiP coomo a MnP
P não
interfferiram nesstes resultad
dos, já que sua produção foi muitto baixa em
m todos os testes,
t
princcipalmente nos
n ensaios com os áciidos húmico
os.
Figu
u e visível (UV-Vis) daas amostrass de Pycnop
porus
sangguineus sem
m o ácido hú
úmico da Siigma-Aldricch® no 10 º dia (A) coom ácido hú
úmico
da Siigma-Aldricch® no 10 º dia (B) ccom ácido húmico
h da Sigma-Aldr
S rich® no 15
5º dia
(C).

93

Figu
porus
sangguineus sem
m ácido húmico extraídoo no 10 º diaa (A) com ácido
á húmicco extraído no
n 10
º dia (B) com áccido húmico
o extraído noo 15º dia (C
C).
Nos resultados das análisees de ultraviioleta e visíível de T. viillosa (figurra 31,

32) em presençça de ácid
do húmico da Sigma--Aldrich® para teste de remoçãão se
mosttraram satissfatórios asssim como a produção enzimáticaa do 10º dass amostras deste
fungoo. O desem
mpenho na diminuiçãoo da absorb
bância em relação
r ao ccomprimen
nto de
ondaa em presença do ácido
o húmico daa Sigma-Ald
drich® e em
m presença ddo ácido hú
úmico
extraaído foram satisfatórias
s s, pois é posssível verifiicar nos esp
pectros do 1 0º para o 15
5º dia
uma queda coonsiderável na absorbbância em função do
d comprim
mento de onda,
princcipalmente na
n região do
o segundo ttrecho que corresponde
c e 400 a 800 nm. O índiice de
perceentual de reemoção no primeiro
p tre cho foi de 17%
1 e de 56% no seguundo trecho.

94

As amostras de
d T. villoosa com o ácido húm
mico extraaído (figuraa 32)
obtivveram uma diminuição
o notável daa absorbância nos espectros do 100º para o 15
5º dia.
E coomo o relattado com o ácido húm
mico da Sig
gma-Aldrich
h®, houve uma dimin
nuição
consiiderável noo segundo trecho m
maior que no primeiro. Os Reesultados foram
f
comppatíveis com
m à produçãão enzimátiica da Lcc obtidas
o na produção
p ennzimática do
d 10º
dia. O índice dee percentuaal de remoçção no prim
meiro trecho % e de 42% no
o foi de 33%
segunndo trecho.
Figu
metes
villossa sem o áccido húmico da Sigmaa-Aldrich® no 10 º diaa (A) com áácido húmico da
Sigm
ma-Aldrich®
® no 10 º dia (B) com áácido húmicco da Sigmaa-Aldrich® no 15º dia (C).
(

95

Figu
metes
villossa sem o áccido húmico
o extraído nno 10 º dia (A)
( com áciido húmico extraído no
o 10 º
dia (B
B) com áciddo húmico extraído
e no 15º dia (C)).
6.2.99 Teste de adsorção

a po
or T. villosaa e P. sangu
uineus com
m o ácido fúúlvico
Os testes
t de adsorção foram
m realizado
os com intuiito de verifi
ficar se os fu
ungos
m os ácidos húmicos e fúlvicos duurante os ensaios,
em eestudos degrradaram ou adsorveram
pois conforme estudos
e de Silva e Fayy (2004), o processo de
d degradaçção depend
de dos
microorganismoss envolvidoss e são diferrentes as reeações e tran
nsformaçõees catalisadaas por
estess. Com o processo de
d autoclavaação realizaados nos en
nsaios foi ppossível parralisar
essass reações que
q promov
vem a degrradação e por
p isso seendo necesssário o tesste de

96

adsorrção como contraprov

va de que o fungo adsorveu e não se utilizzou da ativ
vidade
enzim
mática para a degradação dos áciddos húmicoss e fúlvicos.
Toddos os testees de adsorçção foram feitos
f com fungos quee cresceram
m e no
10º ddia foram levados
l a autoclave.
a O
Os gráficos abaixo obttidos a part
rtir do exam
me de
ultravvioleta e viisível de P. sanguineuus para o pH
H 3,0 mosttram que nãão houve grande
a observar a figura 333, no 10º e 15º dia notaa-se pequenna diminuição na
adsorrção, pois ao
m função do comprimennto de ondaa, neste casso o ácido em estudo era o
absorrbância em
ácidoo fúlvico. o índice de percentual de adsorçãão no primeeiro trecho foi de 6% e de
13% no segundoo trecho.
Clauus e Filip (1998) em
m seu trabaalho com degradação
d das substââncias
húmiicas com fuungos obtiv
veram resulttados com até 60% dee capacidadde de degrad
dação
N entanto, a exata qu
das ssubstâncias húmicas. No uantificação do grau dee degradaçãão foi
difíciil por causaa da adsorçãão da matériia húmica em micélio dos
d fungos.
Figu
porus
sangguineus auttoclavado com
c ácido fúlvico em A) e 15º(B) dia
m pH 3,0 no 10º(A
respeectivamentee.
Paraa as amostras de T. vi llosa nas mesmas

m con
ndições houuve uma red
dução
maioor na absorbbância em função
f do ccomprimentto de onda.. O índice dde percentu
ual de
adsorrção foi um
m pouco maiior no primeeiro trecho onde foi en
ncontrado 433% e de 40
0% no
segunndo trecho (figura 34).

97

Figu
metes
villossa autoclavvado e adiicionado o ácido fúlv
vico em pH
p 3,0, noo 10º e 15
5º dia
respeectivamentee.
Difeerente do qu
ue aconteceuu as amostrras de P. sanguineus coom ácido fú
úlvico
em ppH 3,0 para o teste de adsorção
a ass amostras de
d P. sanguineus com áácido fúlvicco em
pH 55,0 apresenttaram uma redução
r da absorbânciaa em relaçãão ao comprrimento de onda,
mas somente no
n primeiro
o trecho, cconforme fiigura 35. O índice dde percentual de
adsorrção no prim
meiro trecho
o foi de 40%
%.
Figu
porus
sangguineus autooclavado e adicionado
a o ácido fúlv
vico em pH 5,0, no 10ºº(A) e 15º(B
B) dia
respeectivamentee.

98

Nos resultados dos especctros das am

mostras de T. villosa em presençça de
ácidoo fúlvico em
m pH 5,0 para
p o Test e de Adsorrção percebe-se que hoouve redução da
absorrbância em
m relação ao
o comprimeento de ond
da na da reegião do U
UV e tambéém na
regiãão visível. O índice de percentual
p dde adsorção
o foram mattematicamennte iguais, sendo
s
67% no primeiroo trecho e 68%
6 no seguundo trecho
o.A figura 36 mostra ass diferenças entre
o grááfico da amoostra do 10ºº dia com o gráfico do 15º dia.
Figu
metes
villossa autoclaavado com ácido fúúlvico em pH 5,0 no
n 10º(A) e 15º(B)) dia
respeectivamentee.
Paraa as amostraas de P. sannguineus auttoclavado no

n 10º dia e depois colo
ocado
em ppresença de ácido fúlviico em pH 77,0 (figura 37) a adsorrção acontecceu, mas nãão tão
evideente como a que ocorreeu na amosstra do mesm
mo fungo au
utoclavado no 10º dia e que
recebbeu o ácidoo fúlvico em
m pH 5,0. O índice de
d percentuaal de adsorrção no prim
meiro
trechho foi de 26%
2 e nãão foi signiificativo no
o segundo trecho, poiis percentu
ual de
adsorrção não atiingiu a 1%.

99

Figu
porus
sangguineus autooclavado e adicionadoo o ácido fúlvico em pH 7,0 noo 10º e 15
5º dia
respeectivamentee.
A figura
f 38, mostra
m gráfiicos de espeectro de T. villosa autooclavado em
m pH
7,0, oonde a dimiinuição do espectro
e da absorbânciia em relaçãão ao comprrimento de onda,
dsorção de ssomente 15
foi baixa, onde foi encontraado um índiice de perceentual de ad 5% no
prim
meiro trecho foi de 13% no segundoo trecho.
Figu
metes
villossa autoclavvado e adicionado o áácido fúlvicco em pH 7,0
7 no 10º((A) e 15º(B
B) dia
respeectivamentee
Os resultados
r conforme
c m
mostram as figuras 35 e 36, ondee o ácido fú
úlvico
em ppH 5,0 tantoo em presença do P. ssanguineus como de T.
T villosa é mais facilm
mente
adsorrvido pela massa
m fúngiica.

100

Todos estes espectros mostram que houve pequena adsorção. Ao contrário

dos espectros realizados para teste de adsorção os espectros realizados sem a
autoclavação, mostram uma maior diminuição na absorbância combinados com uma
maior atividade enzimática, pois conforme Rezende (2005) o potencial de
biodegradação dos microrganismos está relacionado à sua atividade enzimática. E
segundo Machado et al. (2005), os fungos de decomposição branca degradam devido à
produção de um sistema multienzimático, como as enzimas Lcc, LiP e MnP; aqui
analisadas nos ensaios. Enzimas estas que não estavam presentes nos testes de adsorção
devido ao processo de esterilização utilizando a autoclave.
6.2.10 Teste de adsorção por P. sanguineus e T. villosa com o ácido húmico da

Sigma-Aldrich® e o ácido húmico extraído
As figura 39 a 42 mostram gráficos obtidos dos espectros de P. sanguineus

e T. villosa ambos autoclavados; as primeiras em presença de ácido húmicos da Sigma-
Aldrich® e as demais com o ácido húmico extraído.
Em alguns dos casos não houve diminuição da absorção em função do
comprimento de onda do 10º dia para o 15º dia, havendo um pequeno aumento da
absorbância em relação ao comprimento de onda. Ao retirar a amostra da autoclave
percebeu-se que toda massa fúngica se desfez, provavelmente o calor tenha desfeito
algumas ligações macromoleculares da massa fúngica e liberado alguns resíduos, seria
uma hipótese, já que esta situação ao ser avaliada no espectro causaria dificuldade na
passagem da luz interferindo nos resultados. O que provavelmente ocasionou o aumento
na absorbância em função do comprimento de onda. Como o que ocorreu nas figuras
39, 41, 42.
Só houve adsorção nas amostras de T. villosa autoclavado com ácido
húmico da Sigma-Aldrich® onde foi encontrado um índice de percentual de adsorção de
26% no primeiro trecho e de 35% no segundo trecho como mostrado na figura 40.

101

Figuura 39: Esppectros de ultravioleta

porus
sangguineus autooclavado co
om ácido húúmico da Siigma-Aldricch® no 10ºº(A) e 15º(B
B) dia
respeectivamentee
Figuura 40: Esppectros de ultravioletaa e visível (UV-Vis) das amostrras de Tram

metes
villossa autoclavaado com ácido húmicoo da Sigma-A
Aldrich® no 10º(A) e 15º(B).

102

Figu
porus
sangguineus autooclavado com
m ácido húm
mico extraído no 10º(A
A) e 15º(B).
Figu
metes
villossa autoclavaado com ácido húmicoo extraído no
o 10º(A) e 15º(B).
1
6.3 P
PRODUÇÃ
ÃO ENZIMÁ
ÁTICA E A UTILIAÇ
ÇÃO DO REATOR
R E STÁTICO (JAR
TEST
T)
6.3.11 Resultadoo da produ

ução enzim
mática com a utilizaçã
ão do reatoor estático
o (Jar
Test)) das amostras de P. Sanguineus
S s e T. villosa
a
Todas as análiises estatístticas descritivas da produção

p ennzimática de
d P.
sangguineus e T.
T villosa na utilizaçãoo em reatorr estático (Jar
( Test) eencontram-sse no
Apênndice A.

103

A produção de Lcc (figura 43) pelo P. sanguineus na utilização do Jar Test

com o ácido fúlvico no 10º dia foi de 1,84 U.mL-1, esse valor foi o maior que aquele
produzido pelas mesmas cepas nos ensaios com o ácido fúlvico na incubadora agitadora
Shaker. Já a produção enzimática da LiP e MnP (figura 43) produzidos por P.
sanguineus foram baixos assim como outros resultados obtidos nos outros ensaios para
o ácido fúlvico e húmico. A produção enzimática de Lcc pelo P. sanguineus para o
ensaio com o ácido húmico em reator estático foi maior com 2,84 U.mL-1 (figura 44).
2,50
1,84
)
-1
2,00
1,21
1,50
10 dias
24h
1,00
0,32
0,50 0,13
0,00 0,00
0,00
Lcc LiP MnP
Enzimas Analisadas

sanguineus de todas as amostras do 10º dia e 24h nos testes com o ácido fúlvico.
2,83
4,00
3,50
3,00
2,50
1,26 10 dias
2,00
24h
1,50
1,00
0,50 0,10 0,09
0,01 0,00
0,00
Lcc LiP MnP
Enzimas Analisadas

sanguineus de todas as amostras do 10º dia e 24h nos testes com o ácido húmico.
Já a produção enzimática de Lcc T. villosa (figura 45) para ensaios com o

ácido fúlvico no 10º dia foi de 2,12 U.mL-1 esse valor foi um pouco maior que aquele
produzido pelas mesmas cepas nos ensaios do ácido húmico no Jar Test de 2,02 U.mL-1.

104

Se comparados com outros trabalhos que se utilizaram de indutores, a produção obtida

em nosso trabalho foi baixa, talvez devido à grande diluição do meio de cultura
utilizado. As Lccs extracelulares de basidiomicetos são produzidos apenas em pequenas
quantidades. Portanto, é importante aumentar a produtividade do processo quando sua
utilização é voltada a potenciais aplicações industriais (FLORES et al., 2009)
As produções enzimáticas da LiP e MnP produzidos também foram baixas
(figura 45). A produção enzimática da Lcc nos ensaios com T. villosa com o ácido
húmico (figura 46) no 10º dia foi de 2,02 U.mL-1.
3,00
2,12
2,50
2,00
10 dias
1,50 24h
0,67
1,00
0,50
0,07 0,00 0,09 0,00
0,00
Lcc LiP MnP
Enzimas Analisadas
Figura 45: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) de Trametes villosa de

todas as amostras do 10º dia e 24h nos testes com o ácido fúlvico.
3,00
2,02
2,50
2,00
1,01 10 dias
1,50
24h
1,00
0,50
0,06 0,01 0,07 0,00
0,00
Lcc LiP MnP
Enzimas Analisadas

todas as amostras do 10º dia e 24h nos testes com o ácido húmico.

105

Em todos os experimentos no reator estático (Jar Test) é possível notar

também a queda da produção enzimática após 24 horas do fungo em contato com os
ácidos. Esta queda foi notada nos ensaios com o ácido húmico no Jar Test como
também com o ácido fúlvico. Nos estudos de Hirai et al. (2004), as enzimas lignolíticas
de fungos de decomposição branca, são promissoras na degradação de xenobióticos.
Esses autores verificaram com a enzima extracelular MnP, na presença de mediadores
enzimáticos uma remoção de 60% da concentração inicial em 24 horas de tratamento,
sendo este o melhor tratamento alcançado na sua pesquisa, mas no entanto foi notada a
formação de metabolitos, o que não é interessante no tratamento de água, pois os
mediadores enzimáticos podem ser tóxicos e ocasionar problemas nas etapas seguintes
ao tratamento se as enzimas forem utilizadas para o pré-tratamento.
6.3.2 Resultados de espectrofotometria de Ultravioleta e visível (UV-vis) dos

experimentos em reator estático (Jar Test)
Nos espectros obtidos a partir do exame de UV-vis de T. villosa e de P.

sanguineus com o ácido fúlvico nos experimentos no Jar Test (figuras 48, 49) nota-se
diminuição na absorbância em função do comprimento de onda, neste caso o ácido em
estudo era o ácido fúlvico.
A diminuição da absorbância em função do comprimento de onda dos
espectros de P. sanguineus em presença de ácido fúlvico, pode ser visto e comprovado
através da diminuição da “cor” da água, cor esta provocada pela presença de ácido
fúlvico também observada a olho nu durante a utilização do reator estático (Jar Test) e
pelas fotografias obtidas (figura 47).

106

B
A
Figu
ura 47: Fottografias daa utilizaçãoo do Jar Teest contendo
o as amostr
tras de Tram
metes
villossa com áciddo fúlvico e Pycnoporuus sanguineeus; (A) os dois primeiiros jarros são
s de
metes villossa, e os do
Tram ois últimos de Pycnop uineus (A) – fotograffia da
porus sangu
utilizzação do Jaar Test (B) fotografiass do final do
d uso do Jar Test (300 min. depo
ois do
inícioo do experrimento) o primeiro j arro com as
a amostras de Trameetes villosa
a e o
segunndo com am
mostras conttendo Pycnooporus sang
guineus.
Connforme figurra abaixo aas amostrass de P. san

nguineus coom ácido fú
úlvico
obtivveram um ínndice percen
ntual de rem
moção no primeiro treccho de 53%
% em compaaração
com as amostraas apresentaadas no finnal dos exp
perimentos e as amostr
tras apresen
ntadas
depoois de 10 min.
m de deccantação, taambém foi encontrado
o um índicce percentu
ual de
remooção de 76%
% no primeeiro trecho eem relação as amostraas obtidas ddepois de 24
4h da
finaliização do experimento
e o. Já no seguundo trecho
o os índicess de remoçãão foram dee 42%
em ccomparação com as am
mostras apreesentadas no
o final dos experimenttos e as amo
ostras
apressentadas deppois de 10 min.
m de deccantação, e de remoção
o de 92% noo segundo trecho
em reelação as am
mostras obtiidas depois de 24h da finalização
f do experim
mento. Resulltados
apressentados naa figura 48.

107

Figu
porus
sangguineus com
m ácido fúlv
vico no 10º dia, após a utilização do reator esstático (Jar Test)
(A), após 10 minn. da finalizzação dos exxperimento
os (B) e 24 horas
h após o finalizaçãão dos
experimentos coom o reator estático (Jaar Test) (C)..
As amostras de
d T. villossa com o ácido fúlv
vico, obtiveeram um índice
í
perceentual de reemoção no primeiro ttrecho de 44%
4 em com
mparação ccom as amo
ostras
apressentadas no final dos experimentoos e as amosstras apresen
ntadas depoois de 10 min. de
decanntação, tam
mbém foi encontrado
e um índicee percentuaal de remoçção de 67%
% no
prim
meiro trechoo em relação as amoostras obtid
das depois de 24h daa finalizaçãão do
experimento. Já no segu
undo trechoo os índices de rem
moção foram
m de 43%
% em
compparação com
m as amostras apresenntadas no final dos experimentoos e as amo
ostras
em reelação as am
f do experim
mento. Resulltados

108

Figu
metes
villossa com áciddo fúlvico no
n 10º dia (A), após a utilização do reator eestático (B)) e 24
horass após a utillização do reator
r estáticco (C).
A produção
p en
nzimática ppara os testtes com o ácido húm
mico tanto de
d P.
sangguineus com
mo de T. villosa foram
m promissorras, mas nitidamente ppelas fotografias
(figuura 50) e pelos espectro
os (figura 5 1, 52) a dim
minuição daa absorbânccia em função do
compprimento de onda foi maior em
m T. villosa
a em presen
nça de áciddo húmico,, isso
tambbém pode seer visto a olh
ho nu durannte os experrimentos.

109

A
B
Figu
ura 50: Fottografias do
os experim
mentos em reator
r estático (Jar Teest) contend
do as
amosstras de Traametes villo
osa com áciido húmico e Pycnopo
orus sanguinneus; (A) os
o três
prim ametes villossa, e os trêss últimos Pyycnoporus ssanguineus (A) –
meiros jarros são de Tra
fotoggrafia no momento
m do
o experimennto, (B) fo o final do experimentto em
otografia do
reatoor estático (JJar Test) (30 min. depoois do início
o do ensaio)) (C) fotogra
rafia comparrando
o priimeiro jarrro com as amostras dde Trametess villosa e o segundoo com amo
ostras
conteendo Pycnooporus sang
guineus no ffinal do exp e reator esstático (Jar Test)
perimento em
(30 m
min. depois do início do
o experimennto).
As amostras
a dee P. sanguinneus em exp
perimentos com ácido húmico exttraído
obtivveram um ínndice percen
ntual de rem
moção no primeiro treccho de 68%
% em compaaração
s na final dos experrimentos em
das amostras apresentadas
a m Jar Testt e as amo
ostras
apressentadas deepois de 10 min. de deecantação e um índicee percentuall de remoção de
77% no primeiro trecho em
m relação ass amostras obtidas
o depo
ois de 24h dda finalização do
moção foram
m de 71%
% em
compparação com
m as amostras apresenntadas no final dos experimentoos e as amo
ostras
em reelação as am
f do experim
mento. Resulltados

110

Figu
metes
villossa com áciddo húmico extraído noo 10º dia ap
pós experim
mento em reaator estático
o (Jar
Test)) (A), 10 min.
m após o final doo experimen
nto (B) e 24 horas aapós o final do
experimento (C)) em Jar Tesst respectivvamente.
As amostras de
d P. sanguuineus em ácido
á húmiico extraídoo obtiveram
m um
índicce percentuaal de remoçção no prim
meiro trecho
o de 48% em
m comparaçção das amo
ostras
apressentadas no final dos experimentoos com as am
mostras apreesentadas ddepois de 10
0 min.
de decantação, também fo ual de remooção de 57% no
oi encontraddo um índicce percentu
prim
meiro trechoo em relação as amoostras obtid
moção foram
m de 22%
% em
compparação daas amostrass apresentaadas no fin
nal dos experimentos e as amo
ostras
apressentadas deepois de 10 min. de de cantação e um percenttual de rem
moção de 56
6% no

111

segunndo trechoo em relaçãão as amoostras obtid

experimento. Reesultados ap
presentados na figura 52.
5
Figu
porus
sangguineus com
m ácido húm
mico extraíddo no 10º diia após experimento em
m reator estático
(Jar T
Test) (A), após
a 10 min
n. da finalizaação dos ex
xperimentoss (B) e 24 hhoras após o final
do exxperimento em reator estático
e (C) respectivam
mente.

112

7 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES
Perante os resultados obtidos na parte experimental e das correlações com as

informações pré-existentes, consideram-se que os fungos do presente estudo apresentam
potencial de degradação e de adsorção das substâncias húmicas presentes na água.
Outras conclusões específicas a seguir:
1. Pelas análises de espectroscopia no infravermelho os ácidos húmicos extraídos

apresentaram grupos carboxílicos, alquílicos, aromáticos, alcoólicos, fenólicos e
carboidratos;
2. O método de extração utilizado foi eficaz nas extrações dos ácidos húmicos e
fúlvicos;
3. A enzima predominante em todas as espécies fúngicas utilizadas foi a Lcc;
4. O T. villosa na maioria dos experimentos obteve maior produção enzimática

chegando a uma maior produção de 3,48 U.mL-1;
5. O T. villosa nos índices percentuais de remoção foi o que obteve maior

uniformidade nos resultados obtendo resultados mais constantes;
6. P. sanguineus nos índices percentuais de remoção foi o que obteve um índice

percentual maior de remoção, com um índice de 92% no segundo trecho resultado
que ocorreu de forma isolada, perante os demais resultados encontrados nos cálculos
de índices percentuais de remoção nos experimentos na Incubadora Shaker em testes
com os ácidos em estudo;
7. T. villosa foi também o fungo que apresentou maior adsorção em comparação com
P. sanguineus, o que foi visivelmente comprovado pelos espectros de UV-vis e
chegou a obter um índice percentual de adsorção nos experimentos em Incubadora
Shaker para Teste de Adsorção obtendo um índice percentual de 68% de adsorção;

113

8. T. villosa foi o fungo que apresentou maior freqüência de maiores índices

percentuais de remoção em comparação com P. sanguineus em reator estático, o que
foi visivelmente comprovado pelos espectros de UV-vis e chegando a obter um
índice de remoção depois de 24 horas do final do experimentos de 86%, P.
sanguineus obteve uma remoção em um experimento no segundo trecho de 92%,
percentual que ocorreu somente em um dos experimentos não sendo um resultado
constante;
9. T. villosa se mostrou em todos os ensaios o maior produtor de Lcc isso pode ser
comprovado observando pela produção enzimática da Lcc em todos os ensaios;
10. Os fungos nos ensaios feitos no Jar Test funcionaram como um agente coagulante.
Para complementação dos resultados obtidos e continuidade da pesquisa,

recomenda-se:
1. Utilizar o ácido fúlvico e húmico em outras concentrações;
2. Analisar as amostras coletadas tanto nos ensaios da incubadora agitadora (Shaker),

quanto nos ensaios em reator estático (Jar Test) e aplicar o método de
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa a fim de determinar
quantitativamente a porcentagem de degradação ou transformação das substâncias
húmicas e fúlvicas; análise não realizada por falta de infraestrutura tecnológica;
3. Desenvolver estudos de aplicabilidade de fungos no tratamento de água com

presença de ácidos húmicos e fúlvicos;
4. Recomenda-se a utilização de meio de cultura mais concentrado, para uma maior

produção enzimática, o que pode melhorar o desempenho na degradação dos
ácidos em estudo;

114

REFERÊNCIAS
ANTUNES, R. M.; CASTILHOS, R. M. V.; LEAL, O. A.; CASTILHOS, D. D.

Avaliação das substâncias húmicas de resíduos orgânicos durante a vermicompostagem.
XVI CIC – pesquisa e responsabilidade ambiental/IX ENPOS – Encontro de Pós
Graduação, nov., 2007.
AZEVEDO J. C. R.; NOZAKI. J. Análise de fluorescência de substâncias húmicas

extraídas da água, solo e sedimento da Lagoa dos Patos – MS. Química Nova, v. 31, n.
6, p. 1324-1329, 2008.
AZEVEDO, J. C.; TEIXEIRA, M. C.; NOZAKI, J. Estudo espectroscópico de

substâncias húmicas extraídas da água, solos e sedimentos da Lagoa dos Patos–MS,
Brasil. SaBios-Revista Saúde e Biologia, v. 1, n. 2, p. 59-71, 2006.
BADIS, A.; FERRADJI, F. Z.; BOUCHERIT, A.; FODIL, D.; BOUTOUMI, H.

Characterization and biodegradation of soil humic acids and preliminary identification
of decolorizing actinomycetes at Mitidja plain soils (Algeria). African Journal of
Microbiology Research, v. 3 n. 13 p. 997-1007, December, 2009.
BARBOSA, D. R.; SANTIAGO, M. F. Descoloração do corante antraquinona (remazol

brilhante laranja) por fungos de decomposição branca. Revista Eletrônica de
Farmácia Suplemento, v. 2, n.2, p. 32-33, 2005.
BOTERO, W. G.; OLIVEIRA, L. C.; MENDONÇA, A. G. R.; SANTOS A., ROCHA J.

C., GOMES V. M. Otimização de extração em fluxo contínuo de substâncias húmicas
de amostras de turfa para fins comerciais. 32º Reunião Anual da Sociedade Brasileira
de Química- (RASBQ), 2009.
BRUM, M. C. Remoção de ácido húmico da água por precipitação e flotação com a

utilização de surfactantes catiônicos. Dissertação de Mestrado. UFRJ - Rio de janeiro,
RJ, 2005.
CAMPOS, S. X. ; VIEIRA, E. M. ; AZEVEDO, E. R. ; BONAGAMBA, T. J. ;

BERNARDO, L. Estudo Comparativo de Remoção de Cor de Águas Preparadas com
Substâncias húmicas de Diferentes Características. In: XXX Congresso
Interamericano de Ingenieria Sanitaria y Ambiental, 2006, Punta del Este. Anais
Eletrônicos do Evento - CD, 2006.
CAMPOS, S. X.; DI BERNARDO L., VIEIRA, E. M. Influência das características das

substâncias húmicas na eficiência da coagulação com sulfato de alumínio. Engenharia
sanitária ambiental, v.10, v. 3, abr-jun, 2000.
CAMPOS, S. X.; VIEIRA, E. M. AZEVEDO, E. R.; BONAGAMBA T. J.

Características das substâncias húmicas e as teorias sobre suas estruturas. 30º Reunião
Anual da Sociedade Brasileira de Química. Águas de Lindóia – SP, 2007. CD-
ROM.

115

CASTELLANI, A. Maintenance and cultivation of common pathogenic fungi of man in

sterile distilled water. Futher researcher. Journal Trop. Med. Hyg., v. 70, p. 181-184,
1967.
CLAUS, H.; FILIP, Z. Degradation and Transformation of Aquatic Humic Substances

by Laccase-producing Fungi Cladosporium cladosporioides and Polyporus versicolor.
Acta hydrochimica et hydrobiologica, v 23, p. 180-185, May 1998.
CONAMA – Conselho Nacional do Meio Ambiente (2005). Resolução nº 357, de 17

de Março de 2005. Ministério do Meio Ambiente, 23p.
DI BERNARDO, L. ; CAMPOS, S. X.; VIEIRA E. M. Características das substâncias

húmicas e coagulação de águas com cor alta. 23º Congresso Brasileiro de Engenharia
Sanitária e Ambiental, (ABES) - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e
Ambiental, p.1-6, 2005.
DUARTE, L. T. Produção e caracterização da atividade de tirosinase no extrato bruto de

Pycnosporus sanguineus CCT-4518. Dissertação (Mestrado) Faculdade de
Farmácia/UFG, 67p. 2009.
FLORES, C.; VIDAL, C.; HERNÁNDEZ, M. R. T.; GALINDO, E.; CARREÓN, L. S.

Selection of Trichoderma strains capable of increasing laccase production by Pleurotus
ostreatus and Agaricus bisporus in dual cultures. Journal of Applied Microbiology, v.
106, p. 249–257, Jan. 2009.
FREITAS NETO, M. A.; FELIX, J. P. L.; ARTHAUD, I. D. B.; LEITÃO, R. C.;

SANTAELLA, S. T. Remoção de compostos nitrogenados de águas residuárias de
refinarias de petróleo através de reatores biológicos com fungos. Revista Tecnologia,
Fortaleza, v. 28, n. 1, p. 85-96, jun. 2007.
GARCIA, T. A.; SANTIAGO, M. F.; ULHOA, C. J. Studies on the Pycnosporus

sanguineus laccase purified by hydrophobic interacion chromatography. Applied
Microbiology and Biotechnology, v. 75, p. 311-318, 2007.
GARCIA, T. A. Purificação e caracterização das lacases de Pycnosporus sanguineus –

Tese (Doutorado) – ICB - Departamento de Biologia molecular/Universidade de
Brasilia-DF, 2006.
GRINHUT, T. ; HADAR, Y.; CHEN, Y. Degradation and transformation of humic

substances by saprotrophic fungi: processes and mechanisms. Fungal Biology Reviews,
v. 21, p. 179-189, Nov., 2007.
HIRAI, H.; NAKANISH, S.; NISHIDA, T. Oxidative dechlorination of metoxichlor by

ligninolytic enzymes from white-rot fungi. Chemosphere, v. 55, p. 641-645, 2004.
JARDIM, V. L. Seleção de fungos de decomposição branca produtores de enzimas

oxidativas na presença de acefato para redução de sua toxicidade. Universidade
Federal de Goiás, UFG, Dissertação de mestrado, 131 p. 2010.

116

JULIO, M.; NEVES, E. F. A.; TROFINO, J. C.; DI BERNARDO, L. Emprego do

reagente de fenton como agente coagulante na remoção de substâncias húmicas de água
por meio da flotação por ar dissolvido e filtração. Engenharia sanitária ambiental, v.
11, n. 3, jul/set, p. 260-268, 2006.
KUWAHARA, M.; GLENN, J.K.; MORGAN, M.A & GOLD, M.H. Separation and
characterization of two extracellular H2O2 dependent oxidases from ligninolytic
cultures of Phanerochaete chrysosporium. FEBS Left., n. 169, p. 247-250, 1984.
LIMA, M. X. V. F. Avaliação de resinas de troca iônica para o tratamento de

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Tese (Doutorado) Programa
de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos - UFV, Viçosa- MG, 54 p.
2001.
LOSS, A.; PEREIRA, M. G.; BRITO, R. J. Distribuição das substâncias húmicas em

solos de tabuleiros sob diferentes coberturas vegetais. Revista Universidade Rural –
Série Ciências da Vida, Seropédica, RJ: EDUR, v. 26, n 1, p.57-69, jan-jun, 2006.
MACEDO, R. C.; BERBERT, V. H. C.; LEMOS, J. L. S.; TRINDADE, P. V. O.;

RIZZO, A. C. L. MACEDO, R.C.; BERBERT, V.H.C. (2002). Biorremediação de solos
impactados por óleo cru utilizando fungos filamentosos. In: X jornada de Iniciação
científica – Anais. Rio de Janeiro: Centro de Tecnologia Mineral –CETEM, 2002.
MACHADO, K. M. G.; COMPART, L. C. A; MORAIS R. O.; ROSA, L. H.; SANTOS,

M. H. Biodegradation of reactive textile dyes by basidiomycetous fungi from Brazilian
ecosystems. Brasilian Journal of Microbiology, v. 37, p. 481-487, 2006.
MACHADO, K. M. G.; MATHEUS, D. R.; BONOMI, V. L. R. Ligninolytic enzymes

production and remazol brilliant blue decolorization by tropical Brazilian
basidiomycetes fungi. Brazilian Journal of Microbiology, v. 36, p. 246-252, 2005.
MACIEL, M. J. M.; SILVA, A. C.; RIBEIRO, H. C. T. Industrial and biotechnological

applications of ligninolytic enzymes of the basidiomycota: A review Electron. J.
Biotechnol. . 2010, v. 13, n. 6, p. 1-13, 2010.
MEDEIROS, G. E.; BROCCHI, E. A. Pirólise de biomassa e obtenção de substâncias

húmicas. XV Seminário de Iniciação Científica PUC - Rio Departamento de
Ciência dos Materiais e Metalurgia, Agosto 2007.
MELO, I. S.; SANHUEZA, R. M. V. Métodos de Seleção de Microrganismos

Antagônicos a Fitopatógenos. Manual Técnico. 1. ed. Jaguariúna: EMBRAPA -
Meio Ambiente, 1995. v. 1. 72 p.
MINUSSI R. C. Produção, purificação, caracterização e aplicação industrial de lacase

fúngica. Tese (Doutorado) - Faculdade de Engenharia de Alimentos /UNICAMP,
87p.; 2002.

117

MINUSSI R. C., MORAES S.G.; PASTORE, G.M.; DURÁN, N. Biodecolorization

screening of synthetic dyes by four white-rot fungi in a solid medium: possible role of
siderophores.Letters in Appliend Microbiology.v. 33, n.1 p 21-25, 2001.
MIRANDA, A. B.; TEIXEIRA, B. A. do N. Indicadores para o monitoramento da

sustentabilidade em sistemas urbanos de água e esgotamento sanitário, Engenharia
Sanitária e ambiental (ABES), v. 9, n. 4, p. 269-279, out./dez. 2004.
MOREIRA NETO, S. L. Enzimas ligninolíticas produzidas por Psilocybe castanella

CCB444 em solo contaminado com hexaclorobenzeno. Dissertação (mestrado) -
Instituto de Botânica da Secretaria de Estado do Meio Ambiente, São Paulo, 110 p.
2006.
MOREIRA, A. B.; OLIVEIRA, L. C.; SANTOS, A.; ROCHA, J. C.; SANTOS, A. R.

S.; BISINOTI, M. C. Fracionamento de substâncias húmicas por ultrafiltração: Um
sistema simples e versátil. 31º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química
(RASBQ), 2008.
MUNARI, F. M .; GAIO, T. A.; DILLON, A. J. P. (2003). Cinética da secreção de

lacases e peroxidases e degradação de fenóis totais em cultivo submerso de pleurotus
sajor-caju com efluentes da indústria papeleira. Artigo apresentado na XIV
SINAFERM, Florianópolis, Brasil, 2003.
ONNEBY, K. JONSSON, A.; STENSTROM. J. A new concept for reduction of diffuse

contamination by simultaneous application of pesticide and pesticide-degrading
microrganismos. Biodegradation, v. 21, n. 1, p. 21-29, 2010.
PADILHA, G. S.; ALEGRE, R. M.; TAMBOURGI, E. B.; CURVELO SANTANA, J.

C.; FERREIRA, J. F. Purificação de lípases em coluna de cromatografia de troca iônica
com leito expandido. 48º CBQ (XLVIII Congresso Brasileiro de Química, Tema:
“Química na Proteção ao Meio Ambiente e à Saúde”), set./out., 2008.
POINTING S. B.; VRIJMOED, L. L. P. Descoloration of azo and triphenylmethane

dyes by Pycnosporus sanguineus producing laccase an the sole phenol oxidase. Wold
Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 16, p. 317-318, 2000.
PAULA, J. R. Estudo da influência das substâncias húmicas na absorção de metais por

plantas através de técnicas analíticas. Dissertação (mestrado) - IFQSC/Universidade de
São Carlos- SP, 1992. 93 p.
POLLI, V. R. G.; SANTOS, M. A. S.; VENDRAME Z. B.; M.; FRANCO, A. E.;

PASINI S. M. Estudo da complexação entre as substâncias húmicas e o íon cobre em
solução aquosa. XVI Encontro de Química da Região Sul (16-SBQSul), FURB, 13 a
15 de novembro de 2008.
RESENDE, M. I.; BARBOSA, A. M.; VASCONCELOS, F. D.; HADDAD, R.;

DEKKER, R. F. H. Growth and production of laccases by the ligninolytic fungi,
Pleurotus ostreatus and Botrysphaeria rhodina, cultured on basal medium containing the

118

herbicide, Scepter® (imazaquin), Journal of Basic Microbiology, v. 45, n. 6, p. 454-

474, 2005.
REZACOVA, V.; GRYNDLER, M. Fluorescence spectroscopy: a tool to characterize

humic substances in soil colonized by microorganisms? Folia Microbiol. v. 51, n. 3, p.
215–221, 2006.
ROCHA, J. C.; ZARA L. F.; ROSA, A. H.; SARGENTINI JUNIOR, É; BURBA, P.

Substâncias húmicas: sistema de fracionamento seqüencial por ultrafiltração com base
no tamanho molecular. Química Nova, v. 23, n. 3, p. 410- 412, 2000.
ROSA, A. H., ROCHA; J. C.; FURLAN M.. Substâncias húmicas de turfa: estudo dos
parâmetros que influenciam no processo de extração alcalina. Química nova, v. 23, n.
4, p. 472-476, 2000.
ROSALES, M. A.; OLIVEIRA, O. S.; MOURA, M. A.; LOURES, E. G. Influência das

adubações orgânicas e mineral contínuas sobre as características das frações das
substâncias húmicas do solo. Revista Ceres, v. 46 n. 263, p. 67-81, 1999.
SAMPAIO, G. M. M. S.; SANTOS, E. M. A.; LEITÃO, R. C.; FACÓ, A. M.;

MENEZES, E. A.; SANTAELLA, S. T. Pós-tratamento de efluente de um reator UASB
através de um reator biológico com fungos. Engenharia sanitária e ambiental, v. 9, n
1, jan/mar, p. 73-81, 2004.
SANEAGO, Manual de operação de estação de tratamento de água; Apostila -

Gerência de desenvolvido de pessoal, 2005. 119 p.
SANTOS, A. B. Fundamentos da biotecnologia aplicada à remoção de cor de esgotos

têxteis. Revista Tecnologia, Fortaleza, v. 26, n. 1, p. 80-90, jun. 2005.
SANTOS, A. B.; MATSUMOTO, T. Remoção de cor da água de abastecimento em

diferentes níveis de pH. In: Federación Méxicana de Ingenieria Sanitaria y Ciencias
Ambientales; AIDIS. Gestión inteligente de los recursos naturales: desarrollo y salud.
XXVIII Congresso interamericano de Ingenieria Sanitaria Y Ambiental-
FEMISCA: México, p.1-4, out., 2002.
SANTOS, E. M. A;. SAMPAIO, G. M. M. S.; LEITÃO, R. C.; FACÓ, A. M.;

MENEZES, E. A.; SANTAELLA,S. T. Influência do tempo de detenção hidráulica em
um sistema UASB seguido de um reator biológico com fungos para tratar efluentes de
indústria de castanha de caju. Engenharia sanitária ambiental, v.11, n. 1- jan/mar, p.
39-45, 2006.
SANTOS, H. O.; LOURENÇO, S. R.; OLIVEIRA, A. F. Caracterização das substâncias

húmicas aquáticas com uso de espectroscopia de UV-VIS. Revista Tecnológica, v. 17,
p. 29-38, 2008.
SARGENTINI JUNIOR, É.; ROCHA J. C.; ROSA, A. H.; ZARA, L. F.; SANTOS, A.
Substâncias húmicas aquáticas: fracionamento molecular e caracterização de rearranjos

119

internos após complexação com íons metálicos. Química Nova,v. 24, n 3, p. 339-344,
2001.
SILVA, C. M. M. S.; FAY, E. F. Agrotóxicos aspectos gerais. In: SILVA, C. M. M. S.;

FAY, E. F (Org.). Agrotóxicos e Ambiente. Brasília: EMBRAPA, 2004, cap. 1, p. 17-
67.
SILVA, S. R.; RABELO, J. N.; LUCENA, R. M. S.; SANTAELLA, S. T. Tratamento

de água residuária utilizando o fungo aspergillus niger isolado do efluente de uma
refinaria de petróleo. 48º Congresso Brasileiro de Química, IC- Iniciação Científica,
Rio de Janeiro/RJ, 2008.
SIMÕES, M. L.; SANTOS, L. M.; SILVA, W. T. L.; MILORI, D. M. B. P.; MELO, W.

J.; MARTIN-NETO, L. Caracterização de substâncias húmicas extraídas de solos
submetidos à adição de lodo de esgoto por ressonância paramagnética eletrônica (RPE).
29º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (RASQ), 2006.
SOUZA, A. F.; ROSADO, F. R. Utilização de fungos basidiomicetes em biodegradação

de efluentes têxteis. Revista em Agronegócios e Meio Ambiente, v.2, n.1, p. 121-139,
jan./abr. 2009.
STEFFEN, K. T.. Degradation of recalcitrant biopolymers and polycyclic aromatic

hydrocarbons by litter-decomposing basidiomycetous fungi. Dissertation in
Microbiology - Department of Applied Chemistry and Microbiology, University of
Helsinki, Helsinki 2003.
SZKLARZ, G.D.; A NTIBUS, R.K.; SINSABAUGH, R.L.; L INKINS, A.E.

Production of phenol oxidases and peroxidases by woodrotting fungi. Mycologia, v.81,
n.2, p.234-240, 1989.
TANGERINO, E. P.; DI BERNARDO, L. Remoção de substâncias húmicas em sistema

de oxidação com peróxido de hidrogênio e ozônio In: Federación Méxicana de
Ingenieria Sanitaria y Ciencias Ambientales; AIDIS. Gestión inteligente de los recursos
naturales: desarrollo y salud. XXVIII Congresso interamericano de Ingenieria
Sanitaria Y Ambiental- FEMISCA: México, p.1-6, out., 2002.
TANGERINO, E. P.; DI BERNARDO. L. Remoção de substâncias húmicas por meio

da oxidação com ozônio e peróxido de hidrogênio e FIME. Engenharia sanitária
ambiental, v. 10, n. 4 out/dez, p. 290-298, 2005.
TEIXEIRA, M. R.; LUCAS, H.; ROSA, M. J. Remoção de matéria orgânica natural por
ultrafiltração. caso de estudo: ETA de alcantarilha. Actas do 2º Encontro Nacional de
Entidades Gestoras de Água e Saneamento - ENEG 2001. Lisboa, 9 a 11 de Outubro
2001.
TIEN, M.; KIRK, T. K. Lignin-degrading enzyme from Phanerochaete chrysosporium:

purification, characterization, and catalytic properties of a unique H2 O2 - requiring
oxygenase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, Washington, v. 81, n. 8, p. 2280–2284, 1984.

120

WIECHETECK, G. K.; BENINI, B. D. D. S.; LUIZ DI BERNARDO Remoção de

substâncias húmicas utilizando dupla filtração com filtro ascendente de areia grossa ou
de pedregulho. Engenharia sanitária e ambiental, v. 9, n. 2, abr/jun, p. 156-164, 2004.
ZHOU, J. L.; BANKS, C. J. Mechanism of humic acid colour removal from natural
waters by fungal biomass biosorption. Chemosphere, v. 27, n. 4, p. 607-620, 1993.
ZÚÑIGA U. F. R.; MILORI, D. M. B. P.; SILVA, W. T. L. SIMÕES, M. L.; MARTIN

NETO L.; ROCHA, J. C. Monitoramento de Mudanças Estruturais das Substâncias
Húmicas Aquáticas do Rio Negro AM em função da sazonalidade. 29º Reunião Anual
da Sociedade Brasileira de Química, 2006.

121

APÊNDICE – A
Atividades Enzimáticas

122

Quadro A – 01: Atividade enzimática do Pycnosporus sanguineus com ácido fúlvico.
Lcc pH 3,0/ frasco 1 Lcc pH 3,0/ frasco 2 Lcc pH 3,0/ frasco 3

sem AF com AF sem AF com AF sem AF com AF
U/mL 10º 15º U/mL 10º 15º U/mL 10º 15º
1,824 0,107 1,959 0,059 0,992 0,050
1,959 0,050 2,097 0,289 1,884 0,035
Med 1,8915 0,0785 Med 2,028 0,174 Med 1,438 0,0425

1,472 0,062 1,264 0,016 1,577 0,025
1,369 0,045 1,406 0,029 2,586 0,055
Med 1,4205 0,0535 Med 1,335 0,0225 Med 2,0815 0,04

1,209 0,007 1,564 0,016 1,200 0,020
1,197 0,059 1,39 0,072 1,455 0,097
Med 1,203 0,033 Med 1,477 0,044 Med 1,3275 0,0585
LiP pH 3,0/ frasco 1 LiP pH 3,0/ frasco 2 LiP pH 3,0/ frasco 3

U/mL 10º 15º U/mL 15º U/mL 10º 15º
0,39 0,0 0,39 0,003 0,23 0,002
0,32 0,0 0,31 0,001 0,30 0,001
Med 0,355 0,0 Med 0,35 0,002 Med 0,265 0,0015

0,40 0,001 0,36 0,001 0,31 0,001
0,37 0,000 0,43 0,001 0,38 0,002
Med 0,385 0,001 Med 0,395 0,001 Med 0,345 0,0015

123

Quadro A – 01: Atividade enzimática do Pycnoporus sanguineus com ácido fúlvico

(continuação...)

sem AF com AF sem AF com AF U/mL sem AF com AF
10º 15º U/mL 15º 10º 15º
0,24 0,0010 0,30 0,000 0,31 0,001
0,29 0,0000 0,37 0,002 0,41 0,000
Med 0,265 0,0005 Med 0,335 0,001 Med 0,36 0,0005
MnP pH 3,0/ frasco 1 MnP pH 3,0/ frasco 2 MnP pH 3,0/ frasco 3

0,34 0,000 0,43 0,0 0,23 0,0
0,42 0,000 0,41 0,0 0,21 0,0
Med 0,38 0,0 Med 0,42 0,0 Med 0,22 0,0

0,22 0,000 0,21 0,001 0,13 0,00
0,45 0,002 0,11 0,000 0,32 0,00
Med 0,335 0,001 Med 0,16 0,0005 Med 0,225 0

0,24 0,0 0,24 0,0 0,31 0,001
0,29 0,0 0,35 0,0 0,42 0,000
Med 0,265 0 Med 0,295 0 Med 0,365 0,0005

124

Quadro A – 02: Atividade enzimática do Trametes villosa com ácido fúlvico.

2,04 0,033 3,12 0,024 2,45 0,034
2,1 0,031 2,13 0,021 1,980 0,026
Med 2,07 0,032 Med 2,625 0,0225 Med 2,215 0,030

1,76 0,007 2,17 0,023 3,35 0,014
3,23 0,015 1,46 0,027 2,13 0,060
Med 2,495 0,011 Med 1,815 0,025 Med 2,74 0,037

2,03 0,040 1,56 0,040 1,94 0,056
2,74 0,011 2,13 0,014 1,55 0,014
Med 2,385 0,0255 Med 1,845 0,027 Med 1,745 0,035

0,11 0,0 0,12 0,0 0,13 0,0
0,09 0,0 0,11 0,0 0,12 0,0
Med 0,1 0,0 Med 0,115 0,0 Med 0,125 0,0

0,14 0,0 0,15 0,0 0,143 0,0
0,13 0,0 0,12 0,0 0,150 0,0
Med 0,135 0 Med 0,135 0,0 Med 0,1465 0,0

125

Quadro A – 02: Atividade enzimática do Trametes villosa com ácido fúlvico

(continuação...)

sem AF com AF sem AF com AF U/mL sem AF com AF
10º 15º U/mL 15º 10º 15º
0,12 0,0 0,11 0,001 0,09 0,001
0,12 0,0 0,09 0,000 0,08 0,000
Med 0,12 0,0 Med 0,1 0,0005 Med 0,085 0,0005

0,002 0,0 0,003 0,0 0,0 0,0
0,001 0,0 0,001 0,0 0,0 0,0
Med 0,0015 0 Med 0,002 0 Med 0 0

0,03 0,0 0,192 0,03 0,123 0,01
0,02 0,0 0,153 0,02 0,111 0,01
Med 0,025 0 Med 0,1725 0,025 Med 0,117 0,01

0,001 0,0 0,0 0,0 0 0,001
0,0 0,0 0,0 0,0 0 0,000
Med 0,0005 0 Med 0 0 Med 0 0,0005

126

Quadro A – 03: Atividade enzimática do Pycnoporus sanguineus com ácido húmico da

Sigma-Aldrich®
Lcc frasco 1 Lcc frasco 2 Lcc frasco 3

sem AH com AH sem AH com AH sem AH com AH
3,16 0,405 3,270 0,108 2,70 0,850
4,7 0,205 2,927 0,203 2,9 0,799
Med 3,93 0,305 Med 3,0985 0,1555 Med 2,8 0,8245
LiP frasco 1 LiP frasco 2 LiP frasco 3

0,35 0,001 0,32 0,0 0,34 0,001
0,23 0,001 0,39 0,0 0,42 0,0
Med 0,29 0,0 Med 0,355 0,0 Med 0,38 0,0
MnP frasco 1 MnP frasco 2 MnP frasco 3

0,42 0,0 0,25 0,0 0,25 0,00
0,21 0,0 0,47 0,0 0,28 0,001
Med 0,315 0,0 Med 0,36 0,0 Med 0,265 0,0

127

Quadro A – 04: Atividade enzimática do Pycnoporus sanguineus com ácido húmico extraído

3,21 0,029 3,12 0,038 1,55 0,037
2,13 0,225 1,89 0,225 2,58 0,190
Med 2,67 0,127 Med 2,505 0,1315 Med 2,065 0,1135

0,4 0,002 0,32 0,000 0,25 0,0
0,31 0,0 0,39 0,001 0,36 0,0
Med 0,355 0,0 Med 0,355 0,0 Med 0,305 0,0

0,34 0,09 0,43 0,002 0,22 0,003
0,19 0,003 0,32 0,001 0,4 0,001
Med 0,265 0,0 Med 0,375 0,0 Med 0,31 0,0

128

Quadro A – 05: Atividade enzimática do Trametes villosa com ácido húmico Sigma-Aldrich®

3,850 0,07 3,900 0,2 2,151 0,01
3,711 0,02 3,998 0,34 3,277 0,03
Med 3,7805 0,045 Med 3,949 0,27 Med 2,714 0,02

0,1 0,0 0,23 0,0 0,08 0,0
0,12 0,0 0,27 0,0 0,097 0,0
Med 0,11 0,0 Med 0,25 0,0 Med 0,0885 0,0

0,25 0,0 0,09 0,0 0,12 0,0
0,14 0,0 0,15 0,0 0,11 0,0
Med 0,195 0,0 Med 0,12 0,0 Med 0,115 0,0

129

Quadro A – 06: Atividade enzimática do Trametes villosa com ácido húmico extraído

2,713 0,34 3,680 0,1 2,164 0,1
2,260 0,07 2,125 0,3 2,707 0,2
Med 2,4865 0,205 Med 2,9025 0,2 Med 2,4355 0,15

0,2 0,0 0,09 0,0 0,13 0,0
0,1 0,0 0,1 0,0 0,18 0,0
Med 0,15 0,0 Med 0,095 0,0 Med 0,155 0,0

0,130 0,002 0,23 0,00 0,20 0,0
0,12 0,001 0,34 0,001 0,24 0,0
Med 0,125 0,0015 Med 0,285 0,002 Med 0,22 0

130


Pycnoporus sanguineus com ácido fúlvico
Lcc (U/mL) n Média DP Min Max p

10 dias
pH 3,0 3 1,79 0,31 1,44 2,03
pH 5,0 3 1,61 0,41 1,34 2,08
pH 7,0 3 1,34 0,14 1,20 1,48
Total 9 1,58 0,33 1,20 2,08 0,269
15 dias
pH 3,0 3 0,10 0,07 0,04 0,17
pH 5,0 3 0,04 0,02 0,02 0,05
pH 7,0 3 0,05 0,01 0,03 0,06
Total 9 0,06 0,05 0,02 0,17 0,225
LiP (U/mL) n Média DP Min Max p

10 dias
pH 3,0 3 0,32 0,05 0,27 0,36
pH 5,0 3 0,38 0,03 0,35 0,40
pH 7,0 3 0,32 0,05 0,27 0,36
Total 9 0,34 0,05 0,27 0,40 0,295
15 dias
pH 3,0 3 0,00117 0,00104 0,00000 0,00200
pH 5,0 3 0,00117 0,00029 0,00100 0,00150
pH 7,0 3 0,00067 0,00029 0,00050 0,00100
Total 9 0,00100 0,00061 0,00000 0,00200 0,579
MnP (U/mL) n Média DP Min Max p

10 dias
pH 3,0 3 0,34 0,11 0,22 0,42
pH 5,0 3 0,24 0,09 0,16 0,34
pH 7,0 3 0,31 0,05 0,27 0,37
Total 9 0,30 0,09 0,16 0,42 0,396
15 dias
pH 3,0 3 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
pH 5,0 3 0,00050 0,00050 0,00000 0,00100
pH 7,0 3 0,00017 0,00029 0,00000 0,00050
Total 9 0,00022 0,00036 0,00000 0,00100 0,252

131


Trametes villosa com ácido fúlvico
Lcc (U/mL) n Média DP Min Max p

10 dias
pH 3,0 3 2,30 0,29 2,07 2,63
pH 5,0 3 2,35 0,48 1,82 2,74
pH 7,0 3 1,99 0,34 1,75 2,39
Total 9 2,22 0,37 1,75 2,74 0,495
15 dias
pH 3,0 3 0,028 0,005 0,023 0,032
pH 5,0 3 0,024 0,013 0,011 0,037
pH 7,0 3 0,029 0,005 0,026 0,035
Total 9 0,027 0,008 0,011 0,037 0,775
LiP (U/mL) n Média DP Min Max p

10 dias
pH 3,0 3 0,11 0,01 0,10 0,13
pH 5,0 3 0,14 0,01 0,14 0,15
pH 7,0 3 0,10 0,02 0,09 0,12
Total 9 0,12 0,02 0,09 0,15 0,033
15 dias
pH 3,0 3 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
pH 5,0 3 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
pH 7,0 3 0,00033 0,00029 0,00000 0,00050
Total 9 0,00011 0,00022 0,00000 0,00050 0,079
MnP (U/mL) n Média DP Min Max p

10 dias
pH 3,0 3 0,0012 0,0010 0,0000 0,0020
pH 5,0 3 0,1048 0,0745 0,0250 0,1725
pH 7,0 3 0,0002 0,0003 0,0000 0,0005
Total 9 0,0354 0,0640 0,0000 0,1725 0,052
15 dias
pH 3,0 3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
pH 5,0 3 0,0117 0,0126 0,0000 0,0250
pH 7,0 3 0,0002 0,0003 0,0000 0,0005
Total 9 0,0039 0,0086 0,0000 0,0250 0,159

132

Quadro A – 09: Análise de variância – Teste Tukey da atividade

enzimática do Trametes villosa com ácido fúlvico
LiP (U/mL) p
10 dias
pH 3,0 Ph 5,0 0,117
Ph 7,0
pH 5,0 Ph 7,0 0,030

Pycnoporus sanguineus com ácido fúlvico
Fator n Média DP p
Lcc (U/mL)
10 dias 9 1,578 0,330
15 dias 9 0,061 0,045 <0,001
LiP (U/mL)
10 dias 9 0,339 0,046
15 dias 9 0,001 0,001 <0,001
MnP (U/ml)
10 dias 9 0,296 0,086
15 dias 9 0,000 0,000 <0,001

Trametes villosa com ácido fúlvico
Fator n Média DP p
Lcc (U/mL)
10 dias 9 2,215 0,369
15 dias 9 0,027 0,008 <0,001
LiP (U/mL)
10 dias 9 0,118 0,020
15 dias 9 0,00011 0,00022 <0,001
MnP (U/mL)
10 dias 9 0,035 0,064
15 dias 9 0,0039 0,0086 0,130

133

Quadro A – 12: Análise estatística descritiva de Trametes villosa com

ácido fúlvico em reator estático (Jar Test)
Fator N Média DP Min Max
10º dia
Lcc (U/mL) 3 2,12 0,35 1,81 2,50
LiP (U/mL) 3 0,07 0,08 0,02 0,16
MnP (U/mL) 3 0,09 0,02 0,08 0,11
Total 9 0,76 1,04 0,02 2,50
24 h
Lcc (U/mL) 3 0,67 0,18 0,56 0,88
LiP (U/mL) 3 0,00 0,00 0,00 0,01
MnP (U/mL) 3 0,00 0,00 0,00 0,00
Total 9 0,22 0,35 0,00 0,88
Quadro A – 13: Análise estatística descritiva de Pycnoporus

sanguineus com ácido húmico em reator estático (Jar Test)
10º dia
Lcc (U/mL) 3 2,83 0,79 1,94 3,43
LiP (U/mL) 3 0,10 0,04 0,06 0,13
MnP (U/mL) 3 0,09 0,03 0,06 0,11
Total 9 1,01 1,42 0,06 3,43
24 h
Lcc (U/mL) 3 1,26 0,43 0,81 1,66
LiP (U/mL) 3 0,01 0,01 0,00 0,02
MnP (U/mL) 3 0,00 0,00 0,00 0,00
Total 9 0,42 0,66 0,00 1,66
Quadro A – 14: Análise estatística descritiva de Trametes villosa com

ácido húmico nos experimentos em reator estático (Jar Test)
10º dia
Lcc (U/mL) 3 2,02 0,46 1,73 2,55
LiP (U/mL) 3 0,06 0,02 0,04 0,08
MnP (U/mL) 3 0,07 0,05 0,02 0,11
Total 9 0,72 1,00 0,02 2,55
24 h
Lcc (U/mL) 3 1,01 0,19 0,89 1,24
LiP (U/mL) 3 0,01 0,01 0,00 0,02
MnP (U/mL) 3 0,00 0,00 0,00 0,00
Total 9 0,34 0,51 0,00 1,24

134

Quadro A – 15: Análise estatística descritiva de do Trametes villosa com ácido húmico
Sigma-Aldrich®
Lcc (U/mL) n Média DP Min Max
3,48 0,67 2,71 3,95
10º dia 3
0,11 0,14 0,02 0,27
15º dia 3
1,80 0,02 3,95
Total 6
extraído
2,61 0,26 2,44 2,90
10º dia 3
0,19 0,03 0,15 0,21
15º dia 3
1,40 0,15 2,90
Total 6
Sigma-Aldrich®
LiP (U/mL) n Média DP Min Max
0,15 0,09 0,09 0,25
10º dia 3
0,00 0,00 0,00 0,00
15º dia 3
0,07 0,00 0,25
Total 6
extraído
0,13 0,03 0,10 0,16
10º dia 3
0,00 0,00 0,00 0,00
15º dia 3
0,06 0,00 0,16
Total 6

135

Sigma-Aldrich®
MnP (U/mL) n Média DP Min Max
0,14 0,04 0,12 0,20
10º dia 3
0,00 0,00 0,00 0,00
15º dia 3
0,07 0,12 0,20
Total 6
extraído
0,21 0,08 0,13 0,29
10º dia 3
0,00 0,00 0,00 0,00
15º dia 3
0,11 0,00 0,29
Total 6

húmico Sigma-Aldrich®
3,28 0,59 2,80 3,93
10º dia 3
0,43 0,35 0,16 0,82
15º dia 3
1,85 0,16 3,93
Total 6

húmico extraído
2,41 0,31 2,07 2,67
10º dia 3
0,12 0,01 0,11 0,13
15º dia 3
1,27 0,11 2,67
Total 6

136


0,34 0,05 0,29 0,38
10º dia 3
0,00050 0,00 0,00 0,00
15º dia 3
0,17 0,00 0,38
Total 6

húmico extraído
0,34 0,03 0,31 0,36
10º dia 3
0,00 0,00 0,00 0,00
15º dia 3
0,17 0,00 0,36
Total 6

0,31 0,05 0,27 0,36
10º dia 3
0,00 0,00 0,00 0,00
15º dia 3
0,16 0,00 0,36
Total 6

húmico extraído
0,32 0,06 0,27 0,38
10º dia 3
0,00 0,00 0,00 0,00
15º dia 3
0,16 0,00 0,38
Total 6

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

RYKELLY FARIA CAMPOS

ESTUDO DO POTENCIAL DE REMOÇÃO DE SUBSTÂNCIAS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

RYKELLY FARIA CAMPOS

ESTUDO DO POTENCIAL DE REMOÇÃO DE SUBSTÂNCIAS

Dissertação apresentada no Programa de Pós-Graduação

FICHA AVALIATIVA DE APROVAÇÃO

RYKELLY FARIA CAMPOS

ESTUDO DO POTENCIAL DE REMOÇÃO DE SUBSTÂNCIAS HÚMICAS NA

Profa. Dra. Mariângela Fontes Santiago

Prof. Dr. Edson Pereira Tangerino

Profa. Dra. Kátia Alcione Kopp

Warde Antonieta de Fonseca Zang

Dedico este trabalho:

Aos meus Pais, LUZIA HELENA e AFONSO CAMPOS pela educação

Ao meu namorado Guilherme Rodrigues, por fazer parte da minha

Meus sinceros agradecimentos.

CAMPOS, R. F. ESTUDO DO POTENCIAL DE REMOÇÃO DE SUBSTÂNCIAS

As substâncias húmicas (SHs), matéria orgânica em diferentes estágios de degradação

Palavras-chave: ácidos húmico, ácidos fúlvico, fungos de decomposição branca

CAMPOS, R. F. STUDY OF POTENTIAL REMOVAL OF HUMIC

Key Words: humic acid, fulvic acid, white decomposition by fungi.

Figura 1 (A): Estado da arte do conceito estrutural de um ácido húmico (A)-----------29

Figura 12: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) da Lacase de Trametes

Figura 23: Espectros de ultravioleta e visível (UV-vis) das amostras de Pycnoporus

Figura 33: Espectros de ultravioleta e visível (UV-Vis) das amostras de Pycnoporus

Figura 45: Determinação das atividades enzimáticas (U.mL-1) de Trametes vilosa de

Quadro 1: Enzimas fúngicas estudadas-------------------------------------------------------41

APÊNDICE A – LISTA DE QUADROS

Quadro A – 01: Atividade enzimática do Pycnoporus sanguineus com ácido fúlvico

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

SHs Substâncias húmicas

5.5 MICRORGANISMOS E PREPARO DO MEIO DE CULTURA---------------------52

6.1 EXTRAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS HÚMICAS, PUFICAÇÃO E

6.2.5 Resultado da produção enzimática por Pycnoporus. sanguineus e Trametes

Os problemas ambientais existentes no mundo de hoje são extremamente

As SHs possuem natureza heterogênea e complexa. Pouco se sabe sobre sua

tecnologias e processos de tratamento para a remoção de matéria orgânica vêm sendo

Devido a enorme necessidade de sistemas de tratamento de água serem alto

húmicos. Sendo, portanto essencial que as substâncias húmicas sejam removidas da

3.1 OBJETIVO GERAL

3.1.2 Objetivos específicos:

• Extrair, purificar ácidos húmicos e fúlvicos de amostras de solo de uma área do

município de Goiânia – GO;

• Caracterizar os ácidos húmicos destas amostras de solo;

• Solubilizar os ácidos húmicos e fúlvicos em água para tratamento com fungos;

• Determinar enzimas fúngicas (peroxidases e fenoloxidases) que são responsáveis

pela degradação dos ácidos húmicos e fúlvicos;

• Verificar a viabilidade de tratamento (degradação) destas substâncias por meio

das enzimas fúngicas;

• Verificar quais dos fungos utilizados no estudo são melhores produtores

enzimáticos e melhor consegue remover os ácidos húmicos extraídos e

adquiridos da Sigma-Aldrich® e o ácido fúlvico;

• Avaliar se houve adsorção fúngica dos ácidos húmicos e fúlvicos;

• Verificar a eficácia do tratamento com enzimas fúngicas na remoção dos ácidos

em estudo com o uso de reator estático (Jar Test);

4.1 SUBSTÂNCIAS HÚMICAS

microrganismos (TANGERINO E DI BERNARDO, 2005, ZÚÑIGA et al., 2006). As

4.1.1 Composição das substâncias húmicas

A crescente demanda de consumo de água proveniente do abastecimento

As SHs são macro-moléculas complexas, constituídas de diferentes

4.1.2 Fracionamento das substâncias húmicas

A MON do solo constitui o maior reservatório de carbono da superfície