Curso de Farmácia

Química Geral e Inorgânica

COEFICIENTE DE PARTIÇÃO OCTANOL-ÁGUA

DO VIOLETA DE GENCIANA

Trabalho Laboratorial da Unidade Curricular de

Química Geral e Inorgânica

1.º ano do curso de Farmácia

Luísa Bia
 I. Resumo
Para a realização deste trabalho laboratorial foram necessários 2 procedimentos. O primeiro permitiu--
nos construir uma curva de calibração e o segundo permitiu-nos determinar o coeficiente de partição
octanol--água.
Para que conseguíssemos, posteriormente, construir a curva de calibração, começámos por preparar
uma solução rigorosa de violeta de genciana a 15 µM, colocando num balão volumétrico de 25ml, 294µl de
uma solução de violeta de genciana a 1,28mM e enchendo o balão com água destilada até à risca. De
seguida pipetámos usando micropipetas os seguintes volumes para cuvettes.

Cuvette Vol. Violeta Vol. H2O /µl

0 15µM0 /µl 1000
1 100 900
2 200 800
3 400 600
4 600 400
5 800 200

Depois, usámos a micropipeta para homogeneizar a solução e lemos a 580nm.

Para determinar o coeficiente de partição do octanol-água começámos por transferir 500µl da solução de
violeta de genciana a 1,28mM para um Erlenmeyer de 50ml, adicionámos 20ml de água e homogeneizámos a
solução. A seguir, retirámos 200µl para uma cuvette, adicionámos 800µl de água e lemos a A580. Depois,
transferimos 2,0 ml de solução anterior para um tubo de centrifuga de 10ml, adicionámos 2,0ml de n-octanol,
tapámos com parafilme e agitámos num vortex por 30 segundos. Centrifugámos durante 2 minutos a 3000 rpm,
até que as duas faces se separaram e com uma pipeta de Pasteur retirámos cerca de 1ml da face aquosa para
um novo tubo de ensaio. Por fim, retirámos 200µl dessa fase aquosa para uma cuvette, adicionámos 800µl de
água e lemos a A580.
Os valores de absorvência que lemos no espetrofotómetro foram realistas, pelo que podemos admitir que
são fiáveis e estão corretos.

II. Objetivo
Determinação do coeficiente de partição do violeta de genciana entre a água e o n-octanol.

III. Introdução
O violeta de genciana ou cloreto de metilrosanilida (C25H30ClN3) é um corante muito usado
histologicamente. É utilizado no processo de coloração de Gram e é um importante agente identificador de
bactérias.
A diferença de solubilidade de um soluto entre duas fases é utilizada em muitos ramos em Farmácia. A
purificação de compostos farmacêuticos e outros de elevado grau de pureza é muitas vezes efetuada por
processos de extração.

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 Como o violeta de genciana absorve a 580 nm, as concentrações de equilíbrio podem ser encontradas por
espectrofotometria construindo-se a curva de calibração com concentrações conhecidas de soluto.
Determinando as concentrações aquosas antes e depois da extração com o n-octanol, encontra-se a
concentração orgânica por subtração das anteriores.
O coeficiente de partição octanol-água (Kow) do violeta de genciana pode ser determinado por extração de
uma solução aquosa de violeta de genciana com um dado volume de n-octanol. No equilíbrio tem-se:

C 25 H 30 Cl N 3 ( Aq ) ⇆C25 H 30 Cl N 3 (n−octanol)
e

[ C25 H 30 Cl N 3 ] (n−octanol)
K ow =
[ C25 H 30 Cl N 3 ] ( Aq )

IV. Materiais e Métodos

Materiais:
1 tubo de centrifugação de 10 ml
1 tubo de ensaio 10 ml
1 balão volumétrico de 25,00 ml
8 cuvettes visível
2 pipetas de 5,0 ml
1 Erlenmeyer 50 ml
1 proveta 25 ml
1 micropipeta de 200 µl
1 micropipeta de 1000 µl
1 pipeta Pasteur
Suporte de tubos de ensaio
Pompete
Vortex
Espectrofotómetro

Reagentes:
Violeta de genciana 15,0 µM
Violeta de genciana 1,28 mM
n-octanol
Água destilada

Métodos:
Preparação de solução com concentração rigorosa
Homogeneização de soluções
Pipetagem com micropipeta
Leitura da absorvência utilizando um espetrofotómetro
Agitação em vortex

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Centrifugação
V. Resultados

Curva de calibração
Tabela I – Dados para a elaboração da curva de calibração
Cuvette [violeta] / M A580
0 0 0
1 1,5 0,143
2 3 0,349
3 6 0,519
4 9 0,749
5 12 0,789

NOTA: A última medição foi desprezada para a elaboração do gráfico porque o valor obtido foi muito
diferente do pretendido, devido a um erro de medição, pois, apesar do valor obtido ser maior que o obtido
anteriormente, não é tão diferente do anterior como era suposto.

0.8
f(x) = 0.08 x + 0.03
0.7 R² = 0.98

0.6

0.5
A580 (nm)

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12 14
Concentração (µM)

Gráfico 1 – Curva de Calibração

Determinação do coeficiente de partição octanol-água

Tabela II – Concentrações calculadas para a determinação do coeficiente octanol-água

A580 [violeta]cuvette / M [violeta]solução / M
Solução inicial 0,428 4,83 24,15
Fase aquosa 0,074 0,49 2,45
Fase orgânica (n-octanol) 21,7

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Kow = 8,86
Cálculos para a determinação do coeficiente de partição

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VI. Discussão e Conclusões
Para a construção da curva de calibração, foram feitas 5 diluições da solução padrão em cuvettes que,
posteriormente, foram lidas a A580 e em cada uma delas colocamos maior volume de solução padrão que
na cuvette anterior. Sendo assim, cada solução presente na cuvette tinha maior concentração do que a que
tinha sido preparada anteriormente.
Teoricamente, quanto mais concentrada é a solução, maior é a absorvência da mesma. Deste modo,
lendo as cuvettes pela mesma ordem pela qual foram preparadas as diluições nelas presentes, pode prever-
se que a absorvência lida pelo espetrofotómetro aumente a cada uma das leituras feitas.
As leituras que efetuámos a A580 revelaram, realmente, um aumento da absorvência a cada uma delas.
Assim, conclui-se que as diluições feitas nas cuvettes tenham sido devidamente preparadas e que as leituras
feitas do espetrofotómetro estejam corretas.

O declive da curva de calibração que obtemos tem um valor positivo e o valor de R2 encontra-se entre
0,8 e 1 tal como esperávamos.
Na segunda parte da experiência, os valores obtidos para a concentração de violeta de genciana nas
cuvettes e para a absorvência foram também satisfatórios, pois, era previsível que o valor da concentração
na solução inicial fosse superior ao valor da concentração na fase aquosa, devido ao facto de a solução na
fase aquosa ter sofrido uma diluição pela adição de n-octanol. Sendo maior o valor da concentração, é
também maior o valor da absorvência, tal como havíamos constatado anteriormente.
Em relação aos valores obtidos para a concentração da solução de violeta de genciana na solução inicial
e na fase aquosa, era espectável que estes fossem superiores aos valores calculados para a concentração de
violeta de genciana das cuvettes na solução inicial e na fase aquosa, respetivamente, pois, as soluções das
cuvettes foram obtidas através da diluição das soluções do Erlenmeyer e do tubo de centrifuga,
respetivamente.
Tendo em conta que os valores das concentrações foram calculados corretamente, pois são realistas,
conclui-se que a concentração da fase orgânica está também correta, visto que o seu valor é calculado
através dos valores de concentração obtidos anteriormente.
Este trabalho laboratorial tinha como objetivo determinar o coeficiente de partição do violeta de
genciana entre a água e o n-octanol. Calculámos o coeficiente de partição a partir dos valores obtidos para a
concentração das soluções na fase orgânica e na fase aquosa. Estes valores, tal como constatamos
anteriormente, estão corretos, e tendo em conta que o cálculo foi feito sem erros, podemos concluir que o
valor do coeficiente de partição entre a água e o n-octanol estão corretos. Assim sendo, admite-se que o
objetivo do trabalho laboratorial foi atingido.

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