Você está na página 1de 813

Embrapa Agrobiologia

Rodovia BR 456, Km 7 (Antiga Rodovia Rio-São Paulo)


Caixa Postal 74.505
23890-000 Seropédica, RJ
Fone: (21) 2682-1230 | Fax: (21) 3441-1560
sac@cnpab.embrapa.br | www.cnpab.embrapa.br

Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA)


Av. General San Martin, 1.371, Bongi
50761-000 Recife, PE
Fone: (81) 3184-7200
www.ipa.br

Embrapa Informação Tecnológica


Parque Estação Biológica (PqEB),
Av. W3 Norte (final)
70770-901 Brasília, DF
Fone: (61) 3448-4236 | Fax: (61) 3448-2494
livraria@embrapa.br | www.embrapa.br/livraria

Instituições responsáveis pelo conteúdo


Embrapa Agrobiologia
Instituto Agronômico de Pernambuco

Unidade responsável pela edição (e-book)


Embrapa Informação Tecnológica

Coordenação editorial: Fernando do Amaral Pereira, Lucilene Maria de Andrade e Juliana


Meireles Fortaleza
Revisão de texto: Maria Cristina Ramos Jubé
Normalização bibliográfica: Márcia Maria Pereira de Souza e Iara Del Fiaco Rocha
Capa: Paula Cristina Rodrigues Franco
Foto da capa (da esquerda para a direita): Júlia Kuklinsky Sobral, Márcia do Vale Barreto
Figueiredo, Marisângela Viana Barbosa e Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos
Conversão e editoração do e-book: WOC Tecnologia da Informação Ltda

1ª edição
1ª impressão (2010): 2.000 exemplares

2ª edição
E-book (2012)
Todos os direitos reservados
Para uso exclusivo de #NOME#. A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou
em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610).
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Embrapa Informação Tecnológica
Biotecnologia aplicada à agricultura : textos de apoio e protocolos experimentais / editores técnicos,
Márcia do Vale Barreto Figueiredo, Hélio Almeida Burity, José de Paula Oliveira, Carolina Etienne
de Rosália e Silva Santos, Newton Pereira Stamford. – 2. ed. – Brasília, DF : Embrapa, 2012.
E-book, no formato ePub, convertido do livro impresso.

ISBN 978-85-7035-011-4

1. Bioética. 2. Biossegurança. 3. Controle biológico. I. Figueiredo, Márcia do Vale Barreto.


II. Burity, Hélio Almeida. III. Oliveira, José de Paula. IV. Santos, Carolina Etienne de Rosália e Silva.
V. Stamford, Newton Pereira. VI. Embrapa Agrobiologia. VII.
CDD 631.5233
© Embrapa 2012
Editores Técnicos

Márcia do Vale Barreto Figueiredo


Bióloga, D.Sc. em Microbiologia, pesquisadora do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA/Dipap-CARHP) e professora
membro permanente do Programa de Pós-graduação em Ciências
do Solo da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE),
Recife, PE
marcia.figueiredo@ipa.br

Hélio Almeida Burity


Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Microbiologia Aplicada,
pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) e
professor membro permanente da Rede Nordeste de Biotecnologia
(Renorbio), Recife, PE
halmeida@ipa.br

José de Paula Oliveira


Zootecnista, D.Sc. em Biotecnologia, pesquisador do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
jose.paula@ipa.br

Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos


Zootecnista, D.Sc. em Microbiologia do Solo, pesquisadora do
Departamento de Agronomia, professora membro permanente do
Programa de Pós-graduação em Ciências do Solo da Universidade
Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
etienne@depa.ufrpe.br

Newton Pereira Stamford


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Solos e Nutrição de Plantas,
professor da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE),
Recife, PE
newtonps@depa.ufrpe.br
Autores

Adália Cavalcanti do Espírito Santo Mergulhão


Bióloga, D.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisadora do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
adalia.mergulhao@ipa.br

Ademir Sérgio Ferreira de Araújo


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Ecologia de Agroecossistemas,
professor da Universidade Federal do Piauí (Ufpi), Teresina, PI
asfaruaj@yahoo.com.br

Amaro de Castro Lira Neto


Biólogo, M.Sc. em Genética, pesquisador do Instituto Agronômico
de Pernambuco (IPA), Recife, PE
amaro.castro@ipa.br

Ana Dolores Santiago de Freitas


Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Tecnologias Energéticas
Nucleares, pesquisadora do Departamento de Agronomia da
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
ana.freitas@depa.ufrpe.br

Ana Maria Benko Iseppon


Bióloga, Ph.D. em Ciências Naturais, professora da Universidade
Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
ana.iseppon@gmail.com

Andréa Guimarães Vieira de Vasconcelos


Engenheira-agrônoma, M.Sc. em Zootecnia, aluna do Programa
Integrado de Doutorado em Zootecnia da Universidade Federal
Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
andreaguimaraes@bnb.gov.br

Antonio Felix da Costa


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Agronomia (Fitopatologia),
pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife,
PE
felix.antonio@ipa.br

Arminda Saconi Messias


Química, D.Sc. em Ciências da Engenharia Ambiental, professora
da Universidade Católica de Pernambuco (Unicap) e pesquisadora
do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
saconi@unicap.br

Aurenívia Bonifacio Lima


Bióloga, M.Sc. em Botânica, doutoranda do Programa de Pós-
graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará (UFC),
Fortaleza, CE
aurenivialima@bol.com.br

Bartolomeu Acioli-Santos
Biólogo, D.Sc. em Biologia Molecular, pesquisador da Fundação
Oswaldo Cruz, Recife, PE
bartacioli@hotmail.com

Carlos Henrique Madeiros Castelletti


Biólogo, M.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisador do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
henrique@castelletti.com.br
Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos
Zootecnista, D.Sc. em Agronomia (Ciências do Solo), pesquisadora
do Departamento de Agronomia e professora membro permanente
do Programa de Pós-graduação em Ciências do Solo da
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
etienne@depa.ufrpe.br

Christine Lamenha Luna Finkler


Engenheira química, D.Sc. em Engenharia Química, professora da
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
chrislluna@yahoo.com.br

Cláudia Elizabete Pereira de Lima


Bióloga, D.Sc. em Biologia de Fungos, pesquisadora do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
claudiaell@hotmail.com

Cristiane Figueira da Silva


Engenheira florestal, D.Sc. em Produção Vegetal, professora da
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (Uenf),
Campos dos Goytacazes, RJ
cristiane@uenf.br

Darcy Mayra Furtado Gondim


Bióloga, M.Sc. em Bioquímica, doutoranda em Bioquímica pela
Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE
darcymayra@hotmail.com

Deise Maria Fontana Capalbo


Engenheira de alimentos, D.Sc. em Engenharia de Alimentos,
pesquisadora da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna, SP
daise@cnpma.embrapa.br

Deise Maria Passos da Silva


Bióloga, M.Sc. em Fitopatologia, doutoranda em Biotecnologia na
Renorbio, pesquisadora do Instituto Agronômico de Pernambuco
(IPA/Dipap-CARHP), Recife, PE
deise.passos@ipa.br

Djair dos Santos de Lima e Souza


Biólogo, D.Sc. em Ciências Biológicas, profissional autônomo
djairsouza@yahoo.com.br

Ed Paschoal Carrazzoni
Químico, livre-docente, professor da Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE) e da Universidade Católica de Pernambuco
(Unicap), Recife, PE
edcarrazzoni@hotmail.com

Éderson Akio Kido


Engenheiro agrônomo, D.Sc. em Ciências, professor da
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
ederson.kido@gmail.com

Edma Carvalho de Miranda


Zootecnista, D.Sc. em Produção e Nutrição Animal, professora da
Universidade Federal de Alagoas (Ufal), Maceió, AL
edmacdm@qui.ufal.br

Eduardo Romano
Biólogo, D.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisador da Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
romano@cenargen.embrapa.br

Eidy Simões de Souza


Zootecnista, D.Sc. em Agronomia (Ciências do Solo), pesquisadora
do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
eidysimoes@yahoo.com.br

Elaine Malosso
Bióloga, Ph.D. em Ecologia Microbiana, professora da Universidade
Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
elainemalosso@yahoo.com.br

Eliana Maria Gouveia Fontes


Bióloga, Ph.D. em Entomologia, pesquisadora da Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
eliana@cenargen.embrapa.br

Eliane Maria Ribeiro da Silva


Engenheira Florestal, D.Sc. em Agronomia, pesquisadora da
Embrapa Agrobiologia, Brasília, DF
eliane@cnpab.embrapa.br
Ely Nahas
Biólogo, D.Sc. em Bioquímica, professor da Universidade Estadual
Paulista (Unesp), São Paulo, SP
enahas@fcav.unesp.br

Everardo Valadares de Sá Barretto Sampaio


Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Agronomia, professor da
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
esampaio@ufpe.br

Fabiano de Carvalho Balieiro


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Agronomia, pesquisador da
Embrapa Solos, Rio de Janeiro, RJ
balieiro@cnps.embrapa.br

Fatima Maria de Souza Moreira


Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Agronomia (Ciências do Solo),
professora da Universidade Federal de Lavras (Ufla),
Lavras, MG
fmoreira@dcs.ufla.br

Fernando Gomes Barcellos


Biólogo, D.Sc. em Agronomia (Genética e Melhoramento de
Plantas), Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC),
Petrópolis, RJ
fgbarcel@yahoo.com.br

Fernando Gomes da Silva


Engenheiro-agrônomo, M.Sc. em Botânica, pesquisador da
Secretaria de Agricultura, Abastecimento, Pesca e Desenvolvimento
Rural (Seagri), Maceió, AL
gomes_opuntia@yahoo.com.br

Gabriel Maurício Peruca de Melo


Zootecnista, D.Sc. em Zootecnia, professor da Universidade Camilo
Castelo Branco (Unicastelo), Descalvado, SP
gmpmelo@terra.com.br
Geraldo Pereira de Arruda
Biólogo, M.Sc. em Entomologia, pesquisador do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
arrudagp@oi.com.br

Hugo Bruno Correa Molinari


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Agronomia, pesquisador da
Embrapa Agroenergia, Brasília, DF
hugo.molinari@embrapa.br

Ilka Maria Vasconcelos


Farmacêutica, D.Sc. em Ciências Biológicas (Química Biológica),
professora da Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE
imvasco@ufc.br

Janete Magali de Araújo


Química, D.Sc. em Ciências Biológicas (Genética e Melhoramento
de Plantas), professora da Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE), Recife, PE
janetemagali@yahoo.com.br

Jean Luiz Simões de Araújo


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisador
da Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ
jean@cnpab.embrapa.br

Joaquim Albenisio Gomes Silveira


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Agronomia (Solos e Nutrição de
Plantas), professor da Universidade Federal do Ceará (UFC),
Fortaleza, CE
silveira@ufc.br

José Nildo Tabosa


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Tecnologias Energéticas
Nucleares, pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco
(IPA), Recife, PE
tabosa@ipa.br
José de Paula Oliveira
Zootecnista, D.Sc. em Biotecnologia, pesquisador do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
jose.paula@ipa.br

José Tadeu Abreu Oliveira


Biólogo, Ph.D. em Bioquímica, professor da Universidade Federal
do Ceará (UFC), Fortaleza, CE
jtaolive@ufc.br

José Teodorico de Araújo Filho


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Zootecnia, professor da
Universidade Federal de Alagoas (Ufal), Maceió, AL
hircus4@gmail.com

Júlia Kuklinsky Sobral


Biomédica, D.Sc. em Agronomia (Genética e Melhoramento de
Plantas), professora da Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Unidade Acadêmica de Garanhuns (UFRPE/UAG), Garanhuns, PE
jksobral@uag.ufrpe.br

Júlio Zoé de Brito


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Botânica, presidente do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
zoe@ipa.br

Karina Patrícia Vieira da Cunha


Bióloga, Doutora em Agronomia (Ciências do Solo), pesquisadora
da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE
cunhakpv@yahoo.com.br

Kátia Regina dos Santos Teixeira


Bióloga, D.Sc. em Biologia Celular e Molecular, pesquisador da
Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ
katia@cnpab.embrapa.br

Krystyna Gorlach-Lira
Bióloga, Ph.D. em Agronomia (Microbiologia do Solo), professora da
Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa, PB
krysgl@dbm.ufpb.br

Laureen Michelle Houllou-Kido


Bióloga, D.Sc. em Ciências (Energia Nuclear na Agricultura),
pesquisadora do Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste
(Cetene), Recife, PE
laureenhk@yahoo.com

Leda Cristina Mendonça Hagler


Química industrial, D.Sc. em Ciências (Microbiologia), professora da
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro, RJ
leda@mls.com.br

Liane Maria de Almeida Castro Maranhão


Bióloga, M.Sc. em Fitossanidade, pesquisadora do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
liane.maranhao@ipa.br

Ligiane Aparecida Florentino


Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Ciências (Microbiologia Agrícola),
doutoranda em Ciência do Solo pela Universidade Federal de
Lavras (Ufla), Lavras, MG
ligiflorentino@yahoo.com.br

Lílian Vieira de Medeiros


Bióloga, M.Sc. em Biologia de Fungos, pesquisadora bolsista do
Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
lilivmedeiros@yahoo.com.br

Luc Felicianus Marie Rouws


Biólogo, D.Sc. em Química Biológica, profissional autônomo
rouws@bioqmed.ufrj.br

Márcia do Vale Barreto Figueiredo


Bióloga, D.Sc. em Microbiologia, pesquisadora do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA/Dipap-CARHP), professora
membro permanente do Programa de Pós- graduação em Ciências
do Solo da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE),
Recife, PE
marcia.figueiredo@ipa.br

Márcia Vanusa da Silva


Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Biologia Celular e Molecular,
professora da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife,
PE
marcia.vanusa@ufpe.br

Márcio José Rossi


Engenheiro químico, D.Sc. em Engenharia Química, professor da
Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, SC
marcio@enq.ufsc.br

Marcio de Oliveira Martins


Biólogo, M.Sc. em Botânica, doutorando em Bioquímica, pela
Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE
momartins@yahoo.com.br

Maria do Carmo Silva Barreto


Bióloga, M.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisadora bolsista (BCT-
Facepe) do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
helenbio2000@yahoo.com.br

Maria Fátima Grossi-de-Sa


Bióloga, D.Sc. em Ciências, professora da Universidade Católica de
Brasília e pesquisadora da Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, Brasília, DF
fatimasa@cenargen.embrapa.br

Maria Luiza Ribeiro Bastos da Silva


Bióloga, D.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisadora do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
maria.luiza@ipa.br

Mariangela Hungria
Engenheira-agrônoma, D.S.c. em Agronomia (Ciências do Solo),
pesquisadora da Embrapa Soja, Londrina, PR
hungria@cnpso.embrapa.br

Mario de Andrade Lira


Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Agronomia, pesquisador do
Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife, PE
mariolira@terra.com.br

Mario de Andrade Lira Junior


Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Ciências de Planta, professor da
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
mario.lira@depa.ufrpe.br

Meiriana X. Vila Nova


Bióloga, D.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisadora bolsista
(Fixação de Recursos Humanos, CNPq) do Instituto Agronômico de
Pernambuco (IPA), Recife, PE
novax62@yahoo.com.br

Michel Eduardo Beleza Yamagishi


Matemático, D.Sc. em Matemática Aplicada, pesquisador da
Embrapa Informática Agropecuária, Campinas, SP
michel@cnptia.embrapa.br

Natália Florêncio Martins


Bióloga, D.Sc. em Bioquímica e Imunologia, pesquisadora da
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
natalia@cenargen.embrapa.br

Newton Pereira Stamford


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Solos e Nutrição de Plantas,
professor da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE),
Recife, PE
newtonps@depa.ufrpe.br

Olivia Márica Nagy Arantes


Farmacêutica e bioquímica, D.Sc. em Agronomia (Genética e
Melhoramento de Plantas), professora da Universidade Estadual de
Londrina, Londrina, PR
onarantes@gmail.com

Paula Regina Kuser-Falcão


Física, PhD. Em Cristalografia de Proteínas, pesquisadora da
Embrapa Informática Agropecuária, Campinas, SP
paula@cnptia.embrapa.br

Philip C. Brookes
Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Ciências do Solo, pesquisador do
Rothamsted Research Institute, Harpenden, Hertfordshire, Reino
Unido
philip.brookes@bbsrc.ac.uk

Rinaldo Luiz Caraciolo Ferreira


Engenheiro florestal, D.Sc. em Ciência Florestal, professor da
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
rinaldo@dcfl.ufrpe.br

Romualdo Camelo Sena


Engenheiro-agrônomo, M.Sc. em Agronomia (Fitossanidade),
pesquisador do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), Recife,
PE
romualdo@ipa.br

Sérgio Crovella
Biólogo, D.Sc. em Antropologia Molecular, professor da
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
crovelser@gmail.com

Sérgio Luiz Ferreira-Silva


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Bioquímica, professor da
Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, CE
agrosergol@yahoo.com.br

Sergio Miana de Faria


Engenheiro florestal, PhD em Ciências biológicas, pesquisador da
Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ
sdefaria@cnpab.embrapa.br

Stefan Schwab
Bioquímico, D.Sc. em Ciências (Bioquímica), pesquisador da
Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ
sschwab@cnpab.embrapa.br

Tânia Lucia Montenegro Stamford


Nutricionista, D.Sc. em Nutrição, professora da Universidade
Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
tlmstamford@yahoo.com.br

Teresa Cristina Soares de Lima Grisi


Bióloga, M.Sc. em Ciência e Tecnologia de Alimentos, doutoranda
em Biotecnologia pela Rede Nordeste de Biotecnologia, Fortaleza,
CE
tcris.lima@gmail.com

Thatiana Montenegro Stamford Arnaud


Odontóloga, M.Sc. em Ciências de Materiais, doutoranda em
Química Fundamental pela Universidade Federal de Pernambuco,
Recife, PE
thatianaarnaud@hotmail.com

Thayza Christina Montenegro Stamford


Odontóloga, D.Sc. em Ciências Biológicas, professora da
Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa, PB
thayzastam@hotmail.com

Valdinar Bezerra dos Santos


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Agronomia, professor da
Universidade Federal do Piauí (Ufpi), Teresina, PI
santosvb@bol.com.br

Valéria Peruca de Melo


Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Agronomia (Produção Vegetal),
professora do Centro Universitário de Formiga (Unifor), Formiga,
MG
vpmelo@uniformg.edu.br

Vanildo Alberto L. B. Cavalcanti


Engenheiro-agrônomo, M.Sc. em Fitossanidade, diretor de Pesquisa
e Desenvolvimento do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA),
Recife, PE
vanildo.leal@ipa.br

Veronica Massena Reis


Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Agronomia (Ciências do Solo),
pesquisadora da Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ
veronica@cnpab.embrapa.br

Virginia Maria Tenório Sabino Donato


Engenheira-agrônoma, D.Sc. em Botânica, professora da
Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE
vmtsdonato@uol.com.br

Wanderley José de Melo


Engenheiro-agrônomo, D.Sc. em Solos e Nutrição de Plantas,
professor da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias
(FCAV/Unesp), Jaboticabal, SP
wjmelo@fcav.unesp.br

Zaida Inês Antoniolli


Bióloga, Ph.D. em Aspectos Ecológicos e Molecular de Micorriza,
professora da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa
Maria, RS
zaida@ccr.ufsm.br
Agradecimentos

Ressaltamos que esta obra resultou do esforço conjunto de


autores de várias instituições, que atenderam a nossa solicitação
com grande empenho e venceram o desafio de adequar textos de
apoio e protocolos à dinâmica dos novos conhecimentos na área de
forma clara e objetiva. A eles nossos mais sinceros agradecimentos.
Estendemos nossos agradecimentos ao Dr. José Geraldo
Eugênio de França (Diretor-Executivo da Embrapa), que não mediu
esforços para a realização desta obra. Agradecemos também ao Dr.
Eduardo Francia Carneiro Campelo (Chefe-Geral da Embrapa
Agrobiologia), ao Dr. Júlio Zoé de Brito (Presidente do Instituto
Agronômico de Pernambuco – IPA), ao Dr. Vanildo Alberto Leal B.
Cavalcanti (Diretor de Pesquisa e Desenvolvimento do IPA), ao Dr.
Élcio Oliveira Tenório de Lima (Presidente da CARHP), ao Dr.
Josival Gomes de Almeida (Diretor de Pesquisa e Desenvolvimento
Rural da Dipap/Seagri), ao Dr. Fernando do Amaral Pereira
(Gerente-Geral da Embrapa Informação Tecnológica), à Dra. Mayara
Rosa Carneiro (Gerente-Adjunta de Projetos Editoriais da Embrapa
Informação Tecnológica) e a toda a sua equipe de editoração.
Apresentação

Uma nova agricultura se faz necessária. Questões atuais, como


mudanças climáticas globais, excesso de uso de agroquímicos,
degradação do ecossistema, não são fatos isolados ou passageiros,
fazem parte de uma agenda permanente incorporada às discussões
das políticas necessárias para suporte ao desenvolvimento
sustentável do negócio agrícola e às discussões sobre segurança
alimentar e nutrição.
O planeta espera por mudanças radicais, desde que tais mudan‐
ças tragam sustentabilidade e o equilíbrio dos sistemas naturais.
Fundamentos científicos associados ao desenvolvimento de uma
biotecnologia segura e aplicada às demandas e necessidades da
sociedade são sempre bem-vindos.
Um dos grandes desafios ao desenvolvimento de uma agricultura
com práticas sustentáveis se dá exatamente na incorporação, no dia
a dia de laboratórios, escolas, empresas e campos, das práticas
atuais de biotecnologia voltadas ao melhoramento genético, ao con
trole biológico, ao uso eficiente de microrganismos na fixação
biológica de nitrogênio, na biorremediação, nos processos
fermentativos industriais, como o de produção de etanol, a partir de
práticas comprovadamente seguras.
É nesse escopo que o conteúdo desta obra é fundamental, não
apenas como uma atualização das técnicas e procedimentos biotec‐
nológicos, mas como um convite à reflexão de formuladores de
políticas públicas, cientistas, professores e gestores, no sentido de
incorporarem às suas instituições projetos e programas que deem
suporte à biotecnologia como agente inovador e transformador para
a agricultura, a pecuária e a indústria de alimentos, insumos e
matérias-primas neste século.
A obra mostra o envolvimento de inúmeras áreas do conheci‐
mento e a oportunidade de utilização de disciplinas básicas como a
enzimologia, a bioquímica, a química, a biologia e a bioinformática
que em conjunto possibilitam o desenvolvimento de uma
biotecnologia avançada, ainda pouco reconhecida pelo setor
produtivo nacional.
José Geraldo Eugênio de França
Diretor-Executivo
Prefácio

A biotecnologia envolvendo a atuação de microrganismos vem


merecendo destaque especial no desenvolvimento da ciência, na
produção e eficiência de novas tecnologias, bem como em avanços
dos conhecimentos modernos. O termo biotecnologia refere-se a um
conjunto amplo de tecnologias que envolvem a utilização, alteração
controlada e a otimização de organismos vivos, células e moléculas
para a geração de produtos e processos. Seus resultados são
aplicáveis e utilizados por setores de diversas áreas do
conhecimento, como microbiologia, biologia molecular, fisiologia,
bioquímica, química, genética, entre outras. Nesse sentido, faz-se
da maior importância a edição de um livro que forneça as linhas
básicas para a real qualificação de profissionais e estudantes da
área, principalmente com vistas à divulgação e ao desenvolvimento
de novos métodos e práticas de processos biotecnológicos.
A ideia de escrever este livro deveu-se principalmente à
escassez de protocolos atualizados na maioria dos laboratórios de
microbiologia e biotecnologia, o que gera muita dificuldade na
execução de análises que usam técnicas mais recentes. Portanto, o
livro é proposto com o intuito de facilitar o trabalho de
pesquisadores, professores, técnicos e alunos de graduação e pós-
graduação nas áreas de microbiologia, agronomia e biotecnologia.
O conteúdo deste livro procura refletir os diferentes temas da
biotecnologia e contemplar técnicas recentes, e está dividido em 5
partes – Biossegurança e bioética; Enzimas; Técnicas moleculares e
aplicação da genética nas áreas agrícolas; Microrganismos
promotores do crescimento de plantas; e Técnicas biotecnológicas
aplicadas à agricultura –, de modo que as investigações em cada
capítulo são dirigidas a aspectos relacionados aos processos
biológicos.
Espera-se que esta publicação sirva de estímulo para que
surjam, cada vez mais, interessados em desenvolver pesquisas e
aplicá-las em benefício do meio ambiente.
Os Editores
Parte 1
Biossegurança
e bioética
Capítulo 1
Panorama brasileiro de
biossegurança e bioética
Leda Cristina Mendonça Hagler
Deise Maria Fontana Capalbo
Olivia Márica Nagy Arantes
Eliana Maria Gouveia Fontes

1. Introdução

A agricultura tem grande relevância para a economia brasileira.


O setor gera um terço das exportações e do produto interno bruto
(PIB) e emprega um quinto da mão de obra ativa. O melhoramento
de plantas e sua adaptação aos diferentes ambientes foram
conduzidos no Brasil como nos demais países de agricultura
avançada, baseados em tentativa e erro. Com os avanços nas
técnicas de melhoramento no início do século 20, foi possível
desenvolver variedades que combinavam as prévias características
a outras, como tolerância a estresses bióticos e/ou abióticos
(COOK, 1999). Esse histórico de melhoramento demonstrou
segurança dos produtos dele derivados: ensaios de campo antes do
lançamento comercial foram usados, e as decisões quanto às
variedades a serem lançadas comercialmente se mostraram
adequadas, e/ou as práticas de manejo em uso se mostraram
suficientes para mitigar qualquer risco associado com a nova
variedade.
Nos últimos 30 anos, a aplicação das ferramentas de biologia
molecular permitiu o desenvolvimento de plantas com novas
características que não podiam ser introduzidas pelas técnicas de
melhoramento convencional. Isso expandiu o cenário das caracterís‐
ticas genéticas que podem ser agregadas às plantas; e apesar de a
técnica não ter inerentemente um caráter menos seguro do que as
anteriores (NAS 1987; NRC 1989), elas geraram a percepção
mundial da necessidade de regulamentação que hoje é aplicada
para análise da segurança de tais plantas. O mesmo se repetiu no
Brasil, não apenas por ser detentor de reconhecida vantagem
competitiva na agricultura tropical, mas especialmente em
decorrência de políticas públicas, voltadas para o desenvolvimento
tecnológico e formação de recursos humanos em biologia molecular
e ciências agrícolas (SILVEIRA et al., 2004). E, nesse cenário, a
biotecnologia tem sido considerada uma das áreas prioritárias para
investimentos em pesquisa e inovação.
A pesquisa brasileira é majoritariamente desenvolvida em
universidades e instituições públicas. Estima-se que apenas um
terço dos recursos aplicados em pesquisa e desenvolvimento seja
proveniente do setor privado (BRASIL, 2009a; SILVEIRA et al.,
2004). A genômica representa uma área de considerável avanço no
País, após a implantação de redes genômicas, seguindo o
pioneirismo do Instituto Virtual Onsa de São Paulo, que sequenciou
o genoma da bactéria Xylella fastidiosa (SIMPSON et al., 2000).
Nesse contexto, o governo federal lançou um programa
ambicioso visando desenvolver a biotecnologia moderna aplicada à
saúde, agricultura e ao meio ambiente (BRASIL, 2009a). Os
principais tópicos focalizados no citado programa foram: genômica,
proteômica, organismos geneticamente modificados, terapia gênica,
células-tronco, biocombustíveis e nanotecnologia. O Ministério de
Ciência e Tecnologia (MCT) implementou o programa nacional em
genômica, com a incumbência de sequenciar genomas de plantas e
microrganismos (BRASIL, 2009a; VASCONCELOS et al., 2003).
Recentemente, a rede Riogene, RJ, sequenciou o genoma da
bactéria endofítica diazotrófica denominada Gluconoacetobacter
azotofixans (EMBRAPA, 2009).
Apesar da existência desse cenário nacional favorável ao desen‐
volvimento da biotecnologia agrícola, a adoção de plantas transgê‐
nicas foi tardia em comparação com outros países de agricultura
forte. Um dos fatores determinantes dessa morosidade foi a
oposição interna organizada de grupos ambientalistas, explorando
as lacunas jurídicas que existiam na legislação.
No presente capítulo, apresentamos o panorama atual sobre a
legislação brasileira de biossegurança e a comercialização de
plantas transgênicas, discutindo as questões de bioética e as
perspectivas para o desenvolvimento da biotecnologia moderna
aplicada ao setor agrícola.

2. Marco regulatório de biossegurança

Biossegurança é o termo usado para descrever os estudos e


esforços para reduzir ou eliminar potenciais riscos resultantes da
biotecnologia moderna e ou de seus produtos, dentro do escopo de
manejo de riscos biológicos (ZAID et al., 2001). Ele envolve também
regulamentações que se destinam à análise e ao manejo dos riscos
potenciais para o alimento, a saúde humana e animal, o desenvolvi‐
mento saudável de plantas e também para o ambiente. Esse é um
conceito holístico que remete à relevância do tema para a susten‐
tabilidade da agricultura e dos produtos alimentares, proteção
ambiental (incluindo a biodiversidade), sendo especialmente
aplicado aos organismos vivos geneticamente modificados (OGMs)
e seus derivados, além do manejo de espécies invasoras exóticas.
Para fins desse capítulo, o termo será empregado nos aspectos
associados com plantas transgênicas e agricultura.
Várias áreas da ciência e disciplinas relevantes são, portanto,
parte integrante desses estudos e informações, como a biologia
molecular, o melhoramento de plantas, a genética, a agronomia e a
ecologia, entre outras. O processo de integração, de forma lógica,
entre informações multidisciplinares é complexo, bem como a
credibilidade para estabelecer uma visão balanceada da situação
antes e depois da inserção da nova tecnologia ou seu produto no
ambiente de produção e consumo.

2.1. Esforços internacionais em biossegurança

Pela crescente percepção das alterações ambientais globais e


preocupação com a acelerada degradação ambiental durante o
último quarto do século 20, a comunidade internacional impulsionou
as questões ambientais para o topo da agenda política dos
governos. Já em 1993, a Organização para a Cooperação e
Desenvolvimento Econômico (OECD) publicou princípios gerais que
os estados membros deveriam aplicar à produção e comercialização
em larga escala de plantas geneticamente modificadas (GM) ou
transgênicas, como são conhecidas no Brasil (OECD, 1993).
Durante a Conferência das Nações Unidas (Unced), realizada em
1992 no Rio de Janeiro, foram assinados protocolos importantes,
como a Agenda 21 e a Convenção sobre Diversidade Biológica
(CBD), ratificados por mais de 170 países. A biossegurança possui
interfaces com esses instrumentos normativos. O artigo 15 da
Declaração do Rio de Janeiro (DECLARAÇÃO..., 1992) estabelece
o Princípio da Precaução, com o fim de proteger o meio ambiente e
assim postulado: “quando houver ameaças de danos graves ou
irreversíveis, a ausência de certeza científica absoluta não será
utilizada como razão para o adiamento de medidas
economicamente viáveis para prevenir a degradação ambiental”.
A CBD preconiza a preservação e o uso sustentável da
biodiversidade e reconhece o direito soberano dos países sobre
seus recursos genéticos e a justa e equitativa partilha dos benefícios
gerados pelo uso da biodiversidade. O texto da CBD faz referência
ao uso seguro da biotecnologia moderna, no artigo 8 (g), que
expressa a necessidade de regulamentar o uso e liberação de
OGM. As negociações efetuadas durante as reuniões dos países
membros da CBD resultaram em recomendações de biossegurança,
propostas pelo Pnud (Programa das Nações Unidas para o Meio
Ambiente) (UNEP, 1995) e aceitas pelos países membros da CBD.
Outro artigo da CBD (artigo 19-3) contempla o movimento de OGM
entre fronteiras e trata da necessidade de desenvolvimento de um
protocolo estabelecendo os procedimentos para sua importação e
uso, evitando efeitos adversos sobre a biodiversidade. Este instru‐
mento legal, denominado Protocolo de Cartagena sobre Biosse‐
gurança (PCB), foi negociado pelos países membros da CBD,
passando a vigorar desde 2002, tendo sido posteriormente ratificado
pelo Brasil. O PCB inclui um mecanismo denominado Acordo Prévio
Informado (AIA) que garante ao país importador de OGM a
realização de análise de risco, anterior à importação, seguindo
metodologia descrita no anexo III do PCB. O OGM importado para
cultivo e comercialização, destinado à alimentação humana, animal
ou processamento, deve ser acompanhado de documentação
informativa sobre seu conteúdo e transportado em consonância com
as regras internacionais de segurança. Os fármacos estão excluídos
do referido protocolo, porque estão incluídos em outros instrumentos
legais.
As informações sobre OGMs comercializados entre os países
signatários do protocolo e suas respectivas legislações de biosse‐
gurança devem ser disponibilizadas em um banco de dados –
Biosafety Clearing House (BCH). O PCB enfatiza a colaboração
entre os países membros em ações para capacitação de recursos
humanos e estimula a participação da opinião pública nas
discussões sobre biossegurança, visando à conservação e ao uso
sustentável da biodiversidade e proteção à saúde humana
(PROTOCOLO... 2003).

2.2. O marco regulatório brasileiro

É importante mencionar que o Brasil tem adotado uma série de


políticas públicas voltadas para a conservação e uso sustentável de
seu rico manancial de recursos genéticos. Dentre as principais
ações, destacamos a instituição do Conselho de Gestão do
Patrimônio Genético (CGEN), do Programa Nacional da Diversidade
Biológica (Pronabio) e da Comissão Nacional da Biodiversidade
(Conabio), refletindo a preocupação do governo com o patrimônio
genético da nação (BRASIL, 2009b).
A legislação brasileira de biossegurança adotou o modelo de
avaliação específica para os OGMs, efetuada por um colegiado
multidisciplinar e pluri-institucional, com competência para
regulamentar todas as atividades que envolvem DNA recombinante,
denominado Comissão Técnica Nacional de Biossegurança
(CTNBio). A legislação de biossegurança foi instituída pela Lei n°
8.974 de 5/1/1995, alterada pela Medida Provisória nº 2.191-9/01,
posteriormente regulamentada por instruções normativas. Esse
marco legal gerou um sistema operacional excessivamente
burocratizado em decorrência de conflitos na interpretação de textos
legais ambíguos em relação à definição de competências entre o
disposto no texto da Lei de Biossegurança e legislações pré-
existentes no âmbito da vigilância sanitária, agrotóxicos e meio
ambiente. A exigência de avaliações múltiplas nas diversas
instâncias de governo gerou situações conflituosas para análise dos
processos envolvendo OGMs no Brasil, resultando em ações
judiciais que prejudicaram significativamente o avanço da
biotecnologia moderna (FONTES, 2003; MENDONÇA-HAGLER;
ALEIXO, 2002). Esse cenário motivou o governo federal a enviar ao
congresso um novo projeto de Lei de Biossegurança, que resultou
na Lei n° 11.105 de 28/3/2005, regulamentada pelo Decreto n°
5.591 de 22/11/2005, atualmente em vigor (LEGISLAÇÃO... 2009).
A nova Lei de Biossegurança eliminou a polêmica associada à
interpretação legal de que qualquer liberação de OGMs constituía
uma atividade potencialmente poluidora, sendo obrigatória a
realização de licenciamento ambiental, independente do resultado
da avaliação da CTNBio. Atualmente, o cumprimento da Resolução
nº 305, de 2002, do Conselho Nacional do Meio Ambiente
(Conama), pode ser exigido somente no caso de atividade
considerada pela CTNBio como potencialmente degradadora do
meio ambiente.
A nova legislação eliminou também o conflito em relação à Lei n°
9.782/1999 que criou a Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(Anvisa) e que atribui competências à agência para regulamentar,
controlar e fiscalizar produtos oriundos da engenharia genética que
possam apresentar riscos à saúde humana. A Lei n° 11.105 estabe‐
leceu claramente a competência da CTNBio para identificar as ativi‐
dades e produtos decorrentes do uso de OGMs e seus derivados
que possam causar riscos à saúde humana.
Outra modificação na legislação feita com fins de harmonização
do arcabouço legal da biossegurança no Brasil foi a mudança da
definição do termo agrotóxico da Lei dos Agrotóxicos (Lei nº
7.802/89), que incluía nessa categoria os organismos
geneticamente modificados para resistência a vírus ou insetos,
destinados à alimentação humana e animal. O novo texto isentou
estes OGMs dos procedimentos previstos na Lei nº 7.802/89, com
exceção de OGM usado na produção de agrotóxicos.
Outras modificações significativas são apresentadas a seguir.

Modificações promovidas pela Lei n° 11.105 de 28/3/2005, regulamentada pelo Decreto n° 5591 de
22/11/2005.

• Criação do Conselho Nacional de Biossegurança (CNBS) vinculado à Presidência da Repúblicca e


encarregado de formulação e implementação da Política Nacional de Biossegurança.

• Reestruturação da CTNBio, delegando à comissão a competência para aprovar os OGMs para fins
de pesquisa e comercialização, autorizar as pesquisas, inclusive as de campo, e identificar as
atividades que necessitem de estudo de impacto ambiental.

• Criação, no âmbito do MCT, do Sistema de Informações em Biossegurança (SIB).

• Permissão para uso de células-tronco embrionárias humanas para fins de pesquisa e terapia e
proibição de tecnologias genéticas de restrição de uso que resultam em OGMs com estruturas
reprodutivas estéreis (tecnologias Gurts).

Foram mantidas as exigências sobre a constituição de Comissão


Interna de Biossegurança (Cibio), o Certificado de Qualidade em
Biossegurança (CQB), a proibição da clonagem humana e o uso de
engenharia genética em célula germinal, zigoto ou embrião
humanos. Esse arcabouço legal de biossegurança e as interfaces
com outros instrumentos legais foram discutidos em detalhes por
Mendonça-Hagler et al. (2006a).

3. Avaliação de risco ambiental de


organismos geneticamente modificados

Durante a obtenção de dados para análise de risco, é funda‐


mental a comparação entre a cultivar transgênica e seu parental
isogênico. Basicamente, a avaliação de risco utiliza as informações
sobre o grau de risco do organismo parental, as características dos
novos genes inseridos, o processo de inserção, o fenótipo do OGM
resultante e as características do ambiente receptor. A avaliação de
risco segue a sistemática de análise, caso a caso, e em etapas
crescentes de escala de desenvolvimento da tecnologia. Inicia-se
em experimentos de laboratório para obtenção e seleção do evento
de transformação, passando para testes em casas de vegetação e
posteriormente para os testes de campo. A comercialização é
licenciada quando os resultados dos experimentos prévios,
estruturados sobre os tópicos relevantes e que identificam a
presença ou ausência dos principais impactos das plantas GMs,
indicam alta probabilidade de segurança do OGM:

Tópicos relevantes para a biossegurança de plantas GMs.

Riscos à saúde humana e animal: toxicidade (alimentar e para rações); qualidade dos alimentos e
rações derivados de plantas GMs; alergenicidade; patogenicidade; resistência a drogas (antibióticos,
por exemplo); mercado seletivo (risco econômico).

Riscos ao ambiente: persistência do gene ou transgene (plantas voluntárias, vigor, invasividade);


suscetibilidade aos organismos não alvo; mudanças no uso de produtos químicos agrícolas;
alterações na biodiversidade por interações tritróficas; alterações na fertilidade do solo ou na
degradação de material orgânico.

Riscos à agricultura: resistência/tolerância dos organismos alvo; desenvolvimento de plantas


invasoras ou superinvasoras; alteração do valor nutricional; alterações de prática de manejo;
poluição genética pela dispersão de pólen ou sementes; transferência de genes a microrganismos
ou geração de novos tipos de vírus por recombinação.
Principais impactos avaliados para liberação de OGMs no ambiente.

• Possibilidade de fluxo gênico.

• Vantagem competitiva (possibilidade de surgirem superinvasoras, por exemplo).

• Possibilidade de desenvolvimento de resistência em insetos.

• Riscos de OGMs resistentes a vírus.

• Possibilidade de ocorrência de erosão genética.

• Impactos em ecossistemas e organismos não alvo da tecnologia.

A liberação de um OGM em regiões diferentes requer a obtenção


de dados regionais, considerando as diferentes respostas
resultantes da interação genótipo versus ambiente. O
monitoramento periódico deve ser feito após a liberação em novo
ambiente, permitindo avaliar respostas inesperadas no campo. O
monitoramento pós-comercialização tem sido exigido para cultivo de
plantas GMs no País. A base científica desses possíveis impactos é
discutida a seguir.
A possibilidade de fluxo gênico do OGM para espécies sexual‐
mente compatíveis é uma questão fundamental na avaliação de
risco ambiental, particularmente para OGMs que serão cultivados
nas proximidades dos centros de origem e de diversidade das
respectivas espécies. A probabilidade de fluxo gênico depende de
muitos fatores, como a dinâmica das populações envolvidas, os
mecanismos de polinização e de dispersão das sementes e o
ambiente da liberação. A formação de híbridos entre plantas
transgênicas e seus parentes silvestres tem sido bem documentada
(BERGELSON et al., 1998; DALE; SCHEFFLER, 1996; ELSTRAND,
2003). A localização geográfica da liberação é um dado importante,
particularmente quando estão presentes no ambiente espécies
sexualmente compatíveis com o OGM. A próxima etapa da
avaliação de risco considera as consequências da introgressão do
transgene, analisando a possível vantagem competitiva conferida às
cultivares não transgênicas. No Brasil existem diversas cultivares de
várias plantas de importância econômica (ex.: algodão, arroz,
batata, entre outras), fato que deve ser considerado na análise de
risco dos respectivos OGMs antes da liberação em território
nacional. Os procedimentos para evitar ou minimizar os riscos de
fluxo gênico são apresentados a seguir.

Procedimentos recomendados para o manejo de risco de fluxo gênico.

• Isolamento espacial ou temporal entre espécies sexualmente compatíveis.

• Retirada de florescências das plantas.

• Uso de plantas macho estéril.

• Uso de bordaduras de plantas incompatíveis com a planta transgênica.

• Procedimentos apropriados de descarte do material transgênico.

• Monitoramento pós-colheita para eliminação de plantas voluntárias.

A transferência horizontal de genes pode ocorrer no ambiente


entre organismos procariontes, pelos processos de conjugação,
transdução e transformação. Genes de origem bacteriana são
comumente inseridos nas plantas transgênicas, tais como os que
conferem resistência a antibióticos. A transferência horizontal de
genes de plantas para microrganismos, quando detectável, ocorre
com baixa frequência (KAY et al., 2002; SMALLA, 2000). Os genes
de resistência aos antibióticos, comumente usados como
marcadores em OGMs, existem naturalmente nos microrganismos,
e sua disseminação, a partir das plantas transgênicas, representa
um risco pouco significativo, particularmente na ausência de
pressão seletiva (DEMANÈCHE et al., 2008).
O aumento de área cultivada com plantas tolerantes a herbicida
pode favorecer o aparecimento de plantas com tolerância múltipla
aos herbicidas de amplo espectro, resultantes de vários eventos de
transferência gênica e sob elevada pressão seletiva, podendo apre
sentar o comportamento de planta daninha, superinvasoras
(SANVIDO et al., 2007). Esse tipo de risco pode ser reduzido por
modificações na construção do OGM, dificultando a introgressão de
genes em espécies sexualmente compatíveis (GRESSEL, 2000).
O amplo uso e a expressão contínua de genes de resistência a
insetos, representado atualmente pelo gene cry obtido da bactéria
Bacillus thuringiensis, podem aumentar a pressão seletiva exercida
pela presença contínua de tal característica inseticida, favorecendo
a seleção de insetos resistentes às toxinas bioinseticidas. Os meca‐
nismos de resistência e as diferentes estratégias para manejar esse
risco foram recentemente revisados por Bravo e Soberón (2008). As
associações de diferentes toxinas Bt, oriundas dos pesticidas
denominados biológicos (CAPALBO et al., 2004), já são largamente
usadas na agricultura orgânica, manejo que dificulta o aparecimento
de resistência. Também o uso de refúgios, possuindo insetos sen‐
síveis, permite o cruzamento destes com insetos resistentes,
resultando em populações vulneráveis à toxina. Os cultivos de milho
e algodão Bt nos EUA incluem refúgios que variam geralmente de
20% a 50% da área plantada com OGMs. A CTNBio aprovou a
comercialização de plantas Bt (ver destaque adiante), exigindo a
inclusão de áreas de refúgio.
A introdução de genes de resistência a vírus também pode
apresentar riscos, como a recombinação entre os vírus de RNA
presentes na planta transgênica, podendo originar novos patógenos.
Os riscos decorrentes da formação de novos vírus, por
recombinação e encapsidação heteróloga, precisam ser
investigados para aplicação segura da tecnologia, de grande
importância no controle de infecções virais em plantas (FUCHS;
GONSALVES, 2007; TEPFER, 2002).
Poucas espécies de plantas comestíveis são usadas na
alimentação humana, e destas poucas variedades são cultivadas, o
que coloca em risco as variedades não comerciais que foram
evoluindo ao longo do tempo de domesticação da planta,
contribuindo para a chamada erosão genética. A expansão da
biotecnologia agrícola, em escala global, pode reduzir ainda mais a
diversidade dos cultivos e contribuir para a redução de diversidade
genética.
As plantas transgênicas resistentes aos insetos (plantas Bt)
podem causar impactos diretos, como a deposição de pólen no
ambiente ou efeitos indiretos em organismos não alvo, no entanto
os impactos detectados em vários estudos foram pouco
significativos. (SANVIDO et al., 2007).
Os possíveis efeitos de plantas GMs sobre os ecossistemas de
solo foram recentemente discutidos (ICOZ; STOTZKY, 2008;
MENDONÇA-HAGLERet al., et al. 2006b; SAXENA et al., 1999).
Algumas plantas Bt podem potencialmente afetar a diversidade
microbiana do solo, alterando os ciclos do carbono e nitrogênio com
implicações para a fertilidade do solo. Flutuações na estrutura das
comunidades microbianas de solos, cultivados com plantas GMs,
foram detectadas em vários estudos, no entanto essas tiveram
efeito passageiro e foram menores que a variação natural detectada
em diferentes solos, independente de transgenia (DUNFIELD;
GEMIDA, 2004).
Experimentos com cultivo de transgênicos em larga escala foram
desenvolvidos em duas centenas de campos na Europa, para
avaliar os efeitos de OGMs tolerantes a herbicida sobre os
agroecossistemas. Os impactos sobre a biodiversidade entre as
diferentes cultivares testadas foram muito variáveis, excedendo as
diferenças entre os cultivos transgênicos e convencionais. No início
do cultivo, as lavouras transgênicas de milho, canola e beterraba
tolerantes a herbicida apresentaram maior biomassa e número de
plantas daninhas. No entanto, em estágios mais avançados de
crescimento, as lavouras de beterraba e canola apresentaram
menos sementes de plantas daninhas e menor biomassa no solo,
bem como uma redução no número de abelhas e borboletas. No
caso do milho tolerante a herbicida, foram observados maior
mortalidade das plantas daninhas e maior número de invertebrados
e pássaros, com benefícios para a biodiversidade. Todas as
lavouras com plantios transgênicos apresentaram maior
biodiversidade de organismos no solo por causada maior
concentração de detritos nestes cultivos decorrente da eliminação
das plantas daninhas. Os resultados desses estudos foram
avaliados e sumarizados por Firbank (2003) e Ammann (2004). As
mudanças na estrutura das comunidades podem não resultar em
grandes alterações nos ecossistemas em razão da dinâmica
compensatória de espécies funcionalmente similares que atuam
como tampão.

4. Segurança alimentar e rotulagem de


OGMs e derivados

A CTNBio avalia a biossegurança de OGMs importados e


comercializados no Brasil bem como de produtos contendo OGMs e
derivados produzidos para o mercado interno. Basicamente, a
análise de risco emprega o conceito de equivalência substancial,
que compara a composição nutricional entre os OGMs e derivados
com os similares convencionais não transgênicos (TOMLISON,
2000). A metodologia para determinação da composição química de
OGM tem sido atualizada e segue as recomendações emanadas do
Codex Alimentarius (WHO, 2003). Durante a escassez de milho no
mercado interno, a CTNBio aprovou a importação de milho
transgênico comercializado em outros países, após avaliação
criteriosa da segurança alimentar dos eventos comercializados.
Houve forte oposição de grupos ambientais a esta importação. As
cargas de milho transgênico foram transportadas, sob a jurisdição
do Ministério de Agricultura, do porto de entrada para a fábrica de
moagem, como medida de segurança. A CTNBio também aprovou
ingredientes alimentares e enzimas produzidos por microrganismos
GMs. Esses derivados, quando não contêm DNA recombinante e
constituem substâncias quimicamente definidas, estão isentos da
regulamentação aplicada a OGMs.
Os produtos alimentícios que contêm OGMs e derivados, em
concentração de 1% ou mais, devem ser rotulados (Decreto nº
4680/2003). O símbolo designado para indicar conteúdo de transgê‐
nicos é representado por um triângulo com um T em fundo amarelo.
O regulamento também aborda a presença não intencional de
OGMs em alimentos. A rotulagem é entendida, nesse contexto legal,
como direito do consumidor à informação, não estando relacionada
às questões de biossegurança, que são avaliadas em etapa anterior
à comercialização (CTNBio, 2009). Poucos produtos no mercado,
contendo transgênicos, são rotulados em conformidade com a
legislação em vigor.

5. Plantas transgênicas no Brasil

Experimentos de campo – Um total aproximado de 2.000 petições


foi aprovado pela CTNBio, desde seu funcionamento em 1996, com
o objetivo de liberação planejada de plantas transgênicas em
campo. A avaliação de risco dessas solicitações foi efetuada caso a
caso, com base em critérios reconhecidos pela comunidade
científica internacional (EDMONDS INSTITUTE, 1998;
PROTOCOLO... 2003; UNEP, 1995). As principais liberações
planejadas foram: milho (85%), feijão-soja (7%), algodão (5%),
cana-de-açúcar (2%), feijão, eucalipto, batata, arroz, mamão e
tabaco (~1%). As principais características genéticas inseridas
nessas plantas foram tolerância a herbicida (HT) 55%, resistência a
insetos (IR) 42%, eventos múltiplos (HT+IR) 2% e resistência a vírus
(VR) 1% (MENDONÇA-HAGLERet al., 2008). Plantas GMs, ditas de
segunda e terceira gerações, que expressam características de
enriquecimento nutricional, redução de lignina, resistência para
solos secos ou salinos, cana com sacarose aumentada, produção
de fármacos e outras, estão em desenvolvimento (CTNBio, 2009).
Comercialização de cultivos transgênicos – O período de grande
atividade política em relação à proteção ambiental coincidiu com o
aumento das áreas plantadas com OGMs. Desde as primeiras
lavouras de plantas GMs, a área tem crescido mais de 10% ao ano,
passando de 1,7x106 ha em 1996 para 125x106 ha em 2008
(JAMES, 2009). Cerca de metade da área mundial cultivada está
localizada nos países: Estados Unidos, Argentina, Brasil, Índia,
Canadá e China. Vale ressaltar que desses apenas Brasil e China
ratificaram o Protocolo de Cartagena.
Apenas quatro culturas representam praticamente toda a área de
plantas GMs no mundo: soja (53% da área cultivada com
variedades transgênicas), milho (30%), algodão (12%) e canola
(5%). Esses percentuais são maiores nos Estados Unidos, onde
mais de 90% da soja plantada, 80% do algodão e 50% do milho são
transgênicos. Em menor escala, são plantados abobrinha, alfafa e
papaia transgênicas nos Estados Unidos; papaia, álamo, tabaco,
tomate e pimenta doce são cultivados na China; e arroz no Irã, entre
outros produtos em pequenas áreas.
O Brasil cultiva atualmente 15,8 milhões de hectares
representando 16% das lavouras mundiais de transgênicos, sendo
87% de soja tolerante a glifosato, com menor participação de
algodão Bt e milho (Bt e tolerante a herbicida) (JAMES, 2009). A
primeira aprovação comercial de uma planta transgênica no Brasil
data de 1998, ocasião em que a CTNBio aprovou a soja tolerante ao
glifosato, sob condição de monitoramento ambiental, uma exigência
inovadora. Essa aprovação foi questionada em longas batalhas
jurídicas. Estima-se que a soja transgênica representou 64% da
safra brasileira de soja em 2008. O algodão Bt, resistente a inseto,
foi aprovado em 2005, sob exigências de zonas de exclusão
(BARROSO et al., 2005), uso obrigatório de áreas de refúgio,
cultivadas com algodão convencional, e medidas adicionais de
contenção. Recentemente, dois eventos de algodão foram aprova‐
dos, ambos tolerantes a herbicida. O milho transgênico foi sempre
alvo de calorosas discussões relacionadas à preocupação com a
preservação da rica diversidade genética de raças crioulas
encontradas no Brasil. Os processos para comercialização de milho
GM ficaram vários anos sob avaliação, tendo sido recentemente
aprovados seis eventos de milho transgênico. Os cultivos transgê‐
nicos comercializados no Brasil e respectivos anos de aprovação
estão listados a seguir (CTNBio, 2009).

Comercialização de plantas geneticamente modificadas no Brasil.

• Soja tolerante a glifosato (epsps) (RoundUp Ready) evento GTS 40.3-2 (1998).

• Algodão resistente a inseto (cry1Ac) evento 531 (2005).

• Algodão tolerante a glufosinato (bar) evento LL Cotton 25 (2008).

• Algodão tolerante a glufosato (cp4 epsps) evento MON 1445 (2008).

• Algodão resistente a insetos e tolerante a glufosinato (Widestrike) (cry1F+cry1Ac+pat) evento


281-24-236/3006-210-23 (2009).

• Algodão resistente a insetos (Cry1Ac+Cry2Ab2+NptII+aad+uidA) (Bolgard II) evento 15985


(2009).

• Algodão resistente a insetos e tolerante a glifosato (cry1Ac+cp4epsps) evento MON 531 x MON
1445 (2009).

• Milho Bt resistente a inseto (Cry1Ab) evento MON 810 (2007).

• Milho tolerante a glufosinato (bar) evento T-25 (2007).

• Milho resistente a insetos e tolerante a glifosinato (cry1Ab+bar) evento Bt-11 (2008).

• Milho tolerante a glifosato (cp4 epsps) evento NK603 (2008).

• Milho tolerante a glifosato (m epsps) evento GA21 (2008).

• Milho resistente a insetos e tolerante a glufosinato (cry 1F+bar) evento TC1507 (2008).

• Milho resistente a insetos e tolerante a glifosato (Cry1Ab+bar+m epsps) evento Bt 11 x GA21


(2009).

• Milho resistente a insetos e tolerante a glifosato (cp4 epsps+cry1Ab) evento MON810 x NK603
(2009).

• Milho resistente a insetos (Vip 3 Aa) evento MIR 162 (2009).

• Milho resistente a insetos (cry1A.105 + cry2Ab2) evento MON 89034 (2009).

• Milho resistente a inseto e tolerante a glifosato (cp4 epsps+cry1F+pat) evento TC1507 x NK 603
(2009).

As plantas transgênicas liberadas para comercialização são


também cultivadas em outros países, existindo familiaridade quanto
à biossegurança dos respectivos eventos genéticos (SANVIDO et
al., 2007). Excepcionalmente, para suprir o mercado interno, foi
importado o milho GM comercializado em outros países, para
processamento e uso como ração. Antes da aprovação para
comercialização no País, o milho GM foi testado experimentalmente
em regiões brasileiras, resultando dados complementares sobre o
comportamento ambiental das cultivares. Tipicamente, esses
estudos mostraram a eficiência de milho de Bt no controle de
insetos alvo no campo, sem causar mudanças significativas na
diversidade de outros insetos (FERNANDES et al., 2007;
FERNANDES, 2003; FRIZZAS, 2003; MARTINELLI, 2001). A
comercialização de milho transgênico foi condicionada a um
programa de monitoramento ambiental e ao cumprimento de normas
visando assegurar a coexistência entre os diferentes sistemas de
cultivo. É importante mencionar que nenhum cultivo de plantas
transgênicas é permitido em áreas de preservação ambiental e nas
reservas indígenas (CTNBio, 2009).
Os possíveis impactos socioeconômicos associados à comercia‐
lização dos três primeiros eventos de milho foram avaliados em
instância superior (CNBS), que ratificou as decisões da CTNBio,
sinalizando um cenário positivo para a adoção de lavouras transgê‐
nicas no País. As questões associadas à coexistência entre as
distintas tecnologias agrícolas têm sido discutidas em vários países
(FONTES, 2007; JANK et al., 2006; SCHIEMANN, 2003).

6. Perspectivas para a biotecnologia agrícola

As plantas transgênicas tiveram um grande desenvolvimento nos


últimos 15 anos, com um crescente em área cultivada e em
representatividade na produção mundial de soja, milho, algodão e
canola. A primeira geração de plantas GMs autorizadas para plantio
comercial em diversos países buscou a melhoria das características
agronômicas, como tolerância a herbicidas e resistência ao ataque
de insetos. A segunda geração foi pesquisada buscando a melhoria
de valor nutricional, porém não atingiu ainda a expectativa comercial
desejada; mas, por suas características de interesse para uso em
países onde há carência de alimentos, continua sendo alvo de
desenvolvimento.
Uma terceira geração das plantas GMs está em vias de entrar no
mercado e foi/está sendo desenhada como biofábrica para produção
de grande variedade de componentes de alto valor farmacológico e
industrial. O aumento de produtividade e valor nutricional, novas
características de interesse para saúde, pode não ser atraente para
os consumidores em países desenvolvidos, no entanto essas
características são importantes para melhorar as condições de vida
em países com problemas de disponibilidade de alimento. Tais
países precisam migrar do grupo de fornecedores de matéria-prima
para o de gerador de tecnologia, seja pela venda de suas sementes
ou pela transferência de conhecimentos. Os produtos da
biotecnologia devem ser desenvolvidos e estabelecidos em todos os
países e serem aplicados às necessidades locais para resolver
problemas específicos e, sempre que necessário, serem apoiados
por organismos internacionais ou organizações sem fins lucrativos.
Estão listadas, a seguir, algumas vantagens das plantas de terceira
geração para as quais os tópicos de biossegurança são ainda mais
importantes, pois muitas são plantas usadas na alimentação dos
seres humanos, como o arroz e o milho, que são visualmente iguais
aos seus equivalentes não transgênicos (FONTES, 2007).

Vantagens de uso da terceira geração de OGMs (biofábricas) em relação à produção atual.

• Facilidade para estabelecer e manter a um custo relativamente menor, uma vez que utilizam
sistemas agrícolas já em uso.

• Facilidade de adaptação, em escala de produção, às demandas de mercado; o que não é o caso


de produção em reatores.

• Facilidade de estocagem, transporte e distribuição dos produtos derivados, pois a síntese do novo
produto ocorre diretamente em partes específicas da planta; por exemplo, na semente ou na raiz.

• Geração de produto sem necessidade de purificação, como é o caso de algumas vacinas; ou


esse produto é mais fácil de purificar, quando necessário, uma vez que os métodos de expressão
das novas moléculas são muito específicos, por exemplo, em corpos oleosos, no caso da
proteína oleosina.

• Geralmente apresenta o novo produto na sua forma bioativa, o que não acontece atualmente com
culturas de microrganismos.

• Gera produto isento de risco de contaminação por agentes patogênicos ao ser humano (viroses
animais, príons, entre outros) como seria o caso de sistemas em cultura de células animais.

Alguns episódios de mistura de material não transgênico com


transgênico, no campo ou durante o transporte, estocagem e
processamento, foram identificados para as plantas da primeira
geração e demonstram a importância da regulamentação e
mecanismos de controle que não estão sendo aplicados de forma
rigorosa. Portanto, a rastreabilidade dos OGMs, desde sua origem
até a comercialização ao final da cadeia industrial, é ainda mais
essencial no caso das plantas transgênicas.
As características de aumento de rendimento e as oportunidades
para obtenção e geração de novos produtos fazem dos organismos
transgênicos um campo que ainda oferece muitos territórios a
explorar, muito além das três gerações mencionadas. Uma dessas
áreas, que já está se tornando realidade, é a manipulação de
plantas e microrganismos para a geração de energia (FAO, 2006).
Esse é um campo bastante promissor para o Brasil, uma vez que o
País é a maior fronteira agrícola do mundo e o mais experiente na
produção de biocombustíveis. Os combustíveis renováveis, como o
etanol, são produzidos à base do açúcar como única matéria-prima.
O Brasil possui abundância de açúcar e tem preços competitivos;
seus cientistas conhecem a tecnologia da produção podendo
facilmente transformar as pesquisas em negócios.
Um exemplo do desenvolvimento da biotecnologia verde é a
instalação de uma empresa americana no País para transformar o
caldo de cana primeiramente em diesel, depois em gasolina e
querosene de aviação. As leveduras transgênicas dessa empresa
funcionam nas condições controladas dos laboratórios da Califórnia,
mas foi o conhecimento dos cientistas e produtores brasileiros que
permitiu que a produção do diesel de açúcar tivesse escala
comercial.
Caso semelhante aconteceu em 2007 quando a Basf e a
Embrapa anunciaram o desenvolvimento comercial de uma
variedade de soja GM; a multinacional isolou, em seu laboratório
nos Estados Unidos, um gene que amplia a resistência a herbicidas.
Já sua aplicação à variedade de soja mais adaptada ao Brasil –
segundo maior produtor do grão do mundo – foi realizada pela
Embrapa. Os royalties do produto final, quando comercializado,
serão divididos entre as duas empresas (REVISTA EXAME, 2008).
Apesar dos avanços alcançados, nossa nação ainda precisa
investir muito em biotecnologia. Além de competir com outros
setores da economia, as organizações brasileiras concorrem
também com outros países, mais ousados e experientes. É
necessário criar novas empresas e explorar mais os recursos
disponíveis no País, para que um dia possamos nos tornar
protagonista mundial neste setor.
Assim, poderíamos resumir que as grandes áreas que se
apresentam com boas perspectivas para que sejam desenvolvidos
OGMs são: área das ciências da vida, buscando novos reagentes e
novos genes; área agrícola, focada no melhoramento de plantas e a
busca de receptores para expressão heteróloga; área verde, tendo
como meta as energias renováveis, por exemplo, produção de
celulase e estudos de metabolômica e de biossistemas; área
industrial, enfatizando o aprimoramento na produção de enzimas,
bioprospecção de novos microrganismos e novas moléculas
fitoquímicas; e área farmacológica, com desenvolvimento de
conhecimentos em antibiose, terapia com enzimas, síntese de
novas drogas, entre outros.
Como mencionado anteriormente, várias outras características
políticas e científicas são necessárias para que haja avanços signi‐
ficativos no setor de transgênicos: desenvolvimento de capacitação
de recursos humanos; apoio às publicações internacionais; bem
estabelecidos e respeitados marcos legais de biossegurança para
transgênicos, de acesso a recursos genéticos e sistema de proprie‐
dade intelectual; articulação de cooperação internacional de
fronteira; estruturação de uma rede de informação e comunicação,
alargando a compreensão mútua e contribuição para que a
cooperação regional se fortaleça no campo da biotecnologia e
biossegurança. Valle (2005) sugere ainda perenização, continuidade
e políticas públicas mais seletivas, que contribuam para maior
vinculação dos atores nele circunscritos; instituição de mecanismos
que contribuam para o incremento do investimento público e
privado; criação de condições mais favoráveis para o
empreendedorismo privado, mediante a instituição de linhas de
financiamento privilegiadas, dinamização de mercados de capitais,
instrumentos de intermediação financeira.
Enquanto alianças dentro do setor privado concentram no
avanço das novas tecnologias, o setor público deve concentrar
esforços nas culturas e características desejáveis nas quais o outro
setor não está atento ou não fará investimentos. Certamente a
priorização dada à biotecnologia em relação a outras pesquisas
deve estar vinculada às prioridades e objetivos agrícolas do País e
às suas preocupações e características ambientais (LUIJBEN;
COHEN, 2000). Com certeza investimentos para dar suporte a uma
boa governança, à infraestrutura do setor rural e acesso ao mercado
são requeridos anteriormente aos resultados que a biotecnologia
possa prover; mas se as políticas visam ao crescimento econômico
e à redução de fome e pobreza, certamente elas terão uma parcela
significativa para as pesquisas biotecnológicas (WHO, 2005).

7. Comunicação e conhecimento: interfaces


entre bioética e biossegurança

Como apresentado ao longo deste capítulo, a biossegurança de


OGMs é uma área de interesse crescente, caracteristicamente de
cunho multidisciplinar que envolve ciência, ética e sociedade, além
de aspectos regulatórios, de fiscalização e manejo de riscos à saúde
animal e humana e ao meio ambiente.
Como anteriormente ressaltado, apesar da existência de um
cenário nacional favorável ao desenvolvimento da biotecnologia
agrícola, a adoção de cultivos transgênicos tem sido lenta em
comparação com outros países produtores de commodities
agrícolas. A percepção pública nacional está dividida entre a
imprensa sensacionalista e a opinião completamente oposta entre
algumas ONGs e segmentos da comunidade científica. Isso tem
levado a sociedade ao desinteresse e incerteza sobre avanços
nessa área. Esta é, hoje, a principal questão ética que permeia a
biotecnologia agrícola: a responsabilidade na fala pública.
Sendo a bioética o exercício da reflexão ética sobre as questões
que se apresentam durante o desenvolvimento tecnocientífico da
sociedade, ela é dinâmica e está presente nas angústias, dúvidas e
discussões dos diferentes segmentos da sociedade. Nesse sentido,
a bioética tem muito a contribuir na melhoria do debate público
sobre as plantas transgênicas. Como ponte entre ciência e vida, a
bioética estimula a responsabilidade da participação dos atores
sociais e produtivos nesse diálogo (GTZ, 2006). A informação é um
requisito imprescindível para aumentar o poder decisório dos
cidadãos, mas não suficiente para diminuir o fosso entre o público
em geral e os setores de interesse, tanto favoráveis quanto
contrários aos transgênicos (GUIVANT, 2006). A informação técnica
não é o único elemento responsável pela formação de opinião do
público em geral e também dos tomadores de decisão. A autonomia
para escolher, portanto, necessária a uma tomada de decisão, é
resultante da informação e do padrão cultural que cada indivíduo
possui (ARANTES, 2003).
Com a democratização dos meios de comunicação, cada um e
todos podem proclamar aquilo que tem como verdade e fazer
previsões. No entanto, informar exige clareza, exatidão e trans‐
parência. Ações orientadas para o êxito são diferentes de ações
orientadas para o entendimento. Aquele que fala publicamente
necessita ser responsável no discurso. Ter o cuidado de não usar o
outro, que ouve como instrumento para alcançar seu objetivo, pois
admitir o valor incondicional da pessoa é fim e não meio justificativo.
O respeito pela autonomia do indivíduo tomar decisões informadas é
central no diálogo bioético. O público deve sim ouvir, mas também
pesquisar, refletir, ponderar, e formar, moldar e modificar suas
opiniões. Esse deve ser o processo da escolha e da tomada de
decisão.
A confusão que foi estabelecida no diálogo público sobre as
plantas transgênicas chegou ao seu grau máximo onde quem é a
favor está colocado ao lado das grandes corporações e quem é
contra é colocado como tendo uma posição ideológica; no entanto, o
bem comum não é um presente de alguém, mas sim uma
construção, um produto de negociações, alianças e conflitos sociais.
Só a transparência promove a legitimidade aos olhos do público. Em
relação ao debate entre os prós e contras, a credibilidade passa
pela explicitação dos argumentos de cada grupo, que tem origem na
sua escala de valores culturais.
As autoridades responsáveis pelos processos regulatórios
almejam a confiança do público exercitando a deliberação: cada um
envolvido no processo de decisão sobre as plantas transgênicas
deve clara e sinceramente explicitar todos os argumentos da sua
opinião, se considerando um agente moral, mostrando as reais
razões do seu ponto de vista e ouvindo as razões dos outros
(GRACIA, 2003; HABERMAS, 1989). O processo deliberativo tenta
aproximar pessoas com convicções, crenças e valores distintos.
A CTNBio é uma forma democrática de participação pública e
pode, pelo exercício dessa deliberação, ser a oportunidade de
resgate de credibilidade de instituições nacionais aos olhos do
público. A confiança resgatada será o suporte enriquecedor do
processo da tomada de decisão (CAPALBO et al., 2006; HAILS;
KINDERLERER, 2003). Este é um dos grandes desafios da bioética
do século 21: respeitar as diferenças, a diversidade e exercitar a
tolerância. Para os envolvidos no debate sobre as plantas
transgênicas é oportunidade de exercício da deliberação.

8. Considerações finais

A sociedade brasileira está aceitando, com certa benevolência,


as novas tecnologias na área médica e industrial, como a fertilização
assistida, o uso de células-tronco, fármacos e enzimas
recombinantes, entre outras, em decorrência da associação com os
possíveis benefícios direcionados aos consumidores. Entretanto, a
percepção pública nacional, sensibilizada pela imprensa e pelo
posicionamento de grupos ambientalistas, tem sido bastante
negativa quanto à biotecnologia agrícola, apesar da incontestável
relevância para o agronegócio global e das evidências científicas
indicando a segurança dos cultivos comerciais.
O País implantou, desde 1995, um marco legal de biossegurança
moderno. Esse foi posteriormente aperfeiçoado com a entrada em
vigor da Lei nº 11.105/2005, confirmando a competência da CTNBio
para deliberar sobre as atividades efetuadas com OGMs, em
harmonia com outros instrumentos legais. Atualmente, algumas
centenas de instituições brasileiras, que desempenham estas
atividades, foram cadastradas e credenciadas pelo Certificado de
Qualidade em Biossegurança (CQB). Além disso, um significativo
programa de capacitação de recursos humanos em biossegurança
vem sendo desenvolvido com a participação das universidades,
associações científicas, CTNBio e agências de fomento (ODA et al.,
2008; MENDONÇA et al., 2008).
Apesar desse esforço e de consideráveis investimentos em
biotecnologia, a adoção de cultivos transgênicos foi demorada.
Atualmente encontra-se em crescimento acelerado a cada nova
safra, com a comercialização de soja, algodão e milho GM. A cana-
de-açúcar possivelmente será a próxima lavoura transgênica. O
tema continua suscitando posições polarizadas, muitas vezes no
âmbito do próprio governo. A legislação em vigor exige a avaliação
de risco dos transgênicos e define também o espaço adequado para
a consideração de impactos socioeconômicos, avaliados no âmbito
do CNBS. A legislação anterior não deixava espaço para essas
questões, tendo ocorrido cobranças da sociedade dirigidas à
CTNBio, ao colegiado técnico, que não possui competência legal
para avaliar esses aspectos.
A riqueza de recursos genéticos dos biomas brasileiros repre‐
senta um rico manancial de genes com potencialidade para
importantes aplicações biotecnológicas. A multiplicidade de
aplicações da biotecnologia desperta o fascínio e ao mesmo tempo
o medo de riscos desconhecidos. Nesse cenário, além dos riscos,
devem ser também considerados os benefícios da biotecnologia
agrícola, tais como o aumento de produtividade agrícola, a
conservação de biodiversidade com redução da fronteira agrícola, a
redução do uso de pesticidas, alimentos enriquecidos e menor
vulnerabilidade de novas plantas transgênicas aos estresses
ambientais.
Finalizando, podemos afirmar que a área de biossegurança de
OGMs tem apresentado avanços significativos. Muitos países pos‐
suem marcos regulatórios implantados e são signatários do
Protocolo de Cartagena, favorecendo o uso seguro dessa poderosa
tecnologia. Atualmente, 25 países cultivam plantas transgênicas.
Vislumbramos um panorama mundial favorável à biotecnologia
moderna com inserção efetiva do País; no entanto, ressaltamos
como medida de precaução que seja mantida a vigilância sobre os
transgênicos comercializados e que os novos OGMs sejam
submetidos às avaliações de biossegurança embasadas no
conhecimento científico.

9. Referências
AMMANN, K. The impact of agricultural biotechnology in biodiversity. 2004. Disponível em:
< <http://www.botanishergarten.ch>. Acesso em: 18 fev. 2009
ARANTES, O. M. N. O que é preciso saber sobre clonagem e transgênicos. Rio de Janeiro:
Loyola, 2003.
BARROSO, P. A. V.; FREIRE, E. C.; AMARAL, J. A. B.; SILVA, M. T. Zonas de exclusão de
algodoeiros transgênicos para preservação de espécies de Gossipium nativas ou naturalizadas.
Campina Grande: Embrapa Algodão, 2005. 7 p. (Embrapa Algodão. Comunicado Técnico,
242).
BERGELSON, J.; PURRINGTON, C. B.; WICHMANN, G. Prosmiscuity in transgenic plants.
Nature, London, UK, v. 398, p. 25, 1998.
BRASIL. Ministério da Ciência e Tecnologia. Biotecnologia. Brasília, DF, 2009a. Disponível
em: <http://www.mct.gov.br>. Acesso em: 18 fev. 2009.
BRASIL. Ministério do Meio Ambiente. Brasília, DF, 2009b. Disponível em:
<http://www.mma.gov.br>. Acesso em: 18 fev. 2009
BRAVO, A.; SOBERÓN, M. How to cope with insect resistance to Bt toxins? Trends in
Biotechnology, Amsterdam, NL, v. 26, p. 573-579, 2008.
CAPALBO, D. M. F.; SIMON, M. F.; NODARI, R. O.; VALLE, S.; SANTOS, R. F. dos;
CORADIN, L.; DUARTE, J. O.; MIRANDA, J. E.; DIAS, E. P. F.; QUYEN, L.Q. Consideration
of problem formulation and option assessment for Bt cotton in Brazil. In: HILBECK, A.;
ANDOW, D.; FONTES, E. Environmental risk assessment of genetically modified organisms:
methodologies for assessing Bt cotton in Brazil. Wallingford: CABI Publishing, 2006. v. 2, p.
67-92.
CAPALBO, D. M. F.; VILAS-BOAS, G. T. V.; ARANTES, O. M. N. B. thuringiensis:
formulações e plantas transgênicas. In: BORÉM, A. (Org.). Biotecnologia e meio ambiente.
Viçosa: Editora da Universidade Federal de Viçosa, 2004. p. 309-350.
COOK, R. J. Science-based risk assessment for the approval and use of plants in
agricultural and other environments. In: PERSLEY, G. J.; LANTIN, M. M. (Ed.). Agricultural
biotechnology and the poor: proceedings of an International Conference. Washington, DC:
Consultative Group on International Agricultural Research, 1999. p. 123-130.
CTNBio. Comissão Técnica Nacional de Biossegurança. 2009. Disponível em:
<http://www.ctnbio.gov.br>. Acesso em: 18 fev. 2009.
DALE, P. J.; SCHEFFLER, J. A. Gene dispersal from transgenic crops. In: SCHIMIT, E. R.;
HALKELN, T. (Ed.).Transgenic organisms and biosafety. Berlin, DE: Springer-Verlag, 1996.
DECLARAÇÃO do Rio de Janeiro. 1992. Disponível em:
<http://www.mma.gov.br/sitio/index.php?
ido=conteudo.monta&idEstrutura=18&idConteudo=576>. Acesso em: 18 fev. 2009
DEMANÈCHE, S.; SANGUIN, H.; POTÉ, J.; NAVARRO, E.; BERNILLON, D.; MAVINGUI,
P.; WILDI, W.; VOGEL, T. M.; SIMONET, P. Antibiotic-resistant soil bacteria in transgenic
plant fields. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Washington, DC, v.
105, p. 3957-3962, 2008.
DUNFIELD, K. E; GEMIDA, J. J. Impact of genetically modified crops on soil an plant-
associated microbial communities. Journal of Environmental Quality, Madison, v. 33, p. 806-
815, 2004.
EDMONDS INSTITUTE. Manual for assessing ecological and human health effects of genetic
engineered organisms. Washington, DC, 1998. 200 p.
ELLSTRAND, N. C. Current knowledge of gene flow in plants: implication for transgenic
flow. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Ser. B, London, UK, v. 358, p.
1163-1170, 2003.
EMBRAPA. Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia. Brasília, DF, 2009. Disponível em:
<http://www.cnpab.embrapa.gov.br>. Acesso em: 18 fev. 2009
FAO. Expert consultation on biosafety within a biosecurity framework: contributing to
sustainable agriculture and food production. 2006. Disponível em:
<http://www.fao.org/ag/agn/agns/files/BiosafetyBiosecurityExpConsFinalReport.pdf>.
Acesso em: 20 fev. 2009.
FERNANDES, O. D. Efeito do milho geneticamente modificado (MON810) em Spodoptera
frugiperda (JE Smith, 1797) e no parasitoide de ovos Trichogramma spp. 2003. 164 f. Tese
(Doutorado) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Piracicaba, 2003.
FERNANDES, O. D.; FARIA, M.; MARTINELLI, S.; SCHMIDT, F.; CARVALHO, V. F.;
MORO, G. Short assessment of Bt maize on non-target arthropods in Brazil. Scientia
Agricola, Piracicaba, v. 64, p. 249-255, 2007.
FIRBANK, L. Introduction to the farm scale evaluation of spring-sown genetically modified
crops. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Ser. B, London, UK, v. 358,
p. 1777-1778, 2003.
FONTES, E. M. G. Legal and regulatory concerns of transgenic plants in Brazil. Journal of
Invertebrate Pathology, New York, v. 83, p.100-103, 2003.
FONTES, E. M. G. A health mix: strategies for GM and non-GM crop co-existence. In:
SANTOS, M. G. B. dos. (Org.). Artigos técnicos divulgados na mídia: coletânea 2007.
Brasília, DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2007. (Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia. Documentos, 244).
FRIZZAS, M. R. Efeito do milho geneticamente modificado MON810 sobre a comunidade de
insetos. 2003. 192 p. Tese (Doutorado) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz,
Piracicaba, 2003.
FUCHS, M.; GONSALVES, D. Safety of virus-resistant transgenic plants two decades after
their introduction: lessons from realistic field risk assessment studies. Annual Review of
Phytopathology, Palo Alto, v. 45, p. 173-202, 2007.
GRACIA, D. Ethical case deliberation and decision making. Medicine, Health Care and
Philosophy, New York, v. 6, p. 227-233, 2003.
GRESSEL, J. Molecular biology of weed control. Transgenic Research, Philadelphia, v. 9, p.
355-382, 2000.
GTZ. Cooperación Técnica Alemana. (Ed.). Hablemos con la comunidad sobre bioseguridad
y bioética en biotecnología: guía para periodistas. Cali: GTZ/Universidad Nacional de
Colombia, 2006.
GUIVANT, J. Transgênicos e percepção pública da ciência no Brasil. Ambiente & Sociedade,
Campinas, v. 9, p. 88-103, 2006.
HABERMAS, J. Consciência moral e agir comunicativo. São Paulo: Ed. Tempo Brasileiro,
1989.
HAILS, R.; KINDERLERER, J. The GM public debate: context and communication
strategies. Nature Reviews, London, UK, v. 4, p. 819-825, 2003.
ICOZ, I.; STOTZKY, G. Fate and effects of insect-resistant Bt crops in soil ecosystems. Soil
Biology and Biochemistry, Oxford, v. 40, p. 559-586, 2008.
JAMES, C. Global status of commercialized Biotech/GM Crops – ISAAA-International Service
for the Acquisition of Agri-biotech Applications. 2009. Disponível em:
<http://www.isaaa.org>. Acesso em: 20 fev. 2009
JANK, B.; RATH, J.; GAUGITSCH, H. Co-existence of agricultural production systems.
Trends in Biotechnology, Amsterdam, NL, v. 24, p. 198-200, 2006.
KAY, E.; VOGEL, T. M.; BERTOLLA F.; NALIN, R.; SIMONET, P. In situ transfer of antibiotic
resistance genes from transgenic (transplastomic) tobacco plants to bacteria. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 68, p. 3345-3351, 2002.
LEGISLAÇÃO brasileira. 2005. Disponível em: <http://www.planalto.gov.br>. Acesso em: 18
fev. 2009
LUIJBEN, M.; COHEN, J .I. Developing countries forge ahead in crop biotechnology for the
poor. Next harvest: conference report. International Service for National Agricultural
Research (ISNAR) Biotechnology Service, 2000. Disponível em:
<http://www.isnar.cgiar.org/ibs/nextHarvest.htm>. Acesso em: 20 fev. 2009
MARTINELLI, S. Efeitos de híbridos de milho Bt expressando toxinas de Bacillus thuringiensis
Berliner sobre insetos herbívoros e agentes de controle biológico em condições de campo. 2001.
139 p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto - USP, Ribeirão Preto, 2001.
MENDONÇA-HAGLER, L. C.; ALEIXO, L. Current status of biosafety framework in Brazil.
In: ROSELAND, C. R. (Ed.). LMOS and the environment. Paris, FR: OECD, 2002. p. 121-
128.
MENDONÇA-HAGLER, L. C.; MINARÉ, R.; LANGENBACH, T. A biodiversidade e os
marcos legais de biossegurança para a biotecnologia molecular. In: GARAY, I.; BECKER, B.
Dimensões humanas da biodiversidade. Petrópolis: Vozes, 2006a. p. 135-155.
MENDONÇA-HAGLER, L. C.; MELO, I. S.; INGLIS, M. C.; ANIANGO. B.; SIQUEIRA, J. O.;
WHEATLEY. R. E. (2006 b). Non-target and biodiversity impacts in soil. In: HILBECK, A.;
ANDOW, D.; FONTES, E. Environmental risk assessment of genetically modified organisms.
Methodologies for assessing Bt cotton in Brazil. Wallingford: CABI Publishing, 2006b. v. 2,
p. 225-260.
MENDONÇA-HAGLER, L. C.; SOUZA, L.; ALEIXO, L.; ODA, L. Trends in biotechnology
and biosafety in Brazil. Environmental Biosafety Research, Amsterdam, NL, v. 7, p.115-122,
2008.
NAS. National Academy of Sciences. Introduction of recombinant DNA-engineered
organisms into the environment: Key issues. Washington, DC: National Academy of
Sciences, 1987. 24 p.
NRC. National Research Council. Field testing genetically modified organisms. Washington,
DC: National Academy of Sciences, 1989. 170 p.
ODA, L. M.; FAUSTINO V.; SOUZA, K. Capacity building on biosafety: an experience from
the South. In: ANNUAL CONFERENCE OF THE EUROPEAN BIOSAFETY ASSOCIATION,
11., 2008, Florence, IT. Anais... Florence, IT: EBSA, 2008. Disponível em:
<www.ebsaweb.eu>. Acesso em: 18 fev. 2009
OECD. Organization for Economic Co-operation and Development. 1993. Disponível em:
<http://www.oecd.org>. Acesso em: 20 out. 2003.
PROTOCOLO de Cartagena sobre Biossegurança. 2003. Disponível em:
<http://www.biodiv.org/welcome.aspx>. Acesso em: 19 fev. 2009
REVISTA EXAME. Edição Especial Dupla, São Paulo, v. 42, n. 21, 5 nov. 2008.
SANVIDO, O.; ROMEIS, J.; BIGLER, F. Ecological impacts of genetically modified crops:
ten years of field research and commercial cultivation. Advances in Biochemical Engineering
Biotechnology, New York, v. 107, p. 235-278, 2007.
SAXENA, D.; FLORES, S.; STOTZKY, G. Inseticidal toxin in root exudates from Bt corn.
Nature, London, UK, v. 402, p. 408, 1999.
SCHIEMANN, J. Co-existence of genetically modified crops with conventional and organic
farming. Environmental Biosafety Research, Amsterdam, NL, v. 2, p. 213-217, 2003.
SILVEIRA, J. M .F. J.; DAL POZ, M. E.; ASSAD, A. L. Biotecnologia e recursos genéticos:
desafios e oportunidades para o Brasil. Campinas: Instituto de Economia, 2004. 412 p.
SIMPSON, A. J. G.; REINACH, F. C.; ARRUDA, P.; NASCIMENTO, A. L. T. O. ; MEIDANIS,
J.; SETUBAL, J. C. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature,
London, UK, v. 406, p. 151-157, 2000.
SMALLA, K. Horizontal transfer of antibiotic resistance genes from transgenic plants to
bacteria - are there new data to fuel the debate? WHO Seminar, 2000. p.13-14. Disponível
em:
<http://www.who.it/Emissues/GMO/gmos.htm>. Acesso em: 18 fev. 2009
TEPFER, M. Risk assessment of virus- resistant transgenic plants. Annual Review of
Phytopathology, Palo Alto, v. 40, p. 467-491, 2002.
TOMLISON, N. The concept of substantial equivalence, its historical development and current
use. Rome, IT: FAO: WHO, 2000. (Joint FAO/WHO Expert Consultation on Foods Derived
by Biotechnology).
UNEP. United Nations Environment Programme. International Technical Guidelines for
Safety in Biotechnology. Nairobi: Unep, 1995.
VALLE, M. G. do O sistema nacional de inovação em biotecnologia no Brasil: possiveis
cenários. 2005. 249 f. Tese (Doutorado em Política Científica e Tecnológica) – Universidade
Estadual de Campinas, Campinas, 2005.
VASCONCELOS, A. T.; ALMEIDA, D. F.; HUNGRIA, M.; GUIMARAES, C. T.; ANTONIO, R.
V.; ALMEIDA, F. C.; ALMEIDA, L. G. P. de; ALMEIDA, R. de; ALVES-GOMES, J. A.;
ANDRADE. E. M.; ARAUJO, J.; ARAUJO, M. F. R. de; ASTOLFI FILHO, S.; AZEVEDO, V.;
BAPTISTA, A. J.; BATATUS, L. A. M.; BATISTA, J. da S.; BEIO, A.; BERG, C. van den.;
BOGO, M.; BONATTO, S.; BORDIGNON, J.; BRIGIDO, M. M.; BRITO, C. A.; BROCCHI,
M.; BURITY, H. A.; CAMARGO, A. A.; CARDOSO, D. das D. de P.; CARNEIRO, N. P. The
complete genome sequence of Chromobacterium violaceum reveals remarkable and
exploitable bacterial adaptability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
USA, Washington, DC, v. 100, p. 11660-11665, 2003.
WHO. World Health Organization. Food Safety. Guidelines for the conduct of food safety
assessment of foods derived from recombinant-DNA plants. 2003. Disponível em:
<http://www.who.int>. Acesso em: 18 fev. 2009
WHO. World Health Organization. 2005. Disponível em: <http://www.who.int>. Acesso em:
19 fev. 2009
ZAID, A.; HUGHES, H. G.; PORCEDDU, E.; NICHOLAS, F. Glossary of biotechnology for
food and agriculture: a review and augmented edition of the Glossary of biotechnology and
genetic engineering. Rome, IT: FAO, 2001. (FAO Research and Technology Paper, 9).
Disponível em: <http://www.fao.org/sd/2002/KN0502_en.htm>. Acesso: 25 nov. 2001.
Parte 2
Enzimas
Capítulo 1
Ensaios enzimáticos de proteínas
e inibidores de proteases
envolvidos com a defesa de
plantas a patógenos
José Tadeu Abreu Oliveira
Darcy Mayra Furtado Gondim
Ilka Maria Vasconcelos

1. Introdução

Durante o curso de sua coevolução, plantas e patógenos vêm


estabelecendo relações intrínsecas, resultado de contínuas trocas
de informações moleculares. Em decorrência desse diálogo
molecular, os patógenos, hoje, possuem uma série de estratégias
para parasitar plantas, e estas, por sua vez, desenvolveram diversos
mecanismos de defesa, incluindo eventos constitutivos e induzidos
(GOHRE; ROBATZEK, 2008; JONES; DANGL, 2006).
Mecanismos de defesa pré-existentes envolvem barreiras
estruturais, tais como ceras, calose, cutina, lignina e compostos
antimicrobianos pré-formados, como fitoanticipinas, que previnem a
colonização do tecido. As plantas também possuem respostas de
defesa ativa que podem ser induzidas por todas as classes de
patógenos vegetais e por moléculas eliciadoras tanto do próprio
hospedeiro como do patógeno. A resposta induzida envolve
mecanismos como: (a) a explosão oxidativa, quando ocorre
aumento rápido e transitório de espécies reativas de oxigênio; (b)
resposta hipersensitiva (HR), caracterizada por morte celular rápida
e localizada no sítio de infecção; (c) acúmulo de metabólitos
secundários, por exemplo, de fitoalexinas; (d) produção de
moléculas sinalizadoras, tais como ácido salicílico, ácido jasmônico
e etileno; (e) indução de enzimas hidrolíticas; (f) deposição de
lignina para reforçar a parede celular; (g) formação de papila; e (g)
biossíntese de proteínas relacionadas à patogênese (PR-proteínas)
(BERGER et al., 2007; BRUCE; PICKETT, 2007; COLLINGE, 2009;
GARCIA-BRUGGER, 2006; JEANDET et al., 2002; UNDERWOOD;
SOMERVILLE, 2008; LOON et al., 2006).
Na explosão oxidativa, o excesso de produção de espécies
reativas de oxigênio (EROs), tais como peróxido de hidrogênio
(H2O2), íon superóxido (O2-) e radicais hidroxilas (-OH), constitui-se
num importante mecanismo de defesa vegetal (TORRES et al.,
2006). De fato, quando atacadas por patógenos, plantas ativam uma
série de mecanismos que inclui o rápido acúmulo dessas espécies.
As EROs podem funcionar na defesa vegetal por ação tóxica direta
contra o patógeno, formação de lignina, produção de fitoalexinas e
reação hipersensitiva, que restringe o desenvolvimento do patógeno
(HAMMERSCHIMIDT, 2005; TOMÁNKOVÁ et al., 2006). Quando
em excesso, as EROs podem levar à oxidação de proteínas, ácidos
graxos insaturados e DNA, causando danos celulares e eventual
morte da célula (HALLIWELL, 2006; SHULAEV; OLIVER, 2006).
Para evitar tais danos, as plantas possuem eficientes sistemas
antioxidantes. Participando desses sistemas, estão as enzimas
dismutase do superóxido (SOD), catalase (CAT) e peroxidase do
ascorbato (APX).
A via dos fenilpropanoides é uma das mais importantes vias do
metabolismo secundário vegetal que produz uma variedade de
compostos fenólicos relacionados à defesa. A fenilalanina amônia
liase (FAL) é a enzima-chave do metabolismo de fenilpropanoides.
Ela catalisa a formação do ácido trans-cinâmico, precursor de vários
compostos de defesa das plantas (WEN et al., 2005). Vários
trabalhos relacionam a indução dessa enzima e aumento da defesa
vegetal (BARRETO et al., 2007; BAYSAL et al., 2005; YAO; TIAN,
2005).
Outra classe de proteínas envolvidas com a defesa vegetal
engloba as PR-proteínas. Essas proteínas estão ausentes ou
presentes em pequenas quantidades em plantas saudáveis, mas se
acumulam em grandes quantidades após reconhecimento, pela
planta, da presença do agressor (FERREIRA et al., 2007; LOON et
al., 2006). Dentre as PR-proteínas, as peroxidases de fenóis (POX)
estão associadas com processos ligados à parede celular, tais como
oxidação de fenóis e lignificação de células vegetais hospedeiras
durante a reação de defesa contra agentes patogênicos (ALMAGRO
et al., 2009). Restrição à infecção por patógenos tem sido
correlacionada com o aumento da atividade de POX por vários
pesquisadores (BAYSAL et al., 2005; FERNANDES et al., 2006;
YAO; TIAN, 20056). Outras importantes PR-proteínas são as β-1,3-
glucanases e quitinases, consideradas proteínas genuinamente
antifúngicas (LOON et al., 2006). Há evidências de que essas
enzimas exercem, no mínimo, duas funções no controle de doenças.
Elas são capazes de catalisar a degradação da parede celular de
fitopatógenos, compostas por β-1,3-glucanos e quitina, e de
liberarem oligossacarídeos biologicamente ativos (elicitores),
capazes de regular o estado de imunização da planta (AMBORABÉ
et al., 2008; CAVALCANTI et al., 2008; DUTSADEE; NUNTA, 2008).
Vários trabalhos correlacionam aumento da expressão dessas
enzimas com mecanismos de defesa vegetal (CAVALCANTI et al.,
2007; COTA et al., 2007; RESENDE et al., 2007).
Os patógenos produzem proteinases extracelulares tendo papel
ativo no desenvolvimento de doenças nas plantas. Em resposta à
ação dessas proteinases, as plantas sintetizam inibidores de
proteinases serínicas, cisteínicas, aspárticas e metalo-proteinases
(HAQ et al., 2004; SAWANO et al., 2008). Esses inibidores têm sido
estudados na perspectiva de serem usados no controle não só de
fitopatógenos, mas, também, de nematoides e insetos
(BENCHABANE et al., 2008; MOSOLOV; VALUEVA, 2008) que
atacam as plantas. As fitocistatinas são inibidores de proteases
cisteínicas que ocorrem em plantas, já tendo sido isolados de várias
fontes e tecidos vegetais (GIANOTTI et al., 2006; OLIVEIRA et al.,
2003). Além da função protetora nas plantas, há evidências de que
esses inibidores regulam a ação de proteinases cisteínicas
endógenas durante o desenvolvimento e germinação da semente e
na morte celular programada (GIANOTTI et al., 2006).
De maneira geral, uma resposta de defesa apropriada das
plantas vem da percepção de sinais extracelulares e sua transdução
entre as células vegetais. Especificamente para interação plantas e
patógenos, esses são ainda fenômenos pouco compreendidos, e
sua elucidação representa uma importante tarefa da patologia
vegetal (NIMCHUK et al., 2001). O conhecimento do comportamento
das enzimas antioxidativas e das PR-proteínas envolvidas com os
mecanismos de defesa ajudam a entender como as plantas reagem
frente ao ataque de agressores.
Neste capítulo, ensaios quantitativos de algumas das proteínas
envolvidas com os mecanismos de defesa das plantas, corriqueira‐
mente usados no nosso laboratório, são apresentados. Atenção
especial deve ser dada à faixa operacional do espectrofotômetro a
ser usado, na qual a linearidade é mantida.

2. Protocolos enzimáticos

2.1. Dismutases de superóxido (SOD; EC 1.15.1.1)

As dismutases de superóxido (SODs) são metaloenzimas que


catalisam a formação de peróxido de hidrogênio a partir do íon
superóxido, constituindo a primeira linha de defesa celular contra as
EROs. O excesso de peróxido de hidrogênio deverá ser, também,
rapidamente eliminado das células (BIAN; JIAN, 2009; FOYER;
NOCTOR, 2005). Em plantas, as SODs são encontradas, principal‐
mente, nos cloroplastos, mitocôndrias, citosol e peroxissomos, sob
diferentes isoformas.
2.1.1. Princípio do ensaio
O ensaio para detecção e quantificação de SODs descrito, aqui,
envolve a excitação fotoquímica da riboflavina, seguida de sua
redução pela L-metionina para uma semiquinona, que doa um
elétron para o oxigênio, formando, assim, o radical superóxido
(Figura 1). O superóxido formado converte, por sua vez, o nitro azul
de tetrazólio (NBT) para formazana azul. Essa reação final é, então,
inibida pela SOD (PIACHAM et al., 2003).

Figura 1. Fotorredução do NBT a formazana.


Fonte: adaptado de Piacham et al. (2003).

2.1.2. Reagentes
A. Tampão fosfato de potássio 1 M, pH 7,8.
B. EDTA 1 mM.
C. Triton X-100 0,25%.
D. L-Metionina 130 mM.
E. Amostra em teste.
F. Água deionizada de alta qualidade.
G. Nitro azul de tetrazólio (NBT) 750 µM.
H. Riboflavina 100 mM.

2.1.3. Procedimento (ROSSUM et al., 1997)


O ensaio foi adaptado para ser feito em micropoços de placas
tipo ELISA. Sendo realizado à temperatura ambiente (25 ºC), os
reagentes devem estar nessa condição antes do início do ensaio.
Nos poços da microplaca adicionar, nesta ordem, e em triplicata:
• 10 µL do reagente A.
• 20 µL do reagente B.
• 10 µL do reagente C.
• 20 µL do reagente D.
• 0 µL a 100 µL de E (amostra).
• 0 µL a 100 µL de F (E + F = 100 µL).
• 20 µL do reagente G.
• 20 µL do reagente H (com a adição da riboflavina a reação se
inicia).
A adição dos reagentes G e H deve ser feita em ambiente com
baixa luminosidade. Imediatamente após adição de H, deve-se
cobrir a microplaca com papel alumínio, mantê-la no escuro e
proceder com as leituras de absorbância a 630 nm, em leitora de
ELISA, após 5 minutos em repouso. As absorbâncias determinadas
no escuro se referem àquelas inerentes à mistura reacional e não à
reação propriamente dita. Após a etapa no escuro, deve-se
transferir a microplaca para uma câmara com luz fluorescente de 32
W ou 40 W e fazer leituras a 630 nm, a intervalos de 1 minuto, até
completar o tempo de 5 minutos de reação. Após cada leitura de
absorbância, a placa deve voltar, imediatamente, para a câmara
luminosa.

2.1.4. Cálculo da atividade


A atividade da SOD é determinada de acordo com a capacidade
da enzima em inibir a produção da formazana azul. Uma unidade de
atividade (1 UA) é definida como a quantidade da amostra
necessária para inibir 50% da fotorredução, em relação ao controle
positivo, do NBT à formazana azul.
Para avaliar a constância da velocidade de reação, deve-se
fazer, inicialmente, um gráfico de absorbância (ordenada) versus
tempo (abscissa). Confirmada a linearidade, calcula-se o percentual
máximo (100%) de fotorredução do NBT/min, na ausência da
amostra, considerando 5 minutos de reação, da seguinte maneira:

Para calcular o percentual de fotorredução na presença da


amostra, procede-se:

Se Absmax/min corresponde a 100% de fotorredução; então, para


a amostra, Absamostra/min corresponde a X% de fotorredução. Logo, o
percentual de inibição (I%) da fotorredução, pela amostra, será (I%)
= 100 - X%.
Para calcular a unidade de atividade (UA), definida como a
quantidade da amostra necessária para inibir 50% da fotorredução
do NBT à formazana azul, usa-se a correspondência:
Se 50% de inibição corresponde a 1 UA, logo (I%) corresponderá a
Y UA.
Como o Y calculado é a unidade de atividade (UA) presente no
volume da amostra utilizado no ensaio, padroniza-se Y para 1,0 mL
de amostra (UA/mL). Por exemplo, se o volume da amostra utilizado
no ensaio foi de 10 µL, multiplica-se Y por 100.
Para expressar UA por mg de proteína (UA/mg P) (atividade
específica), divide-se o valor de Y, extrapolado para o volume de 1,0
mL da amostra, pela sua concentração de proteína (mg/mL)
(BRADFORD, 1976).
Para expressar UA por grama de massa fresca (UA/g MF),
multiplica-se o valor Y, expresso em UA/mL, pelo volume de tampão
de extração das proteínas do tecido (UA total) e divide-se pela
massa (g) do tecido utilizado.

2.2. Catalases (CAT; EC 1.11.1.6)

Estas enzimas estão associadas com a defesa vegetal,


protegendo as células dos danos oxidativos oriundos da
acumulação excessiva do peróxido de hidrogênio. As plantas
possuem várias isoformas de catalase, encontradas nos
peroxissomos, glioxissomos, citosol e mitocôndrias. São as
principais enzimas de detoxificação do peróxido de hidrogênio em
plantas e podem dismutar, diretamente, o peróxido ou oxidar
substratos, tais como metanol, etanol, formaldeído e ácido fórmico
(BREUSEGEM et al., 2001). Comparadas às peroxidases de
ascorbato, as CATs possuem baixa afinidade pelo substrato (H2O2),
porém apresentam alta atividade catalítica. Essa diferença de
propriedade cinética é atribuída à necessidade da ligação
simultânea de duas moléculas de peróxido de hidrogênio ao sítio
catalítico da CAT para que ocorra a reação (NOCTOR; FOYER,
1998).

2.2.1. Princípio do ensaio


As CATs catalisam a dismutação do H2O2 em água e oxigênio
molecular, conforme reação abaixo:

2H2O2 → 2H2O + O2

2.2.2. Reagentes
A. Tampão fosfato de potássio 75 mM, pH 7,0.
B. Água deionizada de alta qualidade.
C. Peróxido de hidrogênio 112,5 mM preparado momentos antes do
ensaio.

2.2.3. Procedimento (HAVIR; MCHALE, 1987; PEIXOTO et al.,


1999)
Nos tubos de ensaio, em triplicata, adicionar, nesta ordem:
• 600 µL do reagente A. Incubar tubos a 30 ºC por 10 minutos.
• ≤ 300 µL da amostra diluído previamente caso necessário.
• Volume do reagente B em quantidade suficiente para (q.s.p)
completar 900 µL da mistura reacional.
• 100 µL do reagente C.
Em cubeta de quartzo, deve-se zerar o espectrofotômetro com
água e ler as absorbâncias das amostras a 240 nm. Faz-se uma
primeira leitura após 10 segundos da adição do reagente C
(considerar como branco). Em seguida, acompanha-se decréscimo
da absorbância ao longo do tempo; por exemplo, em intervalos de
10 segundos até 60 segundos após o início da reação. Esse tempo
poderá ser reduzido ou aumentado dependendo da intensidade de
atividade presente na amostra. Para comprovar a linearidade da
velocidade de reação no intervalo de tempo usado no ensaio,
plotam-se as absorbâncias (ordenada) obtidas versus tempo
(segundo) de reação (abscissa).

2.2.4. Cálculo da atividade


A atividade da CAT poderá ser estimada utilizando-se o coefi‐
ciente de absortividade (extinção) molar de 36 M/cm (ANDERSON
et al., 1995) e expressa em µmolar de H2O2 consumido. Segue o
cálculo da ∆Abs das amostras:

∆Abs240nm = Abs240nm (10 s) - Abs240nm (60 s, por exemplo)


No exemplo acima, o resultado obtido de ∆Abs240nm refere-se ao
intervalo de 50 segundos de reação. Deve-se extrapolar o resultado
obtido de ∆Abs240nm para o tempo de reação de 1 minuto (∆Abs240nm x
60/50).
Nesse caso, o valor foi obtido para o volume da alíquota da
amostra usada. Esse valor deve ser corrigido para o volume de 1
mL. Por exemplo, se o volume da amostra utilizado no ensaio, não
diluída previamente, foi de 50 µL, multiplica-se o valor de
∆Abs240nm/min por 20. Se diluída, multiplica-se pelo fator de diluição.
O resultado final estará expresso em ∆Abs240nm/mL/min.
Alternativamente, para cada amostra, pode-se fazer o gráfico de
∆Abs240nm (ordenada) versus tempo (s) para vários intervalos, sendo
a tangente da reta obtida equivalente à variação da absorbância por
segundo (∆Abs240nm/s). Converte-se o resultado para ser expresso
por mL/min (∆Abs240nm/mL/min).
De posse desse valor (média das triplicatas), usa-se a lei de
Lambert-Beer: A = e x l x c, sendo A = absorbância; e = coeficiente
absortividade molar (36 M/cm); l = caminho óptico; c = concentração
(M) da amostra.
Após calcular o valor de c, deve-se convertê-lo para μmolar.
Esse valor (atividade da CAT) corresponde a μmolar de H2O2 consu‐
mido/min.
Para expressar μmolar de H2O2 consumido/min/mg de proteína
(atividade específica), divide-se o resultado anterior (μmolar de H2O2
consumido/min) pela concentração de proteína da amostra
(BRADFORD, 1976), expressa em mg/proteína/mL.
Para expressar em μmolar de H2O2 consumido/g de massa
fresca do tecido, multiplica-se o resultado obtido (μmolar de H2O2
consumido/min) pelo volume do tampão usado para extrair as
proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g) do tecido.
2.3. Peroxidase do ascorbato (APX; EC 1.11.1.11)

As peroxidases do ascorbato (APXs) são importantes oxirreduta‐


ses, componentes do sistema antioxidante das plantas superiores.
São encontradas, principalmente, nos cloroplastos, mitocôndrias,
citosol e peroxissomos, ocorrendo sob várias isoformas. Porém,
todas as APXs utilizam o ascorbato como doador específico de
elétrons (ASADA et al., 1992).

2.3.1. Princípio do ensaio


As APXs catalisam a redução do H2O2 em água, pela oxidação
do L-ascorbato.

2 L-ascorbato + H2O2 → 2 monodehidroascorbato + 2H2O

2.3.2. Reagentes
A. Tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 6,0, contendo 0,5 mM de
ácido L-ascórbico (adicionar o ácido ascórbico momentos antes
da realização do ensaio, em tampão 2x concentrado e diluir para
50 mM, pH 6,0).
B. Peróxido de hidrogênio 2 mM (preparar momentos antes do
ensaio).

2.3.3. Procedimento (KOSHIBA, 1993; PEIXOTO et al., 1999)


Nos tubos de ensaio, em triplicata, adicionar, nesta ordem:
• 800 µL do reagente A.
• 100 µL da amostra (diluir, previamente, caso necessário).
Incubar os tubos a 30 ºC, por 10 minutos.
• 100 µL do reagente B.
Ajustar comprimento de onda no espectrofotômetro para 290 nm.
Zerar o aparelho com a cubeta de quartzo contendo água
deionizada. Iniciar a leitura de absorbância logo após colocar o
H2O2. Acompanhar o decréscimo da absorbância ao longo do
tempo, por exemplo, em intervalos de 30 segundos, para averiguar
a linearidade da velocidade de reação.

2.3.4. Cálculo da atividade


O decréscimo na leitura da absorbância é mensurado como
índice de oxidação do ascorbato. A atividade da APX pode ser
determinada, também, utilizando-se a curva padrão construída a
partir de concentrações conhecidas de ácido L-ascórbico (de 0,1
μmol/mL a 1,0 μmol/mL). Segue o cálculo da ∆Abs das amostras:

∆Abs290nm = Abs290nm (10 s) - Abs290nm (190 s, por exemplo)

No exemplo acima, o resultado obtido de ∆Abs290nm é para o


tempo de 180 segundos. Deve-se extrapolar o resultado para ser
expresso por minuto (∆Abs290nm/min).
No ensaio, o valor foi obtido para o volume da alíquota da
amostra usada. Esse valor deve ser corrigido para o volume de 1
mL. Por exemplo, se o volume da amostra utilizado no ensaio, não
diluída previamente, foi de 100 µL, multiplica-se o valor de
∆Abs290nm/min por 10. Se diluída, multiplica-se pelo fator de diluição.
O resultado final estará expresso em ∆Abs290nm/mL/min.
Alternativamente, para cada amostra, pode-se fazer o gráfico de
∆Abs290nm (ordenada) versus tempo (s) (abscissa) para vários
intervalos, sendo a tangente da reta obtida equivalente à variação
da absorbância por segundo (∆Abs290nm/s). Converte-se o resultado
para ser expresso por minuto e extrapola-se para o volume de 1 mL
da amostra, não diluída (∆Abs290nm/mL/min).
Para obtenção da curva padrão, deve-se plotar Abs290nm
(ordenada) versus μmol L-ascorbato/mL (abscissa) e calcular a
cotangente da reta [fator de conversão (Fc)].
Em seguida, calcula-se a atividade da amostra ensaiada, já
corrigida para mL e minuto, como segue:

∆Abs290nm/mL/min da amostra x Fc = resultado expresso em


μmol ascorbato consumido/mL/min

Para expressar em μmol ascorbato consumido/mg de proteína


(atividade específica), divide-se o resultado anterior, expresso em
μmol ascorbato consumido/mL/min, pela concentração de proteína
(BRADFORD, 1976) da amostra, expressa em mg proteína/mL.
Para expressar em μmol ascorbato consumido/g de massa
fresca do tecido, multiplica-se o resultado obtido, expresso em μmol
ascorbato consumido/mL/min, pelo volume usado para extrair as
proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g) do tecido.

2.4. Peroxidase de fenóis (POX; EC 1.11.1.7)

As peroxidases, encontradas em diversos compartimentos


celulares como o citosol, vacúolo e parede celular, compõem uma
super família de enzimas envolvidas com diversos papéis nas
plantas, dentre os quais se destacam a participação no processo de
lignificação da parede celular, regulação do crescimento, biossíntese
do etilieno e resposta a vários estresses (CAVALCANTI et al., 2007),
além de atividade antifúngica (GHOSH, 2006).

2.4.1. Princípio do ensaio


A POX catalisa a seguinte reação:

4 guaiacol + 4 H2O2 → Tetraguaiacol + 8 H2O

2.4.2. Reagentes
A. Tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2.
B. Guaiacol 20 mM (manter essa solução em vidro escuro).
C. Peróxido de hidrogênio 60 mM (preparar momentos antes do
ensaio).

2.4.3. Procedimento (URBANEK et al., 1991)


Nos tubos de ensaio, em triplicata, adicionar, nesta ordem:
• 800 µL do reagente A.
• 500 µL do reagente B.
• 500 µL do reagente C. Incubar os tubos a 30 ºC por 10 minutos.
• 200 µL da amostra (diluir, previamente, caso necessário).
Em cubeta de plástico ou vidro, deve-se zerar o espectrofo‐
tômetro com água e ler absorbância a 480 nm. Iniciam-se leituras
imediatamente após colocar a amostra. Acompanha-se o aumento
da absorbância ao longo do tempo, por exemplo, em intervalos de
30 segundos até 3 minutos. Esse tempo poderá ser reduzido ou
aumentado na dependência da intensidade de atividade presente na
amostra. A leitura no tempo de 10 segundos é tomada como branco.

2.4.4. Cálculo da atividade


O aumento da absorbância, no curso da reação, indica formação
do tetraguaiacol. Uma unidade de atividade peroxidásica (1 UA) é
definida como a variação de uma unidade de absorbância por
mL/min. Segue o cálculo da ∆Abs480nm da amostra:

∆Abs480nm amostra = Abs480nm amostra (tempo escolhido, p.ex.: 100 s) -


Abs480nm amostra (10 s)

No exemplo acima, o resultado obtido de ∆Abs480nm amostra foi para


o intervalo de tempo de 90 segundos. Extrapola-se para ser
expresso em ∆Abs480nm amostra/min.
No ensaio, o valor foi obtido para o volume da alíquota da
amostra usada. Este valor deve ser corrigido para o volume de 1
mL. Por exemplo, se o volume da amostra utilizado no ensaio, não
diluída previamente, foi de 10 µL, multiplica-se o valor de ∆Abs480nm
amostra/s por 100. Se diluída, multiplica-se pelo fator de diluição. O
resultado final estará expresso em ∆Abs480nm amostra/mL/min.
Alternativamente, para cada amostra, pode-se fazer o gráfico de
∆Abs480nm amostra (ordenada) versus tempo (s) (abscissa) para vários
intervalos, sendo a tangente da reta obtida equivalente à variação
da absorbância por segundo (∆Abs480nm amostra/s). Converte-se o
resultado para ser expresso por mL e por minuto, como indicado
anteriormente (∆Abs480nm/mL/min). Para expressar em UA proceder
da seguinte forma:
Se a variação de uma unidade de absorbância/mL/min
corresponde a 1 UA, ∆Abs480nm amostra/mL/min corresponde a X UA.
Para expressar em UA/mg de proteína (atividade específica),
divide-se a UA obtida pela concentração de proteína (BRADFORD,
1976) da amostra, expressa em mg proteína/mL.
Para expressar em UA/g de massa fresca do tecido, multiplica-se
o valor de UA pelo volume do tampão usado para extrair as
proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g) do tecido.

2.5. Fenilalanina amônia liase (FAL; EC 4.3.1.5)

A FAL é uma importante enzima envolvida no mecanismo de


defesa de plantas ao ataque de patógenos. Essa enzima é respon‐
sável pela conversão de L-fenilalanina em ácido trans-cinâmico, um
intermediário-chave para produção de vários fenilpropanoides, como
a lignina, flavonoides (fitoalexinas) e coumarinas, e também do
ácido salicílico, um sinalizador químico de repostas de defesa
vegetal contra patógenos (EL-SHORA, 2002; PAPARU, 2007; ZHAO
et al., 2005).

2.5.1. Princípio do ensaio


A FAL atua catalisando a desaminação não oxidativa da
fenilalanina pela seguinte reação:

L-fenilalanina → ácido trans-cinâmico + NH3

2.5.2. Reagentes
A. Ácido trans-cinâmico 1 mM.
B. Tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8,8.
C. β-Mercaptoetanol 50 mM.
D. Solução L-Fenilalanina 40 mM.
E. HCl 6 M.

2.5.3. Procedimento (EL-SHORA, 2002; MORI et al., 2001)


Para obtenção da curva padrão de ácido trans-cinâmico, deve-se
adicionar, em tubos tipo eppendorf, à temperatura de 30 ºC, nesta
ordem:
• De 0 µL a 900 µL (em alíquotas de 100 µL) do reagente A
diluído 15x.
• De 0 µL a 900 µL do reagente B (A + B = 900 µL).
• 100 µL do reagente E.
Em cubeta de quartzo, deve-se zerar o espectrofotômetro com o
branco, sem ácido trans-cinâmico, e medir leituras de absorbância a
290 nm. Deve-se construir a curva padrão [Abs290nm (ordenada)
versus μmol/mL de ácido trans-cinâmico (abscissa)] e calcular a
cotangente da reta [fator de conversão (Fc)]. Para determinação da
atividade enzimática (em triplicata), adiciona-se, nesta ordem:
• 20 µL do reagente C.
• 100 µL da amostra, diluída previamente caso necessário.
• 580 µL do reagente B.
• 200 µL do reagente D. Incubar a 30 ºC, por 60 minutos.
• 100 µL do reagente E.
No controle em branco para cada amostra, coloca-se o reagente
D somente após a interrupção da reação com o reagente E. Devem-
se centrifugar todos os tubos a 10.000 g/10 minutos e ler absorbân‐
cia, zerando antes o espectrofotômetro com água deionizada.

2.5.4. Cálculo da atividade


Segue o cálculo da absorbância corrigida:

Abscorrigida amostra = Absamostra - Absbranco

Calcula-se a média das triplicatas. No ensaio, o valor foi obtido


para o volume da alíquota da amostra usada. Esse valor deve ser
corrigido para o volume de 1 mL. Por exemplo, se o volume da
amostra utilizado no ensaio, não diluída previamente, foi de 100 µL,
multiplica-se o valor de Abs290nm por 10. Se diluída, multiplica-se pelo
fator de diluição. O resultado estará expresso em Abs290nm
amostra/mL/hora. Em seguida, calcula-se a atividade da amostra, já
corrigida para mL, como segue:

Abs290nm amostra/mL/h x Fc = resultado expresso em μmol de ácido


trans-cinâmico gerado por mL/h

Para expressar em μmol de ácido trans-cinâmico gerado/mg de


proteína (atividade específica), divide-se o resultado anterior (μmol
de ácido trans-cinâmico gerado/mL/h) pela concentração de
proteína (BRADFORD, 1976) da amostra, expressa em mg
proteína/mL.
Para expressar em μmol ácido trans-cinâmico gerado/g de
massa fresca do tecido, multiplica-se o resultado obtido (μmol ácido
trans-cinâmico gerado/mL/h) pelo volume de tampão usado para
extrair as proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g)
do tecido.
2.6. β-1,3-glucanase (GLU; EC 3.2.2.6 ou 3.2.1.39)

As β-1,3-glucanases são enzimas hidrolíticas largamente distri‐


buídas no reino vegetal. Elas se apresentam sob diferentes
isoformas e estão localizadas tanto no vacúolo como nos espaços
extracelulares. O mecanismo de ação dessas glucanases envolve
degradação de paredes celulares de agentes patogênicos das
plantas, já que β-1,3-glucanos são componentes essenciais dessas
estruturas. Como consequência da sua ação hidrolítica, essas
enzimas, além de desestruturarem paredes celulares diversas,
podem liberar oligossacarídeos biologicamente ativos (elicitores)
capazes de regular o estado de imunização da planta (CHARLES et
al., 2009; LOON et al., 2006).

2.6.1. Princípio do ensaio


O método de quantificação da β-1,3-glucanase, aqui descrito,
baseia-se na capacidade da amostra que contenha a enzima de
liberar glucose, a partir da degradação da laminarina, polissacarídeo
usado como substrato. Uma vez liberados, os monômeros de
glucose irão reduzir sais de cobre, em solução alcalina, que irão
produzir um composto de coloração azul passível de ser quanti‐
ficado por colorimetria. A concentração de laminarina aqui utilizada
deve ser adequada para a maioria dos ensaios com plantas.
Entretanto, é sugerido que se faça a reação ao longo do intervalo de
tempo sugerido (30 minutos) para verificação da linearidade da
reação.

2.6.2. Reagentes
A. Solução padrão de glucose (300 µg/mL = 1,7 x 106 nM). Preparar
em azida a 0,02%.
B. Tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2.
C. Composição:
Na2CO3 (anidro): 25 g
KNaC4H4O6·4H2O: 25 g
NaHCO3 : 20 g
Na2SO4 (anidro): 200 g
H2O deionizada (q.s.p.): 1.000 mL
D. Composição:
CuSO4 5H2O : 15 g
H2SO4 (concentrado): 1 a 2 gotas
H2O deionizada (q.s.p.): 100 mL
E. Misturar 1,0 mL do reagente D + 25,0 mL do reagente C
(preparar minutos antes do ensaio).
F. Composição:
H2O deionizada: 450 mL
H2SO4 (concentrado): 21 mL
(NH4)6Mo7 O24.4H2O: 25 g
Obs.: adicionar o ácido sulfúrico sobre a água, em banho de gelo,
estando protegido com óculos e vestimenta adequada. Dissolver o
molibdato de amônio nessa solução, agitando.
G. Composição:
Na2HAs04.7H20: 3 g
H2O deionizada: 25 mL
H. Misturar as soluções F e G, agitando. Deixar em repouso por 24
horas, 37 ºC, ou por 30 minutos, 55 ºC.
Obs.: manter a solução em vidro escuro.
I. Solução de laminarina (2 mg/mL). Dissolver a laminarina em água
deionizada. Aquecer a 60 ºC por 10 minutos. Dialisar, exaustiva‐
mente, contra água para remover glucose livre.
Obs.: essa solução deverá ser utilizada até 3 dias após ser
preparada.

2.6.3. Procedimento (BOLLER, 1993)


Para obtenção da curva padrão de glucose, deve-se adicionar
em tubos de ensaio (20 mL), à temperatura ambiente, nesta ordem:
• 0, 10 µL, 20 µL, 30 µL, 40 µL, 50 µL, 60 µL, 80 µL e 100 µL do
reagente A.
• 1.000 µL, 990 µL, 980 µL, 970 µL, 960 µL, 950 µL, 940 µL, 920
µL e 900 µL, respectivamente, do reagente B.
• 1.000 µL do reagente E. Incubar a 100 ºC, por 20 minutos.
Resfriar, em água, por 5 minutos.
• 1.000 µL do reagente H. Agitar tubos em vortex, até completa
remoção dos gases. Deixar em repouso por 5 minutos.
Em cubeta de vidro ou plástico, deve-se zerar o espectrofotô‐
metro com água deionizada e ler absorbância a 520 nm. Constrói-se
a curva padrão [Abs520nm (ordenada) versus concentração (μg/mL)
de glucose (abscissa)] e calcula-se a cotangente da reta para
obtenção do fator de conversão (Fc).
Para determinação da atividade da β-1,3-Glucanase nas
amostras, deve-se misturar, à temperatura ambiente, nesta ordem:
• 100 µL da amostra (diluída, previamente, com o reagente B,
caso necessário).
• 900 µL do reagente I. Incubar a 50 ºC, por 30 minutos.
• 1.000 µL do reagente E. Incubar a 100 ºC, por 30 minutos.
Resfriar em água por 5 minutos.
• 1.000 µL do reagente H. Agitar tubos em vortex, até completa
remoção dos gases. Deixar em repouso por 5 minutos.
Obs.: em nosso laboratório, a experiência tem mostrado a necessi‐
dade de se fazer os seguintes controles:
a) Branco dos reagentes: substituir a alíquota da amostra e da
laminarina pelo reagente B (1 mL); b) Branco da laminarina:
substituir somente a alíquota da amostra pelo reagente B (100 µL);
c) Branco correspondente a cada amostra ensaiada (branco
amostra): substituir a laminarina da mistura reacional pelo reagente
B.

2.6.4. Cálculo da atividade


A quantidade de glucose liberada pela ação da enzima sobre a
laminarina é calculada com base na curva padrão construída a partir
de concentrações conhecidas do açúcar. A atividade da enzima
pode ser expressa em nanokatal (nkat). Um nkat equivale a 1 nmol
de glucose liberado por mL da amostra por segundo. Segue o
cálculo da absorbância corrigida em relação aos brancos:

Abs520nm amostra corrigida = [(Absamostra - Absbranco amostra) - (Absbranco laminarina -


Absbranco reagente)]

Calcula-se a média das triplicatas. Padroniza-se a média obtida


para mL, levando em conta o volume da amostra utilizada, bem
como sua diluição prévia, caso isso tenha ocorrido.
Corrige-se o valor obtido para ser expresso por segundo. Divide-
se por 1.800, já que o tempo de reação é de 30 minutos.
Multiplica-se o resultado do valor de absorbância/segundo pelo
fator da curva para converter a absorbância em µg de glucose
produzida por mL, por segundo (µg de glucose liberada/mL/s).
Converte-se este valor para nmol de glucose liberada/mL/s. 1
nmol de glucose liberada/mL/s equivale a 1 nkat.
Para expressar em nkat/mg de proteína (atividade específica),
divide-se o resultado (nkat) pela concentração de proteína
(BRADFORD, 1976) da amostra, expressa em mg proteína/mL.
Para expressar em nkat/g de massa fresca do tecido, multiplica-se o
resultado obtido (nkat) pelo volume do tampão usado para extrair as
proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g) do tecido.

2.7. Quitinase (CHI; EC 3.2.1.14)

As quitinases são enzimas capazes de hidrolisar ligações tipo


β-1,4 que unem os resíduos de N-acetil-D-glucosamina (NAG) que
formam a quitina, composto presente na parede celular de diversos
fungos fitopatogênicos, em nematoides parasitas de planta e na
membrana peritrófica de alguns insetos herbívoros. Além de sua
ação direta contra patógenos, essas enzimas também são capazes
de potencializar respostas de defesa vegetal ativa ao liberarem
oligômeros de açúcares, que funcionam como moléculas elicitoras
(LOPEZ; GÓMEZ-GÓMEZ, 2009; LOON et al., 2006).

2.7.1. Princípio do ensaio


A determinação da atividade desta enzima consiste na capaci‐
dade da amostra em liberar NAG, a partir da sua ação hidrolítica
sobre a quitina coloidal. A enzima glucoronidase é adicionada a
esse ensaio para que os oligômeros resultantes da ação
endoquitinolítica sejam clivados. Após liberação dos monômeros,
ocorrerá o coramento dos mesmos em duas etapas independentes
envolvendo os reagentes tetraborato de potássio e p-
dimetilaminobenzaldeído (DMAB). Primeiramente, ocorre a
formação de um composto intermediário, uma glucoxazolina e, em
seguida, sua reação com o DMAB para a produção da cor em meio
ácido (REISSIG et al., 1955). A quitina coloidal é preparada a partir
de quitosana de carapaça de caranguejo (MOLANO et al., 1970),
usando anidrido acético não radioativo (MARTINS-MIRANDA,
2002).

2.7.2. Reagentes
A. NAG 1 mM. Preparar em água deionizada, contendo azida
0,02%. Diluir o reagente A para concentrações de 100 µM, 200
µM, 300 µM, 400 µM, 500 µM e 600 µM, momentos antes de
construir a curva padrão.
B. Tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2.
C. Tetraborato de potássio 0,6 M.
D. DMAB 10%. Dissolver 10 g em 100 mL de ácido acético glacial
contendo 12,5% (v/v) de ácido clorídrico 11,5 M. Essa solução
deverá ser diluída duas vezes (1:2) com ácido acético glacial, no
momento de ser utilizada.
E. Quitina coloidal (10 mg/mL).
F. β-Glucoronidase (EC 3.2.1.31; 132.000 unidades/mL). Diluir 10x.

2.7.3. Procedimento (BOLLER, 1993; MARTINS-MIRANDA, 2002;


REISSIG et al., 1955)
Para obtenção da curva padrão, deve-se adicionar, em tubos tipo
eppendorf (tampa rosqueada), à temperatura ambiente, nesta
ordem:
• 100 µL do reagente A (NAG) previamente diluído.
• 400 µL do reagente B.
• 100 µL do reagente C. Incubar a 100 ºC, por 5 minutos.
Resfriar, imediatamente, em banho de gelo.
• 1.000 µL do reagente D. Homogeneizar e incubar a 37 ºC, por
20 minutos precisamente.
Imediatamente, em cubeta de vidro ou plástico, deve-se zerar o
espectrofotômetro com água deionizada, ou com o branco dos
reagentes, e ler absorbância a 585 nm. As leituras têm que ser
feitas no menor tempo possível, pois, a cada 5 minutos passados
após o tempo de incubação, a absorbância cai, aproximadamente,
1,5% (RESSIG et al., 1955).
Deve-se construir a curva padrão [Abs585nm (ordenada) versus
concentração (nmoles/1.600 µL) de NAG (abscissa)] e calcular a
cotangente da reta para obtenção do fator de conversão (Fc).
Para determinação da atividade da quitinase, deve-se adicionar
em tubos tipo eppendorf (tampa rosqueada), à temperatura
ambiente, nesta ordem:
1ª etapa:
• 250 µL da amostra. Diluir, previamente, com o reagente B, caso
necessário.
• 250 µL do reagente E. Homogeneizar e incubar a 37 ºC por 60
minutos sob leve agitação. Em seguida, incubar a 100 ºC por 5
minutos e resfriar, imediatamente, em banho de gelo.
Centrifugar os tubos a 10.000 g por 10 minutos.
2ª etapa:
• 300 µL do sobrenadante final da etapa anterior, após
centrifugação, para um novo tubo tipo eppendorf (tampa
rosqueada, 2 mL), ao qual se deve adicionar:
• 10 µL do reagente F. Incubar a 37 ºC, por 60 minutos, sob leve
agitação. Em seguida, incubar a 100 ºC por 5 minutos e resfriar,
imediatamente, em banho de gelo.
• 190 µL do reagente B.
• 100 µL do reagente C. Incubação a 100 ºC, por 5 minutos,
precisamente. Resfriar, imediatamente, em banho de gelo, por 5
minutos.
• 1.000 µL do reagente D. Homogeneizar e incubar a 37 ºC, por
20 minutos, precisamente.
Da mesma forma como indicado para construção da curva
padrão, deve-se ler absorbância a 585 nm, imediatamente após a
incubação final. Observe que o volume da mistura da 2ª etapa, em
que será mensurada a liberação de NAG, é de 1.600 µL, à
semelhança do volume da curva padrão.
Obs.: neste protocolo, a atividade mensurada é a total, ou seja,
engloba a ação endoquitinolítica e exoquitinolítica da enzima.
2.7.4. Cálculo da atividade
A quantidade do açúcar liberado é calculada com base na curva
padrão construída a partir de concentrações conhecidas de NAG (10
nmoles a 60 nmoles) contidas no volume de reação (1.600 µL). A
atividade quitinásica é expressa em nanokatal (nkat). Um nkat
equivale a 1 nmol de NAG liberado/s nas condições do ensaio.
Segue o cálculo da absorbância corrigida em relação aos
respectivos brancos:

Abs585nm = Absamostra - Absbranco amostra

Calcula-se a média das triplicatas. Extrapola-se a média obtida


para mL, levando em conta o volume da amostra utilizada no
ensaio, bem como sua diluição prévia, caso isso tenha ocorrido.
Corrige-se o valor obtido para ser expresso por segundo (divide-
se por 3.600, já que o tempo de reação é de 60 minutos).
Multiplica-se pelo fator da curva (Fc) para converter a absor‐
bância em nmoles de NAG liberados por mL da amostra por
segundo (nmoles de NAG liberado/mL/s). 1 nmol de NAG
liberada/mL/s equivale a 1 nkat.
Para expressar em nkat/mg de proteína (atividade específica),
divide-se o resultado (nkat) pela concentração de proteína
(BRADFORD, 1976) da amostra, expressa em mg proteína/mL.
Para expressar em nkat/g de massa fresca do tecido, multiplica-se o
resultado obtido (nkat) pelo volume usado para extrair as proteínas
do tecido e divide-se o resultado pela massa (g) do tecido.

2.8. Inibidor de proteinase cisteínica

Os inibidores de proteinases cisteínicas (fitocistatinas) estão


presentes em mono e dicotiledôneas e são encontrados em semen‐
tes, raízes, tubérculos, folhas e frutos. Possuem massa molecular
variando, aproximadamente, de 5 kDa a 87 kDa e são, em geral,
resistentes a altas temperaturas e extremos de pH (OLIVEIRA et al.,
2003). As fitocistatinas exercem seu efeito inibitório interagindo com
as proteinases na região adjacente ao seu centro catalítico, bloque‐
ando o acesso do substrato (RZYCHON et al., 2004).

2.8.1. Princípio do ensaio


No ensaio não inibido, a enzima atua sobre o substrato sintético
cromogênico N-α-benzoil-arginina-ρ-naftilamida (BANA), liberando
arginina e ρ-naftilamina. Esta última reage com 4-
dimetilaminocinamaldeído (DMACA) formando um produto colorido,
lido a 540 nm. A intensidade da coloração varia com o nível de
atividade da protease. Na presença do inibidor, essa intensidade
estará diminuída.

Equação 1. BANA → L-arginina + ρ-naftilamina


Equação 2. ρ-naftilamina + DMACA → produto colorido
(vermelho)

2.8.2. Reagentes
A. Tampão fosfato de sódio 0,25 M, pH 6,0.
B. Papaína (1 mg/mL de água deionizada). Diluir 50x com reagente
A.
C. Solução ativadora, constituída por 2 mM de EDTA (ácido etileno
diaminotetracético) e 3 mM de DTT (ditiotreitol), preparada no
reagente A.
D. Substrato sintético (BANA). Preparar, na concentração de 1 mM,
dissolvendo-o em 1 mL de DMSO (dimetilsulfóxido) e ajustando
volume final com o reagente A.
E. HCl 2% preparado em etanol.
F. DMACA 0,06%, preparado em etanol.
2.8.3. Procedimento (ABE et al., 1992)
Adicionar em tubos de ensaio, em triplicata, nesta ordem, em
banho de gelo (etapas 1 a 4):
• 20 µL do reagente B.
• 40 µL do reagente C.
• 240 µL do reagente A.
• 200 µL da amostra (diluir, previamente, com o reagente A, caso
necessário).
• Incubar, em banho-maria, a 37 ºC, por 10 minutos.
• 200 µL do reagente D. Continuar incubando a 37 ºC, por mais
20 minutos.
• 500 µL do reagente E. Deixar em repouso por 5 minutos à
temperatura ambiente (≈ 25 ºC).
• 500 µL do reagente F. Incubar por 30 minutos. Ler absorbân‐
cias a 540 nm.
Obs.: a) Para mensuração da atividade papainásica (100% de
atividade enzimática), os 200 µL da amostra contendo inibidor
devem ser substituídos por 200 µL do reagente A; b) Nas provas em
branco (controle), feitas para cada amostra, a reação será
interrompida com o reagente E (HCl) antes da adição do substrato
(BANA) e etapas subsequentes.

2.8.4. Cálculo da atividade


Deve-se calcular a absorbância corrigida da amostra, em relação
ao branco correspondente, como abaixo:

Abs540nm corrigida = Absamostra - Absbranco amostra

Calcula-se a média aritmética das triplicatas, a variação de


absorbância (∆Abs540nm) entre o controle positivo (reação da papaína
na ausência do inibidor, 100% ativa) e a amostra contendo o
inibidor:

∆Abs540nm = Abspapaína corrigida - Absamostra corrigida

Extrapola-se o valor obtido para o volume de 1 mL da amostra,


levando em conta o volume usado no ensaio, bem como sua
diluição prévia, caso isso tenha ocorrido.
Deve-se expressar o resultado em unidade arbitrária de atividade
antipapainásica (UI), sendo esta definida como a diminuição de 0,01
na absorbância (corrigida) do controle positivo (100% atividade da
papaína), por 1 mL de volume da amostra, na ausência do inibidor.
Para expressar a atividade inibitória em UI/mg de proteína
(atividade específica), divide-se o resultado pela concentração de
proteína da amostra, expressa em mg proteína/mL. Para expressar
em UI/grama de massa fresca do tecido, multiplica-se o resultado
obtido (UI/mL da amostra) pelo volume do tampão usado para
extrair as proteínas do tecido e divide-se o resultado pela massa (g)
do tecido.
Caso queira expressar em atividade residual (% de inibição da
papaína), deve-se usar a relação % de inibição = (Abscontrole positivo -
Absamostra) x (100/Abscontrole positivo), estando os valores já corrigidos dos
respectivos brancos.
Para verificar a cinética de inibição, devem-se usar volumes
crescentes da amostra (50 µL, 100 µL, 150 µL, 200 µL, 300 µL e
400 µL, por exemplo) no ensaio descrito acima e plotar os valores
de absorbância a 540 nm já corrigidos (ordenada) versus volumes
ou concentrações de proteína da amostra (abscissa).

3. Considerações finais
A grande maioria dos ensaios enzimáticos é realizada utilizando-
se métodos espectrofotométricos que permitem quantificar a forma‐
ção de um produto final ou o desaparecimento do substrato sob
ação da enzima. Há vários protocolos para mensuração de
atividades enzimáticas citados na literatura que podem ser seguidos
ou mesmo adaptados para as condições de cada laboratório, em
particular, desde que obedecidas algumas regras básicas, como
manutenção das condições ótimas de pH, temperatura,
concentração do substrato e linearidade da velocidade de reação.

4. Referências

ABE, M.; ABE, K.; KURODA, M.; ARAI, S. Corn kernel cysteine proteinase inhibitor as a
novel cystatin superfamily member of plant origin: molecular cloning and expression
studies. European Journal Biochemistry, New York, v. 209, p. 933-937, 1992.
ALMAGRO, L.; ROS, L. V. G.; BELCHI-NAVARRO, S.; BRU, R.; BARCELÓ, A. R.;
PEDREÑO, M. A. Class III peroxidases in plant defence reactions. Journal of Experimental
Botany, London, UK, v. 60, p. 377-390, 2009.
AMBORABÉ, B. E.; BONMORT, J.; FLEURAT-LESSARD, P.; ROBLIN, G. Early events
induced by chitosan on plant cells. Journal of Experimental Botany, London, UK, v. 59, p.
2317-2324, 2008.
ANDERSON, M. D.; PRASAD, T. K.; STEWART, C. R. Changes in isozyme profiles of
catalase, peroxidase, and glutathione reductase during acclimation to chilling in mesocotyls
of maize seedlings. Plant Physiology, Rockville, v. 109, p. 1247-1 257, 1995.
ASADA, K. Ascorbate peroxidase: a hydrogen peroxide scavenging enzyme in plants. Plant
Physiology, Rockville, v. 99, p. 235-238, 1992.
BARRETO, A. L. H.; VASCONCELOS, I. M.; GRANGEIRO, T. B.; MELO, V. M. M.; MATOS,
T. E.; ELOY, Y. R. G.; FERNANDES, C. F.; TORRES, D. C.; FREIRE-FILHO, F. R.; FREIRE,
F. C. O.; OLIVEIRA, J. T. A. Infection process and host defense response in compatible and
incompatible in interactions between cowpea (Vigna unguiculata) and Colletotrichum
gloesporioides. International Journal of Plant Science, Chicago, v. 168, p. 193-203, 2007.
BAYSAL, O.; TURGUT, C.; MAO, G. Acibenzolar-S-methyl induced resistance to
Phytophthora capsici in pepper leaves. Biologia Plantarum, Praga, CZ, v. 49, p. 599-604,
2005.
BENCHABANE, M.; GOULET, M-C.; DALLAIRE, C.; CÔTÉ, P-L.; MICHAUD, D. Hybrid
protease inhibitors for pest and pathogen control e a functional cost for the fusion partners?
Plant Physiology, Biochemistry, kalyani, v. 46, p. 701-708, 2008.
BERGER, S.; SINHA, A. K.; ROITSCH, T. Plant physiology meets phytopathology: plant
primary metabolism and plant–pathogen interactions. Journal of Experimental Botany,
London, UK, v. 58, p. 4019-4026, 2007.
BIAN, S.; JIAN, Y. Reactive oxygen species, antioxidant enzyme activities and gene
expression patterns in leaves and roots of Kentucky bluegrass in response to drought stress
and recovery. Scientia Horticulturae, Amsterdam, NL, v. 120, p. 264-270, 2009.
BOLLER, T. Biochemical analysis of chitinase and β-1,3-glucanases In: CURR, S. J.;
MCPHERSON, M. J.; BOWLES, D. J. (Ed.). A Practical Approach. New York: Oxford
University Press,1993. p. 23–29.
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for quantification of micrograms quantities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemystry, San Diego,
v. 72, p. 248-254, 1976.
BREUSEGEM, F. van; VRANOVA, E.; DAT, J. F.; INZE, D. The role active oxygen species in
plant signal transduction. Plant Science, London, UK, v. 161, p. 405-414, 2001.
BRUCE, T. J.; PICKETT, J. A. Plant defence signaling induced by biotic attacks. Current
Opinion in Plant Biology, London, UK, v. 10, p. 1–6, 2007.
CAVALCANTI, F. R.; RESENDE, M. L. V.; CARVALHO, C. P. S.; SILVEIRA, J. A. G.;
OLIVEIRA, J. T. A. An aqueous suspension of Crinipellis perniciosa mycelium activates
tomato defence responses against Xanthomonas vesicatoria. Crop Protection, Surrey, v. 26,
p. 729–738, 2007.
CAVALCANTI, F. R.; RESENDE, M. L. V.; JUNIOR, P. M. R.; PEREIRA, R. B.; OLIVEIRA, J.
T. A. Induction of resistance against Verticillium dahliae in cacao by a Crinipellis perniciosa
suspension. Journal Plant Pathology, London, UK, v. 90, p. 271-278, 2008
CHARLES, M. T.; TANO, K.; ASSELIN, A.; ARUL, J. Physiological basis of UV-C induced
resistance to Botrytis cinerea in tomato fruit. V. Constitutive defence enzymes and inducible
pathogenesis-related proteins. Postharvest Biology and Technology, Amesterdam, NL, v. 51,
p. 414–424, 2009.
COLLINGE, D. B. Cell wall appositions: the first line of defence. Journal of Experimental
Botany, London, UK, v. 60, p. 351–352, 2009.
COTA, I. E.; TRONCOSO-ROJAS, R.; SOTELO-MUNDO, R.; SÁNCHEZ-ESTRADA, A.;
TIZNADO-HERNÁNDEZ, M. E. Chitinase and b-1,3-glucanase enzymatic activities in
response to infection by Alternaria alternata evaluated in two stages of development in
different tomato fruit varieties. Scientia Horticulturae, Amsterdam, NL, v. 112, n. 42-50,
2007.
DUTSADEE, C.; NUNTA, C. Induction of peroxidase, scopoletin, phenolic compounds and
resistance in Hevea brasiliensis by elicitin and a novel protein elicitor purified from
Phytophthora palmivora. Physiological and Molecular Plant Pathology, London, UK, v. 72, p.
179-187, 2008.
EL-SHORA, H. M. Properties of phenylalanine ammonia-lyase from marrow cotyledons.
Plant Science, London, UK, v. 162, p. 1-7, 2002.
FERNANDES, C. F.; MORAES, V. C. P.; VASCONCELOS, I. M.; SILVEIRA, J. A. G.;
OLIVEIRA, J. T. A. Induction of an anionic peroxidase in cowpea leaves by exogenous
salicylic acid. Journal Plant Physiology, Stuttgart, v. 163, p. 1040-1048, 2006.
FERREIRA, R. B.; MONTEIRO, S.; FREITAS, R.; SANTOS, C. N.; CHEN, Z.; BATISTA, L.
M.; DUARTE, J.; BORGES, A.; TEIXEIRA, A. R. The role of plant defence proteins in fungal
pathogenesis. Molecular Plant Pathology, London, UK, v. 8, p. 677–700, 2007.
FOYER, C. H.; NOCTOR, G. Oxidant and antioxidant signalling in plants: a re-evaluation of
the concept of oxidative stress in physiological context. Plant and Cell Environment, Oxford,
v. 28, p. 1056-1071, 2005.
GARCIA-BRUGGER, A.; LAMOTTE, O.; VANDELLE, E.; BOURQUE, S.; LECOURIEUX,
D.; POINSSOT, B.; WENDEHENNE, D.; PUGIN, A. Early signaling events induced by
elicitors of plant defenses. Molecular Plant Microbe Interactions, St. Paul, v. 19, p. 711–724,
2006.
GHOSH, M. Antifungal properties of haem peroxidase from Acorus calamus. Annals of
Botany, London, UK, v. 98, p. 1145–1153, 2006.
GIANOTTI, A.; RIOS, W. M.; SOARES-COSTA, A.; NOGAROTO, V.; CARMONA, A.;
OLIVA, M. L. V.; ANDRADE, S. S.; HENRIQUE-SILVA, F. Recombinant expression,
purification, and functional analysis of two novel cystatin from sugarcane (Saccharum
officinarum). Protein Expression and Purification,[S. l.], v. 47, p. 483–489, 2006.
GOHRE, V.; ROBATZEK S. Breaking the barriers: microbial effector molecules subvert plant
immunity. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v. 46, p. 189–215, 2008.
HALLIWELL, B. Reactive species and antioxidants. Redox biology Is a fundamental theme
of aerobic life. Plant Physiology, Rockville, v. 141,
p. 312–322, 2006.
HAMMERSCHIMIDT, R. Antioxidants and regulation of defense. Physiological and Molecular
Plant Pathology, London, UK, v. 66, p. 211-212, 2005.
HAQ, S. K.; ATIF, S. M.; KHAN, R. H. Protein proteinase inhibitor genes in combat against
insects, pests, and pathogens: natural and engineered phytoprotection pests, and
pathogens: natural and engineered phytoprotection. Archives of Biochemistry Biophysics,
Amsterdam, NL, v. 431, p. 145-159, 2004.
HAVIR, E. A.; MCHALE, N. A. Biochemical and developmental characterization of multiple
forms of catalase in tobacco leaves. Plant Physiology, Rockville, v. 84, p. 450–5, 1987.
JEANDET, P.; DOILLET-BREUIL, A. C.; BESSIS, R.; DEBORD, S.; SBAGHI, M.; ADIAN, M.
Phytoalexins from vitaceae: biosynthesis, phytoalexin gene expression in transgenic plants,
antifungal activity, and metabolism. Journal of Agriculture and Food Chemistry, Washington,
DC, v. 50, p. 2731-2741, 2002.
JONES, J. D. G.; DANGL, J. L. The plant immune system. Nature, London, UK, v. 444, p.
323–329, 2006.
KOSHIBA, T. Cytosolic ascorbate peroxidase in seedlings and leaves of maize (Zea mays).
Plant Cell Physiology, Tokyo, JP, v. 34, p. 713-721, 1993.
LOON, L. C. van; REP, M.; PIETERSE, C. M. J. Significance of inducible defense-related
proteins in infected plants. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v. 44, p. 135-162,
2006.
LOPEZ, R. C.; GÓMEZ-GÓMEZ, L. Isolation of a new fungi and wound-induced chitinase
class in corms of Crocus sativus. Plant Physiology and Biochemistry, Kaliani, v. 47, p. 426-
434, 2009.
MARTINS-MIRANDA, A. S. Atividade de enzimas relacionadas com estresses bióticos e
abióticos em plântula de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) WALP.] exposta à salinidade e
deficiência hídrica. 2002. 85 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2002.
MOLANO, J.; DURÁN, A.; CABIB, E. A rapid and sensitive assay for chitinase using tritiated
chitin. Analitical Biochemystry, San Diego, v. 83, p. 648–656, 1977.
MORI, T.; SAKURAI, M.; SASUTA, M. Effects of conditioned medium on activities of PAL,
CHS, DAHP syntase (DS-Co and Ds-Mn) and anthocyanin production in suspension
cultures of Fragaria ananassa. Plant Science, London, UK, v. 160, p. 355-360, 2001.
MOSOLOV, V. V.; VALUEVA, T. A. Proteinase Inhibitors in Plant Biotechnology: a review.
Applied Biochemistry and Microbiology, New York, v. 44, p. 233–240, 2008.
NIMCHUK, Z.; ROHMER, L.; CHANG, J. H.; DANGL, J. L. Knowing the dancer from the
dance: R-gene products and their interactions with other proteins from host and pathogen.
Currient Opinion in Plant Biology, London, UK, v. 4, p. 288-294, 2001.
NOCTOR, G.; FOYER, C. H. Ascorbate and glutathione keeping active oxygen under
control. Annual Review of Plant Physiological and Plant Molecular Biology, Amsterdam, NL,
v. 49, p. 249-279, 1998.
OLIVEIRA, A. S.; XAVIER-FILHO, J.; SALES, M. P. Cystein proteinases and cystatins.
Brazilian Archives of Biology and Technology, Curitiba, v. 46, p. 91-104, 2003.
PAPARU, P.; DUBOIS, T.; COYNE, D.; VILJOEN, A. Defense-related gene expression in
susceptible and tolerant bananas (Musa spp.) following inoculation with non-pathogenic
Fusarium oxysporum endophytes and challenge with Radopholus similes. Physiological and
Molecular Plant Pathology, London, UK, v. 71, p. 149-157, 2007.
PEIXOTO, P. H. P.; CAMBRAIA, J.; SANT’ANNA, R.; MOSQUIM, P. R.; MOREIRA, M. A.
Aluminum effects on lipid peroxidation and on the activities of enzymes of oxidative
metabolism in sorghum. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, Londrina, v. 11, p. 137-143,
1999.
PIACHAM, T.; AYUDHYA, C. I.; PRACHAYASITTIKUL, V.; BÜLOWA, L.; YE, L. A polymer
supported manganese catalyst useful as a superoxide dismutase mimic. Chemical
communications, London, UK, p. 1254-1255, 2003.
REISSIG, J. L.; SROMENGER, J. L.; LELOIR, L. F. A modified colorimetric method for the
estimation of N-acetylamino sugars. Jornal of Biological Chemistry, Baltimore, v. 217, p.
959-966, 1955.
RESENDE, M. L. V.; COSTA, J. C. B.; CAVALCANTI, F. R.; RIBEIRO JÚNIOR, P. M.;
CAMILO, F. R. Seleção de extratos vegetais para indução de resistência e ativação de
respostas de defesa em cacaueiro contra a vassoura-de-bruxa. Fitopatologia Brasileira,
Brasília, DF, v. 32, p. 213-221, 2007.
ROSSUM, M. W. P. C. van; ALBERDA, M.; VAN DER PLAS, L. H. W. Role of oxidative
damage in tulip bulb scale micropropagation. Plant Science, London, UK, v. 130, p. 207-216,
1997.
RZYCHON, M.; CHMIEL, D.; STEC-NIEMCZYK, J. Modes of inhibition of cysteine
proteases. Acta Biochimica Polonica, Varsóvia, v. 51, p. 861-873, 2004.
SAWANO, Y.; HATANO, K-I.; MIYAKAWA, T.; KOMAGATA, H.; MIYAUCHI, Y.; YAMAZAKI,
H.; TANOKURA, M. Proteinase inhibitor from ginkgo seeds is a member of the plant
nonspecific lipid transfer protein gene family. Plant Physiology, Rockville, v. 146, p. 1909-
1919, 2008.
SHULAEV, V.; OLIVER, D. J. Metabolic and proteomic markers for oxidative stress new
tools for reactive oxygen species research. Plant Physiology, Rockville, v. 141, p. 367-372,
2006.
TOMÁNKOVÁ, K.; LUHOVÁ, L.; PETRIVALSKÝ, M.; PEC, P.; LEBEDA, A. Biochemical
aspects of reactive oxygen species formation in the interaction between Lycopersicon spp.
and Oidium neolycopersici. Physiological and Molecular Plant Pathology, Orlando, v. 68, p.
22-32, 2006.
TORRES, M. A.; JONES, J. D. G.; DANGL, J. L. Reactive oxygen species signaling in
response to pathogens. Plant Physiology, Rockville, v. 141, p. 373-378, 2006.
UNDERWOOD, W.; SOMERVILLE, S. C. Focal accumulation of defences at sites of fungal
pathogen attack. Journal of Experimental Botony, Oxford, v. 59, p. 3501-3508, 2008.
URBANEK, H.; KUZNIAK-GEBAROWSKA, E.; HERKA, K. Elicitation of defense responses
in bean leaves by Botrytis cinerea polygalacturonase. Acta Physiologiae Plantarum, Krakow,
v. 13, p.43-50, 1991.
WEN P-F.; CHEN, J-Y.; KONG, W. F.; PAN, Q-H.; WAN, S-B.; HUANG, W-D. Salicylic acid
induced the expression of phenylalanine ammonia-lyase gene in grape berry. Plant Science,
London, UK, v. 169, p. 928-934, 2005.
YAO, H.; TIAN, S. Effects of pre- and post-harvest application of salicylic acid or methyl
jasmonate on inducing disease resistance of sweet cherry fruit in storage. Postharvest
Biology and Technology, Amsterdam, NL, v. 35, p. 253-262, 2005.
ZHAO, H.; WANG, B-C.; ZHAO, H-C.; WANG, J. B. Stress stimulus induced resistance to
Cladosporium cucumerinum in cucumber seeding. Colloids Surfaces B: Biointerfaces,
Amsterdam, NL, v. 44, p. 36-40, 2005.
Capítulo 2
Redução de nitrato e assimilação
da amônia em sistemas vegetais:
mensuração de atividade
enzimática e metabólitos
Joaquim Albenisio Gomes Silveira
Marcio de Oliveira Martins
Aurenívia Bonifacio Lima
Sérgio Luiz Ferreira-Silva

1. Introdução

A via metabólica da redução assimilatória do nitrato e assimi‐


lação primária da amônia ocorre em sistemas vegetais e em micror‐
ganismos, possibilitando a conversão do N-NO-3 em aminoácidos,
conforme esquema geral da Figura 1. O processo é um dos mais
importantes por ser limitante para a transformação do N inorgânico
em proteínas (SILVEIRA et al., 2001a). Primariamente, a via envolve
a participação sequencial de quatro enzimas: redutase do nitrato
(NR), redutase do nitrito (NRi), sintetase da glutamina (GS) e sintase
do glutamato (GOGAT), sendo que as duas últimas atuam de forma
cíclica perfazendo o ciclo GS/GOGAT. O envolvimento da atividade
aminante da desidrogenase do glutamato (GDHA) ainda é
controverso, sendo que as evidências mais recentes têm apontado
que essa enzima esteja envolvida na assimilação secundária da
amônia.
Sob o ponto de vista do controle metabólico, a redutase do
nitrato é a enzima mais importante por catalisar a reação passo
limitante até a conversão do N inorgânico em proteínas. O esquema
da Figura 1 mostra também que as reações de assimilação estão
associadas com a formação de outros aminoácidos por meio da
atividade das transaminases do grupo amino (AT) que utilizam a-
cetoácidos, como 2-oxoglutarato (2-OG), como doadores de
esqueletos de carbono.

Figura 1. Esquema global da via de redução assimilatória do nitrato e assimilação da


amônia.

2. Determinação das atividades enzimáticas

2.1. Atividade da redutase do nitrato (NR; EC 1.7.1.1)

a) Características gerais da enzima


A redutase do nitrato (NR) é largamente encontrada em plantas,
algas e em muitos tipos de bactérias, fungos e leveduras. Ela
permite que esses organismos possam utilizar o nitrato como fonte
única de nitrogênio para o crescimento. Em plantas superiores, a
enzima apresenta uma estrutura de homodímero, com massa
molecular de cada subunidade de 100 kDa a 115 kDa, sendo
constituída por um complexo enzimático com multicomponentes
(Flavina Adenina Dinucleotídeo – FAD, citocromo b e molibdênio),
os quais constituem uma minicadeia de transporte de elétrons,
doados inicialmente por NAD(P)H (VIÉGAS; SILVEIRA, 2002),
conforme mostra a Figura 2.
A NR de plantas é localizada no citosol nas proximidades dos
cloroplastos (folhas) ou de plastídios (raízes). A enzima apresenta
uma rápida taxa de renovação (turnover), sendo sua concentração e
atividade dependentes da presença de seu substrato, o nitrato. NR
apresenta mecanismos de transcrição, pós-tradução e de regulação
de sua atividade extremamente complexos, os quais são
controlados por diversos fatores metabólicos endógenos e por
vários outros de origem ambiental. A enzima é extremamente
sensível aos procedimentos de extração e purificação, fato que tem
limitado muito os estudos sobre sua estrutura. Quando extraída da
célula (dentro do extrato bruto, livre de células), a NR sofre rápido
ataque de proteases que causam perda na atividade da enzima.

Figura 2. Esquema de transporte de elétrons que ocorre durante a reação processada pela
enzima redutase do nitrato.

b) Princípio do método
O método mais utilizado para a determinação da atividade de NR
se baseia na mensuração da quantidade do produto da reação, o
NO2-. Cuidados são tomados para evitar a redução enzimática e não
enzimática no nitrito o qual é muito instável. A quantidade de nitrito é
usualmente determinada por meio do método colorimétrico clássico
de Snell e Snell (1949), que se baseia na reação do NO2- com a
sulfanilamida em meio ácido, com formação de um sal de diazônio.
Em seguida, esse sal reage com N-1-naftiletilenodiamina (NNEDA),
resultando num complexo de cor rosa-vermelha estável, com
máximo de absorção em 540 nm. Esse complexo possui um
coeficiente de absortividade molar igual a 55 (E1mM = 55). Significa
que uma solução 1 mM de NO2- (a reação apresenta uma
estequiometria de 1:1 entre NO2- e o complexo formado) formará
uma solução com uma absorbância teórica de 55. Esse índice é
importante em duas situações: (1) para checar se os cálculos da
curva padrão estão corretos e (2) para calcular a concentração de
NO2- em situações que não que existe a curva padrão.

c) Marcha analítica para extração e ensaio da atividade


Método in vivo
Neste caso, a enzima não é extraída, pois a mensuração é feita
no tecido intacto. O método foi melhorado por Hageman e
Hucklesby (1971) e posteriormente sofreu algumas pequenas
modificações. Segmentos de tecidos intactos, usualmente de 100
mg a 200 mg de massa fresca de discos de folhas de 10 mm de
diâmetro, segmentos de raízes, nódulos, etc., são colocados em
presença de 5 mL de um meio tamponado (tampão fosfato 100 mM
pH 7,5 contendo KNO3 (substrato) a 50 mM + isopropanol 1% – um
detergente que facilita a infiltração da solução). O meio e o tecido
devem sofrer uma sucção do ar por uma bomba de vácuo, de
aproximadamente -1,0 MPa, durante 2 minutos seguida de
infiltração com N2 por igual período. Esse processo permite a
infiltração do nitrato no tecido ao mesmo tempo em que elimina o O2
com a finalidade de estabilizar o NO2- formado e minimizar a
respiração que consome NADH endógeno – o que pode limitar a
atividade de NR no tecido. Em seguida, o meio deve ser incubado
numa temperatura adequada (≈ 30 ºC) de 15 a 30 minutos no
escuro, para minimizar a redução do NO2-. Posteriormente, a
solução deve ser aquecida em banho-maria por 5 minutos, para
paralisar as reações enzimáticas e também extrair todo NO2-
formado dentro do tecido. Alíquotas adequadas (de 0,1 mL a 1 mL,
completada para 1 mL com água destilada q.s.p.) da solução,
contendo o nitrito, devem ser transferidas para tubos de reação
contendo 1 mL de sulfanilamida 1% dissolvida em HCl 2,4 N + 1 mL
de NNEDA 0,02% (m/v). Deve-se deixar a reação estabilizar após
15 minutos à temperatura ambiente e fazer as leituras a 540 nm,
usando como controle as leituras das alíquotas no tempo zero de
incubação, a fim de subtrair o NO2- residual contido nos tecidos.
Método in vitro
O método in vitro segue o princípio dos demais métodos enzi‐
máticos. Diferentemente do in vivo, as células são rompidas, e a
enzima é extraída no extrato bruto livre de células. Após centrifu‐
gação, esse extrato conterá essencialmente uma fração composta
por citosol, vacúolos e matrizes das demais organelas. Como a NR
está localizada na fração do citosol, pode-se obter uma boa
estimativa de sua atividade total ou potencial, uma vez que, neste
caso, as condições são mais artificiais, e os protocolos procuram
aperfeiçoar as condições do ensaio (concentrações ótimas do
substrato e de NAD(P)H, presença de FAD e de várias substâncias
protetoras). O método tem sofrido grandes mudanças no sentido de
maximizar a atividade e separá-la em atividade do estado ativo e
atividade máxima e ainda estimar o percentual de ativação da
enzima, como descrito por Kandlbinder et al. (2000).
O protocolo de extração apresentado aqui pode ser simplificado
em termos da quantidade de agentes de proteção, na dependência
do tipo de material e testes prévios. Durante a extração, cuidados
especiais devem ser tomados em relação aos riscos de degradação
e inibição da NR, principalmente em razão da ação de proteases e
fenóis. Para isso, certa quantidade de tecido fresco imediatamente
coletado deverá ser macerada sob baixa temperatura (de 0 °C a 4
°C) sob banho de gelo ou em câmara fria e adição de N2 líquido na
presença de tampão, uma relação de aproximadamente 1 g/5 mL,
contendo em seu interior um coquetel extremamente rico na
proteção enzimática: tampão Tris-HCl pH 7,5 contendo FAD 10 µM
(grupo prostético da enzima) + EDTA 20 mM (evita a ação de
proteases dependentes de íons metálicos e a passagem da NR para
a forma inativa) + DTT 5 mM (fonte de grupos -SH redutores para
evitar oxidação da enzima e de fenóis que formam quinonas que
podem desnaturar a enzima) + BSA 0,5 - 1% (uma proteína em
excesso para sofrer ataque de proteases, protegendo a enzima) +
caseína 0,02% (função idêntica a da BSA) + PVP 1% (remove
fenóis por adsorção, precipitando-os) + mistura de inibidores de
proteases (PMSF 0,1 mM + leuptina 10 µM + benzidina 1 mM). Após
maceração, o extrato deve ser filtrado em duas camadas de tecido
de musseline e centrifugado a 20.000 g (de 2 °C a 4 °C) durante 10
minutos. Opcionalmente, o extrato obtido pode ser passado numa
coluna de Sephadex G-25, para eliminação de sais e possíveis con‐
taminantes de baixa massa molecular. Após extração/purificação
parcial, o extrato será utilizado para determinação da atividade do
estado ativo e/ou atividade máxima.
Para determinação da atividade máxima (ROBIN, 1979), alíquota
do extrato, de 100 µL a 500 µL, será adicionada num meio
tamponado com Tris-HCl ou Fosfato 100 mM pH 7,5 contendo EDTA
10 mM + NADH 0,15 mM + KNO3 5 mM. É interessante adicionar
também DTT 5 mM + FAD 10 µM no meio de reação. A reação deve
ser iniciada pela adição do KNO3 5 mM. Deve-se incubar o meio de
reação a 30 °C por 30 minutos. Parar a reação com adição de 200
µL de acetato de zinco 0,5 M (também favorece a precipitação de
pigmentos). Se houver turvação, deve-se centrifugar a 3.000 g e
usar o sobrenadante contendo o nitrito formado para mensuração de
sua concentração seguindo os mesmos procedimentos anteriores
para determinação da atividade in vivo e usar um branco sem a
presença do NO3- no meio de reação.

d) Cálculos da atividade e formas de expressão dos resultados


Para calcular a atividade de NR é necessário quantificar o NO2-
produzido pela reação enzimática. A maneira mais usual e mais
correta é determinar a quantidade de nitrito a partir de uma curva
padrão previamente determinada com concentrações conhecidas de
NO2-, obtido a partir de KNO2 ou NaNO2 PA. A reação de Snell e
Snell (1949), forma um complexo colorido róseo-vermelho com uma
relação absorbância versus concentração linear na faixa de 1 nmol
NO2-/mL a 50 nmol NO2-/mL (concentração na alíquota/amostra). A
reta obtida deverá passar próxima da origem (na prática, após
visualizar a equação, usa-se a opção de passar na origem) e deverá
ter uma inclinação de aproximadamente 0,02 (y = 0,02x e r2 =
0,9975), em que y é a absorbância, e x é a concentração de nitrito
(nmol/mL). Deve-se observar que o valor do coeficiente angular
(0,02) não deve variar entre as curvas obtidas no laboratório (no
máximo 10%). A partir dessa equação pode ser calculada a
quantidade de nitrito na alíquota utilizada nas amostras. Considere
um exemplo prático para a atividade in vivo com uma alíquota de 1
mL da amostra diluída 1:1 (0,5 mL do extrato + 0,5 mL de água
destilada) e uma leitura de 0,5 de absorbância. Pela equação acima,
essa leitura corresponderá a x = 0,5/0,02 = 25 nmol/mL do extrato.
Corrigindo a diluição (fator diluição = 2), têm-se 25 x 2 = 50 nmol/mL
do extrato. Como essa alíquota (1 mL) foi retirada de um volume
total de 5 mL (meio de reação), o total de nitrito produzido será 50 x
5 = 250 nmol/5 mL do extrato. Como a esse volume foi adicionado
100 mg de massa fresca de tecido, ficará 250 nmol/100 mg ou 2.500
nmol/g de MF. Esse nitrito foi produzido num intervalo de 30 minutos
de reação; então se pode escrever: 2.500 nmol NO2- produzido/g
MF/30 minutos ou 5.000 nmol NO2- produzido/g MF/h ou 5,00 µmol
NO2- produzido/g MF/h. Essa é uma forma final de representar uma
atividade de NR. O procedimento para a atividade in vitro é
semelhante. Os resultados finais deverão ser expressos nas
seguintes formas: µmol NO2-/g MF/h, µmol NO2-/mg proteína/h ou
em katal. Um katal (kat) é definido como a atividade enzimática que
causa a conversão de 1 mol de substrato/s. Para expressar na base
de proteína, deve inicialmente ser calculada a quantidade de
proteína no mesmo extrato da NR, em mg proteína/mL, a partir de
uma curva padrão, por exemplo pelo método de Bradford, conforme
descrito neste capítulo. Em seguida, a quantidade de proteína é
calculada na base de mg/g de MF, e a conversão da atividade de
NR em µmol NO2-/mg proteína/h é feita facilmente. A expressão na
base de massa fresca é mais utilizada quando não ocorre variação
de umidade no tecido. Quando ocorre variação de umidade entre os
tecidos estudados, deve-se usar µmol NO2-/g MS/h, corrigindo a
umidade. A expressão na base de proteína é utilizada quando não
ocorrem grandes flutuações nos níveis de proteínas solúveis dos
tecidos entre tratamentos. O katal, apesar de ser a unidade
recomendada pelo Sistema Internacional (SI), ainda tem seu uso
restrito principalmente na fisiologia e microbiologia.

2.2. Atividade da redutase do nitrito (NRi; EC 1.7.2.1)

a) Características gerais da enzima


A redutase do nitrito (NRi) é uma enzima também largamente
distribuída em plantas e microrganismos. Ela é bastante ativa nas
células, indicado pelos baixos níveis de nitrito encontrados nos
tecidos. Está localizada dentro dos cloroplastos e nas raízes dentro
de plastídios. NRi possui massa molecular de aproximadamente 60
kDa e aparentemente possui somente uma subunidade. Ela contém
um centro Fe-S tetra nuclear (Fe4-S4) e um siroheme (um tipo
especial de grupo heme). O centro siroheme atua como um
intermediário para a transferência dos elétrons da ferredoxina
reduzida para o nitrito. Nas raízes e tecidos aclorofilados o NADPH
parece ser o doador elétron para a reação. A redução do NO2- até
NH4+ ocorre sem a formação de intermediários. A reação catalisada
por NRi também envolve uma minicadeia de transporte de elétrons
envolvendo a transferência de 6e- por Ferredoxina reduzida
conforme Figura 3.
Figura 3. Esquema de transporte de elétrons que ocorre durante a reação processada pela
enzima redutase do nitrito.

b) Princípio do método
O princípio do método é a medida do consumo do NO2- no meio
de reação por ação de NRi. Utiliza-se o mesmo método de Snell e
Snell (1949) previamente descrito no item 2.1 (b).

c) Marcha analítica para extração e ensaio da atividade


O procedimento de extração de NRi pode ser o mesmo utilizado
para NR. O ensaio enzimático pode ser conduzido de acordo como
descrito por Losada e Paneque (1971), com adaptações. Neste
método, o metil violageno substitui a ferredoxina reduzida como
doadora de elétron. Adicionar 0,3 mL do extrato enzimático em 1,5
mL da mistura tamponada de reação (Tampão Tris-HCl 100 mM pH
7,5 contendo NaNO2 15 mM + metil violageno 5 mM) correndo em
paralelo um branco sem a enzima. A reação deve iniciar pela adição
de 0,2 mL de uma solução recém preparada de ditionito de sódio 86
mM dissolvida numa solução de NaHCO3 190 mM. Após incubação
a 30 ºC durante 15 minutos, paralisar a reação por meio de agitação
muito vigorosa em agitador do tipo vórtex. Estimar a quantidade de
nitrito pelo método de Snell e Snell (1949), semelhante ao reportado
para a atividade de NR. O nitrito reduzido enzimaticamente é
calculado a partir da quantidade de nitrito na presença da enzima
com aquele no meio sem a presença do extrato enzimático.

d) Cálculos da atividade e formas de expressão dos resultados


O procedimento é semelhante ao apresentado para a atividade
de NR. Inclusive as formas de expressão são iguais, diferindo
apenas que no caso da NRi o NO2- é consumido (µmol NO2-/g MF/h
ou µmol NO2-/mg proteína/h) enquanto que na NR ele é produzido.

2.3. Atividade da sintetase de glutamina (GS; EC 6.3.1.2)

a) Características gerais da enzima


A GS é largamente encontrada em animais, microrganismos e
vegetais. As plantas possuem isoformas da enzima presentes em
cloroplastos (GS2) e no citosol (GS1) e formas específicas de raízes
e nódulos (VIÉGAS; SILVEIRA, 1999). Em plantas superiores, é
uma octamérica com massa molecular de 350 kDa a 400 kDa. A
enzima catalisa a entrada de amônia em aminoácidos por meio da
conversão dependente de ATP do glutamato em glutamina:

NH3 + Glutamato + ATP → Glutamina + ADP + Pi

A GS apresenta afinidade elevada por amônia (Km = 3-5 µM),


mas pode também usar hidroxilamina como substrato, produzindo ɣ-
glutamil-hidroxamato.

b) Princípio do método
O método para mensurar a atividade de GS que mais se apro‐
xima das condições fisiológicas é o método sintetase ou método
biossintético do hidroxamato que utiliza hidroxilamina no lugar da
amônia, conforme mostrado a seguir:

Glutamato + NH2OH + ATP → ɣ-glutamil-hidroxamato + ADP


+ Pi

É importante observar que GS apresenta valores de Km e Vmax


semelhantes entre NH3 e NH2OH. O método se baseia na formação
de um complexo de cor marrom entre o ɣ-glutamil-hidroxamato e o
Fe+3, sendo a absorbância (540 nm) desse complexo diretamente
proporcional à concentração do ɣ-glutamil-hidroxamato.

c) Marcha analítica para extração e ensaio da atividade


O ensaio enzimático pode ser conduzido de acordo com o
método de Elliott (1955), com adaptações de Silveira et al. (2003).
Amostras de tecido vegetal fresco (proporção de 2 g/5 mL) são
maceradas na presença de N2 líquido sob banho de gelo (0 °C a 4
°C), com adição de um meio contendo tampão de extração (fosfato
de potássio 0,1 M, pH 8,0 contendo EDTA 5 mM, β-mercaptoetanol
10 mM, DTT 10 mM, e PVP 1%. Posteriormente, o extrato será
submetido a uma centrifugação a 15.000 g, durante 10 minutos, a 4
°C. No sobrenadante obtido foi determinada a atividade enzimática
da GS. Alíquotas do extrato (100 µL a 500 µL) serão adicionadas
em tubos de ensaio contendo tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,0 + ATP
6 mM, MgSO4 50 mM + hidroxilamina-NaOH 0,25 M (1:1) +
glutamato de sódio 0,5 M. A reação será iniciada pela adição da
alíquota do extrato enzimático. O volume final da solução de reação
poderá ser de 3 mL. Após incubação em banho-maria, por 30
minutos, a 30 °C, a reação será paralisada pela adição de uma
solução 1:1:1 contendo FeCl3 10% (m/v) em HCl 0,2 M + TCA 24%
(m/v) + HCl 50% (m/v) (solução férrica ácida). Após o
desenvolvimento da reação (aparecimento de uma coloração
marrom), a solução será centrifugada a 3.000 g, por 10 minutos, à
temperatura ambiente para precipitar as proteínas e tornar a solução
colorida mais translúcida. Em seguida, fazer a leitura de sua
absorbância a 540 nm em espectrofotômetro. Em paralelo com as
amostras, correr dois controles: um sem adição do extrato
enzimático mas com todos os reagentes para zerar o aparelho e
outro sem adição do substrato hidroxilamina. A atividade GS será
determinada a partir de uma reta padrão com concentrações
crescentes de ɣ-glutamil-hidroximato (GGH).

d) Cálculos da atividade e formas de expressão dos resultados


Inicialmente deverá ser construída uma curva padrão a partir de
uma faixa de concentrações conhecidas ɣ-glutamil-hidroxamato (a
faixa linear é obtida com concentrações de GGH de 0,05 µmol/mL a
3,0 µmol/mL na alíquota). Essa reta deverá passar pela origem e
possuir um r2 muito próximo de 1,0. Por exemplo, com uma alíquota
de 500 µL e um volume de reação de 3 mL, pode-se obter uma
relação linear com uma equação y = 0,474x e r2 = 0,9997, em que y
representa a absorbância e x a concentração de GGH na alíquota
em µmol/mL. Como exemplo prático, considere-se uma extração
com 2 g de MF e um volume de extração (extrato) de 5 mL e uma
alíquota de reação de 0,5 mL. Após a reação, a amostra deu uma
leitura de 0,52 de absorbância. Com base na equação da reta, a
concentração na alíquota será x = 0,52/0,474 = 1,097 µmol/mL de
GGH na alíquota (0,5 mL). Extrapolando para o volume da alíquota,
será 1,097 x 0,5 = 0,548 µmol de GGH/0,5 mL (isto representa
quantidade e não concentração). Como o volume do extrato foi de 5
mL, então a quantidade total de GGH será = 0,548 x 5/0,5 = 5,48
µmol de GGH/5 mL do extrato. Como os 5 mL do extrato foram
obtidos a partir de 2 g de MF, implica que terá 5,48 µmol de GGH/2
g MF ou 2,74 µmol de GGH/g MF. Como o tempo de reação foi de
30 minutos, levando a atividade para minuto, teremos 2,74 x 60/30 =
5,48 µmol de GGH/g MF/h. Caso haja mudanças por efeito de
tratamento na umidade do tecido, expressa-se a atividade como
GGH/g massa seca/h. No caso de expressar a atividade na base de
proteínas solúveis, determina-se a concentração das mesmas no
extrato (mg de proteína/mL) e depois converte-se em mg/g MF,
usando o mesmo artifício adotado anteriormente. Assim, a atividade
final poderá ser expressa como µmol de GGH/mg proteína/h.

2.4. Atividade da sintase de glutamato (GOGAT; EC


1.4.1.14)

a) Características gerais da enzima


GOGAT é responsável pela transferência do grupo amida da
glutamina para o 2-cetoglutarato para formar duas moléculas de
glutamato. A proteína é largamente distribuída em plantas, algas e
bactérias. Duas formas diferentes de GOGAT estão presentes em
plantas superiores: uma que utiliza ferredoxina como doador de
elétron e outra que utiliza o NADH. A GOGAT dependente de
ferredoxina está presente em concentrações elevadas em folhas e é
localizada dentro dos cloroplastos. A enzima é uma flavo proteína
Fe-S com uma cadeia peptídica simples de massa molecular de 140
kDa a 160 kDa. A GOGAT dependente de NADH está presente em
baixas concentrações nas folhas, mas parece ter um papel
fundamental em raízes e nódulos. A enzima de nódulos (duas
isoformas) também apresenta uma única subunidade de 200 kDa.

b) Princípio do método
A atividade da GOGAT dependente de NADH (raízes, nódulos,
frutos) pode ser determinada pelo decréscimo na absorbância de
NAD(P)H (340 nm), conforme a reação:

glutamina + 2-cetoglutarato + NAD(P)H → 2 glutamato +


NAD(P)+

No caso da GOGAT dependente de ferredoxina, o método mais


usual é medir o incremento na concentração do glutamato formado
por cromatografia de papel ou por HPLC:

glutamina + 2-cetoglutarato + Ferredoxina (red) → 2 glutamato


+ Ferredoxina (oxi)

Usualmente, no laboratório se utiliza o redutor metil violageno em


substituição à ferredoxina por ser mais barato e de mais fácil
armazenagem.

c) Marcha analítica para extração e ensaio da atividade


O método de extração pode ser o mesmo adotado para a GS,
sendo a proporção de massa fresca para volume de extração de 1
g/5 mL. A determinação da atividade de GOGAT dependente de
NAD(P)H é realizada pelo método de Suzuki et al. (1994). Em tubos
de ensaio contendo 3 mL do meio tamponado com Tris-HCl 100 mM
pH 7,4 + EDTA 1 mM + glutamina 10 mM + a-cetoglutarato 20 mM +
0,25 mM de NADH. A reação deve ser iniciada com adição de 0,1
mL a 0,4 mL de extrato no meio de reação. Deve-se monitorar a 25
ºC a oxidação do NADH por meio da redução da absorbância a 340
nm, a cada minuto. A atividade será proporcional ao decréscimo na
absorbância. Utiliza-se um controle sem a presença de glutamina e
testa-se a presença de atividade de oxidases de NAD(P)H
incubando o extrato na presença do tampão e monitorando a
absorbância.
Para a atividade de GOGAT dependente de ferredoxina, deve-se
alterar o meio de reação adicionando metil violageno 5 mM em
substituição ao NADH. Inicia-se a reação adicionando 0,6 mL de
uma solução contendo 90 mg de ditionito de sódio + 90 mg de
bicarbonato de sódio por mL, preparada imediatamente antes da
reação. Após incubação por 15 minutos, a reação é paralisada pela
adição de 1 mL de etanol seguida de violenta agitação para oxidar o
metil violageno e o ditionito. Um branco com ausência de ditionito
deve correr em paralelo. A vantagem do uso do metil violageno em
substituição à ferredoxina é que ele é mais barato, mais estável no
armazenamento e mostra uma cor azul quando reduzido que
desaparece após a sua completa oxidação. A quantificação do
glutamato consumido na reação pode ser feita por meio de três
métodos: cromatografia líquida de alta performance (HPLC), que é
mais rápida e mais precisa, porém mais cara. Por cromatografia de
papel, mais demorada e menos precisa, porém mais barata.
Finalmente, por meio de colunas Dowex-1 (troca iônica), também
mais demorado, menos preciso e mais barato. Nos dois últimos
métodos, o glutamato, após separação, será eluído e quantificado
por meio de reação com ninhidrina com auxílio de curva padrão.
Esses dois últimos métodos estão descritos em Coombs e Hall
(1982).

d) Cálculos da atividade e formas de expressão dos resultados


Atividade de GOGAT dependente de NADH
O primeiro passo é fazer uma curva padrão com NADH (como
para os demais métodos espectrofotométricos existe a opção de
utilizar o coeficiente de absortividade molar (E) ao invés da curva).
Esse índice é um valor padrão encontrado em Handbooks. No caso
do NAD(P)H (340 nm), é igual a 6,3. Significa que uma solução de 1
mM de NADH, numa cubeta com distância interna de 1 cm,
apresentará uma absorbância estimada igual a 6,3. É recomendado
usar esse índice somente quando não há condição de fazer a curva
padrão no laboratório. O gráfico para concentração de NADH (x)
versus absorbância (y) é linear entre 0,001 µmol/mL e 0,1 µmol/mL
de NADH (na alíquota) e um volume final de reação de 3 mL, com
uma equação de y = 5,079x e r2 = 0,997. A atividade da enzima será
diretamente proporcional ao decréscimo da absorbância (A) num
certo intervalo de tempo (ΔA). Esse ΔA deverá apresentar uma
variação linear em função do tempo. No caso de GOGAT-NADH, ele
é linear entre 0 e 10 minutos. Pode-se então padronizar o tempo de
reação de 2 minutos. Como exercício, considere-se uma extração
com 1 g MF para 5 mL de extrato, um tempo de reação de 2 minutos
e uma alíquota de extrato de 0,1 mL. Para uma determinada
amostra a variação de A em 2 minutos foi igual a 0,2. Então,
substituindo na equação 0,2 de A corresponde a x = 0,2/5,079 =
0,04 µmol/mL de NADH. Convertendo para o volume do extrato (0,1
mL), x = 0,04x1/0,1 = 0,4 µmol de NADH/0,1 mL de extrato.
Extrapolando para o volume total de extrato (5 mL), x = 0,4x5/0,1 =
20 µmol de NADH/5 mL. Como esse volume corresponde a uma
massa de 1 g de MF, x = 20 µmol de NADH/g MF. Levando a
atividade para a base de minuto, x = 20x1/2 = 10 µmol de NADH
reduzido/g MF/min. Essa atividade poderá ser expressa na base de
µmol de NADH reduzido/mg de proteína/h, determinando a
quantidade de proteína na alíquota conforme indicado no subitem d
do item 2.1 deste capítulo.
Atividade de GOGAT dependente de ferredoxina
A forma de cálculo será essencialmente semelhante às ante‐
riores. Será necessário determinar a variação na síntese de
glutamato com auxílio de uma curva padrão no caso da
cromatografia de papel ou da separação por coluna de troca iônica.
No caso do HPLC, será mais simples, pois o equipamento já fornece
diretamente a concentração final de glutamato e, por diferença com
a inicial, calcula-se a quantidade produzida. Na verdade, deve-se
correr no HPLC amostras com o glutamato na concentração inicial
junto com os padrões e as amostras dos extratos depois de ocorrida
a reação enzimática. A forma de expressar o resultado é
semelhante, sendo, neste caso, µmol glutamato produzido/g MF/h.

2.5. Atividade da desidrogenase de glutamato aminante


(GDH; EC 1.4.1.2)

a) Características gerais da enzima


A desidrogenase de glutamato (GDH) é largamente encontrada
em todos os seres vivos, incluindo as plantas superiores. A GDH
pode estar localizada em mitocôndrias, cloroplastos e possivelmente
no citosol. Existem evidências de que a GDH de plantas apresenta
massa molecular entre 210 kDa e 230 kDa, possivelmente com uma
estrutura tetramérica ou hexamérica. A enzima catalisa de forma
reversível a aminação do a-cetoglutarato (atividade aminante) e a
desaminação do glutamato (atividade desaminante), envolvendo a
oxidação e a redução de NAD(P)H/NAD(P)+, respectivamente,
conforme reação a seguir:

α-cetoglutarato + NH3 + NAD(P)H ↔ glutamato + NAD(P)+


Em virtude de seu elevado Km para amônia, a importância na
assimilação primária da NH3 oriunda do nitrato perdeu valor a partir
da década de 1970, a despeito de seu real papel nas plantas ser
ainda bastante controvertido. A importância de GDH aminante é
maior durante a reciclagem da amônia, especialmente nos
processos de fotorespiração e senescência.

b) Princípio do método
A determinação da atividade aminante de GDH se baseia na
medida do decréscimo da absorbância do NAD(P)H a 340 nm, na
presença de NH3 e a-cetoglutarato, conforme equação mostrada
acima.

c) Marcha analítica para extração e ensaio da atividade


A técnica de extração de GDH em tecidos vegetais pode ser a
mesma utilizada para GOGAT. O ensaio para determinação da ativi‐
dade da GDH aminante é feita pela mensuração da oxidação de
NADH (COOMBS; HALL, 1982). O meio de reação tamponado (5
mL) pode ser constituído por tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,4)
contendo a-cetoglutarato 7 mM + cloreto de amônio 10 mM + CaCl2
2 mM + 0,25 mM de NADH. A reação é iniciada pela adição do
extrato enzimático (0,1 mL a 0,2 mL). Deve-se monitorar a 25 ºC a
oxidação do NADH por meio da redução da absorbância a 340 nm,
a cada minuto. A atividade será proporcional ao decréscimo na
absorbância. Utiliza-se um controle na ausência de NH4Cl e testa-se
a presença de atividade de oxidases de NAD(P)H incubando o
extrato com o tampão e monitorando a absorbância a 340 nm.

d) Cálculos da atividade e formas de expressão dos resultados


Neste caso, o procedimento é igual ao desenvolvido para
calcular a atividade de GOGAT dependente de NADH.
3. Determinação da concentração de
substratos e/ou produtos

3.1. Determinação da concentração do nitrato total e do


metabolicamente disponível

a) Características gerais
Sob condições normais de aeração no solo, o nitrato é a principal
fonte de nitrogênio, sendo, portanto, a forma inorgânica nitrogenada
mais absorvida preferencialmente pelas plantas. Uma vez absorvido
pelos vegetais, o nitrato é convertido em amônio e então
incorporado em aminoácidos e outros compostos nitrogenados que
vão levar a formação de proteínas e outras diversas
macromoléculas ou ainda pode ser armazenado nos vacúolos. O
nitrato na célula pode estar contido no citosol (pool de nitrato
metabolicamente ativo) ou armazenado nos vacúolos (pool de
reserva). A primeira fração, a despeito de ser muito menor, é a mais
importante como substrato – indutor da redutase do nitrato
(SILVEIRA et al., 2001c). Na realidade, em termos de indução de
NR, o fator mais importante é o fluxo de nitrato no citosol, o qual é
de difícil mensuração.

b) Princípio dos métodos

NO3- total

Existem três métodos principais para a determinação de nitrato


que são o método proposto por Cataldo et al. (1975), o de Cawse
(1967) e o do eletrodo seletivo, no entanto o primeiro é o mais
utilizado na determinação de nitrato em tecido vegetal. A
metodologia proposta por Cataldo et al. (1975) baseia-se na nitração
do ácido salicílico (ácido 2-hidroxibenzoico) pelos íons NO3-, numa
relação molar de 1:1, que ocorre em pH alcalino (acima de 12) e
resulta em um nitro-composto de cor amarela, o ácido 5-
nitrossalicílico (Figura 4).

Figura 4. Reação da nitritação do ácido salicílico formando ácido 5-nitrosalicílico.

c) Marcha analítica para extração e determinação


Para o preparo do extrato, são necessários cerca de 50 mg a 100
mg de tecido vegetal liofilizado com 5 mL de água deionizada a
quente em banho-maria por 1 hora. Em seguida, após a solução
atingir a temperatura ambiente, deve-se centrifugar a 3.000 rpm por
10 minutos e recolher o sobrenadante. O extrato irá conter o NO-3
total no tecido. Caso o extrato esteja pigmentado, devem-se eliminar
os pigmentos com acetona ou clorofórmio. Alíquotas de 0,1 mL
devem ser misturadas com 0,2 mL da solução de ácido salicílico 5%
(m/v) e então agitadas. Posteriormente, o volume deve ser comple‐
tado para 5 mL com NaOH 2N, e a solução novamente agitada. A
adição do NaOH à solução garante a formação de um pH altamente
básico, condição necessária para que ocorra a reação entre o nitrato
e o ácido salicílico. Em razão do calor causado pela dissolução da
NaOH, é necessário aguardar que a solução volte à temperatura
ambiente para que, então, as leituras possam ser realizadas em
espectrofotômetro ajustado a 410 nm e zerado com o branco. O
branco deve conter água deionizada como substituinte do extrato e
passar pelas mesmas condições das amostras. Na construção da
curva padrão, recomenda-se a utilização da solução de KNO3 numa
faixa de concentração de 0,1 μmol NO3-/mL a 5 μmol NO3-/mL (na
alíquota). Após a obtenção das leituras referentes às soluções dos
padrões com diferentes concentrações, deve-se calcular a curva
padrão (reta), que deve cruzar a origem e possuir coeficiente de
correlação (r2) muito próximo de 1. Com base nesta curva padrão
pode-se proceder ao cálculo da concentração do nitrato nas
amostras analisadas.

d) Cálculos e modos de expressão dos resultados


Como exemplo para o cálculo da concentração de nitrato nas
amostras, vamos utilizar a equação y = 0,14679x (r2 = 0,9998)
obtida pela construção da curva padrão, onde y representa a
absorbância e x a concentração de NO3- em µmol/mL. Utilizando-se
0,05 g de tecido vegetal para 5 mL de água deionizada na extração
e alíquota de reação de 0,1 mL, foi obtida uma leitura de 0,108.
Procedendo-se os cálculos, tem-se x = 0,108/0,14679 = 0,736
µmol/mL, que ajustando para o volume da alíquota (0,1 mL) fica
0,0736 µmol de NO3-/0,1 mL. Como foram utilizados 5 mL para a
obter o extrato, então a quantidade total de NO3- será de 0,0736 x
5/0,1, ou seja, 3,678 µmol de NO3-/5 mL do extrato. Ajustando-se
para a quantidade de massa seca utilizada (0,05 g), teremos 3,678
µmol de NO3-/0,05 g MS ou 73,6 µmol de NO3-/g MS. Note que, para
o cálculo, considerou-se que a amostra não sofreu diluição. Assim,
caso haja utilização da amostra diluída o fator de diluição deve ser
incluído no cálculo.
NO3- metabolicamente ativo
O método é baseado na mensuração da concentração do nitrato
a partir do NO2- acumulado no tecido intacto, sem a presença de
NO3- exógeno no meio de reação (SILVEIRA et al., 2001b) .
Essencialmente, o método é semelhante ao da determinação da
atividade in vivo da NR, aumentando para 90 minutos o tempo de
incubação. O princípio é que sob essas condições todo nitrito
acumulado no tecido será originado a partir do nitrato endógeno do
pool metabolicamente ativo ou do citosol. Portanto, a marcha
analítica é semelhante àquela descrita para atividade in vivo de NR,
com as seguintes diferenças: o meio de reação não contém KNO3, e
o tempo de incubação deverá ser de no mínimo 90 minutos quando
ocorre saturação na acumulação de nitrito. O cálculo dos resultados
também é igual, e a forma de expressão usual é nmol NO3-/g MF ou
nmol NO3-/g MS.

3.2. Determinação da concentração de nitrito

a) Características gerais
Em células vegetais, o nitrito (NO2-) é o produto da redução do
nitrato pela NR. As plantas também podem adquirir o nitrito do meio
externo, em pequena proporção. Em ambos os casos, por ser alta‐
mente tóxico, o nitrito, assim como a sua forma ácida, o ácido
nitroso (HNO2), não se acumula em altas concentrações. O nitrito é
produzido no citosol pela NR citosólica. Depois de formado, o nitrito
é imediatamente transportado para dentro dos cloroplastos ou
plastídios e reduzido a amônio pela NRi e, por essa razão, é
encontrado em baixíssimas concentrações nos tecidos. A utilização
do nitrito in vivo é evitada pela anaerobiose, e sob aeração o nitrito é
rapidamente convertido em amônia.

b) Princípio do método
O método de Snell e Snell (1949) é uma modificação do método
descrito por Griess em 1879. Este se baseia na formação de sal
diazônio durante uma reação em meio ácido, do nitrito com a
sulfanilamida, e o posterior estabelecimento de um complexo
colorido quando o sal diazônio reage com N-(1-naftil)etilenodiamina
(NNEDA) (Figura 5). O complexo resultante tem coloração rosa-
vermelho e tem um pico de absorção a 540 nm.
Figura 5. Formação do sal diazônio durante a reação em meio ácido do nitrito com a
sulfanilamida, e posterior estabelecimento de um complexo colorido quando o sal diazônio
reage com NNEDA.

c) Marcha analítica para extração e ensaio


O problema para a determinação da concentração de nitrito livre
em amostras vegetais é o de sua extração uma vez que ele é muito
instável na presença de O2 e luz, por exemplo. Um procedimento
razoável é congelar 5 g de material fresco em N2 líquido e liofilizar
imediatamente. A seguir, fazer uma extração a frio com etanol 80%
sob maceração (500 mg de MS/5 mL). Centrifugar a 3.000 rpm e
utilizar o sobrenadante imediatamente. Fazer todas as operações ao
abrigo da luz. Do extrato obtido, tomar uma alíquota de 3 mL e
misturar em tubo de ensaio contendo 1 mL da solução de
sulfanilamida 1% (dissolver 1 g de sulfanilamida em HCl 2,4N e
completar para 100 mL) + 1 mL do NNEDA (pesar cerca de 0,02 g
do dicloridrato N-(1-naftil)etilenodiamina). Agitar e deixar 15 minutos,
para em seguida realizar a leitura em espectrofotômetro a 540 nm.
d) Cálculos da atividade e formas de expressão dos resultados
Inicialmente deverá ser construída uma curva padrão a partir de
uma faixa de concentrações conhecidas de KNO2, a qual deve variar
entre 1 nmol/mL e 50 nmol/mL. Por exemplo, com uma alíquota de 3
mL e um volume de reação de 5 mL, pode-se obter uma relação
linear com uma equação y = 0,0304x e r2 = 0,9996, em que y
representa a absorbância e x a concentração de NO2- na alíquota
em nmol/mL. Como exemplo prático, considere-se uma extração
com 500 mg de MS e um volume de extração (extrato) de 5 mL e
uma alíquota de reação de 3 mL. Após a reação, a amostra
apresentou leitura de 0,5 de absorbância. Com base na equação da
reta, a concentração na alíquota será: x = 0,5/0,0304 = 16,447
nmol/mL de NO2- para cada mL da alíquota. Extrapolando para o
volume da alíquota, será: 16,447 x 3 = 49,34 nmol/3 mL (isso
representa quantidade e não concentração). Como o volume do
extrato foi de 5 mL, então a quantidade total de NO2- será = 49,34 x
5/3 = 82,24 nmol de NO2-/5 mL do extrato. Como os 5 mL do extrato
foram obtidos a partir de 500 mg de MS, implica que ter-se-ão 82,24
nmol de NO2-/500 mg MS ou 164,48 nmol de NO2-/g MS.

3.3. Determinação da concentração de amônio

a) Características gerais
O metabolismo que transforma amônio em aminoácidos e
amidas é o principal mecanismo de assimilação e detoxificação de
amônio nas plantas. A formação de glutamato e glutamina é a porta
de entrada da amônia oriunda do nitrato e da reciclagem do N que
envolve processos importantes, como fotorespiração, ciclo da ureia,
senescência, etc. Portanto, apesar de o amônio não ser acumulado
nas células em virtude de sua toxicidade elevada (acima de 5 mM),
sua reciclagem é intensa. Sob certas condições metabólicas,
durante a reciclagem parte do amônio é eliminada ou perdida para a
atmosfera.
b) Princípio do método
O método baseia-se na formação de um composto de coloração
azulada, o indofenol, após a reação da amônia com fenol e
hipoclorito em pH alcalino, induzido pela adição de NaOH na
solução de reação (FELKER, 1977; WEATHERBURN, 1967)
demonstrada na Figura 6. O indofenol pode ser quantificado em
espectrofotômetro com um máximo de absorção a 640 nm.

Figura 6. Formação do indofenol a partir da reação da amônia com fenol e hipoclorito em


pH alcalino induzido pela adição de NaOH.

c) Marcha analítica para extração e ensaio da atividade


Para a extração, deve-se pesar 100 mg de tecido vegetal liofili‐
zado, adicionar 5 mL de água deionizada em tubos de ensaio
lacrados. Colocar os tubos em banho-maria por 1 hora a 100 ºC e
centrifugar por 10 minutos a 3.000 rpm. Após a centrifugação,
transferir o sobrenadante (extrato) para recipiente adequado e
guardar em freezer. Do extrato obtido, transferir uma alíquota de 0,4
mL para tubos de ensaio contendo 2,5 mL da solução de reação A
(dissolver 5 g de fenol e 25 mg de nitroprussiato de sódio em água
deionizada e completar o volume para 500 mL. Guardar em
refrigerador e utilizar em 30 dias, no máximo). Após agitar em
vórtex, acrescentar 2,5 mL da solução de reação B (dissolver 2,5 g
de NaOH e 12,6 mL de hipoclorito de sódio comercial e completar o
volume para 500 mL. Guardar em refrigerador e utilizar em 30 dias,
no máximo) e agitar. Colocar os tubos em banho-maria por 20
minutos a 37 ºC; após 30 minutos, ler as absorbâncias em
espectrofotômetro a 625 nm. A concentração de amônio livre será
determinada utilizando-se uma curva padrão ajustada com
concentrações crescentes de sulfato de amônio (NH4)2SO4.

d) Cálculos da concentração e formas de expressão dos


resultados
Inicialmente deverá ser construída uma curva padrão a partir de
uma faixa de concentrações conhecidas de sulfato de amônio
(NH4)2SO4. A faixa deve variar entre 0 e 0,4 µmol NH4+/mL (faixa
linear). Por exemplo, com uma alíquota de 0,4 mL e um volume de
reação de 5,4 mL, pode-se obter uma relação linear com uma equa‐
ção y = 1,2896x (r2 = 0,9995), em que y representa a absorbância e
x a concentração de NH4+ na alíquota em µmol/mL. Como exemplo
prático, considere-se uma extração com 100 mg de MS e um
volume de extração (extrato) de 5 mL e uma alíquota de reação de
0,4 mL. Após a reação, a amostra deu uma leitura de 0,3 de
absorbância. Com base na equação da reta, a concentração na
alíquota será: x = 0,3/1,2896 = 0,232 µmol/mL de NH4+ na alíquota
(0,4 mL). Extrapolando para o volume da alíquota, será: 0,232 x 0,4
= 0,093 µmol de NH4+/0,4 mL. Como o volume do extrato foi de 5
mL, então a quantidade total de NH4+ será: 0,093x5/0,4 = 1,16 µmol
de NH4+/5 mL do extrato. Como os 5 mL do extrato foram obtidos a
partir de 100 mg de MS, implica que ter-se-á 1,16 µmol de NH4+/100
mg MS ou 11,61 µmol de NH4+/g MS.

3.4. Determinação da concentração de aminoácidos


livres totais (N a-amino livre)

a) Características gerais
Os aminoácidos são os produtos primários da assimilação da
amônia oriunda da redução assimilatória do nitrato. Após formação
dos primeiros aminoácidos (glutamato, glutamina, aspartato e
asparagina), ocorre intensa interconversão, principalmente
catalisada pela transferases do grupo amino. Com decorrer do
metabolismo, duas frações de aminoácidos se estabelecem: um
grupo que segue a via de síntese proteica e de outras biomoléculas
nitrogenadas, e uma fração que permanece na forma livre,
constituindo um pool importante, envolvido com vários processos
fisiológicos. Na realidade, esses dois pools, ou seja, as frações de
aminoácidos, se interligam metabolicamente com a mediação dos a-
cetoácidos, que fornecem os esqueletos de carbono para a síntese
de novos aminoácidos e síntese proteica.

b) Princípio do método
O método se baseia na reação de um a-aminoácido livre com
duas moléculas de ninhidrina, sendo uma por vez. Inicialmente, uma
molécula de ninhidrina (agente fortemente oxidante) ocasiona a
oxidação descarboxilativa dos aminoácidos resultando em amônio e
hidridantina que então reagem com uma segunda molécula de
ninhidrina produzindo um composto de cor púrpura (YEMM;
COCKING, 1955) (Figura 7). Quando a reação ocorre com a prolina
e/ou hidroxiprolina, as quais não possuem o seu a-aminogrupo livre,
o produto resultante é um composto de cor amarela característica. A
intensidade de cor formada, assim como a absorbância, não é igual
para todos os aminoácidos. Portanto, o método apenas estima a
concentração dos aminoácidos livres totais, dependendo, portanto,
da composição da amostras.
Figura 7. Formação de um pigmento púrpuro a partir da ligação de duas moléculas de
ninhidrina com um aminoácido.

c) Marcha analítica para extração e determinação


Para a extração, deve-se pesar 50 mg de tecido vegetal liofili‐
zado, adicionar 5 mL de água deionizada e realizar extração à
quente em banho-maria por 1 hora e, então, centrifugar a 3.000 rpm
por 10 minutos. Após a centrifugação, transferir o sobrenadante
(extrato) para recipiente adequado e guardar em freezer. Alíquotas
de 0,1 mL a 0,5 mL (completadas até 0,5 mL com água destilada
q.s.p.) devem ser misturadas com 0,25 mL de tampão citrato 0,2 M
(pH 5,0) + 0,6 mL solução de ninhidrina 5% (m/v) e KCN 0,2 mM na
proporção de 1:5. A solução de ninhidrina 5% deve ser dissolvida
nos solventes metilcelosolve, metoxi-etanol ou ultrasolve. Agitar em
vórtex e levar ao banho-maria (100 °C por 15 minutos) para o
desenvolvimento da cor característica (azul-violeta). Ao final desse
período, os tubos devem ser resfriados em banho de gelo e então
0,65 mL de etanol 60% deve ser adicionado. O etanol garante a
estabilidade da cor desenvolvida por cerca de 1 hora. As leituras
devem ser realizadas em espectrofotômetro a 570 nm zerado com o
branco. O branco deve ser feito substituindo-se o extrato por água
deionizada.

d) Cálculos e modos de expressão dos resultados


Na construção da curva padrão, recomenda-se a utilização de
uma solução de glicina que varie de 0,05 nmol de glicina a 0,5 nmol
de glicina/0,1 mL. A reta obtida deve cruzar a origem e possuir
coeficiente de correlação (r2) muito próximo de 1. Como exemplo
para o cálculo da concentração de aminoácidos livres nas amostras,
vamos utilizar a equação y = 0,0024x (r2 = 0,9983) obtida pela
construção da curva padrão, em que y representa a absorbância e x
a concentração de glicina em µmol/mL. Utilizando-se 0,05 g de
tecido vegetal para 5,0 mL de água deionizada e alíquota de reação
de 0,5 mL (com uma diluição 1:1), foi obtida uma leitura de 0,272.
Procedendo-se os cálculos, tem-se x = 0,272/0,0024 = 113,33 nmol
de AA/0,1 mL. Como foram utilizados 5 mL para a obter o extrato,
então a quantidade total de AA será de 113,33 x 5/0,1, ou seja,
5666,5 nmol de AA para 5 mL do extrato. Ajustando-se para a quan‐
tidade de massa seca utilizada (50 mg), teremos 5,666 µmol de
AA/50 mg MS ou 5,666 x 20 = 113,33 µmol de AA/g MS. Fazendo a
correção pelo fator diluição (2x) o resultado final será de 226,66
µmol de AA/g MS.

3.5. Determinação da concentração de proteínas


solúveis

a) Características gerais
Historicamente, as proteínas vegetais são classificadas com
base em sua solubilidade em vários solventes. Existem as
albuminas, solúveis em água e em solução salina; globulinas,
insolúveis em água, mas solúveis em soluções salinas; glutelinas,
insolúveis em água e em soluções salinas, mas solúveis em ácidos
e bases diluídas; e as prolaminas, insolúveis em água, solução
salina ou ácida diluída e solúvel em etanol 70% a 80%. As proteínas
também podem ser classificadas em solúveis e proteínas insolúveis,
dependo de sua localização celular. As primeiras estão presentes no
citosol e matrizes organelares e são extraídas após ruptura das
membranas e separadas por centrifugação. Nessa fração localizam-
se a maioria das enzimas. A fração insolúvel compreende as
proteínas ligadas às membranas, de extração e separação mais
difícil.

b) Princípio do método
O método desenvolvido por Bradford (1976) baseia-se numa
reação de adsorção de peptídeos, por meio principalmente dos
aminoácidos básicos, no corante coomassie brilliant blue. A forma
aniônica do corante fixa preferencialmente os grupamentos
catiônicos das proteínas por meio de interações eletrostáticas. A
reação produz um complexo de coloração azulada que pode ser
mensurada pela absorbância a 595 nm. O complexo proteína-
corante possui alto coeficiente de extinção molar, e isso confere
grande sensibilidade ao método. Apesar de existirem outros
métodos como o de Lowry (1951), o de Bradford se destaca pela
sua sensibilidade, simplicidade e rapidez. Entretanto, como os
demais, apresenta limitações, tais como interferências, baixa
especificidade, diferentes coeficientes de absortividade molar para
diferentes proteínas, além de não reagir diretamente somente com
as proteínas. A estrutura final do complexo proteína-corante é
mostrada na Figura 8.
Figura 8. Complexo proteína-corante formado na reação de Bradford.

c) Marcha analítica para extração e determinação


Na extração de proteínas solúveis para determinação de ativi
dade enzimática, tecido vegetal fresco ou liofilizado deve ser
macerado na presença de N2 líquido sob banho de gelo (0 °C a 4
°C) seguido da adição de uma solução tampão, por exemplo, fosfato
de potássio 100 mM. Após a centrifugação do extrato (20.000 g por
15 minutos), deve-se recolher 0,1 mL do sobrenadante e adicionar
2,5 mL do reagente de Bradford (o produto colorido formado
permanece estável por cerca de 1 hora). Após a adição do reagente,
aguardar 15 minutos (necessário para a reação se estabilizar),
realizar a leitura em espectrofotômetro a 595 nm. Para a construção
da curva padrão, recomenda-se a utilização de uma solução de
albumina sérica bovina (BSA) que varie de 10 μg de proteína/mL a
100 μg de proteína/mL. Após a obtenção das leituras referentes às
soluções padrão é necessário calcular a curva padrão que deve
cruzar a origem e possuir coeficiente de correlação (r2) muito
próximo de 1. Como observação, deve-se atentar para que as
leituras de absorbância não ultrapassem a faixa de 0,4, visto que até
este ponto de absorbância o método é mais linear. Portanto, antes
de iniciar a reação nas amostras, fazer um teste de diluição.
O reagente de Bradford pode ser preparado da seguinte forma:
pesar 0,11 g de Coomassie Brilliant Blue 90% ou 0,154 g de
Coomassie 65% e dissolver em 50 mL de etanol 95%, mantendo
sob agitação constante por 1 hora. Após a dissolução, adicionar 100
mL de H3PO4 concentrado (85%), completar o volume para 1 L com
água deionizada e realizar duas filtrações consecutivas em papel de
filtro qualitativo. É de extrema importância que o reagente de
Bradford apresente cor castanha e seja guardado em frasco escuro,
protegido com papel alumínio, à temperatura ambiente.

d) Cálculos e modos de expressão dos resultados


Como exemplo para o cálculo da concentração de proteínas nas
amostras, vamos utilizar a equação y = 0,0164x (r2 = 0,9944) obtida
pela construção da curva padrão, em que y representa a
absorbância e x a concentração de proteína em µmol/mL.
Utilizando-se 0,5 g de tecido vegetal fresco para 1,5 mL de tampão
de extração e alíquota de reação de 0,1 mL (diluída 40x) foi obtida
uma leitura de 0,124. Procedendo-se os cálculos, tem-se x =
0,124/0,0164 = 7,56 µg de proteína/0,1 mL ou 75,6 µg de
proteína/mL. Como foram utilizados 1,5 mL de tampão para obter o
extrato, então a quantidade total de proteína será de 75,6 x 1,5/1, ou
seja, 113,41 µg de proteína/1,5 mL do extrato. Ajustando-se para a
quantidade de massa seca utilizada (0,5 g), teremos 113,41 µg de
proteína/500 mg de massa fresca ou seca (liofilizada) ou 0,2268 µg
de proteína/mg de MF ou MS. Nota-se que, no cálculo, o fator de
diluição (40) ainda não foi inserido, então a concentração de
proteína será de 0,2268 x 40 resultando em 9,073 mg de proteína/g
de MF.

4. Considerações finais
A metodologia para determinação de atividades enzimáticas e
concentrações de metabólitos em tecidos vegetais representa um
passo fundamental para o sucesso de uma pesquisa e/ou controle
de qualidade de produtos biotecnológicos. Existe uma dificuldade
natural na qualidade daquelas mensurações imposta pela própria
complexidade da estrutura dos vegetais. Dessa maneira, a maioria
dos resultados obtidos reflete mais uma estimativa feita in vitro em
relação aos dados reais na situação in situ. Em virtude disso, a
interpretação dos resultados não é simples. Portanto, é necessário
ter a clareza dessa limitação e incentivar o aperfeiçoamento e
surgimento de novos métodos analíticos químicos e bioquímicos.
Essa é uma área da pesquisa que requer mais progresso como se
pode deduzir pela idade de muitos dos métodos clássicos ainda em
pleno uso. Como essa área envolve, muitas vezes, aspectos
essencialmente empíricos, é essencial que cada laboratório busque
adaptar e otimizar seus métodos antes de usá-los como uma receita
pronta. Especificamente no caso da assimilação do N inorgânico,
apesar da imensa quantidade de pesquisa realizada, muito ainda
precisa ser feito para possibilitar uma melhor compreensão dos
mecanismos a fim de possibilitar utilização biotecnológica desse
processo para o desenvolvimento de produtos de maior valor
agregado.

5. Referências

BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram


quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analitical Biochemystry,
San Diego, v. 72, p. 248-254, 1976.
CATALDO, J. M.; HAROOM, M.; SCHRADER, L. E.; YOUNGS, V. L. Rapid colorimetric
determination of nitrate in plant tissue by nitration of salicylic acid. Communications in Soil
Science and Plant Analysis, New York, v. 6, n. 1, p. 71-80, 1975.
CAWSE, P. A. The determination of nitrate in soil solution by ultraviolet spectrophotometry.
Analyst, London, UK, v. 9, n. 2, p. 309-313, 1967.
COOMBS, J.; HALL, D. O. Techniques in productivity and photosynthesis. New York:
Pergamon Press, 1982. 171 p.
ELLIOTT, W. H. Glutamine synthesis. Methods in Enzymology, New York, v. 2, p. 337-342,
1955.
FELKER, P. Microdetermination of nitrogen in seed protein extracts. Analytical Chemistry,
Washington, DC, v. 49, n. 7, p. 1080, 1977.
GRIESS, P. Bemerkungen zu der abhandlung der H. H. Weselsky und enedikt “Ueber
einige azoverbindungen”. Chemische Berichte, Berlin, DE, v. 12, n. 8, p. 426, 1879.
HAGEMAN, R. H.; HUCKLESBY, D. P. Nitrate reductase from higher plants. Methods in
Enzymology, New York, v. 17, n. A, p. 491-503, 1971.
KANDLBINDER, A.; WEINER, H.; KAISER, W. M. Nitrate reductases from leaves of Ricinus
(Ricinus communis L.) and spinach (Spinacia oleracea L.) have different regulatory
properties. Journal Experimental Botany, Oxford, v. 51, n. 347, p. 1099-1105, 2000.
LOSADA, M.; PANEQUE, A. Nitrite reductase. Methods in Enzymology, New York, v. 23, p.
487-491, 1971.
LOWRY, O. H.; ROSEBROUGH, N. J.; FARRA, A. L.; RANDALL, R. J. Protein
measurement with the Folin phenol reagent. Journal of biological Chemistry, Baltimore, v.
193, p. 265-275, 1951.
ROBIN, P. Etude de quelques conditions d’extraction de la nitrate réductase des racines et
des feuilles de plantules de maıs. Physiologie Végétale, Paris, FR, v. 17, p. 45-54, 1979.
SILVEIRA, J. A. G. S.; MELO, A. R. B.; VIÉGAS, R. A.; OLIVEIRA, J. T. A. Salinity-induced
effects on nitrogen assimilation related to growth in cowpea plants. Environmental and
Experimental Botany, Oxford, v. 46, p. 171-179, 2001a.
SILVEIRA, J. A. G. S.; MATOS, J. C. S.; CECATTO, V. M.; VIÉGAS, R. A.; OLIVEIRA, J. T.
A. Nitrate redutase activity, distribution, and response to nitrate in two contrasting
Phaseolus species inoculated with Rhizobium spp. Environmental and Experimental Botany,
Oxford, v. 46, p. 37-46, 2001b.
SILVEIRA, J. A. G. S.; COSTA, R. C. L.; OLIVEIRA, J. T. A. Drought-induced and recovery
of nitrate assimilation and nodule activity in cowpea plants inoculates with Bradyrhizobium
spp. under moderate nitrate level. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 32, p.
187-194, 2001c.
SILVEIRA, J. A. G. S.; VIÉGAS, R. A.; ROCHA, I. M. A.; MOREIRA, A. C. O. M.; MOREIRA,
R. A.; OLIVEIRA, J. T. A. Proline accumulation and glutamine synthetase activity are
increased by salt-induced proteolysis in cashew leaves. Journal of Plant Physiology,
Stuttgart, v. 160, p. 115-123, 2003.
SNELL, F. D.; SNELL, C. T. Colorimetric methods of analysis. New York: Van Nostrand,
1949. v. 2, p. 793.
SUZUKI, I.; CRETIN, C.; OMATA, T.; SUGIYAMA, T. Transcriptional and post-transcriptional
regulation of nitrogen-responding expression of phosphoenolpyruvate carboxylase gene in
maize. Plant Physiology, Rockville, v. 105, p. 1223-1229, 1994.
VIEGAS, R. A.; SILVEIRA, J. A. A. G. Activation of nitrate reductase of cashew leaf by
exogenous nitrite. Brazilian Journal of Plant Physiology, Piracicaba, v. 14, n. 1, p. 39-44,
2002.
VIEGAS, R. A.; SILVEIRA, J. A. A. G. Ammonia assimiliation and prline accumalitaion in
young cashew plants during long term exposure to NaCl-salinity. Brazilian Journal of Plant
Physiology, Piracicaba, v. 11, n. 3, p. 153-159, 1999.
WEATHERBUNR, M. W. Phenol-hypochlorite reaction for determination of ammonia.
Analytical Chemistry, San Diego, v. 39, n. 8, p. 971-974, 1967.
YEMM, E. W.; COCKING, E. F. The determination of amino acids with ninhydrin. Analyst,
London, UK, v. 80, p. 209-213, 1955.

6. Literatura recomendada

BAETHGEN, W. E.; ALLEN, M. M. A manual colorimetric procedure for measuring


ammonium nitrogen in soil and plant Kjeldahl digest. Communications in Soil Science and
Plant Analysis, New York, v. 20, n. 9/10, p. 961-969, 1989.
BARKER, A. V.; PILBEAM, D. J. Handbook of plant nutrition. Boca Raton: CRC Taylor &
Francis, 2007. 662 p.
KALRA, Y. P. Handbook of reference methods for plant analysis. Boca Raton: CRC Press,
1998. 291 p.
Capítulo 3
Enzimas hidrolíticas
extracelulares em microrganismos
Maria Luiza Ribeiro Bastos da Silva
Eidy Simões de Souza
Maria do Carmo Silva Barreto
José de Paula Oliveira

1. Introdução

Enzimas são catalisadores biológicos que permitem as reações


metabólicas de organismos vivos realizadas de forma eficiente em
condições compatíveis com a atividade celular, sendo capazes de
aumentar algumas reações, sem requerer condições extremas de
pH, pressão e temperatura. Além de formarem a base do sistema
metabólico dos organismos vivos, essas proteínas proporcionam
enormes oportunidades às indústrias por efetuarem conversões
biocatalíticas finas, eficientes e mais econômicas (GODFREY;
WEST, 1996).
Apesar de as enzimas ocorrerem amplamente em plantas e
animais, as de origem microbiana representam as melhores fontes
em razão de sua ampla diversidade bioquímica e susceptibilidade à
manipulação genética (ALTAMIRANO et al., 2000). Também
possuem muitas vantagens sobre as equivalentes de origem animal
ou vegetal, como o menor custo de produção, a possibilidade de
produção em larga escala em fermentadores industriais, além de
oferecer um amplo espectro de características físico-químicas
(MANFIO, 2003). Apesar disso, enzimas com o mesmo perfil de
atuação sobre o substrato podem apresentar funcionamento ótimo
em pH, temperatura e concentração iônica diferentes, o que requer
a triagem de enzimas adequadas às condições nas quais serão
utilizadas. Portanto, a identificação de novas fontes microbianas,
principalmente não tóxicas ao organismo humano, é de grande
interesse estratégico, pois além de garantir o suprimento de
enzimas aos mais variados processos industriais, tornam possível o
desenvolvimento de novos sistemas enzimáticos que não podem ser
obtidos de plantas ou animais (ALVES et al., 2002).
Atualmente, as enzimas hidrolíticas são as mais utilizadas nos
processos industriais, sendo aplicadas na degradação de várias
substâncias naturais. De forma geral, elas são usadas em grande
escala nas indústrias têxteis (amilase, celulase, pectinase,
oxidorredutase), de detergentes (celulase, lipase, protease,
oxidorredutase), alimentícia (celulase, lactase, lipase, pectinase,
protease, oxidorredutase), de papel (lipase, oxidorredutase,
xilanase) e de couro (lipase, protease) (KIRK et al., 2002; NIELSEN;
OXEMBOLL, 1998; VANBEILEN, 2002;). Uma propriedade singular
das enzimas hidrolíticas é a sua grande especificidade pelo
substrato, hidrolisando um substrato específico.
Em virtude da sua vasta aplicação nesses setores industriais,
assim como no campo farmacêutico (RAO et al., 1998), as
proteases formam o grupo mais estudado das hidrolases. Por outro
lado, as amilases e celulases, comumente utilizadas nas indústrias
de amido, têxtil e detergente, representam o segundo maior grupo
de enzimas (GODFREY; WEST, 1996). Segundo Hartzell e Hsieh
(1998) e Tzanov et al. (2001), as celulases, lipases, pectinases e
proteases podem ser utilizadas eficientemente nos processos de
limpeza de fibras de algodão.
As enzimas microbianas extracelulares podem ser produzidas
em meio líquido ou sólido. O uso de meio sólido, ao contrário do
meio líquido, permite a triagem de uma grande quantidade de
microrganismos (SANOMIYA; NAHAS, 2003), além de possibilitar
uma rápida detecção de enzimas específicas (STAMFORD et al.,
1998; STRAUSS et al., 2001). Os suportes mais utilizados são a
própria fonte de carbono de alto peso molecular, tais como celulose,
amido, pectina e hemicelulose, entre outros.

2. Pectinases (E.C. 3.2.1.15)

As pectinases são responsáveis pela degradação das substân‐


cias pécticas para fins nutricionais e são produzidas principalmente
por fungos filamentosos, leveduras, bactérias e plantas superiores,
não sendo sintetizadas por células animais, exceto por alguns
insetos (PARDO et al., 1991). Essas enzimas têm muitas aplicações
industriais, especialmente na área de alimentos, em operações
como extração, clarificação e remoção de pectina de sucos de frutas
e vinhos, maceração de vegetais e frutas e extração de óleos
vegetais (KASHYAP et al., 2001; KAUR et al., 2004). Podem ainda
ser encontradas em aplicações na indústria de papel e têxtil, bem
como na produção de produtos unicelulares, que tem o intuito de
preservar a integridade de células de plantas, por hidrolise seletiva
de polissacarídeos presentes na lamela média (KASHYAP et al.,
2001).
A síntese dessas enzimas sofre influência dos componentes do
meio de cultura, particularmente da fonte de carbono, presença de
indutores (pectina e derivados) (GUMMADI; PANDA, 2003) e das
condições de cultivo, como pH, temperatura, aeração, agitação e
tempo de incubação e escolha de linhagens apropriadas (SOUZA et
al., 2003). Com relação às técnicas de fermentação, a fermentação
em estado sólido geralmente é preferida por permitir a produção de
enzimas brutas mais concentradas e, consequentemente, com
menores custos de extração e purificação (GREGORIO et al., 2002).

2.1. Atividade pectinolítica


Na determinação da atividade pectinolítica é utilizado o meio M9,
tendo a pectina como fonte de carbono, segundo Miller (1974).
Meio M9 (MILLER, 1974): Sacarose 2,0 g/L; Na2HPO4 6,0 g/L;
KH2PO4 3,0 g/L; NaCl 0,5 g/L; NH4Cl 1,0 g/L; Ágar 15 g/L; completar
com água destilada para 1.000 mL. Complementar com 1,2 g de
extrato de levedura e 4 g de pectina por litro. Adicionar 10 mL da
solução de CaCl2 0,01 M e 1 mL da solução de MgSO4.7H2O 1 M,
autoclavados separadamente.
Procedimentos
– Transferir os microrganismos para placas contendo o meio M9
com pectina.
– Após 2 a 4 dias de incubação a 28 °C–30 °C, retirar as
colônias com Swab e adicionar a solução de HCl 2 N até cobrir
completamente o meio.
– Após a reação ácida, são consideradas produtoras de pectina‐
se as colônias que formam halo claro.
– Como esse método é destrutivo, recomenda-se fazer a trans‐
ferência simultânea para duas placas (‘replica plate’), em que
uma delas não recebe o tratamento ácido, servindo assim para
recuperar os microrganismos positivos.

2.1.1. Determinação da atividade pectinolítica


Para a determinação da atividade pectinolítica em meio líquido,
utiliza-se 1% de pectina cítrica (Sigma) como fonte de carbono.
Meio (Soares et al., 1999): pectina cítrica 10 g/L; (NH4)2SO4 1,4
g/L; K2HPO4 6 g/L; KH2PO4 2 g/L; MgSO4 7H2O 0,1 g/L; completar
para 1.000 mL com água destilada. Ajustar o pH para 6,0 com
NaOH 1 M.

2.1.1.1. Determinação da atividade da enzima


poligalacturonase (PG)
A determinação da atividade de poligalacturonase (endo e exo) é
determinada pela reação com ácido 3’, 5’ dinitrosalicílico (DNS),
descrito por Miller (1959).
Procedimentos
– Inocular o meio com a suspensão contendo 106 células/mL.
– Incubar em frascos de Erlenmeyers de 125 mL com 25 mL de
meio em agitador rotatório a 150 rpm por 30 °C.
– Após 48 horas de crescimento, separar a biomassa por
centrifugação a 1.000 g durante 20 minutos.
– O sobrenadante obtido será utilizado para a determinação da
atividade pectinolítica.
– Uma mistura de 250 μL de amostra enzimática é incubada com
250 μL da solução de polipectato de sódio 1% dissolvida em
tampão acetato de sódio 100 mM, inicialmente em pH 6,0.
– Incubar a 37 °C por 10 minutos e paralisar a reação com a
adição de 1 mL de solução de DNS.
– Manter a solução em ebulição por 8 minutos, resfriar em banho
de gelo e adicionar 8 mL de solução 50 mM de tartarato duplo
de sódio-potássio.
– A absorbância é medida em espectrofotômetro a 540 nm
contra o branco que representa o tempo zero da reação, no
qual a hidrólise espontânea do substrato é mínima.
Obs.: uma unidade de atividade poligalacturonásica é definida como
a quantidade de enzima necessária para produzir 1 μmol de açúcar
redutor, por minuto, nas condições de ensaio, utilizando uma curva
padrão obtida a partir do ácido monogalacturônico e a atividade
específica como sendo U total/mg de proteína total.

2.1.1.2. Determinação da atividade da enzima


polimetilgalacturonato liase (PMGL)
A atividade da pectina liase é determinada segundo método de
Ayers et al. (1966), descrito por Pitt (1988), em que é medida a
reação entre os produtos insaturados finais da degradação da
pectina e o ácido tiobarbitúrico.
Procedimentos
– Misturar 5,0 mL da solução de pectina 1,0% em tampão Tris-
HCl 0,05 M, pH 8,5; 1,0 mL da solução de CaCl2 0,01 M; 1,0 mL
de solução enzimática e 3,0 mL de água destilada.
– Incubar por 2 horas a 30 ºC, adicionar 0,6 mL de uma solução
de ZnSO4 7.H2O 9%, em seguida 0,6 mL de NaOH 0,5 M.
– As proteínas precipitadas do substrato não consumido são
removidas por centrifugação a 3.000 g por 10 minutos.
– Ao sobrenadante é adicionado uma mistura de 3,0 mL do ácido
tiobarbitúrico 0,04 M; 1,5 mL de HCl 0,1 M e 0,5 mL de água
destilada.
– A mistura é fervida em banho-maria por 30 minutos e resfriada
em banho de gelo.
– A absorbância é medida a 550 nm contra um branco, que
contém os mesmos reagentes da mistura de reação, acrescidos
de ZnSO4 e NaOH imediatamente após a adição da enzima.
Obs.: uma unidade da atividade enzimática é definida como a quan‐
tidade de enzima que causa a mudança de 0,1 na absorbância a
550 nm, nas condições do ensaio.

3. Celulases (E.C. 3.2.1.4)

Celulase, o componente mais abundante encontrado na


natureza, quase que exclusivamente nas paredes das células
vegetais, também é produzida por alguns animais como os
tunicados e por algumas bactérias (LYND et al., 2002). É um
polissacarídeo composto de unidades de β-D-glicopiranosil unidas
por ligações β-1,4-glicosídicas (GILKES et al., 1991). Na maioria dos
casos, a celulose não está presente num estado puro e sim
formando fibras que estão embebidas numa matriz de outros
biopolímeros como hemiceluloses e lignina (ROBSON;
CHAMBLISS, 1989).
Há uma diferença entre as estratégias de utilização da celulose
em organismos aeróbios e anaeróbios. Microrganismos anaeróbios
não liberam as enzimas no meio extracelular e sim mantêm um
sistema enzimático complexo (celulossoma) em suas paredes,
produzindo pequenas quantidades da enzima, e o resultado da
degradação são produtos de fermentação como etanol, ácidos
orgânicos, CO2 (LYND et al., 2002).
Microrganismos com metabolismo oxidativo produzem grandes
quantidades de enzimas que são secretadas para o meio de cultura
e podem ser recuperadas nos sobrenadantes, além de terem altas
produções, característica do metabolismo aeróbio. É importante
notar que a maioria das bactérias celulolíticas do solo (Bacillus,
Micromonospora, Themobifida) também são produtoras de
metabólitos secundários e endósporos, habilidades importantes que
conferem vantagens seletivas na natureza (LYND et al., 2002).

3.1. Atividade celulolítica em meio sólido

Para a atividade celulolítica, os microganismos devem ser culti‐


vados em ágar contendo carboximetilcelulose (CMC) como fonte de
carbono.
Meio de Cultura (ARIFFIN et al., 2006): KH2PO4 1,0 g/L;
MgSO4.7H2O 0,5 g/L; NaCl 0,5 g/L; FeSO4.7H2O 0,01 g/L;
MnSO4.H2O 0,01 g/L; NH4NO3 0,3 g/L; CMC 10 g/L; Ágar 12 g/L. O
pH deve ser ajustado em 7,0 com NaOH 1 M.
Procedimentos
– As placas contendo o meio são incubadas a 30 °C por 96 horas
para permitir a secreção de celulase.
– Ao final da incubação, o ágar é coberto com solução de ver‐
melho do congo (1,4 g/L) em tampão Tris-HCl 0,1 M pH 8,0
durante 30 minutos.
– A solução de vermelho congo é descartada, e as placas são
novamente cobertas com NaCl 0,5M por 30 minutos.
– Em torno da colônia crescida, forma-se um halo descolorido
em razão da ausência da celulose original.
– As medições do diâmetro do halo produzido são realizadas
com paquímetro em três dimensões distintas, tanto da colônia
crescida quanto do halo formado.
Obs.: a atividade enzimática foi determinada segundo Anagnostakis
et al. et al. (1975) pela relação entre o diâmetro médio do halo de
degradação e o diâmetro médio da colônia, expressa como índice
enzimático de atividade (IEA), determinada por meio da equação 1.

diâmetro do halo descolorido (cm)


IEA = (1)
diâmetro da colônia (cm)

3.2. Determinações da atividade celulolítica

3.2.1. Atividade da carboximetilcelulose (CMCase)


Para determinar a atividade da CMCase é utilizado o método
descrito por Wood e Bhat (1998), com algumas modificações, citado
por Ariffin et al. et al. (2006).
Meio de Cultura (ARIFFIN et al., 2006): KH2PO4 1,0 g/L; K2HPO4
1,145 g/L; MgSO4.7H2O 0,4 g/L; (NH4)2SO4 5,0 g/L; CaCl2.2H2O 0,05
g/L; FeSO4.7H2O 0,00125 g/L; CMC 10 g/L. O pH deve ser ajustado
em 7,0 com NaOH 1 M.
Procedimentos
– Incubar em frascos de Erlenmeyer de 125 mL com 25 mL do
meio em agitador rotatório a 150 rpm por 30 °C.
– Retirar mostras de 5 mL e centrifugar a 3.000 g durante 15
minutos a 4 °C.
– Em seguida adicionar 0,1 mL do sobrenadante (solução enzi‐
mática) em 2,0 mL de CMC (10 g/L) em tampão acetato 0,2 M,
pH 5,2 e colocar em banho termostático a 45 °C e 60 °C por 10
minutos.
– A reação é finalizada adicionando 3,0 mL de DNS (ácido
dinitrosalicílico) e posterior banho fervente por 5 minutos,
seguido de banho de gelo.
– Às amostras são adicionados 8,0 mL de tartarato de sódio e
potássio 0,05 M.
– Os açúcares redutores liberados são medidos a 540 nm
(MILLER, 1959). Também deve ser coletada alíquota de 1 mL
no tempo zero da reação para eventuais interferências caso
haja açúcar redutor na solução enzimática.
Obs.: uma unidade de atividade de CMC é determinada como a
capacidade da enzima em liberar 1 μmol de glicose por minuto a
partir da CMC original nas condições do ensaio.

3.2.2. Atividade de celobiase


– Um volume de 0,1 mL da solução enzimática é adicionado em
uma mistura de 0,1 mL de solução de celobiose 20 mM em
tampão acetato 0,2 M, pH 5,2.
– A mistura é colocada em banho termostático a 45 °C por 30
minutos.
– A reação é paralisada depois de 30 minutos de incubação em
banho fervente por 5 minutos, seguido de banho de gelo.
– O teor de glicose formado é determinado pelo método da
glicose-oxidase (HENRY et al., 1974).
Obs.: uma unidade de atividade de celobiase é definida como a
capacidade da enzima em produzir 1 μmol de glicose por minuto a
partir da celobiose original nas condições do ensaio.

3.2.3. Atividade de hidrólise em papel de filtro (FPase)


Procedimento Mandels et al. (1976) com algumas alterações
– Pesar 50 mg de papel de filtro Whatman número 1 (fonte de
celulose).
– Adicionar a solução a tubos de ensaio contendo 2 mL de
tampão acetato 0,2 M e pH 5,5.
– Um volume de 1 mL da solução enzimática é adicionado ao
tubo em banho termostático a 45 °C por 1 hora.
– As amostras devem ser incubadas em banho em ebulição por
5 minutos e depois em banho de gelo.
– Os açúcares redutores liberados serão medidos com ácido
dinitrosalicílico em leitura espectrofotométrica a 540 nm
(MILLER, 1959).
Obs.: uma unidade de atividade de FPase é determinada como a
capacidade da enzima em liberar 1 μmol de glicose por minuto a
partir do papel de filtro original.

4. Lipase (E.C. 3.1.1.3)

As lipases são glicerol éster hidrolases que catalisam a quebra


de triglicerídeos em diglicerídeos, monoglicerídeos, glicerol e ácidos
graxos (SOMMER et al., 1997), agindo nas ligações éster carboxil
presentes nos acilgliceróis (JAEGER et al., 1994).
A lipase acontece exclusivamente na interface lipídeo-água, e a
concentração de substrato é que determina a taxa de quebra
(JAEGER; REETZ, 1998). As lipases de origem microbiana são as
mais versáteis e conseguem fazer um grande número de reações,
como hidrólise, esterificação, alcoólise (HAKI; RAKSHIT, 2003).
Dentre as bactérias produtoras de lipases, comercialmente estão
disponíveis as enzimas de Pseudomonas sp., Pseudomonas
fluorescens, Bulkholderia (anteriormente Pseudomonas) cepacia
para a aplicação em síntese quiral, e as lipases de Burkholderia sp.
e Arthrobacter sp. utilizadas na determinação diagnóstica de
triacilgliceróis. O rápido crescimento celular, em relação aos fungos,
é uma das vantagens das fontes bacterianas como produtoras
dessas enzimas (JAEGER et al., 1999).

4.1. Produção de lipases

O método de Rodamina B (HABA et al., 2000) evidencia micror‐


ganismos lipolíticos em razão da presença da enzima extracelular
lipase.
Meio Luria Bertani (LB): cloreto de sódio 10,0 g/L; extrato de
levedura 5,0 g/L e triptona bacteriologica 10,0 g/L. Ajustar o pH para
7,0 com NaOH 1 M.
Procedimentos
– Dissolver os componentes do meio em água destilada e
autoclavar, resfriar a 60 °C e adicionar 25 mL/L de óleo de oliva
estéril e 10 mL/L de solução de Rodamina B (Synth) 0,001%.
– Os microrganismos são inoculados em placas de Petri a 30 °C
por 24 a 48 horas.
– Após este período, as colônias são submetidas à luz U.V. (300
nm), e as que apresentarem um halo de coloração laranja-
fluorescente formado ao redor das colônias serão identificadas
como microrganismos lipolíticos, evidenciando a produção de
lipase extracelular que degrada lipídeo.
Obs.: a atividade enzimática é determinada segundo Anagnostakis
et al. (1975) pela relação entre o diâmetro médio do halo de
degradação e o diâmetro médio da colônia, expressa como índice
enzimático de atividade (IEA), determinada por meio da equação 1
(item 3.1).

4.2. Produção do extrato lipolítico bruto (BARON, 2008)

Composição do meio: KNO3 3,54 g/L; K2HPO4 1,0 g/L; MgSO4.


7H2O 0,5 g/L; NaCl 0,38 g/L; FeSO4. 7H2O 0,01 g/L; extrato de
levedura 5 g/L e 10 mL de óleo de oliva comercial.
1. Solução A: palmitato de p-nitrofenila (Sigma) em isopropanol,
em uma concentração de 3 mg/mL.
2. Solução B: 2 g de Triton X-100 e 0,5 g de goma arábica, em
450 mL de tampão fosfato 0,05 mol/L pH 7,0.
Procedimentos
– O pré-inóculo é preparado em Erlenmeyer de 125 mL contendo
25 mL do meio LB (item 4.1), em agitador orbital com agitação
de 150 rpm a 30 °C até as células atingirem a concentração de
108 células/mL.
– Após esse período, 1 mL do pré-inóculo (108 células/mL) é
inoculado em Erlenmeyers de 500 mL contendo 150 mL de
meio.
– Incubar os cultivos em agitador orbital com agitação de 150
rpm a 30 °C por 72 horas.
– Centrifugar as células a 8.500 g por 20 minutos a 4 °C.
– Adicionar ao sobrenadante (em banho de gelo) sulfato de
amônio até 80% de saturação, com agitação branda.
– Manter o extrato a 4 °C por 12 horas, com agitação branda,
depois centrifugar a 8.500 g por 10 minutos.
– O sobrenadante é removido, e o precipitado ressuspendido em
um volume mínimo de tampão fosfato 0,05 M, pH 7,0.
– Essa suspensão é dializada contra esse mesmo tampão a 4
°C, com 2 trocas.
– A fração dialisada é liofilizada e delipidada pela extração
líquido-líquido e extração sólido-líquido.
– O extrato lipolítico bruto é liofilizado e tratado com isopropanol
30% (v/v).

4.3. Determinação da atividade lipolítica em meio aquoso

a) Método da hidrólise do pNPP


Este método espectrofotométrico foi inicialmente descrito por
Winkler e Stukmann (1979), sendo modificado conforme Krieger
(1995).
Procedimentos
– Em 1 mL da solução A, misturar 10 mL da solução B, lenta‐
mente e sob contínua agitação.
– A mistura é feita imediatamente antes da determinação da
atividade, pois o substrato é instável quando em meio aquoso.
– Desta solução é colocado 0,9 mL em cubeta. Estabilizada a
temperatura a 37 °C, é adicionada a solução de enzima (0,1
mL) ou de tampão, quando se prepara o branco.
– A reação é feita em cubeta de 1,0 mL, e faz-se a leitura sempre
contra um branco contendo o substrato e o tampão sem a
enzima, a 37 °C e pH 8,0.
– Medir a absorbância a 410 nm.
Obs.: uma unidade de atividade enzimática (U) é definida como a
quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de p-nitrofenol por
minuto a 37 °C, nas condições de ensaio.

b) Método titulométrico
A determinação da atividade de lipases por titulometria é
baseada no método titulométrico, realizado de acordo com o método
empregado por Watanabe et al. (1977).
Procedimentos
– A reação enzimática é realizada em frascos Erlenmeyer de 125
mL de capacidade, em banho-maria a 30 °C, sob agitação (150
ciclos/min) durante 10 minutos.
– A mistura da reação: emulsão de óleo de oliva (25%, v/v) em
solução de álcool polivinílico a 2% p/v (5,0 mL); solução-tampão
Tris-HCl 0,02M pH 8,0 (4,0 mL-1) ou solução-tampão fosfato pH
6,0 (4,0 mL-1); preparação enzimática (1,0 mL-1).
– A reação é paralisada pela adição de 20 mL de solução
acetona/álcool etílico (1:1).
– Em paralelo fazer como controle (branco) a enzima inativada,
ou seja, a preparação enzimática deverá ser colocada em
banho-maria fervente durante 10 minutos.
– Em seguida, adicionar 5 gotas de solução indicadora de timol‐
ftaleína a 0,2%.
– Após homogeneização da mistura em reação, fazer a titulação
dos ácidos graxos liberados com uma solução padronizada de
hidróxido de sódio 0,05 M, até o ponto de viragem,
caracterizada pelo aparecimento da coloração azul clara, sendo
registrado o volume de hidróxido de sódio gasto em cada
titulação.
Obs.: uma unidade de atividade lipásica é definida como a
quantidade de enzima que libera 1 μmol de ácido graxo por minuto
nas condições de ensaio.
A atividade (em U/mL) é calculada multiplicando-se a diferença
de volumes gastos (mL) (reação e controle) de solução de hidróxido
de sódio pelo fator de diluição, dividido pelo tempo de incubação. O
resultado é multiplicado por 50 (fator aplicado para expressar o
resultado em micro moles de ácido graxo por mL da amostra).

5. Protease (E.C. 3.4)


Enzimas proteolíticas ou proteases catalisam a quebra das liga‐
ções peptídicas em proteínas. São enzimas da classe 3, as
hidrolases, e subclasse 3.4, as peptídeo-hidrolases ou peptidases.
Estas enzimas constituem uma grande família (EC 3.4), dividida em
endopeptidases ou proteinases (EC 3.4. 21-99) e exopeptidases
(EC 3.4.11-19), de acordo com a posição da ligação peptídica a ser
clivada na cadeia peptídica. As endopeptidases podem ser ainda
subdivididas de acordo com o grupo reativo no sítio ativo envolvido
com a catálise em serina- (EC 3.4.21), cisteína- (EC 3.4.22),
aspártico-proteinases ou endopeptidases (EC 3.4.23) e
metalloproteinases ou metalloendopeptidases (EC 3.4.24). As
enzimas cujo mecanismo de ação não está completamente
elucidado são classificadas no subgrupo EC. 3.4.99.
As proteases microbianas têm sido extensivamente estudadas,
havendo necessidade de descobrir novas proteases com diferentes
características para atender o crescimento rápido das indústrias
baseadas na tecnologia da produção de enzimas, bem como a
otimização dos métodos empregados para a sua purificação
(RAZAK et al., 1994).

5.1. Atividade proteolítica

A habilidade dos microrganismos em hidrolisar proteínas é


testada em meio contendo caseína como única fonte de carbono.
Procedimentos
– Crescer os microrganismos em meio com caseína 1%.
– Para melhor visualização do halo de proteólise, incubar as
placas por 72 a 96 horas a 30 ºC.
– As colônias nas placas são reveladas usando solução de ácido
acético a 5%.
– Uma região transparente ao redor da colônia em contraste com
a superfície opaca do meio na placa indica atividade
proteolítica.
A atividade enzimática foi determinada segundo Anagnostakis et
al. (1975) pela relação entre o diâmetro médio do halo de
degradação e o diâmetro médio da colônia, expressa como índice
enzimático de atividade (IEA), determinada por meio da equação 1
(item 3.1).

5.2. Determinação da atividade proteolítica

O método para determinação da atividade proteolítica de


enzimas que utiliza a azocaseína foi inicialmente desenvolvido por
Charney e Tomarelli (1947).
Procedimentos
– Crescer o microrganismo em meio de cultura (consulte o meio
adequado ao microrganismo estudado) até a fase exponencial.
– Após o tempo de crescimento que pode variar, dependendo do
microrganismo testado, fazer a densidade ótica a 560 nm.
– Centrifugar as células a 15.500 g por 15 minutos a 4 °C, o
sobrenadante livre de células é utilizado para dosagem da
atividade da enzima.
– Preparar uma solução de azocaseína 0,2% (p.v -1) em tampão
Tris/HCl (pH 8,5) e manter sob refrigeração por um período
máximo de três semanas.
– Adicionar alíquota de 100 μL de azocaseína 0,2% e adicionar
200 μL de solução tampão fosfato 0,2 mM pH 8,0. Após 2
minutos de homogeneização na temperatura de 50 °C em
banho de água, adicionar 100 μL de amostra.
– O ensaio é conduzido com um período de incubação de 15
minutos. A reação é finalizada com a adição de 800 μL de
solução de ácido tricloroacético (TCA) 20% (MITIDIERI et al.,
2002).
– Para cada ponto de amostragem preparar um branco mediante
a adição de 100 μL de azocaseína, 200 μL de solução tampão
fosfato e de 800 μL de solução TCA (20%).
– Por último, adicionar 100 μL de amostra e incubar por 15 mi‐
nutos.
– Centrifugar as amostras a 15.000 g durante 15 minutos,
realizando-se imediatamente a leitura de absorbância do
sobrenadante a 400 nm.
– Para a leitura, é utilizada cubeta de acrílico de 1 mL com
caminho ótico de 10 mm.
Obs.: uma unidade de atividade proteásica é definida como sendo a
quantidade de enzima requerida para produzir um aumento de 0,01
unidades na absorvância a 400 nm por hora de incubação, sendo
expressa em U/mL. A atividade proteásica específica é calculada
pela razão entre a atividade proteásica total e a quantidade de
proteínas contidas em 1 mL da amostra (U/mg).

6. Quitinase (E.C. 3.2.1.14)

Quitinases, enzimas que catalisam a conversão de quitina


(homopolímero linear insolúvel, formado por ligações do tipo b-l,4 de
monômeros de 2-acetoamino-2-desoxi-D-glicopiranose N-acetilglico‐
samina – NAcGlc ou NAG) a componente monomérico amplamente
distribuído na natureza (GOODAY, 1999).
Elas são produzidas por uma grande variedade de organismos
que degradam quitina, incluindo bactérias, fungos, insetos, plantas e
animais (GOODAY, 1990). Entre as bactérias, os gêneros
Streptomyces, Bacillus, Vibrio possuem as maiores atividades
quitinolíticas (TRACHUK et al., 1996). A produção de quitinases é
normalmente regulada pela presença do substrato, pois sua síntese
é reprimida quando a bactéria cresce em um meio rico e só induzida
quando cresce em meio mínimo suplementado com quitina como
única fonte de carbono (FOLDERS et al., 2001).
As aplicações biotecnológicas de enzimas constituem um vasto
campo de possibilidades nas mais diversas áreas, como agricultura
e o setor industrial. Nos últimos anos, várias quitinases derivadas de
diversos microrganismos foram isoladas, clonadas e expressas na
forma recombinante.

6.1. Determinação da atividade de quitinase

A atividade de quitinase é determinada conforme a metodologia


descrita por Rèissig et al. (1955) e Sandhu et al. (1989) utilizando
quitina coloidal como substrato (FLEURI, 2003).
Procedimentos
– Crescer o microrganismo em meio de cultura (consulte o meio
adequado ao microrganismo estudado), até a fase exponencial.
– Após o tempo de crescimento que pode variar, dependendo do
microrganismo testado, fazer a densidade ótica a 560 nm.
– Centrifugar as células a 13.000 g, a 4 °C , por 10 minutos.
– O sobrenadante é utilizado como fonte de enzima para deter‐
minação das características de atividade das quitinases.
– Preparar 20 g de quitina da carapaça de caranguejo em pó
(Practical Grade, Sigma) dissolvida em 200 mL HCl
concentrado, precipitada como quitina coloidal em água gelada
e enxaguada por filtração até pH 5,5 (KANG et al., 1999).
– Alíquotas de 0,5 mL do sobrenadante é incubado com 1 mL de
quitina coloidal preparada a 1% em de tampão acetato 100 mM
pH 5,0 a 50 °C.
– Incubar com agitação 37 °C por 24 horas.
– A quitina residual é separada por centrifugação a 2.000 g por
15 minutos.
– Alíquotas de 250 µL do sobrenadante são incubadas com 50
µL de tetraborato de sódio 0,8 M pH 9,1.
– Ferver por 3 minutos e interromper a reação em gelo por 1
minuto.
– Adicionar 1,5 mL de DMAB (ρ-dimetilbenzaldeído 1,0% p/v /
HCl 1,25% v/v em ácido acético glacial).
– Incubar em banho-maria a 37 °C por 15 minutos.
– O produto formado a partir da reação é determinado pela
medida da absorbância a 585 nm.
Obs.: uma unidade de atividade enzimática é definida como μg de
N-acetilglicosamina liberado por mL da solução da enzima nas
condições da reação.

6.2. Ensaio da atividade de quitinolítica

A atividade enzimática de quitinase é determinada pela quan‐


tificação de N-acetil glicosamina (NAcGlc) formada a partir da degra‐
dação dos substratos sintéticos N,N’-diacetilquitobiose (dímero),
N,N’,N’’- triacetilquitotriose (trímero) e N,N’,N’’,N’’’-tetraquitotetrose
(tetrâmero) segundo modificações do método descrito por Reissig et
al. (1955).
Procedimentos
– Adicionar 40 µL de tampão acetato 200 mM pH 5,5/10 µL de
substrato 4 mM dissolvido em água Milli-Q (N,N'-
diacetilquitobiose N,N’,N’’-triacetilquitotriose ou N,N’,N’’,N’’’-
tetraquitotetrose) e 120 µL do sobrenadante.
– Incubar a 37 °C por 1 hora.
– Adicionar 30 µL de tetraborato de sódio 0,8 M pH 9,1.
– Ferver a mistura por 3 minutos e resfriar em gelo.
– Adicionar 1 mL de DMAB (ρ-dimetilbenzaldeído 1,0% p/v/ HCl
1,25% v/v em ácido acético glacial).
– Incubar a mistura a 37 °C por 10 minutos para o desenvol‐
vimento e estabilização da coloração.
– O produto formado a partir da reação é determinado pela
medida da absorbância a 585 nm.
Obs.: uma unidade enzimática (U) é definida como a quantidade de
enzima necessária para formar 1 µmol de NAcGlc por min/mL a 37
°C.

6.3. Zonas de hidrólise em substrato

Para se verificar a hidrólise enzimática em substrato, a de‐


gradação de quitina produz um halo claro que é visualizado sob
ultravioleta, e o diâmetro das zonas de hidrólise é medido.
Procedimentos
– Preparar as placas de gel de difusão com 1,6% de agarose em
tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5,0, adicionar 0,5% da
solução de glicol quitina a 10% (TRUDEL; ASSELIN, 1989)
após temperatura de 50 °C a 60 °C.
– Depois de solidificada a solução, fazer poços (2 mm) e, em
cada poço, adicionar 10 µL do sobrenadante.
– Como padrão, utilizar marcador de quitinase Serratia
marcescens (Sigma).
– Incubar as placas a 30 °C por 16 horas.
– Realizar coloração com calcofluor (Sigma) a 0,1% (p/v) em
tampão Tris-HCL 0,5 M pH 8,9) por 10 minutos.
– Lavar as placas várias vezes em água destilada.
– Visualizar os halos de degradação de quitina sob luz ultra‐
violeta (300 nm).
6.4. Gel de atividade quitinásica

A eletroforese é em SDS-PAGE, de acordo com Laemmili (1970),


pelo método vertical com placas de 20 cm x 20 cm, com gel de
separação a 12% e gel de empilhamento a 4% com glicol quitina
0,01%. Como padrão, utiliza-se marcador de proteína de quitinase
Serratia marcescens (Sigma).
Procedimentos
– Adicionar ao sobrenadante da amostra em tampão (Tris-HCl
0,0625 M pH 6,8, SDS 2,5%, glicerol 10%, azul de bromofenol
0,001%) na proporção (1:1).
– Incubar por 30 minutos a 30 °C.
– A corrida eletroforética será a 100 V e 5 °C.
– Agitar o gel suavemente por 24 horas a 30 °C em tampão
acetato de sódio 100 mM pH 5,5.
– Corar o gel um uma solução recém-preparada de calcofluor
White M2R 0,1% em tampão Tris-HCL 0,5 M, pH 8,9 por 10
minutos.
– Descorar em água por 2 horas, a temperatura ambiente.
– Visualizar a atividade quitinolítica sob luz ultravioleta e fotodo‐
cumentar.

7. Amilase

Amilases são responsáveis pela degradação da molécula de


amido e encontram-se na natureza. O amido é encontrado principal‐
mente em sementes de cereais como milho, cevada, trigo e arroz, e
em tubérculos ou raízes como batata e mandioca cujo tamanho e
forma dos grãos são específicos para os distintos cereais
(MORAES, 2004). O amido possui em sua constituição amilose
(25%) e amilopectina (75%). Amilose é um polímero linear
constituído de cerca de 6.000 resíduos de glicose unidos por
ligações glicosídicas do tipo a-1,4. Amilopectina consiste de
pequenas cadeias laterais de 15 a 45 resíduos unidos por ligações
do tipo a-1,6 (BULÉON et al., 1998).
Segundo Gupta et al. (2003), as amilases são divididas em dois
grupos, as endoamilases e exoamilases.
As endoamilases catalisam hidrólises de forma aleatória no
interior da molécula do amido. Essa ação causa a formação de
ramos lineares de oligossacarídeos de cadeias de vários
comprimentos e dessa forma quebram as ligações glicosídicas a-1,4
presentes na parte interna (endo) das cadeias de amilose ou
amilopectina. A α-amilase (E.C. 3.2.1.1) é a endoamilase mais
conhecida. As exoamilases hidrolisam exclusivamente ligações
glicosídicas a-1, 4, como a β-amilase (E.C. 3.2.1.2) ou ambas as
ligações α-1,4 e α-1, 6, como amiloglicosidase (E.C. 3.2.1.3) e
glicosidase (E.C. 3.2.1.20). Outros exemplos de exoamilases são a
ciclodextrina glicosiltransferase (E.C. 2.4.1.19) e a a-amilase
maltogênica (glicano 1,4-a-glicanohidrolase, E.C. 3.2.1.133).

7.1. Determinação da atividade amilolítica

A atividade amilolítica poderá ser determinada por dois métodos


diferentes, utilizando amido como substrato. O primeiro,
denominado de atividade dextrinizante, baseia-se na variação da
intensidade da cor do complexo iodoamido (FUWA, 1954). O
segundo, denominado de método sacarificante, baseia-se na
produção de açúcares redutores (MILLER, 1959).

7.1.1. Atividade amilolítica dextrinizante


A quantidade de amido consumido é calculada de acordo com
uma curva padrão construída com quantidades crescentes de amido
solúvel (de 0 mg/mL a 0,5 mg/mL).
Procedimentos
- Adicionar 80 μL de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5, em
20 μL de amostra enzimática e 100 μL de solução de amido
(0,5%).
– Incubar a mistura a 50 ºC por 20 minutos.
– Interromper a reação com a adição de 200 μL de ácido acético
1,0 M e 200 μL da solução de iodo/iodeto (1% iodo em etanol
absoluto, 10% iodeto de potássio e água destilada na proporção
de 1v:1v:3v). O volume é completado para 10 mL com água
destilada.
– Homogeneizar e ler a absorbância determinada a 660 nm.
Obs.: uma unidade (U) de atividade amilolítica dextrinizante é
definida como sendo a quantidade de enzima necessária para
hidrolisar 0,1 mg de amido por minuto de reação (FUWA, 1954).

7.1.2. Atividade amilolítica sacarificante


A quantidade de açúcares redutores formados é calculada de
acordo com uma curva padrão de glicose (MILLER, 1959).
Procedimentos
– Adicionar 80 μL de tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,5, em
20 μL de amostra enzimática e 100 μL de solução de amido
(0,5%).
– Incubar a mistura a 50 ºC por aproximadamente 12 horas.
– Após este tempo, 100 μL da mistura de reação são coletados e
adicionados em tubo de ensaio contendo 1,0 mL do reagente
ácido dinitrosalicilico (10 g/L ácido dinitrosalicilico (DNS), 100
mL de NaOH 2 mM, 300 g/L de tartarato de sódio e potássio).
– A mistura é fervida por 5 minutos em banho-maria a 96 ºC.
– Homegeneizar e ler a absorbância determinada a 550 nm.
Obs.: uma unidade (U) de atividade sacarificante é definida como a
quantidade de enzima que libera 0,1 mg de açúcar redutor por
minuto de reação.

7.1.3. Determinação da atividade amilolítica em gel de


poliacrilamida
Para determinação de atividade em gel de poliacrilamida (12%),
as condições de corrida do gel são as mesmas descritas para a
técnica de eletroforese desnaturante (SDS-PAGE), conforme
Laemmli (1970), exceto para o tampão de amostra que não contém
o b-mercaptoetanol e a corrida é realizada a 4 ºC.
Procedimentos
– Concentrar as amostras por liofilização.
– As amostras concentradas são ressuspensas em tampão de
amostra 1X (50 μL de tampão Tris-HCl 0,5 mM pH 6,8, 1,0 μL b
– mercaptoetanol, 100 μL SDS 10%, 100 μL glicerol, 0,005 mg
de azul de bromofenol e água destilada suficiente para 1,0 mL).
– Ferver as amostras por 5 minutos e aplicar no gel.
– A corrida é realizada utilizando-se uma voltagem inicial de 80
V, posteriormente aumentar para 100 V.
– Utilizar marcador para a determinação da massa molecular das
proteínas.
– Após a corrida, o gel é incubado com tampão acetato de sódio
50 mM, pH 5,5 por 1 hora.
– Em seguida, transferir o gel para um recipiente contendo uma
solução de amido (0,5%).
– Incubar por 12 horas a 4 ºC.
– Após esse período, o gel é incubado por 2 horas a temperatura
de 37 ºC e coberto com uma solução de iodo-iodeto para
visualização das bandas de degradação do amido (LACKS;
SPRINGHORN, 1980).
8. Considerações finais

As enzimas têm sido utilizadas pelo ser humano a milhares de


anos de duas formas: direta, pelo emprego de extratos enzimáticos
brutos de origem animal ou vegetal, e indiretamente, pelo aprovei‐
tamento da ação enzimática decorrente do crescimento microbiano
sobre determinados substratos. A produção e o uso de enzimas de
origem microbiana, sob uma forma controlada, têm tido um maior
enfoque na indústria biotecnológica (JAEGER; EGGERT, 2002;
NEIDLEMAN, 1991).
Aproximadamente 80% das enzimas produzidas por fermen‐
tação, em escala industrial, são hidrolíticas, e quase todas são
extracelulares (ARBIGE; PITCHER, 1989). Dentre as indústrias que
utilizam enzimas em larga escala incluem-se as de alimentos
(laticínios, processamento de amido, cervejarias e padarias), de
detergentes, de couro e têxteis (NIELSEN; BORCHERT, 2000; KIRK
et al., 2002; NIELSEN et al., 2003).
O mercado mundial de enzimas é responsável por mais de 5
bilhões de dólares, sendo 2 bilhões de dólares pertencentes ao
mercado de enzimas industriais (enzimas para a indústria de
alimentos e enzimas para ração animal) e 3 bilhões de dólares ao
de enzimas especiais (enzimas terapêuticas, enzimas para
diagnósticos e enzimas para química quiral) (BON, 2006).

9. Referências

ALTAMIRANO, M. M.; BLACKBURN, J. M.; AGUAYO, C.; FERSHT, A. R. Directed evolution


of new catalytic activity using the alpha/beta-barrel scaffold. Nature, London, UK, v. 403, n.
6.770, p. 617-622, 2000.
ALVES, M. H.; CAMPOS-TAKAKI, G. M.; PORTO, A. L. F.; MILANEZ, A. I. Screening of
Mucor spp. for the production of amylase, lipase, polygalacturonase and protease. Brazilian
Journal of Microbiology, São Paulo, v. 33, n. 4, p. 225-230, 2002.
ANAGNOSTAKIS, S. L.; HANKIN, L. Use of selective media to detect enzyme production by
microorganisms in food products. Journal of Milk and Food Technology, Ames, v. 38, n. 10,
p, 570-572, 1975.
ARBIGE, M. V.; PITCHER, W. H. Industrial enzymology: a look towards the future. Trends
Biotechnology, Amsterdam, NL, v. 7, p. 330−335, 1989.
ARIFFIN, H.; ABDULLAH N.; UMI KALSOM, M. S.; SHIRAI, Y.; HASSAN, M. A. Production
and characterisation of cellulase by Bacillus pumilus Eb3. International Journal of
Engineering and Technology, Paris, FR, v. 3, n. 1, p. 47-53, 2006.
AYERS, W. A.; PAPAVIZAS, G. C.; DIEM, A. F. Polygalacturonate trans-eliminase and
polygalacturonase production by Rhizoctonia solani. Phytopathology, Corvallis, v. 56, p.
1006-1011, 1966.
BARON, A. M. Preparação e caracterização de lípases imobilizadas para utilização em
biocatálise. 2008. 120 f. Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal do Paraná,
Paraná, 2008.
BON, E. P. S. A produção de celulases no projeto bioetanol: produção de etanol por
hidrólise enzimática da biomassa da cana-de-açúcar. Guia Oficial - Simtec 2006, Piracicaba,
p. 24-24, 21 jul. 2006.
BULÉON, A. Starch granules: structure and biosintesis. Internacional journal of Biological
Macromolecules, Guildford, v. 23, p. 85-112, 1998.
CHARNEY, M. S.; TOMARELLI, R. M. A colorimetric method for the determination of the
proteolytic activity of duodenal juice. Journal of Biological Chemistry, Baltimore, v. 171, p.
501-505, 1947.
FLEURI, L. F. Produção de b-1,3 glucanases, proteases líticas e quitinases por microrganismos
e aplicação na lise de leveduras. 2003. 141 f. Dissertação (Mestrado em Ciência de
Alimentos) - Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2003.
FOLDERS, J.; ALGRA, J.; ROELOFS, M. S.: VAN LOON, L. C.; TOMMASSEN, J.; BITTER,
W. Characterization of Pseudomonas aeruginosa chitinase, a gradually secreted protein.
Journal of Bacteriology, Washington, DC, v. 183, p. 7044-7052, 2001.
FUWA, H. A new method for microdetermination of amylase activity by the use of amylose
as the substrate. The journal of Biochimistry, Washington, DC, v. 41, p. 583-603, 1954.
GILKES, N. R.; HENRISSAT, B.; KILBURN, D. G.; MILLER JÚNIOR, R. C.; WARREN, R. A.
J. Domains in microbial b-1,4-glycanases: sequence conservation, function, and enzyme
families. Microbiological Reviews, Washington, DC, v. 55, n. 2, p. 303-315, 1991.
GODFREY, T.; WEST, S. I. Introduction to industrial enzymology. In: GODFREY, T. (Ed.).
Industrial Enzymology. 2nd ed. London, UK: Macmillan Press, 1996. p. 120-138.
GOODAY, G. W. Physiology of microbial degradation of chitin and chitosan. Biodegradetion.
London, UK, v. 1, p. 177-190, 1990.
GOODAY, G. W. Aggressive and defensive roles of chitinases. EXS, Birkhauser Verlag, v.
87, p. 157–169, 1999.
GREGORIO, A.; MANDALANI, G.; ARENA, N.; NUCITA, F.; TRIPODO, M. M.; LO CURTO,
R. B.; SCP and crude pectinase production by slurry-state fermentation of lemon pulps.
Bioresource Technololy, Essex, v. 83, n. 2, p. 8994, 2002.
GUMMADI, S. N.; PANDA, T.; Purification and biochemical properties of microbial
pectinases: a review. Process Biochemistry, Watford, v. 38, p. 987-996, 2003.
GUPTA, R; MOHAPATRA, H; GOSWAMI, V. K.; CHAUHAN, B. Microbial a-Amylases:
biotechnological perspective. Process Biochemistry, Watford, jan., 2003.
HABA, E.; BRESCO, O.; FERRER, C.; MARQUES, A.; BUSQUETS, M.; MANRESA, A.
Isolation of lipase-screening bacteria by deploying used frying oil as selective substrate.
Enzyme and microbial technology, Giuldford, v. 26, p. 40-44, 2000.
HAKI, G. D; RAKSHIT, S. K. Developments in industrially important thermostable enzymes:
a review. Bioresource Technology, Essex, v. 89, p. 17-34, 2003.
HARTZELL, M. M.; HSIEH, Y. L. Enzymatic scouring to improve cotton fabric wettability.
Textiles Research Journal, New Jersey, v. 68, n. 4, p. 233-241, 1998.
HENRY, R. J.; CANNON, D. C.; WINKELMAN, J. Clinical chemistry principles an techniques.
2nd ed. New York: Harper and Row Publishers, 1974. p. 1288.
JAEGER, K .E.; DIJKSTRA, B. W.; REETZ, M. T. Bacterial Biocatalist: molecular biology,
three dimensional structures and biotechnological applications os lipases. Annual Review
Microbiology, Palo Alto, v. 53, p. 315-351, 1999.
JAEGER, K. E.; RANSAK, S.; KOCH, H. B.; FERRATO, F.; DIJKSTRA, B. W. Bacterial
lipases. FEMS Microbiology Ecology, Haren, v. 15, p. 29-63, 1994.
JAEGER, K. E.; EGGERT, T. Lipases for biotechnology. Currient Opinion Biotechnology,
London, UK, v. 13, p. 390-397, 2002.
JAERGER, K. E.; REETZ, M. T. Microbial lipases form versatile tools for biotechnology.
Trends Biotechnology, Amsterdam, NL, v. 16, p. 396-403, 1998.
KANG, S. C.; PARK, S.; LEE, D. G. Purification and characterization of a novel chitinase
from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Journal of Invertebrate
Pathology, New York, v. 73, p. 276-281, 1999.
KASHYAP, D. R.; VOHRA, P. K.; CHOPRA, S.; TEWARI, R. Applications of pectinases in
the commercial sector: a review. Bioresource Technology, Essex, v. 77, n. 3, p. 215-227,
2001.
KAUR, G.; KUMAR, S.; SATYANARAYANA, T. Production, characterization and application
of a thermostable polygalacturonase of a thermostable polygalacturonase of a thermophilic
mould Sporotrichum thermophile Aipinis. Bioresource Technology, Essex, v. 94, p. 239-243,
2004.
KIRK, O.; BORCHERT, T. V.; FUGLSANG, C. C. Industrial enzyme applications. Current
Opinion in Biotechnology, London, UK, v. 13, n. 4, p. 345-351, 2002.
KRIEGER, N. Produção, purificação e caracterização de lipases de Penicillium citrinum. 1995.
260 f. Tese (Doutorado em Ciências – Bioquímica) – Universidade Federal do Paraná,
Curitiba, 1995.
LACKS, S. A.; SPRINGHORN, S. S. Renaturation of enzymes after polyacrilamide gel
eletrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate. The Journal of Biological
Chemistry, Baltimore, v. 255, p. 7467-7473, 1980.
LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature, London, UK, v. 227, p. 680-685, 1970.
LYND, L. R.; WEIMER, P. J.; ZYL, W. H. van; PRETORIUS, I. S. Microbial cellulose
utilization: fundamentals and biotechnology. microbiology and molecular biology reviews.
American Society for Microbiology, Washington, DC, n. 3, v. 66, p. 506-577, 2002.
MANDELS, M.; ABDREOTTI, R.; ROCHE, C. Measurment of saccharifying cellulose.
Biotechnology Bioengineering Symposium, New York, v. 6, n. 1, p. 182-190, 2001.
MANFIO, G. P.; LEMOS, M. F. Microrganismos e aplicações industriais: actnomicetos na
industria. In: WORKSHOP: BIODIVERSIDADE: PERSPECTIVAS E OPORTUNIDADES
TECNOLÓGICAS, 1996, Campinas. Anais... Campinas: BDT, 1996. p. 1-9. Disponível em:
http://www.bdt.org.br/publicações/padct/bio/).
MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars.
Analytical Chemistry, Washington, DC, v. 31, p. 426-428, 1959.
MILLER, J. H. Experiments in molecular genetics. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor
Laboratory, 1974, 468 p.
MITIDIERI, S.; MARTINELLI, A. H. S.; CAMASSOLA, S.; MENGUER, P. K.; SCBRANCK,
A.; VAINSTEIN, M. H. Detergentes biológicos biodegradáveis: avaliação das formulações
do mercado. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, Brasília, DF, n. 26, p. 56-60, 2002.
MORAES, L. M. P. Amilases. In: SAID, S.; PIETRO, R. Enzimas como agentess
biotecnológicos. Ribeirão Preto: Legis Summa, 2004.
NIELSEN, R. I.; OXENBØLL, K. Enzymes from fungi: their technology and uses. Mycologist,
New York, v. 12, n. 3, p. 69-71, 1998.
NIELSEN, J.; VILLADSEN, J.; LIDÉN. G. Bioreaction Engineering Principles. 2nd ed. New
York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2003.
NIELSEN, J. E.; BORCHERT, T. V. Protein engeneering of bacterial a-amilases. Biochimica
et Biophysica Acta, Amsterdam, NL, v. 1543, p. 253-274, 2000.
NEIDLEMAN, S. L. Enzymes in the food industry: a backward glance. Food Technology,
Chicago, v. 45, p. 88-91, 1991.
PARDO, C.; LAPENA, M. A.; GACTO, M. Purification and characterization of on extracelular
exoplygalacturonase from Geotrichum lactis. Canadian Journal of Microbiology, Ottawa,
CA, v. 37, n. 12, p. 974-977, 1991.
PITT, M.; Pectin lyase from Phoma medicaginis var. pinodella. In: Methods Enzymology,
New York, v. 161, p. 350-354, 1988.
RAO, M. B.; TANKSALE, A. M.; GHATGE, M. S.; DESHPANDE, V. V. Molecular and
Biotechnological Aspects of Microbial Proteases. Microbiology and Molecular of Biology
Reviews, Washington, DC, v. 62, n. 3, p. 596-635, 1998.
RAZAK, N. A.; SAMAD, M. Y. A.; BASRI, M.; YUNUS, W. M. Z. W.; AMPON, K.; SALLEH,
A. B. Thermostable extracellular protease of Bacillus stearothermophilus: factors affecting
its production. World Journal of Microbiology and Biotechnology, Oxford, v. 10, p. 260-263,
1994.
REISSIG, J. L.; STROMINGER, J. L.; LELOIS, L. F. A modified colorimetric method for the
estimation of N-acetylaminosugar. Journal of Biological Chemistry, Baltimore, v. 217, n. 2, p.
959-966, 1955.
ROBSON, L. M.; CHAMBLISS, G. H. Cellulases of bacterial origin. Enzyme and Microbial
Technology, Guildford, v. 11, p. 626-644, 1989.
SANDHU, D. K.; WADHWA, V.; BAGGA, P. S. Use of lytic enzymes for protoplast
production in Trichoderma reesei QM9414. Enzyme and Microbial Technology, Guildford, v.
11, p. 21-25, 1989.
SANOMIYA, L. T.; NAHAS, E. Microorganismos produtores de hidrolases envolvidos nas
transformações dos compostos do carbono e do nitrogênio do solo. Ciência Rural, Santa
Maria, v. 33, n. 5, p. 835-842, 2003
SOMMER, P.; BORMANN, C.; GOTZ, F., Genetic and biochemical characterization of a new
extracellular lipase from Streptomyces cinnamomeus. Applied Environmental Microbiology,
Washington, DC, v. 63, p. 3553–3560, 1997.
SOUZA, J. V. B.; SILVA, E. S.; MAIA, M. L. S.; TEIXEIRA, M. F. S Screening of fungal
strains for pectinolytic activity: endopolygalacturonase production by Peacilomyces
clavisporus 2A.UMIDA.1. Process Biochemistry, Watford, v. 39, p. 455-458, 2003.
STAMFORD, T. L. M.; ARAÚJO, J. M.; STAMFORD, N. P. Atividade enzimática de
microorganismos isolados do jacatupé (Pachyrhizus erosus L. Urban). Ciência e Tecnologia
de Alimentos, Campinas, v. 18, n. 4, p. 382-385, 1998.
STRAUS, M. L. A.; JOLLY, N. P.; LAMBRECHIS, M. G.; RENSBURG, P. van. Screening for
the production of extracellular hudrolytic enzymes by non-Saccharomyces wine yeasts.
Journal of Applied Microbiology, Danvers, v. 91, n. 1, p. 182-190, 2001.
TRACHUK, L. A.; REVINA, L. P.; SHEMYAKINA, T. M.; CHESTUKHINA, G. G.;
STEPANOV, V. M. Chitinases of Bacillus licheniformis B-6839: isolation and properties.
Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, CA, v. 42, p. 307-315, 1996.
TRUDEL, J.; ASSELIN, A. Detection of chitinase activity after polyacrilamide gel
eletrophoresis. Analytical Biochemistry, San Diego, v. 178, p. 362-366, 1989.
TZANOV, T.; CALAFELL, M.; GÜBITZ, G. M.; CAVACO-PAULO, A. Biopreparation of cotton
fabrics. Enzyme Microbioal Technology, v. 29, n. 6-7, p. 357-362, 2001.
VANBEILEN, J. B. Enzyme technology: an overview. Current Opinion in Biotechnology,
London, UK, v. 14, n. 4, p. 338-344, 2002.
WATANABE, N.; OTA, Y.; MINODA, Y.; YAMADA, K. Isolation and identification of alkaline
lipase producing microorganismos, cultural conditions and some properties. Agricultural
Biology and Chemistry, Tokyo, JP, v. 41,
p. 1353-1358, 1977.
WOOD, T. M.; BHAT, K. M. Methods for measuring cellulase activities. Methods in
Enzymology, New York, v. 160, p. 87-112, 1988.
WINKLER, U. K. E.; STUCKMANN, M. Glycogen, Hyaluronate, and some other
polysaccharides greatly enhance the formation of exolipase by Serratia marcescens.
Journal of Bacteriology, Washington, DC. v. 3, p. 663-670, 1979.
Capítulo 4
Avaliação da atividade enzimática
em amostras de solo
Wanderley José de Melo
Gabriel Maurício Peruca de Melo
Ademir Sérgio Ferreira de Araújo
Valéria Peruca de Melo

1. Introdução

O solo é um dos sistemas mais complexos do planeta e está


constantemente recebendo e perdendo constituintes os mais varia‐
dos possíveis.
Em um sistema natural em equilíbrio, as plantas estão continua‐
mente retirando água e nutrientes do solo e, por meio da energia
solar, do gás carbônico presente na atmosfera e das vias
metabólicas C3 e C4, sintetizam substâncias orgânicas diversas,
que são incorporadas ao solo pela queda de folhas, de galhos e de
exudatos radiculares. A água da chuva, escorrendo pelas folhas,
caules e troncos, leva ao solo substâncias particuladas em
suspensão na atmosfera ou depositadas na superfície das folhas. E
esse conjunto de substâncias que chega ao solo permite o
desenvolvimento de uma gama de macro, meso e microrganismos,
que ao usarem as fontes de C e de energia promovem a ciclagem
dos elementos. É isso que permite a ocorrência da exuberante
Floresta Amazônica sobre um solo pobre e ácido.
Os microrganismos que habitam o solo estão em constante
disputa por água, nutrientes, fontes de carbono e de energia. Para
sobreviverem, produzem e excretam substâncias como antibióticos
e enzimas. Os antibióticos garantem a disputa pelo espaço,
enquanto as enzimas catalisam a hidrólise de macromoléculas para
sua absorção.
O homem, por meio de suas atividades, também leva ao solo
substâncias que podem melhorar suas propriedades físicas,
químicas e biológicas (impacto positivo) ou causar poluição e
contaminação (impacto negativo), como metais pesados e produtos
orgânicos tóxicos e muitas vezes de difícil degradação.
Para avaliar o nível de qualidade de um solo, tem-se buscado
índices de qualidade que possam refletir alterações em função das
atividades antrópicas. Entre os atributos utilizados está a atividade
enzimática, que é rapidamente alterada em resposta a variações
nas propriedades do solo.
Neste capítulo, far-se-á uma abordagem bastante prática sobre
as metodologias para avaliação da atividade das enzimas mais
frequentemente usadas como atributo de qualidade do solo.

2. Celulase (EC 3.2.1.4 b-glucan-4-


glucanoidrolase)

2.1. Comentários

A celulose é um homopolissacarídeo formado por n moléculas de


glicose em ligação glicosídica b 1,4. Pelo fato de ser uma molécula
muito grande, possui poucas extremidades redutoras, sendo
considerada como um carboidrato não redutor, ou seja, não é capaz
de reduzir o cobre do licor de Fehling.
A celulase é uma enzima que catalisa a hidrólise da celulose em
unidades de celobiose, que é um dissacarídeo formado por
unidades de glicose em ligação glicosídica b 1,4. A celobiose é
posteriormente hidrolisada pela b-glicosidase, de tal modo que a
hidrólise total da celulose resulta em muitas moléculas de glicose.
Tanto a glicose como a celobiose são capazes de reduzir o cobre do
licor de Fehling, formando um precipitado de cor vermelho-tijolo, que
é o óxido cuproso.
O princípio do método para estimar a atividade de celulase no
solo é o da incubação da amostra de solo com o substrato da
enzima (a celulose ou um substrato derivado, como a
carboximetilcelulose), avaliando-se, então, a quantidade de
açúcares redutores produzidos, expressos na forma de glicose
(PANCHOLY; RICE, 1973).

2.2. Reagentes

Solução padrão de glicose a 50 mg/L: pesar 2,00 g de glicose


previamente seca a 70 oC e colocar em béquer de 500 mL.
Adicionar cerca de 150 mL de água desionizada e dissolver.
Transferir para balão volumétrico de 200 mL e completar o volume
com a água desionizada. Pipetar 1 mL desta solução para balão
volumétrico de 200 mL e completar o volume com água desionizada.
Solução de carboximetilcelulose (CMC) a 1%: pesar 1 g de
carboximetilcelulose, colocar em béquer de 250 mL e adicionar
cerca de 80 mL de água desionizada. Aquecer em bico de bunsen
até dissolução. Deixar atingir temperatura ambiente, transferir para
balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água
desionizada.
Tampão acetato-fosfato 0,5 mol/L, pH 5,5: pesar 73,1733 g de
fosfato bibásico de sódio anidro (Na2HPO4) e colocar em béquer de
1.000 mL. Adicionar cerca de 700 mL de água desionizada e
dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar
o volume com água desionizada. Pipetar 28,90 mL de ácido acético
para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água
desionizada. Misturar as duas soluções em partes iguais no
momento de usar.
O reagente de cobre é constituído de três soluções, aqui
denominadas A, B e C, preparadas conforme descrito a seguir.
Solução A: pesar 50,00 g de carbonato de sódio anidro e colocar
em béquer de 1.000 mL. Adicionar 60 mL de solução de NaOH 1
mol/L e 700 mL de água desionizada. Dissolver, transferir para balão
volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água
desionizada.
Solução B: pesar 0,50 g de sulfato de cobre pentaidratado e
colocar em béquer de 250 mL. Adicionar 80 mL de água
desionizada, dissolver, transferir para balão volumétrico de 100 mL e
completar o volume com água desionizada.
Solução C: pesar 1,00 g de tartarato duplo de sódio e potássio e
colocar em béquer de 250 mL. Adicionar 80 mL de água
desionizada, dissolver, transferir para balão volumétrico de 100 mL e
completar o volume com água desionizada.
Reagente de cobre: misturar, no momento de usar, 500 mL da
solução A, 10 mL da solução B e 10 mL da solução C.
Solução de ácido fosfomolíbdio: em béquer de 1.000 mL, colocar
35,00 g de ácido molíbdico, 5,00 g de tungstato de sódio, 200 mL de
solução de hidróxido de sódio 10% e 200 mL de água desionizada.
Ferver por 20 a 40 minutos até remoção de toda amônia. Deixar
atingir temperatura ambiente e adicionar água desionizada até
volume de aproximadamente 350 mL. Adicionar 125 mL de ácido
fosfórico 85%. Deixar atingir temperatura ambiente, transferir para
balão volumétrico de 500 mL e completar o volume com água
desionizada. Essa solução deve ser armazenada em frasco escuro.

2.3. Curva de calibração

Em 7 tubos de ensaio colocar, respectivamente, 0, 0,2 mL, 0,4


mL, 0,8 mL, 1,2 mL, 1,6 mL e 2,0 mL da solução padrão de glicose e
completar o volume a 2,0 mL com água desionizada.
Adicionar a cada tubo 1 mL do reagente de cobre.
Vedar a boca do tubo de ensaio com papel laminado e colocar
em banho-maria em ebulição por 20 minutos.
Deixar atingir temperatura ambiente e adicionar 2 mL da solução
de ácido fosfomolíbdico.
Agitar intermitentemente até que cesse a efervescência.
Adicionar 2 mL de água desionizada, agitar, deixar em repouso
por 15 minutos e realizar a leitura da absorbância em comprimento
de onda de 420 nm.
Repetir este protocolo por mais duas vezes, de modo a obter a
curva de calibração com três repetições.
Aos resultados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a
obter a equação relacionando absorbância (eixo Y) com a concen‐
tração de glicose em mg/L (eixo X).

2.4. Marcha analítica

Pesar 10,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em


peneira de 2 mm, colocar em frasco Erlenmeyer de 125 mL e adicio‐
nar 1 mL de toluol.
Agitar e deixar 15 minutos em repouso.
Adicionar 10 mL da solução de CMC a 1%, 10 mL da solução
tampão acetato-fosfato e agitar.
Colocar para incubação a 30 oC por 24 horas.
Adicionar 30 mL de água desionizada, agitar e centrifugar por 10
minutos a 5.000 rpm.
Pipetar 2 mL do sobrenadante para tubo de ensaio e adicionar 1
mL do reagente de cobre.
Vedar a boca do tubo de ensaio com papel laminado e colocar
em banho-maria em ebulição por 20 minutos.
Deixar atingir temperatura ambiente e adicionar 2 mL da solução
de ácido fosfomolíbdico.
Agitar intermitentemente até que cesse a efervescência.
Adicionar 2 mL de água desionizada, agitar, deixar em repouso
por 15 minutos e realizar a leitura da absorbância em comprimento
de onda de 420 nm.
Fazer um branco para cada amostra de solo, seguindo a mesma
marcha analítica acima descrita, porém adicionando a solução de
CMC após o período de incubação.

2.5. Cálculos

A equação para cálculo da atividade de celulase é dada a seguir:

em que
At = atividade de celulase, expressa em mg de glicose por kg de
TFSE e por hora; Vs = volume, em mL, da solução de CMC; Vt =
volume, em mL, da solução tampão; Vh = volume, em mL, de água
desionizada adicionada após o período de incubação; Aa =
absorbância da amostra; Ab = absorbância do branco; b = constante
da equação da curva de calibração; Fc = fator de conversão de
umidade para TFSE; a = coeficiente angular da equação da curva
de calibração; m = massa, em gramas, de solo usada na
determinação da atividade enzimática; t = tempo de incubação, em
horas.

3. Amilases (EC 3.2.1)


3.1. Comentários

A denominação amilase inclui um conjunto de enzimas que


catalisam a hidrólise do amido até unidades de glicose.
O amido é um homopolissacarídeo formado por dois tipos de
biomoléculas, a amilose, formada por muitas unidades de glicose
unidas pela ligação glicosídica a-1,4, e a amilopectina, formada por
unidades de glicose em ligação glicosídica a-1,4 e a-1,6. Do mesmo
modo que a celulose, não é um açúcar redutor.
No solo, sob a ação de enzimas chamadas de amilases, as
ligações glicosídicas da molécula de amido são hidrolisadas,
liberando unidades de maltose e, no estádio final de hidrólise,
moléculas de glicose. Assim, após a hidrólise, o amido transforma-
se em açúcar redutor.
Há vários tipos de amilase, cada um promovendo a quebra da
molécula em posições diferentes. As a-amilases ou endoamilases
hidrolisam as ligações glicosídicas a-1,4 ao acaso, mas não são
capazes de hidrolisar a ligação glicosídica a-1,6. Da sua ação
resulta a liberação de uma mistura de glicose, maltose, maltotriose e
dextrinas limites. As b-amilases removem unidades de maltose
(duas glicoses em ligação glicosídica a-1,4) a partir de uma
extremidade não redutora. Também não conseguem hidrolisar a
ligação glicosídica a-1,6. Outras enzimas que hidrolisam o amido
são as γ-amilases, fosforilases, enzima R e amilo-1,6-glicosidase (as
duas últimas são capazes de promover a hidrólise da ligação
glicosídica a-1,6).
Melo et al. (1983) adaptaram a metodologia para avaliação da
atividade de amilases para solos da ordem Latossolos.
O princípio do método para avaliar a atividade de amilases no
solo é a incubação de uma amostra de solo com o substrato da
enzima, o amido, determinando a quantidade de açúcares redutores
produzida.
A atividade de amilases diminui quando a amostra de solo é seca
ao ar e durante armazenamento sob temperatura ambiente (21 oC)
ou a -20 oC.

3.2. Reagentes

Solução tampão acetato-fosfato 0,5 mol/L, pH 5,5: ver item 2.2.


Solução de amido a 1%: pesar 10,00 g de amido solúvel (amido
de batata não serve) e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar
cerca de 800 mL de água desionizada e aquecer em bico de bunsen
até que o amido forme uma solução. Aguardar atingir temperatura
ambiente, transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar
o volume com água desionizada.

3.3. Curva de calibração

A curva de calibração para determinação da atividade de amila‐


ses é a mesma acima descrita para a determinação da atividade da
celulase (ver item 2.3).

3.4. Marcha analítica

Pesar 10,00 g de solo recém-obtida, passada em peneira de 2


mm, colocar em béquer de 125 mL e adicionar 2,5 mL de toluol,
uniformemente distribuído na amostra.
Deixar em repouso por 15 minutos em temperatura ambiente.
Adicionar 20 mL da solução tampão acetato-fosfato 0,5 mol/L, pH
5,5, e 20 mL da solução de amido 1%.
Vedar a boca do Erlenmeyer com papel laminado e colocar para
incubação a 30 oC por 24 horas.
Adicionar 20 mL de água desionizada.
Filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou similar e determinar o
teor de açúcares redutores em 2 mL de extrato pelo método de
Somogyi & Nelson, conforme acima descrito para determinação da
atividade de celulase (ver item 2.4).
Para cada amostra de solo, desenvolver um branco, adicionando
a solução de amido após o período de incubação.

3.5. Cálculos

A equação para cálculo da atividade de amilases é dada a


seguir:

em que
At = atividade de amilases, expressa em mg de glicose por kg de
TFSE e por hora; Vs = volume, em mL, da solução de amido; Vt =
volume, em mL, da solução tampão; Aa = absorbância da amostra;
Ab = absorbância do branco; b = constante da curva de calibração;
Fc = fator de conversão de umidade para TFSE; a = coeficiente
angular da curva de calibração; m = massa, em gramas, de solo
usada na determinação da atividade enzimática; t = tempo de
incubação, em horas.

4. Arilsulfatases (EC 3.1.6.1 arilsulfato


sulfohidrolase)

4.1. Comentários
As arilsulfatases constituem um grupo de enzimas que catalisam
a hidrólise da ligação éster de sulfato ligado ao radical aril.
A atividade de arilsulfatases correlaciona-se positivamente com o
teor de matéria orgânica, mas não com o teor de enxofre.
O método para estimar a atividade de arilsulfatases de uma
amostra de solo consiste na incubação desta com um substrato
artificial, o p-nitrofenilsulfato de potássio, e um inibidor de
crescimento microbiano, o toluol. Após o período de incubação,
determina-se o teor de p-nitrofenol liberado, substância que
apresenta coloração amarela.
A solução de p-nitrofenilsulfato de potássio é incolor, enquanto a
solução de p-nitrofenol apresenta cor amarela, o que permite leitura
direta em espectrofotômetro. Tabatabai e Bremner (1970) desenvol‐
veram uma metodologia para determinação da atividade de
arilsulfatases em amostras de solo com base neste princípio.
A atividade de arilsulfatase aumenta quando a amostra recém-
obtida é seca a 22 oC–24 oC.

4.2. Reagentes

Solução de p-nitrofenil sulfato de potássio 25 mmol/L: pesar


0,312 g de p-nitrofenil sulfato de potássio e colocar em béquer de
100 mL. Dissolver com cerca de 30 mL de tampão acetato 0,5
mol/L, pH 5,8. Transferir para balão volumétrico de 50 mL e
completar o volume com tampão acetato. Essa solução pode ser
armazenada em geladeira por 1 semana.
Solução de cloreto de cálcio 0,5 mol/L: pesar 73,50 g de
CaCl2.2H2O e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de
500 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para balão
volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água
desionizada.
Solução de hidróxido de sódio 0,5 mol/L: pesar 20,00 g de NaOH
e colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 500 mL de
água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de
1.000 mL e completar o volume com água desionizada.
Solução padrão de p-nitrofenol (PNF) 10 µg/mL: pipetar 10 mL
de uma solução de p-nitrofenol 0,1% para balão volumétrico de 100
mL e completar o volume com água desionizada. Armazenar a 4 oC.
Solução tampão ácido acético-acetato 0,5 mol/L, pH 5,8: pesar
68,00 g de acetato de sódio tri-hidratado e colocar em béquer de
1.000 mL. Adicionar cerca de 700 mL de água desionizada e ajustar
o pH com ácido acético concentrado. Transferir para balão
volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água
desionizada.

4.3. Curva de calibração

Em 6 tubos de ensaio adicionar, respectivamente, 0, 0,5 mL, 1,0


mL, 1,5 mL, 2,0 mL e 2,5 mL da solução de PNF 10 µg/mL e
completar o volume a 5,0 mL com a solução tampão.
Adicionar a cada tubo 0,25 mL de toluol, 1 mL da solução de
CaCl2.2H2O 0,5 mol/L e 4 mL da solução de NaOH 0,5 mol/L.
Agitar por alguns segundos e filtrar em papel de filtro Whatman
n° 1 ou similar.
Ler a absorbância em comprimento de onda de 400 nm.
Repetir esse protocolo por mais duas vezes, de modo a obter
uma curva de calibração com três repetições.
Aos dados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a se obter
a equação, relacionando concentração de p-nitrofenol em µg/mL
(eixo X) com absorbância (Y).

4.4. Marcha analítica


Pesar 1,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em
peneira de 2 mm, e colocar em Erlenmeyer de 125 mL.
Adicionar 4 mL da solução tampão acetato, 0,25 mL de toluol e 1
mL da solução de p-nitrofenil sulfato de potássio 25 mmol/L.
Agitar para homogeneização, vedar a boca do Erlenmeyer com
papel laminado e incubar a 37 oC por 1 hora.
Retirar da estufa, adicionar 1 mL da solução de cloreto de cálcio
0,5 mol/L e 4 mL da solução de hidróxido de sódio 0,5 mol/L.
Agitar por alguns segundos e filtrar em papel de filtro Whatman
n° 1 ou similar.
Proceder à leitura da absorbância em comprimento de onda de
400 nm.
Para cada amostra de solo deve ser feito um branco, aplicando-
se a mesma sequência acima descrita, sendo a solução de p-
nitrofenil sulfato de potássio (substrato) adicionada ao Erlenmeyer
após o período de incubação.

4.5. Cálculos

A equação para cálculo da atividade da arilsulfatases é dada a


seguir:

em que
At = atividade de arilsulfatases, expressa em mg de PNF por kg
TFSE e por hora; Vt = volume, em mL, da solução tampão; Vs =
volume, em mL, da solução de p-nitrofenil sulfato de potássio; Vc =
volume, em mL, da solução de CaCl2.2H2O; Vh = volume, em mL, da
solução de NaOH; Aa = leitura da absorbância da amostra; Ab =
leitura da absorbância do branco; b = constante da equação da
curva de calibração; Fc = fator de correção de umidade para TFSE;
m = massa, em gramas, de solo usada para determinação da
atividade enzimática; t = tempo de incubação, em horas; a =
coeficiente angular da equação da curva de calibração.

5. Urease (EC 3.5.1.5 ureia amidohidrolase)

5.1. Comentários

A urease é uma enzima que catalisa a hidrólise da molécula de


ureia com produção de amônia e gás carbônico.
É uma enzima de grande importância no solo, ao se considerar
que a ureia é hoje uma das principais formas de fertilizante nitroge‐
nado. Se a atividade da urease for alta, há formação rápida de
amônia, que pode ser perdida para a atmosfera se não for adsorvida
pelo complexo coloidal do solo. No solo, a amônia vai se transformar
no íon amônio, que pode ser absorvido pelas plantas ou nitificado,
correndo o risco de se perder por lixiviação. Se a atividade ureolítica
for baixa, a produção de N-amoniacal pode ser menor que as
exigências nutricionais da planta.
A urease é uma enzima relativamente persistente no solo. Alguns
autores admitem que isso se deve ao fato de ficar protegida da ação
de outras proteases por permanecer no interior de agregados do
solo, onde o substrato (ureia) consegue penetrar, mas não molé‐
culas de maior peso, que é o caso das proteases. Alguns autores
têm encontrado que a secagem ao ar da amostra de solo (22 oC por
48 horas) ou em estufa (55 oC por 24 horas) e que o
armazenamento de amostras secas ao ar em temperatura ambiente
por até 1 ano não afetam a atividade da enzima de modo
significativo.
O princípio do método modificado por Longo e Melo (2005) para
avaliação da atividade de urease em amostras de solo consiste na
incubação da amostra em presença de ureia e determinação do N-
amoniacal liberado.

5.2. Reagentes

Solução de ureia 3,5 g/L: pesar 3,5 g de ureia e colocar em


béquer de 1.000 mL. Dissolver em cerca de 800 mL de água
desionizada, transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e
completar o volume com água desionizada.
Solução de cloreto de potássio 2 mol/L: pesar 149,00 g de KCl
p.a. e colocar em béquer de 600 mL. Adicionar cerca de 400 mL de
água desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de
1.000 mL e completar o volume com água desionizada.
Solução de ácido bórico com indicadores vermelho de metila e
verde de bromocresol: pesar 20,00 g de ácido bórico e colocar em
béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 600 mL de água
desionizada. Aquecer em bico de bunsen até total dissolução.
Aguardar atingir temperatura ambiente e transferir para balão
volumétrico de 1.000 mL. Adicionar 200 mL de etanol, 6,6 mL de
solução alcoólica de vermelho de metila 0,1%, 13,2 mL de solução
alcoólica de verde de bromocresol 0,1% e 2,5 mL de solução de
NaOH 0,05 mol/L. Completar volume com água desionizada. A
solução apresenta coloração vermelho-escura.
Solução alcoólica de vermelho de metila 0,1% (m/v): pesar
0,0500 g de vermelho de metila p.a. e colocar em béquer de 50 mL.
Adicionar cerca de 30 mL de álcool etílico (etanol) p.a. e dissolver.
Transferir para balão volumétrico de 50 mL e completar volume com
etanol p.a.
Solução padrão de carbonato de sódio 0,1 mol/L: pesar 10,5990
g de carbonato de sódio anidro p.a. previamente seco e colocar em
béquer de 600 mL. Adicionar cerca de 500 mL de água desionizada
e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e
completar o volume com água desionizada.
Solução padrão de ácido sulfúrico 0,1 mol/L: adicionar cerca de
300 mL de água desionizada a um béquer de 600 mL. Adicionar ao
béquer, cuidadosamente, 5,54 mL de H2SO4 p.a. (d = 1,84 g/L,
pureza = 96%). Aguardar atingir temperatura ambiente e transferir
para balão volumétrico de 1.000 mL. Completar o volume com água
desionizada. Pipetar 25 mL da solução padrão de carbonato de
sódio 0,1 mol/L para béquer de 100 mL. Adicionar 1 mL da solução
alcoólica de vermelho de metila 0,1% (m/v). Colocar a solução de
ácido sulfúrico a ser padronizada em uma bureta de 50 mL.
Adicionar, gota a gota, sob agitação a frio, a solução de ácido
sulfúrico a ser padronizada ao béquer contendo a solução de
carbonato de sódio, até que a solução fique levemente vermelha. A
concentração da solução de H2SO4, expressa em mol/L, será
calculada pela equação M = VcxNc/Va, em que M = concentração
do ácido em mol/L, Vc = volume, em mL, da solução de carbonato
de sódio, Nc = concentração da solução de carbonato de sódio em
mol/L, Va = volume, em mL, da solução de H2SO4 gasto na titulação.
Solução padrão de ácido sulfúrico 0,01 mol/L: pipetar 10 mL da
solução padrão de H2SO4 0,1 mol/L para balão volumétrico de 100
mL e completar o volume com água desionizada.

5.3. Marcha analítica

Pesar 30,00 g da amostra de solo recém-obtida, passada em


peneira de 2 mm, e colocar em frasco Erlenmeyer de 125 mL.
Adicionar 0,5 mL de toluol, homogeneizar e deixar 5 minutos em
repouso.
Adicionar 12 mL de água desionizada e incubar por 10 minutos a
30 C.
o

Retirar da incubadora e adicionar 3 mL da solução de ureia 3,5


g/L.
Vedar a boca do Erlenmeyer com papel laminado e voltar à
incubadora por 1 hora.
Retirar da incubadora, adicionar 15 mL da solução de KCl 2
mol/L, contendo acetato de fenil mercúrio, agitar por 5 minutos e
filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou similar.
Pipetar 10 mL do filtrado para a câmara de destilação do micro‐
destilador Kjeldahl e proceder à determinação do teor de N-
amoniacal por destilação a vapor (BREMNER; KEENEY, 1965) ou
outro método disponível.
Para cada amostra de solo, desenvolver um branco, da mesma
forma acima descrita, adicionando-se a solução de ureia após o
período de incubação.

5.4. Cálculos

A equação para cálculo da atividade de urease no solo é dada


por

em que
At = atividade de urease, expressa em mg N-NH4 por kg de TFSE
por hora; N = normalidade da solução de ácido sulfúrico usada na
titulação do destilado; Vh = volume, em mL, de água desionizada;
Vs = volume, em mL, da solução de ureia; Ve = volume, em mL, da
solução de KCl; Va = volume, em mL, da solução de ácido sulfúrico
gasto na titulação da amostra; Vb = volume, em mL, da solução de
ácido sulfúrico gasto na titulação do branco; Fc = fator de correção
de umidade para TFSE; m = massa, em gramas, de solo usada na
incubação; Vd = volume, em mL, do extrato usado para destilação; t
= tempo de incubação, em horas.

6. Proteases

6.1. Comentários

Proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de proteínas,


liberando, no estádio final de hidrólise, uma mistura de aminoácidos.
Os aminoácidos liberados são passíveis de sofrer desaminação,
liberando o nitrogênio na forma amoniacal. Assim, a hidrólise das
proteínas constitui o primeiro passo na mineralização do nitrogênio
proteico que chega ao solo pela incorporação dos restos culturais,
fertilizantes orgânicos ou pela morte de organismos.
Para se estimar a atividade de proteases em uma amostra de
solo, pode-se incubá-la, na presença de toluol, com um substrato
natural, como a caseína, ou com um substrato sintético, como o
Bapna (benzoilarginina p-nitroanilida).
O princípio do método que faz uso de substrato natural consiste
na avaliação do aminoácido tirosina, liberada durante o período de
incubação, pela reação com o reagente de Folin-Ciocateau (cor
amarela), que dá origem à formação de um complexo de cor azul.
Quando o substrato é o Bapna (incolor), o princípio do método
consiste na avaliação do p-nitrofenol, liberado durante o período de
incubação, o qual apresenta cor amarela e cuja concentração pode
ser facilmente determinada pela leitura da absorbância.

6.2. Reagentes

Solução padrão de tirosina 500 mg/L: pesar 0,050 g de tirosina e


colocar em béquer de 250 mL. Adicionar 80 mL de tampão Tris,
dissolver, transferir para balão volumétrico de 100 mL e completar o
volume com tampão Tris.
Solução de caseinato de sódio 2%: pesar 10,00 g de caseinato
de sódio e colocar em béquer de 500 mL. Adicionar 200 mL de
tampão Tris. Acertar o pH para 8,1 com solução de NaOH. Transferir
para balão volumétrico de 500 mL e completar o volume com água
desionizada.
Solução tampão Tris 50 mmol/L, pH 8,1: pesar 6,05 g de Tris e
colocar em béquer de 1.000 mL. Adicionar 700 mL de água desio‐
nizada e dissolver. Acertar o pH para 8,1 com solução de NaOH ou
HCl. Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o
volume com água desionizada.
Solução de ácido tricloroacético (TCA) 15%: pesar 75,00 g de
TCA e colocar em béquer de 500 mL. Adicionar 300 mL de água
desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 500 mL
e completar o volume com água desionizada.
O reagente alcalino é constituído de três soluções, aqui deno‐
minadas A, B e C, preparadas conforme descrito a seguir.
Solução A: pesar 50,00 g de carbonato de sódio anidro e colocar
em béquer de 1.000 mL. Adicionar 60 mL de solução de NaOH 1
mol/L e 700 mL de água desionizada. Dissolver, transferir para balão
volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água
desionizada.
Solução B: pesar 0,50 g de CuSO4.5H2O e colocar em béquer de
250 mL. Adicionar 80 mL de água desionizada, dissolver, transferir
para balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água
desionizada.
Solução C: pesar 1,00 g de tartarato duplo de sódio e potássio e
colocar em béquer de 250 mL. Adicionar 80 mL de água
desionizada, dissolver, transferir para balão volumétrico de 100 mL e
completar o volume com água desionizada.
O reagente alcalino deve ser preparado no momento de usar,
colocando em béquer de 1.000 mL e homogeneizando 500 mL da
solução A, 10 mL da solução B e 10 mL da solução C.
Reagente Folin-Ciocateau 33%: pipetar 167 mL de reagente de
Folin, adquirido no mercado, para balão volumétrico de 500 mL e
completar o volume com água desionizada.

6.3. Curva de calibração

A 7 tubos de ensaio adicionar, respectivamente, 0, 0,1 mL, 0,2


mL, 0,4 mL, 0,7 mL, 1,4 mL e 2,1 mL da solução de tirosina 500
mg/L e completar o volume a 10 mL com solução tampão Tris.
Adicionar a cada tubo 5 mL da solução de caseína e 5 mL da
solução de TCA.
Agitar, filtrar para tubos de ensaio por meio de papel de filtro
Whatman n° 1 ou similar, adicionar 7,5 mL do reagente alcalino e
deixar em repouso em temperatura ambiente por 15 minutos.
Adicionar 5 mL do reagente de Folin 33%, agitar e deixar em
repouso por 1 hora.
Ler a absorbância em comprimento de onda de 700 nm.
Repetir esse protocolo por mais duas vezes, de modo a obter a
curva de calibração com três repetições.
Aos dados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a se obter
a equação, relacionando concentração de tirosina em mg/L (eixo X)
com absorbância (eixo Y).

6.4. Marcha analítica

Pesar 1,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em


peneira de 2 mm, e colocar em frasco Erlenmeyer de 250 mL.
Adicionar 5 mL da solução tampão Tris, 5 mL da solução de
caseinato de sódio e incubar, sob agitação, por 2 horas a 50 oC.
Adicionar 50 mL da solução de TCA, agitar manualmente e filtrar
para tubo de ensaio, utilizando-se papel de filtro Whatman n° 1 ou
similar.
Adicionar 7,5 mL do reagente alcalino e deixar em repouso em
temperatura ambiente por 15 minutos.
Adicionar 5 mL do reagente de Folin 33%, deixar em repouso por
1 hora e ler a absorbância em comprimento de onda de 700 nm.

6.5. Cálculos

A fórmula para cálculo da atividade de proteases é dada pela


equação a seguir:

em que
At = atividade de proteases, expressa em mg de tirosina por kg de
TFSE por hora; Vt = volume, em mL, da solução tampão; Vs =
volume, em mL, da solução de caseinato de sódio; Vp = volume, em
mL, da solução de TCA; Aa = absorbância da amostra; Ab =
absorbância do branco; b = constante da equação da curva de
calibração; a = coeficiente angular da equação da curva de
calibração. Fc = fator de conversão de umidade para TFSE; m =
massa, em gramas, da amostra de solo; t = tempo de incubação, em
horas.
7. Fosfatases

7.1. Comentários

As enzimas genericamente chamadas de fosfatases catalisam a


hidrólise da ligação éster de fosfato. Há três grupos de fosfatases,
de acordo com o tipo de ligação fosfórica que hidrolisam:
fosfomonoesterases, fosfodiesterases e fosfotriesterases.
As fosfomonoesterases (EC 3.1.3) recebem nomes vulgares de
acordo com o substrato sobre o qual atuam (fitase, nucleotidase,
açúcar fosfatase, glicerofosfatase) e catalisam a seguinte reação:

R - O - PO2-3 + H2O → HPO2-4 + R - OH


As nucleases, que catalisam a hidrólise dos ácidos nucleicos
para seus nucleotídeos, e as fosfolipases, que catalisam a hidrólise
dos fosfolipídeos, pertencem ao grupo das diéster fosfórico
hidrolases (EC 3.1.4). Ao grupo das triéster fosfórico hidrolases (EC
3.1.5) pertencem as enzimas que atuam sobre grupos fosforil,
contendo anidrido (EC 3.6.1) e as que atuam sobre a ligação P-N,
caso das fosfoamidases (EC 3.9.1.1).
As fosfomonoesterases têm sido muito estudadas, pois trans‐
formam o fósforo orgânico em inorgânico, que pode ser absorvido
pelas plantas. As enzimas desse grupo classificam-se em ácidas,
neutras e alcalinas, dependendo do pH ótimo para a hidrólise. Tanto
as fosfatases ácidas (pH ótimo = 4,0–6,5) como as alcalinas (pH
ótimo = 9,0–10,0) têm sido encontradas no solo.
O princípio do método para avaliar a atividade das fosfomonoes‐
terases em amostras de solo consiste em determinar o teor de p-
nitrofenol (cor amarela) liberado durante a incubação das amostras
com o substrato p-nitrofenilfosfato de sódio (incolor), segundo
metodologia desenvolvida por Eivazi e Tabatabai (1977).
O uso do p-nitrofenilfosfato de sódio como substrato deve ser
cauteloso em solos ácidos, pois o p-nitrofenilfosfato de sódio é
rapidamente hidrolisado a p-nitrofenol. Em solos ricos em matéria
orgânica ou em Fe e Al extraíveis, pode ocorrer extração incompleta
do p-nitrofenol.
Quando o tempo de incubação for de 1 a 2 horas, o tolueno pode
ser omitido sem grandes alterações nos resultados.
O cloreto de cálcio tem por finalidade evitar a dispersão da argila
pelo NaOH, utilizado para extrair o p-nitrofenol.
É preciso tomar cuidado na escolha do tampão a ser usado na
avaliação da atividade de fosfatases em amostras de solo, pois
alguns dos tampões podem causar inibição da enzima. Os tampões
acetato e citrato-fosfato, por exemplo, causam inibição da atividade.

7.2. Reagentes

Solução padrão de p-nitrofenol 1 g/L: pesar 1,00 g de p-nitrofenol


e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar cerca de 70 mL de água
desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000
mL e completar o volume com água desionizada.
Solução padrão de p-nitrofenol 10 mg/L: pipetar 1 mL da solução
padrão de p-nitrofenol 1 g/L para balão volumétrico de 100 mL e
completar o volume com água desionizada.
Solução estoque do tampão universal modificada (MUB), pH
11,0: pesar 12,1 g de Tris, 11,6 g de ácido maleico, 14,0 g de ácido
cítrico, 6,3 g de ácido bórico e colocar em béquer de 1.000 mL.
Adicionar cerca de 500 mL de solução de NaOH 1 mol/L e dissolver.
Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume
com água desionizada. Armazenar a 4 oC.
Solução tampão MUB, pH 6,5: pipetar 200 mL da solução
estoque de MUB para béquer de 500 mL e adicionar solução de HCl
0,1 mol/L até atingir pH 6,5, sob contínua agitação. Transferir para
balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água
desionizada.
Solução de CaCl2.2H2O 0,5 mol/L: ver item 4.2.
Solução de NaOH 0,5 mol/L: ver item 4.2.

7.3. Curva de calibração

A 6 frascos Erlenmeyers de 50 mL, adicionar, respectivamente,


0,1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL e 5 mL da solução de p-nitrofenol 10 mg/L
e completar o volume a 5 mL com água desionizada.
Ler a absorbância das soluções de p-nitrofenol em comprimento
de onda de 400 nm.
Repetir esse protocolo por mais duas vezes, de modo a obter
uma curva de calibração com três repetições.
Aos resultados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a
obter a equação da curva de calibração, relacionando absorbância
(eixo Y) com concentração de p-nitrofenol em mg/L (eixo X).

7.4. Marcha analítica

Pesar 1,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em


peneira de 2 mm, e colocar em frasco Erlenmeyer de 50 mL.
Adicionar 0,25 mL de toluol, 4 mL do tampão MUB pH 6,5 para o
caso da fosfatase ácida (ou pH 11 para a fosfatase alcalina) e 1 mL
da solução de p-nitrofenilfosfato de sódio.
Homogeneizar, vedar a boca do frasco com papel laminado e
incubar a 37 oC por 1 hora.
Adicionar 1 mL da solução de CaCl2.2H2O 0,5 mol/L e 4 mL da
solução de NaOH 0,5 mol/L.
Agitar e filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou equivalente.
Ler a absorbância do filtrado em comprimento de onda de 400
nm.
Para cada amostra de solo, desenvolver um branco, adicionando
a solução de p-nitrofenilfosfato de sódio após a adição da solução
de NaOH 0,5 mol/L.

7.5. Cálculos

O cálculo da atividade de fosfatases é feito pela equação a


seguir:

em que
At = atividade, em mg, de p-nitrofenol por kg de TFSE por hora; Vt =
volume, em mL, do tampão; Vs = volume, em mL, de p-
nitrofenilfosfato de sódio; Vc = volume, em mL, de CaCl2.2H2O; Vh =
volume, em mL, de NaOH; Aa = absorbância da amostra; Ab =
absorbância do branco; b = constante da equação da curva de
calibração; Fc = fator de correção de umidade para TFSE; a =
coeficiente angular da equação da curva de calibração; m = massa,
em gramas, da amostra de solo; t = tempo de incubação, em horas.

8. Desidrogenases

8.1. Comentários
As desidrogenases são enzimas que catalisam a oxidação de
substratos orgânicos pela remoção de elétrons e hidrogênios, os
quais são recebidos por uma coezima como NAD+ ou FAD+. As desi‐
drogenases são enzimas ligadas às células e não enzimas
extracelulares.
Um dos métodos mais frequentemente usados para avaliar a
atividade de desidrogenases do solo tem como princípio usar o TTC
(cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio) como o aceptor dos elétrons e H+
(THALMANN, 1968), reduzindo-se a TPF (trifenilformazan), que
apresenta coloração vermelha, podendo ser facilmente determinado
por espectrofotometria na região do visível (Figura 1).

Figura 1. Reação de redução do cloridrato de trifeniltetrazólio (TTC) a trifenilformazan


(TPF).

O TTC pode ser adsorvido pela matéria orgânica e pelos coloides


inorgânicos do solo, de tal modo que é recomendável um estudo
prévio para se ter ideia da concentração ideal de TTC a se usar
como substrato.
Tanto o TTC como o TPF sofrem alteração na presença da luz,
motivo pelo qual se recomenda que as determinações sejam feitas
na ausência de luz.
O TPF é insolúvel em água e permanece no sítio onde ocorreu a
redução. Dessa forma, é preciso extrai-lo da amostra de solo por
meio de um solvente adequado como acetona ou metanol.
Os íons nitrato, nitrito e Fe+3 inibem a atividade de
desidrogenases, enquanto P-inorgânico, Fe+2, sulfato e Mn
estimulam a redução do TTC (BREMNER; TABATABAI, 1973).
É preciso evitar o contato do meio de incubação com o oxigênio
do ar, pois o TTC é reduzido pelo oxigênio. Para que os resultados
de diferentes amostras sejam comparáveis, é necessário que os
tubos de ensaio tenham a mesma área de exposição ao oxigênio
(BENEFIELD et al., 1977), o que se consegue com o menor
diâmetro possível.
A atividade de desidrogenases mantém-se relativamente cons‐
tante, quando a amostra de solo é armazenada úmida em sacos de
polietileno sob temperatura ambiente (CASIDA et al., 1964). É
inibida pela presença do clorofórmio e pelo aquecimento em
temperaturas acima de 65 oC.
Na presença do Zn em pó, o TTC é reduzido a TPF.
Em solos ácidos (pH < 5), a atividade de desidrogenases é muito
baixa.
A atividade de desidrogenases avalia a respiração associada à
atividade metabólica, não sendo, necessariamente, a medida do
número de microrganismos presentes.
Tem sido observada diferença entre a atividade de desidrogena‐
ses, avaliada pelo método do TTC, e a atividade respiratória do solo,
o que tem sido atribuído ao fato de o TTC servir como aceptor de
elétrons apenas quando outros aceptores presentes no solo já foram
utilizados.
O TTC é um indicador muito sensível de alterações na atividade
microbiana do solo causada por diferentes tipos de manejo do solo,
entre eles os métodos de cultivo (TIWAN et al., 1989). Não serve,
contudo, para estimar a atividade microbiana em solo contaminado
com cobre (CHANDER; BROOKES, 1991).

8.2. Reagentes
Solução padrão de trifenilformazan (TPF) 500 mg/L: pesar
0,0500 g de TPF e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar cerca
de 80 mL de acetona e dissolver. Transferir para balão volumétrico
de 100 mL e completar o volume com acetona. Armazenar em
frasco de cor âmbar.
Solução tampão Tris-HCl, pH 7,6: pesar 12,10 g de Tris
(hidroximetilaminometano) e colocar em béquer de 1.000 mL.
Adicionar cerca de 700 mL de água desionizada e dissolver.
Adicionar HCl até pH 7,6. Transferir para balão volumétrico de 1.000
mL e completar o volume com água desionizada.
Solução de cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC) a 3%: pesar
3,00 g de TTC e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar cerca de
80 mL de tampão Tris-HCl, pH 7,6, e dissolver. Transferir para balão
volumétrico de 100 mL e completar o volume com o tampão Tris-
HCl. Armazenar em frasco de cor âmbar.

8.3. Curva de calibração

Pipetar 0, 0,5 mL, 1,0 mL, 2,0 mL, 3,0 mL, 4,0 mL da solução
padrão de TPF 500 mg/L para balões volumétricos de 50 mL.
Adicionar a cada balão 8,3 mL de tampão Tris-HCl, pH 7,6, e
completar o volume com água desionizada.
Ler a absorbância em comprimento de onda de 546 nm.
Repetir esse protocolo por mais duas vezes, de modo a obter
uma curva de calibração com três repetições.
Aos resultados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a se
obter a equação, relacionando absorbância (eixo Y) com
concentração de TPF em mg/L (eixo X).

8.4. Marcha analítica


Pesar 5,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em
peneira de 2 mm, e colocar em tubo de ensaio.
Adicionar 5 mL da solução de TTC (a solução deve conter de 1,0
g/100 mL a 1,5 g/100 mL para solo argiloso ou orgânico e 0,1 g/100
mL para solo arenoso ou pobre em matéria orgânica).
Vedar os tubos, misturar muito bem o conteúdo e incubar por 24
horas a 30 oC.
Adicionar 40 mL de acetona, agitar energicamente e manter em
temperatura ambiente por 2 horas, com agitação periódica. Essa
incubação deve ser feita no escuro, e todas as outras operações
sob luz difusa.
Filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou equivalente.
Ler a absorbância do filtrado em comprimento de onda de 546
nm.
Para cada amostra de solo, realizar um branco, substituindo a
solução de TTC por 5 mL de solução tampão Tris-HCl, pH 7,6.

8.5. Cálculos

A atividade de desidrogenases é calculada pela equação a


seguir:

em que
At = atividade de desidrogenases, expressa em mg de TPF por kg
de TFSE por hora; b = constante da equação da curva de
calibração; Va = volume, em mL, de acetona; Vs = volume, em mL,
da solução de TTC; Fc = fator de correção de umidade para TFSE;
a = coeficiente angular da equação da curva de calibração; t =
tempo de incubação, em horas; Aa = absorbância da amostra; Ab =
absorbância do branco.

9. Hidrólise do diacetato de fluoresceína


(FDA)

9.1. Comentários

A hidrólise do 3,6 diacetilfluoresceína (FDA) não expressa a


atividade de uma enzima específica, mas a de um grupo de enzimas
que são capazes de realizá-la. Neste grupo estão lipases,
esterases, proteases. O FDA pode ser hidrolisado por algas,
protozoários e tecidos animais, mas não por esporos e células
microbianas na fase estacionária de crescimento, de tal modo que a
reação pode ser usada para colorir células microbianas ativas.
Os ésteres da fluoresceína são apolares e conseguem
atravessar com facilidade a membrana celular, enquanto os
produtos da hidrólise são polares e permanecem no interior da
célula.
O pH ótimo para a hidrólise do FDA situa-se na faixa de 7 a 8.
Em pH 8,5 já ocorre a hidrólise química do FDA.
A solução de diacetato de fluoresceína é incolor, enquanto a
solução de fluoresceína apresenta-se fluorescente e pode ser esti‐
mada quantitativamente por espectrofotometria (Figura 2). Esse é o
princípio do método para avaliação do potencial de hidrólise do FDA
em amostras de solo (SCHNÜRER; ROSSWALL, 1982).
Figura 2. Diacetato de fluoresceína e fluoresceína.

De um modo geral, 2,00 g de amostra, peso equivalente à


amostra seca em estufa a 105 oC, são suficientes para avaliar a
atividade de hidrólise do FDA. Para solos com muita atividade,
pode-se usar 1,00 g, enquanto para solos com baixa atividade, 4,00
g podem ser necessários. Em qualquer dos casos, deve-se reajustar
os volumes da solução tampão e de diacetato de fluoresceína, de tal
modo que a concentração final de FDA fique em torno de 10 µg/mL.
A adição de acetona após o período de incubação até atingir
concentração de 50% (v/v) tem por finalidade parar a reação de
hidrólise do FDA e extrair a fluoresceína produzida durante a
hidrólise.
A hidrólise química do FDA ocorre em temperatura ambiente ou
mesmo a 8 oC, de tal modo que é recomendado o armazenamento
do sal e das soluções a -20 oC.

9.2. Reagentes

Tampão fosfato de sódio 60 mmol/L, pH 7,6: misturar 800 mL de


uma solução de Na2HPO4, contendo 11,9 g/L, com 200 mL de uma
solução de KH2PO4, contendo 9,08 g/L. Se necessário, acertar o pH
com HCl.
Solução estoque de diacetato de fluoresceína 2 g/L: pesar
0,2000 g de diacetato de fluoresceína e colocar em béquer de 50
mL. Adicionar 10 mL de acetona e dissolver. Transferir para balão
volumétrico de 100 mL e completar o volume com acetona.
Armazenar a -20 oC. No momento de uso, diluir a solução estoque
na proporção 1:18 com água destilada (solução de trabalho). Na
marcha analítica, para cada mL de tampão, adicionar 100 µL da
solução de FDA diluída (solução de trabalho).
Solução estoque de fluoresceína 5 g/L: pesar 0,5000 g de
fluoresceína e colocar em béquer de 50 mL. Adicionar 10 mL de
acetona e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 100 mL e
completar o volume com acetona. Armazenar a -20 oC. Para o
estabelecimento da curva de calibração, diluir a solução estoque na
proporção 1:50 com solução tampão (solução de trabalho a 100
mg/L).

9.3. Curva de calibração

Para 7 balões volumétricos de 50 mL, pipetar, respectivamente,


0, 0,25 mL, 0,50 mL, 1,0 mL, 2,5 mL, 5,0 mL e 10,0 mL da solução
de trabalho de fluoresceína (100 mg/L).
Completar o volume com a solução tampão fosfato de sódio 60
mmol/L, pH 7,6.
Ler a absorbância em comprimento de onda de 490 nm.
Executar esse protocolo por mais duas vezes, de modo a obter a
curva de calibração com três repetições.
Aos resultados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a
obter a equação, relacionando absorbância (eixo Y) com a concen‐
tração de fluoresceína em µg/mL (eixo X).

9.4. Marcha analítica


Pesar 2,00 g (equivalente em peso seco) de amostra de solo
recém-obtida, passada em peneira de 2 mm. A amostra pode ter
sido armazenada a 5 oC.
Colocar em frasco Erlenmeyer de 250 mL, adicionar 25 mL de
tampão fosfato 60 mmol/L, pH 7,6, e 2,5 mL da solução de trabalho
de diacetato de fluoresceína (concentração final de FDA de 10
µg/mL).
Misturar muito bem e incubar por 1 hora a 24 oC sob agitação.
Adicionar 50 mL de acetona (a concentração final de acetona
deve atingir 50% v/v).
Centrifugar por 10 minutos a 4.000 rpm e ler a absorbância do
sobrenadante em comprimento de onda de 490 nm.
Para cada amostra de solo, realizar uma prova em branco,
adicionando a solução de FDA após o período de incubação.

9.5. Cálculos

A atividade de hidrólise do FDA é calculada pela equação a


seguir:

em que
At = atividade, em mg de fluoresceína por kg de TFSE por hora; Aa
= absorbância da amostra. Ab = absorbância do branco; b =
constante da equação de regressão da curva de calibração; Vf =
volume, em mL, de FDA; Vt = volume, em mL, de tampão; Va =
volume, em mL, de acetona; m = massa, em gramas, de solo; a =
coeficiente angular da equação de regressão da curva de
calibração; t = tempo de incubação, em horas; Fc = fator de
correção de umidade para amostra seca a 105 oC.

10. Beta-glicosidase (EC 3.2.1.21 β-


glicosídeo glicoidrolase)

10.1. Comentários

A β-glicosidase é a enzima que realiza a hidrólise limite da


celulose (Figura 3) e tem sido detectada em animais, plantas e
microrganismos. Logo, ela catalisa a hidrólise de um dissacarídeo
que possui ligação glicosídica β-1,4, a celobiose.

Figura 3. Reação de hidrólise da celobiose, catalisada pela β-glicosidase.

O substrato utilizado para avaliar a atividade da β-glicosidase em


amostras de solo tem sido o ρ-nitrofenil-β-D-glicosídeo (EIVAZI;
TABATABAI, 1988), cujo método baseia-se no fato de que este
substrato é incolor, enquanto o produto da hidrólise, o p-nitrofenol,
apresenta cor amarela, sendo facilmente determinado por
espectrofotometria na região do visível.
A β-glicosidase tem se relacionado positivamente com o teor de
matéria orgânica do solo e é uma enzima que perde atividade,
quando aquecida acima de 70 oC.
10.2. Reagentes

Toluol: usar reagente p.a.


Solução estoque do tampão universal modificado (MUB): ver item
8.2.
Solução tampão MUB, pH 6,5: ver item 7.2.
Solução de CaCl2 0,5 mol/L: ver item 4.2.
Solução tampão Tris-hidróxido de sódio 0,1 mol/L, pH 12: pesar
12,20 g de Tris (também denominado Tham) e colocar em béquer
de 1.000 mL. Adicionar cerca de 800 mL de água desionizada e
dissolver. Adicionar solução de NaOH 0,5 mol/L até atingir pH 12.
Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume
com água desionizada. Essa solução funciona como extrator.
Solução estoque de p-nitrofenol 1 g/L: ver item 7.2.
Solução tampão Tris 0,1 mol/L, pH 10: pesar 12,20 g de Tris
(também denominado Tham) e colocar em béquer de 1.000 mL.
Adicionar cerca de 800 mL de água desionizada e dissolver.
Solução padrão de p-nitrofenol 10 mg/L: Transferir 10 mL da
solução estoque de p-nitrofenol para balão volumétrico de 1.000 mL
e completar o volume com água desionizada. Essa solução funciona
como diluente.
Solução de p-nitrofenil-b-D-glicosídeo (PNG) 25 mmol/L: pesar
0,377 g de PNG e colocar em béquer de 100 mL. Adicionar 30 mL
da solução de tampão universal (MUB) e dissolver. Transferir para
balão volumétrico de 50 mL e completar o volume com a solução de
tampão universal.

10.3. Curva de calibração

A 6 frascos Erlenmeyers de 50 mL, adicionar, respectivamente,


0, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL e 5 mL da solução padrão de p-nitrofenol
10 mg/L e completar o volume a 5 mL com água desionizada.
Ler a absorbância em comprimento de onda de 400 nm.
Repetir esse protocolo por duas vezes, de modo a obter a curva
de calibração com três repetições.
Aos resultados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a
obter a equação, relacionando absorbância (eixo Y) com
concentração de p-nitrofenol em mg/L (eixo X).

10.4. Marcha analítica

Pesar 1,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em


peneira de 2 mm, e colocar em frasco Erlenmeyer de 50 mL.
Adicionar 0,25 mL de toluol, 4 mL de solução tampão MUB, pH
6,5, e 1 mL da solução de PNG.
Vedar a boca do Erlenmeyer com papel laminado, misturar bem e
incubar por 1 hora a 37 oC.
Adicionar 1 mL da solução de CaCl2 0,5 mol/L, 4 mL do tampão
Tris, pH 12, agitar vigorosamente e filtrar em papel de filtro
Whatman n° 1 ou similar.
Ler a absorbância do filtrado em comprimento de onda de 400
nm. Se a cor for muito intensa, diluir o filtrado com solução tampão
Tris, pH 10, e ler a absorbância novamente.
Para cada amostra de solo, preparar um branco, adicionando a
solução de p-nitrofenil-b-D-glicosídeo após a incubação, antes da
adição da solução de CaCl2.

10.5. Cálculos

A atividade da b-glicosidase é calculada pela equação a seguir:


em que
At = atividade da b-glicosidase, expressa em mg de p-nitrofenol por
kg de TFSE por hora; Vt = volume, em mL, do tampão MUB; Vs =
volume, em mL, de PNG; Vc = volume, em mL, da solução de CaCl2;
Ve = volume, em mL, do tampão Tris; Aa = absorbância da amostra;
Ab = absorbância do branco; b = constante da equação da curva de
calibração; a = coeficiente angular da equação da curva de
calibração; m = massa, em gramas, da amostra de solo; t = tempo
de incubação, em horas; Fc = fator de correção de umidade para
amostra seca em estufa a 105 oC.

11. Sacarase ou invertase (EC 3.2.1.26 β-D-


frutofuranosídeo frutohidrolase)

11.1. Comentários

A sacarose é um dissacarídeo formado por unidades de glicose e


frutose em ligação glicosídica β-2,1. É um carboidrato amplamente
distribuído na natureza e mais facilmente hidrolisado que outros
dissacarídeos. Pelo fato de não apresentar hidroxila glicosídica livre
(as duas hidroxilas glicosídicas participam da ligação glicosídica),
não apresenta mutarrotação e não é um açúcar redutor.
A sacarose é hidrolisada a D(+)-glicose e D(-)-frutose pela
enzima denominada sacarase ou invertase. O nome invertase se
deve ao fato que, após a hidrólise, há alteração no sentido do desvio
da luz polarizada, uma vez que a sacarose possui [a]D20 = +66o,
enquanto a frutose possui um [a]D20 = -92,40o, e a glicose, um [a]D2 =
+ 52,7o, de tal modo que a mistura equimolecular resultante da
hidrólise desvia o plano de luz polarizada para a esquerda.
O pH ótimo para a atividade da invertase em amostras de solo
situa-se na faixa de 5,0 a 5,6, enquanto a temperatura ótima é de 50
o
C (FRANKENBERGER; JOHANSON, 1983). O KM da reação tem
variado entre 16,3 mmol/kg e 42,1 mmol/kg. A secagem da amostra
causa diminuição na atividade da enzima. O toluol e a esterilização
por raios gama não afetam a atividade da invertase.
Alguns autores têm encontrado correlação entre atividade de
invertase e teor de C-orgânico.
O princípio do método para avaliação da atividade da invertase
em amostras de solo consiste na determinação do teor de açúcares
redutores liberados, quando a amostra é incubada na presença de
sacarose (SCHINNER; VON MERSI, 1990).

11.2. Reagentes

Solução tampão ácido acético-acetato 2 mol/L, pH 5,5: pesar


164,08 g de acetato de sódio anidro e colocar em béquer de 1.000
mL. Adicionar cerca de 700 mL de água desionizada e dissolver.
Ajustar o pH para 5,5 pela adição de ácido acético concentrado.
Transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume
com água desionizada.
Solução de sacarose 1,2%: pesar 12,00 g de sacarose e colocar
em béquer de 1.000 mL. Adicionar cerca de 700 mL de tampão
ácido acético-acetato e aquecer, sob agitação, a 45 oC por 2 horas.
Aguardar atingir temperatura ambiente, transferir para balão
volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com tampão acetato.
Essa solução pode ser armazenada a 4 oC por uma semana.
O reagente de cobre é constituído de três soluções, aqui deno‐
minadas de A, B e C, preparadas conforme descrito a seguir.
Solução A: pesar 16,00 g de carbonato de sódio anidro e 0,90 g
de cianeto de potássio e colocar em béquer de 500 mL. Adicionar
cerca de 400 mL de água desionizada e dissolver. Transferir para
balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água
desionizada.
Solução B: pesar 0,50 g de hexacianeto férrico de potássio e
colocar em béquer de 500 mL. Adicionar cerca de 400 mL de água
desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000
mL e completar o volume com água desionizada.
Solução C: pesar 1,50 g de sulfato férrico de amônio, 1,00 g de
dodecil sulfato de sódio e colocar em béquer de 500 mL. Adicionar
cerca de 300 mL de água desionizada a 50 oC, 4,2 mL de H2SO4
concentrado e dissolver. Aguardar atingir temperatura ambiente,
transferir para balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume
com água desionizada.
Solução estoque de glicose 2,8 g/L: pesar 2,8 g de glicose anidra
e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar cerca de 100 mL de água
desionizada e dissolver. Transferir para balão volumétrico de 1.000
mL e completar o volume com água desionizada.
Solução padrão de glicose 28 mg/L: pipetar 10 mL da solução
estoque de glicose a 2,8 g/L para balão volumétrico de 1.000 mL e
completar o volume com água desionizada.

11.3. Curva de calibração

A 6 tubos de ensaio, adicionar, respectivamente, 0, 0,2 mL, 0,4


mL, 0,6 mL, 0,8 mL e 1,0 mL da solução padrão de glicose 28 mg/L
e completar o volume a 1,0 mL com água desionizada.
Adicionar a cada tubo 1 mL da solução A e 1 mL da solução B.
Homogeneizar, vedar a boca dos tubos e aquecer em banho-
maria a 100 oC por exatamente 15 minutos.
Resfriar em banho-maria a 20 oC por 5 minutos e adicionar 5 mL
da solução C.
Agitar e deixar em repouso a 20 oC por 1 hora para desenvol‐
vimento da cor.
Ler a absorbância em um período de 30 minutos em compri‐
mento de onda de 690 nm.
Repetir o protocolo por mais duas vezes, de modo a obter a
curva de calibração com três repetições.
Aos dados obtidos, aplicar a regressão linear, correlacionando a
absorbância (eixo Y) com a concentração de glicose em mg/L (eixo
X).

11.4. Marcha analítica

Pesar 5,00 g de amostra de solo recém-obtida, passada em


peneira de 2 mm, e colocar em frasco Erlenmeyer de 100 mL.
Adicionar 15 mL da solução de sacarose 1,2% e 15 mL do
tampão acetato.
Vedar a boca dos frascos com papel laminado e incubar a 50 oC
por 3 horas.
Filtrar em papel de filtro Whatman n° 1 ou similar, transferir 1,2
mL do filtrado para balão volumétrico de 50 mL e completar o
volume com água desionizada.
Pipetar 1 mL do filtrado diluído para tubo de ensaio, adicionar 1
mL da solução A, 1 mL da solução B e homogeneizar.
Vedar a boca do tubo de ensaio e aquecer em banho-maria a
100 oC por exatamente 15 minutos.
Resfriar em banho-maria a 20 oC por 5 minutos e adicionar 5 mL
da solução C.
Agitar e deixar em repouso a 20 oC por 1 hora para desenvolvi‐
mento da cor.
Ler a absorbância em um período de 30 minutos em compri‐
mento de onda de 690 nm.
Para cada amostra, realizar um branco, no qual a solução de
sacarose é adicionada após o período de incubação, imediatamente
antes da filtração.

11.5. Cálculos

O cálculo da atividade da invertase é feito pela equação a seguir:

em que
At = atividade da invertase, expressa em mg, de glicose por kg de
TFSE por hora; Vt = volume, em mL, do tampão acetato; Vs =
volume, em mL, da solução de sacarose; Aa = absorbância da
amostra; Ab = absorbância do branco; b = constante da equação da
curva de calibração; Vc = volume, a mL, em que foi diluído o filtrado;
a = coeficiente angular da equação da curva de calibração; m =
massa, em gramas, da amostra de solo; Ve = volume de filtrado, em
mL, usado para diluição antes da determinação dos açúcares
redutores; t = tempo de incubação, em horas; Fc = fator de correção
de umidade para amostra seca em estufa a 105 oC até peso
constante.

12. Referências
BENEFIELD, C. D.; HOWARD, P. J. A.; HOWARD, D. M. The estimation of dehydrogenase
activity in soil. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 9, p. 67-70, 1977.
BREMNER, J. M.; KEENEY, D. R. Steam-distillation methods for determination of
ammonium, nitrate and nitrite. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, NL, v. 32, p. 485-495,
1965.
BREMNER, J. M.; TABATABAI, M. A. Effects of some inorganic substances on TTC assay
of deshydrogenase activity in soils. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 5, p. 385-396,
1973.
CASIDA L. E.; KLEIN, D. A.; SANTORO, T. Soil dehydrogenase activity. Soil Science,
Baltimore, v. 98, p. 371-376, 1964.
CHANDER, K.; BROOKES, P. C. Is the dehydrigenase activity invalid as a method to
estimate microbial activity in copper-contaminated soils? Soil Biology and Biochemistry,
Oxford, v. 23, p. 909-915, 1991.
EIVAZI, F.; TABATABAI, M. A. Phosphatases in soils. Soil Biology and Biochemistry, Oxford,
v. 9, p. 167-172, 1977.
EIVAZI, F.; TABATABAI, M. A. Glucosidases and galactosidases in soils. Soil Biology and
Biochemistry, Oxford, v. 20, p. 1-606, 1988.
FRANKENBERGER, W. T.; JOHANSON, J. B. Factors affecting invertase in soils. Plant and
Soil, The Hague, v. 74, p. 313-323, 1983
LONGO, R. M.; MELO, W. J. Hidrólise da uréia em latossolos: efeito da concentração da
uréia, temperatura, pH, armazenamento e tempo de incubação. Revista Brasileira de
Ciência do Solo, Viçosa, v. 29, p. 651-657, 2005.
MELO, W. J.; PIZAURO JÚNIOR, J. M.; SARTORI, J. L.; KANESIRO, M. A. B. Amilase em
solos do Município de Jaboticabal. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Campinas, v. 7, p.
213-215, 1983.
PANCHOLY, S. K.; RICE, E. L. Soil enzymes in relation to old field sucession: amylase,
cellulase, invertase, dehydrogenase and urease. Soil Science Society of America Proceeding,
Madison, v. 37, p .47-50, 1973.
SCHINNER, F.; MERSI, W. von. Xylanase, CM-cellulase, and invertase activity in soils: an
improved method. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 22, p. 511-515, 1990.
SCHNÜRER, J.; ROSSWALL, T. Fluorescein diacetate hydrolysis as a measure of total
microbial activity in soil and litter. Applied Environmental Microbiology, Washington, DC, v.
43, p. 1256-1261, 1982.
TABATABAI, M. A.; BREMNER, J. M. Arylsulphatase activity in soils. Soil Science Society of
America Proceeding, Madison, v. 34, p. 225-229, 1970.
THALMANN, A. Zur methodik der bestimmung der dehydrogenase aktivita
triphenyltetrazolium chlorid (TTC) im bodem mittels. Journal Fuerna Landwirtschaftliche
Forschung, Viena, v. 21, p. 249-258, 1968.
TIWAN, S. C.; TIWAN, B. K.; MISHRA, R. R. Microbial populations, enzyme activities and
nitrogen-phosphorus-potassium enrichment in earthworm casts and in the surrounding soil
of a pineaple plantation. Biology and Fertility of Soils, Berlin, DE, v. 8, p. 178-182, 1989.
Parte 3
Técnicas moleculares e aplicação
da genética nas áreas agrícolas
Capítulo 1
Técnicas moleculares aplicadas
ao estudo da diversidade e à
identificação de bactérias e
fungos de interesse agrícola
Fernando Gomes Barcellos
Mariangela Hungria

1. Introdução

A identificação correta de microrganismos, como fungos e


bactérias, é fundamental em diversas áreas de importância na
agricultura e em estudos ambientais, por exemplo, no conhecimento
da biodiversidade microbiana do solo, no diagnóstico de doenças de
plantas, entre outros (ANDERSON; CAIRNEY, 2004; MCCARTNEY
et al., 2003). Os métodos convencionais para a identificação de
bactérias e fungos, como os existentes na rizosfera das plantas, no
solo, bem como aqueles associados a plantas, como endofíticos e
simbióticos, entre outros, dependem do isolamento, do cultivo em
meios apropriados e da caracterização morfofisiológica e bioquímica
(GARRO et al., 1999; VANDAMME et al., 1996). No entanto, a
caracterização com base nesses atributos pode resultar, em muitos
casos, na identificação errônea de isolados, por ser passível de
sofrer influência ambiental.
A utilização das metodologias moleculares de análise do DNA
(ou ADN, ácido desoxirribonucleico), principalmente aquelas com
base no uso da PCR (Polymerase Chain Reaction, reação em
cadeia da polimerase) (SAIKI et al., 1988) e das técnicas de
sequenciamento direto do DNA amplificado (INNES et al., 1988;
WINSHIP, 1989), permitiu o estabelecimento de estratégias de
identificação mais precisas dos isolados, baseadas no genótipo, o
qual não está sob influência ambiental. Com a utilização dessas
metodologias, a caracterização e a identificação de microrganismos
vêm adquirindo um papel cada vez mais relevante, por permitir
ações rápidas na identificação e profilaxia de patógenos humanos.
Também nas ciências agrícolas e ambientais, a adoção dessas
metodologias vem crescendo exponencialmente. Neste capítulo
serão discutidas as principais metodologias utilizadas para a
caracterização molecular de fungos e bactérias, com ênfase nos
grupos de maior importância agrícola e ambiental.

2. Técnicas moleculares aplicadas em


estudos de diversidade e identificação de
microrganismos

2.1. Técnicas aplicadas em estudos de taxonomia e


filogenia de microrganismos

Inicialmente, é importante estabelecer algumas definições. A


sistemática é definida como o estudo científico da diversidade e
inter-relações entre os organismos, com o objetivo de caracterizá-
los e arranjá-los de uma maneira ordenada (TRUPER; SCHLEIFER,
1991). A taxonomia é, frequentemente, usada como um sinônimo
para sistemática e consiste na classificação, identificação e
nomenclatura de um organismo (COWAN, 1968). A classificação
consiste no arranjo dos organismos em grupos (táxons), com base
em similaridades, enquanto que a nomenclatura consiste na
determinação de nomes para os grupos taxonômicos, de acordo
com as regras internacionais descritas pelo International Code of
Nomenclature of Bacteria (LAPAGE et al., 1992). Já a identificação é
o uso prático da classificação, a fim de determinar a identidade de
um isolado como membro, ou não, de uma unidade. Uma poderosa
ferramenta para a taxonomia de um determinado organismo é o
estudo da filogenia, utilizado para determinar as relações existentes
entre os organismos, indicando seu possível grupo, suas relações
com outros grupos e seu lugar nas famílias e reinos, bem como
auxiliando no reconhecimento dos ancestrais.
Na década de 1980 e início da década de 1990, o emprego de
técnicas de biologia molecular resultou em uma verdadeira
revolução na taxonomia das bactérias e fungos. Nessa época,
alguns estudos passaram a ser conduzidos com os genes RNA
ribossomais (RNAr), e a análise desses genes resultaram na
escolha preferencial dos mesmos para estimar tanto relações
filogenéticas como a posição taxonômica de microrganismos
(ATKINS; CLARK, 2004; BRIDGE; ARORA, 1998; GARRITY et al.,
2001; MCCARTNEY et al., 2003; WEISBURG et al., 1991; WOESE,
1987; WOESE et al., 1990). Como as análises em geral são feitas
com DNA e não com RNA, também é usual se referir a elas como
DNAr.
Os genes ribossomais apresentam uma série de características
favoráveis a sua utilização em filogenia: i) são encontrados em
todos os organismos vivos, uma vez que a síntese de proteínas
ribossomais é obrigatória; ii) expressam estruturas secundárias
altamente conservadas, que são importantes para o alinhamento
correto das sequências destes genes; iii) são componentes
principais da estrutura dos ribossomos e, portanto, abundantes nas
células, facilitando a sua identificação; iv) diferenças nas sequências
desses genes evoluem em taxas diferentes, permitindo que análises
filogenéticas sejam realizadas em vários níveis de resolução
taxonômica (GARRITY et al., 2001; VANDAMME et al., 1996;
WOESE, 1987; WOESE et al., 1990).
Nas bactérias, a escolha recaiu no 16S DNAr para estimar
relações filogenéticas e taxonômicas (GARRITY et al., 2001;
VANDAMME et al., 1996; WEISBURG et al., 1991; WOESE, 1987;
WOESE et al., 1990). Contudo, em alguns gêneros, como
Burkholderia (COENYE et al., 2001) e Bradyrhizobium (GERMANO
et al., 2006; MENNA et al., 2006), a variabilidade no 16S DNAr é
muito baixa, dificultando a definição clara das espécies. Outra
limitação no uso exclusivo do 16S DNAr surgiu com a quebra de um
dogma evolucionário em procariotos, com a constatação de que
podem ocorrer taxas elevadas de transferência horizontal de genes
entre microrganismos, produzindo genomas extremamente
dinâmicos, com quantidades substanciais de DNA que são
incorporadas ou perdidas do genoma (GEVERS et al., 2005). Desse
modo, a análise adicional de outros genes, em complementação ao
16S rDNA, gera maior confiabilidade à classificação, como exemplo,
o 23S rDNA e o espaço intergênico 16S-23S rRNA (IGS, região
intergênica), que apresentam maior divergência entre as espécies,
diferem quanto à taxa de evolução, e, no caso do 23S rRNA,
apresenta maior número de bases (GERMANO et al., 2006).
No caso dos fungos, a região do DNAr nuclear consiste de três
genes que codificam para os RNAs ribossomais (25-28S, 18S e
5,8S), sendo separados pelas regiões espaçadoras internas (ITS1 e
ITS2), em uma unidade contendo em torno de 200 repetições em
tandem (ATKINS; CLARK, 2004; BERBEE; TAYLOR, 2001;
BRIDGE; ARORA, 1998). As unidades repetidas do DNAr são
separadas por regiões denominadas de espaçadores intergênicos
(IGS). As sequências dos genes 25-28S, 18S e 5,8S são
conservadas evolutivamente e têm sido utilizadas em estudos de
filogenia (principalmente o gene ribossomal 18S) envolvendo
espécies diferentes de fungos (BERBEE; TAYLOR, 2001; BRIDGE;
ARORA, 1998). As regiões espaçadoras ITS1, ITS2 e IGS possuem
sequências mais variáveis e têm sido utilizadas em estudos para
discriminar espécies intimamente relacionadas em alguns gêneros e
na identificação de espécies (BRIDGE; ARORA, 1998). Além dos
genes ribossomais, outros genes (geralmente genes conservados
evolutivamente e denominados, genericamente, de housekeeping)
também têm sido utilizados como alvo na identificação de isolados
fúngicos, como os genes que codificam a síntese de proteínas como
a ß–tubulina, a histona e a calmodulina (BRADSHAW et al., 2006;
MCCARTNEY et al., 2003).
Nos primeiros estudos com os genes ribossomais, utilizava-se o
sequenciamento parcial dos genes (YOUNG et al., 1991) ou, então,
uma combinação de métodos, como o PCR-RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism, polimorfismo de comprimento de
fragmentos de restrição) dos genes ribossomais, que consiste na
amplificação por PCR das regiões do DNA que codificam os genes
ribossomais (ou o espaço intergênico), seguida pelo corte com
enzimas de restrição e eletroforese dos fragmentos amplificados
(ALBERTON et al., 2006; FERNANDES et al., 2003; GERMANO et
al., 2006; GRANGE; HUNGRIA, 2004; KASCHUK et al., 2006;
PINTO et al., 2007). Contudo, com as facilidades e redução no custo
do sequenciamento, esse é, hoje, o método de preferência (BINDE
et al., 2009; MENNA et al., 2006, 2009a).
Para a identificação taxonômica ou das relações filogenéticas de
uma determinada estirpe de bactéria, a sequência do gene
ribossomal 16S em estudo pode ser comparada por similaridade
com sequências ribossomais das estirpes tipo type strain (ou de
referência) das espécies bacterianas depositadas em bancos de
dados (como o GenBank do National Center for Biotechnology
Information1 (NCBI), e o Ribosomal Database Project2 (RDP).
Alternativamente, podem-se construir árvores filogenéticas onde a
sequência do gene ribossomal 16S da bactéria em estudo é
analisada em conjunto com sequências ribossomais de estirpes tipo
e/ou de referência das espécies bacterianas representativas do
estudo. O mesmo se aplica ao caso dos fungos.
É importante mencionar, também, outra metodologia mais
recente que vem sendo cada vez mais empregada, o Multilocus
Sequence Typing (MLST), tipagem por sequenciamento de lócus
múltiplos, a qual consiste no sequenciamento e análise conjunta,
como uma única sequência concatenada, de vários genes
housekeeping, em geral cinco (BAIN et al., 2007; ENRIGHT;
SPRATT, 1999; MCCARTNEY et al., 2003; WOO et al., 2007). De
acordo com Zeigler (2003), os genes utilizados como marcadores
filogenéticos alternativos, além de serem conservados para o grupo
em estudo, precisam obedecer alguns critérios: i) distribuição no
genoma com uma distância mínima entre os genes de 100 kb; ii)
presença no genoma em uma única cópia; iii) extensão nucleotídica
suficiente que permita o sequenciamento; iv) conter informações
suficientes para as análises; e v) os dados obtidos com o uso destes
genes devem ser correlacionados com os dados obtidos com o gene
ribossomal 16S e com os percentuais de similaridade obtidos por
hibridização DNA-DNA. O MLST visa, basicamente, à
caracterização genotípica em nível infraespecífico (GEVERS et al.,
2005) e foi, inicialmente, desenvolvido e utilizado em estudos de
diversidade e identificação em bactérias patogênicas ao homem
(ENRIGHT; SPRATT, 1999), mas passou a ser utilizado também
para a identificação de patógenos de plantas, inclusive fungos (BAIN
2007; MCCARTNEY et al., 2003).
Aplicando o mesmo princípio do MLST à taxonomia e filogenia,
foi então desenvolvida a metodologia de Multilocus Sequence
Analysis (MLSA) (STACKEBRANDT et al., 2002; STEPKOWSKI et
al., 2003), com propósitos específicos que permitem a sua utilização
para a definição de espécies e para elucidar relações taxonômicas
entre espécies bacterianas (GEVERS et al., 2005; MARTENS et al.,
2007; MENNA et al., 2009a; RIBEIRO et al., 2009) e espécies de
fungos (WOO et al., 2007).
Em relação à taxonomia de procariotos, mais detalhes foram
recentemente compilados em uma revisão de Barcellos et al. (2010).
Finalmente, é importante mencionar que, apesar dos avanços nas
técnicas moleculares, a abordagem de taxonomia polifásica,
integrando diferentes tipos de dados e informações fenotípicas,
genotípicas e filogenéticas, nunca deve ser esquecida, pois agrega
informações valiosas que auxiliam no entendimento da diversidade
e evolução dos microrganismos.
2.2. Outras técnicas moleculares aplicadas à
caracterização genética de isolados e estirpes

Várias metodologias moleculares vêm sendo empregadas para a


caracterização de isolados, linhagens e estirpes. A maioria dessas
metodologias tem como base a análise com PCR (denominadas
genericamente como PCR-based DNA fingerprinting techniques),
sendo aplicadas a estudos de diversidade e identificação de estirpes
de bactérias e isolados de fungos, e, até o presente momento, o
maior número de trabalhos relata o uso dos marcadores Rapd,
AFLP e rep-PCR (BRADSHAW et al., 2006; BRIDGE; ARORA,
1998; BRUIJN, 1992; MORTON et al., 2003). Referências a diversos
outros marcadores podem ser encontradas em revisão recente
(BARCELLOS et al., 2010).
O Rapd (Random Amplified Polymorphic DNA, DNA polimórfico
amplificado ao acaso) utiliza como iniciadores primers únicos de
sequências curtas (10 bases), os quais reconhecem regiões no
genoma contendo sequências nucleotídicas curtas, repetidas e
invertidas (BRIDGE; ARORA, 1998). Os produtos de amplificação
por Rapd são submetidos à eletroforese em gel de agarose e geram
perfis de bandas que são utilizados para discriminar estirpes ou
isolados de bactérias, por exemplo, de rizóbios (HUNGRIA et al.,
2000; NISHI et al., 1996), ou linhagens em determinadas espécies
de fungos (BRIDGE; ARORA, 1998). Em geral o Rapd tem sido
mais amplamente utilizado em nível infraespecífico, como na
identificação de grupos de linhagens patogênicas, produtoras de
toxinas, entre outros (BRIDGE; ARORA, 1998). Uma desvantagem
que com frequência é atribuída a esse método reside na baixa
reprodutibilidade nos perfis de bandas obtidos (BRADSHAW et al.,
2006).
O AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, polimorfismo
de comprimento de fragmentos amplificados) envolve a ligação de
adaptadores às extremidades de fragmentos de DNA clivados com
enzimas de restrição, os quais fornecem sítios de anelamento de
primers com alta restringência para as amplificações por PCR
(BRADSHAW et al., 2006). Os produtos de amplificação por PCR
são submetidos à eletroforese em géis de poliacrilamida e geram
um grande número de fragmentos, os quais são resolvidos em um
único gel (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). Apesar de o AFLP
ser uma técnica mais robusta que o Rapd, é tecnicamente mais
laboriosa e, por isso, tem sido pouco utilizado na identificação de
linhagens para fins de diagnóstico (BRADSHAW et al., 2006).
Uma das aplicações dos marcadores Rapd e AFLP é a identi‐
ficação de bandas polimórficas, denominadas Sequence
Characterized Amplified Regions (Scars), as quais são clonadas,
sequenciadas e utilizadas no desenvolvimento de marcadores
espécie específicos ou linhagem específicos (BRADSHAW et al.,
2006; MCCARTNEY et al., 2003).
Os marcadores repetitive sequence based-PCR (rep-PCR)
foram, originalmente, desenvolvidos para o estudo de diversidade e
identificação de bactérias (BRUIJN, 1992; VERSALOVIC et al.,
1991, 1994). Os elementos repetitivos parecem estar localizados em
distintas posições intergênicas no genoma, em ambas as
orientações, e supõe-se que, por serem associadas a graus
elevados de polimorfismo, essas regiões gênicas tenham uma
participação em processos de evolução adaptativa, mediando a
interação dos microrganismos com ambientes hostis. Existem três
famílias principais de elementos, incluindo as sequências Repetitive
Extragenic Palindromic (REP), Enterobacterial Repetitive Intergenic
Consensus (Eric) e elementos BOX, para as quais foram
desenvolvidos e otimizados primers (BRUIJN, 1992; VERSALOVIC
et al., 1991, 1994), que vêm sendo amplamente utilizados desde
então. Inclusive, esses primers também têm sido utilizados em
fungos para a identificação de linhagens, permitindo a diferenciação
de isolados intimamente relacionados de uma mesma espécie
(ATKINS; CLARK, 2004; BRIDGE; ARORA, 1998; MORTON et al.,
2003).
No Brasil, a caracterização de rizóbios por rep-PCR tem sido
vastamente documentada (ALBERTON et al., 2006; BARCELLOS et
al., 2007; BATISTA et al., 2007; BINDE et al., 2009; FERNANDES et
al., 2003; GRANGE; HUNGRIA, 2004; HUNGRIA et al., 2000, 2006,
2008; KASCHUK et al., 2006; MENNA et al., 2009b; PINTO et al.,
2007; SANTOS et al., 1999; STOCCO et al., 2008). Inclusive, em
função da facilidade, alta reprodutibilidade e baixo custo da análise,
BOX-PCR foi, recentemente, definido como método oficial do
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa) para a
caracterização de estirpes de rizóbios autorizadas para a produção
de inoculantes comerciais no Brasil (HUNGRIA et al., 2008). Os
perfis de BOX-PCR dessas estirpes já estão disponíveis (BINDE et
al., 2009; MENNA et al., 2009b).

3. Protocolos

A seguir serão descritos protocolos de algumas metodologias


moleculares com base em PCR utilizadas em estudos de
diversidade e na identificação de isolados de bactérias e fungos de
interesse agrícola (isolados do solo, endofíticos, epifíticos,
simbióticos, entre outros):
1) Estudos de diversidade e identificação de isolados fúngicos
com base nas sequências ribossomais ITS1, 5,8S e ITS2 por
PCR-RFLP.
2) Utilização dos marcadores Rapd em estudos de diversidade
de isolados fúngicos, na diferenciação de linhagens e na
obtenção de marcadores espécie específicos ou linhagem
específicos.
3) Estudos de diversidade e identificação de isolados bacteria‐
nos com o uso dos marcadores rep-PCR (BOX-PCR).
4) Estudos de filogenia e taxonomia de bactérias por MLSA.
3.1. Estudos de diversidade e identificação de isolados
fúngicos com base nas sequências ribossomais ITS1,
5,8S e ITS2 por PCR-RFLP (VIAUD et al., 2000)

Dentre as metodologias para o estudo da diversidade e para a


identificação de isolados de fungos, será descrita a metodologia
utilizada por Viaud et al. (2000). Essa metodologia pode ser aplicada
tanto para a identificação de fungos isolados em meio de cultura,
como para fungos não cultiváveis, identificados a partir do DNA total
extraído de amostras de solo, pela amplificação por PCR com o uso
de primers específicos para o DNA ribossomal e análise por RFLP.

3.1.1. Extração do DNA


Para a extração de DNA dos isolados de fungos pode-se utilizar
o protocolo descrito no item 3.2.1, ou utilizar kits de extração de
DNA disponíveis comercialmente, como o DNeasy Plant mini kit
(Qiagen, Hilden, Germany), seguindo o protocolo descrito pelo
fabricante. No caso das extrações de DNA total do solo, podem-se
utilizar os kits disponíveis comercialmente, como o PowerSoil DNA
Combo Kit (MO BIO, Carlsbad, USA), seguindo o protocolo descrito
pelo fabricante.

3.1.2. Amplificações por PCR da região ITS1, 5,8S e ITS2 do


DNAr
Para as amplificações por PCR da região ITS1 – 5,8S – ITS2,
podem ser utilizados os primers listados na Tabela 1.

Tabela 1. Primers utilizados para a amplificação da região ITS1 – 5,8S – ITS2 de fungos.

Primer Sequência

PN3 5’ – CCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATC – 3’

PN10 5’ – TCCGCTTATTGATATGCTTAAG – 3’

PN34 5’– TTGCCGCTTCACTCGCCGTT – 3’

Fonte: Viaud et al. (2000).


No caso das amplificações a partir do DNA extraído de isolados
de fungos, são utilizados, para as reações de PCR, os primers PN3
e PN10. No caso das amplificações a partir do DNA extraído do
solo, devem-se utilizar os primers PN3 e PN34.
Em todas as análises devem ser incluídos os DNAs de linhagens
padrões ou referência das espécies ou gêneros em estudo, os quais
serão utilizados nas análises comparativas dos perfis de bandas
obtidos por RFLP.
Conforme descrito por Viaud et al. (2000), as reações de PCR
podem ser realizadas da seguinte maneira: para um volume final de
50 µL utilizar, aproximadamente, 50 ng de DNA molde, 200 µmol de
cada dNTP (desoxirribonucleotídeos fosfatados: dATP-
desoxiAdenosina Trifosfatada; dCTP- desoxiCitidina Trifosfatada;
dGTP-desoxiGuanosina Trifosfatada e dTTP-desoxiTimidina
Trifosfatada), 1 unidade (U) de enzima Taq DNA polimerase e 0,2
µmol de cada primer. No caso das amplificações a partir de DNA
extraído do solo, devem-se incluir, na mistura de reação de PCR, 2
µL de albumina de soro bovino (2,5 µg/mL) para evitar a atividade
de substâncias inibitórias nas amostras de DNA.
Os ciclos de amplificação consistem de 30 ciclos de 60 segun
dos a 95 oC, 90 segundos a 50 oC e 60 segundos a 72 oC. Os
produtos de amplificação devem ser submetidos à eletroforese em
gel de agarose a 2% (peso/volume, p/v). Os géis podem ser corados
com solução de brometo de etídio (ver o preparo no item 3.2.2) e
fotografados em um transiluminador sob radiação ultravioleta (UV)
de comprimento de onda curto. Em todas as reações de PCR, deve-
se utilizar o controle negativo contendo todos os reagentes menos o
DNA da amostra, para certificar-se que não ocorram amplificações
em razão de contaminações com DNA exógeno, presente em algum
dos reagentes utilizados.
Os produtos de amplificação obtidos a partir do DNA total
extraído do solo devem ser clonados em vetor apropriado para
clonagem de produtos de PCR, como o pGEM T easy vector
(Promega) ou o TOPO TA cloning (Invitrogen), seguindo o protocolo
descrito pelo fabricante. Cada clone obtido deve ser reamplificado
com o uso da combinação de primers PN3/PN10 para a realização
das análises de RFLP.

3.1.3. RFLP
Para as análises de RFLP são realizadas quatro reações de
clivagem com as endonucleases HaeIII, HinfI, Hin6I e NdeII. Para as
reações de clivagem devem-se utilizar 5 µL do produto de PCR e 10
U de enzima de restrição em 10 µL de tampão da enzima, fornecido
pelo fabricante. As reações de clivagem devem ser incubadas por 1
hora (h) a 37 oC, posteriormente submetidas à eletroforese em gel
de agarose a 2%.

3.1.4. Análise dos resultados


Com base nos resultados obtidos por Viaud et al. (2000), espera-
se que os produtos de amplificação por PCR obtidos a partir das
amplificações com o uso de DNA obtido dos isolados de fungos
(primers PN3 e PN10) tenham um tamanho aproximado entre 400 e
700 pares de bases (pb). No entanto, espera-se que os produtos de
amplificação obtidos com o uso do DNA total extraído do solo
(primers PN3 e PN34) tenham um tamanho aproximado entre 350 e
1.000 pb.
No caso das amplificações descritas por Viaud et al. (2000), a
digestão dos produtos de amplificação com as enzimas de restrição
(endonucleases de restrição) utilizadas, as quais apresentam sítio
de reconhecimento de restrição de quatro bases, geraram de uma a
quatro bandas visíveis.
Para a identificação dos isolados fúngicos ou dos clones obtidos
a partir das amplificações do DNA total do solo, os perfis de bandas
devem ser comparados com as linhagens padrões (ou linhagem
tipo) da espécie/gênero em estudo. Sendo identificado um perfil de
banda idêntico ao das linhagens padrões, a espécie ou gênero é
identificado; caso contrário, alternativamente, pode-se realizar o
sequenciamento da região amplificada (previamente clonada no
vetor plasmidial apropriado, por exemplo, o pGEM T easy vector ou
o TOPO TA cloning), e a sequência obtida pode ser utilizada em
comparações e análise de similaridade com sequências ribossomais
de isolados e linhagens de fungos depositadas em bancos de dados
públicos, como o Genbank (NCBI), por meio de análises de
similaridade, por exemplo, com o uso do programa Blast (NCBI).

3.2. Utilização dos marcadores Rapd em estudos de


diversidade de isolados fúngicos, na diferenciação de
linhagens e na obtenção de marcadores espécie
específicos ou linhagem específicos

Será utilizado, como exemplo, o uso do Rapd em fungos fila‐


mentosos. Para isso, o método de extração de DNA utilizado nesse
protocolo é o descrito por Raeder e Broda (1985).

3.2.1. Extração de DNA de fungos filamentosos (RAEDER;


BRODA, 1985)
Para a extração de DNA, as linhagens devem ser crescidas em
meio líquido adequado para cada espécie, por um período de 24 a
30 horas (este tempo varia conforme o crescimento de cada
linhagem ou espécie), sob agitação (150 rotações por minuto, rpm),
a 37 oC ou conforme a temperatura ótima de crescimento da
espécie. Após esse período, o micélio deve ser filtrado em filtro
Büchner, lavado em água destilada esterilizada e, em seguida,
pesado. O micélio deve ser triturado em nitrogênio líquido e
distribuído em tubos, sendo que para cada grama de micélio devem
ser adicionados 2,1 mL de tampão de extração. Para um volume
final de 200 mL, adicionar 40 mL de Tris
[tris(hidroximetil)aminometano] 1 mol/L, pH 8,0; 10 mL de NaCl
(cloreto de sódio) 5 mol/L; 10 mL de EDTA (ácido etilenodiamino
tetra-acético) 0,5 mol/L, pH 8,0 e 20 mL de SDS (dodecil sulfato de
sódio) 10%, completando o volume com água destilada e
esterilizada. A solução deve ser preparada no momento do uso.
Para o preparo da solução de Tris, devem-se adicionar 121,1 g de
Trizma-base (Tris-base) para um volume final de 1.000 mL de água
destilada e desionizada, e o pH deve ser ajustado para 8,0 com HCl
concentrado. A solução deve ser autoclavada e mantida a 4 oC.
Essa mistura deve ser incubada por 15 minutos a 65 oC. Após o
período de incubação, adiciona-se um volume de fenol equilibrado
de origem comercial, pH 8,0, misturam-se as fases e centrifugam-se
a 12.000 rpm por 10 minutos em microcentrífuga. Despreza-se a
fase fenólica e acrescenta-se, à fase aquosa, um volume de
clorofane (mistura de fenol e clorofórmio na proporção 1:1, v/v).
Misturam-se as fases e centrifuga-se como anteriormente.
Despreza-se a fase fenólica e adiciona-se, à fase aquosa, um
volume de clorofil (mistura de clorofórmio e álcool isoamílico na
proporção de 24:1, v/v). Misturam-se as fases e centrifugam-se
como nos passos anteriores. Após a centrifugação, retira-se a fase
aquosa e adiciona-se NaCl 3 mol/L para uma concentração final de
0,3 mol/L. Adicionam-se dois volumes de etanol absoluto, resfriado
a -20 oC. Mistura-se vagarosamente, até visualizar o DNA
precipitado. Os tubos de microcentrífuga contendo o DNA
precipitado são, então, submetidos à centrifugação a 12.000 rpm por
15 minutos. Após a secagem do DNA à temperatura ambiente, esse
é ressuspenso em 200 µL de tampão TE. Para um volume final de
100 mL de tampão Tris-EDTA, adicionam-se 1 mL de Tris 1 mol/L,
pH 7,6 e 0,2 mL de EDTA 0,5 mol/L, pH 8,0 e completa-se o volume
para 100 mL com água destilada. A solução deve ser autoclavada e
mantida a 4 oC. Por fim, os DNAs extraídos devem ser quantificados
e sua integridade verificada em gel de agarose a 0,8%.

3.2.2. Amplificação de DNA por Rapd


As reações de amplificação devem ser preparadas para um
volume final de 30 µL, contendo: tampão (Tris 20 mmol/L, pH 8,4;
KCl 50 mmol/L); mistura de nucleotídeos (0,25 mmol/L); primer (0,4
µmol/L) (as sequências dos primers utilizados em Rapd podem ser
obtidas a partir do endereço eletrônico da empresa Operon3; MgCl2
(3,4 mmol/L); enzima Taq DNA polimerase (2 U) e DNA genômico
(15 ng). As reações controle devem consistir na adição de todos os
componentes da reação, exceto o DNA genômico. A amplificação
deve ser realizada em um termociclador programado para realizar
uma desnaturação inicial a 94 oC por 5 minutos, seguida de 40
ciclos de 1 minuto a 92 oC, 1 minuto a 35 oC, 2 minutos a 72 oC e
uma extensão final de 5 minutos a 72 oC.
Amostras de 20 µL dos produtos de amplificação devem ser
misturadas com, aproximadamente, 3 µL de tampão da amostra
(6X). Para um volume final de 100 mL do tampão de amostra,
devem-se adicionar 0,25 g de azul de bromofenol e 15 g de Ficoll,
completando-se o volume final com água destilada. O tampão deve
ser estocado a 4 oC. Os fragmentos devem ser separados por
eletroforese, a 3 V/cm, em gel de agarose a 1,4%. Para o preparo
do gel de agarose 1,4%, deve-se adicionar, a 1,4 g de agarose, um
volume de tampão TBE 1X, de forma a completar o volume final de
100 mL; a solução deve ser aquecida para dissolver a agarose e,
em seguida, vertida na forma para a confecção do gel. Para o
preparo do tampão TBE 10X, devem-se adicionar, para um volume
final de 1.000 mL, 108 g de Trizma-base, 55 g de ácido bórico
(H3BO3) e 40 mL de EDTA, 0,5 mol/L, ajustado em pH 8,0. A solução
deve ser autoclavada e guardada à temperatura ambiente. No
momento do uso devem ser feitas as diluições apropriadas para
obter o TBE 1X. Como padrão de peso molecular pode ser utilizado,
por exemplo, o marcador 100 pb DNA Ladder (Invitrogen). Após a
eletroforese, o gel de agarose deve ser corado em solução de
brometo de etídio (SAMBROOK et al., 1989). Para o preparo da
solução de brometo de etídio, deve-se dissolver 1,0% de brometo de
etídio (p/v) em água destilada. A solução deve ser agitada por várias
horas e estocada à temperatura ambiente. No momento do uso,
devem ser adicionados, a 800 mL de tampão TBE (1X), 40 µL dessa
solução. Decorridos 15 minutos, o gel corado pode ser visualizado
sobre um transiluminador sob radiação UV e fotodocumentado. Para
a realização da eletroforese, deve-se utilizar o mesmo tampão
utilizado na confecção do gel de agarose, no caso aqui descrito o
tampão TBE 1X.
3.2.3. Análise dos dados
Para as análises de Rapd faz-se necessário que as reações de
amplificação de cada amostra de DNA sejam: i) realizadas com, no
mínimo, três repetições, para que se verifique a constância dos
perfis de bandas obtidos; ii) que bandas que não estejam presentes
em todas as repetições não sejam consideradas nas análises.
Nos estudos de diversidade, os perfis de bandas obtidos são
analisados com o uso de programas de computação, como o
NTSYS (Exeter software), Bionumerics (Applied Mathematics,
Kortrijk, Bélgica), que usam algoritmos, os quais são utilizados para
inferir a similaridade genética entre os isolados ou linhagens
fúngicas e que geram dendrogramas, onde os isolados ou linhagens
são agrupados de acordo com a similaridade (DEMEKE; ADAMS,
1994).

3.2.4. Obtenção de marcadores espécie específicos ou linha‐


gem específicos (Scars)
Para o desenvolvimento de marcadores espécie específicos ou
linhagem específicos, deve-se identificar, inicialmente, a existência
de bandas presentes somente nas linhagens ou isolados de
interesse e ausentes nos demais isolados. No caso de marcadores
espécie específicos, as linhagens ou isolados utilizados devem ser
representativos da espécie em estudo, e, também, devem-se utilizar
isolados ou linhagens das outras espécies conhecidas do gênero
nas comparações (DNYANESHWAR et al., 2006; SU et al., 2008).
Inicialmente, devem-se obter os perfis de bandas com o uso de
diferentes primers. Em seguida, verifica-se a presença de bandas
específicas somente na linhagem de interesse ou na espécie de
interesse. Após a identificação da banda de interesse, esta deve ser
isolada do gel de agarose com o uso de um estilete ou bisturi e
purificada com o uso de kits comerciais para a purificação de DNA a
partir de géis de agarose (como o QIAquik Gel Extraction kit da
empresa Qiagen), seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante.
Após a purificação do DNA, este deverá ser clonado em um vetor
plasmidial específico para clonar produtos de PCR, como exemplo
podemos citar o pGEM-T easy vector da Promega ou o TOPO TA
cloning vector da Invitrogen, seguindo o protocolo do fabricante.
Após a clonagem, o fragmento de DNA clonado deve ser sequen‐
ciado, e, com base na sequência de DNA obtida, devem-se construir
primers para a amplificação específica dessa região no genoma da
espécie ou linhagem de interesse. Os primers construídos devem
ser testados para a amplificação por PCR utilizando a linhagem (ou
espécie) de interesse e, como controle negativo, as outras linhagens
da espécie ou, alternativamente, as outras espécies do gênero.
Deve-se verificar a amplificação específica do fragmento de DNA de
interesse somente na linhagem (ou espécie) de interesse e não nas
outras linhagens (ou espécies) utilizadas como controles.

3.3. Estudos de diversidade e identificação de isolados


bacterianos com o uso dos marcadores rep-PCR (BOX-
PCR)

Será utilizado, como exemplo, o rep-PCR com o primer BOX.


Conforme já comentado, essa metodologia tem sido utilizada com
bastante sucesso em estudos de diversidade e identificação de
isolados e estirpes de rizóbios. A metodologia descrita a seguir foi
baseada em Hungria et al. (2008) e está sendo adotada oficialmente
pelo Mapa para a identificação de estirpes de rizóbios.

3.3.1. Extração do DNA


As análises para a obtenção dos perfis de BOX-PCR são
realizadas, preferencialmente, com o DNA das bactérias, havendo,
para isso, vários métodos de extração de DNA. As análises também
podem ser feitas diretamente, utilizando-se colônias puras ou meio
líquido; contudo, os estudos de otimização e validação conduzidos
por nosso grupo de pesquisa indicam que a utilização de DNA
extraído e purificado resulta em melhor qualidade e repetibilidade
dos resultados. As bactérias podem ser colocadas para crescer em
meio extrato de levedura-manitol. YM, yeast-mannitol, também
conhecido como Meio 79, contém, em 1 L, 10,0 g de manitol; 0,5 g
de K2HPO4 (fosfato de potássico di-básico); 0,2 g de MgSO4.7H20
(sulfato de magnésio); 0,1 g de NaCl; 0,4 g de extrato de levedura,
completado com água destilada e com pH ajustado a 6,8, mas
modificado para conter 5,0 g/L de manitol, visando diminuir a
produção de exopolissacarídeos. As bactérias também podem ser
colocadas em outros meios que se mostrem adequados para o seu
crescimento, por exemplo, o meio triptona-extrato de levedura. TY,
tryptone-yeast, contém, em 1 L, 5,0 g de triptona; 3,0 g de extrato de
levedura; CaCl2.H2O (cloreto de cálcio), 0,87 g; completado com
água desionizada e pH ajustado de 6,8 a 7,2, útil no caso de
bactérias apresentando grande produção de exopolissacarídeos.
Para a extração do DNA das bactérias, recomenda-se que as
mesmas sejam colocadas para crescer em 15 mL a 20 mL do meio
YM por 3 a 10 dias, dependendo da taxa de crescimento, com
agitação de 150 rpm a 200 rpm, em temperatura adequada para
cada espécie; no caso de rizóbios, aproximadamente 28 °C, com
incubação no escuro. Todas as soluções utilizadas para a extração
do DNA devem ser previamente autoclavadas. Após a incubação,
centrifugar as suspensões bacterianas a, aproximadamente, 10.000
rpm, a 4 °C, durante 10 minutos e descartar o sobrenadante. Em
seguida, ressuspender o pélete e lavar por 3 vezes, com 5 mL de
solução salina (NaCl a 0,85%), podendo, ainda, no caso de
bactérias com grande produção de exopolissacarídeos, fazer uma
última lavagem com solução salina tamponada de fosfato [PBS 1 X,
contendo, em 500 mL, 4,383 g de NaCl 150 mmol/L; 0,1793 g de
NaH2PO4.H2O (fosfato de sódio monobásico) 2,6 mmol/L; 1,36 g de
Na2HPO4.12H2O (fosfato de sódio dibásico) 7,6 mmol/L]. Centrifugar
e descartar o sobrenadante. Depois da última lavagem, acrescentar
1 mL de solução salina ou PBS, homogeneizar e transferir o pélete
para um tubo de ensaio de vidro ou outro recipiente. Ajustar a
concentração de células a, aproximadamente, 109 células/mL, pela
adição de solução salina e calibração, que pode ser efetuada utili‐
zando diferentes métodos, incluindo leitura da densidade ótica em
espectrofotômetro no comprimento de onda de 520 nm a 540 nm
(caso a curva de crescimento da bactéria já tenha sido
determinada), ou por leitura em câmaras de crescimento Petroff-
Hausser ou Helber (SOMASEGARAN; HOBEN, 1994), ou, ainda,
visualmente, utilizando padrões de soluções de McFarland de
sulfato de bário (SOMASEGARAN; HOBEM, 1994). Transferir
aproximadamente de 1,4 mL a 1,5 mL para um outro tubo de PCR
de 1,7 mL ou 2 mL de capacidade (no tubo de 1,7 mL a visualização
do pélete é mais fácil), centrifugar a 12.000 rpm durante 10 minutos
à temperatura ambiente (sempre que se referir à temperatura
ambiente, neste protocolo, ela será de 21 °C a 23 °C) e descartar o
sobrenadante. Em seguida, ressuspender o precipitado em 400 µL
de TE 50:20 (50 mmol/L de Tris, pH 8,0; 20 mmol/L de EDTA-Na2 pH
8,0), adicionar 50 µL de SDS a 10% (10 g de SDS em 100 mL de
água), 10 µL de proteinase K (10 mg/mL, mantida no congelador a
-20 oC), 10 µL de lisozima (5 mg/mL, mantida no congelador a -20
o
C), 2 µL de RNAse (10 mg/mL, mantida conforme especificação do
fabricante) e, então, incubar a 37 ºC por aproximadamente 1 hora
(ou até que o material se torne mais claro). Na sequência, as
amostras podem ser homogeneizadas com ponteiras de 1 mL com a
ponta cortada (aspirar e soltar o material bem lentamente), por 3
vezes, para retirar a viscosidade. A seguir, acrescentar 30 µL de
NaCl 5 mol/L (resultando em uma concentração final de 250
mmol/L), 70 µL de AcONa 3 mol/L (concentração final de 300
mmol/L) e 28 µL de água Milli-Q. As amostras devem ser bem
homogeneizadas e deixadas em repouso por 1 hora na geladeira
(aproximadamente 8 °C) e, em seguida, centrifugadas a 12.000 rpm
durante 15 minutos, em temperatura ambiente. Recolher 300 µL do
sobrenadante de cada amostra e adicionar 600 µL (ou 2 volumes,
no caso de menor volume de sobrenadante) de etanol puro (95% a
99%), gelado (aproximadamente -20 ºC), armazenando-se, então,
por uma noite, a -20 ºC. No dia seguinte, centrifugar as amostras a
12.000 rpm durante 15 minutos, em temperatura ambiente,
descartar o etanol e adicionar 400 µL a 1 mL de etanol a 70%
(temperatura ambiente), visando lavar bem o pélete e retirar o
excesso de sais. Centrifugar novamente a 12.000 rpm durante 5
minutos, em temperatura ambiente, descartar o etanol e secar os
precipitados, também em temperatura ambiente por,
aproximadamente, 3 horas. Ressuspender os precipitados em 50 µL
de água Milli-Q ou TE 10:1 (10 mmol/L Tris pH 8,0; 1 mmol/L EDTA,
pH 8,0), ambos previamente esterilizados. As amostras podem ser
armazenadas a -20 ºC, mas a qualidade do DNA sempre deve ser
verificada antes de cada análise.

3.3.2. Verificação da qualidade do DNA


Para confirmar a concentração e pureza do DNA, as amostras
podem ser submetidas à eletroforese em minigel de agarose de 10
cm x 11 cm a 1,0% (0,4 g de agarose em 40 mL de TBE 1X). Aplicar
2 µL da amostra adicionados a 2 µL de tampão de amostra (0,25%
de azul de bromofenol e 40% de sacarose ou 30% de glicerol).
Submeter à eletroforese durante 40 minutos a 80 Volts. Como essa
é apenas uma etapa de verificação, outros tamanhos de géis, bem
como o tempo e a voltagem, podem ser alterados. A concentração
do DNA pode ser verificada por comparação com padrões de peso
molecular conhecidos, por exemplo, LambdaTM (InvitrogenTM) ou Low
DNA Mass Ladder (InvitrogenTM), ou outro padrão similar. A pureza e
concentração do DNA devem ser verificadas após a coloração com
brometo de etídio e visualização em um transiluminador sob
radiação ultravioleta de comprimento de onda curto, ou pelo uso de
outro corante que tenha a mesma finalidade, adequando os filtros e
comprimentos de onda para esse corante. Equipamentos de
quantificação de DNA também podem ser utilizados. A pureza do
DNA pode ser verificada, no gel, pela análise de uma única banda
de DNA, sem qualquer tipo de arraste; no caso de leitura em
espectrofotômetro, a relação das leituras nos comprimentos de
onda 260/280 nm deve ficar entre 1,8 e 2,0. A concentração do DNA
deve ser ajustada para a concentração desejada, recomendando-se
50 ng/µL, usando água Milli-Q esterilizada como diluente.

3.3.3. Reação de BOX-PCR


Para as amplificações por BOX-, Eric- e REP-PCR são utilizados
os primers descritos por Versalovic et al. (1991, 1994), Koeuth et al.,
(1995) e de Bruijn (1992) e listados na Tabela 2.

Tabela 2. Primers utilizados nas análise de rep-PCR de bactérias.

Primer Sequência

BOX 5’— CTACGGCAAGGCGACGCTGACG – 3’

REP 1R 5’— IIIICGICGICATCIGGC – 3’

REP 2I 5’— ICGICTTATCIGGCCTAC – 3’

Eric 1R 5’— ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC – 3’

Eric 2 5’— AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG – 3’

Na reação de BOX-PCR, o primer BOX será utilizado para a


amplificação seguindo a metodologia descrita por Versalovic et al.
(1994) e Koeuth et al. (1995), com as modificações especificadas
por Hungria et al. (2008). Visando à uniformização para a obtenção
de perfis idênticos, a reação de amplificação deverá ser conduzida
em um volume final de 25 µL, contendo água Milli-Q estéril, 13,8 µL;
dNTPs, 5,0 µL (estoque com 1,5 mmol/L de cada base); tampão
10X (500 mmol/L KCl; 200 mmol/L Tris, pH 8,4), 2,5 µL; MgCl2, 1,5
µL (50 mmol/L); primer, 1,0 µL (50 pmol/µL); DNA, 1,0 µL (50 ng/
µL); Taq, 0,2 µL (5 U/µL). As concentrações podem ser ajustadas no
caso de reagentes com concentrações distintas.
A amplificação será realizada usando-se os seguintes ciclos: 1
ciclo de desnaturação inicial a 95 °C por 7 minutos; 30 a 35 ciclos de
desnaturação (1 minuto a 94 °C), anelamento (1 minuto a 53 °C) e
extensão (8 minutos a 65 °C); 1 ciclo de extensão final a 65 °C por
16 minutos; manutenção a 4 °C. Para a análise com DNA, 30 ciclos
são suficientes, enquanto que, para células ou colônias,
recomendam-se 35 ciclos (VERSALOVIC et al., 1994).
Depois da amplificação, adicionar, aos 25 µL de cada reação, 5
µL de tampão de amostra (0,25% de azul de bromofenol e 40% de
sacarose ou 30% de glicerol). Preparar um gel de agarose (low
EEO, type I-A) a 1,5%, diluído em tampão TBE 1X. Adicionar 250
mL da solução a uma bandeja de cuba de eletroforese de,
aproximadamente, 20 cm x 25 cm. Nas canaletas do gel, colocar 30
µL de cada amostra, com exceção da primeira canaleta, da última e,
preferencialmente, também da central, nas quais devem ser
colocados 5 µL de padrão, por exemplo, do padrão de peso
molecular de 1 kb plus DNA LadderTM (InvitrogenTM), ou outro padrão
similar. Para preparar o padrão de 1 kb plus DNA LadderTM, para
cada 1 µL do marcador, deve-se adicionar 2 µL de tampão de
amostra e 7 µL de água Milli-Q; desse modo, a aplicação de 5 µL
corresponde a 0,5 µg de padrão. Incluir sempre tubos controle,
contendo todos os reagentes da reação de PCR, exceto pelo DNA,
para verificar possíveis contaminações. Aplicar a voltagem de 120 V
(aproximadamente 5 V/cm) e correr à temperatura ambiente por,
aproximadamente, 6 horas e 30 minutos (entre 6 e 7 horas), até que
faltem cerca de 2 cm para o final do gel. Corar o gel com brometo de
etídio, visualizar em transiluminador sob radiação UV e fotografar.

3.3.4. Estirpes apresentando perfis idênticos por BOX-PCR


No caso de estirpes apresentando o mesmo perfil de BOX-PCR,
podem-se obter, se necessário, comprovação de identidade, os
perfis de Eric-PCR ou REP-PCR. Para a reação de amplificação,
devem-se utilizar as mesmas concentrações recomendadas para
BOX-PCR, exceto que, pela utilização de 2 primers, adicionando 1
µL de cada um (50 pmol/µL), o volume final de 25 µL levará 1 µL a
menos de água Milli-Q estéril.
A reação de amplificação será realizada segundo Bruijn (1992) e
Versalovic et al. (1994), com as modificações efetuadas por Santos
et al. (1999), resultando nos ciclos descritos a seguir: para REP 1R
e REP 2I, 1 ciclo a 95 °C por 7 minutos; 30 a 35 ciclos a 94 °C por 1
minuto, a 45 °C por 1 minuto e a 65 °C por 8 minutos; 1 ciclo final de
extensão a 65 °C por 16 minutos, mantendo-se, então, a 4 °C. Para
os primers Eric 1R e Eric 2, os ciclos serão de 1 ciclo de 95 °C por 7
minutos; 30 a 35 ciclos a 94 °C por 1 minuto, a 52 °C por 1 minuto e
a 65 °C por 8 minutos; 1 ciclo final de extensão a 68 °C por 16
minutos, mantendo-se, então, a 4 °C. A corrida em gel de
eletroforese deverá ser realizada conforme descrito para BOX-PCR.

3.3.5. Análises dos dados


Como descrito para a técnica de Rapd, os produtos de ampli‐
ficação pela técnica de BOX-PCR podem ser analisados em estudos
de diversidade ou identificação de isolados, com o auxílio de progra‐
mas de computação específicos para essa finalidade, como o
NTSYS e Bionumerics, por exemplo. O programa Bionumerics
permite a análise das bandas do gel e a construção de
dendrogramas, por exemplo, com o uso do algoritmo UPGMA
(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean) (SNEATH;
SOKAL, 1973) e o coeficiente de Jaccard (JACCARD, 1912).
Recomenda-se que bandas de peso molecular iguais ou supe‐
riores a 12.000 pb e inferiores a 300 pb não sejam consideradas,
pois apresentam maior variabilidade e podem representar falsos
produtos de PCR.

3.4. Estudos de filogenia e taxonomia de bactérias por


MLSA

3.4.1. Reações de amplificação por PCR do DNA


Inicialmente, deve-se proceder à extração do DNA, conforme
descrito no item 3.3.1. Para o estudo de MLSA, podem ser ampli‐
ficados por PCR diversos genes housekeeping. Como exemplo, a
Tabela 3 relaciona alguns primers utilizados em estudos conduzidos
com rizóbios (MENNA et al., 2009a; RIBEIRO et al., 2009).

Tabela 3. Primers utilizados em análises por MLSA em rizóbios.

Gene (≈bp) Primer Sequência (5’ - 3’) (1) Referência


pb
1,422
16S RNAr Weisburg et al.
fD1 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (para fD.
(1,500) (1991)
rD1)
Y2 CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT Young et al.
(1991)

362f CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG Menna et al.


(2006)

786f CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG Menna et al.


(2006)

rD1 AAGGAGGTGATCCAGCC Weisburg et al.


(1991)

dnaK1466F AAGGARCANCAGATCCGCATCCA 305 Martens et al.


dnaK (1,900)
(2007)
dnaK1777R TASATSGCCTSRCCRAGCTTCAT

recA6F CGKCTSGTAGAGGAYAAATCGGTGGA 498 Gaunt et al.


recA (1,090)
(2001)
recA555R CGRATCTGGTTGATGAAGATCACCAT

recA (outra BRdnaKf TTCGACATCGACGCSAACGG 524 Menna et al.


opção) (2009a)
BRdnaKr GCCTGCTGCKTGTACATGGC

gltA428F CSGCCTTCTAYCAYGACTC 644 Martens et al.


gltA (1,290)
(2007)
gltA1111R GGGAGCCSAKCGCCTTCAG

TSglnIIf AAGCTCGAGTACATCTGGCTCGACGG 647 Stepkowski et


glnII (1,040)
al. (2005)
TSglnIIr SGAGCCGTTCCAGTCGGTGTCG

RRrpoAf GGAAATCGCCATCAAGATGG 637 Ribeiro et al.


rpoA (1,010)
(2009)
RRrpoAr GGAAATCGCCATCAAGATGG

TSatpDf TCTGGTCCGYGGCCAGGAAG 577 Stepkowski et


atpD (1,460)
al. (2005)
TSatpDr CGACACTTCCGARCCSGCCTG
(1)
Obtidos pela amplificação.

As condições de amplificação do DNA devem ser conduzidas


conforme descrito anteriormente, para o 16S rRNA, recA, glnII e
atpD (MENNA et al., 2006), e para dnaK, gltA e rpoA (RIBEIRO et
al., 2009), conforme também pode ser visualizado na Tabela 4.

Tabela 4. Condições de amplificação por PCR para os genes 16S RNAr, dnaK, recA, gltA, glnII,
rpoA e atpD com o uso dos primers relacionados na Tabela 3.

Gene Ciclo de amplificação


16S 2 minutos 95 °C, 30 X (15 segundos 94 °C, 45 segundos 93 °C, 45 segundos 55 °C, 2 minutos
RNAr 72 °C), ciclo final de extensão de 5 minutos 72 °C
1 minuto 94 °C, 35 X (1 minuto 94 °C, 1 minuto 64 °C, 40 segundos 72 °C), ciclo final de
dnaK
extensão de 5 minutos 72 °C
2 minutos 95 °C, 35 X (45 segundos 95 °C, 30 segundos 58 °C, 1,5 minuto 72 °C), ciclo final
recA
de extensão de 7 minutos 72 °C
5 minutos 95 °C, 3 X (2 minutos 94 °C, 2 minutos 53 °C, 1 minuto 72 °C), 30 X (30 segundos
gltA
94 °C, 1 minuto 53 °C, 1 minuto 72 °C), ciclo final de extensão de 5 minutos 72 °C
2 minutos 95 °C, 35 X (45 segundos 95 °C, 30 segundos 58 °C, 1,5 minuto 72 °C), ciclo final
glnII
de extensão de 7 minutos 72 °C
2 minutos 95 °C, 35 X (45 segundos 94 ºC, 45 segundos 55 ºC, 2 minutos 72 ºC), ciclo final de
rpoA
extensão de 5 minutos 72 ºC
2 minutos 95 °C, 35 X (45 segundos 95 °C, 30 segundos 58 °C, 1,5 minuto 72 °C), ciclo final
atpD
de extensão de 7 minutos 72 °C

Os produtos amplificados deverão ser purificados, por exemplo,


com o kit QIAquick PCR purification kit (Qiagen), segundo instruções
do fabricante, e sequenciados diretamente, conforme especificação
do fabricante para cada sequenciador.

3.4.2. Análise dos dados


Deve-se proceder ao alinhamento das sequências para cada
gene. Para isso, pode-se utilizar, por exemplo, o programa Clustal_X
(THOMPSON et al., 1997). Às sequências obtidas nos estudos
devem ser adicionadas sequências de estirpes de referência, ou
estirpes tipo. Primeiro, as sequências obtidas devem ser analisadas
individualmente, considerando-se apenas o bloco de sequências
alinhadas com todos os indivíduos estudados. As sequências
individuais podem, então, ser unidas (concatenadas) e analisadas
usando programas como o Molecular Evolutionary Genetics Analysis
(Mega) (KUMAR et al., 2004), por exemplo, com o modelo de
distância K2P (KIMURA, 1980) e o algoritmo Neighbor-Joining
(SAITOU; NEI, 1987). Recomenda-se, também, o teste de suporte
estatístico de bootstrap (FELSENSTEIN, 1985), com 1.000 ou 2.000
amostragens.
4. Referências

ALBERTON, O.; KASCHUK, G.; HUNGRIA, M. Sampling effects on the assessment of


genetic diversity of rhizobia associated with soybean and common bean. Soil Biology &
Biochemistry, Oxford, v. 38, p. 1298-1307, 2006.
ANDERSON, I. C.; CAIRNEY, J. W. G. Diversity and ecology of soil fungal communities:
increased understanding through the application of molecular techniques. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 6, p. 769-779, 2004.
ATKINS, S. D.; CLARK, I. M. Fungal molecular diagnostics: a mini review. Journal of
Applied Genetics, Varsovia, v. 45, p. 3-15, 2004.
BAIN, J. M.; TAVANTI, A.; DAVIDSON, A. D.; JACOBSEN, M. D.; SHAW, D.; GOW, N. A.
R.; ODDS, F. C. Multilocus sequence typing of the pathogenic fungus Aspergillus fumigatus.
Journal of Clinical Microbiology, Washington, DC, v. 45, p. 1469-1477, 2007.
BARCELLOS, F. G.; HUNGRIA, M.; MENNA, P.; BATISTA, J. S. S.; RIBEIRO, R. A.
Taxonomia bacteriana: aspectos atuais e perspectivas. In: FURLANETO, M. C.;
NOGUEIRA, M. A. (Ed.). Tópicos Atuais em Microbiologia. Londrina: Eduel, 2010. Não
publicado.
BARCELLOS, F. G.; MENNA, P.; BATISTA, J. S. S.; HUNGRIA, M. Evidence of horizontal
transfer of symbiotic genes from a Bradyrhizobium japonicum inoculant strain to indigenous
Sinorhizobium (Ensifer) fredii and Bradyrhizobium elkanii in a Brazilian savannah soil.
Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 73, n. 8, p. 2635-2643, 2007.
BATISTA, J. S. S.; HUNGRIA, M.; BARCELLOS, F. G.; FERREIRA, M. C.; MENDES, I. C.
Variability in Bradyrhizobium japonicum and B. elkanii seven years after introduction of both
the exotic microsymbiont and the soybean host in a Cerrados soil. Microbial Ecology, New
York, v. 53, p. 270-284, 2007.
BERBEE, M. L.; TAYLOR, J. W. Systematics and evolution. In: MCLAUGHLIN, D. J.;
MCLAUGHLIN, E. G.; LEMKE, P. A. (Ed.). The Mycota VIIB. Berlin, DE: Springer Verlag,
2001. p. 229–245.
BINDE, D. R.; MENNA, P.; BANGEL, E. V.; BARCELLOS, F. G.; HUNGRIA, M. rep-PCR
fingerprinting and taxonomy based on the sequencing of the 16S rRNA gene of fifty-four
elite commercial rhizobial strains. Applied Microbiology and Biotechnolgy, Washington, DC,
v. 83, p. 897-908, 2009.
BRADSHAW, R. E.; FOSTER, S. J.; MONAHAN, B. J. Molecular Diagnostic tools for
detection of plant pathogenic fungi. In: RAO, J. R.; FLEMING, C. C.; MOORE, J. E. (Ed.).
Molecular diagnostics: current technology and applications. Norfolk: Horizon Bioscience,
2006. p. 47–69.
BRIDGE, P. D.; ARORA, D. K. Interpretation of PCR methods for species definition. In:
BRIDGE, P. D.; ARORA, D. K.; REDDY, C. A.; ELANDER, R. P. (Ed.). Applications of PCR
in Mycology. Wallingford: CAB International, 1998. p. 63-84.
BRUIJN, F. J. Use of repetitive (repetitive extragenic palindromic and enterobacterial
repetitive intergeneric consensus) sequences and the polymerase chain reaction to
fingerprint the genomes of Rhizobium meliloti isolates and other soil bacteria. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 58, p. 2180-2187, 1992.
COENYE, T.; VANDAMME, P.; GOVAN, J. R. W.; LIPUMA, J. J. Taxonomy and identification
of the Burkholderia cepacia complex. Journal of Clinical Microbiology, Washington, DC, v.
39, n. 10, p. 3427-3436, 2001.
COWAN, S. T. A dictionary of microbial taxonomic usage. Edinburgh: Oliver & Boyd, 1968.
118 p.
DEMEKE, T.; ADAMS, R. P. The use of PCR-RAPD analysis in plant taxonomy and
evolution. In: GRIFFIN, H. G; GRIFFIN, A. M. (Ed.). PCR technology: current innovations.
Florida: CRC Press, 1994. p. 179-191.
DNYANESHWAR, W.; PREETI, C.; KALPANA, J.; BHUSHAN, P. Development and
application of RAPD-SCAR marker for identification of Phyllanthus emblica Linn. Biological
and Pharmaceutical Bulletin, Tokyo, JP, v. 29, p. 2313-2316, 2006.
ENRIGHT, M. C.; SPRATT, B. G. Multilocus sequence typing. Trends in Microbiology,
Oxford, v. 7, p. 482-487, 1999.
FELSENSTEIN, J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap.
Evolution, [S. l.], v. 39, p. 783-791, 1985.
FERNANDES, M. F.; FERNANDES, R. P. M.; HUNGRIA, M. Caracterização genética de
rizóbios nativos dos tabuleiros costeiros eficientes para as culturas do guandu e caupi.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 38, p. 911-920, 2003.
FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em
análise genética. Brasília, DF: Embrapa Cenargen, 1998. p. 62-68.
GARRITY, G. M.; BOONE, D. R.; CASTENHOLZ, R. W. (Ed.). Bergey’s manual of systematic
bacteriology. 2..ed. New York: Springer-Verlag, 2001.
GARRO, J.; GENÉ, J.; STCHIGEL, A. M. Developments in Fungal Taxonomy. Clinical
Microbiology Reviews, Washington, DC, v. 12, p. 454-500, 1999.
GAUNT, M. W.; TURNER, S. L.; RIGOTTIER-GOIS, L.; LLOYD-MACGILP, S. A; YOUNG, J.
P. Phylogenies of atpD and recA support the small subunit rRNA-based classification of
rhizobia. International Journal Systematic and Evolutionary Microbiology, Washington, DC,
v. 51, p. 2037-2048, 2001.
GERMANO, M. G.; MENNA, P.; MOSTASSO, F. L.; HUNGRIA, M. RFLP analysis of the
RNA operon of a Brazilian collection of bradyrhizobial strains from thirty-three legume
species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Washington,
DC, v. 56, p. 217-229, 2006.
GEVERS, D.; COHAN, F. M.; LAWRENCE, J. G.; SPRATT, B. G.; COENYE, T.; FEIL, E. J.;
STACKEBRANDT, E.; VAN DE PEER, Y.; VANDAMME, P.; THOMPSON, F. L.; SWINGS, J.
Opinion: Re-evaluating prokaryotic species. Nature Reviews Microbiology, New York, v. 3, p.
733-739, 2005.
GRANGE, L.; HUNGRIA, M. Genetic diversity of indigenous common bean (Phaseolus
vulgaris L.) rhizobia in two Brazilian ecosystem. Soil Biology Biochemistry, Oxford, v. 36, n.
9, p.1389-1398, 2004.
HUNGRIA, M.; ANDRADE, D. S.; CHUEIRE, L. M. O.; PROBANZA, A.; GUTTIERREZ-
MAÑERO, F. J.; MEGÍAS, M. Isolation and characterization of new efficient and competitive
bean (Phaseolus vulgaris L.) rhizobia from Brazil. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 32,
p. 1515-1528, 2000.
HUNGRIA, M.; CHUEIRE, L. M. O.; MEGÍAS, M.; LAMRABET, Y.; PROBANZA, A.;
GUTTIERREZ-MANERO, F. J.; CAMPO, R. J. Genetic diversity of indigenous tropical fast-
growing rhizobia isolated from soybean nodules. Plant and Soil, Hague, v. 288, p. 343-356,
2006.
HUNGRIA, M.; CHUEIRE, L. M. O.; MENNA, P.; BANGEL, E. V. Caracterização genética de
rizóbios e outras bactérias diazotróficas e promotoras do crescimento de plantas por BOX-
PCR. Londrina: Embrapa Soja, 2008. 12 p. (Embrapa Soja. Comunicado Técnico, 79).
INNES, M. A.; MYAMBO,vK. B.; GELFAND, D. H.; BROW, M. A. D. DNA sequencing with
Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction
amplified DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, Washington, DC, v. 86, p. 9355-9359, 1988.
JACCARD, P. The distribution of flora in the alpine zone. New Phytologist, Oxford, v. 11, p.
37–50, 1912.
KASCHUK, G.; HUNGRIA, M.; ANDRADE, D. S.; CAMPO, R. J. Genetic diversity of
rhizobia associated with common bean (Phaseolus vulgaris L.) grown under the no-tillage
and conventional systems in Southern Brazil. Applied Soil Ecology, Amsterdam, NL, v. 32, n.
2, p. 210-220, 2006.
KIMURA, M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through
comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution, New York, v.
16, p. 111-120, 1980.
KOEUTH, T.; VERSALOVIC, J.; LUPSKI, J. R. Differential subsequence conservation of
interspersed repetitive Streptococcus pneumoniae BOX elements in diverse bacteria.
Genome Research, Ottawa, CA, v. 5, p. 408-418, 1995.
KUMAR, S.; TAMURA, K.; NEI, M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary
Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics, Oxford, v. 5, p. 150-
163, 2004.
LAPAGE, S. P.; SNEATH, P. H. A.; LESSEL, E. F.; SKERMAN, V. B. D.; SEELIGER, H. P.
R.; CLARK, W. A. International code of nomenclature of Bacteria (1900 revision).
Washington, DC: American Society for Microbiology, 1992.
MARTENS, M.; DELAERE, M.; COOPMAN, R.; VOS, de P.; GILLIS, M.; WILLEMS, A.
Multilocus sequence analysis of Ensifer and related taxa. International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology, Washington, DC, v. 57, p. 489-503, 2007.
MCCARTNEY, H. A.; FOSTER, S. J.; FRAAIJE, B. A.; WARD, E. Molecular diagnostics for
fungal plant pathogens. Pest Management Science, Sussex, v. 59, p. 129-142, 2003.
MENNA, P.; BARCELLOS, F. G.; HUNGRIA, M. Phylogeny and taxonomy of a diverse
collection of Bradyrhizobium strains based on multilocus sequence analysis of 16S rRNA,
ITS, glnII, recA, atpD and dnaK genes. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, Washinglton, DC, v. 59, p. 2934-2950, 2009a.
MENNA, P.; HUNGRIA, M.; BARCELLOS, F. G.; BANGEL, E. V.; HESS, P. N.; MARTÍNEZ-
ROMERO, E. Molecular phylogeny based on the 16S rRNA gene a of elite rhizobial strains
used in Brazilian commercial inoculants. Systematic and Applied Microbiology, Stuttgart, v.
29, n. 4, p. 315-32, 2006.
MENNA, P.; PEREIRA, A. A.; BANGEL, E. V.; HUNGRIA, M. rep-PCR of tropical rhizobia
for strain fingerprinting, biodiversity appraisal and as a taxonomic and phylogenetic tool.
Symbiosis, Israel, v. 48, n. 1-3, p. 120-130, 2009b.
MORTON, C. O.; MAUCHLINE, T. H.; KERRY, B. R.; HIRSCH, P. R. PCR-based
fingerprinting indicates host-related genetic variation in the nematophagous fungus
Pochonia chlamydosporia. Mycological Research, Cambridge, v. 107, p. 198-205, 2003.
NISHI, C. Y. M.; BODDEY, L. H.; VARGAS, M. A. T.; HUNGRIA, M. Morphological,
physiological and genetic characterization of two new Bradyrhizobium strains recently
recommended as Brazilian commercial inoculants for soybean. Symbiosis, Israel, v. 20, p.
147-162, 1996.
PINTO, F. G. S.; HUNGRIA, M.; MERCANTE, F. M. Polyphasic characterization of Brazilian
Rhizobium tropici strains effective in fixing N2 with common bean (Phaseolus vulgaris L.).
Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 39, n. 8, p. 1851-1864, 2007.
RAEDER, U.; BRODA, P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters of
Applied Microbiology, Oxford, v. 1, p. 17-20, 1985.
RIBEIRO, R. A.; BARCELLOS, F. G.; THOMPSON, F. L.; HUNGRIA, M. Cus sequence
analysis of Brazilian Rhizobium strains microsymbionts of common beans (Phaseolus
vulgaris) reveals unexpected taxonomic diversity. Research in Microbiology, Paris, FR, v. 16,
p. 297-306, 2009.
SAIKI, R. K.; GELFAND, D. H.; STOFFEL, S.; SCHARF, S. J.; HIGUCHI, R.; HORN, E. T.;
ERLICH, H. A. Primer-directed enzimatic amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase. Science, Washington, DC, v. 239, p. 487-491, 1988.
SAITOU, N.; NEI, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing
phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, Chicago, v. 4, p. 406-425, 1987.
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual.
2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
SANTOS, M. A.; VARGAS, M. A. T.; HUNGRIA, M. Characterization of soybean
bradyrhizobia strains adapted to the Brazilian Cerrados Region. FEMS Microbiology
Ecology, Haren, v. 30, p. 261-272, 1999.
SNEATH, P. H. A.; SOKAL, R .R. Numerical taxonomy: the principles and practice of
numerical classification. San Francisco: W.H. Freeman, 1973. 573 p.
SOMASEGARAN, P.; HOBEN, H. J. Handbook for rhizobia: methods in legume Rhizobium
technology. New York: Springer-Verlag, 1994.
STACKEBRANDT, E.; FREDERIKSEN, W.; GARRITY, G. M.; GRIMONT, P. A. D.;
KÄMPFER, P.; MAIDEN, M. C. J.; NESME, X.; ROSSELLÓ-MORA, R.; SWINGS, J. Report
of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology.
International Journal of Systematics and Evolutionary Microbiology, Reading, v. 52, p. 1043-
1047, 2002.
STEPKOWSKI, T.; CZAPLINSKA, M.; MIEDZINSKA, K.; MOULIN, L. The variable part of
the dnaK gene as an alternative marker for phylogenetic studies of rhizobia and related
alpha Proteobacteria. Systematic and Applied Microbiology, Stuttgart, v. 26, p. 483-494,
2003.
STEPKOWSKI, T.; MOULIN, L.; KRZYŻAŃSKA, A.; McINNES, A.: LAW, I. J.; HOWIESON,
J. European origin of Bradyrhizobium populations infecting lupins and serradella in soils of
Western Australia and South Africa. Applied and Environmental Microbiology, Washington,
DC, v. 71, p. 7041-7052, 2005.
STOCCO, P.; SANTOS, J. C. P.; VARGAS, V. P.; HUNGRIA, M. Avaliação da biodiversidade
de rizóbios simbiontes do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) em Santa Catarina, Revista
Brasileira de Ciência do Solo, Campinas, v. 32, n. 3, p. 1107-1120, 2008.
SU, H.; WANG, L.; GE, Y.; FENG, E.; SUN, J.; LIU, L. Development of strain-specific SCAR
markers for authentication of Ganoderma lucidum. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, Oxford, v. 24, p. 1223-1226, 2008.
THOMPSON, J. D.; GIBSON, T. J.; PLEWNIAK, F.; JEANMOUGIN, F.; HIGGINS, D.C. The
CLUSTAL X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by
quality analysis tools. Nucleic Acids Research, London, UK, v. 25, p. 4876-4882, 1997.
TRUPER, H. G.; SCHLEIFER, K. H. Prokaryote characterization and identification. In:
BALOWS, A.; TRUPER, H. G.; DWORKIN, M.; HARDER, W.; SCHLEIFER, K. H. (Ed.). The
Prokaryotes. 2nd ed. New York: Springer, 1991. p. 126-148.
VANDAMME, P.; POT, B.; GILLIS, M.; DE VOS, P.; KERBSTERS, K.; SWINGS, J.
Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiological
Reviews, Washington, DC, v. 60, n. 2, p. 407-438, 1996.
VERSALOVIC, J.; KOEUTH, T.; LUPSKI, J. R. Distribution of repetitive DNA sequences in
eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research,
London, UK, v. 19, p. 6823-6831, 1991.
VERSALOVIC, J.; SCHNEIDER, M.; DE BRUIJN, F. J.; LUPSKI, J. R. Genomic fingerpriting
of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods in
Molecular and Cell Biology, Washington, DC, v. 5, p. 25-40, 1994.
VIAUD, M.; PASQUIER, A.; BRYGOO, Y. Diversity of soil fungi studied by PCR-RFLP of
ITS. Mycological Research, Cambridge, v. 104, p. 1027–1032, 2000.
WEISBURG, W. G.; BARNS, S. M.; PELLETIE, D. A.; LANE, D. J. 16S ribosomal DNA
amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology, Washington, DC, v. 173, p. 97-
703, 1991.
WINSHIP, P. R. An improved method for directly sequencing PCR amplified material using
dimethyl sulphoxide. Nucleic Acids Research, London, UK, v. 17, p. 266, 1989.
WOESE, C. R. Bacterial evolution. Microbiology Reviews, Washington, DC, v. 51, p. 221-
271, 1987.
WOESE, C. R.; KANDLER, O.; WHEELIS, M. L. Towards a natural system of organisms:
proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eukarya. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, Washington, DC, v. 87, p. 4576-4579,
1990.
WOO, P. C. Y.; LAU, C. C. Y.; CHONG, K. T. K.; TSE, H.; TSANG, D. N. C.; LEE, R. A.;
TSE, C. W. S.; HUI, W.; WONG, S. Y.; LAU, S. K. P.; YUEN, K. MP1 homologue-based
multilocus sequence system for typing the pathogenic fungus Penicillium marneffei: a novel
approach using lineage-specific genes. Journal of Clinical Microbiology, Washington, DC, v.
45, p. 3647-3654, 2007.
YOUNG, J. P. W.; DOWNER, H. L.; EARDLY, B. D. Phylogeny of the phototropic Rhizobium
strain BTAi1 by polymerase chain reaction-based sequencing of a 16S rRNA gene
segment. Journal of Bacteriology, Washington, DC, v. 173, p. 2271-2277, 1991.
ZEIGLER, D. R. Gene sequences useful for predicting relatedness of whole genomes in
bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Washington,
DC, v. 53, p. 1893-1900, 2003.
Capítulo 2
Métodos moleculares na análise
da diversidade de fungos
micorrízicos
Adália Cavalcanti do Espírito Santo Mergulhão
Márcia Vanusa da Silva
Elaine Malosso

1. Introdução

A micorriza arbuscular é uma simbiose mutualística entre raízes


da maioria das plantas e fungos do filo Glomeromycota (SCHÜBLER
et al., 2001). A impossibilidade de crescimento dos fungos micorrízi‐
cos arbusculares (FMA) em meios sintéticos na ausência de raízes
metabolicamente ativas e a não caracterização da fase sexuada em
seu ciclo de vida fazem com que a identificação e classificação
desses fungos estejam baseadas, quase que exclusivamente, na
morfologia e estrutura de seus esporos vegetativos (MORTON,
1993). A caracterização fenotípica pode ser influenciada por
condições ambientais e pelo estádio de desenvolvimento dos
esporos, introduzindo problemas para a identificação precisa de
populações de FMA oriundas do campo, bem como para o
acompanhamento de espécies introduzidas. É extremamente difícil
distinguir as espécies de FMA durante a fase simbiótica micelial nos
tecidos radiculares (SALLES; SOUZA, 1998), além do mais, várias
espécies recentemente caracterizadas não coram com os
procedimentos padrões (REDECKER et al., 2000). As dificuldades
de cultivar os FMA in vitro representam um obstáculo ainda não
superado, limitando os estudos de sua biologia e aplicação
biotecnológica. A biologia molecular tem permitido identificar fungos
a partir de esporos coletados diretamente do campo e também
identificar FMA que estão colonizando as raízes (DICKIE;
FITZJOHN, 2007; GAMPER; LEUCHTMANN, 2007; JOLLER;
ROSENDAHL., 2000; KOWALCHUK et al., 2002; MERGULHÃO et
al., 2008; RENKER et al., 2006,).
Considerável atenção tem sido dirigida para o aspecto genético
das populações microbianas em uma tentativa de melhorar o
conhecimento dos táxons microbianos (BRUNS et al., 1991) e suas
relações filogenéticas (BILLS et al., 1999; HIBBETT et al., 2007).
Como relativamente poucos microrganismos são cultiváveis (HEAD
et al., 1998), os estudos envolvendo extração de DNA e análise de
sequências de fragmentos de DNA têm aumentado
significativamente desde o advento da reação em cadeia da
polimerase (PCR) nos anos 80 (SAIKI et al., 1988). Os métodos de
sequenciamento de ácidos nucleicos têm sido desenvolvidos tão
rapidamente que o sequenciamento comparativo de genes
homólogos está rapidamente se tornando uma técnica padrão na
sistemática e filogenética molecular.
A abordagem com uso de PCR não está livre de problemas em
virtude da possibilidade da lise incompleta das células, extração
incompleta do DNA do solo e vieses da PCR (MUYZER; SMALLA,
1998). Bruns e Gardes (1993) afirmam que a região ideal para
realizar amplificações de PCR deve atender os seguintes critérios:
a) estar presente em todos os fungos de interesse: b) ser fácil de
amplificar; c) amplificar preferencialmente o DNA do fungo, quando
este se encontra junto com o DNA da planta; d) ser suficientemente
variável para permitir desenhar iniciadores para numerosas
hierarquias taxonômicas. Os genes que codificam o rRNA atendem
muitos desses critérios, por isso têm sido comumente utilizados
neste tipo de estudo (GAMPER; LEUCHTMANN, 2007; GRIFONI et
al., 1995; RENKER et al., 2003, 2006). Dentre estes genes, as
regiões codificadoras (18S, 5.8S e 28S) são as mais conservadas,
as regiões internas (ITS) mostram variações intraespecíficas, e as
regiões intergênicas (IGS) são as mais variáveis (Figura 1)
(LANFRANCO et al., 1998).
Com os avanços das técnicas de biologia molecular, várias
análises como RFLP (ITS, IGS), AFLP, ARISA, LH-PCR, DGGE,
TGGE e t-RFLP têm sido usadas em estudos direcionados à
caracterização da diversidade e da dinâmica de comunidades
microbianas, incluindo as de fungos micorrízicos. Este capítulo tem
por objetivo revisar de forma sucinta os principais métodos
moleculares empregados atualmente no estudo de FMA e
apresentar alguns protocolos de execução destes métodos.
,

Figura 1. Representação de uma unidade de rDNA mostrando as regiões ITS (espaços


internos transcritos) e a posição de anelamento dos principais iniciadores.
Fonte: White et al. (1990).

2. PCR-RFLP (Polimorfismo no comprimento


de fragmentos de restrição)

Análises de fragmentos de restrição de DNA amplificados por


PCR constituem uma ferramenta poderosa que permite a detecção
de moléculas de ácidos nucleicos específicos presentes em peque‐
nas quantidades e tem sido aplicada com sucesso na identificação
de FMA. Os polimorfismos no comprimento de fragmentos,
baseados na técnica PCR-RFLP, podem ser observados em gel de
agarose após corte por enzimas de restrição dos fragmentos de
DNA de fita dupla, possibilitando que o DNA de dois ou mais
indivíduos sejam comparados. O polimorfismo ocorre porque o DNA
de indivíduos geneticamente distintos difere na sequência de
nucleotídeos ao longo da fita. Ao ser submetido à clivagem com
uma enzima de restrição, o DNA de indivíduos geneticamente
distintos é cortado nos sítios de restrição, gerando fragmentos de
diversos tamanhos. A base genética do polimorfismo observado
resulta de mutações nos sítios de restrição ou de inserções,
deleções e rearranjos entre estes sítios.

2.1. Etapas envolvidas na análise do PCR-RFLP

-- Extração de DNA (método abaixo citado).


-- Amplificação do fragmento de interesse em termociclador
(Tabela 1).
-- Corte do DNA com enzimas de restrição (Tabela 2).
-- Separação por eletroforese dos fragmentos em gel de
agarose 1% (1 g de agarose em 100 mL de tampão TBE 1X).
Obs.: [TBE 5X: 54 g Tris-básico; 27 g de ácido bórico; 20 mL EDTA
0,5 M (pH 8,0) e completar para 1 L de água].
[TBE 1X: retirar 200 mL da solução de TBE 5X e completar para
1.000 mL de água].
-- Gel corado com SybrGold, visualizado em U.V. (ultravioleta) e
fotografado.

Tabela 1. Modelo para preparo da reação de PCR.

Reagente (concentração estoque) Quantidade para volume final de 25 µL

Água estéril 16,7 µL

Tampão (10X) 2,5 µL

MgCl2 (2,5 mM) 1,25 µL


dNTP (0,3 µM) 0,75 µL

Iniciadores (2 µM) 0,5 µL

Taq (1 U–5 U) 0,3 µL

DNA (20 ng–40 ng) 3,0 µL

Fonte: Ferreira e Grattapaglia (1998).

Tabela 2. Modelo para preparo da solução de digestão de DNA com enzima de restrição.

Quantidade para
Reagente Quantidade para 100 indivíduos
1 indivíduo

10X tampão da enzima 2,0 µL 200 µL

RNAase A (5 µg/µL) 1,0 µL 100 µL

Água estéril 5,5 µL 550 µL

Enzima (10 U/µL) 1,5 µL 150 µL

DNA 1,0 µL –

Obs.: colocar o tubo com os reagentes acima citados em banho-maria a 37 °C por 4 a 6


horas ou em termociclador.
Fonte: Ferreira e Grattapaglia (1998).

2.2. Extração de DNA

Extração de DNA dos esporos de FMA segundo Lanfranco et al.


(2001) com algumas modificações:

2.2.1. Procedimento/Protocolo – Extração de DNA a partir de


esporos de FMA
-- Separe 150 a 200 esporos de FMA com auxílio de uma lupa.
-- Lave várias vezes os esporos de FMA em água destilada
estéril.
-- Transfira os esporos limpos com ajuda de uma pipeta para
tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
-- Leve os tubos de microcentrífuga para um sonicador e
execute de 3 a 4 ciclos por 30 segundos cada.
-- Macere os esporos com ajuda de um micropistilo em 50 µL de
tampão de reação de PCR (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl,
1,1 mM MgCl2).
-- Submeta as amostras a 10 choques térmicos (microtubo
fechado) em nitrogênio líquido e banho-maria a 100 ºC, 1 mi‐
nuto cada choque.
-- Incubar a 95 ºC por 15 minutos em banho-maria e centrifugue
a 10.000 g por 5 minutos.
-- Coletar o sobrenadante e estocar a -20 ºC.

3. Amplified Fragment Length Polymorphism


(AFLP)

O termo AFLP significa polimorfismo de comprimentos de


fragmentos amplificados, inicialmente descrito por Vos et al. (1995).
A técnica associa o polimorfismo gerado por enzimas de restrição
com a capacidade de detecção da técnica de PCR. Nesta técnica, o
DNA genômico clivado por enzimas de restrição tem suas
extremidades ligadas a pequenas sequências de DNA
(adaptadores) que se anelarão com oligonucleotídeos específicos,
durante a PCR. A técnica de AFLP apresenta vantagens, tais como
a detecção de grande número de amplicons por reação, com ampla
cobertura do genoma e considerável reprodutibilidade (DOUHAN;
RIZZO, 2003; SPOONER et. al., 2005). O polimorfismo gerado por
este tipo de marcador pode ser decorrente de mutações de ponto no
sítio de corte da enzima, provocadas por deleções, inversões ou
inserções de bases. Essa alteração pode levar a perda ou ganho de
um sítio de restrição reconhecido pela enzima (MUELLER;
WOLFENBARGER, 1999).
Os kits comerciais empregam as enzimas de restrição EcoRI e
MseI simultaneamente, seguidas da ligação com os adaptadores
específicos. Ver instruções do manual técnico do kit AFLP® Analysis
System for Microorganisms (Invitrogen life technologies) e kit
AFLP™ Microbial Fingerprinting (Applied Biosystems).
A visualização dos fragmentos gerados pela técnica de AFLP
pode ser feita utilizando marcações radioativas, em que um dos
oligonucleotídeos utilizados na amplificação é marcado por um
isótopo (geralmente 32P). Um método de coloração alternativo, que
utiliza nitrato de prata associado ao carbonato de sódio, tem sido
utilizado com sucesso em vários laboratórios.
Abaixo segue descrito um protocolo otimizado baseado em Vos
et al. (1995) para o marcador AFLP utilizando a coloração com prata
adaptada de Creste et al. (2001) para revelação dos fragmentos.

3.1. Passo 1: digestão do DNA genômico

Componentes Para uma amostra

H2O ultrapura Completar volume para 50 µL

Enzima 1 (EcoRI) 5 unidades

Enzima 2 (MseI) 5 unidades

Tampão 10X OPA 5,0 µL

DNA (25 ng/µL) 10,0 µL

Ao se utilizar outras enzimas, deve-se verificar qual tampão é ideal para eficiente
digestão. Incubar a 37 ºC por 2 a 3 horas. Inativar as enzimas a 70 ºC por 15 minutos.
Estocar a -20 ºC.

3.2. Passo 2: ligação dos adaptadores


3.2.1. Preparo dos adaptadores

Adaptador EcoRI (suficiente para 120 ligações)

5,6 µL do adaptador EcoRI foward (600 ng/µL) (5’CTC GTA GAC TGC GTA CC3’)

4,8 µL do adaptador EcoRI reverso (600 ng/µL) (5’AAT TGG TAC GCA GTC TAC3’)

6,0 µL tampão OnePhorAll (OPA) (GE Healthcare Life Sciences)

103,6 µL de H2O ultrapura

Adaptador MseI (suficiente para 120 ligações)

64 µL do adaptador Mse I foward (500 ng/µL) (5’CGATGAGTCCTGAG3’)

56 µL do adaptador Mse I reverso 500 ng/µL) (5’TACTCAGGACTCAT3’)

7 µL tampão OnePhorAll (OPA) (GE Healthcare Life Sciences)

13 µL de H2O ultrapura
Imediatamente após o preparo, os adaptadores deverão ser submetidos, em
termociclador, ao seguinte programa: 1) 65 ºC 10 minutos; 2) 37 ºC 10 minutos; 3) 25 ºC
10 minutos. Estocar os adaptadores a -20 ºC.

3.2.2. Reação de ligação

Componentes Volume para uma amostra (µL)

H2O ultrapura 6,7

Adaptador EcoRI 1,0

Adaptador MseI 1,0

Tampão 10X da ligase 1,0

T4 DNA ligase (3 unid/µL) 0,33


Adicionar os 10 µL desse mix (reação de ligação) aos 50 µL do DNA já digerido, com as
enzimas de restrição (passo 1); incubar a amostra a 20 ºC por 3 horas; estocar a -20 ºC.

3.3. Passo 3: pré-amplificação

Componentes Volume para uma amostra


(µL)

H2O ultrapura 11,4

Tampão 10X da taq polimerase 2,0


MgCl2 (25 mM) 1,2

Mix dNTP’s (10 mM) 0,8

Oligonucleotídeo EcoRI (25 ng/µL)


1,0
(5’GACTGCGTACCAATCA3’)

Oligonucleotídeo MseI (25 ng/µL)


1,0
(5’TGAGTCCTGAGTAAC3’)

Taq polimerase (5 unid/µL) 0,6

DNA ligado aos adaptadores* 2,0

* Passo 2.

3.3.1. Programa para pré-amplificação

Temperatura (ºC) Tempo (min) Número de ciclos

94 2 1

94 1

56 1 26
72 1

72 5 1
Após a pré-amplificação acrescentar 80 µL de água ultrapura. Estocar a -20 ºC.

3.4. Passo 4: reação de amplificação seletiva

Componentes Volume para uma amostra (µL)

H2O ultrapura 12,5

Tampão 10X da taq polimerase 2,0

MgCl2 (25 mM) 1,2


Mix dNTP’s (10 mM) 0,4

Oligonucleotídeo EcoRI (25 ng/µL) 1,0

Oligonucleotídeo MseI (25 ng/µL) 1,0

Taq polimerase (5 unid/µL) 0,4

DNA pré-amplificado 1,5

3.4.1. Programa para amplificação seletiva

Temperatura (ºC) Tempo (min) Número de ciclos

94 2 1

94 0,3

65 0,3 12

72 1

94 0,3

56 0,3 23

72 1

72 2 1
Estocar a -20 ºC.

3.4.2. Sugestões de combinações dos oligonucleotídeos EcoRI


e MseI a serem utilizados na reação de amplificação seletiva

Denominação Sequência do par de oligos 5’- 3’

Oligo 1 E-GACTGCGTACCAATCAGC/M-GATGAGTCCTGAGTAACTG

Oligo 2 E-GACTGCGTACCAATCACA/M-GATGAGTCCTGAGTAACAG

Oligo 3 E-GACTGCGTACCAATCACG/M-GATGAGTCCTGAGTAACAG

Oligo 4 E-GACTGCGTACCAATCAGC/M-GATGAGTCCTGAGTAACAT

Oligo 5 E-GACTGCGTACCAATCACC/M-GATGAGTCCTGAGTAACAG

Oligo 6 E-GACTGCGTACCAATCAAG/M-GATGAGTCCTGAGTAACAA
Oligo 7 E-GACTGCGTACCAATCACG/M-GATGAGTCCTGAGTAACAC

Oligo 8 E-GACTGCGTACCAATCACC/M-GATGAGTCCTGAGTAACTG

3.5. Visualização dos produtos amplificados via AFLP

Os produtos das amplificações podem ser analisados em gel de


poliacrilamida 6% em tampão TBE (89 mM Tris-base; 2 mM EDTA;
89 mM ácido bórico) em condições não desnaturante ou desnatu‐
rante.

3.6. Preparo da matriz de poliacrilamida (30%)

Atenção: acrilamida é tóxica e deve ser manipulada com cuidado.


Usar luvas e máscara até a polimerização.

N,N’ metilenebisacrilamida 1,0 g

Acrilamida 29,0 g

H2O destilada Completar volume para 100 mL


Aquecer a 37 ºC para dissolver. Manter a solução sob penumbra (evitar luz direta).

3.7. Protocolo de gel não desnaturante

Gel de poliacrilamida – gel protean pequeno 6%

H2O destilada 9 mL

Matriz de poliacrilamida (30%) 3 mL

TBE 5X 3 mL

Persulfato de amônia 10% 80 µL

Temed 40 µL

Total 15 mL
Preparo das amostras: carregar normalmente o gel empregando um tampão de
carregamento com azul de bromofenol.
Eletroforese: 120 V em tampão TBE 1 X por 4 horas.

3.8. Protocolo de gel desnaturante

Eletroforese em cuba de sequenciamento


Tratamento das placas de vidro para facilitar a manipulação e
coloração do gel: as placas de vidro devem ser tratadas, sendo a
maior (42 cm x 42 cm) com 2 mL de Plus One Repel Silane (GE
Healthcare Life Sciences). Após a secagem, o excesso do produto
deve ser retirado com lenço de papel umedecido em água destilada.
A outra placa de vidro (menor) de 39 cm x 42 cm deve receber
solução de 2 mL de PlusOne Bind Silane. Após secagem, o excesso
deve ser retirado com lenço de papel umedecido em etanol 95%.
Solução de poliacrilamida e 7 M ureia em TBE para gel de
sequenciamento.

Matriz de poliacrilamida (30%) 100 mL

TBE 5 x 100 mL

Ureia 210 g

H2O destilada Completar volume para 500 mL


Gel de poliacrilamida de sequenciamento 6%.

Gel de poliacrilamida de sequenciamento 6%

Solução de poliacrilamida e 7 M ureia em TBE 70 mL

Persulfato de amônia 10% 250 µL

Temed 100 µL

Total 70 mL
Carregar as placas de vidro com o gel com cuidado para evitar a formação de bolhas. A
espessura do gel é de 0,2 mm a 0,5 mm.
Preparo das amostras: adicionar nas amostras de PCR, antes de
carregar no gel, um volume na proporção de 1:1/2 de tampão de
carregamento (95% formamida, 0,05% xylene cyanol, 0,05%
bromophenol blue, 12,5% sacarose, 10 mM NaOH). As amostras
são desnaturadas a 94 oC por 5 minutos e mantidas em gelo até o
carregamento.
Eletroforese: pré-corrida – 65 V por 40 a 60 minutos, até aquecer
o gel a 50 ºC–55 ºC; corrida – 50 V–60 V em tampão TBE 1 x por 2
horas.

3.9. Coloração do gel

Após a eletroforese, o gel deverá ser revelado sob agitação com


as seguintes soluções:

A) Solução de fixação B) Solução de pré-tratamento

1.780 mL de água
2.000 mL de água ultrapura
ultrapura

20 mL de ácido acético
30 mL de ácido nítrico
glacial

200 mL de etanol
Armazenar em geladeira.
absoluto

Armazenar em geladeira.

C) Solução de
D) Solução reveladora
impregnação

200 mL de água
2.000 mL de água ultrapura
ultrapura

4 g de nitrato de prata 60 g carbonato de cálcio

Armazenar a temperatura Agitar até dissolver completamente e deixar gelar. Na hora de


ambiente em frasco escuro. utilizar, adicionar 1.080 µL de formaldeído.

E) Solução de bloqueio
1.900 mL de água
ultrapura

100 mL de ácido acético


glacial

Armazenar em geladeira.

Método para coloração com nitrato de prata

Procedimento Solução Tempo de agitação

Fixação 10 minutos
A
Lavagem 1 minuto

Pré-tratamento 2,40 minutos


B
Lavagem 1 minuto

Impregnação 20 minutos
C
Lavagem 2 x de 30 segundos

Revelação D Até aparecimento das bandas

Bloqueio 5 minutos
C
Lavagem 1 minuto

Fotografar o gel para realizar análise dos padrões amplificados.

4. Length heterogeneity polymerase chain


reaction (LH-PCR)

Os genes do RNA ribossomal estão entre as sequências mais


comuns e conservadas encontradas na natureza. Tipicamente os
genes do rRNA de eucariotos são encontrados como unidades repe‐
titivas em sequência (100 a 200 cópias), separadas por espaços não
transcritos chamados NTS (Non Transcribed Spacers) (GUEVARA
et al., 1992; RAMIREZ; GUEVARA, 1987; HERWERDEN et al.,
2000). Cada unidade transcrita é composta pelos genes do rRNA
18S, 5,8S e 28S, bem como de várias regiões espaçadoras internas
que são transcritas, chamadas ITS (Internal Transcribed Spacers),
as quais são flanqueadas por sequências NTS.
Os ITS são regiões transcritas, porém não traduzidas dos genes
do rRNA e demonstram uma ampla variabilidade, são relativamente
pequenos e rodeados por segmentos altamente conservados, aos
quais os iniciadores para PCR são direcionados (DÁVILA; MOMEN,
2000; FERNANDES et al., 1999; SOM et al., 2000). Essas
sequências altamente variáveis são de grande importância para
distinguir espécies fúngicas por análise da PCR. Uma das técnicas
da PCR que utiliza a variabilidade das regiões ITS é LH-PCR que
analisa a heterogeneidade de comprimentos dos amplicons da
subunidade menor dos genes do RNA ribossomal (SSU rDNA).
Fragmentos marcados com fluorescência são separados por
eletroforese capilar e detectados a laser em sequenciador
automático de DNA (MANTER; VIVANCO, 2007; RITCHIE et al.,
2000; SUZUKI et al., 1998). Abaixo segue descrito um protocolo
alternativo, em que os fragmentos gerados são clonados em vetor
de clonagem e sequenciados, sem a utilização da marcação por
fluorescência.
As etapas básicas para análise do LH-PCR são as seguintes:
Reação de amplificação.

Componente e concentração final na reação da PCR

Tampão 1X da taq polimerase

MgCl2 1,5 mM

Mix dNTP’s 1 mM

Oligonucleotídeo ITS1F 0,2 µM

Oligonucleotídeo ITS4 0,2 µM

Taq polimerase 2U
DNA molde 10 ng

H2O ultrapura para completar volume*

* O volume total da reação normalmente é de 25 µL.

Sequências dos oligonucleotídeos.

Denominação Sequência do par de oligos 5’- 3’

ITS1F CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA

ITS4 CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG

Programa para amplificação.

Temperatura (ºC) Tempo Número de ciclos

95 5 minutos 1

95 45 segundos

55 45 segundos 26

72 1 minuto

72 5 minutos 1

Estocar a -20 ºC.

4.1. Clonagem do fragmento gerado no PCR

O produto obtido por PCR será clonado em vetor T/A pCR2.1


Topo (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante, e será
empregado na transformação em células de Escherichia coli DH5a.

4.2. Sequenciamento e análise das sequências

As sequências de nucleotídeos de cada inserto serão deter‐


minadas em sequenciador automático de DNA (ABI PRISM 377
Applied Biosystems, Foster City, Califórnia), utilizando o kit Big Dye
Terminator (Applied Biosystems). Oligos convencionais, M13-
Forward e M13-Reverse, serão utilizados para determinar as
sequências de DNA. As sequências obtidas serão submetidas a
uma análise de homologia/similaridade com sequências mantidas
em banco de dados utilizando para tal o programa BlastX
(ALTSCHUL et al., 1997), em bancos de dados National Center for
Biotechnology Information1(NCBI), The Institute for Genomic
Research2 (TIGR) e DNA Data Bank of Japan3(DDBJ).

5. Automated rRNA intergenic spacer


analysis (Arisa)

Análise das regiões intergênicas do rRNA (Risa) é um método


simples e confiável que explora a variabilidade no comprimento da
região intergênica (IGS). Em fungos, a região analisada são os dois
espaçadores internos transcritos e o gene 5.8S (ITS1-5.8S-ITS2) do
operon rRNA de fungo. O Risa automatizado (Arisa) foi
desenvolvido para melhorar a resolução e análise em escala em
fungos (F-Arisa) (CARDINALE et al., 2004; FISCHER; TRIPLETT,
1999; RANJARD et al., 2000, 2001). Arisa envolve a utilização de
um oligonucleotídeo marcado com fluorescência para PCR e
posterior eletroforese em um sistema automatizado.
As etapas básicas para análise do F-Arisa são as seguintes:
Reação de amplificação.

Componente e concentração final na reação de PCR

Tampão 1X da taq polimerase

MgCl2 2,5 mM

Mix dNTP’s 200 µM

Oligonucleotídeo 2234C 1 µM*


Oligonucleotídeo 3126T 1 µM

Taq polimerase 2,5U

DNA molde 50 ng

H2O ultrapura para completar volume**

* Oligo 2234C 5’ marcado com 6-carboxifluoresceína (FAM).


** O volume total da reação normalmente é de 50 µL.

Sequências dos oligonucleotídeos.

Denominação Sequência do par de oligos 5’- 3’

2234C GTTTCCGTAGGTGAACCTGC

3126T ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT

Programa para amplificação.

Temperatura (ºC) Tempo Número de Ciclos

94 2 min 1

94 15 s

55 15 s 30

72 45 s

72 5 min 1

Estocar a -20 ºC.

Preparo das amostras para sequenciamento: reações da PCR


serão diluídos com 80 μL de água ultrapura. 2 μL da diluição serão
adicionados a 13 μL de tampão de carregamento (12 μL de forma‐
mida, 0,5 μL de NaOH 0,3 M e 0,5 μL Genescan 2500 (Tamra)). A
mistura deverá ser desnaturada a 95 °C por 5 minutos.
Sequenciamento: fragmentos Arisa serão resolvidos em gel
poliacrilamida 6% em condições de desnaturação a 150 V por 12
horas em sequenciador ABI 373 (Applied Biosystems). Os dados
serão analisados pelo programa GeneScan 3.1 (Perkin-Elmer). O
software converte os dados de fluorescência em eletroforegrama.
Os picos representam os fragmentos de tamanhos diferentes, e as
alturas dos picos são proporções relativas dos fragmentos no
produto total.
Análise das sequências: idem item das sequências do Length
heterogeneity polymerase chain reaction (LH-PCR).

6. Eletroforese em gel com gradiente


desnaturante (DGGE)

Uma variação da abordagem de PCR e clonagem, a eletroforese


em gel com gradiente desnaturante (DGGE), foi introduzida por
Muyzer et al. (1993). Na DGGE, fragmentos de DNA ribossomal am‐
plificados por PCR, de mesmo comprimento, porém com sequências
diferentes, são separados em géis de poliacrilamida. Essa
separação é baseada na diminuição da mobilidade eletroforética de
uma molécula de DNA de fita dupla parcialmente desnaturada ao
longo de um gradiente linear de desnaturante de DNA (uma mistura
de ureia e formamida). A desnaturação dos fragmentos de DNA
ocorre nos chamados domínios de desnaturação, ou extensões de
pares de bases com temperaturas de desnaturação idênticas. Assim
que um domínio atinge sua temperatura de desnaturação (Tm) em
uma posição particular do gradiente no gel desnaturante, uma
modificação na molécula de DNA da forma helicoidal para
parcialmente desnaturada ocorre, e a migração desse fragmento de
DNA pelo gel praticamente para. Variações na sequência nesses
domínios, principalmente no conteúdo de GC, implicam em
diferenças na concentração de desnaturante que causará a perda
da estrutura helicoidal, fazendo com que moléculas com sequências
diferentes parem de migrar em diferentes posições no gel
(MUYZER; SMALLA, 1998).
O uso da DGGE permite que muitas amostras coletadas em
diferentes intervalos de tempo durante um estudo sejam simultanea‐
mente analisadas. Essa é uma característica que faz da técnica uma
poderosa ferramenta para o monitoramento do comportamento de
comunidades após uma perturbação ambiental. Enquanto a maioria
dos relatos sobre o uso da DGGE (e sua variante TGGE) é
relacionada à análise do rDNA 16S de bactérias, em vários estudos
têm sido usada essa abordagem para analisar comunidades
fúngicas (KOWALCHUK et al., 1997; PENNANEN et al., 2001; SMIT
et al., 1999).
Usando DGGE, aproximadamente 50% das sequências variantes
podem ser individualizadas em fragmentos de DNA de até 500 bp
embora a separação de fragmentos de até 1.650 bp já tenha sido
relatada (PENNANEN et al., 2001). A porcentagem de bandas
resolvidas em um gel desnaturante pode ser aumentada
significativamente com a incorporação de uma sequência rica em
GC (um GC-clamp) na extremidade 5’ de um dos iniciadores
(MYERS et al., 1985 ). Este GC-clamp será coamplificado com a
sequência alvo e, assim, introduzido nos fragmentos de DNA
amplificados (SHEFFIELD et al., 1992). A sequência rica em GC
age como um domínio de baixa desnaturação, evitando que as duas
fitas de DNA se dissociem completamente em fitas simples
(MUYZER et al., 1997). O uso de géis com gradiente crescente da
concentração do desnaturante de cima para baixo, paralelo à
direção da eletroforese, permite a análise de múltiplas amostras em
um mesmo gel, facilitando comparações ecológicas (MUYZER,
1999).
Os fungos micorrízicos arbusculares também já foram estudados
utilizando a técnica de DGGE (KOWALCHUK et al., 2002; LIANG et
al., 2008; LIU et al., 2009; MA et al., 2005; ÖPIK et al., 2003;
SOUZA et al., 2004, 2005). Nesse caso, porém, ainda não foi
possível fazer inferências seguras sobre as comunidades de FMA
pela simples análise do DNA total do solo em razão dos múltiplos
núcleos geneticamente diferentes (PAWLOWSKA; TAYLOR, 2004)
encontrados em um único esporo de FMA. Esses fungos
apresentam, por assim dizer, uma população de núcleos (genomas)
em seus esporos. Porém, genes como o rDNA, quando amplificado
de amostras de DNA total do esporo, geram um perfil de bandas no
gel de DGGE comparável ao obtido pela análise de amostras
ambientais complexas, revelando a diversidade de sequências
desse gene que podem ser encontradas em um único esporo.

6.1. Algumas vantagens e desvantagens do método de


DGGE

Muyzer e Smalla (1998) afirmam que ao interpretar fingerprints


de DGGE é necessário lembrar que bandas na mesma posição em
um gel desnaturante têm o mesmo comportamento de
desnaturação, mas não necessariamente a mesma sequência, e
apenas o sequenciamento das bandas pode provar a identidade da
sequência. A DGGE também apresenta duas outras limitações
importantes: (1) é geralmente considerado possível separar apenas
fragmentos relativamente pequenos, de até 500 bp, o que limita a
quantidade de informação da sequência disponível para as
inferências filogenéticas subsequentes quando as bandas são
excisadas e sequenciadas, e (2) técnicas de DGGE e TGGE tendem
a mostrar apenas os fragmentos de rDNA dos táxons predominantes
na comunidade em razão dos vieses da PCR. Apesar dessas
preocupações, a DGGE ainda é considerada um método confiável
para a investigação da distribuição temporal e espacial das
populações microbianas.

6.2. DGGE de fungos

Produtos de PCR de fungos, aproximadamente 400 bp), gerados


por uma reação como a exemplificada na Tabela 3, podem ser
separados em um gel de acrilamida a 6% com um gradiente desna‐
turante variando de 30% a 50% (MALOSSO et al., 2006). Os géis
são preparados usando uma combinação proporcional de duas
soluções desnaturantes. A primeira solução contém 3 mL de
solução de acrilamida a 40% (v/v), 0,4 mL de tampão TAE 50×
[0,04M Trisacetate (Tris (hydroxymethyl)aminomethane acetate),
0,01M EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid), pH 8], 4 mL de
solução de formamida e 4,2 g de ureia, preparados no volume de 20
mL com água desionizada. Isso resulta em uma solução de
acrilamida a 6% (w/v) contendo 50% de desnaturante. A segunda
solução, contendo 3 mL de solução de acrilamida a 40% (v/v), 0,4
mL de TAE 50×, 2,4 mL de solução de formamida e 2,52 g de ureia
no volume final de 20 mL de água desionizada, resulta em
acrilamida a 6% (w/v) contendo 30% de desnaturante. O gel é
moldado verticalmente entre 2 placas de vidro previamente limpas e
preparadas com uma solução de dimetildiclorosilano e separadas
por 2 espaçadores de 1 mm. Imediatamente antes de verter o gel,
200 µL de solução de sulfato de amônio a 0,1% (w/v) e 20 µL de N,
N, N’, N’-tetra metiletilenodiamina (Temed) são adicionados a cada
20 mL de solução como agentes polimerizantes. Os géis são
vertidos com auxílio de um formador de gradiente que fará o
gradiente mais forte no fundo, e um pente de dentes longos é
inserido no topo, antes da polimerização, para formar os poços de
amostras. Os géis podem ser colocados a 4 °C durante uma noite
para garantir a completa polimerização. Recomenda-se a leitura do
volume 68 da série Documentos da Embrapa (ABOIM et al., 2004).

Tabela 3. Exemplo de condições da PCR para um par de iniciadores, sendo um deles


com GC-clamp, usados para amplificar a SSU rDNA de fungos para análise por DGGE.

Par de
ini- Mistura Condição da PCR no termociclador(2)
ciadores

FR1(GC)/ Componente
µL Temperatura 1× 25x–30× 1×
FF390(1) [Conc. estoque]

10 × NH4 3 94 °C 10 1 minuto -
minutos

45
10 mM dNTP 0,8 50 °C - -
segundos

FR1(GC) [10 pmol/µL] 3 72 °C - 2 minutos 10 minutos

FF390 [10 pmol/µL] 3

50 mM MgCl2 1,6

Taq polimerase [10 U/


0,2
µL]

1–
DNA molde [100 ng/µL]
3

H2O para 30
(1)
Fonte: Vainio e Hantula (2000).
(2)
Fonte: Malosso et al. (2006).

O gel será carregado com uma mistura de 7 µL de tampão de


aplicação de amostra contendo xileno cianol FF 0,25% (w/v), azul de
bromofenol 0,25% (w/v), sacarose 40% (w/v) em água e a amostra
(≅ 100 ng de produto de PCR), além de água para um volume total
de 32 µL. As amostras correm lado a lado com 5 µL de um
marcador de DNA a 0,05 mg/mL. A corrida se dá a 60 °C por
aproximadamente 3 horas a 200 V em um sistema do tipo BioRad D
GeneTM (BioRad, USA), alimentado por uma fonte de eletroforese.
Após a eletroforese, o gel é corado com SYBR Green 1 (WANG et
al., 2000) por 30 minutos sob uma leve agitação e digitalizado por
40 segundos sob luz UV em um sistema de foto-documentação de
gel.
Bandas únicas, selecionadas do gel de DGGE, podem ser
excisadas usando uma ponteira de pipeta estéril. A banda do gel
será colocada em 12 µL de água ultrapura e o DNA eluído do gel
pode ser usado como molde para reações de PCR e os produtos
sequenciados para análises filogenéticas.
7. Eletroforese em gel com gradiente de
temperatura (TGGE)

A eletroforese em gel com gradiente de temperatura (TGGE) é


uma variação da técnica DGGE. Na TGGE (do inglês Temperature
Gradient Gel Electrophoresis, MUYZER, 1999), o gel é preparado
com uma solução de desnaturante sem a formação do gradiente
químico. O aparelho de eletroforese, no entanto, é diferenciado
gerando um gradiente de temperatura no gel, que corre na posição
horizontal. O princípio da técnica é o mesmo da DGGE, ou seja, a
molécula de DNA irá se desnaturar em uma dada combinação de
temperatura e concentração de agente desnaturante (BIOMETRA,
2000). Como o gradiente de desnaturante e um gradiente de
temperatura apresentam uma relação linear, as duas técnicas são
de um ponto de vista teórico praticamente idênticas. Porém, os
gradientes químicos tais como os usados em DGGE não são
facilmente reprodutíveis, são difíceis de estabelecer e
frequentemente não individualizam completamente os
heteroduplexes (TSOLAKIDOU et al., 2003).

7.1. Condições recomendadas como ponto de partida


para a otimização individual para a análise da
diversidade microbiana

Composição do gel Tampão TAE 1X

Poliacrilamida (37,5:1) 6%

Ureia 8 M

Glicerol 2%

Formamida 20%

Gradiente de temperatura L1: 33 °C, L6 44 °C

Eletroforese 130 V, 2 horas


O preparo do gel é um passo que requer maior cuidado do
pesquisador. Como um sistema tamponado deve ser escolhido, é
importante que o sistema permaneça estável no contexto do
aumento da temperatura. Assim, a ureia é tipicamente utilizada para
o preparo do gel; entretanto, o pesquisador precisa estar atento ao
fato de que a quantidade de ureia usada terá um impacto na
temperatura geral requerida para desnaturar o DNA (BIOMETRA,
2000). Dependendo do tipo de TGGE que será realizada,
perpendicular ou paralela, quantidades variáveis de amostras
precisarão ser preparadas e carregadas. Quantidades maiores de
uma amostra são usadas com gel perpendicular, enquanto uma
quantidade menor de muitas amostras é usada em TGGE paralela.
Uma desvantagem desta técnica, em relação à DGGE, é que o
equipamento para a eletroforese com gradiente de temperatura é
mais caro.
O uso da TGGE para fungos micorrízicos é muito mais restrito
que o uso da DGGE. Um estudo empregou a técnica associada a
uma variável temporal como ferramenta para a caracterização de
FMA (CORNEJO et al., 2004). No entanto, a técnica foi proposta
nesse estudo para a análise do rDNA 18S de diferentes espécies de
Glomus. Mesmo limitando o uso para apenas um gênero, o
screening revelou que a região amplificada pelo par de iniciadores
NS31-AM1 continha variação insuficiente para discriminar as
espécies. Em contraste, a análise da região amplificada pelo par de
iniciadores NS31-Glo1, obtida pela técnica de PCR nested com o
produto de NS31-AM1, mostrou que cada espécie é caracterizada
por um perfil de bandas específico. Entretanto, isolados da mesma
espécie não puderam ser distinguidos.

8. T-RFLP (Terminal Restriction Fragment


Length Polymorphism)
A análise do polimorfismo de comprimento de fragmentos
terminais de restrição, do inglês Terminal Restriction Fragment
Length Polymorphism ou t-RFLP, é uma variação da técnica de
PCR-RFLP em que um nucleotídeo fluorescente terminal é
incorporado ao DNA amplificado. Posteriormente os amplicons são
cortados com uma enzima de restrição (ER) e separados, por
tamanho, em gel longo de poliacrilamida ou sistema capilar, com
detecção a laser dos fragmentos marcados em um sequenciador
automático (LIU et al., 1997). O método fornece perfis distintos
(fingerprints) dependentes da composição de espécies nas
comunidades das amostras e permite a análise comparativa das
comunidades (CLEMENT et al., 1998; MARSH, 1999).
A técnica de t-RFLP tem sido comum nas análises de comu‐
nidades microbianas, porém são ainda poucos os estudos de
comunidades fúngicas (BRODIE et al., 2003; BURKE, 2008; BURKE
et al., 2005, 2006; MORRIS et al., 2008; SINGH et al., 2006;
VANDENKOORNHUYSE et al., 2003).
O método de análise de comunidades utilizando a técnica de t-
RFLP segue alguns passos: (1) obtenção das amostras; (2)
extração de DNA; (3) amplificação do DNA alvo com iniciador
marcado com um fluoróforo (4 repetições por amostra), combinação
e purificação dos produtos em um único tubo e eletroforese em gel
de agarose para verificação; (4) digestão com enzima de restrição
dos produtos de PCR obtidos na etapa anterior; (5) eletroforese dos
produtos de restrição em sequenciador de DNA e (6) análise dos
dados. A digestão com ER é realizada com 10 µL de produto de
PCR concentrado e purificado, conforme descrição na Tabela 2, em
temperatura adequada para a enzima escolhida. A eletroforese dos
fragmentos de restrição não necessita ser realizada imediatamente,
no entanto, esses fragmentos devem ser armazenados em -20 °C
até sua aplicação no gel.
O conjunto de iniciadores utilizados para a análise de fragmentos
terminais de restrição (T-RF) é geralmente composto por um
iniciador forward com a extremidade 5’marcada com fluorescência
que irá se anelar à extremidade 3’ da fita antisenso e um iniciador
reverse não marcado que irá se anelar à extremidade 3’ da fita
senso do gene alvo (muitas vezes o rDNA SSU). A reação de PCR
resultará em amplicons de DNA de fita dupla com a extremidade 5’
da fita senso marcada.
Na reação de restrição enzimática que se segue, cada amplicon
dará origem a um fragmento de DNA terminal marcado (T-RF) e um
ou mais fragmentos não marcados. O uso das endonucleases de
restrição HhaI, RsaI, HaeIII e MSPI já foi relatado (PARK et al.,
2006; TIEDJE et al., 1999). Porém, outras enzimas de restrição
podem ser selecionadas de acordo com o conhecimento que se
tenha sobre o gene/organismo alvo da pesquisa. Os fragmentos são
então separados (± 1 a 2 bases, dependendo do comprimento total
do fragmento) por eletroforese em um sequenciador automático, no
qual os fragmentos marcados são reconhecidos por um detector de
fluorescência. Padrões internos (marcadores de tamanho de
fragmento com fluorescência) são incluídos em cada amostra.
O cromatograma resultante revela os tamanhos de fragmentos
presentes na amostra, assim como a distribuição quantitativa
relativa entre eles, sendo então possível comparar amostras de
acordo com a presença/ausência de picos e a distribuição relativa
dos picos. Para a eletroforese e detecção dos fragmentos terminais
marcados, as amostras necessitam ser preparadas (passo 5
mencionado acima). Nessa etapa, os T-RFs são misturados com o
tampão de corrida e com um marcador de tamanho de fragmentos
(e.g. GS-1000 ROX, PE Biosystems), na seguinte proporção:

Marcador padrão 0,5 μL

Tampão de amostra 2,5 μL

T-RFs 2 μL

Volume total 5 μL
Uma mistura master (menos T-RFs) é preparada em volume
suficiente para todas as amostras e distribuída (3 μL) em cada
pocinho de uma placa de PCR de 96 poços, e então os 2 μL dos T-
RFs são adicionados. A placa é colocada em um termociclador a 94
°C por 2 a 4 minutos para a desnaturação do DNA e transferida
imediatamente para o gelo, onde será mantida até que as amostras
(aproximadamente 2 μL) sejam carregadas no gel.
O gel utilizado nesse caso é de poliacrilamida, preparado de
modo semelhante ao descrito para a análise de TGGE. Um técnico
responsável pela operação do sequenciador geralmente executa
essa etapa do trabalho. Algumas recomendações podem ser feitas
para os passos mais críticos do processo:
1) As duas placas de vidro do sequenciador devem ser lavadas
com sabão e água quente seguida de enxágue com água
desionizada e enxágue final com água ultrapura, tomando-se
cuidado especial na limpeza das faces internas que irão ter contato
direto com o gel.
2) Observar que os espaçadores devem ser umedecidos antes
de montados nas placas, e as outras partes deverão estar limpas e
secas; todo o trabalho com acrilamida deve ser realizado em capela
de exaustão.
3) Pode-se bater levemente na placa conforme o espaço do gel
for sendo preenchido para evitar a formação de bolhas. Colocar o
pente com a parte lisa (sem dentes) voltada para o gel e posicionar
os grampos na placa de vidro ao redor do pente. O gel deve ser
deixado para solidificar por pelo menos uma hora e meia.
4) Os lados de fora do conjunto de placas contendo o gel
polimerizado devem ser limpos para remover resíduos de acrilamida
que se queimariam nas placas, o que poderia também obstruir a
passagem do laser do leitor. O pente deve então ser removido, o
poço enxaguado com água ultrapura e o pente, depois de limpo com
água, novamente posicionado no poço com os dentes pressionados
aproximadamente 0,5 mm no gel.
5) Deve-se correr uma checagem da placa (comando ‘plate-
check’). Se forem observados picos nessa etapa, limpar as placas
novamente e correr outra checagem.
6) Carregar as amostras no gel aquecido a, no mínimo, 48 °C.
7) Após a corrida, checar visualmente se todas as canaletas
foram corretamente rastreadas; corrigir manualmente, se
necessário.
8) Os dados são fornecidos de duas formas: um eletroferograma
(série de picos coloridos representando a comunidade microbiana),
e uma tabela numérica que inclui o tamanho em pares de base e
altura do pico representando uma medida relativa da proporção de
cada população na comunidade.
Como ocorre com todas as técnicas de análise de comunidades
microbianas, a t-RFLP também apresenta limitações. Avis et al.
(2006) sugeriram que os estudos em que se emprega t-RFLP
necessitam incluir informações sobre fungos conhecidos,
identificados nos locais onde os estudos serão realizados e não
confiar apenas nos perfis de t-RFLP. Edwards e Turco (2005)
chamam a atenção para a escolha da enzima de restrição que pode
influenciar fortemente a distinção entre as sequências,
especialmente quando menos de três enzimas são usadas para
grupos de espécies proximamente relacionadas. Isso mostra a
necessidade de ter cautela na interpretação dos resultados, ainda
mais porque já foi mostrado que fragmentos terminais de restrição
(TRF) idênticos podem ser gerados para grupos de espécies não
relacionadas.
Em uma tentativa de facilitar a interpretação dos resultados das
análises de t-RFLP de comunidades microbianas complexas, Smith
et al. (2005) propuseram uma ferramenta com base na web. Essa
ferramenta4 (T-Align) – permite a comparação de múltiplos perfis de
t-RFLP para identificação de componentes microbianos únicos e
compartilhados de maneira mais rápida e com menor probabilidade
de erro. O funcionamento dessa rotina se dá pela geração de um
perfil consenso, baseado na comparação de repetições, contendo
apenas os fragmentos que ocorrem em todas as repetições. Os
perfis consenso das diferentes comunidades são comparados para
produzir uma lista que mostrará se um TRF está presente em uma
amostra em particular e também a sua fluorescência relativa.

9. Considerações finais

Os métodos baseados no DNA não são afetados por mudanças


durante a ontogênese ou diferenciação de órgãos. Dessa forma, é
urgente o desenvolvimento de ferramentas para detecção e identi‐
ficação de FMA durante todos os estádios de seu ciclo de vida. Sem
essa perfeita caracterização, torna-se difícil o uso otimizado dessa
simbiose em campo, pois estudos básicos ligados à competição,
sobrevivência, dispersão e eficiência ficam comprometidos quando
executados em comunidades complexas como as encontradas em
solos tropicais (SALLES; SOUZA, 1998). É importante salientar,
também, que, na maioria dos casos, classificações baseadas em
marcadores moleculares corroboram classificações feitas com base
em características morfológicas (LEAL-BERTIOLI, 1998). O
desenvolvimento de técnicas para a identificação taxonômica,
associadas a novas ferramentas da biologia molecular, são pontos
de grande importância para sustentar as pesquisas com FMAs no
País, que é um grande centro de biodiversidade desses fungos.

10. Referências

ABOIM, M. C. R.; BARBOSA, J. C.; COUTINHO, H. L. C.; ROSADO, S. Avaliação de


diversidade microbiana em amostras de solos: técnica do PCR/DGGE (Protocolo
Laboratorial). Rio de Janeiro: Embrapa Solos, 2004. 31 p. (Documentos, n. 68).
ALTSCHUL, S. F; MADDEN, T. L.; SCHÄFFER, A. A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.; MILLER, W.;
LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database
search programs. Nucleic Acids Research, London, UK, v. 25, p. 3389-3402, 1997.
AVIS, P. G.; DICKIE I, A. MUELLER. G. M. A ‘dirty’ business: testing the limitations of
terminal restriction fragment length polymorphism (TRFLP) analysis of soil fungi. Molecular
Ecology, Oxford, v. 15, p. 873-882, 2006.
BILLS, G. F.; PLATAS, G.; PELAEZ, F.; MASUREKAR, P. Reclassification of a
pneumocandin-producing anamorphous, Glarea lozoyensis gen. et sp. nov., previously
identified as Zalerion arboricola. Mycological Research, Cambridge, v. 103, p. 179-192,
1999.
BIOMETRA. TGGE MAXI System Manual Version 3.02. Goettingen, Biometra
biomedizinische Analytik GmbH, Alemanha: [s.n.], 2000. 54 p.
BRODIE, E.; EDWARDS, S.; CLIPSON, N. Soil fungal community structure in a temperate
upland grassland soil. FEMS Microbiology Ecology, Haren, v. 45, p. 105-114, 2003.
BRUNS, T. D.; GARDES, M. Molecular tools for the identification of ectomycorrhizal fungi:
taxon-specific oligonucleotide probes for the sullied fungi. Molecular Ecology, Oxford, v. 2, p.
233-242, 1993.
BRUNS, T. D.; WHITE, T. J.; TAYLOR, J. W. Fungal molecular systematics. Annual Review
of Ecology and Systematics, Palo Alto, v. 22, p. 525-564, 1991.
BURKE, D. J. Effects of Alliaria petiolata (garlic mustard; Brassicaceae) on mycorrhizal
colonization and community structure in three herbaceous plants in a mixed deciduous
forest. American Journal of Botany, Bronx, v. 95, p. 1416-1425, 2008.
BURKE, D. J.; MARTIN, K. J.; RYGIEWICZ, P. T.; TOPA, M. A. Ectomycorrhizal fungi
identification in single and pooled root samples: terminal restriction fragment length
polymorphism (TRFLP) and morphotyping compared. Soil Biology and Biochemistry, Oxford,
v. 37, p. 1683-1694, 2005.
BURKE, D. J.; MARTIN, K. J.; RYGIEWICZ, P. T.; TOPA, M. A. Relative abundance of
ectomycorrhizas in a managed loblolly pine (Pinus taeda) genetics plantation as determined
through terminal restriction fragment length polymorphism profiles. Canadian Journal of
Botany, Ottawa, CA, v. 84, p. 924-932, 2006.
CARDINALE, M.; BRUSETTI, L.; QUATRINI, P.; BORIN, S.; PUGLIA, A. M.; RIZZI, A.;
ZANARDINI, E.; CORLINI, C.; CORSELLI, C.; DAFFONCHIO, D. Comparison of different
primer sets for use in automated ribosomal intergenic spacer analysis of complex bacterial
communities. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 70, p. 6147-
6156, 2004.
CLEMENT, B. G.; KEHL, L. E.; DEBORD, K. L.; KITTS, C. L. Terminal restriction fragment
patterns (TRFPs), a rapid, PCR-based method for the comparison of complex bacterial
communities. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, NL, v. 31, p. 135-142, 1998.
CORNEJO, P.; AZCON-AGUILAR, C.; BAREA, J. M.; FERROL, N. Temporal temperature
gradient gel electrophoresis (TTGE) as a tool for the characterization of arbuscular
mycorrhizal fungi. FEMS Microbiology Letters, Haren, v. 241, p. 265-270, 2004.
CRESTE, S.; TULMANN NETO, A.; FIGUEIRA, A.; Detection of single sequence repeat
polymorphism in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining. Plant
Molecular Biology Reporter, Georgia, v. 19, p. 299-306, 2001.
DÁVILA, A. M. R.; MOMEN, H. Internal-transcribed-spacer (ITS) sequences used to explore
phylogenetic relationships within Leismania. Annals of Tropical Medicine and Parasitology,
New york, v. 94, p. 651-654, 2000.
DICKIE, L. A.; FITZJOHN, R. G. Using terminal restriction fragment length polymorphism
(T-RFLP) to identify mycorrhizal fungi: a methods review. Mycorrhiza, Berlin, DE, v. 17, p.
259-270, 2007.
DOUHAN, G. W.; RIZZO, D. M. Amplified Fragment Length Micro satellites (AFLM) might
be used to develop micro satellite markers in organisms with limited amounts of DNA
applied to Arbuscular Mycorrhizal (AM) fungi. Mycologia, New York, v. 95, p. 368-373, 2003.
EDWARDS, I. P.; TURCO, R. F. Inter- and intraspecific resolution of rDNA TRFLP assessed
by computer-simulated restriction analysis of a diverse collection of ectomycorrhizal fungi.
Mycological Research, Cambridge, v. 109, p. 212-226, 2005.
FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em
análise genética. 3. ed. Brasília, DF: Embrapa Cenargen, 1998. 220 p. (Documentos, n. 20).
FISCHER, M. M.; TRIPLETT, E. Automated approach for ribosomal intergenic spacer
analysis of microbial diversity and its application to freshwater bacterial communities.
Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 65, p. 4630-4636, 1999.
GAMPER, H.; LEUCHTMANN, A. Taxon-specific PCR primers to detect two inconspicuous
arbuscular mycorrhizal fungi from temperate agricultural grassland. Mycorrhiza, Berlin, DE,
v. 17, p. 145-152, 2007.
GRIFONI, A.; BAZZICALUPO, M.; DI SERI, C.; FANCELLI, S.; FANI, R. Identification of
Azospirillum strains by restriction fragment lenght polymorphism of 16S rDNA and of the
histidine operon. FEMS Microbiology Letters, Haren, v. 127, p. 85-91, 1995.
GUEVARA, P.; ALONSO, G.; FRANCO DA SILVEIRA, J.; DE MELLO, M.; SCORZA, J. V.;
ANEZ, N.; RAMIREZ, J. L.; Identification of New World Leishmania using ribosomal gene
spacer probes. Molecular Biochemistry Parasitology, Amsterdam, NL, v. 59, p. 15-26, 1992.
HEAD, I. M; SAUNDERS, J. R.; PICKUP, R. W. Microbial evolution, diversity, and ecology: a
decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms. Microbial Ecology, New
York, v. 35, p. 1-21, 1998.
HERWERDEN, L. van; GASSER, R. B.; BLAIR, D. ITS-1 ribosomal DNA sequence variants
are maintained in different species and strains of Echinococcus. Internacional Journal
Parasitology, Australian, v. 30, p. 157-169, 2000.
HIBBETT, D. S.; BINDER, M.; BISCHOFF, J. F.; BLACKWELL, M.; CANNON, P. F.;
ERIKSSON, O. E.; HUHNDORF, S.; JAMES, T.; KIRK, P. M.; LUCKING, R.; LUMBSCH, H.
T.; LUTZONI, F.; MATHENY, P. B.; MCLAUGHLIN, D. J.; POWELL, M. J.; REDHEAD, S.;
SCHOCH, C. L.; SPATAFORA, J. W.; STALPERS, J. A.; VILGALYS, R.; AIME, M. C.;
APTROOT, A.; BAUER, R.; BEGEROW, D.; BENNY, G. L.; CASTLEBURY, L. A.; CROUS,
P. W.; DAI, Y. C.; GAMS, W.; GEISER, D. M.; GRIFFITH, G. W.; GUEIDAN, C.;
HAWKSWORTH, D. L.; HESTMARK, G.; HOSAKA, K.; HUMBER, R. A.; HYDE, K. D.;
IRONSIDE. J. E; KÕLJALG, U.; KURTZMAN, C. P.; LARSSON, K. H.; LICHTWARDT, R.;
LONGCORE, J.; MIADLIKOWSKA, J.; MILLER, A.; MONCALVO, J. M.; MOZLEY-
STANDRIDGE, S.; OBERWINKLER, F.; PARMASTO, E.; REEB, V.; ROGERS, J. D.;
ROUX, C.; RYVARDEN, L; SAMPAIO, J. P.; SCHÜßLER, A.; SUGIYAMA, J.; THORN, R.
G.; TIBELL, L.; UNTEREINER, W. A.; WALKER, C.; WANG, Z.; WEIR, A.; WEISS, M.;
WHITE, M. M.; WINKA, K.; YAO, Y. J.; ZHANG, N. A higher-level phylogenetic classification
of the Fungi. Mycological Research, Cambridge, v. 3, p. 509-547, 2007.
KJOLLER, R.; ROSENDAHL, S. Detection of arbuscular mycorrhizal fungi (Glomales) in
roots by nested PCR and SSCP (single stranded conformation polymorphism). Plant and
Soil, Hague, v. 226, p. 189–196, 2000.
KOWALCHUK, G. A.; DE SOUZA, F. A. VAN VEEN, J. A. Community analysis of arbuscular
mycorrhizal fungi associated with Ammophila arenaria in Dutch coastal sand dunes.
Molecular Ecology, Oxford, v. 11, p. 571-581, 2002.
KOWALCHUK, G. A.; GERARDS, S.; WOLDENDORP, J. W. Detection and characterization
of fungal infections of Ammophila arenaria (Marram Grass) roots by denaturing gradient gel
electrophoresis of specifically amplified 18S rRNA. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, DC, v. 63, p. 3858-3865, 1997.
LANFRANCO, L.; BIANCIOTTO, V.; LUMINI, E.; SOUZA, M.; MORTON, J. B.; BONFANTE,
P. A cambined morphological and molecular approach to characterize isolates of arbuscular
mycorrhizal fungi in Gigaspora (Glomales). New Phytologist, Oxford, v. 152, p. 169-179,
2001.
LANFRANCO, L.; PERROTO, S.; LONGATO, S.; MELLO, A.; COMETTI, V.; BONFANTE, P.
Molecular approaches to investigate biodiversity in mycorrhizal fungi. In: VARMA, A. (Ed.).
Mycorrhiza manual. Berlin: Springer, p. 353-372, 1998.
LEAL-BERTIOLI, S. C. de M. O enfoque molecular na sistemática de fungos. Revisão Anual
de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 6, p. 197-230, 1998.
LIANG, Z. B.; DRIJBER, R. A.; LEE, D. J.; DWIEKAT, I. M.; HARRIS, S. D.; WEDIN, D. A. A
DGGE-cloning method to characterize arbuscular mycorrhizal community structure in soil.
Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 40, p. 956-966, 2008.
LIU, W. T.; MARSH, T. L.; CHENG. H.; FORNEY, L. J. Characterization of microbial diversity
by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S
rRNA. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, 63, 4516-4522.
LIU Y.; HE, L.; AN, L. Z; HELGASON, T.; FENG, H. Y. Arbuscular mycorrhizal dynamics in a
chronosequence of Caragana korshinskii plantations. FEMS Microbiology Ecology, Harem,
v. 67, p. 81-92, 2009.
MA, W. K.; SICILIANO, S .D.; GERMIDA, J. J. A PCR-DGGE method for detecting
arbuscular mycorrhizal fungi in cultivated soils. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 37,
p. 1589-1597, 2005.
MALOSSO, E.; WAITE, I. S.; ENGLISH, L.; HOPKINS, D. W.; O’DONNELL, A. G. Microbial
diversity of Antarctic soils determined using a combination of culture isolation, molecular
fingerprinting and cloning techniques. Polar Biology, Berlin, DE, 29, p. 552-561, 2006.
MANTER, D. K.; VIVANCO, J. M. Use of the ITS primers, ITS1F and ITS4, to characterize
fungal abundance and diversity in mixed-template samples by qPCR and length
heterogeneity analysis. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, NL, v. 71, p. 7-14,
2007.
MARSH, T. L. Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP): an emerging
method for characterizing diversity among homologous populations of amplification
products. Current Opinion in Microbiology, New York, v. 2, p. 323-327, 1999.
MERGULHÃO, A. C. E. S.; SILVA, M. V.; FIGUEIREDO, M. V. B.; BURITY, H. A.; MAIA, L.
C. Characterisation and identification of arbuscular mycorrhizal fungi species by PCR/RFLP
analysis of the rDNA internal transcribed spacer (ITS). Annals of Microbiology, Heidelberg,
v. 58, p. 341-344, 2008.
MORRIS, M. H.; PEREZ-PEREZ, M. A.; SMITH, M. E.; BLEDSOE, C. S. Multiple species of
ectomycorrhizal fungi are frequently detected on individual oak root tips in a tropical cloud
Forest. Mycorrhiza, Berlin, DE, v. 18, p. 375-383, 2008.
MORTON, J. B. Problems and solutions for the integration of Glomalean taxonomy,
systematic biology, and the study of endomycorrhizal phenomena. Mycorrhiza, Berlin, DE,
v. 2, p. 97-109, 1993.
MUELLER, U. G.; WOLFENBARGER, L. L. AFLP genotyping and fingerprinting. Trends in
Ecology & Evolution, Amsterdam, NL, v. 14, p. 389-394, 1999.
MUYZER, G.; SMALLA, K.; Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie van
Leeuwenhoekv, Delft, v. 73, p. 127-141, 1998.
MUYZER, G. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems.
Current Opinion in Microbiology, New York, v. 2, p. 317-322, 1999.
MUYZER, G.; BRINKHOFF, T.; NÜBEL, U.; SANTEGOEDS, C.; SCHÄFER, H.; WAWER,
C. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology. In: AKKERMANS,
A. D. L.; ELSAS, J. D. van; DE BRUIJN, F. J. (Ed.). Molecular Microbial Ecology Manual.
Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1997. p. 1-27.
MUYZER, G.; DE WAAL, E. C.; UITTERLINDEN, A. G. Profiling of complex microbial
populations by denaturating gradient cell electrophoresis analysis of polymerase chain
reaction: amplified genes coding for 16S r RNA. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, DC, v. 59, p. 695-700, 1993.
MYERS, R. M.; FISCHER, S. G.; LERMAN, L. S;. MANIATIS, T. Nearly all single base
substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp can be detected by denaturing
gradient gel electrophoresis. Nucleic Acids Research, London, UK, v. 13, p. 3131-3145,
1985.
ÖPIK, M.; MOORA, M.; LIIRA. J.; KOLJALG, U.; ZOBEL, M.; SEN, R. Divergent arbuscular
mycorrhizal fungal communities colonize roots of Pulsatilla spp. in boreal Scots pine forest
and grassland soils. New Phytologist, Oxford, v. 160, p. 581-593, 2003.
PARK, S.; KU, Y. K.; SEO, M. J.; KIM, D. Y.; YEON, J. E.; LEE, K. M.; JEONG, S. C.;
YOON, W. K.; HARN, C. H.; KIM, H. M. Principal component analysis and discriminate
analysis (PCA–DA) for discriminating profiles of terminal restriction fragment length
polymorphism (T-RFLP) in soil bacterial communities. Soil Biology and Biochemistry, Oxford,
v. 38, p. 2344-2349, 2006.
PAWLOWSKA, T. E.; TAYLOR, J. W. Organization of genetic variation in individuals of
arbuscular mycorrhizal fungi. Nature, London, UK, v. 427,p. 733-737, 2004.
PENNANEN, T.; PAAVOLAINEN, L; HANTULA, J. Rapid PCR-based method for the direct
analysis of fungal communities in complex environmental samples. Soil Biology and
Biochemistry, Oxford, v. 33, p. 697-699, 2001.
RAMIREZ, J. L.; GUEVARA, P. The ribosomal gene spacer as a tool for the taxonomy of
Leishamania. Molecular Biochemistry Parasitology, Amsterdam, NL, v. 22, p. 177-183, 1987.
RANJARD, L.; POLY, F.; COMBRISSON, J.; GOURBIÉRE, F.; RICHAUME, A.;
THIOULOUSE, J.; NAZARET, S. Heterogeneous cell density and genetic structure of
bacterial pools associated with various soil microenvironments as determined by
enumeration and DNA fingerprinting approach (RISA). Microbial Ecology, New York, v. 39,
p. 263-272, 2000.
RANJARD, L.; POLY, F.; LATA, J. C.; MOUGEL, C.; THIOULOUSE, J.; NAZARET, S.
Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic
spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 67, p. 4479-4487, 2001.
REDECKER, D.; MORTON, J. B.; BRUNS, T. D. Ancestral lineages of arbuscular
mycorrhizal fungi (Glomales). Molecular Phylogenetics Evolution, San Antonio, v. 14, p. 276-
284, 2000.
RENKER, C.; HEINRICHS, J.; KALDORF, M.; BUSCOT, F. Combining nested PCR and
restriction digest of the internal transcribed spacer region to characterize arbuscular
mycorrhizal fungi on roots from the field. Mycorrhiza, Berlin, DE, v. 13, p. 191-198, 2003.
RENKER, C.; WEIßHUHN, K.; KELLNER, H.; BUSCOT, F. Rationalizing molecular analysis
of field-collected roots for assessing diversity of arbuscular mycorrhizal fungi: to pool, or not
to pool, that is the question. Mycorrhiza, Berlin, DE, v. 16, p. 525-531, 2006.
RITCHIE, N. J.; SCUTTER, M. E.; DICK, R. P.; MYROLD, D. D. Use of length heterogeneity
PCR and fatty acid methyl ester profiles to characterize microbial communities in soil.
Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 66, p. 1668-1675, 2000.
SAIKI, R, K.; GELFAND, D. H.; STOFFEL, S.; SCHARF, S. J.; HIGUCHI, R.; HORN, G. T.;
MULLIS, K. B.; ERLICH, H. A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a
thermo stable DNA polymerase. Science, Washington, DC, v. 239, p. 487-491, 1988.
SALLES, J. F.; SOUZA, F. A. Revisões em micorriza I: técnicas moleculares aplicadas ao
estudo dos fungos micorrízicos arbusculares. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, 1998. 24
p. (Embrapa-CNPAB, Série Documentos, 68).
SCHUßLER, A.; SCHWARZOTT, D.; WALKER, C.; A new fungal phylum, the
Glomeromycota: phylogeny and evolution. Mycological Research, Cambridge, v. 105, p.
1413-1421, 2001.
SHEFFIELD, V. C.; BECK, J. S.; STONE, E. M.; MYERS, R. M. A simple and efficient
method for attachment of a 40-base pair, GC-rich sequence to PCR-amplified DNA.
BioTechniques, Notick, v. 12, p. 386-387, 1992.
SINGH, B. K.; NAZARIES, L.; MUNRO, S.; ANDERSON, I. C.; CAMPBELL, C. D. Use of
multiplex terminal restriction fragment length polymorphism for rapid and simultaneous
analysis of different components of the soil microbial community. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, DC, v. 72, p. 7278-7285, 2006.
SMIT, E.; LEEFLANG, P.; GLANDORF, B.; VAN ELSAS, J. D.; WERNARS, K. Analysis of
fungal diversity in the wheat rhizosphere by sequencing of cloned PCR-amplified genes
encoding 18S rRNA and temperature gradient gel electrophoresis. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 65, p. 2614-2621, 1999.
SMITH, C. J.; DANILOWICZ, B. S.; CLEAR, A. K.; COSTELLO, F. J.; WILSON, B.; MEIJER,
W. G. T-Align, a web-based tool for comparison of multiple terminal restriction fragment
length polymorphism profiles. FEMS Microbiology Ecology, Haren, v. 54, p. 375-380, 2005.
SOUZA, F. A.; KOWALCHUK, G. A.; LEEFLANG, P.; VEEN, J. A. van; SMIT, E. PCR-
denaturing gradient gel electrophoresis profiling of inter- and intraspecies 18S rRNA gene
sequence heterogeneity is an accurate and sensitive method to assess species diversity of
arbuscular mycorrhizal fungi of the genus Gigaspora. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, DC, v. 70, p. 1413-1424, 2004.
SOUZA, F. A.; DECLERCK, S.; SMIT, E.; KOWALCHUK, G. A. Morphological, ontogenetic
and molecular characterization of Scutellospora reticulata (Glomeromycota). Mycological
Research, Cambridge, v. 109, p. 697-706, 2005.
SPOONER, D.; TREUREN, R. van; VICENTE, M. C. de; Molecular markers for genebank
management. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, IT, 2005. 126 p.
(IPGRI. Technical Bulletin, 10)
SUZUKI, M.; RAPPE, M. S.; GIOVANNONI, S. J. Kinetic bias in estimates of coastal
picoplankton community structure obtained by measurements of small-subunit rRNA gene
PCR amplicon length heterogeneity. Applied and Environmental Microbiology, Washington,
DC, v, 64, p. 4522-4529, 1998.
TIEDJE, J. M.; ASUMING-BREMPONG, S.; NÜSSLEIN, K.; MARSH, T. L. FLYNN, S. J.
Opening the black box of soil microbial diversity. Applied Soil Ecology, Amsterdam, NL, v.
13, p. 109-122, 1999.
TSOLAKIDOU, A. F.; COULOCHERI S, A.; SEKERIS, C. E.; MOUTSATSOU, P. Application
of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to screen for mutations of the human
glucocorticoid receptor a gene (hGR a). Clinical Biochemistry, Amsterdam, DL, v. 36, p.
305-311, 2003.
VAINIO, E. J.; HANTULA, J. Direct analysis of wood-inhabiting fungi using denaturing
gradient gel electrophoresis of amplified ribosomal DNA. Mycological Research, Cambridge,
v. 104, p. 927-936, 2000.
VANDENKOORNHUYSE, P.; RIDGWAY, K. P.; WATSON, I. J.; FITTER, A. H.; YOUNG, J.
P. W. Co-existing grass species have distinctive arbuscular mycorrhizal communities.
Molecular Ecology, Oxford, v. 12, p. 3085-3095, 2003.
VOS, P.; HOGERS, R.; BLEEKER, M.; REIJANS, M.; VAN DE LEE, T.; HORNES, M.;
FRIJTERS, A.; POT, J.; PELEMAN, J.; KUIPER, M.; ZABEAU, M. AFLP: A new technique
for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, London, UK, v. 23, p. 4407-4414, 1995.
WANG, X.; SAWAGUCHI, T.; SAWAGUCHI, A. Application of electrophoresis technology to
DNA analysis. Advances in Electrophoresis, Weinheim, 21, p. 334-337.
WHITE, T. J.; BRUNS, T.; LEE, S.; TAYLOR, J. Amplification and direct sequencing of
fungal ribosomal RNA genes for phylogenetic. In: NNIS, M. A.; GEBFAUD, D. H.; SMINSKY,
J. J.; WHITE, J. J. (Ed.). PCR Protocols: a guide to methods and application. San Dieg:
Academic Press, p. 315-322, 1990.
Capítulo 3
Análise in silico para o
desenvolvimento de marcadores
SNP-CAPS associados a
características agronômicas
Laureen Michelle Houllou-Kido
Éderson Akio Kido
Ana Maria Benko Iseppon
Sérgio Crovella

1. Introdução

O melhoramento tradicional de plantas produziu, ao longo de


séculos, cultivares e variedades mais produtivas e resistentes às
condições adversas, bem como aos diferentes níveis tecnológicos
dos produtores, utilizando-se principalmente da seleção massal de
indivíduos superiores, oriundos de cruzamentos envolvendo uma
mesma espécie ou da hibridização entre membros de diferentes
espécies ou até de diferentes gêneros. No entanto, apesar desse
sucesso, o desenvolvimento de novas cultivares pelo melhoramento
convencional normalmente é muito demorado, em média, mais de
uma década (LEWONTIN, 2004).
As últimas três décadas permitiram à agricultura testemunhar o
desenvolvimento e a consolidação, em alguns casos com sucesso,
do melhoramento assistido por marcadores moleculares. O
desenvolvimento de diferentes tipos de marcadores e a
disponibilidade ou facilidade de obtenção poderiam facilitar a
identificação de materiais promissores em processos seletivos
demorados, de difícil instalação e/ou avaliação ou caros. Ao longo
dessas décadas várias metodologias de marcadores moleculares
foram desenvolvidas e empregadas: Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP), Rapid Amplified Polymorphic DNAs (Rapd),
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), Simple Sequence
Repeats (SSR), Single Nucleotide Polymorphism (SNP), etc. Um
ponto em comum no uso dessas diferentes técnicas é que todas são
baseadas em polimorfismos encontrados em DNAs genômicos. Em
termos genéticos, esses marcadores moleculares têm se mostrado
úteis na detecção de variabilidade genética caracterizando
indivíduos ou mesmo bancos de germoplasmas. Além da finalidade
acima, em termos agronômicos práticos, para auxiliar o
melhoramento convencional, um fenótipo específico deveria ser
associado com um dos polimorfismos vistos no DNA. No entanto, a
utilização dessas metodologias com esse intuito pode ser custo-
proibitiva, principalmente quando se avalia populações segregantes
muito grandes. Assim, estratégias devem ser desenvolvidas visando
desenvolver marcadores confiáveis e de custos mais acessíveis
(BUCKLER; THORNSBERRY, 2002; WEISING et al., 2005).
Os projetos em Genômica, sejam eles estruturais ou funcionais
gerados a partir de transcritos, vêm fornecendo ao longo dos anos
informações extremamente relevantes com relação às sequências
ou os genes envolvidos. Atualmente, existe uma quantidade
relevante de sequências nucleotídicas disponibilizadas em bancos
de dados públicos, que podem ser utilizadas para auxiliar o
desenvolvimento de marcadores específicos para uma característica
em estudo. Normalmente, as estratégias iniciais se baseiam na
busca da(s) sequência(s) de interesse ou daquelas similares e que
se encontram disponíveis nos bancos de dados, via análises
computacionais. A seguir, verifica-se a possibilidade de desenhos de
primers específicos, que poderão amplificar regiões alvo em DNAs
genômicos ou mesmo a partir de transcritos, procurando validar os
marcadores em diferentes genótipos ou seus devidos controles
(JACKSON et al., 2006).
O polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) é uma das
formas mais comum de variabilidade encontrada nos genomas. Os
SNPs são uma variação da sequência de DNA que ocorre quando
um nucleotídeo (A, C, G ou T) do genoma difere entre membros de
uma mesma espécie (KWOK, 2000). Os SNPs ocorrem tanto nas
regiões codantes como nas regiões não codantes e intergênicas
(REGISTER et al., 2002). Em Arabidopsis, foram identificados cerca
de 37.000 SNPs entre 2 acessos (JANDER et al., 2002). Já em
milho, foi descrita a ocorrência de SNP a cada 31 pb em regiões não
codantes e a cada 124 pb em regiões codantes (CHING et al.,
2002). Essa variabilidade tem recebido muita atenção dos
pesquisadores, objetivando-se associar características importantes
a um haplótipo específico (CONG et al., 2002; KNIGHT, 2004). De
fato, os marcadores baseados em SNPs pertencem a mais recente
geração de marcadores moleculares utilizados para a genotipagem,
com vistas a uma seleção futura assistida por marcadores (MAS). O
desenvolvimento de marcadores SNPs baseia-se, em sua maioria,
no conhecimento e compreensão da base genética envolvida nas
características agronômicas importantes. Dessa forma, seria
possível correlacionar um polimorfismo com os genes envolvidos
com o fenótipo alvo.
A principal diferença entre os marcadores tradicionais (RFLP,
AFLP, SSR) e os marcadores baseados em SNPs é que os
primeiros requerem a utilização de eletroforese, ao passo que
algumas das diferentes metodologias para o desenvolvimento de
marcadores SNPs dispensam a mesma. Outro aspecto importante
dos marcadores SNPs é que eles são excelentes para mapear
genes que controlam características complexas, auxiliando dessa
forma o desenvolvimento de mapas gênicos de alta resolução
(NAKITANDWE et al., 2007).
Existem várias metodologias descritas e utilizadas para o desen‐
volvimento de marcadores SNPs. Neste capítulo, será descrita uma
abordagem in silico para desenvolvimento de marcadores SNP-
CAPS.
2. Levantamento de sequências no banco de
dados

O trabalho se inicia com o levantamento das sequências rela‐


cionadas à característica ou aos genes de interesse nos bancos de
dados. Atualmente, um grande número de bancos de dados, princi‐
palmente de sequências expressas, aquelas derivadas de
transcritos com cauda Poli A e que são denominadas Expressed
Sequence Tags (EST) (Tabela 1), tem permitido explorar de uma
forma eficiente o polimorfismo do tipo SNP em genes.

Tabela 1. Exemplo de bancos de dados disponibilizados na internet com sequências EST


de plantas.

Banco de dados de EST de plantas Endereço eletrônico

PlantGDB http://www.zmdb.iastate.edu/PlantGDB

NCBI Unigenes http://www.ncbi.nlm.nih.gov./UniGene

TIGR Plant Genes Indices http://www.tigr.org/tdb/tgi/plant.shtml

Solanaceae genomic network http://sgn.cornell.edu/

B-EST barley database http://:pgrc.ipk_gatersleben.de/est/est/login

Nesses bancos de dados, realizam-se buscas de sequências


EST relacionadas com a característica alvo, por exemplo, genes
induzidos por ABA, com tolerância à seca, relacionada com
estresses, etc. As sequências em formato FASTA podem ser
agrupadas em arquivos multifasta, conforme o interesse, por
exemplo, por gênero vegetal, para análises posteriores. Esse
formato é o mais comumente aceito pelas diferentes ferramentas de
bioinformática.
A busca pode ser feita por palavra-chave ou empregando-se uma
sequência conhecida em programas que realizam alinhamentos,
comparando a similaridade entre sequências, por exemplo, ferra‐
mentas Basic Local Alignment Seach Tool (Blast) (ALTSCHUL et al.,
1990). Sequências similares apresentam relevante grau de
identidade, pareamento das mesmas bases em um alinhamento.
Essa similaridade, no entanto, não necessariamente está associada
ao desempenho de mesma função biológica pelas sequências
alinhadas. Isso só pode ser definido a partir de experimentos
desenhados para esse propósito. Se as sequências similares
compartilham uma ancestralidade em comum e foram sabidamente
relacionadas com as mesmas funções, elas são consideradas
também homólogas. A similaridade entre sequências é determinada
não somente pelo percentual de nucleotídeos idênticos em DNAs e
cDNAs ou aminoácidos, proteínas, em comum entre as sequências
comparadas, mas também por parâmetros como: Expectation value
(E-value), tamanho do trecho alinhado, presença ou não de gaps,
que representam inserções ou deleções presentes na sequência
fornecida (query) ou na sequência do banco de dados (subject).
Um alinhamento de boa similaridade apresenta mais de 70% dos
nucleotídeos idênticos, os mesmos, nos mesmos locais, em
sequências query e subject com mais de 100 nucleotídeos. Um dos
parâmetros mais importantes na identificação de similaridade é o E-
value. De uma maneira simplificada, o E-value pode ser definido
como o número de vezes de concordância (match) da sequência
query alinhadas com sequências do banco de dados somente em
razão do acaso. Sendo assim, quanto mais baixo for o valor do E-
value, menores as chances desse alinhamento ter ocorrido em
razão do acaso. Este valor leva em conta também o tamanho da
sequência e do banco em questão (KORF et al., 2003). No presente
caso, recomenda-se trabalhar com sequências cujo resultado do
Blastn forneça um E-value igual ou menor que 0,06. Alguns bioinfor‐
matas consideram similaridade entre sequências cujo E-value é
igual ou menor que 0,01. Outros são mais restritivos, recomendando
a seleção de sequências cujo E-value é igual ou menor que 0,001.
No entanto, a definição de um valor de E-value utilizado como ponto
de corte (Threshold) varia de acordo com a finalidade do trabalho a
ser desenvolvido (ex.: identificação de sequências provenientes de
uma biblioteca de cDNA, filogenia, etc.) e o tipo de sequência que
se busca similaridade ou homologia (proteína ou DNA).
Para tornar mais didáticas as diferentes etapas das análises
bioinformáticas que precedem a validação em bancada, será
utilizado um conjunto de sequências pertencentes à família gênica
Heat Shock Proteins (HSPs) da espécie vegetal Glycine soja,
depositadas no banco de dados NCBI.
As HSPs estão associadas a mecanismos de adaptação dos
organismos à condição de estresse. Elas correspondem a membros
de várias famílias de proteínas conservadas, cuja função parece
estar correlacionada com a preservação e reparo de estruturas
macromoleculares durante a desidratação ou reidratação
(VERTUCCI; FARRANT, 1995). As principais classes descritas em
plantas são: Hsp60; Hsp70; Hsp90 e Hsp100. Embora todos os
organismos sintetizem HSPs em resposta ao calor, o balanço de
proteínas sintetizadas e a relativa importância das famílias
individuais de HSP na tolerância ao estresse variam enormemente
entre organismos (QUEITSCH et al., 2000). Proteínas resistentes ao
calor já foram identificadas em eixos embrionários de sementes de
soja, sendo o seu acúmulo variável de acordo com as condições de
dissecação ou embebição.
O trabalho in silico se inicia com a mineração das sequências
alvo no banco de dados NCBI1. Na página principal, deve-se digitar
na caixa de busca (Search) as palavras-chave Heat Shock proteins
Glycine (Figura 1), bem como individualizar o banco a ser
pesquisado ou não (em todos os bancos de dados seria All
Databases).
Figura 1. Página inicial do NCBI. A seta indica a caixa de busca onde devem ser colocadas
as palavras-chave.

Das 584 sequências ESTs (Figura 2), 39 foram descritas para G.


soja (Figura 3). Um número maior de sequências poderá ser encon‐
trado em virtude dos depósitos constantes de novas sequências nos
bancos de dados NCBI. É comum, mesmo utilizando-se palavras-
chave específicas, o aparecimento na página de resultados de
sequências não correlacionadas, em princípio, com a busca inicial.
No caso, sequências de HSP relacionadas aos gêneros Brassica,
Prunus e Malus foram listadas (Figura 3). Isso ocorre como con‐
sequência das informações fornecidas para cadastramento das
sequências no banco de dados, quando alguma referência à palavra
Glycine (ex.: similar a HSP70 de Glycine) teria sido feita, mesmo em
se tratando de sequência de outra espécie ou gênero. Para se obter
somente as sequências de G. soja clica-se no link correspondente
(Figura 3).
Figura 2. Exemplo da página de resultado do NCBI utilizando-se as palavras-chave Heat
Shock Protein Glycine. A seta indica o link para acesso às sequências EST.
Figura 3. Página do NCBI com sequências obtidas a partir da busca com palavras-chave. A
seta indica link para obtenção das sequências de Glycine soja.

Uma nova página de resultados será aberta (Figura 4). Para


obtenção das sequências em seu formato FASTA deve-se
selecionar a opção na caixa Display, que originalmente apresenta
Summary como default, bem como alterar em Show o número de
sequências exibidas, de 20 para 50. Por sua vez, para salvar as
sequências FASTA em arquivo para análises posteriores em seu
computador, seleciona-se a opção file na caixa Send to.

Figura 4. Tela parcial de resultados mostrando setas para tipo de informações (Display),
número de sequências por tela (Show), modo de ordenamento (Sort by) e enviar para
(Send to).

Para maximizar a possibilidade de identificação de polimorfismos


SNP e o desenvolvimento de marcadores específicos relacionados,
é necessário levantar o maior número possível de sequências
FASTA relativas aos genes envolvidos com a característica alvo.
Quanto maior o número de genes e de sequências, maior a chance
de identificar polimorfismos úteis para desenhos de iniciadores
específicos. Os arquivos multifasta gerados e salvos (Figura 5)
serão utilizados nas demais análises.

Figura 5. Exemplo de sequências em formato FASTA.

3. Preparo das sequências

3.1. Clusterização – Identificação dos contigs e das


sequências únicas

No caso da análise para identificação de polimorfismo tipo SNP,


as sequências levantadas no banco de dados devem ser
clusterizadas minimizando, assim, a ocorrência de redundância de
análise de sequências pertencentes a uma mesma informação.
Nesse caso, as sequências FASTA de Heat shock protein foram
clusterizadas utilizando-se o programa CAP32 (Figura 6). A função
do CAP3 é literalmente formar sequências maiores a partir de
fragmentos menores de cDNA ou de DNA (HUANG; MADAN, 1999).
Essas sequências, provenientes do sequenciamento genômico, são
agrupadas considerando sobreposições de regiões comuns. Dessa
forma, um conjunto de sequências pode ser agrupado formando os
chamados contigs, resultando em uma sequência consenso.
Sequências que não puderem ser agrupadas permanecem como
sequências únicas (single sequence ou singlets). Essa ferramenta
permite minimizar a análise repetitiva de sequências que na
realidade fazem parte de mesmo consenso.

Figura 6. Página do programa CAP3. As sequências podem ser copiadas e coladas na


janela da página, desde que não ultrapassem 50 Kb.
Após as análises, contigs e sequências únicas são disponibili‐
zados na página de resultado, sendo os respectivos FASTAs obtidos
ao se clicar nos respectivos links (Figura 7). Em Assembly details é
possível ver quais sequências (de acordo com o número gi – identifi‐
cador do NCBI) compõem cada um dos contigs. Essa informação é
relevante, ao se determinar quais contigs permitiram identificar
polimorfismos SNP.

Figura 7. Página de resultado do CAP3. A seta indica link para sequências no formato
FASTA.

Todas as sequências (contigs e singlets) serão utilizadas na


identificação dos quadros abertos de leitura (Open read frames –
ORFs), sendo as ORFs utilizadas na busca de polimorfismo tipo
SNP (Figura 8).
Figura 8. Página inicial do ORFinder. A seta indica janela para seleção da tabela de código
genético.

3.2. Identificação das ORFs

Apesar de um cDNA ser gerado a partir de um RNA com cauda


poli A, nem toda a sua extensão é informativa para a síntese de
proteínas. As regiões denominadas 3’ e 5’ UTR (UnTranslated
Region) não são informativas durante a síntese proteica, sendo
traduzida somente a região codificadora. Sendo assim, uma
ferramenta do tipo ORFinder3, disponível no site do NCBI, identifica
possíveis quadros abertos de leitura para uma dada sequência. O
ORFinder (ROMBEL et al., 2002) busca ao longo da sequência
FASTA o códon de iniciação ATG (ou alternativo, se selecionado) e
os códons de finalização (TAA,TAG e TGA). O resultado com cada
sequência usada como query gera seis barras horizontais, cada
uma correspondente a um dos possíveis frames de leitura. Os
frames positivos (+1, +2 e +3) são determinados a partir da própria
sequência fornecida, começando-se as trincas codificadoras a partir
do primeiro, segundo ou terceiro nucleotídeo, respectivamente. Os
frames negativos (-1, -2 e -3) correspondem aos três possíveis
frames obtidos a partir da fita complementar àquela fornecida como
query. Uma ORF completa apresenta códon de início e de fim.
Normalmente, a sequência codante do gene corresponde à maior
ORF encontrada (com exceções). Para verificar esse resultado pode
se realizar um alinhamento via Blast da sequência FASTA da ORF
contra o banco de dados de proteínas do NCBI (Blastp). Se a ORF
escolhida for correta, o resultado do Blast indicará o grau de similari‐
dade com alguma sequência relacionada depositada. Algumas
vezes pode não haver sequências similares depositadas no banco
de dados, ainda.
O ORF finder permite que alguns dos critérios da análise sejam
alterados, como o tamanho do Threshold padrão de 100
nucleotídeos para, por exemplo, 50–300 nucleotídeos.
Para identificação da ORF pelo ORFinder foi utilizada, a título de
exemplo, a sequência do Contig 7, resultado do agrupamento de
cinco sequências HSP de G. soja em um único consenso pelo
CAP3. A sequência consenso é dada a seguir:
Essa sequência deve ser colada na janela de análise da ferra‐
menta ORFinder4, deixando-se os demais parâmetros sem
alterações (default) (Figura 9). Dependendo do organismo, pode-se
escolher o código genético mais adequado para identificação da
ORF. No ORFinder, há atualmente 16 opções, incluindo os códigos
para mitocôndria de vertebrados e de invertebrados.

Figura 9. Página do ORFinder com os seis diferentes frames possíveis para o Contig 7 com
sequências de Heat Shock Protein para Glycine soja.

O resultado da análise pelo ORFinder (Figura 9) mostra os


possíveis frames para a sequência fornecida (+1, +2, +3, respectiva‐
mente as três primeiras barras horizontais) e para a sua fita
complementar (-1, -2, -3, respectivamente as três barras seguintes).
Nesse caso, o frame correto é o maior e corresponde ao +1
(trincas definidas a partir da primeira base da sequência fornecida).
Para selecionar essa ORF, clica-se na barra que mudará de cor,
devendo-se aceitá-la em accept. A sequência FASTA da ORF sele‐
cionada pode ser vista em View. A sequência FASTA da ORF
correspondente ao frame +1 do Contig7 se inicia no 13o nucleotídeo
da sequência original.
As ORFs de cada contig e de cada singlet de Heat Shock Protein
devem ser salvas em arquivos separadamente.

4. Identificação e classificação do
polimorfismo

A ideia de gerar marcadores moleculares a partir da digestão do


DNA com enzimas de restrição não é recente. A técnica de RFLP já
utilizava esse princípio para o desenvolvimento de marcadores.
Atualmente, esse princípio foi utilizado para o desenvolvimento de
marcadores mais facilmente reprodutíveis, via PCR, em diferentes
laboratórios. Entre as metodologias atuais, está a SNP-CAPS, que
surgiu da modificação da técnica de marcadores CAPS. Marcadores
CAPS são desenvolvidos a partir de duas etapas. Na primeira, uma
sequência específica do DNA é amplificada utilizando-se primers
específicos. Na segunda etapa o produto da amplificação é digerido
com enzima de restrição (normalmente uma de corte frequente, com
sequência de reconhecimento de quatro bases). O produto da
digestão pode ou não apresentar polimorfismo após a separação
dos fragmentos em um gel de agarose (DEL BLANCO et al., 2007;
MAEDA et al., 1990).
O desenvolvimento de marcadores SNP-CAPS difere da meto‐
dologia tradicional CAPS pela análise prévia, via bioinformática,
para identificação de possíveis SNPs na região de reconhecimento
da enzima de restrição. Dessa forma, a presença do SNP pode
interferir no reconhecimento da sequência do DNA pela enzima de
restrição gerando o polimorfismo entre amostras de diferentes
indivíduos.
A seguir, serão descritos os passos para a identificação de
polimorfismo SNPs, o desenho de primers específicos que
flanqueiam a região com polimorfismo e, por último, a identificação
de enzimas de restrição que sejam compatíveis com os possíveis
pontos de polimorfismo.
Nessa etapa do trabalho, as sequências levantadas nos bancos
de dados e processadas (CAP3 e ORFinder) são utilizadas em
programas específicos que permitem a identificação de SNPs, como
o programa HaploSNPer5. Esse programa apresenta uma interface
flexível, que permite a identificação e classificação de SNPs tanto
em organismos diploides como em organismos poliploides (TANG et
al., 2008).
Na identificação in silico de SNPs com a ferramenta HaploSNPer
(Figura 10), pode-se usar uma das estratégias descritas a seguir.

4.1. Utilizando banco de dados do HaploSNPer

A sequência de cada ORF (identificada em cada contig e em


cada sequência única) pode ser analisada frente a banco de dados
disponibilizados pelo site (uma das ferramentas mais utilizadas na
identificação de polimorfismo tipo SNP ou Indel). Para a busca de
SNPs, deve-se, após colar a sequência FASTA na janela do lado
esquerdo, selecionar o banco de dados desejado com a opção
Select a database (Figura 10). Atualmente há 22 bancos de
sequências disponíveis, sendo 9 de animais e 13 de vegetais.

Figura 10. Página inicial do HaploSNPer. A janela do lado esquerdo é utilizada para busca
de SNPs utilizando-se banco de dados disponibilizado pelo site. A janela da direita
restringe a busca contra um conjunto de sequências.

4.2. Utilizando um conjunto de sequências FASTA

Nessa estratégia, para se fazer a identificação de SNPs, cada


uma das ORFs identificadas é alinhada separadamente via
programa CAP3 ou Phrap (opções para seleção) contra um conjunto
de sequências que funcionaria como o banco de dados. Essas
sequências são inseridas na janela do lado direito da tela do
HaploSNPer (Figura 10). Recomenda-se que as sequências com E-
value entre 0 e -60 sejam selecionadas e salvas em formato FASTA
nas respectivas pastas de cada ORF de origem. Essas sequências
serão utilizadas para identificação de SNPs e Indels em uma outra
opção do HaploSNPer.
Alguns parâmetros do HaploSNPer podem ser ajustados con‐
forme a necessidade da análise, tais como: E-value, percentual de
similaridade a ser considerado pelo CAP3 ou Phrap, tamanho das
regiões a serem consideradas de baixa qualidade na região 3´ e 5´,
o número mínimo de sequências a formar o cluster, etc. (Figura 11).

Figura 11. Continuação da página do HaploSNPer mostrando diferentes parâmetros que


podem ser otimizados para as análises.
Utilizando-se ORF do Frame +1 do contig 7 como sequência
query em relação ao banco de dados de Soja do HaploSNPer (a
primeira estratégia) e os demais parâmetros na condição default (E-
value: 1e-60; Minimum number of sequences for a cluster: 4;
Minimum number of sequences for each allele for every potential
SNP: 2; Low quality region from 5’ side: 30 nucleotides; Low quality
region from 3’ side: 20% of the whole length of sequence; Weight
value of low quality region: 0.5), com alinhamento via CAP3 (simila‐
ridade de 95%) foi identificado um SNP, classificado como uma
transição (A-T) verdadeira. Esse SNP foi localizado na posição 479
e está assinalado na sequência abaixo em vermelho. Nesse caso, o
polimorfismo corresponde à presença da base T ou C na posição
479.

5. Desenho de primers para amplificar a


região polimórfica

O desenho do par de primer a ser utilizado na PCR é uma das


etapas mais importantes. Primers são pequenas sequências de
DNA (20–30 bases) que se anelam com as extremidades da
sequência alvo que se deseja amplificar. Entre os programas de
bioinformática mais utilizados para desenho de primers está o
Primer36.
Basicamente, o tamanho dos primers pode variar, mas eles
devem ser suficientes para dar especificidade à reação e não
aumentar o custo de síntese. Além disso, se a temperatura de
dissociação dos primers é muito baixa, produtos não específicos
podem aparecer na reação. Esse valor é usado para calcular a
temperatura de anelamento, normalmente de 2 a 3 graus abaixo da
Tm (T melting – corresponde à temperatura em que metade dos
primers se encontram anelados com a fita molde). Atenção deve ser
dada ao resultado do Primer3, para que o conjunto de primers tenha
temperatura de Tm similar e que o conteúdo de GC esteja entre
40% e 60% ao longo da extensão do primer. O programa fornece
mais algumas informações como o Max Self Complementarity (grau
de homologia dentro cada primer para evitar anelamento entre os
primers reduzindo a eficiência da amplificação) e o Max 3´
Complementarity (grau de homologia entre a região 3` de cada
primer evitando a formação de dímeros causando baixa eficiência
na formação do produto).
Para o desenho dos possíveis conjuntos de primers, a sequência
FASTA que contém o polimorfismo SNP deve ser colada na janela
específica (Figura 12). A região alvo pode ser indicada entre
colchetes.
Figura 12. Página inicial do Primer3.

O programa Primer3 fornece o melhor par e mais quatro con‐


juntos de primers alternativos e que poderiam ser utilizados. Além
das sequências dos mesmos, outras informações relevantes são
fornecidas e ajudam a otimizar a reação de PCR, tais como: TM,
conteúdo de GC (%), tamanho dos primers (forward e reverse),
tamanho esperado do produto de amplificação, etc.
Dos pares de primers desenhados pelo programa Primer3 (nas
condições default) para a sequência consenso do contig 7 de Heat
Shock Protein Glycine soja (Figura 13), um dos pares amplifica a
região polimórfica de interesse (SNP na posição 479). As
características desse par podem ser vistas na Tabela 2.
Figura 13. Página de resultados do Primer3 mostrando os quatro pares de
oligonucleotídeos adicionais.

O primer esquerdo, se anelando da base 419 até a 429, ampli‐


ficaria um produto da amplificação de 223 pb, o que incluiria a base
479, local do SNP.

Tabela 2. Característica do par de primers que amplifica a região de polimorfismo da


sequência consenso do contig 7 de Heat Shock Protein de Glycine soja.

Primer Início (pb) Tamanho (pb) Tm (°C) GC% Sequência

Esquerdo 419 20 60,2 45 TGAGATTCAACATGCCAGGA

Direito 641 20 59,9 50 ATCCCATCTTTGACCTGTGC


Obs.: tamanho do produto = 223 pb.

6. Identificação das enzimas de restrição que


identificam o polimorfismo
Uma das ferramentas disponíveis on line para a identificação de
sítios de restrição a partir de uma dada sequência de DNA é o
NEBcutter (VINCZE et al., 2003). Nesse caso, também tem que se
fornecer a sequência para análise em formato FASTA.
O resultado fornecido pelo NEBcutter (Figura 14) indica não
somente quais são as enzimas que apresentam sítios de restrição
na sequência, mas a localização de cada um dos sítios (Figura 15).

Figura 14. Página inicial do NEBcutter. Essa ferramenta fornece opções para restrição das
enzimas que serão utilizadas na análise logo abaixo da janela em que é depositada a
sequência.
Figura 15. Página de resultado do NEBcutter, mostrando graficamente a sequência com as
respectivas enzimas de restrição e seus sítios de ação.

Para visualizar melhor a região de polimorfismo, deve-se marcar


com o mouse (clicando sobre a sequência) e solicitar na janela
Zoom, que fica logo abaixo da representação gráfica da sequência,
para ampliar o trecho marcado. Ao ampliar o trecho da sequência
correspondente ao polimorfismo, torna-se mais fácil visualizar os
sítios de reconhecimento das enzimas de restrição. Ao passar com
o mouse sobre o nome da enzima, o programa automaticamente
indica no gráfico (em vermelho) a região de reconhecimento da
enzima (Figura 16). Essa ferramenta também fornece algumas
informações relevantes, como se a enzima ainda é comercializada e
que tipo de corte ela produz na sequência (seta na Figura 16).
Figura 16. Página do NEBcutter apresentando ampliação de trecho específico da sequência
do contig 6 de Heat Shock Protein de Glycine soja. A seta indica escala de cores referente
às características de cada enzima.

Com a análise pelo NEBcutter foi possível identificar quatro


enzimas (NspI, NlaIII, CviAII, FatI) cujos pontos de reconhecimento
coincidem com a posição 479 da sequência do contig 6 da Heat
Shock Protein de Glycine soja.
É importante lembrar que, como os primers foram desenhados a
partir de sequências de EST, é possível que não amplifiquem a
sequência genômica se houver um intron na região de anelamento
do primer com o DNA genômico. Da mesma forma, caso exista um
intron no meio da sequência de reconhecimento da enzima de
restrição, a clivagem do DNA não ocorrerá.
Sendo assim, se for possível, deve-se comparar a sequência
EST com a sequência genômica do gene. Outra possibilidade, para
evitar esses problemas, é utilizar as enzimas de restrição para
digerir os produtos da RT-PCR.
7. Referências

ALTSCHUL, S. F.; GISH, M. G. W.; WEBB, M. E. W.; LIPMAN, D. J. Basic local alignment
search tool. Journal of Molecular Biology, Amsterdam, NL, v. 215, p. 403-410, 1990.
BUCKLER, E. S.; THORNSBERRY, J. M. Plant molecular diversity and applications to
genomics. Currient Opinion in Plant Biology, London, UK, v. 5, p. 107–111, 2002.
CHING, A.; CALDWELL, K. S.; JUNG, M.; DOLAN, M.; SMITH, O. S.; TINGEY, S.;
MORGANTE, M.; RAFALSKI, A. J. SNP frequency, haplotype structure and linkage
disequilibrium in elite maize inbred lines. BMC Genetic, London, UK, v. 3, n. 19, 2002.
CONG, B.; LIU, J.; TANKSLEY, S. D. Natural alleles at a tomato fruit size quantitative trait
locus differ by heterochronic regulatory mutations. Proceedings of the National Academy of
Sciences, Washington, DC, v. 99, p. 13606–13611, 2002.
DEL BLANCO, I. A.; SCHMIERER, D. A.; KLEINHOFS, A.;ULLRICH, S. E. PCR-based
markers targeting barley putative grain yield and quality QTLs regions. Barley Genetics
Newsletter, Fort Collins, v. 37, p. 21-23, 2007.
HUANG, X.; MADAN, A. CAP3: A DNA Sequence Assembly Program. Genome Research,
New York, v. 9, p. 868-877, 1999.
JACKSON, S.; ROUNSLEY, S.; PURUGGANAN, M. Comparative Sequencing of Plant
Genomes: Choices to Make. Plant Cell, Rockville, v. 18, p. 1100-1104, 2006.
JANDER, G.; NORRIS, S. R.; ROUNSLEY, S. D.; BUSH, D. F.; LEVIN, I. M.; LAST, R. L.
Arabidopsis Map-Based cloning in the Post-Genome. Era Plant Physiology, Stanford, v. 129,
p. 440-450, 2002.
KNIGHT, J. C. Allele-specific gene expression uncovered. Trends in Genetics, Amsterdam,
NL, v. 20, p. 113–116, 2004.
KORF, I.; YANDELL, M.; BEDELL, J. An essential guide to the basic local aligment search tool.
Sebastopol: O’Reilly, 2003. 348 p. 2003.
KWOK, P. Y. Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms. Annual Review of
Genomics and Human Genetics, Palo Alto, v. 2, p. 235-258, 2001.
LEWONTIN, R. C. The history of interest in genetic variation. In: Molecular markers, natural
history and evolution. Sunderland: Sinauer Associates, 2004. p. 2354. 2004.
MAEDA, M.; URYU, N.; MURAYAMAN, N.; ISHII, H.; OTA, M.; TSUJI, K.; INOKO, H. A
simple and rapid method for HLA-DP genotyping of digestion of PCR amplified DNA with
allele specific restrictions endonucleases. Human Immunology, San Diego, v. 27, p. 111-
211, 1990.
NAKITANDWE, J.; TROGNITZ, F.; TROGNITZ, B. Reliable allele detection using SNP-
based PCR primers containing Locked Nucleic Acid: application in genetic mapping. Plant
Methods, Chicago, v, 17, n. 1, p. 1-9, 2007.
QUEITSCH, C.; HONG, S. W.; VIERLING, E.; LINDQUIST, S. Heat shock protein 101 plays
a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell, Rockville, v. 12, p. 479-492,
2000.
REGISTER, J. C.; TINGEY, S. V.; RAFALSKI, A. Insertion-deletion polymorphisms in 3’
regions of maize genes occur frequently and can be used as highly informative genetic
markers. Plant Molecular Biology, New York, v. 48, p. 539–547. 2002.
ROMBEL, I. T.; SYKES,K.S; RAYNER, S.; JOHNSTON, S.A. ORF-FINDER: a vector for
high-throughput gene identification. Genetics, Maryland, v. 282, n. 1-2, 9, p. 33-41. 2002.
TANG, J.; LEUNISSEN, J. A. M.; VOORRIPS, R. E.; LINDEN, C. G. van der; VOSMAN. B.
HaploSNPer: a web-based allele and SNP detection tool. BMC Genetics, London, UK, v. 9,
n. 23, p. 1-7. 2008.
VERTUCCI, C. W.; FARRANT, J. M. Acquisition and loss of desiccation tolerance. In:
KIGEL, J.; GALILI, G. (Ed.). Seed development and germination. New York: Marcel Dekker,
1995. p. 237-271.
VINCZE, T.; POSFAI, J.; ROBERTS, R. J. NEBcutter: a program to cleave DNA with
restriction enzymes Nucleic Acids Research, London, UK, v. 31, p. 3688-3691, 2003.
WEISING, K.; NYBOM, H.; WOLFF, K.; KAHL, G. DNA fingerprinting in plants. principle,
methods and applications. Boca Raton: CRC Press, 2005. 444 p.

Anexo

Lista dos gi das sequências EST de Glycine soja utilizadas nas análises
do capítulo...
>gi|16281180|gb|BI944355.1|BI944355 saa56f01.y1 Gm-c1060 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1060-650 5’
similar to TR:O04056 O04056 HEAT SHOCK PROTEIN 70
PRECURSOR.
>gi|12689344|gb|BG155680.1|BG155680 saa64d11.y1 Gm-c1060 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1060-1342 5’
similar to TR:Q40867 Q40867 HEAT SHOCK PROTEIN 17.9. ;, mRNA
sequence
>gi|12689338|gb|BG155674.1|BG155674 saa64c06.y1 Gm-c1060 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1060-1284 5’
similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-
SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|12493448|gb|BG045577.1|BG045577 saa03c04.y1 Gm-c1058 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1058-127 5’
similar to SW:HS82_ARATH P55737 HEAT SHOCK PROTEIN 81-2 ;,
mRNA sequence
>gi|12492958|gb|BG045334.1|BG045334 saa40f03.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-1422 5’
similar to SW:HS82_TOBAC P36182 HEAT SHOCK PROTEIN 82 ;,
mRNA sequence
>gi|12492910|gb|BG045310.1|BG045310 saa40d01.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-1322 5’
similar to SW:HS82_ORYSA P33126 HEAT SHOCK PROTEIN 82. ;,
mRNA sequence
>gi|12492255|gb|BG044981.1|BG044981 saa36a01.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-794 5’
similar to TR:Q40694 Q40694 HEAT SHOCK PROTEIN HSP82 ;, mRNA
sequence
>gi|12490491|gb|BG044011.1|BG044011 saa23b09.y1 Gm-c1058 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1058-2009 5’
similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-
SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|12489475|gb|BG042997.1|BG042997 saa46g12.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-2232 5’
similar to TR:Q96269 Q96269 HEAT-SHOCK PROTEIN. [1] ;, mRNA
sequence
>gi|12488280|gb|BG041844.1|BG041844 saa41g12.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-1847 5’
similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-
SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|12488268|gb|BG041837.1|BG041837 saa41g03.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-1829 5’
similar to TR:O80982 O80982 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;,
mRNA sequence
>gi|12015538|gb|BF716266.1|BF716266 saa17c09.y1 Gm-c1058 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1058-1649 5’
similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-
SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|12489242|gb|BG042764.1|BG042764 sv13f04.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1056-1807 5’
similar to SW:HS11_LYCES P30221 17.8 KD CLASS I HEAT SHOCK
PROTEIN. [2] TR:Q9SYU9 ;, mRNA sequence
>gi|12487754|gb|BG041578.1|BG041578 sv36c04.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1057-1640 5’
similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-
SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|11691080|gb|BF598756.1|BF598756 sv21d05.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1057-177 5’
similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-
SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|11690967|gb|BF598643.1|BF598643 sv20a07.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1057-14 5’
similar to TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;,
mRNA sequence
>gi|11690757|gb|BF598433.1|BF598433 sv17e06.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1056-2147 5’
similar to TR:O80329 O80329 HEAT SHOCK PROTEIN 26 ;, mRNA
sequence
>gi|11690742|gb|BF598418.1|BF598418 sv17c11.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1056-2061 5’
similar to SW:HS2C_ARATH P31170 CHLOROPLAST SMALL HEAT
SHOCK PROTEIN PRECURSOR. ;, mRNA sequence
>gi|11690433|gb|BF598109.1|BF598109 sv03e02.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1056-963 5’
similar to TR:Q9XIF5 Q9XIF5 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;,
mRNA sequence
>gi|18849152|gb|BM568262.1|BM568262 sal02b06.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-3923 5’ similar to
TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA
sequence
>gi|18732190|gb|BM526900.1|BM526900 sal47a10.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1059-5036 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18731186|gb|BM526307.1|BM526307 sal39f05.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1059-4498 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18731104|gb|BM526260.1|BM526260 sal38h11.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1059-4605 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18727984|gb|BM524462.1|BM524462 sal16a05.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1059-2313 5’ similar to
TR:Q9XCB2 Q9XCB2 HEAT SHOCK PROTEIN DNAJ. ;, mRNA
sequence
>gi|18727288|gb|BM524049.1|BM524049 sal06g12.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-4559 5’ similar to
SW:HS21_SOYBN P05477 17.9 KD CLASS II HEAT SHOCK PROTEIN.
;, mRNA sequence
>gi|18727056|gb|BM523910.1|BM523910 sal05b01.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-4274 5’ similar to
TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA
sequence
>gi|18691843|gb|BM520691.1|BM520691 sak97d04.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-3631 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18691767|gb|BM520615.1|BM520615 sak96d05.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-3610 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18691638|gb|BM520486.1|BM520486 sak94g12.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-3408 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18691076|gb|BM519924.1|BM519924 sak86c12.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-2448 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18690990|gb|BM519838.1|BM519838 sak85a03.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-2333 5’ similar to
TR:Q9SIL3 Q9SIL3 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA
sequence
>gi|26059251|gb|CA802165.1|CA802165 sat46b02.y2 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-4299 5’ similar to
TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA
sequence
>gi|26057001|gb|CA799915.1|CA799915 sat64c09.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-6257 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|26056878|gb|CA799792.1|CA799792 sat62f11.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-6045 5’ similar to
TR:Q96269 Q96269 HEAT-SHOCK PROTEIN. [1] ;, mRNA sequence
>gi|26056078|gb|CA798992.1|CA798992 sat73f06.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-7164 5’ similar to
SW:HS14_SOYBN P04794 17.5 KD CLASS I HEAT SHOCK PROTEIN
;, mRNA sequence
>gi|26047084|gb|CA783981.1|CA783981 sat59g11.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-5710 5’ similar to
SW:HS2C_ARATH P31170 CHLOROPLAST SMALL HEAT SHOCK
PROTEIN PRECURSOR. ;, mRNA sequence
>gi|26046400|gb|CA783579.1|CA783579 sat50c04.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-4735 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|26045556|gb|CA783102.1|CA783102 sat67g01.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-6458 5’ similar to
TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA
sequence
>gi|26044294|gb|CA782452.1|CA782452 sat29a03.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-2694 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
Capítulo 4
Bioinformática aplicada ao estudo
de genomas expressos (EST) em
plantas
Laureen Michelle Houllou-Kido
Antonio Felix da Costa
Lílian Vieira de Medeiros
Meiriana X. Vila Nova

1. Introdução

O sequenciamento de genomas foi iniciado na segunda metade


do século 20 e se desenvolveu rapidamente na última década do
século passado para abranger várias espécies de organismos (1995
– Genomas completos bacterianos, 1996 – Genoma completo de
levedura, 1999 – Genoma completo da mosca-da-fruta). O resultado
deste trabalho permitiu acumular conhecimento sobre as sequências
de diferentes genes nas mais variadas espécies de organismos.
Essas sequências vêm sendo depositadas, em sua maioria, em
bancos de dados públicos, facilitando o acesso a essas informações
por quaisquer grupos de pesquisa no mundo inteiro. Esses bancos
de dados genômicos contêm tanto as sequências de DNA como as
sequências de etiquetas de sequências expressas (EST). As
sequências de EST correspondem a pequenos cDNAs (com 200 a
800 bases) obtidos a partir do mRNA. Os ESTs correspondem,
atualmente, a uma parcela bastante representativa dos projetos de
genoma desenvolvidos até o presente momento e são utilizados
para identificação de genes, identificação de transcritos alternativos,
caracterização de proteomas, etc. (NAGARAJ et al., 2006).
O conjunto completo de RNAs codificadores e não codificadores
(mensageiros, ribossômicos, transportador) é chamado
transcriptoma. Desse transcriptoma, só uma pequena parte é
codificadora (mRNA). Ao contrário do genoma, o transcriptoma de
uma planta varia de acordo com estádio fisiológico, com os
estímulos físicos, químicos e biológicos, doenças, etc. (SOUZA et
al., 2000).
As informações fornecidas com o estudo do transcriptoma são de
grande importância não apenas para a identificação de novos
genes, mas também por fornecer informações que esclareçam a
que rotas metabólicas os genes podem estar associados, por
estarem sendo expressos em condições específicas. As condições
fisiológicas podem inclusive induzir um splicing alternativo,
conferindo a um gene específico uma grande variação funcional, de
acordo com a montagem dos exons (processamento diferencial).
Os ESTs permitiram estudar o padrão de genes expressos em
diferentes situações e estádios de desenvolvimento nos mais
diferentes organismos, gerando a criação de bancos de dados
específicos. Sendo assim, os objetivos do sequenciamento de ESTs
são: 1) associar os mRNAs expressos em uma dada condição às
respectivas etiquetas de genes de função conhecida (anotação); 2)
permitir a identificação de genes e proteínas desconhecidos; 3)
viabilizar o estudo de rotas metabólicas associadas a características
específicas, etc.
Dentre os bancos de dados gerados a partir da anotação de
ESTs, destaca-se o dbEST (NCBI, 2009). O dbEST (Expressed
Sequence Tags database, dados de 30 janeiro de 2009) é,
atualmente, o maior banco público do mundo de sequências
expressas e conta com mais de 59 milhões de ESTs, entre eles,
mais de oito milhões de ESTs humanos, mais de 4,8 milhões de
ESTs de camundongo e de rato, mais de 2 milhões de ESTs de
milho, mais de 1,3 milhão de sequências de EST de soja, mais de
1,2 milhão de EST de arroz, etc. Vale a pena ressaltar que, em
1999, o dbEST possuía pouco mais de 2 milhões de ESTs
depositados.
Surge, então, um importante problema: processar a grande
quantidade de informações proveniente do sequenciamento de EST,
como agrupar as sequências pertencentes a um mesmo contig e
identificar a que gene corresponde cada sequência de EST. Nesse
ponto, entram as ferramentas computacionais que fazem parte da
bioinformática para ajudar a analisar de forma mais eficiente os
dados produzidos pelos projetos de genomas expressos (EST).
A bioinformática surgiu da necessidade de gerenciamento da
quantidade maciça de dados gerados pelos projetos de sequencia‐
mento (PERSSON, 2000) e requer a atuação conjunta de
profissionais de diversas áreas (EWING et al., 1998). Atualmente,
diversas técnicas e programas computacionais estão sendo
utilizados para o estudo da estrutura dos genomas (ver capítulo 5 da
parte 3), permitindo, por exemplo, a identificação de regiões
codantes (codificadoras), usualmente chamadas de quadros abertos
de leitura, ou Open Reading Frames (ORFs), e de outras regiões
não codantes (3’ e 5’ UTR), regiões repetitivas, elementos
transponíveis, etc. Entre as diferentes ferramentas de
bioinformática, uma das mais relevantes na anotação de EST
recém-sequenciados pertence ao pacote de programas do Blast. O
Blast permite determinar a possível função de um gene, pela busca
de similaridade com sequências de genes conhecidos e descritos
em bancos de dados públicos (ex.: NCBI). A utilização de
ferramentas computacionais para correlacionar ou predizer a função
gênica de sequências recém-sequenciadas recebe o nome de
anotação. A atribuição de uma provável função a uma sequência
EST só é possível graças à existência de genes ortólogos (genes
homólogos, descritos em diferentes espécies, que se originaram de
um gene ancestral comum por especiação). Dessa forma, pode-se
atribuir uma possível função a uma sequência EST pelo grau de
homologia entre sequências provenientes de organismos distintos.
Acredita-se que uma característica comum de genes ortólogos é de
que eles, normalmente, realizam a mesma função (KOONIN, 2005).
Graças à exploração de informações da expressão gênica em
espécies modelos (ex.: Arabidopsis thaliana), aliada à conservação
gênica entre espécies relacionadas (Sintenia), foi possível a identi‐
ficação de genes candidatos associados a características
agronômicas relevantes. Como exemplo, Graham et al. (2006)
identificaram, usando a bioinformática, 52 genes candidatos em
feijão, induzidos apenas em condição de baixos níveis de fósforo.
Outro exemplo foi a identificação de genes candidatos a
transportadores de Fe e Zn em milho, por meio da comparação com
sequências gênicas conhecidas de arroz e outras espécies de
gramíneas (CHAUHAN, 2006).
No entanto, a validação dessa informação pode requerer a
realização de testes em bancada como as técnicas que provocam a
perda de função gênica (knockout) ou pela inibição total ou parcial
da tradução do RNA, conhecida como iRNA (KIM, 2001).
Este capítulo objetiva apresentar, de uma forma resumida, a
estratégia que pode ser utilizada para a obtenção e análise de
bibliotecas de ESTs. Sendo assim, será utilizada como exemplo a
metodologia para análise de EST obtidos de cultivares contrastantes
para resistência à salinidade.

2. Condições experimentais dos genótipos


para a construção das bibliotecas

Para a construção das bibliotecas de expressão de genes de


resistência à salinidade podem ser utilizadas duas variedades
contrastantes, uma suscetível e outra resistente. As plantas,
mantidas em casa de vegetação, devem ser cultivadas em areia
lavada e regadas com solução nutritiva de Hoagland. Em seguida,
parte das plantas é regada com solução nutritiva de Hoagland
acrescida de NaCl (100 mM). Parte das plantas não será submetida
ao estresse salino, para ser utilizada como controle. O número de
plantas para o experimento depende do número de bibliotecas que
serão feitas. Esse exemplo foi montado em um experimento para
construção de seis bibliotecas, conforme a Tabela 1 abaixo. Nesse
caso, serão utilizadas oito plantas por biblioteca, fazendo um total
de 48 plantas (24 de cada cultivar).

Tabela 1. Esquema resumido do experimento de estresse salino


em variedades contrastantes para construção de biblioteca de
expressão.
Cultivar Tratamento Número de plantas

30 minutos após
Suscetível 8
estresse

90 minutos após
Suscetível 8
estresse

4 coletas com 30 minutos + 4 coletas com 90


Suscetível Controle
minutos

30 minutos após
Resistente 8
estresse

90 minutos após
Resistente 8
estresse

4 coletas com 30 minutos + 4 coletas com 90


Resistente Controle
minutos

Normalmente o material do controle é coletado no mesmo


período do material submetido ao estresse, para eliminar quaisquer
interferências de fatores ambientais, como variação da luminosidade
e temperatura, no momento da coleta. Os tecidos pertencentes ao
material controle podem ser reunidos em uma só amostra dentro de
cada cultivar. Sendo assim, as raízes do material suscetível,
coletadas aos 30 e aos 90 minutos, que não foram submetidas ao
estresse salino, podem ser misturadas formando apenas uma
biblioteca.
Cada biblioteca será designada empregando um sistema de
codificação para sua identificação, sendo duas letras para o tipo de
estresse (sob estresse ou controle); duas letras para o tecido (raiz
ou folha); dois dígitos para o tempo; uma letra para a forma
(resistente ou suscetível). Exemplo: RCTRZ30+90PL3P37
corresponde à biblioteca do material resistente, não exposto à
salinidade (controle) com material de raiz coletada nos tempos 30 e
90 minutos, placa 3, poço 37 (R = resistente e S = suscetível; ES =
estresse salino; CT = controle; RZ = raiz; FL = folha; 30 = 30
minutos; 90 = 90 minutos; PL = placa; P = poço).
Depois das plantas serem submetidas a cada tratamento, as
raízes são lavadas para a remoção de impurezas e imediatamente
congeladas em N2 líquido e mantidas a -80 °C.

3. Extração de RNA

A metodologia descrita a seguir pode necessitar de modificações


conforme o tecido e a espécie vegetal em estudo. Para este capítulo
será descrita metodologia que pode ser utilizada para purificação de
RNA de raízes de cana-de-açúcar.
As raízes congeladas são maceradas em N2 líquido e o RNA total
isolado preferencialmente com o reagente Trizol (Invitrogen),
conforme preconizado pelo fabricante. Outras metodologias de
extração podem ser empregadas caso a qualidade do RNA não
esteja boa com a extração com Trizol (ex.: extração com cloreto de
lítio). O RNA total das raízes, de cada cultivar e de cada tratamento,
pode ser extraído e reunido após extração individual. A proporção
recomendada é de 100 mg de tecido vegetal fresco, macerado em
nitrogênio, para 1 mL de Trizol. Esse material deve ser vortexado e
homegeneizado por 5 minutos, a 15 °C–30 °C. Em seguida, o
material é centrifugado (11.400 rpm, 15 minutos a 4 °C). A fase
aquosa, transferida para um tubo novo, deve ser lavada com
clorofórmio (200 µL) sob agitação (± 20 segundos) e incubada à
temperatura ambiente (5 minutos). Após esse período, submete-se
a amostra a uma centrifugação novamente. A fase aquosa é
transferida para um microtubo limpo, para precipitação do RNA total
com isopropanol (0,5 mL de isopropoanol por mL de Trizol). A
solução é centrifugada mais uma vez. O pellet é então lavado com 1
mL de etanol 75% e seco a 37 °C por 10 minutos. O RNA total deve
ser, então, ressuspendido em 30 µL de água Depc (0,01%),
precipitado em 1/10 do volume de NaOAc 300 mM, pH 5,5; 1/50
volumes de glicogênio (50 µg/mL) e 2,5 volumes de etanol absoluto
e armazenado a -80 °C.
Ressaltamos que se o material tiver uma grande quantidade de
polissacarídeos, como em raízes de algumas espécies, é recomen‐
dado algumas modificações dessa metodologia: (i) utiliza-se a pro‐
porção de 200 mg para cada mL de Trizol; (ii) o RNA deve ser
centrifugado a 11.400 rpm, 15 minutos a 4 °C após a
homogeneização com Trizol, e o sobrenadante deve ser precipitado
com 0,8 M de citrato de sódio e 1,2 M NaCl, juntamente com o
isopropanol; (iii) a qualidade e limpeza do RNA são analisadas por
espectrometria e em gel de agarose, utilizando o tampão da amostra
com 1% de formamida. Quando necessário, realiza-se limpeza de
RNA com o RNase Plant Mini Kit (Qiagen). Para a extração de RNA
poli A+ utiliza-se 1 mg de RNA total de cada ponto (dia) e o kit
Oligotex Spin Column (Qiagen) de acordo com as orientações do
fabricante, salvo algumas modificações: (i) Incuba-se o RNA total e
resina de oligo-dT por 30 minutos sob agitação; (ii) nas três
eluições, ressuspende-se a resina com o volume máximo
recomendado (100 µL) da solução OEB e pipeta-se a solução a 70
°C.

4. Isolamento do RNA mensageiro (RNAm)


Amostras de RNAm são isoladas a partir do RNA total, utilizando
um kit específico (ex.: Oligotex dT – Qiagen), conforme as
instruções do fabricante. Utilizando-se o Kit Oligotex dT: (i) misturar
uma alíquota da amostra, contendo 1 mg de RNA total em 500 µL
de água-Depc, com 500 µL de solução tampão OBB (TRIS-HCl 20
mM, pH 7,5; NaCl 1 M; Edta 2 mM e SDS 0,2%) e 100 µL de resina
Oligotex Suspension; (ii) incubar a 70 °C por 5 minutos e, em
seguida, a 37 °C mais 20 minutos; (iii) o complexo RNA total + oligo
(dT) deve ser peletizado por centrifugação (20.000 g por 2 minutos),
e o precipitado remanescente deve ser ressuspendido em 600 µL de
tampão OW2 (TRIS-HCl 10 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM e Edta 1
mM) e transferido para uma coluna RNase-free Spin Columns e
centrifugado (12.000 g por 2 minutos). A coluna é transferida para
um novo microtubo, e a lavagem com OW2 repetida. Para a eluição
do RNAm, são adicionados 100 µL de tampão OEB (TRIS-HCl 5
mM, pH 7,5) pré-aquecido a 70 °C.
Para precipitação do RNA deve-se proceder da seguinte forma:
(i) após a centrifugação (20.000 g por 1 minuto), o sobrenadante é
separado e tratado com uma solução de 1/10 do volume de NaOAc
(300 mM, pH 5,5), 1/50 volumes de glicogênio (50 µg/mL) e 2,5 vo‐
lumes de etanol absoluto a -80 °C por 2 horas; (ii) após esse
período, a solução deverá ser centrifugada, e o precipitado lavado
com 2 mL de etanol 75%. Por último, (iii) deixa-se o pelet secar a 37
°C por 20 minutos. O RNA deverá ser ressuspende em água-DEPC.

5. Construção das bibliotecas de cDNA fita


dupla

As bibliotecas de cDNA podem ser confeccionadas, por exemplo,


com o protocolo descrito para o kit SuperScript Plasmid ou outro, de
outra marca, contanto que as instruções do fabricante sejam
seguidas. Utilizando-se o kit SuperScript Plasmid e o Cloning Kit
(Invitrogen) deve se proceder da seguinte forma: (i) utilizar primers
oligodT estendidos e com o sítio para a enzima de restrição e a
enzima transcriptase reversa para sintetizar o cDNA; (ii) utilizar base
metil-dC para a síntese da primeira fita, evitando da fita clivagem por
enzimas de restrição; (iii) adicionar adaptadores às extremidades do
cDNA. Após essa etapa, o produto é duplamente digerido,
utilizando-se enzimas de restrição, para liberação do cDNA. A
ligação do cDNA ao vetor deve seguir as instruções do fabricante.
Após a ligação, a biblioteca gerada deve ser amplificada e
aliquotada, podendo ser estocada a 4 oC. A alíquota de uso da
biblioteca, uma vez titulada, serve para a preparação das sub-
bibliotecas de sequenciamento. Dessa forma, se ocorrer algum
problema durante o sequenciamento, será possível repeti-lo.

6. Bibliotecas EST para sequenciamento

As bibliotecas são elaboradas a partir dos ESTs obtidos nas


etapas anteriores. Essa fração é transformada in vivo com o plasmí‐
deo fornecido no Cloning Kit (Invitrogen). Alíquotas da
transformação devem ser plaqueadas, e os clones bacterianos,
contendo o vetor pSORT1 recombinante, repicados em placas de 96
poços. As placas máster devem ser estocadas a -80 oC até o
momento do uso.

7. Validação da biblioteca de EST

A validação das bibliotecas de EST se faz com o uso da PCR,


avaliando-se a presença e tamanho dos insertos. São selecionadas
as bibliotecas de EST contendo inserto médio com 1 kb a 2 kb e
com ao menos 70% dos 96 poços da placa indicando a presença do
inserto.
Para amplificação dos insertos, os recombinantes são coletados,
individualmente, da biblioteca de EST e ressuspendidos em 200 µL
de tampão SM (100 mM NaCl, 8 mM MgSO4 7 H2O, 50 mM Tris-HCl
pH 7 e 0,04% de gelatina) contendo 0,5% de clorofórmio
(SAMBROOK et al., 1989). Em seguida, os materiais são incubados
a 4 oC por 12 horas.
As reações de PCR são realizadas em um volume total de 50 µL
(5 µL da suspensão obtida na etapa anterior e 45 µL de master mix,
dos quais 38,05 µL de água estéril, 5 µL de tampão de PCR 10X,
0,75 µL 150 mM dNTPs e 0,5 µL de 0,1 µM primers). São utilizados
os primers universais que hibridizam de cada lado do sítio de multi‐
clonagem do pSORT1 inseridos no vetor.
Após desnaturação preliminar a 95 oC, por 10 minutos, são
adicionados 0,2 µL de Taq polimerase (5 U/µL) em cada tubo de
reação. Em seguida, são realizados 30 ciclos (desnaturação a 95 oC
por 90 segundos, anelamento a 60 oC por 90 segundos, e extensão
a 72 oC por 20 segundos, com uma extensão final a 72 oC por 15
minutos). Controles negativos sem DNA são adicionados a cada
série de amplificações para verificar a ocorrência de possíveis
contaminações. Os produtos de PCR são mantidos a -20 oC até
sequenciamento. Os amplicons são analisados em eletroforeses,
em gel de agarose 1%–1,5% e tampão de corrida TBE 1X
(SAMBROOK et al., 1989). Utiliza-se um DNA padrão de tamanho e
concentração conhecidos. Os produtos são visualizados, após
coloração em solução de brometo de etídio (4 µg/mL), o resultado
da corrida é observado em transiluminador UV, e a imagem
capturada em sistema computadorizado. São mantidas as
suspensões de fagos com produtos acima de 600 pb. A seguir, é
feita uma miniprep (metodologia para extração de DNA plasmidial)
para purificação dos plasmídeos que serão utilizados na etapa de
sequenciamento.

8. Sequenciamento automático
Para o sequenciamento são utilizados os plasmídeos como
moldes, usando kits da Applied Biosystems (BygDye Cycle
Sequencing kit). Cada clone deve ser sequenciado separadamente,
utilizando-se os primers T7 (início em 3´) e T3 (início em 5´). Os pro‐
dutos são precipitados com etanol 95% usando de acetato de sódio
3 M e lavados com etanol 70%, antes de serem secos sob vácuo.
As reações secas podem ser estocadas a -20 oC, protegidas da luz.
Os produtos das reações de sequenciamento são analisados em
sequenciador (ex.: ABI 3100 – Applied Biosystems) que disponha de
programas específicos para coleta, análise dos dados, gerando
arquivo em formato abi, que pode ser interpretado pelo programa
Phred.

9. Preparo das sequências EST para análises


em bancos de dados

Os eletroferogramas, obtidos do sequenciamento dos cDNAs,


devem ser analisados pelo programa Phred. Esse programa vai
atribuir um valor qualitativo para cada um dos picos de cada base, a
partir de critérios como: a intensidade do sinal, o espaçamento entre
bandas, a largura e a altura de cada pico, etc. Para essa análise,
devem ser estabelecidos os parâmetros de aceitação das
sequências (ex.: recomenda-se definir o tamanho mínimo da
sequência no intervalo entre 150 pb–250 pb). Essa análise deve ser
feita utilizando-se um valor de qualidade Phred superior a 20, o que
corresponde a 99% de certeza de que a base indicada está correta
(um erro a cada 1.000 bases). Todas as sequências devem ser
depositadas em banco de dados específico preferencialmente em
formato FASTA. A seguir, todas as sequências devem ser
submetidas a uma análise para eliminar qualquer segmento de
vetores, de cauda poli-A, de genes ribossomais ou de contaminação
por DNA. Segundo Telles e Silva (2001), essas sequências devem
ser eliminadas porque podem introduzir, nos EST, regiões de
similaridade que não são relevantes para a clusterização. Dessa
forma, a presença de segmentos de vetores pode ser identificada e
eliminada com o programa VecScreen1.
Em seguida, essas sequências devem ser submetidas à cluste‐
rização pelo programa CAP3 (Figura 1) (HUANG; MADAN, 1999),
que vai agrupar as sequências por meio da sobreposição de áreas
comuns. A partir dos contigs (agrupamento de sequências em um
consenso) e das sequências únicas (que não foram agrupadas com
nenhuma outra no CAP3), são formados bancos de dados que irão
ser utilizados na busca de homologia com genes já depositados em
bancos de dados.

Figura 1. Página inicial do CAP3. Essa ferramenta é utilizada para agrupar os ESTs em
contigs.

O CAP3 (2009) ordena as sequências dos clones formando um


contig. O ordenamento é feito pela sobreposição das sequências
dos clones. Assim, o contig é uma sequência contínua, resultado da
sobreposição das sequências com o uso do CAP3, e a Single
sequences refere-se às demais sequências que não se agruparam.
O Assembly details refere-se aos detalhes do alinhamento e da
sobreposição das sequências (Figura 2).

Figura 2. Página de acesso a resultado do CAP3. Os links da página permitem acessar os


detalhes do agrupamento (contigs), as sequências que não agruparam (single sequences)
e o gráfico contendo o alinhamento dos gi em cada contig (assembly details).

Para identificação da região codante das sequências dos agrupa‐


mentos é feita a identificação da ORF (Open Reading Frame), com
o programa ORFFinder (2009), Rombel et al. (2002), desprezando-
se as regiões 3’-UTR e 5’-UTR de cada uma das sequências (Figura
3).
Figura 3. Página inicial do NCBI. A seta indica o link para acessar o programa ORF Finder
(Open Reading Frame Finder).

10. Análises em bancos de dados para busca


de homologia

O objetivo do sequenciamento de ESTs é tentar descobrir as


funções moleculares e celulares referentes a cada uma das sequên‐
cias de cDNA, etapa denominada de anotação. No entanto, apesar
de ter um grande aparato de bioinformática para dar suporte, a
anotação gênica não deve ser considerada uma tarefa simples. A
anotação pode ser dividida em duas etapas: a anotação em nível de
nucleotídeo e a anotação em nível proteico.
Para cada uma dessas etapas, os principais programas utilizados
de bioinformática pertencem ao Basic Local Aligment Search Tool
(Blast), que corresponde a um pacote de programas que analisam a
similaridade entre sequências de nucleotídeos e aminoácidos
(ALTSCHUL et al., 1990). Na página do NCBI2, existem dois grupos
de pacotes de programas para alinhamento e busca de homologia.
O primeiro grupo corresponde ao Basic Blast (Blast básico) em que
são encontradas cinco opções: nucleotide blast, protein blast, blastx
(faz uma busca no banco de dados de proteínas utilizando-se uma
sequência de nucleotídeos traduzida para aminoácidos), blastn (faz
uma busca no banco de dados de nucleotídeos traduzidos para
proteína utilizando uma sequência de aminoácidos), tblastx (busca
no banco de dados de sequências de nucleotídeos traduzidas para
proteína utilizando-se uma sequência de nucleotídeo também
traduzida para proteína). O segundo pacote de programas do Blast
corresponde ao Specializer Blast (Blast especializado), que permite
entre outras coisas fazer primers específicos, buscar domínios
conservados, buscar imunoglobulinas, SNPs, etc. Neste capítulo do
livro serão utilizadas apenas as ferramentas do Blast básico, por
isso não serão detalhadas as características do Blast especializado.
Torna-se necessário nesse ponto esclarecer dois conceitos que
algumas vezes são confundidos: similaridade e homologia. Nem
todas as sequências que apresentam similaridade podem ser
consideradas homólogas. No entanto, a determinação de homologia
é feita com base na similaridade. Sendo assim, como determinar se
duas sequências apresentam similaridade suficiente que justifique
ser denominada de homologia? Similaridade é uma medida da
qualidade do alinhamento entre duas sequências. Para que a
similaridade seja considerada homologia, é necessário levar em
consideração alguns parâmetros fornecidos pela análise de
similaridade como o E-value (Expectation value), o comprimento da
sequência similar entre duas sequências, o padrão de conservação
de aminoácidos e o número de inserções e deleções. Homologia
significa dizer que duas (ou mais) sequências vêm de um ancestral
comum na história evolutiva (CLAVERINE; NOTREDAME, 2007).

10.1. Anotação em nível de nucleotídeo


Com as sequências de nucleotídeos (contigs e sequências
únicas – singlets) no formato FASTA, pode-se, então, compará-las
em busca de homologia. Essa comparação permite inferir sobre as
propriedades de uma determinada sequência, baseando-se em
propriedades conhecidas da outra. A esse processo de comparação
entre sequências dá-se o nome de alinhamento de sequências.
As sequências dos agrupamentos (clusters e singlets) são
comparadas com as sequências contidas no Genbank (nr),
utilizando-se o programa Blast nucleotídeo (ALTSCHUL et al., 1990)
para identificar a presença e o grau de homologia com as
sequências descritas para outras espécies (Figura 4).

Figura 4. Página do NCBI com o link para o pacote de programas do Basic Local Alignment
Search Tool (Blast).
Para o exemplo deste capítulo vamos utilizar a sequência EST
em formato FASTA a seguir:

Inicialmente, na página do Blast3, deve-se clicar no link para


nucleotide blast. Em seguida, deve-se selecionar a opção expressed
sequence tag no Database (Figura 5).

Figura 5. Detalhes da página de análise do Blast para sequência de nucleotídeo. A seta


indica o banco de dados de EST selecionado para a busca de sequências similares.
O resultado dessa análise (Figura 6) permite determinar se essa
nova sequência está correlacionada ao gene que tem a determinada
função.

Figura 6. Resultado do alinhamento das sequências do EST contra o banco de dados de


EST do NCBI.

O resultado (Figura 6) é apresentado em um gráfico colorido, no


qual a cor das barras corresponde ao score do valor do
alinhamento. Barras de coloração preta correspondem ao score
mais baixo de alinhamento, enquanto que barras de coloração
vermelha correspondem ao valor de score de alinhamento mais alto.
Ao passar a seta do mouse sobre cada uma das barras do grá‐
fico, são fornecidas, na janela acima do gráfico, algumas
informações a respeito da sequência indicada. Ao se clicar na
própria barra do gráfico, a página irá ser direcionada ao gráfico do
alinhamento. Vale a pena salientar que cada barra do gráfico
corresponde ao alinhamento por similaridade da sequência (Query)
que se deseja identificar com alguma sequência já descrita e
depositada no banco de EST do NCBI. No alinhamento entre a
sequência EST e as sequências do banco de dados são
apresentadas, além do alinhamento base à base entre a sequência
query e a sequência do banco de dados, as seguintes informações:
o número de identificação da sequência que apresentou homologia
(gb), seguida do cabeçalho que acompanha a sequência no banco
de dados, o Score = 291, o E-value, o número de bases (em
percentual) que apresentou identidade entre a sequência query e a
sequência do banco de dados de EST (Identities), o número de
bases (em percentual) que não apresentou identidade com a
sequência do banco de dados (Gaps).
Ao se clicar na barra do primeiro alinhamento apresentado no
gráfico será apresentado o resultado. Esse resultado indica que a
sequência query apresentou homologia com uma sequência de
cDNA de Glycine max cujo número de identificação é
dbj|BW679146.1. Este alinhamento apresenta um E-value de 0, com
uma identidade de 100% e nenhum Gap.
Na Figura 7, pode ser vista a lista de sequências referente ao
FASTA da EST utilizada como exemplo neste capítulo. Na coluna
referente ao E-value pode se observar que as 30 primeiras
sequências apresentaram E-value igual a 0. Outras informações im‐
portantes são apresentadas na página de resultado (Figura 7) como:
Max Score (probabilidade de número de alinhamentos esperados
para um score específico entre a sequência query e o banco de
dados); Total Score corresponde ao somatório dos scores de
alinhamento de todos os segmentos de uma dada sequência query.
O Total Score é utilizado para distinguir os hits feitos com os
multiexons funcionais de genes daqueles hits feitos com
retrotransposons ou pseudogenes; Query coverange corresponde
ao percentual de nucleotídeos da sequência query que foi incluída
no alinhamento com as sequências do banco de dados escolhido;
Max Ident corresponde ao maior valor de percentual de identidade
encontrado para um conjunto de alinhamentos feito a partir de uma
mesma sequência query. Essas são as definições disponibilizadas
pelo próprio NCBI4.

Figura 7. Página de resultado do Blast com a lista das sequências que apresentaram
homologia com a sequência EST do exemplo.
Com esse resultado, já é possível fazer a primeira anotação
referente ao EST utilizado como exemplo neste capítulo. A
sequência EST, identificada como RESRZ30PL2P23, apresentou
homologia com várias sequência de mRNA de leguminosas como
Glycine, Phaseolus, etc.

10.2. Anotação em nível de proteína

Esta etapa tem por finalidade tentar correlacionar a sequência de


aminoácidos obtida da tradução dos nucleotídeos da sequência
query com outras sequências disponibilizadas em banco de dados
específicos de proteínas (ex.: sequências primárias, estruturais, de
famílias gênicas ou de domínios funcionais). Caso a análise de
homologia dos nucleotídeos tenha fornecido alguma informação
sobre a função da sequência de EST, a análise da sequência de
aminoácidos servirá para validar ou não a possível função indicada
pelo Blast de nucleotídeos. Caso a análise com nucleotídeos não
tenha fornecido nenhuma indicação da função, o Blastx pode
fornecer algum resultado que indique uma possível função para o
possível produto da EST. Essa etapa tem como objetivo
correlacionar o genoma expresso com os respectivos processos
biológicos.
Em eucariotos, a busca de genes é complicada em virtude da
presença de introns e de sítios de splicing alternativo. Sendo assim,
a utilização de ESTs minimiza parte desses problemas, já que essas
sequências de RNAm que deram origem aos ESTs foram
processadas pela célula.
No exemplo descrito neste capítulo, a sequência de
nucleotídeos, em formato FASTA, deverá ser analisada no Blastx.
Essa ferramenta fará a tradução automática da sequência de
nucleotídeos para a sequência de aminoácidos, para, em seguida,
fazer o alinhamento com sequências de aminoácidos. Na página do
Blastx é possível fazer a opção pelo código genético que será
utilizado na tradução. Atualmente existem 13 opções
disponibilizadas pelo NCBI (ex.: mitocôndria de vertebrados,
mitocôndria de leveduras, bactéria, etc.). Para as análises descritas
neste capítulo foi utilizado o código padrão (Standard).
A sequência utilizada para análise foi a seguinte:

O resultado da análise pelo Blastx utilizando-se o banco não


redundante de sequência de proteínas indicou que a sequência em
análise apresentou homologia com sequência de algumas proteínas
de leguminosas correlacionadas com a tolerância à salinidade. O
gráfico obtido com essa análise (Figura 8) é similar ao fornecido
pela análise de nucleotídeos. Da mesma forma, ao passar a seta do
mouse sobre as barras do gráfico, são fornecidas as informações a
respeito da sequência indicada, e, ao se clicar na própria barra do
gráfico, a página irá ser direcionada ao gráfico do alinhamento.
Nesse caso, também é fornecida uma lista das sequências que
apresentaram uma melhor homologia com a sequência query de
aminoácidos (Figura 9). Nesse caso foi possível detectar homologia
com sequências de diferentes gêneros vegetais (ex.: Glycine,
Populus, Cucumis, Vitis, Solanun).
Figura 8. Resultado da análise pelo Blastx evidenciando diferentes níveis de scores para a
sequência EST traduzida para aminoácido.

As sequências listadas pelo Blastx apresentam um número


menor de informações que as disponibilizadas na página do
resultado. A título de recordar, a página de resultado da análise de
nucleotídeos do EST fornece informações do E-value, do Max
Score, do Total Score, do Query coverange e do Max Ident. No
entanto, a lista de sequências similares feitas pela sequência de
aminoácidos fornece apenas o E-value e o score (Figura 9).
Figura 9. Lista de sequências obtidas pelo Blastx. Resultado indica provável similaridade
com proteínas envolvidas na resposta de tolerância à salinidade.

Maiores informações podem ser observadas nos alinhamentos


entre a sequência EST query e as sequências do banco de dados
que apresentaram homologia. Abaixo, estão apresentadas duas
sequências que apresentaram homologia com a EST query. Nesses
exemplos pode-se ver que foram fornecidos, para cada alinhamento,
o gb, o Score, o E-value, o percentual de identidade, o número de
aminoácidos idênticos em ambas as sequências (positives) e o
número de Gaps.
Com base nesses resultados, a anotação para a sequência de
EST utilizada neste capítulo poderia ser a seguinte:
Estes são alguns passos que permitem fazer a anotação dos
genes envolvidos com uma característica agronômica específica
(ex.: tolerância à salinidade). No entanto, outros programas de
bioinformática podem ser utilizados para aumentar o número de
informações referente a cada uma das sequências de EST. Podem
ser utilizados programas que fazem a predição da localização
subcelular (ex.: WolfPSort – http://wolfpsort.org/), a identificação de
resíduos proteicos funcionais e estruturais (ex.: ConSeq5).
Algumas vezes, mesmo fazendo todas essas análises, não é fácil
encontrar alguma informação que permita associar a sequência EST
em estudo com algum gene já descrito ou com alguma proteína.
Dessa forma, essas sequências são tratadas, em alguns casos,
como Unknown (desconhecida). Esse resultado é cada vez menos
comum, já que os bancos de dados estão sendo ampliados com os
estudos dos projetos de genoma, e os genes desconhecidos
(Unknown) sendo identificados com pesquisa em bancada (ex.: Shut
down – inativação do gene permite identificar a que rota metabólica
este pertence). De fato, em bancos de dados, como o Swiss Prot,
são encontrados os termos: Hypotetical protein, Putative protein,
Predicted protein e Protein with unknown function. No entanto,
apesar de não haver uma definição clara desses termos, Liberman
(2004) assume que Hypotetical protein corresponde a uma
sequência de aminoácidos que não se tem certeza que origina uma
proteína; Putative e Predicted protein correspondem a proteínas
cuja função necessitam de comprovação experimental, e Protein
with unknown function corresponderia a uma sequência de
aminoácidos que comprovadamente se constitui em uma proteína,
no entanto sua função é desconhecida.
Para poder depositar as sequências em um banco de dados (ex.:
NCBI), é necessário publicar ao menos um artigo referente às
sequências encontradas na pesquisa; este é um pré-requisito para
depósito em bancos de dados de acesso público. Sendo assim, o
máximo de cuidado deve ser tomado ao se realizar a anotação de
sequências. Alguns grupos chegam a fazer uma seleção rígida dos
anotadores, dando prioridade àqueles que já têm experiência prévia
ou realizando treinamento prévio dos anotadores. Em alguns
grupos, é feita a determinação de que parâmetros devem ser
observados. Todo esse cuidado visa minimizar ao máximo os erros
nessa etapa do trabalho. A etapa de anotação pode ser
automatizada. No entanto, existem relatos de problemas quanto à
padronização da ontologia adotada e das regras de análise dos
dados (LIBERMAN, 2004).

11. Referências

ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHÄFFER, A. A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.; MILLER,
W.; LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database
search programs. Nucleic Acids Research, London, UK, v. 25, p. 3389-3402, 1990.
CAP3. Sequence Assembly Program. Disponível em: <http://www.cottonmarker.org/cgi-
bin/cmd_cap3>. Acesso em: 2 fev. 2009.
CHAUHAN, R. S. Bionformatis approach toward identification of candidate genes for zinc
and iron transposts in maize. Current science, Bangalore, v. 91, p. 510-515, 2006.

CLAVERINE, J. M; NOTREDAME, C. Bioinformatics for Dummies. 2nd ed. Indianápolis:


Wiley Publishing, 2007. 438 p.
EWING, B.; HILLIER, L.; WENDL, M. C.; GREEN, P. Base-calling of automated sequencer
traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research, Ottawa, CA, v. 8, p. 175-
185, 1998.
GRAHAM, M. A.; RAMIREZ, M.; VALDES-LOPEZ, O.; LARA, M.; TESFAYE, M.; VANCE, C.
P.; HERNANDEZ, G. Identification of candidate phosphorus stress induced genes in
Phaseolus vulgaris L. through clustering analysis across several plant species. Functional
Plant Biology, Australia, v. 33, p. 789-797, 2006.
HUANG, X.; MADAN, A. CAP3: A DNA Sequence Assembly Program. Genome Reseaerch,
Ottawa, CA, v. 9, p. 868-877, 1999.
KIM, S. K. C. Elegans: mining the functional genomic landscape. Nature Review, London,
UK, v. 2, p. 681-689, 2001.
KOONIN, E. V. Orthologs, paralogs and evolutionary genomics. Annual Review of Genetics,
Palo alto, v. 39, p. 309-338, 2005.
LIBERMAN, F. Análise dos fatores determinantes para a qualidade da anotação genômica
automática. 2004. 136 f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Católica de Brasília,
Brasília, DF, 2004.
NAGARAJ, S. H.; GASSER, R. B.; RANGANATHAN, S. A Hitchhiker’s guide to expressed
sequence tag (EST) analysis. Briefings in Bioinformatics, London, UK, p. 1-16, 2006.
NCBI. National Center for Biotechnology Information. Disponível em:
<http//:www.ncbi.nlm.nih.gov>. Acesso em: 30 jan. 2009.
ORFFinder. Open Reading Frame Finder. Disponível em:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html> Acesso em: 5 fev. 2009.
PERSSON, B. Bioinformatics in protein analysis. EXS, Basel, v. 88, p. 215-231, 2000.
ROMBEL, I. T.; SYKES, K. S; RAYNER, S.; JOHNSTON, S. A. Orf-Finder: a vector for high-
throughput gene identification. Gene, Amsterdam, NL, v. 282, n. 1-2, 9, p. 33-41, 2002.
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual.
2nd ed. Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1659 p.
SOUZA, S. J.; CAMARGO, A. A.; BRIONES, M. R.; COSTA, F. F.; NAGAI, M. A.;
VERJOVSKI-ALMEIDA, S. Identification of human chromosome 22 transcribed seqüences
with ORF expressed sequence tags. Proceedings of the National Academy Science,
Washington, DC, v .97, p. 12690-12693, 2000.
TELLES, G. P.; SILVA. F. R. da. Trimming and clustering sugarcane ESTs. Genetics and
Molecular Biology, Ribeirão Preto, v. 24, n. 1-4, p. l17, 2001.
Capítulo 5
Bioinformática como instrumento
de apoio aos programas de
melhoramento genético
Paula Regina Kuser-Falcão
Michel Eduardo Beleza Yamagishi
Natália Florêncio Martins

1. Introdução

Nos últimos anos, com os avanços na biologia molecular e o


desenvolvimento das pesquisas genômicas em larga escala, houve
um crescimento explosivo na informação biológica gerada pela
comunidade científica. Essa avalanche de informação genética, por
sua vez, gerou a necessidade de bancos de dados e ferramentas
especializadas, conduzindo ao desenvolvimento da Bioinformática.
A Bioinformática é uma ciência relativamente nova cujo escopo de
atuação vem se modificando continuamente (KOCH; FUELLEN,
2008). No início, na década de 1990, o volume de dados genômicos
produzidos pelos projetos de sequenciamento exigiu uma concen‐
tração no desenvolvimento de bancos de dados e algoritmos de
alinhamento a fim de armazenar e buscar similaridades entre as
sequências de nucleotídeos e aminoácidos. O resultado dessas
atividades precursoras foi tão positivo que estabeleceu uma
associação não intencional entre Bioinformática e organização,
armazenamento e comparação entre sequências, deixando em
segundo plano a análise dos dados, que é um aspecto igualmente
importante. Uma vez consolidada a fase inicial e impulsionada pelos
avanços tecnológicos, cada vez mais a ênfase da Bioinformática se
voltou para a análise e interpretação de diversos tipos de dados
biológicos. Ou seja, não apenas sequências de nucleotídeos ou
aminoácidos são objetos de estudo, mas também imagens digitais,
grafos, tabelas, etc. Se no início a Bioinformática era quase
sinônimo de desenvolvimento e organização de banco de dados,
hoje, ela usa ferramentas de áreas tão distintas quanto a Mineração
de Dados, o Processamento de Imagens, a Estatística e a
Matemática entre outras ciências para extrair informações dos
dados disponíveis. Essa multidisciplinaridade, mais do que uma
escolha, foi uma exigência dos avanços da Tecnologia e das novas
ferramentas biotecnológicas que põem à disposição do
melhoramento genético metodologias inovadoras capazes, por
exemplo, de, pelo cruzamento entre os dados de marcadores
moleculares e de fenótipos, identificar regiões cromossômicas que
contêm genes ligados a fenótipos de interesse, ou inferir a
quantidade de genes expressos em um determinado tecido
analisando imagens digitais.
Portanto, a delimitação do escopo da Bioinformática se modifica
à medida que problemas que envolvam dados biológicos de diferen‐
tes naturezas demandem análises científicas. Assim, quando o
problema é análise de sequências, a Bioinformática trabalha com
banco de dados e algoritmos de alinhamento (Smith-Waterman,
BLAST, BLAT); quando o problema é estudar o transcriptoma
utilizando microarranjos, usa ferramentas do processamento de
imagens, mineração de dados, estatística, etc; quando o problema é
predição de genes a partir de sequências, usa algoritmos
matemático-estatísticos, modelos ocultos de Markov (HMM); quando
o problema é predição de estruturas tridimensionais de proteínas,
usa dinâmica molecular, física, matemática, etc. A Bioinformática
vem se afirmando como a mais multidisciplinar das ciências
multidisciplinares.
Atualmente, o melhoramento genético tem demandado buscas
inteligentes em bancos de dados de diferentes naturezas a fim de
compreender questões biológicas complexas que dizem respeito à
interação genes-fenótipos. Dessa forma, a integração de
plataformas ômicas vem se insinuando como um desafio concreto
para a Bioinformática. Ou seja, integrar dados gerados em
diferentes problemas a fim de cruzar informações que por sua
natureza diferem consideravelmente, desde sequências de DNA até
a estrutura da proteína. Para enfrentar esse desafio, a
Bioinformática vem utilizando sofisticadas ferramentas da Ciência da
Informação, como ontologias. Uma das grandes contribuições que a
Bioinformática pode dar é possibilitar ir além das relações entre as
informações dos bancos de dados e auxiliar mais claramente na
interpretação das complexas redes biológicas de genes e suas
relações com os fenótipos. A exploração de informações a partir de
espécies-modelo aliada à conservação gênica entre espécies está
possibilitando a mineração da informação genética armazenada,
tornando a mineração de dados uma das áreas de atuação da
Bioinformática que mais pode contribuir nos programas de
melhoramento genético.
A busca por sequências similares e ferramentas de junção são a
base de muitas aplicações para a análise de informação genômica.
A habilidade de identificação rápida de similaridades com
sequências previamente caracterizadas melhora muito o processo
de anotação de sequências e conduziu ao desenvolvimento de
banco de dados altamente especializados. A disponibilidade de
bancos de dados mais completos permite a mineração de
características biológicas – por exemplo, polimorfismos de base
única (SNP) (SOMERS et al., 2003) e marcadores moleculares com
sequências simples repetidas (SSR) (ROBINSON et al., 2004), que
são aplicados no melhoramento genético.

2. Bioinformática, Biotecnologia e
melhoramento genético
A redescoberta da Lei de Mendel, a identificação dos caracteres
genéticos em cromossomos e a descoberta da molécula de DNA
trouxeram grandes mudanças para a ciência e abriram perspectivas
inéditas como o desenvolvimento do DNA recombinante, a criação
das tecnologias de marcadores, mapeamento genético e sequencia‐
mento genômico entre muitas outras técnicas incluídas no campo da
Biotecnologia. Com o uso de conhecimento da genética,
citogenética e bioquímica que visem à melhoria de plantas, animais
ou microrganismos, a Biotecnologia se desenvolveu e gerou
ferramentas extremamente úteis ao melhoramento genético. A partir
daí tornou-se possível incorporar as bases da hereditariedade no
melhoramento de forma a orientar e acelerar fixação das
características desejadas.
O melhoramento genético, quando usa ferramentas avançadas
de Biotecnologia, normalmente também necessita do auxílio da
Bioinformática, não só para organizar os dados, mas principalmente
para analisá-los. A cada dia surgem inovações tecnológicas com
aplicações diretas em melhoramento genético que exigem o
desenvolvimento de novas ferramentas de Bioinformática, deixando
obsoletas as anteriores. Por esse motivo, o foco desta discussão
serão os problemas e não as ferramentas utilizadas, embora
algumas sejam mencionadas no decorrer do texto. Apenas para
efeito de ilustração, não faz muito tempo, ferramentas de
Bioinformática eram usadas para identificar microssatélites ou SNPs
em bases de dados de ESTs ou cDNAs. A partir de 2005, com o
advento das novas tecnologias de sequenciamento (SHENDURE;
JI, 2008) que produzem milhões de pares de bases (pb) em uma
única corrida a um custo médio de US$ 2,00 (dois dólares) por
megabase, a Bioinformática precisou desenvolver novos algoritmos
que pudessem lidar com tal volume de dados e com as
características próprias das sequências geradas por esses novos
equipamentos que geralmente têm comprimento menor que aquelas
produzidas pelos sequenciadores automáticos por capilares. O
problema não mudou em sua essência, ou seja, identificar
marcadores moleculares, mas o avanço tecnológico impôs novos
desafios.
Uma das premissas do melhoramento genético é que caracte‐
rísticas fenotípicas estão associadas a genes específicos, sem
esquecer, é claro, a interação com o meio ambiente. As técnicas de
melhoramento genético consolidadas usam a Genética Clássica em
seus programas de melhoramento sem estabelecer a relação entre
fenótipos e genes (o termo está no plural, pois mais de um gene
pode estar envolvido). Entretanto, saber qual gene(s) está
relacionado com um determinado fenótipo pode ser científica e
economicamente importante, pois além de possibilitar testes
diagnósticos, pode ainda abrir caminhos para o desenvolvimento de
organismos geneticamente modificados (OGM). Que a associação
de fenótipos e genes é possível, já está mais do que provado. Há,
entretanto, duas formas de estabelecer essa associação. A primeira
é a associação um-para-um, e a segunda, a de um-para-muitos. A
musculatura dupla, por exemplo, é um fenótipo que está associado
ao gene GDF8 (um único SNP). Esse é um exemplo clássico e bem
documentado na literatura de um gene associado a um fenótipo.
Entretanto, nem sempre, é possível estabelecer essa relação
unívoca (um-para-um). Em muitos casos, o máximo de informação
possível é estabelecer a associação entre um fenótipo e uma região
cromossômica, denominada Quantitative Trait Loci (QTL). Um
exemplo em bovino é o trabalho realizado por Gasparin et al. (2007)
que identificou QTLs em três cromossomos de Bos indicus
relacionados à resistência a carrapatos.
Assim, o melhoramento genético, que nos primórdios passou
pela simples domesticação, agora, com o auxílio da Biotecnologia e
consequentemente da Bioinformática, pode avançar ainda mais.
Pois, não utiliza apenas informações, grosso modo, visíveis a olho
nu, mas lança mão de recursos que possibilitam ir à informação
contida no próprio genoma dos animais e plantas.
Embora a divisão animal e vegetal pareça um tanto artificial no
contexto do melhoramento genético, optou-se por fazer a divisão
para enfatizar algumas idiossincrasias de cada caso

2.1. Melhoramento genético animal

O melhoramento genético animal começou com a domesticação


de animais há mais de 11.000 anos (ZEDER, 2008). Embora não
haja uma definição irrestritamente aceita, podemos definir
domesticação como o processo pelo qual animais cativos se
adaptam ao homem e ao ambiente fornecido pelo homem (PRICE,
1984). A adaptação é obtida pelas mudanças genéticas em
sucessivas gerações (MIGNON-GRASTEAU et al., 2005).
Obviamente, de uma geração para outra, animais com uma
determinada característica são seletivamente cruzados a fim de
transmitir aos descendentes a característica desejada. Essa é a
base do melhoramento genético: seleção e cruzamento (EUCLIDES
FILHO, 2000).
Se o fenótipo é de fácil observação ou mensuração, as técnicas
consolidadas do melhoramento genético fornecem excelentes resul‐
tados. Tais técnicas possibilitam estimar a capacidade genética de
transmissão de cada animal. Essa capacidade de transmissão,
chamada de Diferença Esperada na Progênie (DEP), e modelos
matemático-estatísticos, como o BLUP (HENDERSON, 1975),
auxiliam o processo de seleção. Para mais detalhes sobre seleção e
cruzamento no melhoramento genético animal consultar Euclides
Filho (2000).
Embora os resultados dessas técnicas sejam extremamente
significativos, seja no aumento da produtividade, seja na melhoria
da qualidade dos produtos de origem animal, como em todas as téc‐
nicas, há algumas limitações associadas à sua utilização. Talvez, a
mais importante esteja relacionada aos fenótipos de difícil mensu‐
ração ou de baixa herdabilidade. Para contornar essas dificuldades,
o melhoramento genético vem utilizando ferramentas avançadas da
Biotecnologia, como marcadores moleculares (microssatélites,
SNPs) e chips de expressão gênica e genotipagem (microarranjos)
para identificar quais genes estão de fato associados à determinada
característica fenotípica. Essa parceria entre melhoramento genético
e Biotecnologia trouxe novas perspectivas para o melhoramento
genético animal, pois a identificação dos genes fornece mais
informações sobre os processos biológicos envolvidos no fenótipo,
possibilitando, no futuro, até mesmo a manipulação genética dos
indivíduos. No item sobre aplicações, será discutida a seleção
assistida que, além de possibilitar testes precoces, ainda viabiliza a
redução do tempo entre gerações que no caso animal é um desafio.

2.2. Melhoramento genético vegetal

Tendo iniciado pelo menos 1.000 anos antes do melhoramento


genético animal, o melhoramento de plantas também começou com
a domesticação de algumas espécies. Contudo, nos últimos 30 anos
passou por transformações importantes, culminando com o desen‐
volvimento de organismos geneticamente modificados (OGM)
comercialmente disponíveis, um avanço ainda não observado em
animais. O melhoramento vegetal possui algumas características,
como a plasticidades dos vegetais ou o tempo reduzido entre
gerações que facilitam o processo de melhoramento. Por outro lado,
provoca discussões éticas acirradas.
Os programas de melhoramento iniciaram-se nas universidades
públicas em grandes programas, mas foi no setor privado que a
produção de cultivares melhoradas se desenvolveu e se consolidou.
Essas mudanças foram impulsionadas pela tecnologia e pelo
aumento da informação disponível, tornando mais acessível a
avaliação de germoplasmas e a identificação de genótipos que
exibissem adaptações necessárias para a sociedade e/ou para o
mercado. O desenvolvimento das ciências da informação e da
Biotecnologia trouxe ao cotidiano do melhorista um conjunto novo
de ferramentas e opções para vários aspectos do melhoramento. Os
processos biológicos que formam os mecanismos de resistência a
patógenos e melhoram a qualidade das plantas estão agora
expostos para uma análise funcional sistemática. Essas análises
são feitas com softwares específicos em cima da grande quantidade
de dados gerada e armazenada em bancos de dados, e essa é uma
das atividades da Bioinformática no melhoramento vegetal.
A Bioinformática aplicada ao melhoramento vegetal busca
identificar variantes genéticas associadas aos fenótipos e melhorar
as variedades por meio de melhoramento assistido ou modificação
genética. Para tal, utiliza as informações de genomas de plantas-
modelo sequenciados, sequências de genes de interesse,
informação sobre expressão gênica, coleções de germoplasma e
mapas genéticos. Do ponto de vista da economia, as mais
importantes espécies de plantas que estão tendo seus genomas
estudados são: milho, arroz, trigo, sorgo, soja e alfafa.
Como alguns desses genomas são muito grandes, estudos estão
se baseando em métodos de genômica comparativa que será
discutida com maiores detalhes no item sobre aplicações. Graças à
similaridade em nível genômico entre arroz e outras espécies de
culturas importantes, a obtenção do genoma do arroz (GOFF et al.,
2002; MATSUMOTO et al., 2005; YU et al., 2001) teve um impacto
significativo na biotecnologia de plantas e no melhoramento vegetal.

3. Aplicações

A seguir serão apresentadas duas aplicações da Bioinformática


no melhoramento genético. Uma aplicação mais direta e outra
indireta, mas igualmente importante. A aplicação direta é o MAS e a
seleção genômica. A seleção é uma parte importante de qualquer
programa de melhoramento genético, e por isso apresentaremos
uma aplicação direta da Bioinformática nessa etapa. A aplicação
indireta é a genômica comparativa. É indireta porque não está
diretamente ligada à seleção ou ao cruzamento, mas pode
indiretamente auxiliar nessas etapas, pois identifica genes de
interesse por meio da comparação entre genomas de espécies
filogeneticamente próximas.

3.1. MAS e seleção genômica

Como foi mencionado anteriormente, o melhoramento genético


pode ser dividido para efeitos didáticos em duas etapas: seleção e
cruzamento. Há alguns casos em que os métodos convencionais de
seleção não podem ser aplicados, ou quando o são não produzem
resultados satisfatórios. No caso de melhoramento animal, alguns
fenótipos só podem ser aferidos numa fase tardia do desenvolvi‐
mento animal ou até mesmo após abatimento, ou seja, não estando
disponíveis no momento da etapa de seleção. Há também fenótipos
de baixa herdabilidade ou que requerem testes dispendiosos ou que
envolvam riscos, como resistência a doenças ou pragas. Para lidar
com esses casos, desde a década de 1980 existe a seleção
assistida por marcadores moleculares (FERNANDO; GROSSMAN,
1989), ou, em inglês, Marked-Assisted Selection (MAS). O objetivo
do MAS é realizar a seleção considerando aqueles animais cujos
polimorfismos estejam positivamente correlacionados com o
fenótipo desejado. Usando essa estratégia, a seleção pode ser feita
num estágio bastante inicial de desenvolvimento, até mesmo na
fase intrauterina, bastando para tal a coleta de amostra de tecido
para posterior genotipagem. Uma outra vantagem da seleção
assistida por marcadores moleculares na pecuária é a redução do
intervalo entre gerações (GEORGES; MASSEY, 1991; HALEY;
VISCHER, 1998). Essa redução é especialmente importante no
melhoramento genético animal, em que normalmente o intervalo
entre gerações é medido em meses.
Um ponto fraco do MAS é que apenas uma pequena porção da
variação genética total é explicada pelos marcadores. Isso é conse‐
quência dos testes estatísticos serem bastante restritivos na identifi‐
cação de QTLs com o intuito de reduzir o número de falso-positivos.
Uma forma de contornar esse problema é simplesmente estimar os
efeitos de todos os genes (ou segmentos de cromossomos) simulta‐
neamente. A premissa é que genes com pequenos efeitos terão
estimativas pequenas; enquanto genes com grandes efeitos terão
estimativas grandes. Isso pode ser feito espalhando-se um número
considerável de marcadores moleculares em todos os
cromossomos, dividindo-se dessa forma o genoma em muitos
segmentos de cromossomo. Cada segmento cromossômico é
flanqueado por dois marcadores não muito distantes entre si. Essa
técnica, chamada de seleção genômica, foi originalmente proposta
por Meuwissen et al. (2001) e exige um grande número de
marcadores moleculares assim como uma tecnologia de custo
acessível para genotipagem.
Com o sequenciamento de vários organismos de interesse
pecuário, um grande número de Single Nucleotide Polymorphism
(SNPs) foi descoberto com o auxílio da Bioinformática. E pela sua
distribuição física nos genomas, esses marcadores são particular‐
mente indicados para utilização na seleção genômica. Além disso,
microarranjos de SNP podem ser usados para genotipagem já que o
custo tem caído bastante. Com o suporte de algoritmos de Bioinfor‐
mática especialmente desenvolvidos para analisar um volume de
dados dessa ordem de grandeza, a identificação de QTLs pode ser
realizada com sucesso. Assim, as condições básicas para a seleção
genômica são satisfatórias para alguns organismos de interesse
econômico.
Um animal modelo de interesse econômico que já possui uma
versão do genoma é o Bos taurus. Além disso, há microarranjos
com mais de 50.000 SNPs disponíveis no mercado, o que torna
possível a seleção genômica para esse animal. No Brasil, onde a
carne bovina é um dos principais produtos de exportação, o
melhoramento genético tem contribuído bastante para o sucesso
desse mercado. A Embrapa possui projetos estratégicos para a
melhoria da carne bovina (bife de qualidade), resistência a
carrapatos, mastite, reprodução (genômica animal) que utilizam
técnicas avançadas de Biotecnologia e, consequentemente, de
Bioinformática.
O desafio é particularmente grande porque a subespécie predo‐
minante em nosso território é o Bos indicus. Embora as duas subes‐
pécies sejam filogeneticamente bastante próximas, há diferenças
genômicas que dificultam a utilização direta dos recursos
disponíveis para o Bos taurus. Por exemplo, os chips de SNPs não
são 100% compatíveis, sendo necessário descobrir SNPs
exclusivos do Bos indicus. Como a principal fonte de descobertas de
SNPs eram os projetos genomas; há 5 anos, a descoberta de SNPs
em Bos indicus era considerada demasiadamente cara. Entretanto,
a partir de 2005, surgiram as novas tecnologias de sequenciamento
(SHENDURE; JI, 2008) que baratearam consideravelmente o custo
de sequenciamento por base. Vale ressaltar que a montagem de
novo de genomas não é a única aplicação dessas novas
tecnologias. A descoberta de SNPs, estudos de expressão entre
outros são igualmente aplicações importantes e viáveis.
Para mencionar um exemplo recente, a descoberta e validação
de SNPs (TASSEL et al., 2008) em Bos taurus foram feitas uti‐
lizando as novas tecnologias de sequenciamento (plataforma
Illumina). Usando ferramentas de Bioinformática especialmente
desenvolvidas para lidar com milhões de sequências de
comprimento reduzido (25 pb), pesquisadores identificaram e
validaram 62.042 candidatos a SNPs. Esses candidatos foram
mapeados de volta no genoma bovino para recuperar as regiões
flanqueadoras com a finalidade de construir um microarranjo com os
novos SNPs. Essa metodologia pode ser aplicada, por exemplo,
para a descoberta e validação de SNPs em Bos indicus e construir
um microarranjo específico para a subespécie comercialmente mais
importante no País, o que viabilizaria a seleção genômica ou
seleção assistida em nossos rebanhos.

3.2. Genômica comparativa

A genômica comparativa pode ser definida como o estudo de


similaridades de genomas e genes entre duas ou mais espécies que
podem ou não compartilhar linhagens taxonômicas. A genômica
comparativa estuda as relações entre genes, segmentos de
cromossomos e sequências proteicas por meio de estudos de
sintenia. As sequências de DNA e proteínas são comparadas por
algoritmos de alinhamento para identificar genes parálogos,
ortólogos e duplicações gênicas. As comparações de sequências
podem ser a base para o alinhamento de grandes segmentos
gênicos que podem ser super-contigs ou mesmo cromossomos
(macrossintenia e colinearidade) entre diferentes espécies.
Para realizar a comparação entre genomas, é necessário per‐
correr algumas etapas preparatórias. Sem a pretensão de um deta‐
lhamento exaustivo, serão mencionadas algumas etapas
importantes. A primeira consiste no sequenciamento completo e
montagem do genoma de uma espécie. Posteriormente, a etapa de
análise é iniciada visando à determinação de sentido biológico às
sequências de DNA. O resultado dessas análises é a atribuição de
função a uma sequência gênica, ou anotação. Essa etapa inclui o
estudo de íntrons, exons e regiões promotoras em genomas
completos, e para transcriptomas consiste em atribuir a categoria ou
a função da proteína codificada pela sequência obtida de bibliotecas
de cDNA, exceto para as novas tecnologias de sequenciamento.
Em anotação, a prática comum é atribuir a função a um gene
baseando-se na similaridade de sequência com um gene cuja
função seja conhecida. Os sistemas de anotação mais conhecidos
são Apollo (LEWIS et al., 2002), Artemis (CARVER et al., 2008),
Pendant (FRISHMAN et al., 2001). Desde 2001, o Laboratório de
Bioinformática da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
pesquisa algoritmos de análise de sequências genômicas e
desenvolve um sistema de gerenciamento, armazenamento e
análise de sequências chamado SisGen. O SisGen integra
programas de análise e visualização de sequências nucleotídicas e
cromatogramas originais produzidos em equipamentos de
sequenciamento automático (Megabace, ABI 3700, ABI 3100). A
anotação é realizada com a curadoria do usuário a partir de
alinhamentos com bancos de dados de interesse do projeto. O
SisGen foi montado sob a arquitetura Common Object Request
Broker Architecture (Corba) que define uma plataforma de
orientação de objetos com uma linguagem para descrição de
interfaces com mapeamentos padronizados em diversas linguagens
para um conjunto de serviços básicos (PAPPAS JÚNIOR et al.,
2008).
O interesse em análise comparativa é uma consequência da
descoberta de que muitos genomas de organismos-modelo são
compostos de blocos genômicos similares e regiões de alta taxa de
conservação. A disponibilidade de sequências completas de
genomas, assim como o grande volume de dados de sequências,
está redesenhando a maneira como esses dados podem ser
organizados e investigados. Se uma sequência não está disponível
para uma cultura específica, genomas de outras culturas que
tenham relação taxonômica podem ser usados. Essa observação
fez com que esforços fossem concentrados no estudo de genomas
de espécies-modelo.
Em plantas, os principais genomas-modelo são o de arroz e o de
Arabidopsis, que representam respectivamente uma espécie de
monocotiledônea e uma dicotiledônea. A comparação direta entre os
dois genomas provê as bases para a análise comparativa de
diferentes espécies independente de suas distâncias filogenéticas.
Diversas famílias gênicas foram identificadas nos dois genomas,
indicando a conservação de processos biológicos básicos
associados à manutenção da célula vegetal. Por outro lado, as
diferenças observadas residem no número de cópias de famílias
gênicas, como os receptores quinases que possuem 600 cópias em
Arabidopsis e cerca de 1.100 cópias em arroz (SHIU et al., 2004).
Por meio da genômica comparativa em plantas, um grande
número de estudos tem sido capaz de associar SNPs com caracte‐
rísticas fenotípicas de interesse agronômico. Um exemplo bastante
claro de como um único nucleotídeo altera um fenótipo é o SNP
detectado no gene da betaína aldeído desidrogenase. Esse gene é
responsável pela fragrância característica do arroz (BRADBURY et
al., 2005). Ainda em arroz, o gene amido sintase é associado à
temperatura de gelatinização do grão de arroz, uma característica
importante na comercialização dessa cultivar (BRADBURY et al.,
2005). Uma outra vantagem dos marcadores SNPs é que eles
permitem uma fácil identificação inequívoca dos alelos ou
haplótipos. Por outro lado, em plantas poliplóides, as análises tanto
de genômica comparativa quanto de detecção de marcadores se
tornam muito mais complexas. Brassica napus L. e Triticum
aestivum L. são exemplos típicos de alotetraploide e alohexaploide
respectivamente, cujas análises comparativas podem resultar em
inferências incertas de duplicação gênica ou expansão genômica.
A genômica comparativa possibilita o estudo de regiões funcio‐
nais do genoma, tais como os sítios regulatórios de associação de
motivos de DNA importantes para os fatores de transcrição. Duas
ferramentas de Bioinformática comumente utilizadas para esses
estudos são Vista1 (FRAZER et al., 2004) e Pipmaker2 (SCHWARTZ
et al., 2000). Utilizando interfaces web de tais aplicações, grandes
trechos de sequências de DNA podem ser usados para a busca de
regiões conservadas em outras espécies. O programa Vista contém
as comparações pré-calculadas entre diferentes genomas-modelo.
Esses aplicativos podem ser usados em ambos os sentidos (sense
e antisense) para a identificação de genes, e sequências
reguladoras para a compreensão dos mecanismos e para a história
da evolução de um genoma. Outros algoritmos de alinhamento
foram desenvolvidos, além dos citados acima. Para aprofundamento
sobre comparações de sequências de plantas, o tutorial de Lyons e
Freeling (2008) pode ser consultado.
Existem ainda bases de dados de genomas com ferramentas
integradas de genômica comparativa – como o Plant Genome
DataBase3 (PGDB) que é um banco de dados público de espécies
de plantas para comparação de sequências do tipo EST e GSS,
além de permitir a navegação e visualização da anotação em
diferentes genomas.
A seguir exemplificamos alguns casos bem sucedidos em que a
genômica comparativa demonstrou um papel fundamental nas
descobertas. Primeiramente o caso da busca de sintenia entre
banana (Musa) e arroz, em que Lescot et al. (2008) demonstraram
por meio de comparações de regiões genômicas de arroz, M.
acuminata e M. balbisiana, a alta conservação entre a estrutura dos
genomas e indicaram que esses genomas divergiram cerca de 4,6
milhões de anos. Esses resultados apontam para a utilidade de
análises comparativas entre espécies de monocotiledôneas
remotamente relacionadas como o arroz e Musa.
Outro exemplo de sucesso vem do estudo da tolerância a
alumínio em sorgo e arroz (CANIATO et al., 2006; MAGALHÃES et
al., 2007). Nesse trabalho os autores identificaram por estudos
experimentais e por genômica comparativa os haplótipos de AltSB,
que podem ser incorporados por melhoramento genético molecular
e pela Biotecnologia em programas de melhoramento para a
tolerância a alumínio em solos ácidos. A estratégia envolveu a
comparação microssintênica entre sorgo e arroz seguida da
conversão de dados de sequência em marcadores STS associada à
montagem e anotação de sequências de BAC. A partir daí foi
identificado e clonado o gene de tolerância ao alumínio tóxico em
sorgo, sendo que o alelo de tolerância está sendo transferido para
linhagens e híbridos comerciais de sorgo por meio de seleção
assistida por marcadores. Além disso, a estratégia de transgenia
está sendo utilizada por meio de um promotor constitutivo para a
superexpressão do gene em milho. Novos alelos superiores de
tolerância também estão sendo investigados, para a piramidação de
genes visando ao aumento da tolerância ao alumínio em sorgo.

4. Novas perspectivas

Ao longo dos últimos três anos, surgiram novas abordagens


tecnológicas para sequenciamento de DNA que diferem do método
de Sanger pela química do processo e por se remeterem à parale‐
lização do número de amostras processadas simultaneamente.
Enquanto os sequenciadores automáticos por capilares, que utilizam
o método de Sanger, geram até 96 sequências por corrida, este
número sobe para centenas de milhares ou milhões com as novas
tecnologias, batizadas de tecnologias de sequenciamento de
próxima geração (SPG) ou sistemas de sequenciamento paralelo de
ultradesempenho (MARDIS, 2008).
As expectativas são tão favoráveis em relação às novas tecno‐
logias que permitem a idealização de experimentos que seriam
inatingíveis sem essas.
Um alvo ativamente perseguido é a possibilidade de se obter a
sequência de um genoma humano por US$ 1.000 (MARDIS, 2006),
lembrando que o custo do genoma humano foi de US$ 2,3 bilhões
ao longo de 13 anos (WADMAN, 2008). Com a brutal queda de
custos de sequenciamento e disponibilidade de sequências de
referência, foi recentemente lançado um projeto para o
sequenciamento de 1.000 genomas humanos4. Assim, abre-se o
caminho para o alcance da esperada genômica personalizada,
quando não serão mais analisadas apenas pequenas regiões do
genoma, mas o genoma completo de uma planta, animal ou
qualquer objeto de estudo na busca de uma resposta para
diagnóstico de doenças, determinação precoce de características
fenotípicas de interesse, entre outras.
A perspectiva de aplicação da genômica individual, ou medicina
personalizada, fascina a Biotecnologia no momento. Principalmente
pela facilidade de se realizar esta façanha com as novas tecnologias
de sequenciamento. O maior desafio é realizar um genoma de um
indivíduo ao preço de mil dólares. As empresas, ainda poucas, que
oferecem esse serviço prometem aos clientes a identificação de
possíveis predisposições a doenças genéticas já conhecidas pelo
genoma humano, traduzindo-se em porcentagens de surgimento de
uma doença como Alzheimer, Diabetes ou doenças genéticas mais
raras. As opções de mercado mais baratas são as identificações de
polimorfismo de nucleotídeo único. Nos Estados Unidos já é
possível identificar os SNPs personalizados por US$ 399 por
indivíduo.
Essa tecnologia aplicada ao melhoramento genético certamente
terá grande impacto, seja na descoberta de SNPs, seja no estudo
de expressão gênica, seja na montagem de genomas de vários
indivíduos. Ao lado dessas novas perspectivas está o horizonte de
desafios para a Bioinformática.

5. Considerações finais

A era da informação está revolucionando as ciências naturais. O


sequenciamento de genomas e as técnicas para obter dados em
larga escala nos permitem adquirir conjuntos completos de dados de
sistemas biológicos. A interpretação dos dados a fim de obter
conhecimento biológico é um dos principais desafios da
Bioinformática.
Obter esse conhecimento e conseguir realizar a integração de
dados genômicos àqueles derivados de informação fenotípica será
uma das contribuições da Bioinformática para o melhoramento
genético. A Bioinformática pode ainda ajudar durante o processo de
desenvolvimento ou seleção dos marcadores associados com
fenótipos de interesse econômico e identificação e clonagem de
genes candidatos para o controle de caracteres importantes. As
técnicas pós-genômicas tais como o transcriptômica e
metabolômica, que podem ajudar no mapeamento de populações e
variedades, igualmente exigem ferramentas da Bioinformática para
a análise dos dados que podem ser gerados.
Para compreender completamente as características de
interesse e entender a genética e os genes que estão envolvidos no
processo biológico, aparentemente não será possível um único
procedimento para fazer a ponte entre genótipo e fenótipo, mas uma
combinação de métodos será necessária para identificação dos
genes fundamentais. A Bioinformática pode prover alguns métodos
nessa combinação para trabalhar em prol do melhoramento. A
habilidade para manusear e ligar todos os dados que podem ser
minerados para responder questões específicas ou genéricas em
melhoramento, e a partir daí identificar e acessar as características
relevantes, será um desafio para as próximas décadas.

6. Referências

BRADBURY, L. M. T.; FITZGERALD, T. L.; HENRY, R. J.; JIN, Q. WATERS, D. L. E. The


gene for fragrance in rice. Plant Biotechnology Journal, Oxford, v. 3, p. 363-370, 2005.
CANIATO, F. F.; GUIMARÃES, C. T.; SCHAFFERT, R. E.; ALVES, V. M. C.; KOCHIAN, L.V.;
BORÉM, A.; KLEIN, P. E.; MAGALHÃES, J. V. Genetic diversity for aluminum tolerance in
sorghum. Theoretical and Applied Genetics, New York, v. 114, n. 5, p. 863-876, 2007.
CARVER, T. J.; RUTHERFORD, K. M.; BERRIMAN, M.; RAJANDREAM, M. A.; BARRELL,
B. G.; PARKHILL, J. ACT: the Artemis comparison tool. Bioinformatics, Oxford, v. 21, n. 16,
p. 3422-3423, 2007.
EUCLIDES FILHO, K. Melhoramento genético animal no Brasil: fundamentos, história e
importância. Campo Grande: Embrapa Gado de corte, 2000.
FERNANDO, R. L.; GROSSMAN, M. Marked assisted selection using best linear unbiased
prediction. Genetics Selection Evolution, Paris, FR, v. 21, p. 467-477, 1989.
FRAZER, K. A.; PACHTER, L.; POLIAKOV, A.; RUBIN, E. M. DUBCHAK, I. VISTA:
computational tools for comparative genomics. Nucleic Acids Research, London, UK, v. 32,
p. W273-279, 2004.
FRISHMAN, D.; ALBERMANN, K.; HANI, J.; HEUMANN, K.; METANOMSKI, A.; ZOLLNER,
A.; MEWES, H. W. Functional and structural genomics using PEDANT. Bioinformatics,
Oxford, 17, p. 44–57, 2001.
GASPARIN. G.; MIYATA, M.; COUTINHO, L. L.; MARTINEZ, M. L.; TEODORO, R. L.;
FURLONG, J.; MACHADO, M. A.; SILVA, M. V. G. B.; SONSTEGARD, T. S.; REGITANO, L.
C. A. Mapping of quantitative trait loci controlling tick [Riphicephalus (Boophilus) microplus]
resistance on bovine chromosomes 5, 7 and 14. Animal Genetics, Oxford, v. 38, p. 453-459,
2007.
GEORGES, M.; MASSEY, J. M. Velogenetics, or the synergistic use of marked assisted
selection and germline manipulation. Theriogenology, New York, v. 35, p. 151-159, 1991.
GOFF, S. A.; RICKE, D.; LAN, T. H.; PRESTING, G.; WANG, R.; DUNN, M.;
GLAZEBROOK, J.; SESSIONS, A. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L.
ssp. japonica). Science, Washington, DC, v. 296 n. 5565, p. 92-100, 2002.
HALEY, C. S. VISCHER, P. M. Strategies to utilize marker-quantitative trait loci
associations. Journal of Dairy Science, Chanpaign, v. 81, p. 85-87, 1998.
HENDERSON, C. R. Best Linear Unbiased Estimation and Prediction under a Selection
Model. Biometrics, Washington, DC, v, 31, p. 423-447, 1975.
KOCH, I.; FUELLEN, G. A review of bioinformatics education in Germany. Briefings in
Bioinformatics, London, UK, v. 9, p. 232-242, 2008.
LESCOT, M.; PIFFANELLI, P.; CIAMPI. A. Y.; RUIZ, G.; BLANC, J.; LEEBENS-MACK, F. R.
da SILVA. Insights into the Musa genome: syntenic relationships to rice and between Musa
species. BMC Genomics, London, UK, v. 30, p. 9-58, 2008.
LEWIS, S. E.; SEARLE, S. M. J.; HARRIS, N.; GIBSON, M.; IYER, V.; RICTER, J.; WIEL,
C.; BAYRAKTAROGLU, L.; BIRNEY, E.; CROSBY, M. A.; KAMINKER, J. S.; MATTHEWS,
B.; PROCHNIK, S. E.; SMITH, C. D.; TUPY, J. L.; RUBIN, G. M.; MISRA, S.; MUNGALL, C.
J.; CLAMP, M. E. Apollo: a sequence annotation editor. Genome Biology, London, UK, v. 3,
n. 12, 2002.
LYONS, E.; FREELING, M. How to usefully compare homologous plant genes and
chromosomes as DNA sequences. The Plant Journal, Michigan, v. 53, p. 661–673, 2008.
MAGALHAES, J. V.; LIU, J.; GUIMARÃES, C. T.; LANA, U. G. P.; ALVES, V. M. C.; WANG,
Y. H; SCHAFFERT, R. E.; HOEKENGA, O. A.; PIÑEROS, M. A.; SHAFF, J. E.; KLEIN, P. E.;
CARNEIRO, N. P.; COELHO, C. M.; TRICK, H. N.; KOCHIAN, L. V. A gene in the multidrug
and toxic compound extrusion (MATE) family confers aluminum tolerance in sorghum.
Nature Genetics, New York, v. 39, p. 1156-161, 2007 .
MARDIS, E. R. Anticipating the $1,000 genome. Genome Biology, London, UK, v. 7, n. 7, p.
112, 2006.
MARDIS, E. R. The impact of next generation sequencing techology on genetics. Trends
Genet, Amsterdam, NL, v. 24, p. 133-141, 2008.
MATSUMOTO, T.; WU, J.; KANAMORI, H.; SAKATA, K.; BABA, T.; KATAYOSE, Y.; WU, J;
NIIMURA, Y.; CHENG, Z.; NAGAMURA, Y.; WANG, X.; LU, H;, WU, T.; ZHU, M.; NI, P.;
HAN, H.; DONG, W.; REN X. The map-based sequence of the rice genome. Nature,
London, UK, v. 436, p. 793-800, 2005.
MEUWISSEN, T. H. E.; HAYES, B. J.; GODDARD, M. E. Prediction of total genetic value
using genome wide dense marker maps. Genetics, Maryland, v. 157, p. 1819-1829, 2001.
MIGNON-GRASTEAU, S.; BISSY, A.; BOUIX, J.; FAURE, J-M.; FISHER, A. D.; HINCH, G.
N.; JENSEN, P.; LE NEINDRE P.; MORMEDE, P.; PRUNET, P.; VANDEPUTTE, M.;
BEAUMONT, C. Genetics of adaptation and domestication in livestock. Livestock Production
Science, Amsterdam, NL, v. 93, p. 3-14, 2005.
MOORE, G. E. Cramming more components onto integrated circuits. Electronics Magazine,
New York, v, 38, n. 8, 1965.
PAPPAS JÚNIOR, G.; MIRANDA, R.; MARTINS, N. F.; TOGAWA, R. C.; COSTA, M. M.
SisGen: A CORBA Based Data Management Program for DNA Sequencing Projects.
Lecture Notes in Computer Science, Heidelberg, n. 5109, p. 116-123, 2008.
PRICE, E. O. Behavioral development in animals undergoing domestication. The quarterly
review of biology, Baltimore, v. 59, p. 1-32, 1984 .
ROBINSON, A. J.; LOVE, C. G.; BATLEY, J.; BARKER, G.; EDWARDS, D. Simple
sequence repeat marker loci discovery using SSR primer. Bioinformatics, Oxford, v. 20, n.
9, p. 1475-1476, 2004.
SCHWARTZ, S.; ZHANG, Z.; FRAZER, K. A.; SMIT, A.; RIEMER, C.; BOUCK, J;. GIBBS,
R.; HARDISON, R.; MILLER, W. PipMaker: a Web server for aligning two genomic DNA
sequences. Genome Research, Ottawa, CA, v. 10,
p. 577-586, 2000.
SHENDURE, J.; JI, H. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, New York,
v. 26, p. 1135-1145, 2008 .
SHIU, S. H.; KARLOWSKI, W. M.; PAN, R.; TZENG, Y. H.; MAYER, K. F.; LI, W. H.
Comparative analysis of the receptor-like kinase family in Arabidopsis and rice. Plant Cell,
Rockville, v. 16, n. 5, p. 1220-1234, 2004 .
SOMERS, D. J.; KIRKPATRICK, R.; MONIWA, M.; WALSH, A. Mining single-nucleotide
polymorphisms from hexaploid wheat ESTs. Genome, Ottawa, CA, v. 46, p. 431–437, 2003.
TASSELL, C. P. van; SMITH, T. P. L.; MATUKUMALLI, L. K.; TAYLOR, J. F.; SCHNABEL, R.
D.; LAWLEY, C. T.; HAUDENSCHILD, C. D.; MOORE, S. S.; WAREM, W. C.;
SONSTEGARD, T. S. SNP discovery and allele frequency estimation by deep sequencing
of reduced representatiton libraries. Nature Methods, London, UK, v. 5, p. 247-252, 2008.
WADMAN, M. James Watson’s genome sequenced at high speed. Nature, London, UK, p.
452, n. 7189, p. 788, 2008.
YU, J.; HU, S.; WANG. J.; WONG, G. K.; LI, S.; LIU, B.; DENG, Y.; DAI, L.; ZHOU, Y.;
ZHANG, X. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica). Chinese
Science Bulletin, Beijing, v. 46, n. 23, p. 1937-1942, 2001.
ZEDER, M. A. Domestication and early agriculture in mediterranean basin: origins,
diffusion, and impact. Proceedings of the National Academy of Sciences, Washshington, DC, v.
105, p. 11597-11604, 2008.

Glossário (termos de Bioinformática)

Algoritmo
Conjunto de passos (instruções/comandos) necessários para o
computador executar uma tarefa. Os programadores utilizam a
lógica algorítmica nas diversas linguagens de programação. O
computador, portanto, executa uma tarefa baseado nas instruções
definidas no algoritmo.
Alinhamento
É o processo de alinhar duas ou mais sequências que tem o
máximo nível de identidade (e conservação, no caso de sequências
de aminoácidos) com o propósito de avaliar o grau de similaridade e
a possibilidade de homologia.
Alinhamento global
Alinhamento de duas sequências nucleotídicas ou de aminoácidos
em toda a sua extensão.
Alinhamento local
É o processo de busca de alinhamento de regiões altamente
similares de duas sequências de DNA ou proteína.
Alinhamento múltiplo
É a comparação entre três ou mais sequências de nucleotídeos ou
aminoácidos, com objetivo de posicionar a maior quantidade de
elementos idênticos entre elas (similaridades).
Bioinformática
Ciência que analisa e administra dados biológicos utilizando-se de
técnicas computacionais.
Blast
Do inglês Basic Local Alignment Search Tool. É um algoritmo de
comparação sequêncial otimizado para buscas rápidas em bancos
de dados de sequências genômicas, visando a alinhamentos locais
otimizados.
Genômica
Área da ciência que estuda e sequencia o genoma de um
organismo.
Metabolômica
Área da ciência que estuda o conjunto de metabólitos e os perfis
metabólicos de um organismo.
Metagenômica
Área da ciência que sequencia e estuda os genomas de diversos
organismos em conjunto.
Ômica
Terminação associada às plataformas tecnológicas que têm o
objetivo de isolar e caracterizar o maior número possível de
biomoléculas de um mesmo grupo como DNA, RNA, proteínas e
metabólitos.
Proteômica
Área da ciência que estuda o conjunto de proteínas de uma célula.
Score
No resultado de um alinhamento entre sequências, o score é a
pontuação que uma determinada sequência recebe dependendo do
grau de correspondência encontrada no banco de dados. São pesos
(valores) das operações realizadas no alinhamento múltiplo. As
operações mais comuns são: inserção de espaço (gap´s), inserção
de um novo elemento (nucleotídeos ou aminoácidos), substituição
do elemento (de A para T, ou de G para C).
Similaridade
Sequências correlatas. A similaridade entre duas sequências pode
ser baseada no percentual de identidade e/ou conservação.
Sintenia
Refere-se à propriedade de dois ou mais genes estarem localizados
no mesmo cromossomo.
Capítulo 6
Transformação genética de cana-
de-açúcar
Djair dos Santos de Lima e Souza
Eduardo Romano
Hugo Bruno Correa Molinari
Maria Fátima Grossi-de-Sa

1. Introdução

A cana-de-açúcar representa, desde o início da colonização do


Brasil, uma importante fonte de alimentos, como o açúcar, a
rapadura e a cachaça. Os subprodutos do seu processamento são
usados para a produção de ração para a alimentação animal e papel
(STUPIELLO, 1987). Além disso, vale salientar a importância da
produção de energia elétrica, gerada a partir da queima do bagaço
proveniente da extração do caldo.
A produção da cana-de-açúcar no Brasil está concentrada princi‐
palmente nas regiões Centro-Sul e Nordeste e ocupa uma área de
aproximadamente 8 milhões de hectares. A estimativa de produção
para a safra 2007–2008 é de cerca de 473 milhões de toneladas,
das quais 46,92% (221,99 milhões de toneladas) são para a
fabricação de açúcar e 53,08% (251,17 milhões de toneladas) para
a produção de álcool. O Estado de São Paulo é o de maior
participação na produção, representando cerca de 60% (280
milhões de toneladas) da produção total (CONAB, 2007).
Atualmente, o Brasil é o maior exportador de etanol e o segundo
maior produtor, após os Estados Unidos. Todo etanol brasileiro é
produzido a partir da cana-de-açúcar. O interesse crescente por
esse combustível fez com que a sua produção mundial aumentasse
de 17,25 bilhões de litros no ano 2000 para cerca de 46 bilhões de
litros em 2007, representando cerca de 4% dos 1.300 bilhões de
litros de gasolina consumidos mundialmente. Com todos os novos
programas governamentais da América, Ásia e Europa, a demanda
global pode ultrapassar 125 bilhões de litros por volta de 2020
(BALAT; BALAT, 2009). A perspectiva em 2025 é que o uso do
etanol substitua o uso projetado para a gasolina no mundo em 5%
(LEITE et al., 2009).
Dentre os estresses abióticos causadores das maiores perdas de
colheitas no mundo, além da seca, a alta salinidade é um dos mais
relevantes. O aumento da salinidade de solos aráveis deve levar a
uma perda de 30% na área cultivável nos próximos 25 anos. Do
ponto de vista fisiológico, há sobreposição entre a resposta à seca e
à salinidade. Apesar disso, estudos com a planta modelo
Arabidopsis thaliana revelaram que, em nível de transcriptoma,
muitos genes respondem especificamente à salinidade, enquanto
outros também respondem a outros estresses abióticos, como frio e
seca.
Como toda monocultura, a produção de cana-de-açúcar é preju‐
dicada também pelo ataque de insetos-praga e patógenos. Visando
diminuir as perdas causadas por fitopatógenos, os agricultores
passaram a investir no controle de insetos-praga e doenças a partir
da utilização de produtos químicos, na rotação de culturas e no
desenvolvimento de híbridos mais resistentes; mas, com o passar
do tempo, essas pragas foram adquirindo resistência e vêm
tornando cada vez mais elevado o custo do cultivo de cana-de-
açúcar. O desenvolvimento de cultivares mais resistentes por meio
de intercruzamentos vem ajudando a conseguir maiores índices de
produção e reduzir os danos causados à natureza. Porém, nem
sempre essa é a melhor estratégia para controlar as doenças
causadas por fitopatógenos e insetos-praga, principalmente porque
as espécies do gênero Saccharum possuem diferentes números de
cromossomos (variando entre 80 e 250) podendo tornar o
cruzamento praticamente inviável, gerando indivíduos triploides e/ou
aneuploides, fato este que pode retardar a obtenção de uma cultivar
de cana-de-açúcar com características agronômicas desejáveis em
até 15 anos (LAKSHMANAN et al., 2005).
O crescimento do mercado de consumo de cana-de-açúcar e
seus derivados associado ao aumento da preocupação com a
preservação do meio ambiente têm gerado a necessidade de buscar
novas alternativas e metodologias para o controle de fitopatógenos,
insetos-praga e tolerância a estresses abióticos, como a seca. A
utilização de ferramentas biotecnológicas e a transformação de
plantas vêm surgindo como estratégias promissoras para a
obtenção de cultivares mais produtivas e resistentes, além de serem
menos prejudiciais ao meio ambiente e reduzirem os custos de
produção (NÓBREGA; DORNELAS, 2006).

2. Situação e perspectivas sobre plantas


transgênicas no mundo

Apesar das restrições ao seu uso em alguns países, as lavouras


geneticamente modificadas (GMs) são uma realidade, e, após 13
anos de cultivo comercial, a tecnologia vem sendo adotada de forma
crescente por muitos países. Essa adoção se deve, principalmente,
ao retorno financeiro e ao ganho ambiental resultante desse plantio.
O aumento na renda dos pequenos agricultores também reflete a
importância das lavouras GMs para aliviar a situação dos que
sofrem com fome no mundo (JAMES, 2008). Entre os anos de 1970
e 2006, a população mundial aumentou de 3 bilhões para 6,5
bilhões de habitantes, o que significa um considerável aumento no
número de famintos (DE WAELE; ELSEN, 2007).
A biotecnologia agrícola é uma importante ferramenta para
aumentar a disponibilidade de alimentos em regiões onde o
aumento crescente da população humana torna o alimento um fator
limitante. Além disso, o aumento na produção de vegetais
produtores de fibras, como o algodão e dos usados para a extração
de biocombustíveis (cana-de-açúcar, milho, mandioca e sorgo), é
bastante importante para nações emergentes como o Brasil. O
Brasil hoje é o terceiro país em área plantada de lavouras GMs
(15,8 milhões de hectares), perdendo apenas para os Estados
Unidos e Argentina, respectivamente. Podemos citar vários
exemplos dos benefícios da utilização de lavouras GMs. O primeiro
ponto consiste na possibilidade de se aumentar a produtividade e a
produção de certos cultivares de plantas (JAMES, 2008). Em
segundo lugar, a geração de plantas resistentes a estresses
abióticos como a seca, o estresse salino e o estresse de
congelamento (GAO et al., 2008; XUE et al., 2009) pode ser muito
importante em regiões com condições climáticas, ou de solo, inade‐
quadas para a agricultura.
Além disso, o ganho ambiental pela diminuição com o uso de
pesticidas nas lavouras GMs pode ser representado pelo Quociente
de Impacto Ambiental (EIQ), uma medida composta baseada nos
diversos fatores que contribuem ao impacto ambiental líquido de um
ingrediente ativo individual. Esse coeficiente indicou uma redução
de 17,2% no impacto ambiental, que correspondeu a uma
diminuição de 359 mil toneladas métricas de ingrediente ativo, de
1996 a 2007, em virtude do plantio de plantas transgênicas (JAMES,
2008).
Atualmente, a tolerância a herbicidas é a característica predomi
nante nas lavouras GMs. Em 2008, a tolerância a herbicida
empregada na soja, no milho, na canola, no algodão e na alfafa
ocupou 63% ou 79 milhões de hectares da área global de 125
milhões de hectares de variedades transgênicas. Plantas com mais
de uma característica (principalmente tolerância a herbicidas e
resistência a insetos) ocupam uma área maior (26,9 milhões de
hectares, ou 22% da área global com culturas biotecnológicas) do
que as variedades com resistência a insetos (19,1 milhões de
hectares, ou 15% da área global com culturas biotecnológicas)
(JAMES, 2008). Isso demonstra a nítida tendência de combinar os
benefícios resultantes dessas distintas tecnologias para a
transformação de plantas para uma ou mais características novas. A
maior parte das plantas resistentes a insetos utilizam a tecnologia
Bt. Essas plantas carregam genes codificadores para toxinas Cry,
isolados de Bacillus thuringiensis (Bt). Quando ingeridas pelo inseto
alvo, as toxinas Cry se inserem na membrana das células epiteliais
do intestino, criando poros e provocando um desbalanço eletrolítico
que leva o inseto à morte (CARLINI; GROSSI DE SÁ, 2002; ROH et
al., 2007). Dos US$ 10 bilhões gerados com o mercado global de
produtos GMs, em 2007, US$ 6 bilhões foram oriundos de países
em desenvolvimento, e US$ 4 bilhões vieram de países
industrializados (JAMES, 2008). Os lucros gerados com as plantas
Bt reforçam o potencial de mercado das plantas GMs para o
presente e futuro. Nesse sentido, muitos trabalhos foram
desenvolvidos até o momento, com o objetivo de gerar plantas
transgênicas com potencial agrícola. E, além das plantas Bt resis‐
tentes a insetos e a outras comercializadas atualmente, como as
resistentes a herbicidas, já foram geradas plantas que exibem
tolerância a estresses abióticos (GAO et al., 2008) e outras
resistentes a diferentes patógenos como bactérias (HUANG, 2007),
fungos (SHAH et al., 2009) e nematoides (HUANG et al., 2006).
Sendo assim, plantas transgênicas com potencial para uso
comercial estão sendo produzidas a partir de pesquisas científicas;
e, provavelmente, o Brasil possuirá em alguns anos eventos-elite de
cana-de-açúcar mais produtivos, com características de resistência
a estresses bióticos ou abióticos ou com características metabólicas
adicionais.

3. Transformação genética de cana-de-


açúcar

Por ser uma fonte de combustível renovável e uma alternativa ao


uso de combustíveis fósseis emissores de gases poluentes, o foco
nas pesquisas com cana consiste em maximizar a sua
produtividade, levando a um maior rendimento na produção de
etanol (LEITE et al., 2009). Para atingir essa meta, além de
aumentar a disponibilidade de terras para o seu cultivo, introduzir
características para estresse biótico (insetos-praga) e abiótico em
germoplasma de cana-de-açúcar vem sendo cada dia mais uma
forte demanda. Nesse sentido, o Brasil poderá se beneficiar muito
com novas tecnologias que levem ao aumento da produção da cana
no mundo, diminuição dos custos de plantio e, consequentemente, o
aumento da acessibilidade ao consumidor. Para atingir esses
objetivos, pesquisadores brasileiros e de outras partes do mundo
estão concentrando esforços na busca de genes de interesse e de
métodos mais eficazes para a transformação genética da cana-de-
açúcar.
É de conhecimento geral que a introdução heteróloga de genes
em plantas é uma estratégia única que transcende as opções que o
melhoramento convencional oferece. Sendo assim, características
de interesse agronômico podem ser retiradas de qualquer espécie
de plantas, microrganismo ou animal e introduzidas em plantas
produtoras de alimentos, fibras e combustível. A complexidade
genética das variedades modernas de cana-de-açúcar, decorrente
do elevado nível de ploidia e ocorrência de aneuploidia, constitui o
principal obstáculo para a geração de variedades geneticamente
melhoradas por métodos convencionais. Além disso, atualmente,
são necessários de 12 a 15 anos para se obter novas variedades.
Sendo assim, a transformação genética é uma importante
ferramenta para a introdução de características de interesse no
germoplasma da cana-de-açúcar (MENOSSI et al., 2008).

4. Cultura de tecidos preparativa para a


transformação genética
Desde o trabalho pioneiro na indução de calos por Nickell (1964),
a cultura de tecido de cana-de-açúcar surge como uma ferramenta
valiosa para várias atividades de pesquisas, o que permitiu a sua
utilização para várias aplicações tais como a micropropagação
(HENDRE et al., 1983), conservação de germoplasma (TAYLOR;
DUKIC, 1993), a eliminação de patógenos virais e bacterianos
sistêmicos (PARMESSUR et al., 2002; WAGIH et al., 1995) e,
finalmente, a engenharia genética de cana-de-açúcar (ARENCIBIA
et al., 1995; BOWER; BIRCH, 1992).
A cana-de-açúcar é uma gramínea perene que normalmente se
reproduz vegetativamente por meio dos botões nodais e dos
rizomas, mas a propagação via semente também ocorre (BAKKER,
1999). Comercialmente, a propagação da cana-de-açúcar ocorre via
vegetativa por cortes nodais, e, por esse motivo, a micropropagação
oferece um método prático e rápido para a produção massal do
material de origem clonal.
A micropropagação é um método in vitro para a multiplicação
clonal das plantas utilizando como fonte células e/ou tecidos
meristemáticos ou não meristemáticos, em meios de cultura
contendo vitaminas e nutrientes específicos. As plantas podem ser
regeneradas diretamente do explante (GEIJSKES et al., 2003) ou
indiretamente (de novo) por meio de calos derivados de explante
(HEINZ; MEE, 1971). Como em outras espécies vegetais, as plantas
de cana-de-açúcar propagadas a partir de meristemas são
consideradas, geneticamente e fenotipicamente, mais estáveis que
aquelas produzidas a partir de calos de origem não meristemática
(HENDRE et al., 1983.; LEE, 1987).
Embriogênese somática é provavelmente o método in vitro mais
investigado de regeneração de cana-de-açúcar (GUIDERDONI et
al., 1995). Um grande número de clones comerciais de cana-de-
açúcar foi obtido a partir de embriogênese somática (GUIDERDONI
et al., 1995; MANICKAVASAGAM; GANAPATHI, 1998.) e pode ser
obtido diretamente (MANICKAVASAGAM; GANAPATHI, 1998.), ou
indiretamente (GUIDERDONI; DEMARLY, 1988), do tecido da folha.
Embora desenvolvida originalmente como um sistema alternativo de
regeneração à cultura de tecidos meristemáticos, a embriogênese
somática se tornou importante como uma parte integrante do
sistema genético da transformação (BOWER; BIRCH, 1992).

5. Transformação genética de cana-de-


açúcar mediada por Agrobacterium spp.

Os primeiros calos/células transgênicos de cana-de-açúcar foram


obtidos pelo método de transferência de DNA mediada por Poli
Etileno Glicol (PEG). Esse método, porém, recebeu pouca atenção,
pois a eficiência de transformação dos protoplastos reportada para a
cultivar F164 foi baixíssima (um por 106), além da baixa
reprodutibilidade do método (CHEN et al., 1987). Por outro lado, a
transformação estável de cana por eletroporação de protoplastos se
mostrou um método mais eficiente e reproduzível do que o método
de transformação via PEG. Esse fato foi observado em várias
cultivares transgênicas, como as cultivares Q63 e Q96 que
apresentaram uma frequência de transformação de 102 a 104,
respectivamente (RATHUS; BIRCH, 1992). Nesses experimentos,
porém, a falta de regeneração dos protoplastos culminou na não
formação de plantas transgênicas. Outros experimentos de
transformação via eletroporação obtiveram sucesso na produção de
plantas transgênicas a partir de células embriogênicas intactas e de
tecidos meristemáticos in vitro (ARENCIBIA et al., 1992, 1995). Uma
série de trabalhos também reporta a transformação da cana-de-
açúcar, mediada por Agrobacterium. Dentre esses podemos citar
Arencibia et al. (1998) que transformaram calos de cana-de-açúcar
em cocultura, com as linhagens LBA 4404 e EHA 101 de
Agrobacterium tumefaciens. Nesse trabalho, a frequência de
transformação variou de 9,4 x 10-3 a 1,15 x 10-2, e três principais
fatores foram indicados como cruciais para o aumento da
competência das células para o processo de transferência do T-
DNA: 1) uso de calos jovens e regeneráveis como explantes; 2)
indução e/ou aumento do sistema de virulência de A. tumefaciens
com culturas de células de cana; e 3) pré-indução da organogênese
ou embriogênese-somática. Em outro trabalho, a transformação
mediada por A. tumefaciens (C58C1 RifR (At 2260)) foi usada para
introduzir na cana-de-açúcar resistência genética ao sal de
fosfinotricina (PPT), o componente ativo do herbicida comercial
Basta. Nesse caso, foram usados diferentes protocolos de
transformação para a introdução do gene bar no genoma da cana.
Para isso, secções meristemáticas, usadas como fonte de
explantes, foram tratadas com compostos antinecróticos para
minimizar o dano por estresse oxidativo. A frequência de
transformação para a cultivar comercial Ja60-5 foi de 35%
(ENRIQUEZ-OBREGON et al., 1998). Esse trabalho demonstrou
que tanto a utilização de calos jovens e regeneráveis quanto à
prevenção da morte celular provocada pela infecção com
Agrobacterium são importantes para a obtenção de uma alta
frequência de transformantes em cana-de-açúcar. Ademais,
Manickavasagam et al. (2004) obtiveram plantas de cana resistentes
ao herbicida Basta em uma frequência de transformação de 50%,
utilizando para isso gemas axilares como fonte de explante. Essa
alta taxa de transformação foi obtida com as cultivares Co92061 e
Co671, usando a linhagem de A. tumefaciens, estirpe EHA105.

6. Transformação genética de cana-de-


açúcar mediada por biobalística

A transformação de plantas via bombardeamento de micropar‐


tículas, também conhecido como biobalística, consiste na introdução
em um tecido alvo de microprojéteis, envoltos por DNA de interesse,
que são acelerados a velocidades superiores a 1.500 km/h. Os
microprojéteis acelerados penetram na parede e membrana celular,
e o DNA exógeno em contato com o líquido celular se dissocia das
partículas e é incorporado no genoma do tecido alvo. O
desenvolvimento da primeira cana-de-açúcar transgênica a partir da
cultivar comercial Q117 foi realizado por meio do referido método de
transformação (BOWER; BIRCH, 1992). Esse procedimento rendeu
cerca de uma planta transgênica por bombardeamento de calos
embriogênicos para a inserção do gene nptII. Calos embriogênicos
são os alvos preferidos para esse método, em razão do alto
percentual de transformação e da fácil regeneração. Outros tecidos,
como os meristemas apicais de folhas jovens, verticilos florais e
influorescências (ELLIOTT et al., 2002; GAMBLEY et al., 1993),
também foram usados com sucesso como alvos para a
transformação de cana-de-açúcar. Portanto, em virtude da facilidade
em transformar diversos tecidos e a praticidade do método, a
transformação de cana-de-açúcar por bombardeamen-to de
micropartículas é a metodologia atualmente mais utilizada
(LAKSHMANAN et al., 2005). Na Figura 1 são mostradas as
diferentes etapas do processo de transformação aplicadas na
geração de uma planta transgênica de cana-de-açúcar usando o
método de biobalística.
Figura 1. Esquema de regeneração e transformação de cana-de-açúcar via biobalística: A –
explantes oriundos de folhas imaturas com diâmetro de 2 mm a 3 mm; B – calos
embriogênicos obtidos após 4 subcultivos em meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962)
acrescido de 13 μM de 2,4-D; C – aparelho de bombardeamento de micropartículas
utilizado nos experimentos de transformação genética de cana-de-açúcar; D – etapa de
regeneração dos calos embriogênicos em meio de cultura contendo 25 μM de glufosinato
de amônio; E – alongamento e enraizamento das plantas putativas transgênicas de cana-
de-açúcar; F – fase de aclimatização das plantas em casa –de vegetação; G – fase de
multiplicação e avaliação dos componentes de rendimento dos eventos transgênicos
selecionados em áreas credenciadas pela CTNBio; H – fase final de comercialização e
incorporação das cultivares GMs no sistema de produção sucroalcooleiro.
Fotos: Hugo Bruno Correa Molinari

7. A cana-de-açúcar como fonte de genes


para melhoramento genético da cultura
Definido o método de transformação a ser utilizado para a cultura
de interesse, deve-se então selecionar a característica genética a
ser inserida na planta. Sendo assim, melhorias como o aumento da
qualidade nutricional do vegetal, o melhoramento do seu sistema de
defesa ou o incremento da sua produtividade em campo podem ser
obtidos pela transferência de informação genética de outras fontes,
ou da própria espécie em estudo ou de um isolado da espécie que
contém a característica desejada. Um exemplo da grande profusão
de moléculas a serem utilizadas para a transgenia de plantas
consiste na utilização de genes codantes de proteínas
anticongelantes presentes no sangue de peixes de mares gelados.
Essas proteínas, quando expressas em vegetais, amenizaram os
problemas resultantes dos danos causados pelos cristais de gelo
formados em alimentos como frutas (HIGHTOWER et al., 1991).
Vários trabalhos reportam genes descobertos em bibliotecas de
genes transcritos (ESTs) de cana-de-açúcar. Muito desses genes
são expressos em resposta à herbivoria, à seca e a outros estresses
(CARSON; BOTHA, 2002; CASU et al., 2001; VETTORE et al.,
2003). Assim, essas bibliotecas representam fonte importante de
genes para viabilização da genômica funcional como estratégia
prévia à transgenia da espécie. Não existe ainda relatado o genoma
completo da cana-de-açúcar. Por outro lado, foram construídos
bancos de acesso público que são uma fonte de genes a serem
explorados para o melhoramento da cana no mundo inteiro. Essa é
uma tendência atual da Biotecnologia, trazer facilidades para a
realização de pesquisas com maior eficácia. Para consulta de genes
da cana, podemos acessar o banco internacional Sugarcane Gene
Index1 ou o banco brasileiro Sucest2.

8. Genes potenciais a serem usados na


transformação genética da cana-de-açúcar
8.1. Genes relacionados ao estresse biótico

Assim como outras plantas cultiváveis de grande importância


agrícola, a cana-de-açúcar sofre danos severos causados por
agentes bióticos como insetos e patógenos. Os mecanismos de
defesa vegetal são bastante complexos e envolvem uma série de
genes relacionados a receptores, a proteínas de resistência
(proteínas R) e a metabólitos secundários envolvidos com a
sinalização para a resistência, como o ácido salicílico, o etileno e o
ácido jasmônico. O entendimento da expressão gênica na cana-de-
açúcar, durante a herbivoria, ou com a presença de patógenos, é de
suma importância para a escolha da melhor estratégia a ser
utilizada na transformação da planta. Alguns relatos apontam
potenciais genes relacionados com alguns desses mecanismos.
Como exemplo podemos citar a expressão de um provável receptor
de etileno (SCER1) e dois prováveis fatores de transcrição
(SCERF1 e SCERF2), membros da via de sinalização do etileno, os
quais mostraram ser regulados durante a associação da cana-de-
açúcar com bactérias fixadoras de nitrogênio (CAVALCANTE et al.,
2007).
O projeto do transcriptoma da cana-de-açúcar (Sucest) revelou a
expressão de uma série de genes ortólogos relacionados à resposta
às injúrias causadas por insetos herbívoros. Dentre esses genes,
podemos destacar os que codificam para inibidores de proteinases
digestivas, com potencial de inibição do processo de digestão de
proteínas vegetais pelo inseto-praga, os inibidores de alfa-amilases
que podem impedir a atividade catalítica de enzimas responsáveis
pela digestão do amido da planta atacada e quitinases que podem
atuar no mecanismo de defesa vegetal por digerir o conteúdo
quitinoso da matriz peritrófica do intestino do inseto forrageiro
(FALCO et al., 2001). Em outro relato a cana-de-açúcar foi
submetida a diversos estímulos como tratamento com metil
jasmonato, ácido abiscísico, assim como em associação com
bactérias fixadoras de nitrogênio e sob o ataque do inseto-praga, a
Diatraea saccharalis. No referido trabalho, a presença da D.
saccharalis na cana-de-açúcar, após 24 horas, induziu na planta
uma forte expressão de uma proteína relacionada à patogênese
similar à taumatina (ROCHA et al., 2007). O tratamento de plantas
com hormônios vegetais também pode ser uma alternativa para a
descoberta de novos genes de resistência associados ao estresse
biótico. Por exemplo, quando plantas são atacadas por herbívoros,
elas produzem jasmonato e metil jasmonato. Esses hormônios
participam da sinalização para a expressão de genes de resistência
em resposta à herbivoria ou a injúrias mecânicas no vegetal. Por
essa razão, plantas de cana-de-açúcar foram tratadas com metil
jasmonato, o que resultou na expressão de homólogos de genes de
resistência como a lipoxigenase e uma proteína da família PR-10
(BOWER et al., 2005). Esses e outros exemplos demonstram que a
cana-de-açúcar pode ser uma fonte de genes com potencial para o
incremento da resistência a insetos-praga e patógenos em cultivares
de interesse agronômico. Porém, muitas outras fontes podem ser
utilizadas para a produção de plantas de cana transgênicas
resistentes a estresses bióticos. Essas fontes podem incluir a
bactéria de solo Bacillus thuringiensis como fonte de proteínas Cry
(BRAGA et al., 2003), Galanthus nivalis como fonte de lectinas
(SETAMOU et al., 2002).

8.2. Genes relacionados ao estresse abiótico

Além dos problemas com insetos-praga e patógenos, a agricul‐


tura mundial é afetada por diversos fatores ambientais como a seca,
a salinidade dos solos, as altas temperaturas, o frio que impedem ou
limitam o uso de terras que poderiam ser melhor aproveitadas na
agricultura. Por exemplo, 22% das terras agrícolas do globo são
salinizadas (BHATNAGAR-MATHUR et al., 2008). Além disso, as
mudanças climáticas globais cada vez mais acentuadas, como a
desertificação de florestas, constituem um problema que afetará
seriamente as gerações futuras. Sendo assim, variedades agrícolas
transgênicas ou naturalmente resistentes a estresses abióticos
podem ser uma alternativa para o aproveitamento de terras não
cultiváveis. Práticas como irrigação visando minimizar o déficit
hídrico podem levar a um problema sério de salinização das terras
aráveis no mundo de até 50% até o ano de 2050 (RODRIGUEZ et
al., 2005). Além disso, o percentual de água doce usado na
agricultura corresponde a 65% da água consumida no mundo. Esse
fato demonstra a importância do desenvolvimento de plantas
tolerantes à seca (MENOSSI et al., 2007).
As vias bioquímicas de resposta a estresses abióticos englobam
respostas celulares complexas, as quais incluem moléculas
sensoriais que percebem o sinal inicial do estresse, proteínas
relacionadas com a cascata de sinalização celular, fatores de
transcrição, promotores, bem como as proteínas expressas em
resposta a estresses, como as chaperonas (GROVER et al., 2001;
RODRIGUEZ et al., 2005). Os canais de Ca2+, por exemplo, são
sensores para estresses como a seca, salinidade e frio. O influxo do
cálcio para o meio intracelular leva a ativação das cascatas de
sinalização para a expressão dos genes relacionados à tolerância a
estresses abióticos (RODRIGUEZ et al., 2005). Uma estratégia
importante para a identificação de genes de resistência a estresses
abióticos em cana-de-açúcar consiste na construção de bibliotecas
de cDNA usando variedades de cana submetidas a condições de
déficit hídrico, altas temperaturas, frio ou alta salinidade. Nesse
caso, experimentos realizados com cana-de-açúcar submetida ao
estresse hídrico resultaram na expressão diferencial de vários genes
em relação às plantas controles não submetidas à seca.
Dentre esses genes, podemos destacar ortólogos de fatores de
transcrição Myb, WRKY, NAC e DREB que foram relacionados com
mecanismos de tolerância ao estresse hídrico em outras espécies
de plantas (ROCHA et al., 2007). Outras proteínas importantes que
são expressas em resposta a altas temperaturas são as chaperonas
moleculares Heat Shock Proteins – (HSPs). Pequenas proteínas
(sHSP) ligam-se a proteínas parcialmente desnaturadas, impedindo
que essas sejam inativadas durante o estresse de temperatura.
Essas proteínas são alvos de uso como ferramentas biotecnoló
gicas. Em cana-de-açúcar foram identificadas formas dessas
chaperonas (SsHsp17.2 e SsHsp17.9), que podem ser utilizadas
posteriormente para a produção de variedades de cana transgênica
resistente a estresse de temperatura (TIROLI; RAMOSA, 2007).
Esses são alguns exemplos de genes oriundos da cana-de-açúcar
com potencial uso na obtenção de tolerância de variedades de
interesse econômico a estresses abióticos. Por outro lado, como já
comentado anteriormente, outras espécies de plantas, animais ou
microrganismos também podem ser usados como fontes doadoras
de genes para o melhoramento genético da cana-de-açúcar.

9. Situação global da cana-de-açúcar


transgênica

Atualmente, ainda não existe cana-de-açúcar transgênica co‐


mercial. Como relatado anteriormente, um enorme potencial para o
aumento da produção do etanol brasileiro se abre com as
alternativas para o melhoramento genético da cana-de-açúcar via
transgenia. Existem, também, muitos insetos-praga e patógenos que
contribuem para a diminuição da produtividade da cana-de-açúcar
no Brasil como, por exemplo, a cigarrinha-das-folhas (Mahanarva
posticata), cigarrinha-das-raízes (Mahanarva fimbriolata), a broca-
da-cana (Diatrea saccharalis), broca-gigante (Telchin licuslicus),
nematoides (Meloidogyne incognita), entre outras (PINTO, 2006) –
Boletim Técnico. O maior entendimento da interação entre essas
espécies e a cana-de-açúcar contribuirá para o desenvolvimento de
plantas GMs resistentes em um futuro próximo.
A liberação comercial de cana GM ainda não se deu provavel‐
mente em virtude de questões regulatórias e relacionadas à proprie‐
dade intelectual. No caso das características complexas, tais como
o teor de sacarose, ainda não há comprovação da melhoria do
desempenho agronômico das plantas transformadas (MENOSSI et
al., 2008). Atualmente, existem plantas GMs de cana-de-açúcar com
diferentes características, incluindo tolerância a herbicidas
(CHOWDHURY; VASIL, 1992; ENRIQUEZ-OBREGON et al., 1998;
GALLO-MEAGHER; IRVINE, 1996; LEIBBRANDT; SNYMAN, 2003),
resistência a insetos (ARENCIBIA et al., 1997, 1999), ao vírus-do-
mosaico (BUTTERFIELD et al., 2002; INGELBRECHT et al., 1999),
à bactéria causadora da escaldadura das folhas (ZHANG et al.,
1999) e, ainda, ao gene P5CS, que aumenta o acúmulo do
aminoácido prolina, conferindo assim uma maior tolerância da planta
à seca (MOLINARI et al., 2007), além do gene marcador de seleção
nptII (ARENCIBIA et al., 1998; ELLIOTT et al., 1998; GAMBLEY et
al., 1993). Esses relatos demonstram o potencial da transgenia na
geração de variedades de cana-de-açúcar mais produtivas e
resistentes a doenças e ao déficit hídrico. Um quadro geral da
situação da cana-de-açúcar GM no mundo está resumido na Tabela
1.

Tabela 1. Plantas transgênicas de cana-de-açúcar obtidas pelos métodos de biobalística


e transformação mediada por Agrobacterium spp. Os trabalhos citados na tabela
descrevem diversos protocolos e adaptações para a transformação da cana-de-açúcar
aplicados às características de resistência a herbicidas e a insetos-praga.

Método de
Característica Gene Referência
transformação

Genes repórteres e sistemas de seleção

Neomicina
nptII Biobalística Bower e Birch (1992)
fosfotransferase

β-Glucuronidase uidA Biobalística Bower e Birch (1992)

β-Glucuronidase uidA Eletroporação Arencibia et al. (1995)

β-Glucuronidase uidA Agrobacterium Arencibia et al. (1998)

Higromicina
Hpt Agrobacterium Arencibia et al. (1998)
fosfotransferase

Green Fluorecent Gfp Agrobacterium Elliott et al. (1998)


Protein

Fosfinotricina acetil
Bar Agrobacterium Elliott et al. (1998)
transferase

Promotor Ubi4 e
Gfp Biobalística Wei et al. (2003)
Ubi9

Promotor de
Agrobacterium
superexpressão Gus Liu et al. (2003)
Biobalística
RUBQ2

Resistência a herbicidas

Bialafos Bar Biobalística Gallo-Meagher e Irvine (1996)

Fosfinotricina Bar Agrobacterium Enriquez-Obregon et al. (1998)

Glifosato de amônio Pat Biobalística Leibbrandt e Snyman (2003)

Fosfinotricina nptII Agrobacterium Manickavasagam (2004)

Resistência a doenças

SCMV SCMV-CP Biobalística Joyce et al. (1998a, b)

SrMV SrMV-CP Biobalística Ingelbrecht et al. (1999)

SCYLV SCYLV-CP Biobalística Rangel et al. (2003)

FDVS9
Vírus Fiji Biobalística McQualter et al. (2004a)
ORF1

Escaldadura das
albD Biobalística Zhang et al. (1999)
folhas

Glucanase,
Puccinia
quitinase e Agrobacterium Enriquez et al. (2000)
melanocephala
ap24

Resistência a insetos

Broca-da-cana cry1A Eletroporação Arencibia et al. (1999)

Broca-do-arroz gna Biobalística Legaspi e Mirkov (2000)

Broca-da-cana e Gna Biobalística Setamou et al. (2002)


broca-do-arroz

Scirpophaga
Aprotinina Biobalística Christy et al. (2008)
excerptalis

SKTI e
Broca-da-cana Biobalística Falco e Silva Filho (2003)
SBBI

Alteração de vias metabólicas

Invertase
ácida
antisense
Acúmulo de Ma et al. (2000))
solúvel Biobalística
sacarose Botha et al. (2001)
Invertase
ácida
solúvel

Frutooligossacarídeo lsdA Agrobacterium Enriquez et al. (2000)

Vickers et al. (2005) Analysis and


functional annotation of an expressed
Polifenol oxidase Ppo Biobalística sequence tag collection for tropical
crop sugarcane Genome Res. v. 13, p.
2725-2735, 2003.

phaA,
Polihidroxidobutirato phaB e Biobalística Brumbley et al. (2003)
phaC

Ácido
hch1 e cpl Biobalística McQualter et al. (2004b)
pHidroxibenzoico

Phytase Appa Agrobacterium Santosa et al. (2004)

Déficit hídrico P5CS Biobalística Molinari et al. (2007)

Trehalose
Déficit hídrico synthase Biobalística Zhang et al. (2006)
(TSase)
Fonte: modificado de Lakshmanan et al. (2005).
10. Referências

ARENCIBIA, A.; CARMONA, E.; TELLEZ, P.; CHAN, M. T.; YU, S. M.; TRUJILLO, L.;
ORAMAS, P. An efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp.) transformation mediated
by Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Research, Philadelphia, v. 7, p. 213-222, 1998.
ARENCIBIA, A.; VAZQUEZ, R. I.; PRIETO, D.; TELLEZ, P.; CARMONA, E. R.; COEGO, A.;
HERNANDEZ, L.; RIVA, G. A. de la; SELMAN, H. G. Transgenic sugarcane plants resistant
to stem borer attack. Molecular Breeding, Dordrecht, v. 3, p. 247-255, 1997.
ARENCIBIA, A.; CARMONA, E.; CORNIDE, M. T.; CASTIGLIONE, S.; O’RELLY, J.; CINEA,
A.; ORAMAS, P.; SALA, F. Somaclonal variation in insectresistant transgenic sugarcane
(Saccharum hybrid) plants produced by cell electroporation. Transgenic Researh,
Philadelphia, v. 8, p. 349-360, 1999.
ARENCIBIA, A.; MOLINA, P.; RIVA, G. A. de la; SELMAN-HOUSSEIN, G. Production of
transgenic sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by intact cell electroporation. Plant
Cell Reports, New Yoyk, v. 14, p. 305-309, 1995.
ARENCIBIA, A.; MOLINA, P.; GUTIERREZ, C.; FUENTES, A.; GREENIDGE, V.;
MENENDEZ, E.; RIVA, G. A. de la; SELMAN, G. Regeneration of transgenic sugarcane
(Saccharum officinarum L.) plants from intact meristematic tissues transformed by
electroporation. Biotechnologia Aplicada, New York, v. 9, p. 156-165, 1992.
BAKKER, H. Sugar cane cultivation and management. New York: Kluwer Academic/Plenum
Publishers, 1999. 706 p.
BALAT, M.; BALAT, H. Recent trends in global production and utilization of bio-ethanol fuel.
Applied Energy, New York, v. 86, p. 2273-2282, 2009.
BOTHA, F. C.; SAWYER, B. J. B.; BIRCH, R. G. Sucrose metabolism in the culm of
transgenic sugarcane with reduced soluble acid invertase activity. In: HOGARTH, D. M.
(Ed.). CONGRESS INTERNATIONAL SOCIETY, SUGARCANE TECHNOLOGY, 24., 2001,
Brisbane. Proceedings… Brisbane: ISSCT, 2001. p. 588-591.
BHATNAGAR-MATHUR, P.; VADEZ, V.; SHARMA, K. K. Transgenic approaches for abiotic
stress tolerance in plants: retrospect and prospects. Plant Cell Reports, New York, v. 27, p.
411-424, 2008.
BOWER, R.; BIRCH, R. G. Transgenic sugarcane plants via microprojectile bombardment.
The Plant Journal, London, UK, v. 2, n. 3. p. 409-416, 1992.
BOWER, N. I.; CASU, R. E.; MACLEAN, D. J.; REVERTER, A.; CHAPMAN, S. C.;
MANNERS, J. M. Transcriptional response of sugarcane roots tomethyl jasmonate. Plant
Science, Oxford, v. 168, n. 3, p. 761-772, 2005.
BRAGA, D. P. V.; ARRIGONI, E. D. B.; SILVA-FILHO, M. C; ULIAN, E. C. Expression of the
Cry1Ab protein in geneticallymodified sugarcane for the control of Diatraea saccharalis
(Lepidoptera: Crambidae), Journal of New Seeds, Binghamton, v. 5, n. 2-3, p. 209-221, 2003.
BRUMBLEY, S. M.; PETRASOVITS, L. A.; BONAVENTURA, P. A.; O’SHEA, M. J.;
PURNELL, M. P.; NIELSEN, L. K. Production of polyhydroxyalkanoates in sugarcane.
CONGRESS INTERNATIONAL SOCIEATY SUGAR CANE TECHNOLOGY, 4., 2003,
Brisbane. Proceedings… Brisbane: ISSCT, 2003. p. 31.
BUTTERFIELD, M. K.; IRVINE, J. E.; VALDEZ GARZA, M.; MIRKOV, T. E. Inheritance and
segregation of virus and herbicide resistance transgenes in sugarcane. Theoretical and
Applied Genetics, New York, v. 104, p. 797-803, 2002.
CARLINI, C. R.; GROSSI DE SÁ, M. F. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A
review on their potentialities of bioinsecticides. Toxicon, Elmsford, v. 40, n. 11, p. 1515-
1539, 2002.
CARSON, D.; BOTHA, F. Genes expressed in sugarcane maturing internodal tissue. Plant
Cell Reports, New York, v. 20, n. 11, p. 1075-1081, 2002.
CASU, R. E.; DIMMOCK, C. M.; THOMAS, M.; BOWER, N.; KNIGHT, D. Genetic and
expression profiling in sugarcane. CONGRESS INTERNATIONAL SOCIETY FOR SUGAR
CANE TECHNOLOGY, 24., 2001, Brisbane. Proceendings… Brisbane: ISSCT, 2001. p. 542-
546.
CAVALCANTE, J. J. V.; VARGAS, C.; NOGUEIRA, E. M. Members of the ethylene
signalling pathway are regulated in sugarcane during the association with nitrogen-fixing
endophytic bacteria. Journal of Experimental Botany, London, UK, v. 58, n. 3, p. 673-686,
2007.
CHEN, W. H.; GARTLAND, K. M. A.; DAVEY, M. R.; SOTAK, R.; GARTLAND, J. S.;
MULLIGAN, B. J.; POWER, J. B.; COCKING, E. C. Transformation of sugarcane
protoplasts by direct uptake of a selectable chimaeric gene. Plant Cell Reports, New York, v.
6, p. 297-301, 1987.
CHOWDHURY, M. K. U.; VASIL, I. Stably transformed herbicide resistant callus of
sugarcane via microprojectile bombardment of cell suspension cultures and electroporation
of protoplasts. Plant Cell Reports, New York, v. 11, p. 494-498, 1992.
CHRISTY, L. A.; ARVINTH, S.; SARAVANAKUMAR, M.; KANCHANA, M.; MUKUNTHAN,
N.; SRIKANTH, J.; THOMAS, G. SUBRAMONIAN, N. Engineering sugarcane cultivars with
bovine pancreatic trypsin inhibitor (aprotinin) gene for protection against top borer
(Scirporphaga excerptali Walker). Plant Cell Reports, New York, v. 28, 175-184, 2008.
CONAB. Companhia Nacional de Abastecimento. Acompanhamento da Safra Brasileira:
cana-de-açúcar safra 2007/2008, segundo levantamento, agosto/2007. Brasília, DF:
Conab, 2007.
DE WAELE, D.; ELSEN, A. Challenges in tropical plant nematology. Phytopathology News,
St. Paul, v. 45, p. 457-485, 2007.
ELLIOTT, A. R.; CAMPBELL, J. A.; BRETELL, R. I. S.; GROF, C. P. L. Agrobacterium
mediated transformation of sugarcane using GFP as a screenable marker. Australian
Journal of Plant Physiology, Victoria, v. 25, p. 739-743, 1998.
ELLIOTT, A. R.; GEIJSKES, R. J.; LAKSHMANAN, P.; MCKEON, M. G.; WANG, L. F.;
BERDING, N.; GROF, C. P. L.; SMITH, G. R. Direct regeneration of transgenic sugarcane
following microprojectile transformation of regenerable cells in thin transverse section
explants. In: VASIL, I. K. (Ed.). CONGRESSO INTERNATIONAL ASSOCIATIONAL PLANT
TISSUE CULTURE BIOTECHNOLOGY, 10., 2002, Orlando, Proceedings… Orlando: IAPB,
2002. (Abstract P-1376).
ENRIQUEZ-OBREGON, G. A.; VAZQUEZ, P. R. I.; PRIETO, S. D. L.; RIVA-GUSTAVO, A.
D. L.; SELMAN, H. G. Herbicide resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by
Agrobacterium-mediated transformation. Planta, Heidelberg, v. 206, n. 20-27, 1998.
ENRIQUEZ, G. A.; TRUJILLO, L. E.; MENENDEZ, C.; VAZQUEZ, R. I.; TIEL, K.; ARIETA,
J.; SELMAN, G.; HERNANDEZ, L. Sugarcane (Saccharum hybrid) genetic transformation
mediated by Agrobacterium tumefaciens: production of transgenic plants expressing
proteins with agronomic and industrial value. In: ARENCIBIA, A. D. (Ed.). Plant genetic
engineering: towards the third millennium. Amsterdam, NL: Elsevier Science, 2000. p. 76-
81.
FALCO, M. C.; MARBACH, P. A. S.; POMPERMAYER, P.; LOPES, F. C.; SILVA-FILHO, M.
C. Mechanisms of sugarcane response to herbivory. Genetics and Molecular Biology,
Ribeirão Preto, v. 24, n. 1-4, p. 113-122, 2001.
FALCO, M. C.; SILVA-FILHO, M. C. Expression of soybean proteinase inhibitors in
transgenic sugarcane plants: effects on natural defense against Diatraea saccharalis. Plant
Physiology and Biochemistry, Paris, FR, v. 41, p. 761-766, 2003.
GALLO-MEAGHER, M.; IRVINE, J. E. Herbicide resistant transgenic sugarcane plants
containing the bar gene. Crop Science, Madison, v. 36, p. 1367-1374, 1996.
GAMBLEY, R. L.; FORD, R.; SMITH, G. R. Microprojectile transformation of sugarcane
meristems and regeneration of shoots expressing b-glucuronidase. Plant Cell Reports, New
York, v. 12, p. 343-346, 1993.
GAO, S.; ZHANG, H.; TIAN, Y.; LI, F.; ZHANG, Z.; LU, X; CHEN, X; HUANG, R. Expression
of TERF1 in rice regulates expression of stress-responsive genes and enhances tolerance
to drought and high-salinity. Plant Cell Reports, New York, v. 27, n. 11, p. 1787-1795, 2008.
GEIJSKES, R. J.; WANG, L. F.; LAKSHMANAN, P.; MCKEON, M. G.; BERDING, N.;
SWAIN, R. S.; ELLIOTT, A. R.; GROF, C. P. L.; JACKSON, J.; SMITH, G. R. Smartsette
seedlings: tissue culture seed plants for the Australian sugar industry. Sugarcane
International, High Wycombe, Bucks, may/june, p. 13-17, 2003.
GROVER, A.; KAPOOR, A,; SATYA LAKSHMI, O.; AGRAWAL, S.; SAHI, C.; KATIYAR-
AGARWAL, S.; AGARWAL, M.; DUBEY, H. Understanding molecular alphabets of the plant
abiotic stress responses. Currient Science, Bangalore, v. 80, p. 206-216, 2001.
GUIDERDONI, E.; MEROT, B.; EKSOMTRAMAGE, T.; PAULET, F.; FELDMANN, P.;
GLASZMANN, J. C. Somatic embryogenesis in sugarcane (Saccharum species). In: BAJAJ,
Y. P. S Biotechnology in agriculture and forestry, Berlin, DE, v. 31, pl 92-113, 1995.
GUIDERDONI, E.; DEMARLY, Y. Histology of somatic embryogenesis in cultured leaf
segments of sugarcane plantlets. Plant Cell Tissue and Organ Culture, Hague, v. 14, n. 2. p.
71-88, 1988.
HENDRE, R. R.; IYER, R. S.; KOTWAL, M.; KHUSPE, S. S.; MASCARENHAS, A. F. Rapid
multiplication of sugarcane by tissue culture. Sugarcane, Flórida, v. 1, p. 5-8, 1983.
HEINZ, D. J.; MEE, G. W. P. Morphologic, cytogenetic, and enzymatic variation in
saccharum species hybrid clones derived from callus tissue. American Journal of Botany,
Bronx, v. 58, n. 3. p. 257, 1971.
HIGHTOWER, R.; BADEN, C.; PENZES, E.; LUND, P.; DUNSMUIR, P. Expression of
antifreeze proteins in transgenic plants. Plant Molecular Biology, Dordrecht, v. 17, p. 1013-
1021, 1991.
HUANG, G.; DONG, R.; ALLEN, R.; DAVIS, E. L. A root-knot nematode secretory peptide
functions as a ligand for a plant transcription factor. Molecular Plant Microbe Interactions,
St. Paul, v. 19, n. 5, p. 463-470, 2006.
HUANG, H.; LIU, C.; LEE, M.; GEORGE KUO, C.; CHEN, H.; GER, M.; TSAI, Y.; CHEN, Y.;
LIN, M.; FENG, T. Resistance enhancement of transgenic tomato to bacterial pathogens by
the heterologous expression of sweet pepper ferredoxin-i protein. Biochemistry and cell
Biology, Ottawa, CA, v. 97, p. 900-906, 2007.
INGELBRECHT, I. L.; IRVINE, J. E.; MIRKOV, T. E. Posttranscriptional gene silencing in
transgenic sugarcane. Dissection of homology-dependent virus resistance in a monocot that
has a complex polyploid genome. Plant Physiology, Bethesda, v. 119, p. 1187-1197, 1999.
JAMES, C. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2008. Ithaca: International
Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications, 2008. ( ISAAA Brief n. 39).
JOYCE, P. A.; MCQUALTER, R. B.; BERNAD, M. J.; SMITH, G. R. Engineering for
resistance to SCMV in sugarcane. Acta Horticulturae, Hague, v. 461, p. 385-391, 1998a.
JOYCE, P. A.; MCQUALTER, R. B.; HANDLEY, J. A.; DALE, J. L.; HARDING, R. M.;
SMITH, G. R. Transgenic sugarcane resistant to ugarcane mosaic virus. In: HOGARTH, D.
M. (Ed.). CONFERENCE OF THE AUSTRALIAN SOCIETY OF SUGAR CANE
TECHNOLOGISTS, 20, 1998. Ballina, Austrália. Proceedings... Ballina, Austrália. 1998b. p.
204-210.
LAKSHMANAN, P.; GEIJSKES, R. J.; AITKEN, K.; GROF, C. L. P.; BONNET, G. D.; SMITH,
G. R. Sugarcane Biotechnology: the challenges and Opportunities. In vitro cellular in
developmental biology. Plant, Columbia, v. 41, p. 345-363, 2005.
LEGASPI, J. C.; MIRKOV, T. E. Evaluation of transgenic sugarcane against stalkborers. In:
ALLSOPP, P. G.; SUASA-ARD, W. (Ed.). CONGRESS INTERNATIONAL SOCIETY OF
SUGAR CANE TECHNOLOGISTS, 4., 2000, Khow Kaen, Proceedings… Khon Kaen, 2000.
LEE, T. S. G. Micropropagation of Sugarcane (Saccharum Spp). Plant Cell Tissue and
Organ Culture, Hague, v. 10, n. 1. p. 47-55, 1987.
LEIBBRANDT, N. B.; SNYMAN, S. J. Stability of gene expression and agronomic
performance of a transgenic herbicide-resistant sugarcane line in South Africa. Crop
Science, Madison, v. 43, p. 671-678, 2003.
LEITE, R. C. C.; LEAL, M. R. L. V.; CORTEZ, L. A. B.; GRIFFIN, W. M.; SCANDIFFIO, M. I.
G. Can Brazil replace 5% of the 2025 gasoline world demand with ethanol? New York: Energy
in press, 2009.
LIU, D.; OARD, S. V.; OARD, J. H. High transgene expression levels in sugarcane
(Saccharum officinarum L.) driven by the rice ubiquitin promoter RUBQ2. Plant Science, New
York, v. 165, p. 743-750, 2003.
MA, H.; ALBERT, H. H.; PAULL, R.; MOORE, P. H. Metabolic engineering of invertase
activities in different subcellular compartments affects sucrose accumulation in sugarcane
cells. Australian Journal of Plant Physiology, Victoria, v. 27, p. 1021-1030, 2000.
MANICKAVASAGAM, M.; GANAPATHI, A. Direct somatic embryogenesis and plant
regeneration from leaf explants of sugarcane. Indian Journal of Experimental Biology, New
Delhi, v. 36, n. p. 832-835, 1998.
MANICKAVASAGAM, M.; GANAPATHI, A.; ANBAZHAGAN, V. R.; SUDHAKAR, B.;
SELVARAJ, N.; VASUDEVAN, A.; KASTHURIRENGAN, S. Agrobacterium mediated genetic
transformation and development of herbicide resistant sugarcane (Saccharum species
hybrids) using axillary buds. Plant Cell Reports, New York, v. 23, p. 134-143, 2004.
MCQUALTER, R. B.; DALE, J. L.; HARDING, R. H.; MCMAHON, J. A.; SMITH, G. R.
Production and evaluation of transgenic sugarcane containing a Fiji disease virus (FDV)
genome segment S9-derived synthetic resistance gene. Australian Journal of Agricultural
Research, Melbourne, v. 55, p. 139-145, 2004a.
MCQUALTER, R. B.; FONG CHONG, B.; O’SHEA, M.; MEYER, K.; DYK, D. E. van;
VIITANEN, P. V.; BRUMBLEY, S. M. Initial evaluation of sugarcane as a production platform
for a p-hydroxybenzoic acid. Plant Biotechnoloy, Cambridge, v. 2, p. 1-13, 2004b.
MENOSSI, M.; SILVA-FILHO, M. C.; VINCENTZ, M.; VAN-SLUYS, M. A.; SOUZA, G. M.
Sugarcane Functional Genomics: Gene Discovery for Agronomic Trait. Development
International Journal of Plants Genomics, New York, v. 1, p. 11, 2008.
MOLINARI, H. B. C.; MARUR, C. J.; DAROS, E.; CAMPOS, M. K. F.; CARVALHO, J. F. R.
P. de; BESPALHOK FILHO, J. C.; PEREIRA, L. F. P.; VIEIRA, L. G. E. Evaluation of the
stress-inducible production of proline in transgenic sugarcane (Saccharum spp.): osmotic
adjustment, chlorophyll fluorescence and oxidative stress. Physiologia Plantarum,
Copenhagen, v. 130, p. 218-229, 2007.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol Plant, Rockville, v. 15, n. 3, p. 473-497, 1962.
NÓBREGA, J. C. M.; DORNELAS, M. C. Biotecnologia e melhoramento de cana-de-açúcar.
In: SEGATO, S. V.; PINTO, A. de S.; JENDIROBA, E.; NÓBREGA, J. C. M. (Org.).
Atualização em produção de cana-de-açúcar. Piracicaba: Ceres, 2006. p. 39-56.
NICKELL, L. G. Tissue and cell cultures of sugarcane: another research tool. The Hawaiin
Plant, Millwood, v. 57, p. 223-229, 1964.
PARMESSUR, Y.; ALJANABI, S.; SAUMTALLY, S.; DOOKUN-SAUMTALLY, A. Sugarcane
yellow leaf virus and sugarcane yellows phytoplasma: elimination by tissue culture. Plant
Pathology, London, UK, v. 51, n. 5. p. 561-566, 2002.
PINTO, A. de S. O controle biológico de pragas da cana-de-açúcar. In: PINTO, A. de S.
(Org.). Controle de pragas da cana-de-açúcar. Boletim Técnico Biocontrol, Sertãozinho, v.
1, p. 9-13, 2006.
RANGEL, P.; GOMEZ, L.; VICTORIA, J. I.; ANGEL, F. Transgenic plants of CC 84-75
resistant to the virus associated with the sugarcane yellow leaf syndrome. CONGRESS
INTERNATIONAL SOCIETY FOR SUGAR CANE TECHNOLOGY, 4., 2003, Brisbane.
Proceedings… Brisbane: ISSCT, 2003. p. 30.
RATHUS, C.; BIRCH, R. G. Stable transformation of callus from electroporated sugarcane
protoplasts. Plant Science, London, UK, v. 82, p. 81-89, 1992.
ROCHA, F. R.; PAPINI-TERZI, F. S.; NISHIYAMA JÚNIOR, M. Y. Signal transduction-related
responses to phytohormones and environmental challenges in sugarcane. BMC Genomics,
London, UK, v. 8, p. 71, 2007.
RODRIGUEZ, M.; CANALES, E.; BORRAS-HIDALGO, O. Molecular aspects of abiotic
stress in plants. Biotecnología Aplicada, La Habana, v. 22, p. 1-10, 2005.
ROH, J. Y.; CHOI, J. Y; LI, M. S; JIN, B. R; JE, Y. H. Bacillus thuringiensis as a specific,
safe, and effective tool for insect pest control. Microbiology Biotechnology, Oxford, v. 17, n.
4, p. 547-59, 2007.
SANTOSA, D. A.; HENDROKO, R.; FAROUK, A.; GREINER, R. A. Rapid and highly
efficient method for transformation of sugarcane callus. Molecular Biotechnology, Totowa,
CA, v. 28, p. 113-119, 2004.
SHAH, J. M.; RAGHUPATHY, V.; VELUTHAMBI, K. Enhanced sheath blight resistance in
transgenic rice expressing an endochitinase gene from Trichoderma viren. Biotechnol
Letters, Surrey, v. 31, n. 2, p. 239-244, 2009.
SETAMOU, M.; BERNAL, J. S.; LEGASPI, J. C.; MIRKOV, T. E.; LEGASPI, B. C. Evaluation
of lectin-expressing transgenic sugarcane against stalkborers (Lepidoptera: Pyralidae):
effects on life history parameters. Journal of Economic Entomology, Colleg Park, v. 95, p.
469-477, 2002.
STUPIELLO, J. P. A cana-de-açúcar como matéria-prima. In: PARANHOS, S. B. (Ed.).
Cana-de-açúcar: cultivo e utilização. Campinas: Fundação Cargill, 1987. p. 187-259.
TAYLOR, P. W. J.; DUKIC, S. Development of an in-vitro culture technique for conservation
of saccharum spp hybrid germplasm. Plant Cell Tissue and Organ Culture, Hague, v. 34, n.
2. p. 217-222, 1993.
TIROLI, A. O.; RAMOSA, C. H. I. Biochemical and biophysical characterization of small
heat shock proteins from sugarcane Involvement of a specific region located at the N-
terminus with substrate specificity The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,
Exeter, v. 39, p. 818-831, 2007.
VETTORE, A. L.; SILVA, F. R.; KEMPER, E. L.; SOUZA, G. M.; SILVA, M. da. Analysis and
functional annotation of an expressed sequence tag collection for tropical crop sugarcane.
Genome Research, New York, v. 13, p. 2725-2735, 2003.
VICKERS, J. E.; GROF, C. P. L.; BONNETT, G. D.; JACKSON, P. A. KNIGHT, D. P.;
ROBERTS, S. E.; ROBINSON, S. P. Overexpression of polyphenol oxidase in transgenic
sugarcane results in darker juice and raw sugar. Crop Science, Madison, v. 45, p. 354-362,
2005.
WAGIH, M. E.; GORDON, G. H.; RYAN, C. C.; ADKINS, S. W. Development of an axillary
bud culture technique for fiji disease virus elimination in sugarcane. Australian Journal of
Botany, Victoria, v. 43, n. 1. p. 135-143, 1995.
WEI, H.; WANG, M.; MOORE, P. H.; ALBERT, H. H. Comparative expression analysis of
two sugarcane polyubiquitin promoters and flanking sequences in transgenic plants. Journal
Plant Physiology, Stuttgart, v. 160, p. 1241-1251, 2003.
XUE, Y.; PENG, R.; XIONG, A.; LI, X.; ZHA, D.; YAO, Q. J. Yeast heat-shock protein gene
HSP26 enhances freezing tolerance in Arabidopsis. Journal Plant Physiology, Stuttgart, v.
166, n. 8, p. 844-850.
ZHANG, L;, XU, J.; BIRCH, R. G. Engineered detoxification confers resistance against a
pathogenic bacterium. Nature Biotechnology, New York, v. 17, p. 1021-1024, 1999.
ZHANG, S-Z; YANG, B-P; FENG, C-L; CHEN, R-K; LUO, J-P; CAI, W-W; LIU, F-H.
Expression of the Grifola frondosa Trehalose Synthase Gene and Improvement of Drought-
Tolerance in Sugarcane (Saccharum officinarum L.). Journal of Integrative Plant Biology,
Victoria, v. 48, n.4, p. 453-459, 2006.
Capítulo 7
Análise do metagenoma do solo:
acesso à diversidade genética de
microrganismos e aplicações na
Biotecnologia
Krystyna Gorlach-Lira
Teresa Cristina Soares de Lima Grisi

1. Introdução

Seleção de microrganismos por métodos tradicionais de isola‐


mento e cultivo garantiu, até meados da década de 1990, a
obtenção de novas substâncias que foram aplicadas nas mais
diferentes áreas, como saúde, agricultura, indústria e meio ambiente
(OLIVEIRA et al., 2006). Contudo, com o advento da biologia
molecular, novas estratégias de bioprospecção de produtos
bioativos estão sendo utilizadas, visto que mais de 99% dos
microrganismos presentes em muitos ambientes naturais não são
cultiváveis pelas técnicas de cultivo em laboratório (STREIT;
SCHMITZ, 2004).
Nesse contexto, a metagenômica surge como uma nova meto‐
dologia de análise genômica de comunidades microbianas, que
independe de cultivo e envolve extração direta de DNA de amostras
ambientais, clonagem em vetor adequado, construção de bibliotecas
genômicas do DNA ribossomal 16S, que poderão ser utilizadas para
estudos filogenéticos e diversidade microbiana, além de bibliotecas
genômicas funcionais para investigação de novos metabólicos, tais
como antibióticos, enzimas, corantes, polissacarídeos, etc., que
poderão ter as mais diversas aplicações biotecnológicas
(HANDELSMAN, 2004; LEE, 2005; LORENZ; SCHLEPER, 2002;
SCHLOSS; HANDELSMAN, 2003).

2. Métodos de extração de DNA do solo

O solo é tido como um ecossistema complexo, sendo consi‐


derado o maior reservatório da diversidade genética microbiana.
Essa complexidade é resultado da interação de múltiplos
parâmetros, tais como pH, conteúdo de água, estrutura do solo,
variações climáticas e atividade biótica (LAKAY et al., 2007), sendo
os microrganismos distribuídos de forma heterogênea entre os
agregados das partículas do solo (ROBE et al., 2003). Entretanto,
mesmo com o crescente desenvolvimento das técnicas moleculares,
tem sido um grande desafio o processo de extração e purificação de
DNA de amostras ambientais, como o solo, para posterior
investigação das comunidades microbianas ou aplicação em
processos biotecnológicos (XAVIER et al., 2004).
A extração do DNA metagenômico ambiental pode ocorrer de
maneira indireta, ou direta (HERRERA; COCKELL, 2007; ROH et
al., 2006; XAVIER et al., 2004); porém, em amostras de solo, a
eficiência desses métodos depende das suas características
orgânicas e inorgânicas, que podem interferir na quantidade e no
grau de pureza do DNA (AMORIM et al., 2008; ROBE et al., 2003;
TSAI; OLSON, 1992; WHITEHOUSE; HOTTEL, 2007).
No solo existem inúmeras substâncias como compostos fenóli‐
cos, ácidos húmicos e metais pesados (WILSON, 1997), capazes de
adsorver as moléculas de DNA, tornando-se um fator limitante,
principalmente, quando se utilizam métodos de extração em que o
DNA é liberado durante a etapa de lise celular ainda na presença do
solo (SANTOS et al., 2002).
Solos ricos em matéria orgânica possuem uma grande quanti‐
dade de ácidos húmicos, resultado da ciclagem de nutrientes, e que
aparecem como principais interferentes no processo de extração de
DNA (SANTOS et al., 2002).
Os ácidos húmicos promovem a desnaturação do DNA, pela
ligação de seus grupos fenólicos a amidas, ou por oxidação e
formação de quinonas que podem se ligar covalentemente ao DNA
(AMORIM et al., 2008; ROBE et al., 2003). Essas substâncias têm
tamanho e cargas similares ao DNA, sendo coextraídas e
visualizadas por apresentar uma coloração marrom, após o
processo de extração (YEATES et al., 1998). Elas também possuem
a capacidade de inibir processos moleculares como Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR), hibridização DNA-DNA ou DNA-RNA
e digestão com enzimas de restrição (SANTOS et al., 2002).
A quantificação do DNA pode ser feita por espectrofotometria a
260 nm (DNA) e 280 nm (proteínas), em que a razão da
absorbância nesses comprimentos de ondas entre 1,7 e 2,0 indica
um alto grau de pureza do DNA (SAMBROOK et al., 1989). Porém a
contaminação por ácidos húmicos, que interfere no processo de
quantificação do DNA, pode ser estimada a um comprimento de
onda de 230 nm, e a razão menor que 2,0, entre 260 nm e 230 nm,
indica essa contaminação (YEATES et al., 1998).
No método indireto de extração do DNA, primeiramente as
células microbianas são separadas das partículas do solo e depois
lisadas para posterior purificação do DNA (TORSVIK, 1980). Esse
procedimento requer mais tempo e esforço, além de ter, em geral,
baixo rendimento de DNA (HERRERA; COCKELL, 2007).
O método da lise direta das células microbianas seguida da
extração do DNA é uma abordagem relativamente mais fácil e que
apresenta, na maioria das vezes, um melhor rendimento do DNA,
sendo preferencialmente o mais utilizado (ROOSE-AMSALEG et al.,
2001).
Vários tipos de extração têm sido pesquisados com o intuito de
obter uma maior quantidade de DNA e um alto grau de pureza, mes‐
mo de amostras de solo com conteúdos de substâncias interferentes
(MILLER et al., 1999; ROBE et al., 2003; ROH et al., 2006;
WHITEHOUSE; HOTTEL, 2007).
Lakay et al. (2007) citam alguns métodos de extração de DNA do
solo, avaliados por vários autores: dissociação celular utilizando
nitrogênio líquido (VOLOSSIOUK et al., 1995); ruptura por micro-
ondas (ORSINI; ROMANO-SPICA, 2001); lise utilizando pérolas de
vidro (BORNEMAN et al., 1996).
Para o processo de purificação após extração do DNA ambiental,
Lakay et al. (2007) também citam o uso de brometo de cetil-
trimetilamônio (Ctab), de gradientes de densidades com cloreto de
césio, de polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) e de várias resinas de gel
de filtração.
Atualmente, kits de extração e purificação vêm sendo os mais
requisitados, pois os mesmos apresentam um bom rendimento do
extrato de DNA, bem como um elevado grau de pureza, além de ser
um procedimento mais rápido (WHITEHOUSE; HOTTEL, 2007).

Entre os kits mais comumente utilizados temos: Fast DNA®


SPIN® Kit for Soil (Q-BIOgene, EUA); Puregene DNA purification kit
(Gentra, EUA); QIAamp DNA Stool Mini kit (Qiagen, EUA);
SoilMasterTM DNA extraction kit (Epicentre, EUA); MoBio
UltraCleanTM kit e MoBio PowerMaxTM soil DNA isolation kit (Bio 101,
EUA), utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes
(PEREIRA et al., 2007; PIRES; TEIXEIRA, 2004; WHITEHOUSE;
HOTTEL, 2007).
Martin-Laurent et al. (2001) utilizaram dois tipos de kits
comerciais de extração de DNA (UltraCleanSoilDNA – MoBio Lab.,
Icn., EUA e Fast DNA® Spin® – Bio 101, EUA), em comparação
com método químico convencional associado à disruptura com
pérolas de vidro, em três tipos de amostras de solo. Os dados
obtidos mostraram um melhor rendimento do DNA quando eles
utilizaram o kit Fast DNA Spin (0,76 – 1,01 µg de DNA/g de solo).
Entretanto, quando o gene 16S rDNA foi amplificado, eles
observaram um melhor rendimento do produto da PCR com o DNA
extraído do kit Fast DNA Spin. Provavelmente isso ocorreu em
razão de o kit ter extraído o DNA com melhor grau de pureza, o qual
foi capaz de reter interferentes da Taq polimerase.
O método direto abaixo descrito foi proposto por Yeates et al.
(1998), que utilizaram pérolas de vidro para auxiliar na
desagregação dos microrganismos na amostra do solo e obtiveram
melhor rendimento (de 1,5 mg a 2,35 mg de DNA por 100 g solo) do
DNA entre os demais métodos avaliados, como: sonicação, lise
química e isolamento das células bacterianas.
O método de Yeates et al. (1998) consiste das seguintes etapas:
pesar 100 g de solo (peso seco) e adicionar 100 mL de tampão de
extração (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; Edta 100 mM, pH 8,0; NaCl 1,5
M) contendo 100 g de pérolas de vidro (Bio-Spec Products,
Bartesville,U.S.). Misturar a amostra em Bead-Beater (Bio-Spec
Products) por 2 minutos. Acrescentar 10 mL de SDS (dodecil sulfato
de sódio) a 20% e misturar por mais 5 segundos. Incubar a amostra
a 65 ºC por 1 hora, transferir o homogeneizado para tubos de
centrífuga (250 mL) e centrifugar a 6.000 g por 10 minutos. Coletar o
sobrenadante e ressuspender o pellet com 100 mL de tampão de
extração e novamente incubar e centrifugar, como descrito acima.
Juntar os sobrenadantes e distribuir em tubos de centrífuga (50 mL)
contendo a metade do volume com poliethileno glycol (30%)/cloreto
de sódio (1,6 M), e incubar à temperatura ambiente por 2 horas.
Centrifugar as amostras (10.000 g por 20 minutos) e parcialmente
purificar o DNA ressuspendendo o pellet em 20 mL de TE (10 mM
Tris- HCl, 1 mM sodium Edta, pH 8,0). Adicionar acetato de potássio
(7,5 M) para uma concentração final de 0,5 M. Colocar as amostras
em banho de gelo por 5 minutos e depois centrifugar (16.000 g, 30
minutos) a 4 ºC para precipitar as proteínas e polissacarídeos.
Extrair a fase aquosa com fenol/clorofórmio (v/v) e clorofórmio/álcool
isoamílico (24:1) e precipitar o DNA com 0,6 volume de isopropanol.
Após 2 horas à temperatura ambiente, centrifugar 16.000 g por 30
minutos e ressuspender o DNA com 1 mL TE. O DNA extraído pode
ser estocado a -20 °C.

3. Construção de biblioteca metagenômica

A construção de uma biblioteca metagenômica das amostras


ambientais é conceitualmente simples, entretanto representa um
grande desafio.
A diversidade genética do metagenoma do solo é de 5 mil a 5
milhões de vezes maior que o genoma de E.coli (DOOLITTLE, 1999;
TORSVIK et al., 1998). Com base em vários estudos utilizando
métodos não dependentes de cultivo, estima-se que um grama do
solo pode conter mais que 10 bilhões de células microbianas, as
quais representam milhares ou milhões de espécies genômicas
distintas (TORSVIK; OVREAS, 2002).
Assumindo que um grama de um solo possui 4 mil espécies de
bactérias, o metagenoma possuirá 10 mil Gb do DNA único
(CURTIS et al., 2002), e para obter mais sequências do mesmo tipo,
o tamanho da biblioteca metagenômica deve ser várias vezes maior
que o metagenoma. As bibliotecas de tamanho mínimo
provavelmente representam os genomas de espécies mais
frequentes. Para que a biblioteca possa representar as espécies
raras (0,1%) da comunidade, ela deve ser 100 a 1.000 vezes maior
que o metagenoma (RIESENFELD et al., 2004b).
Outro aspecto importante é o tamanho e a organização dos
genes envolvidos na síntese de metabólitos secundários. Nos proca‐
riontes, esses genes são usualmente organizados em
agrupamentos clusters (MARTIN, 1992) possibilitando a clonagem
de um grande inserto de DNA que abrange toda via biossintética em
um vetor.
Dependendo do objetivo do estudo podem ser construídas
bibliotecas de grandes fragmentos de DNA em fago lambda, cosmí‐
deos, fosmídeos e Bacterial Artificial Chromosomes (BACs), ou de
insertos pequenos (menos que 15 kb) em plasmídios (EYERS et al.,
2004; SOSIO et al., 2000).
As bibliotecas de grandes insertos permitem identificação de
complexas vias metabólicas codificadas por vários genes. Os frag‐
mentos de DNA até 40 kb podem ser clonados em fosmídeos e
cosmídeos, enquanto os fragmentos de DNA maiores são inseridos
em BAC.
Fosmídeos são vetores que apresentam alta eficiência de
clonagem, estabilidade em Escherichia coli e ótimo tamanho do
fragmento de inserção (35 kb–45 kb). Várias bibliotecas foram
construídas utilizando fosmídeos (LIM et al., 2005; QUAISER et al.,
2003; TREUSCH et al., 2004) e cosmídeos (COURTOIS et al., 2003;
ELEND et al., 2006; ENTCHEVA et al., 2001; VOGET et al., 2003).
O vetor BAC tem sido usado para clonagem de fragmentos de
DNA maiores que 100 kb (HANDELSMAN et al., 1998; RONDON et
al., 2000). BACs mantêm insertos até 360 kb em E. coli e
apresentam pequeno número de cópias por célula. Esses vetores
foram desenvolvidos para clonagem do DNA eucarionte e são
amplamente utilizados para estudos genômicos das plantas, animais
(HANDELSMAN et al., 1998; SHIZUYA; SIMON, 1992) e
microrganismos (ELEND et al., 2006; FIERER et al., 2007; LAMMLE
et al., 2007; LILES et al., 2003; LIM et al., 2005; RIESENFELD et al.,
2004ab; RONDON et al., 2000).
As bibliotecas de pequenos fragmentos de DNA são construídas
em plasmídios, tais como pGEM-T, o qual é usado para clonagem
de segmentos de DNA de 1,5 kb de amostras ambientais em E. coli
DH10B como hospedeiro (DUNBAR et al., 1999). Esse vetor têm
sido utilizado na construção da biblioteca do gene de 16S rDNA dos
microrganismos cultivados ou de DNA microbiano extraído do solo
(RONDON et al., 2000). Lammle et al. (2007) construíram biblioteca
metagenômica de amostra de compostagem utilizando o plasmídio
pJOE930 e os fragmentos de DNA de 3 kb a 8 kb. Outros
plasmídios têm sido utilizados para construção de bibliotecas
metagenômicas do solo, tais como pJN105 e pCF430
(RIESENFELD et al., 2004b).
As bibliotecas de pequenos insertos de DNA são úteis para
pesquisar novas funções metabólicas codificadas por um gene ou
pequenos operons e para análise da biodiversidade, entretanto, não
são adequadas para pesquisar as vias metabólicas que dependem
de vários genes (TYSON et al., 2004).
Alta diversidade molecular de microrganismos do solo e de
outros ambientes necessita de uma técnica de clonagem muito efi‐
ciente para que os clones da biblioteca representem todo
metagenoma. A maioria das bibliotecas de grandes insertos possui
até 10 mil clones, o número suficiente para caracterizar uma
comunidade microbiana, em geral, entretanto insuficiente para
representar todas as espécies da comunidade de um ambiente
(RIESENFELD et al., 2004b).
Para melhorar a probabilidade de inclusão na biblioteca de genes
mais raros, pode ser realizado o processo de enriquecimento
específico do solo antes da construção de biblioteca (SCHLOSS;
HANDELSMAN, 2003).
A bactéria hospedeira mais frequentemente utilizada para obten‐
ção de biblioteca metagenômica é Escherichia coli (E. coli DH10B,
E. coli EPI-100, E. coli DH5a). A diversidade dos genes de DNA de
diversos procariontes que foram expressos em E. coli é
surpreendente (BLACK et al., 1995; FERREYRA et al., 1993;
RONDON et al., 1999, 2000), entretanto a expressão heteróloga
persiste como um fator limitante para obtenção da informação
máxima da análise funcional do metagenoma.
Futuramente, E. coli poderá ser modificada para expressar mais
funções dos genes pela introdução de genes que codificam novos
fatores sigma, raras moléculas de RNAt, ou funções que são neces‐
sárias para síntese de compostos precursores para biossíntese de
antibióticos deficientes em E. coli (RIESENFELD et al., 2004a).
Outras bactérias hospedeiras, tais como Bacillus subtilis,
Streptomyces spp., Pseudomonas spp. ou sistema de expressão
eucarionte podem ser utilizados para melhorar a expressão dos
genes de interesse (LORENZ; ECK, 2005). Como exemplos,
Streptomyces lividans foi muito útil como bactéria hospedeira na
descoberta de vários metabólitos novos (COURTOIS et al., 2003;
WANG et al., 2000), como também Rhizobium leguminosarum nos
estudos de expressão de vários genes (LI et al., 2005).
Para facilitar identificação dos genes dos diferentes grupos de
microrganismos, podem ser construídas bibliotecas submetagenô‐
micas como as de bactérias com alto teor de G+C (RAJENDHRAN;
GUNASEKARAN, 2008).
Actinomicetos possuem muitos genes envolvidos na síntese de
metabólitos secundários, como enzimas e antibióticos, os quais são
de grande interesse biotecnológico. Em virtude da diferença no
conteúdo G+C entre E. coli (baixo teor G+C) e actinomicetos (alto
teor G+C), E. Coli não reconhece aproximadamente 80% dos
promotores de actinomicetos (STROHL, 1992), como também não
ocorre a expressão de maioria dos genes de actinomicetos nesse
hospedeiro. Para construção de biblioteca metagenômica voltada
para análise de actinomicetos, Sosio et al. (2000) desenvolveram
um cromossoma artificial E. coli – Streptomyces (Esac).
Um dos parâmetros críticos na construção de banco dos genes
em E. coli ou em outra bactéria hospedeira é o conteúdo de DNA
eucariótico. Burgmann et al. (2001) quantificaram ácidos nucleicos
de bactérias, arqueas e eucariontes em DNA metagenômico, por hi‐
bridização com três sondas de oligonucleotídeos específicos. Nas
diversas amostras do DNA extraído diretamente do solo, 61% a 93%
de DNA foram eucarióticos, originados provavelmente da lise parcial
de organismos como fungos, algas e protozoários, ou em razão da
lise do material vegetal. Nas amostras de DNA obtidas pelo método
indireto, a maioria do DNA (> 92%) foi bacteriana em virtude da
separação das células bacterianas dos organismos eucariontes por
centrifugação diferencial (BURGMANN et al., 2001).
Para construir uma biblioteca metagenômica, o DNA de alto peso
molecular é extraído do solo e purificado (Figura 1). O DNA pode ser
submetido à digestão com enzimas de restrição, tais como EcoRI
(LAMMLE et al., 2007), gelase (RONDON et al., 2000), HindIII
(LILES et al., 2003; RONDON et al., 2000). Os fragmentos de
restrição podem ser separados na base do seu tamanho por
eletroforese em campo pulsante (RONDON et al., 2000), e os
fragmentos de DNA do tamanho desejado são cortados do gel e
clonados em um vetor (fosmídeo, cosmídeo, plasmídio,
cromossomo artificial). Após a transformação realizada em E. coli,
os transformantes são selecionados no ágar LB (Luria-Bertani), com
antibiótico(s) específico(s). A presença dos plasmídios
recombinantes e do polimorfismo dos insertos de DNA pode ser
examinada por eletroforese de campo pulsante dos plasmídios
purificados obtidos dos transformantes de E. coli e digeridos com
enzima de restrição. Os clones podem ser estocados em
microplacas (15% de glicerol, -70 °C) (DUNBAR et al., 1999). Bi‐
blioteca de clones pode ser analisada na base de sequências ou
expressão funcional dos genes.
Figura 1. Construção e análise de uma biblioteca metagenômica do solo.

4. Análise da biblioteca

Bibliotecas metagenômicas constituem uma ferramenta muito


promissória para identificar novos metabólitos (DANIEL, 2005).
Triagem da biblioteca pode ser realizada com base na análise de
sequências ou na de expressão funcional do DNA clonado
(QUAISER et al., 2003; RONDON et al., 2000; WANG et al., 2000)
(Figura 1).
Análise baseada em sequência pode revelar os genes que não
são expressos em espécie hospedeira utilizada para construção de
biblioteca (RIESENFELD et al., 2004b). Sequências fornecem
valiosas informações, entretanto apenas os genes similares com os
já conhecidos podem ser identificados pela limitação dos bancos de
dados de sequências disponíveis. Por outro lado, triagem funcional
tem potencial para identificação de genes novos, os quais não
seriam reconhecidos por detecção de sequências.
A análise dos clones da biblioteca metagenômica por sequência
pode ser realizada por meio dos iniciadores ou de sondas
desenhadas com base nas sequências conservadas dos genes
conhecidos. Esse método é eficiente no caso de genes que
codificam enzimas com domínios altamente conservados (PIEL,
2002). Um dos genes mais estudados por esse método é o gene
16S rRNA utilizado para avaliar a diversidade filogenética de
microrganismos.
Análise da biblioteca baseada na função dos genes objetiva
identificar clones com novas classes de genes, que produzem um
metabólito de interesse. Estima-se que para analisar todo o genoma
microbiano do solo é preciso testar 1 milhão de clones
(HANDELSMAN et al., 1998). A identificação de clones ativos que
produzem uma enzima ou metabólito dentro de milhões de clones
requer muito tempo e esforço e é realizada por testes que devem
ser simples e rápidos.
O número de clones testados em trabalhos sobre detecção de
enzimas e biocatalizadores varia muito. Por exemplo, dois clones
com atividade de lipase e esterase e oito clones com atividade de
amilase foram identificados entre 3.648 clones da biblioteca
metagenômica do solo construída em BAC, com inserto de cerca 27
kb (RONDON et al., 2000).
Henne et al. (2000), analisando 286 mil clones (biblioteca meta‐
genômica do solo construída em plasmídio com insertos de cerca de
6 kb), identificaram 3 clones com atividade de esterase e lipase.
Henne et al. (1999) identificaram 11 clones que produziram chitinase
entre 825 mil clones da biblioteca metagenômica de água marinha
construída em fago lambda.

5. Amplificação dos genes 16S rDNA

Bibliotecas do gene de 16S rDNA constituem uma ferramenta útil


para o estudo do conteúdo genômico da microbiota do solo. O gene
16S rRNA é mais utilizado para esclarecer afiliação taxonômica de
vários táxons (BAKER et al., 1999) e para analisar diversidade
molecular dos ambientes naturais (DUNBAR et al., 1999; HUANG et
al., 2005).
Amplificação de 16S rDNA dos organismos não cultiváveis forne‐
ce inestimável contribuição para conhecer comunidades
microbianas, especialmente dos ambientes extremos, cujas
condições para o cultivo de microrganismos são difíceis de
reproduzir em laboratório. Foram elaborados diversos iniciadores
para amplificação e sequenciamento de 16S rDNA, alguns são
descritos como específicos para certos táxons, outros foram
desenhados para amplificar todos genes procarióticos de 16S rDNA,
ditos iniciadores universais.
Os fragmentos de 16S rDNA amplificados são submetidos à
eletroforese em gel de agarose, e as bandas que correspondem ao
tamanho esperado são cortadas, purificadas e concentradas. Os
fragmentos de DNA são clonados em plasmídios, como pGEM-T, e
transformados em E. coli obtendo a biblioteca de 16S rDNA.
Entre os iniciadores frequentemente utilizados encontramos: 8F
(forward) (5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) (MARTINEZ-
MURCIA et al., 1995; REYSENBACH; PACE, 1995), 9F (forward)
(5’-GAGTTT GATCCTGGCTCAG-3’) (FARELLY et al., 1995;
HANSEN et al., 1998), 1115R (reverse) (5’-
AGGGTTGCGCTCGTTG-3’) (REYSENBACH; PACE, 1995), 1541R
(reverse) (AAGGAGGTGATCCANCCRCA) (SUZUKI; GIOVANNI,
1996).
Fierer et al. (2007) construíram biblioteca de 16S rDNA de bac‐
térias de diversos solos utilizando os primers Bac8f (5’-
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3’) e Univ529r (5’-
ACCGCGGCKGCTGGC-3’) para as bactérias (BAKER et al., 2003;
REYSENBACH; PACE, 1995) e com os primers Arc21f (5’-
TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3’) e Univ529r para as arqueas. Lim
et al. (2005) amplificaram o gene 16S rDNA do DNA metagenômico
do solo de floresta utilizando os primers 530F (5’–
TGACTGACTGAGTGCCAGCMGCCGCGG-3’) e 1492R-1 (5’-
TGACT GACTGAGGYTACCTTGTTACGMYTT-3’).
Baker et al. (2003) analisaram a especificidade dos primers
utilizados para amplificar 16S rRNA nos estudos da diversidade de
microrganismos nos ambientes e concluíram que nenhum dos
primers usados atualmente é universal e que nenhum único par de
primers pode ser recomendado para amplificar 16SrRNA de todos
os procariotos. As descobertas recentes de novos táxons com
sequências de 16S rDNA não complementares com os iniciadores
universais sugerem que a maioria das bibliotecas atuais não
representam verdadeira biodiversidade de procariontes.
A maioria dos primers específicos para arquea não é eficiente
para amplificação de novos táxons desse domínio, como:
Korarchaeotes e Nanoarchaeum (BAKER et al., 2003). O par de
primers A2Fa (5’- TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3’)/ U1510R (5’-
GGTTACCTTGTTACGA CTT-3’) é frequentemente utilizado para
amplificar 16S rDNA de arqueas das amostras ambientais
(HUGENHOLTZ et al., 1998; REYSENBACH; PACE, 1995). Baker et
al. (2003) desenharam novos iniciadores A571F (5’-
GCYTAAAGSRICCGTAGC-3’)/UA1204R (5’-TTM
GGGGCATRCIKACCT-3’) e A751F (5’-
CCGACGGTGAGRGRYGAA-3’)/UA1406R (5’-
ACGGGCGGTGWGTRCAA- 3’), os quais mostraram-se eficientes
para amplificar 16S rDNA dos diversas táxons de arqueas e de
amostras de DNA de vários ambientes.

6. Ferramentas de Bioinformática utilizadas


nos estudos de metagenoma

Novas abordagens envolvendo a biologia molecular e Bioinfor‐


mática vêm permitindo a bioprospecção in silico a partir de informa‐
ções genômicas geradas por sequenciamento e depositadas em
bancos de dados (NCBI – National Center for Biotechnology
Information1; EMBL – Nucleotide Sequence Database2; DDBJ – DNA
Database of Japan3) (BENSON et al., 2000; TATENO et al., 2002),
para análise de microrganismos sem a necessidade de isolamento e
cultivo, a partir da clonagem direta de DNA de amostras ambientais,
denominada metagenômica (OLIVEIRA et al., 2006).
A metagenômica surge, nesse contexto, como uma estratégia
fundamental para acessar uma microbiota, até então não cultivável
pelas técnicas tradicionais de cultivo, abrindo uma grande
perspectiva de conhecimento de novos grupos microbianos e de
novos produtos bioativos para utilização biotecnológica
(HANDELSMAN, 2004; LORENZ; SCHLEPER, 2002; SCHLOSS;
HANDELSMAN, 2003).
O volume de informações geradas a partir dos dados metage‐
nômicos é analisado pelas ferramentas da Bioinformática (GIBAS;
JAMBECK, 2001), que incrementou o desenvolvimento e o emprego
de bases de dados e programas de análise de sequências de DNA
(genômica) e proteínas (proteômica), contribuindo para acelerar a
análise funcional e comparativa dos genes ou operons clonados
(OLIVEIRA et al., 2006).
A sequência genômica de interesse contida em cada clone pode
ser definida como uma unidade taxonômica operacional (UTO) e
pode ser analisada por programas específicos (GORDON et al.,
1998).
As sequências obtidas dos clones da biblioteca 16S rDNA podem
ser primeiramente analisadas utilizando o algoritmo Pherd (EWING
et al., 1998), que verifica a probabilidade de erros base a base. Em
geral, valor maior que 20 em mais de 200 bases é o mais aceito,
que significa dizer que uma base tem a chance em 100 de estar
errada. Outros programas como Check Chimera (LIM et al., 2005)
ou Ballerophon program (HUBER et al., 2004) são utilizados para
verificar a qualidade das sequências e na procura de artefatos
quiméricos (PEREIRA et al., 2007).
O uso do programa VecScreen4 dentro do maior banco de dados
dos Estados Unidos, GenBank (NCBI), serve para identificar a
sequência do vetor que pode estar junto da sequência alvo, infor‐
mando ao usuário se há ou não contaminação, onde e qual vetor foi
identificado, devendo essa sequência ser retirada (BENSON et al.,
2000).
No NCBI também podemos utilizar o programa ORF Finder
(Open Reading Frame5), que busca os possíveis quadros abertos de
leitura, pois um dos problemas enfrentados com as sequências
geradas é a identificação de genes, isto é, saber onde os mesmos
começam e/ou terminam, ou qual a matriz de leitura correta que irá
gerar a proteína (CARRARO; KITAJIMA, 2002). Nesse caso, o ORF
Finder procura pelo códon de iniciação ATG e os de terminações
(TGA, TAA ou TAG) na sequência analisada, devendo-se colocar a
sequência no formato Fasta no campo apropriado ou digitar o
número de acesso no GenBank.
Outra ferramenta dentro do NCBI é a família de programas Blast
(Basic Local Alignment Search Tool6), BLASTn, BLASTp, BLASTx,
tBLASTn, tBLASTx e BLAST 2 sequence (ALTSCHUL et al., 1990),
que serve para alinhar e comparar sequências depositadas em
bancos de dados.
Para ocorrer a comparação das sequências geradas, é neces‐
sário alinhá-las, isto é, duas sequências são combinadas aleatoria‐
mente, e a qualidade da combinação é avaliada e pontuada e deve
ocorrer até se obter o máximo de combinação e pontuação (GIBAS;
JAMBECK, 2001). O tipo de alinhamento utilizado dependerá do
objetivo da pesquisa; entre eles podemos citar: alinhamentos
globais, localizados e múltiplos.
O software Clustal é indicado para alinhar sequências múltiplas,
não apenas de nucleotídeos, mas também de aminoácidos. As prin‐
cipais versões são Clustal W e Clustal X (THOMPSON et al., 1997).
Para utilizar os programas, basta colocar todas as sequências no
formato Fasta, salvando-as em um arquivo com extensão txt.
Uma árvore filogenética é um gráfico bidimensional que repre‐
senta as relações evolutivas entre os organismos, ou no caso de
sequências, entre os genes específicos de diferentes organismos.
Árvores filogenéticas podem ser construídas utilizando programas
como Phylogeny Interference Package (Phylip), DNADist e Neighbor
(GIBAS; JAMBECK, 2001).
Dados moleculares e suas respectivas análises são bastante
úteis para inferir relações entre os organismos; porém, é necessário
primeiramente saber o que se pretende obter com dados gerados e
só então definir o tipo de programa a ser utilizado.
A Bioinformática deverá gerar novas possibilidades de análises
de dados e diferentes modos de acesso a um número cada vez
mais crescente de informações, que deverão contar com a união de
profissionais das mais diversas áreas.
7. Aplicação metagenômica na Biotecnologia
e agricultura

A metagenômica torna-se cada vez mais promissória frente à


demanda crescente por novas enzimas, biocatalizatores,
detergentes, fármacos e outras substâncias que podem ser usadas
na indústria química, farmacêutica e de alimentos, como também na
agricultura. Vários metabólitos com aplicação biotecnológica têm
sido identificados utilizando análise de bibliotecas metagenômicas
(LORENZ; ECK, 2005).
A triagem funcional de bibliotecas permitiu identificar muitas
enzimas, tais como quitinases (COTTRELL et al., 1999); lipases e
esterases (HENNE et al., 2000; LAMMLE et al., 2007; LEE., 2005;
RHEE et al., 2005; RONDON et al., 2000; VOGET et al., 2003);
amilases (GABOR et al., 2003; LAMMLE et al., 2007;
RICHARDSON et al., 2002; RONDON et al., 2000; VOGET et al.,
2003); protease (GUPTA et al., 2002); b-glucosidades e b-
lactamases (GABOR et al., 2004; SONG et al., 2005); celulases
(VOGET et al., 2003); nitrilases (ROBERTSON et al., 2004); e liases
pécticas (SOLBAK et al., 2005; VOGET et al., 2003).
Em bibliotecas metagenômicas foram detectados os genes das
vias biossintéticas de vitaminas, como os genes de 2,5-diketo-D-
ácido glucônico redutase (biossíntese de vitamina C a partir de
glicose) e operon da síntese de biotina (ENTCHEVA et al., 2001;
ESCHENFELD et al., 2001), como também os genes responsáveis
pela produção de pigmentos indirubina e índigo azul (LIM et al.,
2005).
Vários novos antibióticos e fármacos foram descobertos por
bioprospecção em bibliotecas metagenômicas (BRADY; CLARDY,
2003, 2004; GILLESPIE et al., 2002; LIM et al., 2005).
As bibliotecas do solo são as mais promissoras na detecção de
novos antibióticos produzidos por microrganismos não cultiváveis
(GILLESPIE et al., 2002; RIESENFELD et al., 2004a; STEELE;
STREIT, 2005), como também fornecem muitas informações sobre a
diversidade de mecanismos naturais de resistência aos antibióticos
(RIESENFELD et al., 2004a).
Análise funcional de bibliotecas construídas em E. coli e S.
lividans baseada na detecção da via biossintética da policetídeo
sintetase tipo I, envolvida na produção de antibióticos como
eritromicina, rapamicina e epotilona, resultou na detecção de oito
clones positivos (COURTOIS et al., 2003), com as novas sequências
da policetídio sintetase.
As bibliotecas de microssimbiontes de besouros e esponjas
possuíram 3 e 60 clones com novos tipos de policetídeo sintetase
tipo I, respectivamente (PIEL et al., 2004).
O desenvolvimento de novos agroquímicos via metagenômica
(CORRAN et al., 1998), bem como a possibilidade de identificação
de microrganismos não cultiváveis importantes em fitopatologia, tais
como agentes patogênicos e os organismos que atuam na
supressividade de solos (WELLER et al., 2002), despertam muito
interesse na área de agronomia.
A supressividade de solos pode estar relacionada com a pro‐
dução de substâncias (antibióticos) por microrganismos do solo
envolvidos no processo de antibiose (MAZZOLA, 2004). Análise
funcional da biblioteca metagenômica do solo supressivo para
Rhizoctonia solani (15 mil clones) não detectou nenhum clone com
atividade antagonística contra R. solani; entretanto a análise de
sequências revelou que alguns clones possuíram insertos (cerca de
40 kb) com um potencial para a produção de pollicetídeos (ELSAS
et al., 2008). Uma das três sequências analisadas por Elsas et al.
(2008) foi originada da espécie de Acidobacterium, enquanto outras
não foram identificadas.
Os estudos metagenômicos podem também fornecer uma
contribuição importante para o melhoramento genético de plantas. A
maioria dos genes introduzidos em plantas origina-se de microrga‐
nismos; sendo assim, novos genes descobertos em estudos
metagenômicos podem ser utilizados para desenvolvimento de
plantas com novas características, como resistência a pragas
(DUNWELL, 2005).

8. Referências

ALTSCHUL, S. F.; GISH, W.; MILLER, W.; MYERS, E. W.; LIPMAN, D. J. Basic local
alignment search tool. Journal of Molecular Biology, London, UK, v. 215, n. 3, p. 403-410,
1990.
AMORIM, J. H.; MACENA, T. N. S.; LACERDA-JUNIOR, G. V.; REZENDE, R. P.; DIAS, J.
C. T.; BRENDEL, M.; CASCARDO, J. C. M. An improved extraction protocol for
metagenomic DNA from a soil of the Brazilian Atlantic Rainforest. Genetics and Molecular
Research, Ribeirão Preto, v. 7, n. 4, p. 1226-1232, 2008.
BAKER, G. C.; BEEBEE, T. J. C.; RAGAN, M. A. Prothoteca richardsi, a pathogen of
anuran larvae, is related to a clade of protistan parasites near the animal-fungal divergence.
Microbiology, Reading, v. 145, p. 1777-1784, 1999.
BAKER, G. C.; SMITH, J. J.; COWAN, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S
primers. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, NL, v. 55, p. 541-555, 2003.
BENSON, D. A.; KARSCH-MIZRACHI, I.; LIPMAN, D. J.; OSTELL, J.; RAPP, B. A.;
WHEELER, D. L. GeneBank. Nucleic Acids Research, London, UK, v. 28, p. 15-18, 2000.
BLACK, J.; FYFE, A. M.; DAVIES, J. K. A promoter associated with the neisserial repeat
can be used to transcribe the uvrB gene from Neisseria gonorrhoeae. Journal of
Bacteriology, Washington, DC, v. 177, p. 1952-1958, 1995.
BRADY, S. F.; CLARDY, J. Synthesis of long-chain fatty acid enol esters isolated from an
environmental DNA clone. Organic Letters, Washington, DC, v. 5, p. 121-124, 2003.
BRADY, S. F.; CLARDY, J. Palmitoylputrescine, an antibiotic isolated from the heterologous
expression of DNA extracted from bromeliad tank water. Journal of Natural Products,
Cincinnati, v. 67, p. 1283-1286, 2004.
BURGMANN, H.; PESARO, M.; WIDMER, F.; ZEYER, J. A strategy for optimizing quality
and quantity of DNA extracted from soil. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam,
NL, v. 45, p. 7-20, 2001.
BORNEMAN, J.; SKROCH, P. W.; O’SULLIVAN, K. M.; PALUS, J. A.; RUMJANEK, N. G.;
JANSEN, J. L.; NIENHUIS, J.; TRIPLETT, E. W. Molecular microbial diversity of an
agricultural soil in Wisconsin. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v.
62, n. 6, p. 1935-1943, 1996.
CARRARO, D. M.; KITAJIMA, J. P. Sequênciamento e bioinformática de genomas
bacterianos. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, Uberlândia, v. 28, p. 16-20, 2002.
CORRAN, A. J.; RENWICK, A.; DUNBAR, S. J. Approaches to in-vitro lead generation for
fungicide invention. Pesticide Science, Oxford, v. 54, p. 338-344, 1998.
COTTRELL, M. T.; MOORE, J. A.; KIRCHMAN, D. L. Chitinases from uncultured marine
microorganisms. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 65, p. 2553-
2557, 1999.
COURTOIS, S.; CAPPELLANO, C. M.; BALL, M.; FRANCOU, F.-X.; NORMAND, P.;
HELYNCK, G.; MARTINEZ, A.; KOLVEK, S. J.; HOPKE, J.; OSBURNE, M. S.; AUGUST, P.
R.; NALIN, R.; GUÉRINEAU, M.; JEANNIN, P.; SIMONET, P.; PERNODET, J.-L.
Recombinant environmental libraries provide access to microbial diversity for drug
discovery from natural products. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC,
v. 69, p. 49-55, 2003.
CURTIS, T. P.; SLOAN, W. T.; SCANNELL, J. W. Estimating prokaryotic diversity and its
limits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
Washington, DC, v. 99, p. 10494-10499, 2002.
DANIEL, R. The metagenomics of soil. Nature Reviews Microbiology, London, UK, v. 3, p.
470-478, 2005.
DOOLITTLE, W. F. Phylogenetic classification and the universal tree. Science, London, UK,
v. 284, p. 2124-2129, 1999.
DUNBAR, J.; KAKALA, S.; BARNS, S. M.; DAVIS, J. A.; KUSKE, C. R. Levels of bacterial
community diversity in four arid soils compared by cultivation and 16S rRNA gene cloning.
Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 65, p. 1662-1669, 1999.
DUNWELL, J. M. Transgenic crops: the current and next generations. Methods in Molecular
Biology, New York, v. 286, p. 377-398, 2005.
ELEND, C.; SCHMEISSER, C.; LEGGEWIE, C.; BABIAK, P.; CARBALLEIRA, J. D.;
STEELE, H. L.; REYMOND, J. L.; JAEGER, K. E.; STREIT, W. R. Isolation and biochemical
characterization of two novel metagenome-derived esterases. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, DC, v. 72,
p. 3637-3645, 2006.
ELSAS, J. D. van; SPEKSNIJDER, A. J.; OVERBEEK, L. S. A procedure for the
metagenomics exploration of disease-suppressive soils. Journal of Microbiological Methods,
Amsterdam, NL, v. 75, p. 512-522, 2008.
ENTCHEVA, P.; LIEBL, W.; JOHANN, A.; HARTSCH, T.; STREIT, W. R. Direct cloning from
enrichment cultures, a reliable strategy for isolation of complete operons and genes from
microbial consortia. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 67, p. 89-
99, 2001.
ESCHENFELD, W. H.; STOLS, L.; ROSENBAUM, H.; KHAMBATTA, Z. S.; QUAITE-
RANDALL, E.; WU, S.; KILGORE, D. C.; TRENT, J. D.; DONNELLY, M. I. DNA from
uncultured organisms as a source of 2,5-diketo-D-gluconic acid reductases. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 67, p. 4206-4214, 2001.
EWING, B.; HILLIER, L.; WENDL, M. C.; GREEN, P. Base-calling of automated sequencer
traces using phred: I. accuracy assessment. Genome Research, Heidelberg, v. 8, n. 3, p.
175-185, 1998.
EYERS, L.; GEORGE, I.; SCHULER, L.; STENUIT, B.; AGATHOS, S. N.; EL FANTROUSSI,
S. Environmental genomics: exploring the unmined richness of microbes to degrade
xenobiotics. Applied Microbiology and Biotechnology, Berlin, DE, v. 66, p. 123-130, 2004.
FARELLY, V.; RAINEY, F. A.; STACKEBRANDT, E. Effect of genome size and rrn gene copy
number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species.
Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 61, p. 2798-2801, 1995.
FERREYRA, R. G. F.; SONCINI, F. C.; VIALE, A. M. Cloning, characterization, and
functional expression in Escherichia coli of chaperonin (groESL) genes from the
prototrophic sulfur bacterium Chromatium vinosum. Journal of Bacteriology, Washington,
DC, v. 175, p. 1514-1523, 1993.
FIERER, N.; BREITBART, M.; NULTON, J.; SALAMON, P.; LOZUPONE, C.; JONES, J.;
ROBESON, M.; EDWARDS, R. A.; FELTS, B.; RAYHAWK, S.; KNIGHT, R.; ROHWER, F.;
JACKSON, R. B. Metagenomic and small-subunit rRNA analyses reveal the genetic
diversity of bacteria, archaea, fungi, and viruses in soil. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, DC, v. 73, p. 7059-7066, 2007.
GABOR, E. M.; VRIES, E. J. de; JANSSEN, D. B. Efficient recovery of environmental DNA
for expression cloning by indirect extraction methods. FEMS Microbiology Ecology, Haren,
v. 44, p. 153-163, 2003.
GABOR, E. M.; VRIES, E. J. de; JANSSEN, D. B. Construction, characterization, and use of
small-insert gene banks of DNA isolated from soil and enrichment cultures for the recovery
of novel amidases. Environmental Microbiology, Malden, v. 6, p. 948-958, 2004.
GIBAS, C.; JAMBECK, P. Desenvolvendo bioinformática: ferramentas de software para
aplicações em biologia. Rio de Janeiro: Campus, 2001.
GILLESPIE, D. E.; BRADY, S. F.; BETTERMANN, A. D.; CIANCIOTTO, N. P.; LILES, M. R.;
RONDON, M. R.; CLARDY, J.; GOODMAN, R. M.; HANDELSMAN, J. Isolation of antibiotics
turbomycin A and B from a metagenomic library of soil microbial DNA. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 68, p. 4301-306, 2002.
GORDON, D.; ABAJIAN, C.; GREEN, P. Consed: a grafic tool for sequence finishing.
Genome Research, Heidelberg, v. 8, p. 195-202, 1998.
GUPTA, R.; BEG, Q. K.; LORENZ, P. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches
and industrial applications. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 59,
p. 15-32, 2002.
HANDELSMAN, J. Metagenomics: application of Genomics to uncultured microorganisms.
Microbiology and Molecular Biology Reviews, Washington, DC, v. 68, p. 669-685, 2004.
HANDELSMAN, J.; RONDON, M. R.; BRADY, S. F.; CLARDY, J.; GOODMAN, R. M.
Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for
natural products. Chemistry & Biology, Cambridge, v. 5, n. 10, p. 245-249, 1998.
HANSEN, M. C.; TOLKER-NEILSON, T.; GIVSKOV, M.; MOLIN, S. Biased 16S rDNA PCR
amplication caused by interference from DNA flanking template region. FEMS Microbiology
Ecology, Haren, v. 26, p. 141-149, 1998.
HENNE, A.; DANIEL, R.; SCHMITZ, R. A.; GOTTSCHALK, G. Construction of
environmental DNA libraries in Escherichia coli and screening for the presence of genes
conferring utilization of 4-hydroxybutyrate. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, DC, v. 65, p. 3901-3907, 1999.
HENNE, A.; SCHMITZ, R. A.; BOMEKE, M.; GOTTSCHAK, G.; DANIEL, R. Screening of
environmental DNA libraries for the presence of genes conferring lipolytic activity on
Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 66, p. 3113-
3116, 2000.
HERRERA, A.; COCKELL, C. S. Exploring microbial diversity in volcanic environments: a
review of methods in DNA extraction. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, NL,
v. 70, p. 1-12, 2007.
HUANG, L.-N.; ZHU, S.; ZHOU, H.; QU, L.-H. Molecular phylogenetic diversity of bacteria
associated with the leachate of a closed municipal solid waste landfill. FEMS Microbiology
Letters, Haren, v. 242, p. 297-303, 2005.
HUBER, T.; FAULKNER, G.; HUGENHOLTZ, P. Bellerophon: a program to detect chimeric
sequences in multiple sequence alignments. Bioinformatics, Oxford, v. 20, p. 2317-2319,
2004.
HUGENHOLTZ, P.; GOEBEL, B. M.; PACE, N. R. Impact of culture independent studies on
the emerging phylogenetic view of bacterial diversity. Journal of Bacteriology, Washington,
DC, v. 180, p. 4765-4774, 1998.
LAKAY, F. M.; BOTHA, A.; PRIOR, B. A. Comparative analysis of environmental DNA
extraction and purification methods from different humic acid-rich soils. Journal of Applied
Microbiology, Danvers, v. 102, p. 265-273, 2007.
LAMMLE, K.; ZIPPER, H.; BREUER, M.; HAUER, B.; BUTA, C.; BRUNNER, H.; RUPP, S.
Identification of novel enzymes with different hydrolytic activities by metagenome
expression cloning. Journal of Biotechnology, Amsterdam, NL, v. 127, p. 575-592, 2007.
LEE, S.-W. Metagenome, the untapped microbial genome, toward discovery of novel
microbial resources and application into the plant pathology. Plant Pathology, London, UK, v.
21, n. 2, p. 93-98, 2005.
LI, Y.; WEXLER, M.; RICHARDSON, D. J.; BOND, P. L.; JOHNSTON, A. W. B. Screening a
wide host-range, waste-water metagenomic library in tryptophan auxotrophs of Rhizobium
leguminosarum and of Escherichia coli reveals different classes of cloned trp genes.
Environmental Microbiology, Malden, v. 7, p. 1927-1936, 2005.
LILES, M. R.; MANSKE, B. F.; BINTRIM, S. B.; HANDELSMAN, J.; GOODMAN, R. M. A
census of rRNA genes and linked genomic sequences within a soil metagenomic library.
Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 69, p. 2684-691, 2003.
LIM, H. K.; CHUNG, E. J.; KIM, J. C.; CHOI, G. J.; JANG, K. S.; CHUNG, Y. R.; CHO, K. Y.;
LEE, S. W. Characterization of a forest soil metagenome clone that confers indirubin and
indigo production on Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, DC, v. 71, p. 7768-7777, 2005.
LORENZ, P.; SCHLEPER, C. Metagenome: a challenging source of enzyme discovery.
Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, Delft, v. 19, n. 20, p. 13-19, 2002.
LORENZ, P.; ECK, J. Metagenomics and industrial applications. Nature, London, UK, v. 3,
p. 510-516, 2005.
MARTIN, J. F. Clusters of genes for the biosynthesis of antibiotics: regulatory genes and
overproduction of pharmaceuticals. Journal of Industrial Microbiology, Amsterdam, NL, v. 9,
p. 73-90, 1992.
MARTIN-LAURENT, F.; PHILIPPOT, L.; HALLET, S.; CHAUSSOD, R.; GERMON, J. C.;
SOULAS, G.; CATROUX, G. DNA extraction from soils: old bias for new microbial diversity
analysis methods. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 67, n. 5, p.
2354-2359, 2001.
MARTINEZ-MURCIA, A. J.; ACINAS, S. G.; RODRIGUEZ-VALERA, F. Evaluation of
prokaryotic diversity by restrictase digestion of 16S rDNA directly amplified from hypersaline
environments. FEMS Microbiology Ecology, Haren, v. 17, p. 247-256, 1995.
MAZZOLA, M. The science and art of plant-disease diagnosis. Annual Review of
Phytopathology, Palo Alto, v. 42, p. 33-59, 2004.
MILLER, D. N.; BRYANT, J. E.; MADSEN, E. L.; GHIORSE, W. C. Evaluation and
optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples.
Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 65, n. 11, p. 4715-4724, 1999.
OLIVEIRA, V. M. de; SETTE, L. D.; FANTINATTI-GARBOGGINI, F. Preservação e
prospecção de recursos microbianos. 2006. Disponível em:
<www.multiciencia.unicamp.br/artigos_07/a_08_7.pdf>. Acesso em: 27 fev. 2009.
ORSINI, M.; ROMANO-SPICA, V. A microwave-based method for nucleic acid isolation
from environmental samples. Letters in Applied Microbiology, Oxford, v. 33, p. 17-20, 2001.
PEREIRA, M. S.; MEDEIROS, S. R. B.; LIMA, L. F. A.; BLAHA, C. A. G. Detecção de
bactérias alcanotróficas em solos e sedimentos de mangue da Bacia Petrolífera Potiguar.
In: PDPETRO, 4., 2007, Campinas. Anais... Campinas: ABPG, 2007. p. 421-424.
PIEL, J. A polyketide synthase peptide synthetase gene cluster from an uncultured bacterial
symbiont of Paederus beetles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, Washington, DC, v. 99, p. 14002-14007, 2002.
PIEL, J.; HUI, D.; FUSETANI, N.; MATSUNAGA, S. Targeting modular polyketide synthases
with iteratively acting acyltransferases from metagenomes of uncultured bacterial consortia.
Environmental Microbiology, Malden, v. 68, p. 4301-4306, 2004.
PIRES, E. S.; TEIXEIRA, K. R. S. Construção de bibliotecas de genes para 16s RNAr a
partir de amostras ambientais. Revista Universidade Rural, Série Ciências da Vida,
Seropédica, v. 24, n. 2, p. 41-45, 2004.
QUAISER, A.; OCHSENREITER, T.; LANZ, C.; SCHUSTER, S. C.; TREUSCH, A. H.; ECK,
J.; SCHLEPER, C. Acidobacteria form a coherent but highly diverse group within the
bacterial domain: evidence from environmental genomics. Molecular Microbiology, Oxford,
v. 50, p. 563-575, 2003.
RAJENDHRAN, J.; GUNASEKARAN, P. Strategies for accessing soil metagenome for
desired applications. Biotechnology Advances, Oxford, v. 26, p. 576-590, 2008.
REYSENBACH, A.-L.; PACE, N. R. Reliable amplification of hyperthermophilic archaeal
16S rRNA genes by the polymerase chain reaction. In: ROBB, F. T.; PLACE, A. R. (Ed.).
Archaea: a laboratory manual: Thermophiles. New York: Cold Spring Harbour Laboratory
Press, 1995. p. 101-107.
RHEE, J. K.; AHN, D. G.; KIM, Y. G.; OH, J. W. New thermophilic and thermostable
esterase with sequence similarity to the hormone-sensitive lipase family, cloned from a
metagenomic library. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 71, p.
817-825, 2005.
RICHARDSON, T. H.; TAN, X.; FREY, G.; CALLEN, W.; CABELL, M.; LAM, D.;
MACOMBER, J.; SHORT, J. M.; ROBERTSON, D. E.; MILLER, C. A novel, high
performance enzyme for starch liquefaction: discovery and optimization of a low pH,
thermostable alpha-amylase. Journal of Biological Chemistry, Baltimore, v. 277, p. 26501-
26507, 2002.
RIESENFELD, C. S.; GOODMAN, R. M.; HANDELSMAN, J. Uncultured soil bacteria are a
reservoir of new antibiotic resistance genes. Environmental Microbiology, Malden, v. 6, p.
981-989, 2004a.
RIESENFELD, C. S.; SCHLOSS, P. D.; HANDELSMAN, J. Metagenomics: genomic
analysis of microbial communities. Annual Review of Genetics, Palo Alto, v. 38, p. 525-552,
2004b.
ROBE, P.; NALIN, R.; CAPELLANO, C.; VOGEL, T. M.; SIMONET, P. Extraction of DNA
from soil. European Journal of Soil Biology, Braunschweig, v. 39, p. 183-190, 2003.
ROBERTSON, D. E.; CHAPLIN, J. A.; DESANTIS, G.; PODAR, M.; MADDEN, M.; CHI, E.;
RICHARDSON, T.; MILAN, A.; MILLER, M.; WEINER, D. P.; WONG, K.; MCQUAID, J.;
FARWELL, B.; PRESTON, L. A.; TAN, X.; SNEAD, M. A.; KELLER, M.; MATHUR, E.;
KRETZ, P. L.; BURK, M. J.; SHORT, J. M. Exploring nitrilase sequence space for
enantioselective catalysis. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 70,
n. 4, p. 2429-2436, 2004.
ROH, C.; VILLATTE, F.; BYUNG-GEE, K.; SCHMID, R. D. Comparative study of methods
for extraction and purification of environmental DNA from soil and sludge samples. Applied
Biochemistry and Biotechnology, Totowa, v. 134, p. 97-112, 2006.
RONDON, M. R.; GOODMAN, R. M.; HANDELSMAN, J. The Earth’s bounty: assessing and
accessing soil microbial diversity. Trends in Biotechnology, Amsterdam, NL, v. 17, p. 403-
409, 1999.
RONDON, M. R.; AUGUST, P. R.; BETTERMANN, A. D.; BRADY, S. F.; GROSSMAN, T. H.;
LILES, M. R.; LOIACONO, K. A.; LYNCH, B. A.; MACNEIL, I. A.; MINOR, C.; TIONG, C. L.;
GILMAN, M.; OSBURNE, M. S.; CLARDY, J.; HANDELSMAN, J.; GOODMAN, R. M.
Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity
of uncultured microorganisms. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v.
66,
p. 2541-2547, 2000.
ROOSE-AMSALEG, C. L.; GARNIER-SILLAM, E.; HARRY, M. Extraction and purification of
microbial DNA from soil and sediment samples. Applied Soil Ecology, Amsterdam, NL, v. 18,
p. 47-60, 2001.

SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd
ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
SANTOS, S. T.; DIREITO, I. C. N.; TEIXEIRA, K. R. S. Isolamento e amplificação de DNA de
amostras de solo como ferramenta para avaliar a diversidade das populações de bactérias em
solos agrículas. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, 2002. 36 p. (Embrapa Agrobiologia.
Documentos, 148). Disponível em:
<http://www.cnpab.embrapa.br/publicacoes/download/doc148.pdf>. Acesso em: 25 fev.
2009.
SCHLOSS, P. D.; HANDELSMAN, J. Biotechnological prospects from metagenomics.
Current Opinion in Biotechnology, London, UK, v. 14, p. 303-310, 2003.
SHIZUYA, H.; SIMON, M. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments
of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, DC, v. 89, p.
8794-8797, 1992.
SOLBAK, A. I.; RICHARDSON, T. H.; MCCANN, R. T.; KLINE, K. A.; BARTNEK, F.;
TOMLINSON, G.; TAN, X.; PARRA-GESSERT, L.; FREY, G. J.; PODAR, M.; LUGINBUHL,
P.; GRAY, K. A.; MATHUR, E. J.; ROBERTSON, D. E.; BURK, M. J.; HAZLEWOOD, G. P.;
SHORT, J. M.; KEROVUO, J. Discovery of pectin-degrading enzymes and directed
evolution of a novel pectate lyase for processing cotton fabric. Journal of Biological
Chemistry, Baltimore, v. 280, p. 9431-9438, 2005.
SONG, J. S.; JEON, J. H.; LEE, J. H.; JEONG, S. H.; JEONG, B. C.; KIM, S. J.; LEE, S. H.
Molecular characterization of TEM-type betalactamases identified in cold-seep sediments of
Edison Seamount (south of Lihir Island, Papua New Guinea). Journal of Microbiology,
Seoul, KR, v. 43, p. 172-178, 2005.
SOSIO, M.; GIUSINO, F.; CAPPELLANO, C.; BOSSI, E.; PUGLIA, A. M.; DONADIO, S.
Artificial chromosomes for antibiotic-producing actinomycetes. Nature Biotechnology, New
York, v. 8, p. 343-345, 2000.
STEELE, H. L.; STREIT, W. R. Metagenomics: advances in ecology and biotechnology.
FEMS Microbiology Letters, Haren, v. 247, p. 105-111, 2005.
STREIT, W. R.; SCHMITZ, R. A. Metagenomics-the key to the uncultured microbes. Current
Opinion in Microbiology, New York, v. 75, p. 492-498, 2004.
STROHL, W. R. Compilation and analysis of DNA sequences associated with apparent
streptomycete promoters. Nucleic Acids Research, London, UK, v. 20, n. 5, p. 961-974, 1992.
SUZUKI, M. T.; GIOVANNI, S. J. Bias caused by template annealing in the amplification of
mixtures of 16S rRNA genes by PCR. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, DC, v. 62, p. 625-630, 1996.
TATENO, Y.; IMANISHI, T. MIYAZAKI, S.; FUKAMI-KOBAYASHI, K.; SAITOU, N.;
SUGAWARA, H.; GOJOBORI, T. DNA data bank of Japan (DDBJ) for genoma scale
research in life science. Nucleic Acids Research, London, UK, v. 30, p. 27-30, 2002.
THOMPSON, J. D.; GIBSON, T. J.; PLEWNIAK, F.; JEANMOUGIN, F.; HIGGINS, D. G. The
CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by
quality analysis tools. Nucleic Acids Research, London, UK, v. 25, n. 24, p. 4876-4882, 1997.
TORSVIK, V. L. Isolation of bacterial DNA from soil. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v.
12, p. 15-21, 1980.
TORSVIK, V.; DAAE, F. L.; SANDAA, R. A.; OVREÅS, L. Novel techniques for analysing
microbial diversity in natural and perturbed environments. Journal of Biotechnology,
Amsterdam, NL, v. 64, p. 53-62, 1998.
TORSVIK, V.; OVREÅS, L. Microbial diversity and function in soil: from genes to
ecosystems. Current Opinion in Microbiology, New York, v. 5, p. 240-245, 2002.
TREUSCH, A. H.; KLETZIN, A.; RADDATZ, G.; OCHSENREITER, T.; QUAISER, A.;
MEURER, G.; SCHUSTER, S. C.; SCHLEPER, C. Characterization of large-insert DNA
libraries from soil for environmental genomic studies of Archaea. Environmental
Microbiology, Malden, v. 6, p. 970-980, 2004.
TSAI, Y. L.; OLSON, B. H. Rapid method for separation of bacterial DNA from humic
substances in sediments for polymerase chain reaction. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, DC, v. 58, p. 2292-2295, 1992.
TYSON, G. W.; CHAPMAN, J.; HUGENHOLTZ, P.; ALLEN, E. E.; RAM, R. J.;
RICHARDSON, P. M.; SOLOVYEV, V. V.; RUBIN, E. M.; ROKHSAR, D. S.; BANFIELD, J. F.
Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the
environment. Nature, London, UK, v. 428, p. 37-43, 2004.
VOGET, S.; LEGGEWIE, C.; UESBECK, A.; RAASCH, C.; JAEGER, K. E.; STREIT, W. R.
Prospecting for novel biocatalysts in a soil metagenome. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, DC, v. 69, p. 6235-6242, 2003.
VOLOSSIOUK, T.; ROBB, E. J.; NAZAR, R. N. Direct DNA extraction for CR-mediated
assays of soil organisms. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 61,
p. 3972-3976, 1995.
WANG, G. Y.; GRAZIANI, E.; WATERS, B.; PAN, W.; LI, X.; MCDERMOTT, J.; MEURER,
G.; SAXENA, G.; ANDERSEN, R. J.; DAVIES, J. Novel natural products from soil DNA
libraries in a streptomycete host. Organic Letters, Washington, DC, v. 2, p. 2401-2404,
2000.
WELLER, D. M.; RAAIJMAKERS, J. M.; GARDENER, B. B.; THOMASHOW, L. S. Microbial
populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens. Annual Review
of Phytopathology, Palo Alto, v. 40, p. 309-348, 2002.
WHITEHOUSE, C. A.; HOTTEL, H. E. Comparison of five commercial DNA extraction kits
for the recovery of Francisella tularensis DNA from spiked soil samples. Molecular and
Cellular Probes, New York, v. 21, n. 2, p. 92-96, 2007.
WILSON, I. G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 63, p. 3741-3751, 1997.
YEATES, C.; GILLINGS, M. R.; DAVISON, A. D.; ALTAVILLA, N.; VEAL, D. A. Methods for
microbial DNA extraction from soil for PCR amplification. Biological Procedures Online, New
York, v. 1, n. 1, p. 40-47, 1998.
XAVIER, G. R.; SILVA, F. V.; ZILLI, J. E.; RUMJANEK, N. G. Adaptação de método para
extração de DNA de microrganismos associados a raízes de plantas. Seropédica: Embrapa
Agrobiologia, 2004. 24 p. (Embrapa Agrobiologia. Documentos, 171). Disponível em:
<http://www.cnpab.embrapa.br/servicos/download/doc171.pdf>. Acesso em: 25 fev. 2009.
Parte 4
Microrganismos promotores do
crescimento de plantas
Capítulo 1
Bactérias promotoras do
crescimento de plantas: estratégia
para uma agricultura sustentável
Márcia do Vale Barreto Figueiredo
Júlia Kuklinsky Sobral
Tânia Lucia Montenegro Stamford
Janete Magali de Araújo

1. Introdução

1.1. Bactérias promotoras do crescimento de plantas


(BPCPs)

A utilização de bactérias promotoras do crescimento de plantas


(BPCPs), para o aumento da produção agrícola, será provavelmente
uma das táticas mais importantes para a atualidade no mundo. Isso
se deve à demanda emergente para a diminuição da dependência
de fertilizantes químicos e a necessidade de desenvolvimento da
agricultura sustentável (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Bactérias em habitats naturais colonizam o interior e exterior de
órgãos de plantas e podem ser benéficas, neutras ou prejudiciais ao
seu crescimento (MARIANO et al., 2004). As BPCPs estimulam dire
tamente a fixação de nitrogênio (HAN et al., 2005), podem ser
capazes de solubilizar nutrientes (RODRÍGUEZ; FRAGA, 1999),
produzir hormônios de crescimento por meio da presença de 1-
amino-ciclopropano-1-carboxilato (ACC) deaminase (DONATE-
CORREA et al., 2004); ácido indol acético (AIA) (CATTELAN, 1999)
e indiretamente por antagonismo a fungos patogênicos, produção de
sideróforos, quitinase, b-1,3-glucanase, antibióticos, pigmentos
fluorescentes, e cianetos (RENWICK et al., 1991).
Pesquisas vêm sendo desenvolvidas no intuito de se conhecer
cada vez mais as potencialidades das BPCPs. Rodríguez-Díaz et al.
(2004), em estudo realizado na Antártica, encontraram três novas
espécies de Paenibacillus (P. cineris, P. cookii e P. wynnii), fixadores
de nitrogênio atmosférico. Seldin (2008) relata que, dentre as 89
espécies e 2 subespécies de Paenibacillus descritas na literatura, 14
possuem estirpes com a capacidade de fixar o nitrogênio atmos‐
férico; são elas: P. polymyxa, P. macerans, P. peoriae, P. graminis, P.
odorifer, P. brasilensis, P. durus, P. borealis, P. wynnii, P.
massiliensis, P. sabinae, P. zanthoxyli, P. donghaensis e P.
forsythiae.
Pesquisas sobre aplicações práticas de BPCPs têm tido sucesso
na medida em que já existem produtos comerciais à base dessas
bactérias nos Estados Unidos, China, Austrália, País de Gales e
Nova Zelândia (LUZ, 1996). Na China, BPCPs são chamadas Yield
incresing bactéria (YIB), sendo aplicadas extensivamente no campo,
chegando a induzir aumentos médios de cerca de 21% em
produtividade.
O papel dos microrganismos endofíticos nas plantas tem sido
muito discutido; e embora pouco entendido, uma associação simbió‐
tica têm sido sugerida (CREWS et al., 2004). Algumas bactérias
endofíticas antagonistas têm sido testadas para o controle biológico
de fungos fitopatogênicos (CHEN et al., 1995).
A grande vantagem dessas bactérias com relação às epifíticas é
o fato de colonizarem internamente as plantas, um habitat protegido
onde exercem mecanismos diversos (PEIXOTO NETO et al., 2002).
Mendes e Azevedo (2007) sugerem, dentro da definição de micror‐
ganismos endofíticos, a divisão de endofíticos em dois tipos: a) tipo
I, os que não produzem estruturas externas à planta, e b) tipo II, os
que produzem estruturas externas à planta.
Tem sido demonstrado que estirpes isoladas de uma espécie
vegetal são mais aptas a se restabelecer nas raízes, quando
inoculadas na mesma espécie vegetal, sendo denominadas estirpes
homólogas (BALDANI; BALDANI, 2005). Além disso, admite-se ser
o genótipo da planta fator-chave para obtenção dos benefícios
causados por bactérias diazotróficas endofíticas (REIS et al., 2000).
Lacava et al. (2008) relatam que os microrganismos endofíticos são
uma nova fonte para busca de moléculas bioativas de interesse em
diversas áreas, como as indústrias farmacêuticas e agrícolas.

1.2. Coinoculação: bactérias promotoras do crescimento


de plantas (BPCPs) e rizóbios

Li e Alexander (1988) conseguiram incrementar a colonização e


a nodulação de soja, por meio da coinoculação de Bradyrhizobium
japonicum com bactérias do gênero Bacillus, produtoras de antibió‐
ticos. Outros relatos demonstram efeitos positivos na nodulação
pela coinoculação de rizóbio com outras espécies de bactérias
(FIGUEIREDO et al., 2007; SILVA et al., 2006, 2007). Essa
contribuição foi relacionada com a produção de fito-hormônios,
pectinase ou sinais moleculares em Bacillus cereus (HALVERSON;
HANDELSMAN, 1991) e outras espécies de microrganismos
(DAKORA, 2003).
Estudos de coinoculação com BPCP e rizóbios têm apresentado
aumento na nodulação e fixação do N2 (ARAÚJO; HUNGRIA, 1999;
FIGUEIREDO et al., 2008; LI; ALEXANDER, 1988; SILVA et al.,
2006; VESSEY; BUSS, 2002). A coinoculação de Bradyrhizobium
com estirpe de Bacillus resultou no aumento da nodulação da Vigna
unguiculata (Figura 1). Trabalhos conduzidos por Sindhu et al.
(2002) também encontraram aumento na nodulação e crescimento
da Vigna radiata.
Figura 1. Raízes de caupi (Vigna unguiculata [L.] Walp.) cv IPA 205 nodulada, inoculada
com Bradyrhizobium sp. (BR 3267) (B) e coinoculada com Bradyrhizobium sp. + Bacillus
subtilis 434(C1) (B+434). Experimento desenvolvido em casa de vegetação do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA) em vasos de Leonard com areia + vermiculita na propor‐
ção 2:1.
Foto: Márcia do Vale Barreto Figueiredo

A variedade de microrganismos, incluindo espécies de Bacillus e


Pseudomonas, é comumente encontrada na rizosfera de plantas
leguminosas e não leguminosas (LI; ALEXANDER, 1988). Em
virtude da rápida colonização desses microrganismos na rizosfera e
estimulação no crescimento da planta, existe considerável interesse
em pesquisar esses e/ou outros microrganismos existentes na
rizosfera visando otimizar a produção da cultura de interesse.
Aumento na nodulação e benefícios nas plantas são encontrados
em diferentes culturas, tais como feijão (CAMACHO et al., 2001;
FIGUEIREDO et al., 2007, 2008; SRINIVASAN et al., 1996); soja
(LAMBRECHT et al., 2000; VESSEY; BUSS, 2002); caupi (SILVA et
al., 2006, 2007); e ervilha (COOPER; LONG, 1994).
Araújo e Hungria (1999) demonstraram a viabilidade da coino‐
culação em semente de soja, de metabólitos brutos ou formulados
ou, ainda, de células de Bacillus subtilis, para incrementar a contri‐
buição do processo de FBN.
Silva et al. (2007) verificaram que houve estímulo na nodulação
específica do caupi coinoculado com Bradyrhizobium sp. (BR2001),
Paenibacillus polymyxa (Loutit L) e Bacillus sp. (LBF-410), eviden‐
ciado pela correlação positiva entre nitrogênio acumulado/ matéria
seca da raiz (MSR) e nodulação específica. Efeitos indireto e direto
na nodulação específica foram mostrados pela diminuição
significativa do crescimento da raiz (40%) e pelo aumento não
significativo do número de nódulos (46%) nas estirpes Loutit (L.) de
P. polymyxa e na LBF-410 de P. macerans.
Em relação ao aumento nas concentrações de macro e microe‐
lementos, Silva et al. (2006), em estudos utilizando diferentes mé‐
todos de inoculação, verificaram que a coinoculação no caupi com
estirpes de Bradyrhizobium sp. (BR 2001) e Paenibacillus polymyxa
(Loutit L) introduzidas no solo proporciona aumentos nas concen‐
trações de cálcio, ferro e fósforo na parte aérea das plantas.

1.3. Contribuição dos rizóbios como promotores de


crescimento e mediadores de nutrientes

Segundo Dakora (2003), as maiores contribuições feitas separa‐


damente por leguminosas e seus microssimbiontes que não estão
relacionadas com a fixação de N2 nos nódulos da raiz têm sido igno‐
radas. O rizóbio produz moléculas químicas que podem influenciar o
desenvolvimento das plantas, incluindo fito-hormônios, fator Nod,
lumicroma, riboflavina e evolução do H2 por nitrogenase (Tabela 1).
Quando presente no solo, o fator Nod pode estimular as
leguminosas e não leguminosas por diferentes formas.
Os sinais moleculares excretados pelas raízes da planta hos‐
pedeira ativam a expressão dos genes de nodulação, pelo rizóbio,
resultando na produção de fatores Nod (SUGAWARA et al., 2006).
Além disso, têm sido verificados sinais hormonais da planta (sinais
endógenos) que também são importantes para o estabelecimento
da simbiose (HIRSCH et al., 1997). Os fatores Nod são
responsáveis, em baixa concentração, pela síntese de proteínas
denominadas nodulinas, que desempenham papel importante na
formação e manutenção do nódulo radicular (ALMARAZ et al.,
2007). O rizóbio é conhecido por formar nódulos em leguminosas
pela simbiose (micro e macrossimbionte), além de suprimir a
população de patógenos no solo.
Tabela 1. Moléculas de rizóbios com potencial para promoção de crescimento em sistema de cultivo.

Composto rizobiano Papel funcional Referência


Estimula a germinação das sementes Zhang e Smith (2001)
Promove o desenvolvimento das plântulas Smith et al. (2002)
Aumenta a taxa de fotossíntese foliar
Induz a expressão dos genes Smith et al. (2002)
Fator Nod (Nod factor) Spaink e Lugtenberg
flavonoides
Estimula a colonização da raiz por fungo (1991)
micorrízico arbuscular Xie et al. (1995)
Causa divisão das células e embriogênese Spaink (1996)

Lumicroma Estimula o desenvolvimento das plântulas


Phillips et al. (1999)
(Lumichrome) Estimula a produção de CO2 nas raízes

Riboflavina (Riboflavin) Serve de vitaminas para plantas e bactéria West e Wilson (1938)
Promove populações microbianas no solo
Evolução do H2 por
Estimula a diversidade de fauna no solo Dong e Layzell (2001)
nitrogenase Aumenta o C no solo
Fonte: adaptado por Dakora (2003).

2. Identificação e caracterização de bactérias


endofíticas promotoras do crescimento de
plantas
2.1. Identificação de BPCPs

Os microrganismos apresentam imensa diversidade genética e


desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de
ecossistemas, como componentes fundamentais de cadeias
alimentares e ciclos biogeoquímicos (MYERS, 1996). Apesar de sua
grande importância, o número de grupos microbianos conhecidos e
descritos (diversidade de espécies) representa apenas pequena
fração da diversidade microbiana encontrada na natureza
(AZEVEDO, 1998; PACE, 1997). Dados derivados de estudos
comparativos apontam para o fato de que apenas uma pequena
fração dos microrganismos na natureza (entre < 0,1% e 1%,
dependendo do habitat) é cultivada por meio do emprego de
métodos microbiológicos convencionais (AMANN et al., 1995). Um
grande número de fatores pode ser apontado para a dificuldade no
cultivo de microrganismos em condições de laboratório, incluindo o
pouco conhecimento sobre seus requisitos nutricionais e a biologia
de organismos presentes em diferentes amostras ambientais.
Nesse contexto, o habitat associado à planta é um ambiente
dinâmico no qual muitos fatores, tais como mudanças sazonais,
tecidos vegetais (KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2004; MOCALI et al.,
2003), cultivares e espécies de plantas, tipos de solo (DALMASTRI
et al., 1999; FROMIN et al., 2001; KUKLINSKY-SOBRAL et al.,
2005; TORRES et al., 2008) e interação com outros microrganismos
benéficos ou patogênicos (ARAÚJO et al., 2001, 2002a), podem
afetar a estrutura e composição de espécies das comunidades
bacterianas que colonizam os tecidos das plantas, como as BPCPs.
A preservação da diversidade microbiana concentra-se, atual‐
mente, em instituições que mantêm coleções de culturas disponíveis
à comunidade científica, como American Type Culture Collection
(ATTC) nos Estados Unidos da América, Belgian Coordinated
Collections of Microorganisms (BCCM) na Bélgica, Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) na
Alemanha, Embrapa Agrobiology Diazothrophic Microbial Culture
Collection (Embrapa) no Brasil e Japan Collection of Microorganisms
(JCM) no Japão1. Esses institutos também são os principais
responsáveis pela identificação e classificação bacteriana, incluindo
os isolados obtidos do ambiente em grupos já definidos ou em
novos taxa.
A identificação/classificação clássica de bactérias é baseada
principalmente nas características morfológicas e bioquímicas de
cada espécie. Dessa forma, a identificação bacteriana, geralmente,
tem início com a separação dos grupos em Gram positivo ou Gram
negativo. Para tanto, realiza-se a coloração de Gram. Após isso, as
bactérias Gram negativas devem ser submetidas ao teste de O/F
(oxidação fermentação de glicose). Nesse ponto, bactérias fermen‐
tadoras devem ser submetidas a testes específicos de fermentação
de açucares enquanto que as não fermentadoras devem ser sub‐
metidas a outros testes bioquímicos (ARAÚJO et al., 2002b; HOLT
et al., 1994). A morfologia e o arranjo celular também devem ser
considerados.
A evolução das metodologias de biologia molecular aplicadas ao
estudo do meio ambiente tem contribuído significativamente para
um grande avanço do conhecimento sobre a diversidade
microbiana. Resultados de estudos independentes de isolamento e
cultivo, baseados em amplificação e sequenciamento de fragmentos
dos genes de rRNA 16S (rDNA 16S), demonstraram que a
diversidade de microrganismos em amostras ambientais é vasta
(HEAD et al., 1998; HUNTER-CEVERA, 1998). A aplicação dessas
metodologias na identificação de bactérias tem permitido a
descoberta de um número extenso de novas linhas evolutivas nesse
grupo. Métodos independentes de cultivo tendem a complementar
os métodos baseados em isolamento e cultivo para a realização de
levantamentos e comparações da composição, diversidade e
estrutura de comunidades microbianas (ANDREOTE et al., 2009;
HUGENHOLTZ; PACE, 1996; HUGENHOLTZ et al., 1998;
RANJARD et al., 2000).
Nesse contexto, a aplicação de técnicas baseadas em ácidos
nucleicos tem auxiliado muitos estudos de diversidade microbiana
(COSKUNER, 2002; ELSAS et al., 1998; MUYZER; SMALLA, 1998;
RANJARD et al., 2000). Existe um grande número de técnicas que
revelam polimorfismo de DNA, sendo importante considerar o tipo
de organismo em estudo.

2.2. Caracterização morfológica e bioquímica de BPCPs

A caracterização morfológica de BPCPs tem início com a obser‐


vação do comportamento das colônias em meio de cultura sólido.
Para tanto, diferentes aspectos são observados, como, cor da
colônia, tempo de crescimento (rápido, médio ou lento), aspecto
(liso, rugoso, cremoso, seco, brilhante), borda (regular ou irregular),
produção de pigmento, dentre outros. Entretanto, é importante
ressaltar que o comportamento morfológico de uma determinada
espécie bacteriana é variável de acordo com as condições
ambientais (temperatura, tensão de oxigênio, etc.) e nutricionais
(concentração de sais, fonte de carbono, etc.) às quais é submetida.
Ainda considerando a caracterização morfológica das BPCPs, a
microscopia é uma ferramenta muito importante. Além da micros‐
copia ótica, largamente utilizada para classificação das bactérias em
Gram positiva ou Gram negativa, como citado anteriormente, e para
outros testes, a microscopia eletrônica de varredura e de
transmissão tem permitido grandes avanços no estudo da interação
bactéria-planta.
O equipamento utilizado permite localizar e caracterizar o mi‐
crorganismo dentro do organismo superior ou aderido externamente.
O modo de penetração ou adesão, a colonização do hospedeiro e
as alterações mutuamente induzidas são outros aspectos
caracterizados (JAMES; OLIVARES, 1997; NOGUEIRA; BARROSO,
1998).
Nos estudos de bactérias endofíticas, a microscopia eletrônica é
um poderoso instrumento para reconhecer e localizar as bactérias
em tecidos vegetais. A microscopia eletrônica de varredura conven‐
cional (MEV) tem sido satisfatoriamente usada para detectar
bactérias endofíticas em várias plantas, como milho, trigo, arroz e
cana-de-açúcar (JAMES; OLIVARES, 1997; QUADT-HALLMANN et
al., 1997; REINHOLD-HUREK; HUREK, 1998).

2.2.1. Inoculação de BPCPs em plantas hospedeiras


As sementes da planta hospedeira devem ser lavadas em álcool
(70%) por 1 minuto, desinfectadas em solução de hipoclorito de
sódio (2% de Cl- disponível) suplementado com Tween 20 (1 mL/L)
por 10 minutos (otimizar tempo para diferentes vegetais),
enxaguadas novamente em álcool (70%) e, posteriormente, lavadas
três vezes em água destilada e esterilizada para a retirada do
excesso de bactérias e para que permaneçam apenas as que
estiverem agregadas às sementes. A água da última lavagem deve
ser distribuída em meio de cultura rico em nutrientes, como controle
do processo de esterilização.
Após a desinfecção superficial, as sementes devem ser incuba‐
das em câmara úmida por 24 horas e posteriormente colocadas
numa suspensão bacteriana (106 UFC/mL–107 UFC/mL) em tampão
fosfato e agitadas a 150 rpm por 18 horas. Depois as sementes
devem ser enxaguadas com tampão fosfato salino (Phosphate
Buffered Saline – PBS: 1,44 g/L Na2HPO4; 0,24 g/L KH2 PO4; 0,20
g/L KCl; 8,00 g/L NaCl; pH 7,4) e reincubadas em câmara úmida por
24 horas para germinarem. Transcorrido o período, as sementes
devem ser transferidas para tubos contendo meio MS
(MURASHIGUE; SKOOG, 1962), e, após 15 dias, as amostras
devem ser preparadas para a microscopia eletrônica.
O mesmo procedimento deve ser realizado para o material a ser
analisado como controle, excetuando-se a etapa de inoculação de
bactérias.
Composição do MS (MURASHIGUE; SKOOG, 1962) por litro:
NH4NO3 1.650 mg; KNO3 1.900 mg; CaCl2.2H2O 440 mg; KH2PO4
170 mg; MgSO4.7H2O 370 mg; MnSO4.7H2O 22,3 mg; H3BO3 6,2
mg; CuSO4.5H2O 0,025 mg; CoCl2P.6H2O 0,025 mg; NaMoO4.2H2O
0,25 mg; Kl 0,83 mg; ZnSO4.7H2O 8,6 mg; Tiamina-HCl 0,1 mg;
Ácido Nicotínico 0,5 mg; Piridoxina-HCl 0,5 mg; Glicina 2,0 mg;
Inositol 100,0 mg; Ágar 1,8 g. pH 7,0–7,2.

2.2.2. Preparo das amostras para microscopia eletrônica por


varredura (MEV)
Pequenos fragmentos (em torno de 2 cm x 2 cm) de diferentes
tecidos vegetais devem ser seccionados, com o auxílio de estilete
estéril. Esses devem ser fixados em solução de Karnovksy (glutaral‐
deído 2,5%; formaldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,05
M; pH 7,2; CaCl2 0,001 M) por 1 hora. Em seguida, realiza-se a
lavagem em tampão cacodilato 0,05 M por 3 vezes durante 10 minu‐
tos cada. A pós-fixação deve ser feita com OsO4 1% (em tampão
cacodilato 0,05 M; pH 7,2) por 1 hora. Depois as amostras devem
ser lavadas em água destilada por 5 vezes, e, então, realiza-se a
desidratação numa série crescente (30%, 50%, 70%, 90% e 100%)
de acetona, 10 minutos em cada etapa, sendo que a de 100% deve
ser realizada três vezes. Depois as amostras devem ser secas ao
ponto crítico e metalizadas com ouro. Depois de metalizadas, as
amostras devem ser montadas em suportes especiais (stubs) e
observadas em microscópio eletrônico de varredura (KITAJIMA;
LEITE, 1999).

2.2.3. Testes para caracterização bioquímica


Em relação à caracterização bioquímica, existem vários testes a
serem utilizados, como o EPM (ácido e gás de glicose, urease, H2S,
L-triptofano desaminase), Mili (motilidade, indol – lisina), utilização
de citrato, utilização de diferentes fontes de carbono, hidrólise do
amido, oxidase, produção de indol, redução de nitrato a nitrito
(ARAÚJO et al., 2002b). Atualmente, existem diversos kits
comerciais para identificação bacteriana com bases em
características bioquímicas, tornando-se uma análise rápida e
barata. Contudo, esses kits geralmente são específicos para alguns
grupos bacterianos. Dentre os mais utilizados estão: sistemas API
(Appareils et Procédés d’Identification, bio Mérieux); Biolog
Nutritional System (testa a habilidade de uma bactéria em oxidar 95
diferentes fontes de carbono pré-selecionadas); Enterotubos e Micro
ID System (identificação de bactérias da família
Enterobacteriaceae).

2.3. Caracterização fisiológica de BPCPs

A caracterização fisiológica de BPCPs testa a capacidade do


isolado bacteriano em relação a características envolvidas com a
promoção de crescimento de plantas, como fixação de nitrogênio,
produção de fito-hormônios e disponibilização de nutrientes.

2.3.1. Seleção de bactérias com capacidade de fixar N2


A metodologia inicial, e mais comumente empregada, para a
seleção de bactérias fixadoras de nitrogênio atmosférico é pelo culti‐
vo em meio livre de fonte de nitrogênio. Existem meios apropriados
para diferentes grupos bacterianos, mas o mais comum é o meio de
cultura NFb [5 g/L de ácido málico; 0,5 g/L de K2HPO4; 0,2 g/L de
MgSO4.7H2O; 0,1 g/L de NaCl; 0,01 g/L de CaCl2.2H2O; 4 mL/L de
Fe.Edta (solução 1,64%); 2 mL/L de azul de bromotimol (0,5%); 2
mL/L de solução de micronutrientes (0,2 g/L de Na2MoO4.2H2O;
0,235 g/L de MnSO4.H2O; 0,28 g/L de H3BO3; 0,008 g/L de
CuSO4.5H2O); 1,75 g/L de ágar; pH 6,8]. Nesse caso, após o
período de incubação, o resultado positivo é caracterizado pela
presença de um halo de crescimento no interior do meio de cultura
(DÖBEREINER et al., 1995).

2.3.2. Seleção de bactérias produtoras de fito-hormônios do


tipo auxina
A detecção de auxinas pode ser realizada por um método mais
preciso e quantitativo, como a cromatografia líquida de alta perfor‐
mance (HPLC) ou por uma reação colorimétrica específica e
sensível na qual utiliza-se o reagente de Salkowski, porém menos
precisa quantitativamente (CROZIER et al., 1988; EHMANN, 1977).
Existem diferentes metodologias que utilizam o reagente de
Salkowski, algumas utilizam microplacas, outras, membranas de
nitrocelulose (BRIC et al., 1991; SARWAR; KREMER, 1995).
Resumidamente, inocula-se o isolado bacteriano em meio de
cultura acrescido de 5 mM de L-triptofano, incuba-se sob agitação e
na ausência de luz por tempo e temperatura adequados a cada
espécie avaliada, e, após o cultivo, acrescenta-se o reagente de
Salkowski (2% de FeCl3 0,5 M em 35% de ácido perclórico). A
reação será positiva quando o resultado expressar a coloração rosa,
indicando a produção de auxina. Mais informações sobre auxinas
estão descritas no capítulo 2 da parte 4.

2.3.3. Seleção de bactérias solubilizadoras de fosfato


inorgânico
As bactérias solubilizadoras de fosfato dissolvem o fosfato
insolúvel pela produção de ácidos orgânicos e inorgânicos e/ou pela
diminuição do pH; consequentemente, ocorre a produção de fosfato
disponível que pode ser capturado pelas plantas (NAUTIYAL, 1999;
VASSILEV; VASSILEVA, 2003; VAZQUEZ et al., 2000).
Para a bioprospecção dessas bactérias, utiliza-se meio de cultura
sólido contendo fosfato insolúvel (10 g/L de glicose; 5 g/L de NH4Cl;
1 g/L de NaCl; 1 g/L de MgSO4.7H2O; 0,8 g/L de Ca3HPO4; 15 g/L de
ágar; pH 7,2), tendo como resultado positivo a formação de um halo
claro em torno da colônia, indicando, assim, a solubilização do
fosfato.

3. Streptomyces promotores de crescimento


em plantas
As plantas compreendem um microecossistema complexo,
composto por diferentes habitats que podem ser colonizados simul‐
taneamente por uma grande diversidade de microrganismos
endofiticos e epifíticos (CHELIUS; TRIPLETT, 2001; LODEWYCKX
et al., 2002). Essa população microbiana é essencial para o
desenvolvimento das plantas uma vez que facilita a absorção de
nutrientes ao mesmo tempo em que protege a planta contra
fitopatógenos.
Dentro dessa diversidade microbiana, merecem destaque as
actinobactérias, particularmente espécies de Streptomyces como os
endófitos e os da rizosfera que influenciam o crescimento da planta,
além de funcionar como agentes biocontroladores protegendo a
planta por diversos mecanismos (BLOEMBERG; LUGTENBERG,
2001; LODEWYCKX et al., 2002).
Na rizosfera, os mecanismos desses agentes biocontroladores
são antibiose, que envolve a produção de metabólitos secundários
impedindo que o patógeno colonize a rizosfera e estabeleça
doenças, e micoparasitismo, que ocorre pela destruição física da
parede celular do fungo por meio da ação de enzimas hidrolíticas,
produzidas pelo agente biocontrolador (ADAMS, 1990; DOUMBOU
et al., 2001).
A colonização da rizosfera é determinada por uma série de
fatores que varia de acordo com a planta, microrganismos e meio
ambiente (RAMAMOORTHY et al., 2001). As actinobactérias endo‐
fíticas colonizam o tecido da planta obtendo nutrição e proteção da
planta hospedeira sem causar sintomas de doença, ao mesmo
tempo em que produzem uma grande variedade de metabólitos que
estimulam o crescimento da planta. Essa associação é complexa e
provavelmente ocorre variação de hospedeiro para hospedeiro e de
microrganismo para microrganismo (HASEGAWA et al., 2006;
OWEN; HUNDLEY, 2005). Todas as plantas examinadas mostram a
ocorrência de actinobactérias endofíticas principalmente na raiz,
indicando que essa associação é comum na natureza (HASEGAWA
et al., 2006).
3.1. Atividade antagônica

O estímulo do crescimento da planta por actinobactéria endofítica


pode ser influenciado pela produção de fito-hormônio ou pelo
biocontrole de fitopatógenos por meio da produção de antibióticos,
sideróforos, pela competição por nutrientes e indução de resistência
a doenças (IGARASHI et al., 2002a, 2002b).
Tem sido documentado que algumas actinobactérias endofiticas
apresentam atividade antagonista para alguns patógenos como
Pythium spp., Fusarium spp., Rhizoctonia solani, entre outros. Cao
et al. (2004) isolaram Streptomyces endofíticos de raízes de tomate
(Licopersicum esculentum) e observaram que 65% dos isolados
inibiram o crescimento de Rhizoctonia solani, e entre esses isolados
a linhagem de Streptomyces sp. S30 que apresentou atividade in
vitro e in vivo para esse fitopatógeno, indicando o seu potencial
como agente de biocontrole. Taechowisan et al. (2003) também
isolaram 330 actinobactérias endofíticas de 36 espécies de plantas
herbáceas e lenhosas da Tailândia, das quais 10% apresentaram
atividade para Colletotrichum musae e Fusarium oxysporum.
Pesquisas sobre a produção de fito-hormônio por Streptomyces
endofíticos também têm sido realizadas mostrando o benefício
dessa comunidade microbiana para o crescimento da planta. Ácido
piterídico, substância similar à auxina, foi extraído de S.
higroscópicos TP-A045, endófito da planta Pteridium aquilinens, e
mostrou que, na concentração de 1 µM, esse composto acelerou a
formação e o crescimento das raízes em cultura de tecido de feijão
tão efetivamente quanto o ácido indol acético (IGARASHI et al.,
2002b). Igualmente Meguro et al. (2006) também relataram que o
endófito Streptomyces sp. MBR-52 acelerou a emergência e o
alongamento de raízes em cultura de tecido da planta ornamental
Rhododendron indicando que essa linhagem produz algum tipo de
fito-hormônio.

3.2. Isolamento de actinobactérias endofíticas


Microrganismos endofíticos podem ser observados por micros‐
copia ótica ou eletrônica, mas sua identificação in vivo é difícil.
Entretanto muitas pesquisas são realizadas, e diferentes tecidos
vegetais passam por processos de desinfecção para eliminação dos
epifíticos, e os endofíticos são isolados em diferentes meios de
cultura e condições controladas, possibilitando a avaliação do seu
potencial biológico in vitro (ARAÚJO et al., 2002b; OWEN;
HUNDLEY, 2005).
A técnica de isolamento de actinobactérias endofíticas descrita
abaixo está de acordo com Araújo et al. (2002b).
a) Coletar as amostras de folhas, ramos ou raízes, tendo o cui‐
dado de verificar que folhas e ramos não entrem em contato
com o solo. Acondicionar cada amostra em sacos plásticos
individuais, identificados, e transportar para o laboratório em
baixa temperatura (isopor com gelo). O material pode ser
armazenado em câmara fria (4 °C) durante 72 horas.
b) No laboratório o material será separado e lavado com água
corrente para eliminar resíduos de poeira. Em seguida raízes e
caule são cortados em fragmentos de 10 cm para proceder a
desinfecção.
c) Em câmara de fluxo laminar, desinfetar cada amostra com
álcool a 70% por 1 minuto, e em seguida transferir para solução
de hipoclorito de sódio (2,6%) durante 5 minutos, e novamente
tratar com álcool a 70% por 30 segundos. A seguir, lavar a
amostra com água destilada esterilizada por duas vezes e
avaliar a eficiência da desinfecção, plaqueando alíquotas da
última água de lavagem nos meios sólidos utilizados para o
isolamento dos endofíticos. Esse plaqueamento tem como
finalidade comprovar se todos os epifíticos foram eliminados
após a desinfecção.
d) Utilizando um estilete esterilizado cortar de 1,0 mm a 2,0 mm
das bordas das folhas e as extremidades das raízes, e em
seguida colocar de 8 a 10 fragmentos com 0,5 cm2 das folhas e
de 8 a 10 fragmentos de 5,0 mm das raízes na superfície de
cada placa de Petri (ARAÚJO et al., 2001; PEREIRA et al.,
1993) contendo os meios Arginina Glicerol Ágar (EL-NAKEEB;
LECHEVALIER, 1963) e Caseína Amido Ágar (KUSTER;
WILLIAMS, 1964) com ciclohexamida e nistatina na
concentração de 100 µg/mL.
e) Cultivar as placas, durante 30 dias, a 28 °C–30 °C, para
observar crescimento de colônias de Streptomyces que
emergem dos fragmentos e apresentam crescimento muito
lento.
f) Após o isolamento, calcular a frequência de isolamento-FI,
dividindo o número de fragmentos que apresentou crescimento
de colônias de Streptomyces pelo número total de fragmentos
analisados e em seguida multiplicar por 100.

3.3. Isolamento de actinobactérias do solo

As actinobactérias, e em especial o gênero Streptomyces, ocor‐


rem em diversos habitats, entretanto o solo é o maior reservatório
dessas bactérias filamentosas, saprofíticas, que no solo,
decompõem a matéria orgânica, especialmente polímeros como
amido, lignocelulose e quitina que favorecem o desenvolvimento da
população microbiana (SRINIVASAN et al., 1991; ZIMMERMAN,
1990).
Em áreas cultivadas, o número de Streptomyces pode conter
aproximadamente 107 unidade formadora de colônia (UFC) por
grama de solo, enquanto Micromonospora varia de 104 UFC/g a 105
UFC/g; entretanto, em menor freqüência, outros gêneros de
actinobactérias podem ocorrer (HUNTER et al., 1981; KIESER et al.,
2000). A quantidade e o tipo das bactérias filamentosas Gram
positivas são influenciados por vários fatores, como: temperatura,
pH e outros atributos do solo, bem como o conteúdo da matéria
orgânica, umidade e aeração (DAVIES; WILLIAMS, 1970; LABEDA;
SHEARER, 1990). Várias pesquisas mostram que as
actinobactérias são qualitativa e quantitativamente importantes na
rizosfera, podendo influenciar o crescimento das plantas, além de
proteger contra a invasão por fungos patogênicos radiculares
(AGHIGHI et al., 2004; GETHA; VIKINESWARY, 2002).

3.3.1. Pré-tratamento
Em geral as bactérias filamentosas apresentam um crescimento
muito lento durante o seu isolamento em meio de cultura sólido. Por
isso se faz necessário eliminar microrganismos indesejáveis como
as bactérias que são numericamente 10 vezes maiores que
Streptomyces, e o pré-tratamento da amostra por aquecimento a 45
°C, por 2 horas, ou 50 °C, por 10 minutos, elimina principalmente
bactérias Gram negativas que crescem rapidamente (LABEDA;
SHEARER, 1990). Outro pré-tratamento é a ativação dos esporos
de actinobactérias que é importante no isolamento de bactérias
filamentosas Gram positivas. Nessa técnica a suspensão do solo é
tratada com uma solução de extrato de levedura (6,0%) mais
dodecilsulfato de sódio – (SDS) (0,05%), a 40 °C por 20 minutos,
seguida da diluição seriada em água destilada esterilizada e
plaqueamento em meio sólido seletivo (NONOMURA; HAYAKAWA,
1992). Existem vários pré-tratamentos que podem ser realizados
visando a um gênero específico como relatado por Araújo (1998).
Para a determinação da diversidade de microrganismo cultivável
no solo, a técnica do isolamento e quantificação em placa ainda é a
mais indicada. Alguns métodos podem medir a função microbiana
por meio da determinação da velocidade do processo metabólico,
mas não é possível identificar a espécie microbiana (NANNIPIERI et
al., 2003).

3.3.2. Isolamento pela técnica de diluição


Pesar assepticamente amostra do solo (10 g) e adicionar 90 mL
de tampão fosfato (PBS) ou soro fisiológico esterilizado, colocar em
agitação (150 rpm/10 minutos) e realizar diluição seriada. Das dilui‐
ções 103 a 106 retirar 0,1 mL e colocar na superfície de cada placa
contendo 20 mL do meio Caseína Amido Ágar-CAA (KUSTER; WIL‐
LIAMS, 1964) e/ou Ácido Húmico Ágar (NONOMURA; HAYAKAWA,
1992), e em seguida espalhar com alça de Drigalski. As placas
devem ser cultivadas em estufa BOD à temperatura de 28 °C a 30
°C, durante 15 a 20 dias.
Composição do meio Caseína Amido Ágar-CAA (KUSTER; WIL‐
LIAMS, 1964): Amido solúvel 10,0 g; KNO3 2,0 g; Caseína 0,3 g;
K2HPO4 2,0 g; MgSO4.7H2O 0,05 g; NaCl 2,0 g; FeSO4.7H2O 0,01 g;
CaCO3 0,02 g; Ágar 20,0 g. pH 7,0–7,2.
Composição do meio Ácido Húmico Ágar (NONOMURA; HAYA‐
KAWA, 1992): Ácido Húmico 1 g dissolvido em NaOH 0,2 M;
Na2HPO4 0,5 g; KCl 1,7 g; FeSO4.7H2O 0,01 g; CaCO3 0,01 g;
vitamina B 10 mg; Ágar 18 g. pH 7,2.
Composição do meio Arginina-Glicerol Ágar (EL-NAKEEB;
LECHEVALIER, 1963): Arginina-HCl 1,0 g; Glicerol 12,5 g; K2HPO4
1,0 g; NaCl 1,0 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; Fe2(SO4)3.6H2O 0,01 g;
CuSO4.5H2O 0,1 mg; MnSO4.H2O 1,0 mg; ZnSO4.7H2O 1,0 mg; Ágar
15,0 g. pH 6,9–7,1.

4. Atividade antimicrobiana

Para avaliação da atividade antifúngica e antibacteriana de


Streptomyces, a metodologia mais simples é a seleção primária por
meio do ensaio com blocos de gelose e segundo metodologia de
Ichikawa et al. (1971).
a) A partir de culturas de Streptomyces isoladas e cultivadas em
tubos inclinados preparar suspensão de esporos em 2,0 mL de
soro fisiológico esterilizado, contendo 0,1% de Tween 80, agitar
o tubo em vortex e adicionar 0,1 mL dessa suspensão a cada
placa de Petri contendo 15 mL dos meios Caseína Amido Ágar
(CAA) e ISP2 (SHIRLING; GOTTLIEB, 1966). Em seguida,
espalhar a suspensão com alça Drigalski sobre toda a
superfície das placas, que devem ser cultivadas em BOD a 28
°C–30 °C durante 7 dias para observar o crescimento em forma
de tapete.
b) Para o ensaio antifúngico usar culturas de Fusarium
oxysporum, Rhizoctonia solani ou outros fungos que se deseja
testar. Preparar a suspensão de esporos e inocular como no
item anterior usando placas com 15 mL de meio Sabouraud
Ágar ou Batata Dextrose Ágar.
c) No ensaio antibacteriano utilizar linhagens de bactérias Gram
positivas como Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus e
Gram negativa como Escherichia coli com 24 horas de cultivo a
37 °C. Preparar as suspensões das bactérias com densidade
0,5 da escala de McFarland, segundo Kirby et al. (1966) e
inocular como no item anterior em placas contendo 10 mL do
meio TSA (Triptona Soja Ágar) ou o meio Muller Hintton Ágar.
d) Após o crescimento dos Streptomyces (item a) serão feitos
blocos de gelose e circulares, utilizando um furador de rolha
(diâmetro de 6 mm) esterilizado em álcool e flambado. Cada
bloco será transferido para as placas já inoculadas (item b e
item c) levadas para estufa BOD a 37 °C para as bactérias,
durante 24 horas, enquanto os fungos serão cultivados a 28
°C–30 °C, durante 72 horas–96 horas. Após esses períodos
serão observados os halos de inibição os quais serão medidos
em mm com auxílio de uma régua.

5. Considerações finais

Os benefícios dos processos ecológicos desempenhados por


microrganismos por meio das bactérias promotoras do crescimento
de plantas (BPCPs) têm contribuído para alcançar a
sustentabilidade no setor do agronegócio. A tecnologia de
inoculação de bactérias de interesse biotecnológico na agricultura é
um recurso de grande importância econômica, além do que pode
contribuir para reduzir o uso e consequente impacto dos
agroquímicos.
A agricultura sustentável requer a utilização de estratégias que
permitam o aumento da produtividade sem o prejuízo do meio am‐
biente, abrindo novas perspectivas para contribuir no
desenvolvimento de novas tecnologias, métodos e estratégias na
agroindústria. Os processos mediados pelos microrganismos
tornam-se essenciais na preservação e na conservação dos
recursos naturais.

6. Referências

ADAMS, P. B. The potential of mycoparasites for biological control of plant diseases.


Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v. 28, p. 59-72, 1990.
AGHIGHI, S. G. H.; BONJAR, S.; SAADOUN, I. First report of antifungal properties of a new
strain of Streptomyces plicatus (strain 101) against four Iranian phytopathogenic isolates of
Verticillium dahliae, a new horizon in biocontrol agents. Biotechnology, Faisalabad, v. 3, n. 1,
p. 90-97, 2004.
ALMARAZ, J. J.; ZHOU, X.; SOULEIMANOV, A.; SMITH, D. Gas exchange characteristics
and dry matter accumulation of soybean treated with Nod factors. Journal of Plant
Physiology, Stuttgart, v. 164, p. 1391-1393, 2007.
AMANN, R. I.; LUDWIG, W.; SCHLEIFER, K. H. Phylogenetic identification and in situ
detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiology Review, Washington,
DC, v. 59, n. 1, p. 143-169, 1995.
ANDREOTE, F. D.; CARNEIRO, R. T.; SALLES, J. F.; MARCON, J.; LABATE, C. A.;
AZEVEDO, J. L.; ARAÚJO, W. L. Culture-independent assessment of Rhizobiales-related
Alphaproteobacteria and the diversity of Methylobacterium in the rhizosphere and
rhizoplane of transgenic eucalyptus. Microbiology Ecology, New York, v. 57, n. 1, p. 82-93,
2009.
ARAÚJO, F. B.; HUNGRIA, M. Nodulação e rendimento de soja co-infectada com Bacillus
subtilis e Bradyrhizobium japonicum / Bradyrhizobium elkanii. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, Brasília, DF, v. 34, n. 9, p. 1633-1643, 1999.
ARAÚJO, J. M. Estratégias para isolamento seletivo de actinomicetos. In: MELO, I. S.;
AZEVEDO, J. L. (Ed.). Ecologia microbiana. Jaguariúna: Embrapa-CNPNA, 1998. p. 351-
367.
ARAÚJO, W. L.; MACCHERONI, W.; AGUILAR-VILDOSO, C. I.; BARROSO, P. A. V.;
SARIDAKIS, H. O.; AZEVEDO, J. L. Variability and interaction between endophytic bacteria
and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks. Canadian Journal of Microbiology,
Ottawa, CA, v. 47, n. 3, p. 229-236, 2001.
ARAÚJO, W. L.; MARCON, J.; MACCHERONI JUNIOR, W.; ELSAS, J. D. van; VUURDE,
J. W. L. van; AZEVEDO, J. L. Diversity of endophytic bacterial populations and their
interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, DC, v. 68, p. 4906-4914, 2002a.
ARAÚJO, W. L.; LIMA, A. O. S.; MARCON, J.; KUKLINSKY-SOBRAL, J.; LACAVA, P. T.
Manual: isolamento de microrganismos endofíticos. Piracicaba: CALQ, 2002b. 86 p.
AZEVEDO, J. L. Microrganismos endofíticos. In: MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. (Ed.).
Ecologia microbiana. Jaguariúna: Embrapa-CNPNA, 1998. p. 117-137.
BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L. D. History on the biological nitrogen fixation research in
graminaceous plants: special emphasis on the Brazilian experience. Anais da Academia
Brasileira de Ciências, Rio de Janeiro, v. 77, n. 3, p. 549-579, 2005.
BLOEMBERG, G. V.; LUGTENBERG, B. J. J. Molecular basis of plant growth promotion
and biocontrol by rhizobacteria. Current Opinion in Plant Biology, Oxford, v. 4, p. 343-350,
2001.
BRIC, J. M.; BOSTOCK, R. M.; SILVERSTONE, S. Rapid in situ assay for indoleacetic acid
production by bacteria immobilized on a nitrocellulose membrane. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 57, p. 535-538, 1991.
CAMACHO, M.; SANTAMARIA, C.; TEMPRANO, F.; DAZA, A. Co-inoculation with Bacillus
sp. CECT 450 improves nodulation in Phaseolus vulgaris L. Canadian Journal of
Microbiology, Ottawa, CA, v. 47, p. 1058-1062, 2001.
CAO, L.; QUI, Z.; YOU, J.; TAN, H.; ZHOU, S. Isolation and characterization of endophytic
Streptomyces strains from surface-sterilized tomato (Lycopersicum esculentum) roots.
Letters in Applied Microbiology, Oxford, v. 39, p. 425-430, 2004.
CATTELAN, A. J. Métodos qualitativos para determinação de características bioquímicas e
fisiológicas associadas com bactérias promotoras de crescimento vegetal. Londrina: Embrapa
Soja, 1999. 36 p. (Embrapa Soja. Documentos, 139).
CHELIUS, M. K.; TRIPLETT, E. W. The diversity of Archaea and bacteria in association with
the roots of Zea mays l. Microbial Ecology, New York, v. 41, n. 3, p. 252-263, 2001.
CHEN, C.; BAUSKE, E. M.; MUSSON, G.; RODRÍGUEZ-KÁBANA, R.; KLOEPPER, J. W.
Biological control of Fusarium wilt on cotton by use of endophyitic bacteria. Biological
Control, San Diego, v. 5, p. 83-91, 1995.
COOPER, J. B.; LONG, S. R. Morphogenetic rescue of Rhizobium-meliloti nodulation
mutants by trans-zeatin secretion. Plant Cell, Rockville, v. 6, p. 215-225, 1994.
DONATE-CORREA, J.; LEON-BARRIOS, M.; PEREZ-GALDONA, R. Screening for plant
growth-promoting rhizobacteria in Chamaecytisus proliferus (tagasaste), a forage tree-shrub
legume endemic to the Canary Islands. Plant and Soil, Dordrecht, v. 266, n. 1-2, p. 261-272,
2004.
COSKUNER, G. A new molecular technique for the identification of micro-organisms in
biological treatment plants: fluorescent in situ hybridization. Turkey Journal of Biology,
Ankara, v. 26, p. 57-63, 2002.
CREWS, T. E.; BROCKWELL, J.; PEOPLES, M. B. Host-rhizobia interation for effective
inoculation: evaluation of the potential use of the ureide assay to monitor the symbiotic
performance of tepary bean (Phaseolus acutifolius A. Gray). Soil Biology and Biochemistry,
Oxford, v. 36, n. 8, p. 1223-1228, 2004.
CROZIER, A.; ARRUDA, P.; JASMIM, J. M.; MONTEIRO, A. M.; SANDBERG, G. Analysis
of indole-3-acetic acid and related indoles in culture medium from Azospirillum lipoferum
and Azospirillum brasiliense. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v.
54, p. 2833-2837, 1988.
DAKORA, F. D. Defining new roles for plant and rhizobial molecules in sole and mixed plant
cultures involving symbiotic legumes. New Phytologist, Oxford, v. 158, p. 39-49, 2003.
DALMASTRI, C.; CHIARINI, L.; CANTALE, C.; BEVIVINO, A.; TABACCHIONO, S. Soil type
and maize cultivar affect the genetic diversity of maize root-associated Burkholderia cepacia
populations. Microbial Ecology, New York, v. 38, p. 273-284, 1999.
DAVIES, F. L.; WILLIAMS, S. T. Studies on the ecology of actinomycetes in soil: I. the
occurrence and distribution of actinomycetes in a pine forest soil. Soil Biology and
Biochemistry, Oxford, v. 2, n. 4, p. 227-238, 1970.
DÖBEREINER, J.; BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I. Como isolar e identificar bactérias
diazotróficas de plantas não leguminosas. Brasília, DF: Embrapa-SPI, 1995. 60 p.
DOUMBOU, C. L.; SALOVE, M. K. H.; CRAWFORD, D. L.; BEAULIEU, C. Actinomycetes,
promising tools to control plant diseases and promote plant growth. Phytoprotection,
Quebec, v. 82, p. 85-102, 2001.
EHMANN, A. The van urk-Salkowski reagent: a sensitive and specific chromogenic reagent
for silica gel thin-layer chromatographic detection and identification of indole derivatives.
Journal of Chromatography, Amsterdam, NL, v. 132, n. 2, p. 267-276, 1977.
EL-NAKEEB, M. A.; LECHEVALIER, H. A. Selective isolation of aerobic actinomycetes.
Applied Microbiology, Washington, DC, v. 11, p. 75-77, 1963.
FIGUEIREDO, M. V. B.; BURITY, H. A.; MARTINEZ, C. R.; CHANWAY, C. P. Drought stress
response on some key enzymes of cowpea (Vigna unguiculata L. Walp.) nodule
metabolism. World Journal of Microbiology & Biotechnology, Dordrecht, v. 23, n. 2, p. 187-
193, 2007.
FIGUEIREDO, M. V. B.; BURITY, H. A.; MARTINEZ, C. R.; CHANWAY, C. P. Alleviation of
water stress effects in common bean (Phaseolus vulgaris L.) by co-inoculation Paenibacillus
x Rhizobium tropici. Applied Soil Ecology, Amsterdam, NL, v. 40, p. 182-188, 2008.
FROMIN, N.; ACHOUAK, W.; THIERY, J. M.; HEULIN, T. The genotypic diversity of
Pseudomonas brassicacearum populations isolated from roots of Arabidopsis thaliana:
influence of plant genotype. FEMS Microbiology Ecology, Haren, v. 37, p. 21-29, 2001.
GETHA, K.; VIKINESWARY, S. Antagonistic effects of Streptomyces violaceusniger strain
G10 on Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4: Indirect evidence for the role of
antibiosis in the antagonistic process. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,
Amsterdam, NL, v. 28, n. 6, p. 303-310, 2002.
HALVERSON, L. J.; HANDELSMAN, J. Enhancement of soybean nodulation by Bacillus
cereus UW85 in the field and in a growth chamber. Applied and Environmental
Microbialogy, Washington, DC, v. 57, p. 2767-2770, 1991.
HAN, J.; SUN, L.; DONG, X.; CAI, Z.; SUN, X.; YANG, H.; WANG, Y.; SONG, W.
Characterization of a novel plant growth-promoting bacteria strain Delftia tsuruhatensis HR4
both as a diazotroph and a potential biocontrol agent against various pathogens. Systematic
and Applied Microbiology, Stuttgart, v. 28, p. 66-76, 2005.
HASEGAWA, S.; MEGURO, A.; SHIMIZU, M.; NISHIMURA, T.; KUNOH, H. Endophytic
actinomycetes and their interactions with host plants. Actinomycetologica, Tokyo, JP, v. 20,
p. 72-81, 2006.
HEAD, I. M.; SAUNDERS, J. R.; PICKUP, R. W. Microbial evolution, diversity, and ecology:
a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganism. Microbial Ecology, New
York, v. 35, p. 1-21, 1998.
HIRSCH, A. M.; FANG, Y.; ASSAD, S.; KAPULNIK, Y. The role of phytohormones in plant
microbe symbioses. Plant and Soil, Dordrecht, v. 194, p. 171-184, 1997.
HOLT, J. G.; KREIG, N. R.; SNEATH, P. H. A.; STALEY, J. T.; WILLIAMS, S. T. Bergey’s
manual of determinative bacteriology. 9th ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1994. 787 p.
HUGENHOLTZ, P.; GOEBEL, B. M.; PACE, N. R. Impact of culture independent studies on
the emerging phylogenetic view of bacterial diversity. Journal of Bacteriology, Washington,
DC, v. 180, p. 4765-4774, 1998.
HUGENHOLTZ, P.; PACE, N. R. Identifying microbial diversity in the natural environment: a
molecular phylogenetic approach. Trends in Biotechnology, Amsterdam, NL, v. 14, p. 190-
197, 1996.
HUNTER-CEVERA, J. C. The value of microbial diversity. Current Opinion Microbiology,
Oxford, v. 1, n. 3, p. 278-285, 1998.
HUNTER, J. C.; EVELEIGH, D. E.; CASELLA, G. Actinomycetes of a salt marsh. In:
SCHAAL, K. P.; PULVERER, G. (Ed.). Actinomycetes. Zentralblatt für Bakteriologie,
Stuttgart, suppl. 11, p. 195-200, 1981.
ICHIKAWA, T.; DATE, M.; ISHIKURA, T.; OZAKI, A. Improvement of Kasugamycin-
producing strain by the agar piece method and prototroph method. Folia Microbiologica,
Prague, CZ, v. 16, p. 218-224, 1971.
IGARASHI, Y.; LIDA, T.; SASAKI, Y.; SAITO, N.; YOSHIDA, R.; FURUMAI, T. Isolation of
actinomycetes from live plants and evaluation of antiphytopathogenic activity of their
metabolites. Actinomycetologica, Tokyo, JP, v. 16, p. 9-13, 2002a.
IGARASHI, Y.; LIDA, T.; YOSHIDA, R.; FURUMAI, T. Pteridic acids A and B, novel plant
growth promoters with auxin-like activity from Streptomyces hygroscopicus TP-A0451.
Journal of Antibiotics, Tokyo, JP, v. 55, n. 8,
p. 764-767, 2002b.
JAMES, E. K.; OLIVARES, F. L. Infection and colonization of sugar cane and other
graminaceous plants by endophytic diazotrophs. Critical Reviews in Plant Sciences,
Colchester, v. 17, n. 1, p. 77-119, 1997.
KIESER, T.; BIBB, M. J.; BUTNER, M. J.; CHATER, K. F.; HOPWOOD, D. A. Practical
streptomyces genetics. Norwich: John Innes Centre, 2000. p. 1-42.
KIRBY, W. M. M.; BAUER, A. W.; SHERRIS, J. C.; TURCK, M. Antibiotics susceptibility test
by a standardized single disk method. American Journal of Clinical Pathology, Philadelphia,
v. 45, p. 493-496, 1966.
KITAJIMA, E. W.; LEITE, B. Curso introdutório de microscopia eletrônica de varredura. 2. ed.
Piracicaba: NAP-MEPA; ESALQ-USP, 1999. 46 p.
KUKLINSKY-SOBRAL, J.; ARAÚJO, W. L.; MENDES, R.; GERALDI, I. O.; PIZZIRANI-
KLEINER, A. A.; AZEVEDO, J. L. Isolation and characterization of soybean-associated
bacteria and their potential for plant growth promotion. Environmental Microbiology,
Parkview Square, v. 6, n. 12, p. 1244-1251, 2004.
KUKLINSKY-SOBRAL, J.; ARAÚJO, W. L.; MENDES, R.; PIZZIRANI-KLEINER, A. A.;
AZEVEDO, J. L. Isolation and characterizationof endophytic bacteriafrom soybean (Glycine
max) grown in soil treated with glyphosate herbicide. Plant and Soil, Dordrecht, v. 273, n. 1-
2, p. 91-99, 2005.
KUSTER, E.; WILLIAMS, S. T. Selective media for the isolation of Streptomycetes. Nature,
London, UK, v. 202, p. 928-929, 1964.
LABEDA, D. P.; SHEARER, M. C. Isolation of actinomycetes for biotechnological:
applications. In: LABEDA, D. P. (Ed.). Isolation of biotechnological organisms from nature.
New York: McGraw-Hill, 1990. p. 1-19.
LACAVA, P. T.; ANDREOTE, F. D.; AZEVEDO, J. L. Metabólitos secundários produzidos por
microrganismos endofíticos. In: FIGUEIREDO, M. do V. B.; BURITY, H. A.; STAMFORD, N.
P.; SANTOS, C. E. de R. e. (Org.). Microrganismos e agrobiodiversidade: o novo desafio
para agricultura.Guaíba: Agrolivros, 2008. v. 1, p. 211-232.
LAMBRECHT, M.; OKON, Y.; BROEK, A. V.; VANDERLEYDEN, J. Indole-3-acetic acid: a
reciprocal signaling molecule in bacteria-plant interactions. Trends in Microbiology, Oxford,
v. 8, n. 7, p. 298-300, 2000.
LI, D. M.; ALEXANDER, M. Co-inoculation with antibioticproducing bacteria to increase
colonization and nodulation by rhizobia. Plant and Soil, Dordrecht, v. 108, p. 211-219, 1988.
LODEWYCKX, C.; VANGRONSVELD, J.; PORTEOUS, F.; MOORE, E. R. B.; TAGHAVI, S.;
MEZGEAY, M.; LELIE, D. V. Endophytic bacteria and their potential applications. Critical
Reviews in Plant Sciences, Colchester, v. 21, p. 583-606, 2002.
LUZ, E. W. C. Rizobactérias promotoras de crescimento em plantas e de bioproteção.
Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 4, p. 1-49, 1996.
MARIANO, R. L. R.; SILVEIRA, E. B.; ASSIS, S. M. P.; GOMES, A. M. A.; NASCIMENTO,
A. R.; DONATO, V. M. T. S. Importância de bactérias promotoras de crescimento e de
biocontrole de doenças de plantas para uma agricultura sustentável. Anais da Academia
Pernambucana de Ciência Agronômica, Recife, v. 1, p. 89-111, 2004.
MENDES, R.; AZEVEDO, J. L. Valor biotecnológico de fungos endofíticos isolados de
plantas de interesse econômico. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MICOLOGIA, 5.,
2007, Recife. Anais... Recife: Sociedade Brasileira de Micologia, 2007. p. 129-140.
MEGURO, A. Y.; OHMURA, Y.; HASEGAWA, S.; SHIMIZU, M.; NISHIMURA, T.; KUNOH,
H. An endophytic actinomycete, Streptomyces sp. MBR-52, that accelerates emergence
and elongation of plant adventitious roots. Actinomycetologica, Tokyo, JP, v. 20, n. 1, p. 1-9,
2006.
MOCALI, S.; BERTELLI, E.; CELLI, F. D.; MENGONI, A.; SFALANGA, A.; VILANI, F.;
CACIOTTI, A.; TEGLI, S.; SURICO, G.; FANI, R. Fluctuation of bacteria isolated from elm
tissues during different seasons and from different plant organs. Research in Microbiology,
Paris, FR, v. 154, p. 105-114, 2003.
MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e bioquímica do solo. 2. ed. Lavras:
UFLA, 2006. 729 p.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid grown and biassays with tobacco
tissue culture. Physiologia Plantarum, Copenhagen, DK, v. 15, p. 473-497, 1962.
MUYZER, G.; SMALLA, K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie van
Leeuwenhoek, Delft, v. 73, p. 127-141, 1998.
MYERS, N. Environmental services of biodiversity. Proceedings of the National Academy of
Sciences, Washington, DC, v. 93, p. 2764-2769, 1996.
NANNIPIERI, P.; ASCHER, J.; CECCHERINI, M. T.; LANDI, L.; PIETRAMELLARA, G.;
RENELLA, G. Microbial diversity and soil functions. European Journal of Soil Science,
Oxford, v. 54, p. 655-670, 2003.
NAUTIYAL, C. S. An efficient microbiological growth medium for screening phosphate
solubilizing microorganisms. FEMS Microbiology Letters, Reading, v. 170, p. 265-270, 1999.
NOGUEIRA, N. L.; BARROSO, P. A. V. Microscopia eletrônica aplicada aos estudos de
ecologia microbiana. In: MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. (Ed.). Ecologia microbiana.
Jaguariúna: Embrapa-CNPMA, 1998. p. 279-307.
NONOMURA, H. J.; HAYAKAWA, M. New methods for the selective isolation of soil
actinomycetes. In: OKAMI, Y.; BEPPU, T.; OGAWARA, H. Biology of actinomycetes. Tokyo:
Japan Scientific Society, 1992. 484 p.
OWEN, N. L.; HUNDLEY, N. Endophytes-the chemical synthesizers inside plants. Science
Progress, Oxford, v. 87, p. 79-99, 2005.
PACE, N. R. A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science,
Washington, DC, v. 276, p. 734-740, 1997.
PEIXOTO NETO, P. A. S.; AZEVEDO, J. L.; ARAÚJO, W. L. Microrganismos endofíticos:
interação com plantas e potencial biotecnológico. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento,
Uberlândia, v. 29, p. 62-76, 2002.
PEREIRA, J. O.; AZEVEDO, J. L.; PETRINI, O. Endophytic fungi of Stylosanthes: a first
report. Muicologia, New York, v. 85, p. 362-364, 1993.
QUADT-HALLMANN, A.; HALLMANN, J.; KLOEPPER, J. W. Bacterial endophytes in
cotton: location and interaction with other plant-associated bacteria. Canadian Journal of
Microbiology, Ottawa, CA, v. 43, p. 254-259, 1997.
RAMAMOORTHY, V.; VISWANATHAN, R.; RAGUCHANDER, T.; PRAKASAM, V.;
SMAIYAPPAN, R. Induction of systemic resistance by plant growth-promoting rhizobacteria
in crop plants against pests and diseases. Crop Protection, Surrey, v. 20, n. 1, p. 1-11,
2001.
RANJARD, L.; POLY, F.; NAZARET, S. Monitoring complex bacterial communities using
culture-independent molecular techniques: application to soil environment. Research in
Microbiology, Paris, FR, v. 151, p. 167-177, 2000.
REINHOLD-HUREK, B.; HUREK, T. Interactions of gramineous plants with Azoarcus spp.
and other diazotrophs: identification, localization, and peerspectives to study their function.
Critical Reviews in Plant Sciences, Colchester, v. 17, p. 29-54, 1998.
REIS, V. M.; BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L.; DÖBEREINER, J. Biological dinitrogen fixation
in gramineae and palm trees. Critical Reviews in Plant Sciences, Colchester, v. 3, p. 227-247,
2000.
RENWICK, A. R.; CAMPBELL, R.; COE, S. Assessment of in vivo screening systems for
potential biocontrol agents of Gaeumannomyces graminis. Plant Pathology, Oxford, v. 40, n.
4, p. 524-532, 1991.
RODRÍGUEZ, H.; FRAGA, R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth
promotion. Biotechnology Advances, Oxford, v. 17, n. 4-5, p. 319-339, 1999.
RODRÍGUEZ-DÍAZ, M.; LOGAN, N. A.; RODELAS, B. Paenibacillus cineris, P. cookii y P.
wynnii, três nuevas especies fijadoras de nitrógeno atmosférico originarias de la Antártida:
nuevos confines de la fijación biológica de nitrógeno. In: REUNIÓN NACIONAL DE
FIJACIÓN DE NITRÓGENO, 10., 2004, Granada. Libro de Resúmenes... [Granada: SEFIN;
Universidad de Granada; CSIC], 2004.
SARWAR, M.; KREMER, R. J. Determination of bacterially derived auxins using a
microplate method. Letters in Applied Microbiology, Oxford, v. 20, p. 282-285, 1995.
SELDIN, L. Paenibacillus fixadores de nitrogênio: parte II: microrganismos promotores de
crescimento em plantas. In: FIGUEIREDO, M. do V. B.; BURITY, H. A.; STAMFORD, N. P.;
SANTOS, C. E. de R. e S. Microrganismos e agrobiodiversidade: o novo desafio para
agricultura. Guaíba: Agrolivros, 2008. v. 1, p. 259-276.
SHIRLING, E. B.; GOTTLIEB, D. Methods for characterization of Streptomyces species.
International Journal of Systematic Bacteriology, Washington, DC, v. 16, p. 313-340, 1966.
SILVA, V. N.; SILVA, L. E. S. F.; FIGUEIREDO, M. V. B. Atuação de rizóbios com
rizobactérias promotora de crescimento em plantas na cultura do caupi (Vigna unguiculata
L. Walp). Acta Scientiarum Agronomy, Maringá, v. 28, n. 3, p. 407-412, 2006.
SILVA, V. N.; SILVA, L. E. S. F.; MARTINEZ, C. R.; SELDIN, L.; BURITY, H. A.;
FIGUEIREDO, M. V. B. Estirpes de Paenibacillus promovem a nodulação específica na
simbiose Bradyrhizobium-caupi. Acta Scientiarum Agronomy, Maringá, v. 29, p. 331-338,
2007.
SINDHU, S. S.; GUPTA, S. K.; SUNEJA, S.; DADARWAL, K. R. Enhancement of green
gram nodulation and growth by Bacillus species. Biologia Plantarum, Prague, CZ, v. 45, n.
1, p. 117-120, 2002.
SRINIVASAN, M.; PETERSEN, D. J.; HOLL, F. B. Influence of indoleacetic-acid-producing
Bacillus isolates on the nodulation of Phaseolus vulgaris by Rhizobium etli under gnotobiotic
conditions. Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, CA, v. 42, p. 1006-1014, 1996.
SRINIVASAN, M. C.; LAXMAN, R. S.; DESPHARDE, M. V. Physiology and nutritional
aspects of actinomycetes: an overview. World Journal of Microbiology and Biotechnology,
Oxford, v. 7, n. 2, p. 171-184, 1991.
SUGAWARA, M.; OKAZAKI, S.; NUKUI, N.; EZURA, H.; MITSUI, H.; MINAMISAWA, K.
Rhizobitoxine modulates plant-microbe interactions by ethylene inhibition. Biotechnology
Advances, Oxford, v. 24, n. 4, p. 382-388, 2006.
TAECHOWISAN, T.; PEBERDY, J. F.; LUMYONG, S. Isolation of endophytic actinomycetes
from selected plants and their antifungal activity. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, Oxford, v. 19, p. 381-385, 2003.
TORRES, A. R.; ARAÚJO, W. L.; CURSINO, L.; HUNGRIA, M.; PLOTEGHER, F.;
MOSTASSO, F. L.; AZEVEDO, J. L. Diversity of endophytic enterobacteria associated with
different host plants. Journal of Microbiology, Seoul, KR, v. 46, p. 373-379, 2008.
ELSAS, J. D. van; DUARTE, G. F.; ROSADO, A. S.; SMALLA, K. Microbiological and
molecular biological methods for monitoring microbial inoculants and their effects in the soil
environmental. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, NL, v. 32, p. 133-154,
1998.
VASSILEV, N.; VASSILEVA, M. Biotechnological solubilization of rock phosphate on media
containing agro-industrial wastes. Applied Microbiology and Biotechnology, Berlin, DE, v. 61,
n. 5-6, p. 435-440, 2003.
VAZQUEZ, P.; HOLGUIN, G.; PUENTE, M. E.; LOPEZ-CORTES, A.; BASHAN, Y.
Phosphate-solubilizing microorganisms associated with the rhizosphere of mangroves in a
semiarid coastal lagoon. Biology and Fertility of Soils, Berlin, DE, v. 30, n. 5-6, p. 460-468,
2000.
VESSEY, J. K.; BUSS, T. J. Bacillus cereus UW85 inoculation effects on growth, nodulation,
and N accumulation in grain legumes: controlled-environment studies. Canadian Journal of
Plant Science, Ottawa, CA, v. 82, n. 2, p. 282-290, 2002.
ZIMMERMAN, W. Degradation of lignin by bacteria. Journal of Biotechnology, Amsterdam,
NL, v. 13, p. 199-203, 1990.
Capítulo 2
Diazotróficos associativos e de
vida livre: avanços e aplicações
biotecnológicas
Veronica Massena Reis
Stefan Schwab
Luc Felicianus Marie Rouws
Kátia Regina dos Santos Teixeira

1. Introdução

A fixação biológica de nitrogênio (FBN) é um processo em que a


molécula de N2 na forma gasosa é incorporada, na forma de
amônio, ao metabolismo primário de fixação de nitrogênio,
participando da produção de proteínas nas plantas. Apenas
bactérias que possuem o complexo enzimático da nitrogenase são
capazes de realizar a quebra da tripla ligação e fazer a redução de
N2 a NH3+. De uma forma geral bactérias são encontradas na
natureza, em diversos habitats, e nesse caso específico são
conhecidas espécies que vivem em vida livre, outras que foram
isoladas de diversos tecidos de plantas e um grupo mais conhecido
e de aplicação agronômica, que são aquelas que formam nódulos
nas raízes de plantas, principalmente da família das leguminosas.
As associações de bactérias diazotróficas com plantas têm sido alvo
de trabalhos de isolamento, identificação, quantificação do
nitrogênio (N) fixado, desenvolvimento de produtos contendo
bactérias selecionadas e mais recentemente de técnicas
moleculares para estudos taxonômicos e caracterização de genes
tanto de plantas como de bactérias no sentido de elucidar os
mecanismos complexos que esse processo de interação envolve.
Neste capítulo será abordado o estudo sobre bactérias diazo‐
tróficas associativas e de vida livre fornecendo informações metodo‐
lógicas de como fazemos para isolar novas estirpes, como proceder
a caracterização morfológica, taxonômica e filogenética, bem como
os testes bioquímicos e moleculares que podemos aplicar para
avaliar seu efeito no crescimento de plantas e quais são os fatores
relacionados à interação com o hospedeiro.

2. Isolamento e identificação taxonômica

Amostras de solo e planta podem ser utilizadas no isolamento de


bactérias fixadoras de nitrogênio (diazotróficas) do ambiente. Para
se escolher a melhor época de ir ao campo coletar amostras, deve‐
mos conhecer o ciclo da cultura. E para conhecer a população de
bactérias diazotróficas de uma comunidade bacteriana no solo,
podemos utilizar 10 g de solo úmido (coletar logo após uma chuva e
de preferência antes do plantio da cultura) que devem ser mantidos
à temperatura (de 25 oC a 30 oC) ambiente em sacos plásticos com
pequenos furos. Jamais manter na geladeira. Essa amostra deve
ser analisada no mesmo dia ou mantida em isopor para transporte e
avaliação no mais curto espaço de tempo.
No caso de pedaços de planta, utilizamos também 10 g de
preferência. Se fizermos a coleta nos primeiros dias de plantio até a
floração, temos as bactérias associadas à fase de raízes ativas e
maior demanda de N na cultura. Amostras tiradas ao final do ciclo
podem apresentar populações de bactérias de comportamento
saprofítico, as quais proliferam usando raízes e outros materiais
orgânicos em decomposição. Colmos e folhas podem ser utilizados
também. Nesse caso o material fresco é mantido em sacos plásticos
nas mesmas condições citadas acima para o solo.
A amostra de 10 g é triturada em 90 mL de solução salina
composta de (teor para 1 L de solução): 3,4 g de K2HPO4, 0,2 g de
MgSO4, 0,2 g de NaCl, 0,02 g de CaCl2.2H2O 2 mL de solução de
micronutrientes para meio de cultura contendo 0,04 g de
CuSO4.5H2O 1,20 g de ZnSO4.7H2O, 1,40 g de H3BO3, 1,0 g de
Na2MoO4.2H2O e 1,175 g de MnSO4.H2O. Completar o volume para
200 mL com água destilada. Adicionar 4 mL de FeEdta (solução
1,64%). Ajustar o pH para 7,0 com KOH. A seguir é feita a diluição
seriada de 10-2 a 10-5 transferindo 1 mL da suspensão para tubos de
ensaio contendo 9 mL de solução salina. Também pode ser utilizado
tampão PBS ou mesmo solução de sacarose a 5% para plantas
como a cana-de-açúcar. É importante manter as melhores
condições fisiológicas (concentração salina, pH, temperatura,
osmolaridade, etc.) na fase de diluição das amostras manterá fim de
preservar a integridade celular.
Inoculação nos meios de cultivo: uma alíquota de 0,1 mL de cada
uma das diluições é transferida para frascos contendo 5 mL dos
meios semissólidos a seguir. A gota deve ser introduzida no centro
do meio de cultivo para proporcionar a formação da película de
crescimento que, ao atingir a superfície do meio, terá a forma de
uma folha de papel após três a cinco dias dependendo da bactéria
estudada. Crescimentos diversos e subsuperficiais são comuns de
ocorrer e podem significar diferenças no uso do oxigênio (bactérias
anaeróbicas ou anaeróbicas facultativas). Uma observação
importante nessa etapa de formação da película é o espessamento
e opacidade, pois diversas bactérias apresentam comportamento
semelhante no meio semissólido, porém apenas aquelas capazes
de fixar o N-atmosférico é que podem acumular biomassa durante o
período de incubação.
Existem várias receitas de meios semissólidos sem adição de
nitrogênio e que podem ser obtidos na literatura. Por exemplo:
Döbereiner et al. (1995) descrevem os meios NFb, JNFb, LGI, LGI-
P; Baldani et al. (1996) e Reinhold et al. (1986), o meio SM; e Reis
et al. (2004) descrevem o meio JMV. Podemos destacar um dos
mais importantes, o meio NFb (DÖBEREINER et al., 1995). Para
preparo desse meio são necessários os seguintes reagentes em
quantidades para um litro: 5 g de ácido málico; 0,5 g de K2HPO4; 0,2
g de MgSO4.7H2O; 0,1 g de NaCl; 0,02 g de CaCl2.2H2O; 2 mL de
solução de micronutrientes; 2 mL de azul de bromotimol (solução
0,5% em 0,2 N de KOH); 4 mL de FeEdta (solução 1,64%); 1 mL de
solução de vitaminas para meio de cultura (10 mg de Biotina e 20
mg de Piridoxol – HCl, dissolver em banho-maria e completar o
volume para 100 mL com água destilada e manter a solução em
geladeira. Neutralizar o ácido com 4,5 g de KOH). Completar o
volume para 1.000 mL com água destilada. Ajustar o pH para 6,5.
Adicionar o ágar na concentração de 0,17% para semissólido e
1,5% para sólido. No caso de preparo do meio sólido para placas,
deve-se adicionar 50 mg de extrato de levedura por litro. De uma
forma geral, os meios de cultivo são compostos de pelo menos uma
fonte de carbono, tampão, macro e micronutrientes, fatores de
crescimento como vitaminas. O pH pode ser modificado de acordo
com o objetivo do trabalho, mas a maioria das bactérias isoladas de
regiões tropicais cresce bem em pH mais ácido, variando de 5,5 a
6,5 – em geral essa é a faixa de pH da maioria dos solos nessa
região. Os meios também possuem um indicador que auxilia a
visualização da mudança de pH durante o crescimento bacteriano.
O azul de bromotimol, vermelho congo e verde de bromocresol são
os mais comuns. Eles podem ser usados nas formulações líquidas,
semissólidas ou sólidas. Nos casos em que se deseja avaliar a
densidade ótica ou medir proteína, os indicadores de pH devem ser
omitidos, pois a variação na cor interfere no uso de técnicas
baseadas em absorvância e colorimetria.
Os frascos contendo meio semissólido inoculados são incubados
a 30 °C por um período de 5 a 7 dias para o desenvolvimento de
uma película em forma de véu ou espessa na região superficial do
meio. A contagem da população bacteriana é realizada pela técnica
do Número Mais Provável (NMP), utilizando a tabela de Mc Crady
para três e cinco repetições das diluições (DÖBEREINER et al.,
1995). Para facilitar o entendimento, apresentamos a seguir uma
tabela orientadora de nomes e referências dos diversos meios de
cultivo descritos na literatura e qual organismo é beneficiado pela
formulação proposta (Tabela 1).
Processo de isolamento: após a contagem devem-se escolher
dois frascos das duas diluições mais altas e repicar para novo meio
semissólido. Após dois a três dias de incubação, nos frascos com
película positiva inicia-se o processo de riscagem em placa usando
a mesma formulação do meio semissólido utilizado na etapa
anterior, mas desta vez deve-se utilizar a quantidade de ágar
necessária para torná-lo sólido (15%), além de uma pequena dose
de extrato de levedura (50 mg por litro). As colônias isoladas devem
ser repicadas novamente para meios semissólidos. Após a
formação da película característica, devemos fazer a fase de
purificação que consiste da utilização de meios ricos (exemplos: LB,
DYGS, TY, etc.) para verificar se temos apenas uma colônia por
placa, e proceder o estoque inicial da bactéria. Novamente temos
diversos meios ricos que podem ser utilizados. Os mais comuns são
o batata (DÖBEREINER et al., 1995), o caldo nutritivo (fórmula
disponível no mercado), SYP (CABALLERO-MELLADO;
MARTINEZ-ROMERO, 1994), Dygs (RODRIGUES NETO et al.,
1986).

Tabela 1. Meios de cultivo semissólidos desenvolvidos para o isolamento de bactérias


fixadoras de nitrogênio, sem adição de nitrogênio.

Nome do meio de cultivo


Espécie privilegiada Referências
e fonte de carbono

Azospirillum
brasilense, A. NFb – ácido málico Döbereiner et al. (1995)
lipoferum

Azospirillum
LGI – açúcar cristal Baldani (1984) e Döbereiner et al. (1995)
amazonense

Döbereiner et al. (1995) e Reis et al.


Gluconacetobacter LGI-P – açúcar cristal
(1994)
Burkholderia (B. LGI e JMV – açúcar Baldani et al. (1996), Döbereiner et al.
tropica, B. cristal e malato; BAz – (1995), Estrada-de Los Santos et al.
silvatlantica e ácido azelaico (2001) e Reis et al. (1994)
outros)

Herbaspirillum
seropedicae, JNFb Baldani et al. (1992)
H. rubrisubalbicans

Azoarcus SM Reinhold et al. (1986)

Döbereiner et al. (1995), Loiret et al.


Pantoea LGI-P
(2004) e Reis et al. (1994)

Sphingomonas JNFb Baldani et al. (1992) e Videira et al. (2004)

2.1. Caracterização morfológica dos isolados

Para verificação da morfologia celular, devemos montar lâminas


para visualização ao microscópio ótico de contraste de fase. O
melhor será fazer uma nova inoculação no meio semissólido de
culturas jovens, com 24 a 48 horas de crescimento. Nesse caso
também anotamos informações sobre a motilidade das células. O
crescimento nos diversos meios de cultivo também deve ser
anotado.

2.2. Caracterização morfológica de colônias

É importante considerar que nesta etapa deve-se usar mais do


que um meio de cultura para a avaliação, pois diversas bactérias
apresentam morfologia de colônia diferente em relação ao pH e
outros componentes do meio. A seguir é apresentado um protocolo
para a caracterização morfológica de colônias. As células de uma
bactéria isoladas e crescidas em meio semissólido LGI-P foram
riscadas em placas de Petri contendo o mesmo meio. Por se tratar
de um meio semiespecífico, apesar de permitir observar morfologia
de colônias típica de uma espécie, não permite visualização de
possíveis variações entre os isolados. Portanto, os isolados foram
riscados em placas contendo meio sólido Batata-P e SYP. Nos
isolados crescidos em meio Batata-P, foram avaliadas apenas a
presença e a intensidade de pigmento, já nos isolados crescidos em
SYP foram avaliados: tamanho (anotar dimensão, menor que 1 mm,
maior que 1 mm) e forma (puntiforme, circular ou irregular). Outros
critérios utilizados para a caracterização morfológica de colônias são
elevação, borda e superfície da colônia. Abaixo (Figura 1) estão
apresentados esquemas de tipos de elevação, bordas e superfícies
geralmente observados.

Figura 1. Esquemas de tipos de elevação, bordas e superfícies para a caracterização


morfológica de colônias.
Fonte: Yano (1993).

2.3. Uso de fontes de carbono

Para avaliar a capacidade dos isolados de utilizar diferentes


fontes de carbono, pode-se usar a mesma receita do meio
semissólido utilizado no isolamento e variar a fonte de carbono que
pode ser substituída por açúcares como glicose, frutose, sacarose,
arabinose, ribose, galactose, açúcares-álcoois – mio-inositol, sorbitol
e adonitol. Fazer a solução estoque de forma a aplicar 100 µL da
fonte de carbono na concentração de 10 mM. Todas as fontes
devem ser esterilizadas por filtração (Millipore®, 0,2 µm). O inóculo
deve ser crescido em meio líquido e de preferência sem limitações
(meio rico), e com o auxílio de uma micropipeta inocular 20 µL deste
nos frascos. Fazer duas repetições para cada fonte de carbono.
Após a inoculação (30 °C por 3 a 5 dias), observar a formação de
película característica, correspondendo à capacidade de uso da
determinada fonte de carbono.
Outra forma de avaliar fontes de carbono é adquirir kits desen‐
volvidos para esse fim. No mercado existe o Biolog® e o API®. A
capacidade de utilização das diversas fontes de carbono é feita pela
visualização da cor roxa produzida pela redução do indicador
tetrazolium. A cor é medida por espectroscopia ou pelas simples
marcações de positivo (roxo) e negativo (sem alteração da cor).
Esses dados são fornecidos ao programa Bio, do Kit Biolog, que
identifica o gênero e espécie, ou a similaridade do isolado com
algum gênero já descrito.

2.4. Atividade da nitrogenase

A atividade da nitrogenase pode ser medida pela redução do


acetileno, inibidor competitivo da enzima. A técnica da redução de
acetileno (ARA) foi descrita por Boddey e Knowles (1987), e a ativi‐
dade específica é quantificada dividindo-se a atividade total de ARA
pela proteína total acumulada pelas bactérias durante o cultivo,
determinada pelo método descrito por Lowry et al. (1951) ou outro
de sua preferência. Antes de escolher o método recomenda-se que
seja feito uma curva de calibração contendo proteína comercial (tipo
BSA) preparada no meio utilizado durante o cultivo, para avaliar
possíveis interferências de componentes do meio sobre a
linearidade e sensibilidade do método de dosagem de proteínas. Os
isolados são cultivados como descrito no item anterior para uso de
fonte de carbono, e uma alíquota de 20 µL da cultura crescida é
inoculada no centro do meio de cultura, em frascos com capacidade
de 10 mL, contendo 5 mL de meio de cultura semissólido com a
fonte preferencial utilizada pela bactéria. Os frascos são incubados
no escuro a 30 °C por 48 horas. Após a formação da película na
superfície do meio de cultura, os frascos são fechados com rolhas
de borracha perfurável, e 0,5 mL de acetileno será injetado usando
uma seringa. Esse volume de injeção corresponde a 10% da fase
gasosa do frasco. Após a injeção das amostras testes e do controle
contendo apenas o meio de cultura sem bactérias, os frascos serão
incubados por 1 hora a 30 °C. A seguir procede-se a avaliação do
etileno produzido por meio da injeção de 0,5 mL da fase gasosa das
amostras em cromatógrafo a gás com detector por ionização de
chama. O resultado é obtido por meio de um integrador digital de
marca PE Nelson modelo 1022 que está acoplado ao cromatógrafo.
O integrador recebe o sinal do cromatógrafo e o converte em
gráfico, calculando a área e altura do pico e comparando-as com a
curva padrão usada na calibração do aparelho; dessa maneira,
obtém-se a concentração do gás etileno contido na fase gasosa das
amostras. Após a leitura de ARA, as amostras são homogeneizadas
para misturar a película ao meio de cultura e realizada a
determinação de proteínas totais (GUEDES et al., 2007). O princípio
do método baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e
ácido fosfórico (reagente de Fenol-Ciocalteau), que sofre redução
quando reage com proteínas na presença de cobre e produz um
composto com absorção máxima em 750 nm. Em tubos de ensaio,
foram adicionados 0,1 mL de amostra, 0,4 mL de água destilada
estéril, para diluir a amostra e não saturar o método, e 0,5 mL de
NaOH 1 M, agitados e postos em banho-maria a 100 oC por 5
minutos para lisar as células e desnaturar o ágar. Após atingir
temperatura ambiente, adiciona-se 0,25 mL de regente de Lowry,
agitam-se os tubos e incubam-se no escuro por 10 minutos. Em
seguida coloca-se 0,5 mL da solução do Reativo Fenol Ciocalteau,
diluído na proporção de 1 porção de reagente para 2 porções de
água destilada estéril, agitados e incuba-se no escuro por 30
minutos. Após incubação, é efetuada leitura de absorbância em
espectrofotômetro com filtro de 750 nm. Os valores de absorbância
das amostras são multiplicados por 10 (correção pelo uso de 100 µL
de amostras, para obter o resultado em mL), e a concentração de
proteínas determinada usando como padrão curva obtida pelos valo‐
res de absorbância de amostras com quantidades conhecidas da
proteína albumina bovina. O valor da concentração de proteína será
multiplicado pela quantidade de meio de cultura em que a bactéria
estava crescendo.
A atividade de redução de acetileno é dada por nmol de etileno
produzido por hora de incubação (neste caso 1 hora) e dividido pelo
valor de absorbância obtido pela análise de proteínas totais, resul‐
tando em nmol de etileno por mg de proteínas totais, quantificando
dessa maneira a atividade específica da nitrogenase dos isolados.

2.5. Secreção de auxina

Embora a produção de auxina não seja um processo vinculado à


FBN, normalmente se faz a análise de excreção de auxinas nas
estirpes isoladas. Esse método colorimétrico é bem simples e
permite agregar valor ao isolado. Estirpes produtoras de auxinas
atuam no sistema radicular e podem aumentar a superfície das
raízes, melhorando a absorção das plantas e indiretamente a área
de benefício à colonização, por aumentar os pontos de entrada e de
excreção de fontes de carbono, beneficiando o estabelecimento de
bactérias.
A determinação colorimétrica da concentração de auxina no
sobrenadante de culturas de bactérias endofíticas tem sido descrita
em diversos trabalhos (CARREÑO-LOPEZ et al., 2000; GLICKMAN;
DESSAUX, 1995) e foi modificada para o formato de microplacas de
96 poços (SCHWAB et al., 2007). De fato, a técnica colorimétrica
detecta outros compostos indólicos além de auxina, por isso
seremos aqui mais genéricos quanto à terminologia. Após cultivo em
meio líquido apropriado (Tabela 1), 200 µL de cultura são
transferidos para poço de uma placa-filtro Multiscreen-GV (Millipore)
e filtrados por centrifugação a 2.500 g por 5 minutos para poço de
uma outra placa de 96 poços. 100 μL dessa solução filtrada são
transferidos para poço de uma placa de ELISA de 96 poços. São
adicionados 100 µL de uma variação de reagente de Salkowski
(FeCl3 55 mmol/L, H2SO4 7,9 mol/L), fechando em seguida com
tampa adesiva. O sistema é incubado por 30 minutos, sob ausência
de luz, à temperatura ambiente. Os valores de absorbância são
determinados a 550 nm utilizando um leitor automático de
microplacas. Para relacionar a concentração de compostos indólicos
com o número de células na cultura, a D.O.600 da amostra também é
determinada. Para isso, são transferidos 200 μL de cultura para
poço de uma placa de ELISA, e a absorbância é determinada a 600
nm de modo semelhante à determinação a 550 nm. Recomenda-se
a realização dos experimentos em quadruplicata.
Além do método colorimétrico, a secreção de auxina pode ser
acompanhada por cromatografia em camada delgada (CCD) em gel
de sílica, essencialmente como descrito (EHMANN, 1977), ou por
cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). No caso da bac‐
téria Herbaspirillum seropedicae, CCD foi utilizada com sucesso
para acompanhar os níveis de auxina secretada (SCHWAB et al.,
2007), sendo potencialmente aplicável a outras espécies de
endófitos. 20 mL de cultura são centrifugados a 15.000 g, e o
sobrenadante coletado. O pH do sistema é ajustado para ≈1,0 por
meio da adição de solução HCl concentrada. A solução resultante é
extraída com 1 volume de clorofórmio. A fase orgânica inferior é
coletada e concentrada cerca de 15 vezes por evaporação.
Aproximadamente 30 µL são aplicados gradualmente na placa de
gel de sílica, de forma a concentrar a amostra por evaporação do
solvente em uma área circular em torno de 3 mm de diâmetro. O
sistema de solventes de CCD consiste de uma mistura:
clorofórmio:metanol:água na proporção 84:14:1. Após a CCD, a
placa é seca a 45 °C–60 °C por 5 a 10 minutos e fotografada sob luz
UV (254 nm). Para a revelação dos compostos indólicos, a placa é
borrifada na posição vertical, até a sílica adquirir um aspecto úmido,
com o reagente de van Urk–Salkowski (EHMANN, 1977). O
reagente de van Urk consiste de 1 g de p-dimetilaminobenzaldeído
dissolvido em 50 mL de solução HCl concentrada (massa específica
1,19 g/cm3), adicionado de 50 mL de etanol 96%. O reagente de van
Urk–Salkowski consiste de uma mistura reagente dos dois na
proporção 1:3. A placa é incubada em estufa a 100 °C por 5 minutos
e depois resfriada à temperatura ambiente. A placa é lavada 3 vezes
por imersão em ddH2O, agitando cuidadosamente por 1 minuto cada
ciclo, pois nessa etapa o gel de sílica pode descolar-se da placa. O
excesso de umidade da placa pode ser eliminado por mata-borrão
com papel toalha, e as cores das bandas são comparadas com as
da literatura (cores com a placa úmida) (EHMANN, 1977). A placa
pode ser seca a 45 °C–60 °C por 20 a 30 minutos, e novamente as
cores das bandas são comparadas com as da literatura (cores com
a placa seca) (EHMANN, 1977).

2.6. Caracterização molecular

Atualmente, uma etapa importante no processo de caracteri‐


zação e descrição de isolados é o uso de técnicas moleculares.
Informações genéticas associadas às fenotípicas geram
informações mais detalhadas sobre o isolado e permitem uma
abordagem polifásica. Dentre as várias técnicas moleculares
descritas a partir da década de 1980, as que mais apresentam
poder de gerar informações claras e descritivas de uma espécie
assim como de sua variabilidade genética intrínseca são baseadas
no uso de sequências de DNA da região codificadora de genes
ribossomais e espaços intergênicos. O uso da técnica de Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificar sequências dessas
regiões do genoma resulta em amplificação exponencial do número
de cópias do gene-alvo ou de uma região intergênica. O produto
dessas reações é então utilizado em reações de restrição na
presença de endonucleases, as quais promovem cortes em sítios
específicos caracterizados por sequências de bases nucleotídicas.
Durante a reação de PCR é necessário usar os seguintes rea‐
gentes em determinadas concentrações: DNA extraído a partir do
organismo alvo, 1 par de sequências iniciadoras também
conhecidas como primers, mistura de desoxinucleosídeos
trifosfatados para as 4 bases do DNA (dNTPs), MgCl2, tampão de
reação comercial e a Taq DNA polimerase. Uma reação de
amplificação padrão deve conter esses reagentes em concentrações
descritas na Tabela 2.

Tabela 2. Reagentes e concentrações utilizadas em uma reação padrão de PCR.

Quantidade para uma reação de


Reagente Concentração final
50 µL

Água milli-Q estéril (livre de


– Variável
nucleases)

Tampão de reação 10X 1X 5 µL

200 µM de cada
Mistura de dNTP 10 mM 1 µL
dNTP

MgCl2 50 mM 1 mM–4 mM(1) Variável

Primer I 0,1 µM–1 µM Variável

Primer II 0,1 µM–1 µM Variável

DNA molde 10 µg–1 µg Variável

Taq DNA polimerase 5 U/µL 1,25 U 50 µL-1 0,25 µL


(1)
A concentração desse reagente pode variar de acordo com o conjunto de primers
utilizado e
deve ser testado utilizando um DNA amplificado anteriormente como controle positivo.

Os primers utilizados foram descritos por Young et al. (1991): Y1


(5’-TGGCTCAGAA CGAACGCTGGCGGC – 3’) e Y3 (5’–
CTAGACCC CACTTCAGCATTGTTCCAT–3’). No entanto, existe
uma diversidade de primers que pode ser utilizada para obter as
sequências do gene 16S inclusive pelo sequenciamento (CRUZ et
al., 2001). No caso da amplificação de região reconhecida como
espaço intergênico localizado entre os genes 16 e 23S DNAr, são
utilizados os primers PHR e P23 (ARTURO et al., 1995). As
condições de amplificação no termociclador variam de acordo com o
conjunto de primers utilizado. Para os primers Y1 e Y3, é utilizado o
seguinte conjunto de etapas da PCR: 1) desnaturação inicial a 95 ºC
por 2 minutos; 2) 35 ciclos em sequência de desnaturação a 92 ºC
durante 45 segundos, anelamento a 60 ºC durante 45 segundos e
extensão a 72 ºC durante 2 minutos; 3) etapa final de extensão a 72
ºC durante 5 minutos. Para os primers PHR e P23 o programa da
PCR é: 1) desnaturação inicial a 95 ºC por 3 minutos; 2) 35 ciclos
em sequência de desnaturação a 94 ºC durante 30 segundos,
anelamento a 48 ºC durante 1 minuto e extensão a 72 ºC durante 1
minuto e 30 segundos; 3) etapa final de extensão a 72 ºC durante
10 minutos. Em alguns casos, pode ser necessário alterar algumas
dessas condições de amplificação em razão da origem da amostra
ou qualidade do DNA e de primers utilizados. Os fragmentos
amplificados devem ser observados após eletroforese em gel de
agarose 1,2%, em tampão TAE, a 65V, por 2,5 horas. As bandas
resolvidas no gel são visualizadas após coloração com brometo de
etídeo (5 µg/mL), sob iluminação ultravioleta, e registradas por
sistemas de fotodocumentação ou fotografia utilizando equipamento
com filtro adequado para UV. Os produtos de amplificação obtidos a
partir das amostra de DNA avaliadas podem ser utilizados
diretamente para aplicação de outras técnicas moleculares ou
mantidos em freezer -20 ºC.
Após obtenção do produto de PCR dos isolados, é possível
utilizar as técnicas de restrição do DNA ribossomal amplificado
(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis – Ardra) e análise do
espaço intergênico ribossomal (Ribosomal Intergenic Spacer
Analysis – Risa) para avaliar, respectivamente, a variabilidade
genética entre espécies e intraespecífica (AZEVEDO et al., 2005;
GUEDES et al., 2008; REIS JÚNIOR et al., 2004). Essas técnicas se
baseiam na análise do perfil de fragmentos gerados após digestão
do produto da amplificação (DNA amplificado) com endonucleases
que reconhecem uma sequência específica do DNA, também
conhecidas como enzimas de restrição. Dentre as várias enzimas de
restrição disponíveis comercialmente, recomendamos iniciar os
estudos de perfil de restrição dos isolados com HaeIII, AluI, RsaI ou
CfoI. Para um volume final de 20 µL de reação, cada sistema de
restrição deve conter: produto de PCR equivalente a 0,1 µg–0,5 µg
de DNA (volume variável), 5U da enzima de restrição (volume
variável), 2 µL de tampão de reação 10X (fornecido comercialmente
junto com a enzima) e água milli-Q estéril para ajustar o volume final
da reação. As reações de restrição dos produtos de PCR devem ser
incubadas a 37 ºC, por no mínimo 3 horas ou até 16 horas. Após
incubação, os produtos da reação de restrição devem ser
submetidos à eletroforese em gel de agarose (3% em tampão TAE
1X), a 50 V por 4 horas. Posteriormente, após coloração com
brometo de etídeo, os géis devem ser visualizados sob luz
ultravioleta, e a imagem deve ser registrada por equipamento de
fotodocumentação ou fotografada.
Os resultados obtidos na forma de perfil de bandas específicas
para cada tipo de enzima utilizada correspondem a um padrão
comum aos isolados que apresentam sequências similares e
consequentemente formam um grupo. Para realizar o agrupamento,
deve ser construída uma matriz binária, com os dados obtidos da
análise do universo total das bandas, de todos os perfis gerados
pelas quatro enzimas. Para cada posição de migração são
atribuídos os valores 1 ou 0, indicando a presença ou ausência de
uma banda. Os padrões de migração gerados podem então ser
comparados, e suas semelhanças estimadas pelo coeficiente de
Jaccard, em que J = a/(n - d), sendo a o número de combinações
com a presença dos fragmentos menos as combinações de
ausência dos fragmentos, d é o número de combinações de
ausência de fragmentos, e n é o número de combinações possíveis.
Os isolados são então agrupados pelo método das médias das
distâncias, e a representação dos grupos presentes é feita por um
dendrograma utilizando software adequado.

2.7. Expressão gênica


Uma tecnologia para o estudo da expressão e regulação gênica
de um organismo, com ênfase na identificação e caracterização de
promotores ou genes responsivos a uma dada condição de cultivo, é
a técnica de promoter trap (captura de promotores) ou gene trap
(captura de genes). Essa metodologia tem sido aplicada com
sucesso em trabalhos envolvendo bactérias que se associam a
plantas (HAAPALAINEN et al., 1996; RAMÍREZ-ROMERO et al.,
2006; ZHANG; CHENG, 2006), e faz uso de um vetor cuja
característica principal é a de apresentar um sítio múltiplo de
clonagem adjacente a um gene repórter sem promotor (DUNN;
HANDELSMAN, 1999). Bibliotecas contendo fragmentos de DNA
clonados em frente ao gene repórter podem ser utilizadas para
estudar a atividade dos promotores em diversas condições de
cultivo. Um gene repórter bastante utilizado é lacZ, que codifica a
enzima b-galactosidase. As triagens que utilizam os ensaios dessa
enzima têm sua metodologia bem estabelecida (MILLER et al.,
1970).
Utilizando estirpes transformadas com plasmídeos repórteres,
ensaios de atividade específica de b-galactosidase envolvendo A.
brasilense, A. lipoferum e H. seropedicae têm sido descritos
(KATUPITIYA et al., 1995; LIANG et al., 1991; PEDROSA et al.,
1997); em relação a G. diazotrophicus, temos realizado ensaios
dessa enzima com sucesso. São transferidos 40 µL de cultura em
triplicata ou quadruplicata ou de meio de cultura (branco da reação)
para poço de uma placa de 96 poços de 2,2 mL contendo 360 µL de
tampão Z (SDS 0,27%, b-mercaptoetanol 0,39%, Na2HPO4.7H2O 60
mmol/L, NaH2PO4.H2O 40 mmol/L, KCl 10 mmol/L, MgSO4.7H2O 1
mmol/L, pH 7,0). São adicionados 25 µL de clorofórmio. A placa é
fechada com uma tampa adesiva. Mistura-se por agitador de tubo
tipo vórtex (cerca de 2 minutos), centrifugando brevemente e
deixando estabilizar em banho-maria a 28 °C ou à temperatura
ambiente, por 10 minutos. Para iniciar a reação, são adicionados 80
µL de solução de o-nitrofenil-b-D-galactopiranosídeo (ONPG) 4
mg/mL em tampão Z, e, depois de determinado período de tempo
conforme o desenvolvimento da coloração amarela, são
adicionados 200 µL de uma solução de Na2CO3 1 mol/L para
interromper a reação. A mistura é centrifugada a 2.600 g utilizando
rotor para placas durante 10 minutos. 200 µL da fase aquosa
superior são transferidos para uma placa de ELISA de 96 poços
para a leitura da A415 em leitor de microplacas.
A atividade específica de b-galactosidase pode ser apresentada
em nanomoles de o-nitrofenol (ONP) formados por minuto por
miligrama de proteína total (nmol ONP/min/mg prot), pela seguinte
equação:

em que V é o volume de amostra ensaiado (0,040 mL); t é o tempo


de reação (em minuto); [prot] é a concentração de proteína
determinada (em mg/mL); e 255 nmol ONP representa um fator de
conversão entre A415 e nmol de ONP formado (MILLER, 1972). Os
valores de atividade específica de b-galactosidase, referente às
condições de cultivo diversas, podem ser comparados por meio do
teste t bilateral, 95% de intervalo de confiança.

3. Testes em plantas – avaliação efeito


agronômico

Fase 1: seleção de estirpes em substrato estéril

A melhor maneira de se avaliar o efeito de estirpes selecionadas


do ambiente no crescimento de uma determinada planta é instalar
um ensaio em casa de vegetação utilizando substrato estéril e que
não é solo. O solo esterilizado favorece o desenvolvimento de
fungos que podem inviabilizar seu ensaio. O substrato mais barato é
a areia lavada (de rio ou mar). A lavagem é feita em tanques com
água de boa procedência. A areia é misturada com vermiculita
expandida comercial na proporção de 2:1 – v/v. A esterilização a
120 oC por 60 minutos é repetida novamente após resfriamento de
24 horas. O procedimento a seguir é fazer a análise de solo e
adequar os nutrientes para a cultura alvo, lembrando que esses
ensaios são de curta duração, 45 dias aproximadamente,
dependendo do substrato. A procedência da semente deve ser
levada a sério e não possuir agentes de conservação como
fungicidas e inseticidas. Caso não seja possível receber um lote de
sementes antes do tratamento, passar as sementes por álcool 70%
diversas vezes até o produto não ser mais notado visualmente e
lavar com água ao final. O inóculo será testado quanto à pureza
(placa com meio rico) e deverá crescer por 48 horas. A estirpe
crescida em meio líquido será aplicada sobre a semente (1 mL)
contendo o mesmo número de células que deve ser ajustado pela
densidade ótica calibrada pela contagem em câmara de Neubawer.
Cada semente receberá 1 mL da suspensão.
Os controles recomendados são testemunha sem o inoculante e
sem N e duas testemunhas não inoculadas mas adubadas com a
metade e a dose total de N recomendada para cada cultura. O deli‐
neamento utilizado será de blocos ao acaso com quatro repetições.
As avaliações consistem da medida da matéria fresca e seca das
raízes e parte aérea das plantas. O volume e área radicular devem
ser medidos pelo programa de análise de raízes desenvolvido pela
Embrapa Instrumentação Agropecuária (Siarcs) ou por outra
metodologia disponível.

Fase 2: seleção em solo não estéril

As melhores estirpes são testadas em vasos preenchidos com


solo pobre em nitrogênio. A inoculação procederá da mesma forma
citada acima. O delineamento experimental é de blocos ao acaso
com quatro repetições e com os mesmos controles. Os mesmos
parâmetros devem ser avaliados. Essa fase permite avaliar se a
estirpe selecionada na fase 1 é competitiva e mantém a resposta
quando o substrato contém a biota nativa do solo. Essa fase se
justifica se o número de bactérias selecionadas na fase 1 for
elevado. Caso o ensaio selecionou um número pequeno de estirpes,
a melhor maneira é instalar um ensaio no campo.

Fase 3: ensaio no campo de cultivo

Devemos limitar o número de estirpes testadas nas fases ante‐


riores e montar um ensaio com área útil representativa, usando as
recomendações da cultura quanto ao espaçamento, à adubação,
forma de manejo, etc. Recomendam-se nesse caso seis repetições
por tratamento em razão da variabilidade dos sistemas biológicos
(estirpe). Quanto ao local, devemos implantar o ensaio onde seja
mais fácil acompanhar o desenvolvimento da cultura. Caso o
sucesso da inoculação ocorra, devemos implantar ensaios em
outros locais e repeti-los por pelo menos dois anos em virtude da
variabilidade de clima. Como a maioria das plantas, não há
recomendação de genótipos mais responsivos para a FBN;
devemos utilizar materiais selecionados para baixa resposta a
nitrogênio nos ensaios iniciais e depois expandir o uso para
materiais contrastantes. Como tratamos de uma resposta da planta
à inoculação, a escolha sobre o material genético é muito
importante. No caso de plantas em que o melhoramento genético
ainda não evoluiu, devemos escolher sementes de mesmo tamanho
e origem (lote). A inoculação nesse caso deve ser preparada
conforme o descrito para o rizóbio que mistura a estirpe com um
veículo que permite a bactéria aderir à semente. No caso de plantas
propagadas por colmos, devemos fazer a imersão no inóculo com
densidade ótica conhecida, em torno de 108 a 109 células por mL. A
produção (no caso de grãos – 14% de umidade) e N total no grão
são parâmetros a serem analisados. Avaliações do stand (número
de plantas), número de espigas por planta (ex.: milho, panículas no
arroz, etc.), peso médio de espigas entre outras análises de
produtividade podem e devem ser incluídas. O conteúdo total de N
será determinado pela digestão de Kjeldahl, seguida de destilação e
titulação, conforme descrito em Bremner e Mulvaney (1982).

4. Quantificação da contribuição da FBN

Existem vários métodos disponíveis na literatura que permitem


avaliar a contribuição da FBN. Talvez o fator limitante seja o equipa‐
mento necessário para a escolha de uma metodologia em
detrimento de outra. Embora esse fator possa ser contornado por
meio de parcerias com outras instituições, devemos dar ênfase à
seleção de alguns parâmetros iniciais que permitem avaliar o
sistema no qual estamos trabalhando. Podemos começar com o
balanço de N no sistema solo-planta. Isso significa que todas as
entradas e saídas, tais como o N do solo (inicial e final), da semente
e da planta ao final do ciclo ou qualquer outra entrada, são
quantificadas. Se no final houver mais nitrogênio do que no início,
isso representa que houve ganho via FBN. O balanço de nitrogênio
é uma metodologia fácil de aplicar, e embora algumas perdas de N
por volatilização sejam difíceis de controlar, podemos usar formas
de N pouco voláteis. Um outro método mais preciso de medir o
ganho atribuído à FBN é pela marcação do N do solo com um
isótopo mais pesado do nitrogênio, o 15N. Essa marcação pode ser
feita por meio da utilização direta do adubo ou da incorporação de
material marcado que tenha sido cultivado previamente. Desde que
a marcação do solo esteja estável, essa técnica pode estimar a
entrada do N do ar, que irá diluir a quantidade da marcação do N no
material analisado. Também pode ser feita a incorporação direta na
forma de gás, mas essa medida é possível por um curto intervalo de
tempo. Outra técnica usa o 15N naturalmente presente no solo. Essa
técnica pode ser empregada uma vez que o N do solo é enriquecido
em 15N em comparação ao N2 do ar (SHEARER et al., 1978). A
planta não fixadora apresenta uma abundância natural de 15N muito
semelhante a do N disponível do solo, enquanto que a planta
fixadora de N2 apresenta valores de abundância de 15N que mais se
aproximam de zero quanto maior for a atividade fixadora das
bactérias a elas associadas.
Para a estimativa da FBN por meio da abundância natural de
d N utiliza-se a seguinte expressão:
15

em que P é a % de fixação biológica de N, d15N solo é o valor de


d15N encontrado na planta testemunha coletada em cada parcela
experimental, e B é o fator de correção do fracionamento isotópico
que no caso das gramíneas é considerado zero. Em virtude de dife‐
renças do desenvolvimento radicular entre as plantas em avaliação
e as plantas controle, amostras de várias profundidades do solo
serão retiradas para avaliar a uniformidade de marcação natural de
15
N no perfil do solo. Dependendo da uniformidade de marcação do
solo, as espécies espontâneas deverão ser selecionadas em função
do aprofundamento de raízes e exploração do solo.

5. Considerações finais

A exemplo do uso do inoculante de rizóbio na agricultura, muitos


outros produtos podem vir a ser desenvolvidos para utilização em
plantas diferentes das leguminosas. O entendimento das relações
entre plantas e bactérias aumentou muito com o advento de
métodos moleculares e instrumentos de visualização como novos
microscópios e técnicas de marcação. Sabe-se hoje que apenas
uma pequena parcela da diversidade microbiana do solo foi
descoberta, e que os microrganismos colonizam os diversos tecidos
vegetais. Por um lado podemos esperar que a ciência desenvolva
novos produtos biotecnológicos que podem substituir parcialmente
ou totalmente a aplicação de nitrogênio fertilizante em plantas e que
eles estejam disponíveis para uso nos próximos anos, mas, por
outro lado, estamos cientes da diversidade de nichos a serem
colonizados e pouco conhecemos sob a interação de uma nova
estirpe no solo ou em uma planta.

6. Referências

ARTURO, A.; ODELSOR, D. A.; HICHEY, R. F.; TIEDJE, J. M. Bacterial community


fingerprint of amplified 16S and 16S-23S ribosomal DNA gene sequences and restriction
endonuclease analysis (ARDRA). In: AKKERMANS, A. D. L.; ELSAS, J. D. van; BRUIJN, F.
J. de. (Ed.). Molecular microbial ecology manual. Dordrecht: Kluwer Academic, 1995. p. 1-8.
AZEVEDO, M. S.; TEIXEIRA, K. R. S.; KIRCHHOF, G.; HARTMANN, A.; BALDANI, J. I.
Influence of soil and host plant crop on the genetic diversity of Azospirillum amazonense
isolates. Pedobiologia, Jena, v. 49, n. 6, p. 565-576, 2005.
BALDANI, J. I. Ocorrência e caracterização de Azospirillum amazonense em comparação com
as outras espécies deste gênero, em raízes de milho, sorgo e arroz. 1984. 110 f. Dissertação
(Mestrado em Ciências de Solo) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Itaguaí,
1984.
BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I.; DÖBEREINER, J. Meios de cultura específicos para o
isolamento de bactérias endofíticas que fixam N2 atmosférico. Seropédica: Embrapa
Agrobiologia, 1996. 4 p. (Embrapa-CNPAB. Comunicado Técnico, 12).
BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I.; OLIVARES, F. L.; DÖBEREINER, J. Identification and
ecology of Herbaspirillum seropedicae and the closely related Pseudomonas
rubrisubalbicans. Symbiosis, Rehovot, v. 13, n. 1-3, p. 65-73, 1992.
BODDEY, R. M.; KNOWLES, R. Methods for quantification of nitrogen fixation associated
with gramineae. Critical Review in Plant Science, Boca Raton, v. 6, n. 3, p. 209-266, 1987.
BREMNER, J. M.; MULVANEY, C. S. Nitrogen: total. In: PAGE, A. L.; MILLER, R. H.;
KEENEY, D. R. (Ed.). Methods of soil analysis. Madison: American Society of Agronomy,
1982. p. 595-624.
CABALLERO-MELLADO, J.; MARTINEZ-ROMERO, E. Limited genetic diversity in the
endophytic sugarcane bacterium Acetobacter diazotrophicus. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, DC, v. 60, n. 5, p. 1532-1537, 1994.
CARREÑO-LOPEZ, R.; CAMPOS-REALES, N.; ELMERICH, C.; BACA, B. E. Physiological
evidence for differently regulated tryptophan-dependent pathways for indole-3-acetic acid
synthesis in Azospirillum brasilense. Molecular and General Genetics, New York, v. 264, n. 4,
p. 521-530, 2000.
CRUZ, L. M.; SOUZA, E. M.; WEBER, O. B.; BALDANI, J. I.; DÖBEREINER, J.;
PEDROSA, F. O. 16S ribosomal DNA characterization of nitrogen-fixing bacteria isolated
from banana (Musa spp.) and pineapple (Ananas comosus (L.) Merril). Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 67, n. 5, p. 2375-2379, 2001.
DÖBEREINER, J.; BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I. Como isolar e identificar bactérias
diazotróficas de plantas não-leguminosas. Brasília, DF: Embrapa-SPI, 1995. 60 p.
DUNN, A. K.; HANDELSMAN, J. A vector for promoter trapping in Bacillus cereus. Gene,
Amsterdam, NL, v. 226, p. 297-305, 1999.
EHMANN, A. The van Urk-Salkowski reagent: a sensitive and specific chromogenic reagent
for silica gel thin-layer chromatographic detection and identification of indole derivatives.
Journal of Chromatography, Amsterdam, NL, v. 132, p. 267-276, 1977.
ESTRADA-DE LOS SANTOS, P.; BUSTILLOS-CRISTALES, R.; CABALLERO-MELLADO,
J. Burkholderia, a genus rich in plant-associated nitrogen fixers with wide environmental
and geographic distribution. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v.
67, n. 6, p. 2790-2798, 2001.
GLICKMAN, E.; DESSAUX, Y. A critical examination of the specificity of the Salkowski
reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 61, n. 2, p. 793-796, 1995.
GUEDES, H. V.; PERIN, L.; REIS, V. M.; BALDANI, J. I.; TEIXEIRA, K. R. S. Quantificação
de proteínas totais de bactérias diazotróficas crescidas em meio de cultivo semi-sólido.
Seropédica: Embrapa Agrobiologia, 2007. 4 p. (Embrapa-CNPAB. Comunicado Técnico,
95).
GUEDES, H. V.; SANTOS, S. T.; PERIN, L.; TEIXEIRA, K. R. S.; REIS, V. M.; BALDANI, J.
I. Polyphasic characterization of Gluconacetobacter diazotrophicus isolates obtained from
different sugarcane varieties. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 39, p. 718-
723, 2008.
HAAPALAINEN, M.; KARP, M.; METZLER, M. C. Isolation of strong promoters from
Clavibacter xyli subsp. cynodontis using a promoter probe plasmid. Biochimica et Biophysica
Acta: Gene Structure and Expression, Amsterdam, NL, v. 1305, n. 3, p. 130-134, 1996.
KATUPITIYA, S.; NEW, P. B.; ELMERICH, C.; KENNEDY, I. R. Improved N2 fixation in 2,4-D
treated wheat roots associated with Azospirillum lipoferum: studies of colonization using
reporter genes. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 27, p. 447-452, 1995.
LIANG, Y. Y.; KAMINSKI, P. A.; ELMERICH, C. Identification of a nifA-like regulatory gene of
Azospirillum brasilense Sp7 expressed under conditions of nitrogen fixation and in the
presence of air and ammonia. Molecular Microbiology, Oxford, v. 5, n. 11, p. 2735-2744,
1991.
LOIRET, F. G.; ORTEGA, E.; KLEINER, D.; ORTEGA-RODÉS, P.; RODÉS, R.; DONG, Z. A
putative new endophytic nitrogen-fixing bacterium Pantoea sp. from sugarcane. Journal of
Applied Microbiology, Danvers, v. 97, n. 3, p. 504-511, 2004.
LOWRY, O. H.; ROSEBROUGH, N. J.; FARR, A. L.; RANDALL, R. J. Protein measurement
with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, Baltimore, v. 193, n. 1, p. 265-
276, 1951.
MILLER, J. H. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1972.
MILLER, J. H.; REZNIKOFF, W. S.; SILVERSTONE, A. E.; IPPEN, K.; SIGNER, E. R.;
BECKWITH, J. R. Fusions of the lac and trp regions of the Escherichia coli chromosome.
Journal of Bacteriology, Washington, DC, v. 104, p. 1273-1279, 1970.
PEDROSA, F. O.; TEIXEIRA, K. R. S.; MACHADO, I. M. P.; STEFFENS, M. B. R.;
KLASSEN, G.; BENELLI, E. M.; MACHADO, H. B.; FUNAYAMA, S.; RIGO, L. U.; ISHIDA,
M. L.; YATES, M. G.; SOUZA, E. M. Structural organization and regulation of the nif genes
of Herbaspirillum seropedicae. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 29, p. 843-846,
1997.
RAMÍREZ-ROMERO, M. A.; MASULIS, I.; CEVALLOS, M. A.; GONZÁLEZ, V.; DÁVILA, G.
The Rhizobium etli σ70 (SigA) factor recognizes a lax consensus promoter. Nucleic Acids
Research, London, UK, v. 34, p. 1470-1480, 2006.
REINHOLD, B.; HUREK, T.; NIEMANN, E. G.; FRENDERIK, I. Close association of
Azospirillum and diazotrophic rods with different root zones of kallar grass. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 52, p. 520-526, 1986.
REIS JÚNIOR, F. B.; TEIXEIRA, K. R. S.; REIS, V. M. Análises de restrição do DNA
Ribossomal Amplificado (ARDRA) em estudos de diversidade intra-específica de Azospirillum
amazonense isolado de diferentes espécies de brachiaria. Planaltina: Embrapa Cerrados, 2004.
41 p. (Embrapa-CPAC. Documentos, 117).
REIS, V. M.; ESTRADA-DE LOS SANTOS, P.; TENORIO-SALGADO, S.; VOGEL, J.;
STOFFELS, M.; GUYON, S.; MAVINGUI, P.; BALDANI, V. L.; SCHMID, M.; BALDANI, J. I.;
BALANDREAU, J.; HARTMANN, A.; CABALLERO-MELLADO, J. Burkholderia tropica sp.
nov., a novel nitrogen-fixing, plant-associated bacterium. International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology, Washington, DC, v. 54, p. 2155-2162, 2004.
REIS, V. M.; OLIVARES, F. L.; DÖBEREINER, J. Improved methodology for isolation of
Acetobacter diazotrophicus and confirmation of its endophytic habitat. World Journal of
Microbiology and Biotechnology, Oxford, v. 10, p. 401-405, 1994.
RODRIGUES NETO, J.; MALAVOLTA JÚNIOR, V. A.; VICTOR, O. Meio simples para o
isolamento e cultivo de Xanthomonas campestris pv. citri tipo B. Summa Phytopathologica,
Piracicaba, v. 12, n. 1-2, p. 16, 1986.
SCHWAB, S. Caracterização parcial dos elementos em cis responsáveis pela regulação da
expressão do operon glnAntrBC de Herbaspirillum seropedicae. 2002. 120 f. Dissertação
(Mestrado em Ciências-Bioquímica) - Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2002.
SHEARER, G.; KOHL, D. H.; CHIEN, S. H. The Nitrogen-15 abundance in a wide variety of
soils. Soil Science Society of America Journal, Madison, v. 42, p. 899-902, 1978.
VIDEIRA, S. S.; OLIVEIRA, A. L. M.; BALDANI, J. I.; BALDANI, V. L. D. Identificação e
avaliação da diversidade de novos isolados de bactérias diazotróficas em plantas de arroz
(Oryza sativa). Revista Universidade Rural: Série Ciências da Vida, Seropédica, v. 24, n. 2, p.
35-40, 2004.
YANO, D. M. Y. Técnicas assépticas e semeadura de microrganismos. In: YANO, D. M. Y.;
FARRIS, M. G.; UMINO, C. Y.; COUTINHO, H. L. C.; CANHOS, V. P. Técnicas para cultivo,
identificação e preservação de bactérias. Campinas: Fundação Tropical de Pesquisas e
Tecnologia “André Tosello”, 1993. p. 1-9.
YOUNG, J. P. W.; DOWNER, H. L.; EARDLY, B. D. Phylogeny of photrophic Rhizobium
strain BTAi1 by polymerase chain reaction-based sequencing of a 16S rRNA segment.
Journal of Bacteriology, Washington, DC, v. 173, n. 7, p. 2271-2277, 1991.
ZHANG, X. S.; CHENG, H. P. Identification of Sinorhizobium meliloti early symbiotic genes
by use of a positive functional screen. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, DC, v. 72, p. 2738-2748, 2006.
Capítulo 3
Bactérias fixadoras de N2 e fungos
micorrízicos arbusculares em
espécies florestais: avanços e
aplicações biotecnológicas
Fatima Maria de Souza Moreira
Sergio Miana de Faria
Fabiano de Carvalho Balieiro
Ligiane Aparecida Florentino

1. Introdução

Milhares de espécies de microrganismos promotores de cresci‐


mento vegetal, cuja biodiversidade ainda está sendo desvendada,
habitam o solo não rizosférico. Dentre esses, já são conhecidas várias
espécies que podem estabelecer dois tipos básicos de interação com
espécies vegetais: as associações e as simbioses. Do ponto de vista
biotecnológico, ainda não é possível o manejo bem sucedido das
associações em espécies florestais. Já para as simbioses, diversos
inoculantes estão disponíveis e vários outros ainda podem ser obti‐
dos. Os processos mediados pelos microssimbiontes que contribuem
para o crescimento vegetal são: a fixação biológica de N2 (FBN) por
bactérias, e outros processos principalmente relacionados ao aumen‐
to da área explorada pelas raízes, quando infectadas por fungos
micorrízicos, que aumentam a absorção de água e nutrientes pouco
móveis, como o P.
As simbioses de bactérias fixadoras de N2 (BFN) com espécies
florestais têm como característica a formação de estruturas denomi‐
nadas nódulos. Espécies nodulíferas estão restritas a famílias perten‐
centes a quatro ordens componentes de um dos dois subclados das
Eurosídeas nas Angiospermas, considerando a classificação baseada
nos genes: ribossomal 18S rDNA, cloroplástico rbcL e atpD. Maior
diversidade filogenética de espécies hospedeiras (de oito famílias
distribuídas nas ordens Fagales, Cucurbitales e Rosales) estabelece
simbiose com bactérias do gênero Frankia, simbioses estas denomi‐
nadas de actinorrízicas. As simbioses de BFN vulgarmente denomina‐
das rizóbios se restringem a espécies das famílias Ulmaceae e
Leguminosae, respectivamente pertencentes às ordens Rosales e
Fabales. Ressalta-se que nessas ordens ocorrem outras famílias que
não estabelecem simbiose com BFN. Do mesmo modo, nas famílias e
gêneros contendo espécies nodulíferas podem ocorrer outros gêneros
e espécies não nodulíferos. Só dois dos gêneros relatados até o
momento como actinorrízicos ocorrem no Brasil: Colletia e Discaria.
No entanto, esses não têm importância econômica. Além disso, o
manejo das simbioses actinorrízicas, em geral, é bastante limitado em
razão da dificuldade de isolamento e multiplicação do microssim‐
bionte. Por isso, essas simbioses não serão abordadas neste
capítulo, mas tem um grande potencial para novas descobertas no
Brasil, uma vez que seu estudo em nossos solos é praticamente
inexistente. Já as simbioses de rizóbios com leguminosas se
destacam não só pela importância econômica e ampla distribuição
geográfica dos hospedeiros, que incluem várias espécies florestais,
mas também pela facilidade de seu manejo.
Os fungos micorrízicos são ubíquos na natureza e se dividem em
sete tipos, dos quais os arbusculares e ectomicorrízicos são os mais
importantes do ponto de vista de simbiose com espécies florestais
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Os fungos ectomicorrízicos não serão
abordados neste capítulo, pois é assunto do capítulo 7 da parte 4.
A eficiência dos processos biológicos, mediados pelos micros‐
simbiontes, no crescimento vegetal depende da compatibilidade entre
macro e microssimbiontes e dos diversos fatores ambientais e
edáficos. Apesar de diversos resultados promissores e práticos já
estarem disponíveis, nosso conhecimento ainda é limitado em relação
à grande diversidade de espécies microbianas e vegetais, solos e
climas que ocorrem nos diversos biomas brasileiros, cujo estudo,
portanto, precisa ser incentivado e incrementado.
Este capítulo aborda os métodos utilizados para estudo das
simbioses de espécies florestais com bactérias fixadoras de N2 (BFN)
e com fungos micorrrízicos arbusculares (FMA) visando maximizar e
manejar os processos, por meio dos quais promovem o crescimento
vegetal.

2. Simbioses de bactérias fixadoras de


nitrogênio (BFN) com espécies da família
Leguminosae

A família Leguminosae é subdividida em três subfamílias:


Mimosoideae, Papilionoideae e Caesalpinioideae (POLHILL, 1994;
POLHILL et al., 1981). As espécies arbóreas são predominantes nas
cerca de 3.000 espécies, tanto em Caesalpinioideae como em
Mimosoideae. Embora não sejam predominantes nas Papilionoideae,
as arbóreas ocorrem em número expressivo de cerca de 4.000 espé‐
cies nessa subfamília. A nodulação apresenta-se de forma diferen‐
ciada nas três subfamílias, sendo mais frequente nas Papilionoideae,
depois na Mimosoideae e pouco expressiva na Caesalpinioideae
(ALLEN; ALLEN, 1981; FARIA et al., 1999; MAGALHÃES et al., 1982;
SPRENT, 2001). Diferentes tipos de nódulos são encontrados nas
diversas espécies de leguminosas, e esses são determinados pela
espécie hospedeira. O tipo mais comumente conhecido é o esférico
de crescimento determinado que ocorre nas leguminosas de grãos
como soja e caupi, mas também é encontrado em várias espécies
florestais arbóreas ou com outros hábitos de crescimento (Figura 1A).
Outro tipo comum nas espécies florestais é o ramificado de cres‐
cimento indeterminado que pode alcançar tamanhos bem maiores
que os esféricos como os mostrados nas Figuras 1B, 2A e 2B.
Figura 1. Nódulos de crescimento determinado e indeterminado em A) Desmodium
leiocarpum e B) Crotalaria juncea.
Fotos: S. M. Faria

Figura 2. Nódulos de crescimento indeterminado em A) Swartzia schomburkii e B)


Enterolobium contortisiliquum.
Fotos: F. M. S. Moreira

3. Simbioses de fungos micorrízicos


arbusculares (FMA) com espécies vegetais
Os FMA, restritos ao Filo Glomeromycota, formam uma das mais
expressivas simbioses com raízes de plantas em termos de ocorrên‐
cia no reino vegetal, distribuição geográfica, benefícios para a planta
hospedeira e para o meio ambiente. Levantamentos sobre a ocorrên‐
cia da simbiose micorrízica no reino vegetal indicam que 80% das
famílias de plantas formam algum tipo de simbiose micorrízica
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2006), e que as micorrizas arbusculares são
as mais ancestrais e de maior ocorrência em regiões tropicais
(BRUNDRETT, 2002). Os FMA agem como uma extensão do sistema
radicular das plantas potencializando a absorção de nutrientes,
principalmente aqueles que apresentam uma menor taxa de mobili‐
dade no solo, como o fósforo, ou incrementando a absorção de água
sob condições de estresse hídrico. Os FMA podem também apresen‐
tar efeito sinérgico com BFN em simbioses tripartites (fungo-planta-
bactéria) (CARVALHO; MOREIRA, 2010; JESUS et al., 2005).
Trabalhos recentes têm demonstrado a existência de especifici‐
dade hospedeira ou seletividade na simbiose micorrízica (SANDERS,
2003; SCHEUBLIN et al., 2004; VANDENKOORNHUYSE et al., 2002,
2003); além disso, a eficiência da simbiose em termos de contribuição
para o crescimento vegetal pode variar em função tanto da espécie
fúngica como da espécie vegetal envolvidas na simbiose (SANTOS et
al., 2008). Comunidades de plantas podem apresentar espécies com
respostas diferenciadas tanto em relação aos fungos micorrízicos
quanto às BFN, de forma que o efeito desses microrganismos sobre o
crescimento vegetal e na estrutura da comunidade vegetal vai
depender da especificidade e das características funcionais das espé‐
cies vegetais.

4. Utilização de espécies florestais em


monocultivos, sistemas agroflorestais e na
recuperação de áreas degradadas
A simbiose tripartite com BFN e FMA em espécies florestais tem
ampla variabilidade para exploração econômica por seu próprio uso
em monocultivos ou por sua inclusão em sistemas de manejo
diversos com outras espécies nas agroflorestas, sistemas silvipastoris
e na recuperação de áreas degradadas.
Embora espécies florestais compreendam predominantemente
espécies arbóreas, encontram-se entre elas espécies com os mais
diversos hábitos de crescimento, que possuem como principal carac‐
terística a tolerância a condições de menor luminosidade, uma vez
que o dossel formado pelas espécies arbóreas limita a entrada de luz
nos extratos inferiores do ecossistema. Além do uso como madeira,
as espécies florestais podem ser usadas como forrageiras, lenha,
flora apícola, gomas, celulose e papel, alimentação humana, cercas
vivas, produtos medicinais, aromáticos e fotoquímicos e adubação
verde. Neste último caso, a maior concentração de N e de outros
nutrientes nos tecidos, em virtude das simbioses com bactérias
fixadoras de N2 e fungos micorrízicos, pode fornecer aporte ao solo de
matéria orgânica de alta qualidade com baixa relação C:N e C:P, entre
outros, aumentando a disponibilidade de nutrientes no solo que pode
ser usada por outras espécies vegetais (consorciadas, em sucessão,
rotação ou após incorporação dos resíduos vegetais) e também por
organismos macro e microscópicos do solo, contribuindo para o
aumento da biodiversidade. Alguns trabalhos têm confirmado que a
presença de leguminosas arbóreas fixadoras de N2 em sistemas
mistos de produção de eucalipto em área degradada ou pastos pode
aumentar os estoques de carbono do solo (BALIEIRO et al., 2008;
MACEDO et al., 2008; RESH et al., 2002) e, consequentemente,
manter as reservas orgânicas de N e de outros nutrientes.
As simbioses de leguminosas com FMA e BFN estão entre as mais
bem estudadas, em função dos benefícios gerados. Tem sido
demonstrado experimentalmente que plantas que vivem em simbiose
mutualística com BFN e FMA apresentam vantagens na colonização
de áreas degradadas. A simbiose resulta no surgimento de proprieda‐
des emergentes na planta hospedeira, que no caso de leguminosas,
BFN e FMA, confere às plantas autossuficiência em nitrogênio e
maior capacidade de absorver nutrientes e água, o que a torna uma
espécie melhor colonizadora. Essa combinação enriquece o solo com
a deposição de matéria orgânica permitindo que espécies não legumi‐
nosas possam se estabelecer, facilitando assim o recrutamento mais
rápido de espécies da flora local. Vários trabalhos têm demonstrado
os benefícios que essas espécies trazem sobre a capacidade de
regeneração de áreas severamente impactadas pela ação antrópica
(CHADA et al., 2004; DOMMERGUES et al., 1999; FRANCO; FARIA,
1997; HERRERA et al., 1993; PARROTA; KNOWLES, 1999; REIS,
2006) e a estabilidade dos ecossistemas (HEIJDEN et al., 1998;
MAHERALI; KLIRONOMOS, 2007).
Com relação à recuperação de áreas degradadas, a demanda por
técnicas de revegetação1 e recomposição ambiental2 de terras
impactadas pela ação antrópica tem crescido nos últimos anos. Essa
demanda reflete a maior conscientização da sociedade, em geral, da
necessidade de conservação dos recursos naturais com vista à
sustentabilidade dos ecossistemas. Além disso, indica a expansão e
intensificação de atividades agrícolas, pecuária e da exploração
mineral. Por razões diversas, sejam éticas, profissionais e também
por força da lei (Lei nº 6.938/81 da Política Nacional de Meio Ambi‐
ente, regulamentada pelo Decreto nº 99.274/90), a revegetação, por
meio de reflorestamento, e a recomposição ambiental têm sido algu‐
mas das demandas prioritárias para a continuidade da exploração
mineral a qual sempre resulta em impactos marcantes no meio am‐
biente, podendo levar a perdas significativas da biodiversidade local.
É importante e necessário desenvolver tecnologias para a
recuperação e conservação da biodiversidade. Para alcançar esses
objetivos, é imprescindível o conhecimento do papel dos processos
biológicos, dentre eles os que permitam a coexistência das espécies
vegetais e dos microrganismos. A funcionalidade e a estabilidade dos
ecossistemas terrestres são determinadas pela biodiversidade de
plantas e de outros organismos micro e macroscópicos, pela ciclagem
de nutrientes e pelo fluxo de energia. Entretanto, os mecanismos que
regem a dinâmica dessas comunidades nos ecossistemas ainda não
são completamente compreendidos (HEIJDEN et al., 1998). Um
entendimento maior dos mecanismos determinantes da diversidade
vegetal possibilitará também a adoção de práticas mais eficazes de
revegetação de áreas degradadas e recomposição ambiental, seja
por ações antrópicas ou por causas naturais.

5. Levantamento da capacidade de
estabelecer simbiose com BFN em espécies
de leguminosas

Allen e Allen (1981) e Graham (1976) já alertavam para o fato de


que a capacidade de nodular só era conhecida em 12% a 15% das
cerca de 20.000 espécies da família Leguminosae, e que a maioria
das espécies sem informação era leguminosa arbórea tropical. Hoje,
apesar de diversos trabalhos e de levantamento intensivos terem sido
realizados, principalmente no Brasil (BARBERI et al., 1998; BONETTI
et al., 1984; FARIA; LIMA, 1998; FARIA et al., 1984, 1987, 1989;
MAGALHÃES et al., 1982; MAGALHÃES; FERNANDES, 1984;
MAGALHÃES; SILVA, 1986; MOREIRA et al., 1992; SOUZA et al.,
1994; SYLVESTER-BRADLEY et al., 1980), essa característica ainda
é desconhecida para cerca de 75% das espécies da família (SPRENT,
2001). Portanto, ainda existe um campo vasto para novas
descobertas. Além de informações sobre a capacidade de nodular e
consequentemente seu potencial para a FBN, os levantamentos
permitem a coleta de nódulos, o isolamento, a coleção e a avaliação
da diversidade de bactérias nodulíferas fixadoras de N2 para fins
posteriores de seleção para obtenção de inoculantes.
O levantamento da capacidade de fixação biológica de nitrogênio
das espécies leguminosas pode ser realizado no campo e em
condições de viveiro.
No campo, cada coleta de nódulos e/ou sementes deve ser
acompanhada por uma ficha com o maior número possível de infor‐
mações sobre características diversas (nome vulgar ou científico da
espécie vegetal, tipo de solo, local, etc.), pois essas serão muito
importantes, não só para análise posterior dos dados de nodulação
como também para experimentos de seleção de estirpes, principal‐
mente para espécies altamente específicas ou até mesmo para
verificar o grau de promiscuidade das mesmas. Todas as plantas
investigadas devem ser coletadas secas e armazenadas em um
herbário para a correta identificação botânica e para a constatação de
futuras dúvidas (FARIA et al., 1984; MAGALHÃES; SILVA, 1986;
MOREIRA, 2008a).

5.1. Análise de mudas, ervas e árvores no campo

No campo é mais fácil a análise de mudas ou ervas, pois seu


sistema radicular inteiro pode ser removido escavando em torno delas
cuidadosamente e afofando o solo para evitar que os nódulos sejam
removidos das raízes acidentalmente.
O sistema radicular de indivíduos adultos deve ser analisado
retirando cuidadosamente o solo ao redor de uma raiz que esteja
inserida no tronco principal. Esse procedimento deve ser realizado até
as ramificações mais finas dessa raiz, onde normalmente ocorrem os
nódulos. Como na floresta raízes de várias espécies entrelaçam-se,
mesmo rente ao tronco de cada árvore, essa análise deve ser cuida‐
dosa para que a procedência dos nódulos seja confirmada. Esse
procedimento é bastante demorado e laborioso, mas compensa, pois
permite, a partir do isolamento das bactérias dos nódulos encontra‐
dos, a obtenção de estirpes que nodulam aquela espécie hospedeira
nas condições climáticas e edáficas locais e que, portanto, estão
potencialmente mais adaptadas a elas.
Cada nódulo deve ser coletado contendo um pedaço de 0,5 cm a 1
cm da raiz onde está inserido para facilitar sua manipulação com os
instrumentos durante as etapas de isolamento das bactérias de seu
interior, pois o contato direto dos instrumentos com o nódulo pode
danificá-lo e comprometer o isolamento.
No campo, a eficiência dos nódulos pode ser analisada pela
presença da leghemoglobina que confere uma cor avermelhada a
rósea ao interior dos mesmos, com a desvantagem que uma vez
cortados os nódulos não poderão ser utilizados para isolamento de
BFN. Alternativa e/ou concomitantemente em outros nódulos, pode se
analisar a eficiência da atividade da nitrogenase em reduzir o
acetileno, embora seja mais laboriosa e demorada. O acetileno pode
ser produzido num recipiente de vidro com tampa de borracha flexível
como uma mamadeira ou um kitasato acoplado a uma câmara de
borracha de bola, colocam-se pedras de carbureto no interior, fecha-
se o recipiente, e, com a ajuda de uma seringa, introduzem-se lenta‐
mente gotas de água. O acetileno se formará, e o excesso deve ser
evitado com a permanência somente da agulha na tampa, ou, no caso
da câmara, interrompendo a entrada de água quando ela estiver
suficientemente inflada (MOREIRA, 2008a; MOREIRA; PEREIRA,
2001). Os nódulos são colocados em vidros hermeticamente fechados
e 10% (V:V) de acetileno injetado nos mesmos. Após um período de
incubação determinado, geralmente 1 hora, uma amostra gasosa é
retirada e guardada num vacutainer para posterior análise por
cromatografia gasosa da presença de etileno resultante da redução
do acetileno pela nitrogenase (DILWORTH, 1966).
Após análise da presença e atividade, e antes de serem colocados
em frascos contendo sílica gel ou cloreto de cálcio anidro como
dessecante, os nódulos devem ser lavados para remoção das partí‐
culas de solo e de outros detritos, e o excesso de água removido com
papel toalha. A sílica gel e o cloreto de cálcio anidro promovem o
dessecamento dos nódulos evitando que apodreçam durante o
período de armazenamento desde a coleta até o isolamento no
laboratório. A sílica gel geralmente traz um indicador de umidade que
a torna azul sem umidade e rosa com umidade. Sem indicador sua
cor é esbranquiçada. O cloreto de cálcio anidro, quando sob excesso
de umidade, torna-se leitoso. Assim, deve-se verificar o estado do
dessecante antes de colocar o nódulo no vidro de armazenamento,
pois se o dessecante já estiver com excesso de umidade não será
efetivo. Os vidros devem ser hermeticamente fechados para evitar a
entrada de umidade. É importante salientar que os nódulos não
devem entrar em contato direto com esses produtos, porém eles
podem ser embrulhados em papel poroso e acondicionados nos reci‐
pientes ou pode-se colocar algodão sobre o dessecante separando-o
do(s) nódulo(s). Esses procedimentos aumentarão e manterão a
viabilidade das bactérias até o momento do isolamento em
laboratório. Deve-se proceder ao isolamento logo após o retorno ao
laboratório, pois a viabilidade pode diminuir durante longos períodos
de armazenamento. O isolamento é realizado em meio 79 sólido
(FRED; WAKSMAN, 1928), também conhecido como YMA (VINCENT,
1970), após desinfestação superficial com hipoclorito de Ca ou de Na
ou peróxido de hidrogênio (H2O2) e lavagem com água estéril. O
tempo de exposição ao desinfetante é variável dependendo do
tamanho do nódulo e da camada externa de células suberificadas que
constituem a periderme, ou seja, quanto maior e mais suberificado,
maior o tempo. Após o isolamento, as bactérias são estocadas para
posterior uso em experimentos diversos. A estocagem pode ser em
meio 79 sólido em tubos. Após crescimento das bactérias até a fase
log, as culturas podem ser cobertas com óleo mineral esterilizado, ou,
caso os tubos tenham tampas rosqueáveis que os mantenham
hermeticamente fechados, o óleo mineral é dispensável. Outros
métodos mais eficazes para preservar as culturas são a liofilização e
o armazenamento em ultrafreezer a -80 ºC.

5.2. Análise de mudas no viveiro

Geralmente é muito difícil encontrar nódulos em sistemas em


clímax como florestas (MOREIRA et al., 1992). Nesse caso, quando
há disponibilidade de sementes, essas podem ser coletadas e
plantadas em substrato livre de nitrogênio na forma combinada
mineral ou orgânica. Todos os demais nutrientes devem estar em
teores adequados no substrato para evitar que fatores limitantes
inibam o crescimento das plantas e consequentemente a nodulação.
O uso de esterco, comum na produção de mudas florestais, deve ser
evitado, pois seu teor de nitrogênio inibe a nodulação. Métodos de
desinfestação do substrato como o uso de brometo de metila também
devem ser evitados, pois resíduos desse produto são tóxicos às BFN.
Esse substrato pode ser inoculado com uma mistura de várias
estirpes de rizóbio obtidas de espécies taxonomicamente próximas. O
solo originário da área de coleta ou de outras áreas com tipos de solo
e clima diversos pode também ser utilizado sem inoculação, quando
se pretende obter, pelo isolamento dos nódulos, uma ampla
diversidade de estirpes bacterianas compatíveis com aquela espécie
(FARIA et al., 1984; MOREIRA, 1995, 1997; MOREIRA et al., 1992;
MAGALHÃES; SILVA, 1986).
As sementes de várias espécies perdem a viabilidade rapidamente
enquanto outras podem ser estocadas por longos períodos sem perda
de viabilidade. Além disso, existem espécies cujas sementes
necessitam de quebra de dormência para que possam germinar.
Portanto, para cada espécie, tanto a viabilidade das sementes como a
necessidade de quebra de dormência com tratamentos adequados
devem ser verificadas. A quebra de dormência pode ser efetuada com
imersão em ácido sulfúrico concentrado, água quente, ou por
rompimento do tegumento por processos diversos, como pelo uso de
uma lixa. Nesse caso, deve-se realizar o rompimento do tegumento
longe do embrião para evitar que esse seja danificado. O uso do
ácido sulfúrico dispensa a desinfestação com outras substâncias.
Cada espécie tem tratamentos específicos que podem variar
dependendo da condição de estocagem apenas com relação ao
tempo de exposição. Por exemplo, estocagem em condições secas
geralmente requer tempos maiores de exposição à água quente ou ao
ácido sulfúrico. O sistema radicular das plantas deve ser analisado
em torno de quatro meses ou mais após o plantio, dependendo da
taxa de crescimento inerente de cada espécie. Após esse período, o
sistema radicular é analisado, e, se houver nódulos, eles são retirados
e levados ao laboratório para isolamento e estocagem das bactérias
de acordo com os procedimentos descritos anteriormente.

6. Aplicações biotecnológicas

O estabelecimento, o desenvolvimento, a sobrevivência e a taxa


de aquisição de nutrientes pelas plantas dependem, muitas vezes, da
sua simbiose com os microrganismos eficientes. A existência de
diferentes níveis de especificidade/promiscuidade na simbiose de
espécies vegetais e BFN, além de variabilidade quanto à eficiência,
requer que se faça a seleção das bactérias nodulíferas mais eficientes
na fixação de nitrogênio para cada espécie. Para os FMA, não ocorre
uma seletividade preferencial entre planta, ambiente e o fungo,
podendo a planta ser colonizada simultaneamente por diversas
espécies de FMA. No entanto, mesmo para leguminosas promíscuas,
determinadas estirpes de BFN podem se sobressair quanto à
eficiência nas condições de campo (LACERDA et al., 2004; SOARES
et al., 2006), e espécies de FMA podem exibir maior eficiência com
determinadas espécies (SANTOS et al., 2008). Portanto, o
entendimento das interações desses microrganismos com espécies
em condições ambientais determinadas assume destaque no manejo
dessas simbioses.

6.1. Especificidade e promiscuidade hospedeira de


leguminosas com rizóbio

Em condições naturais, as espécies e gêneros de leguminosas são


noduladas por estirpes, espécies e até gêneros diferentes (MOREIRA,
2008a, 2008b), podendo essa diversidade ocorrer até num mesmo
nódulo. Essa variabilidade pode se refletir na eficiência do processo
da FBN, de ineficiente até altamente eficiente (LIMA et al., 2009), que
será resultante da interação e contribuição das diversas estirpes. A
seleção de estirpes de bactérias compatíveis com a espécie vegetal,
altamente eficientes, competitivas e adaptadas a condições edáficas e
climáticas, para inoculação no ato do plantio, assegura que os
nódulos formados pela planta serão das bactérias desejáveis, e que a
FBN será maximizada.
Em experimentos de inoculação e de avaliação da especificidade
hospedeira de espécies florestais realizados na Embrapa Agrobiologia
desde a década de 1960 observa-se que determinadas tribos da
família são muito específicas quanto à estirpe de rizóbio, enquanto
outras são muito promíscuas em relação a essas bactérias
(CAMPELO; DÖBEREINER, 1969; FARIA et al., 1999). No primeiro
caso, tem-se detectado que as espécies da tribo Mimoseae só
nodulam com bactérias isoladas do mesmo gênero, enquanto que, no
segundo caso, as espécies da tribo Phaseoleae nodulam
eficientemente com a maioria dos isolados de toda a família. Ainda,
observa-se que algumas bactérias são capazes de nodular,
eficientemente, várias espécies da família de onde foram isoladas, de
outros gêneros, tribos e até de outras subfamílias. Ou seja, a
promiscuidade ou a especificidade podem ocorrer tanto na espécie
vegetal como na BFN. Um exemplo extremo de especificidade é de
Sesbania virgata com Azorhizobium doebereinerae, tanto do ponto de
vista do hospedeiro como da BFN. Nesse caso, todas as estirpes
homólogas, i. e., que são oriundas de nódulos da mesma espécie
onde estão sendo testadas, têm alta eficiência com seu hospedeiro
(GONÇALVES; MOREIRA, 2004).
No caso das espécies arbóreas, a maioria das respostas obtidas à
inoculação de estirpes foi observada em casa de vegetação ou em
viveiro de produção de mudas, e poucos estudos demonstram um
efeito significativamente no campo durante vários anos. Isso acontece
em virtude do longo tempo requerido para obtenção de respostas no
caso dessas espécies. Todavia, em áreas como as de mineração,
onde o substrato é geralmente desprovido de matéria orgânica, os
efeitos da inoculação são muito significativos porque não existem
bactérias que possam competir com as inoculadas. Resultados
positivos e significativos da inoculação também são disponíveis para
a sobrevivência de mudas no campo. Estudos sobre a competição
entre estirpes naturais e inoculadas, e sobre sua sobrevivência com o
passar do tempo em campo, devem ser incentivados no Brasil para
uma melhor avaliação do potencial da inoculação das bactérias em
diferentes condições edafoclimáticas. A seleção de estirpes de BFN
selecionadas para espécies florestais tem sido realizada
predominantemente pela Embrapa Agrobiologia. Muitas delas já são
aprovadas como inoculantes pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (Mapa) (Tabela 1). Porém, considerando que parcela
significativa das cerca de 2.000 espécies de leguminosas nativas é
espécie florestal, ainda existe um vasto campo para pesquisas futuras
nessa área.
Tabela 1. Identificação referencial das estirpes de bactérias fixadoras de nitrogênio
autorizadas pelo Mapa
(IN no 5 de 6/8/2004) para produção de inoculantes para leguminosas florestais no Brasil.

Base de Identificação (no


Espécie de Designação Designação
recomendação(1) acesso Genbank Referências
leguminosa Semia original
– Instituição ou EMBL)

Faria
(1997),
Faria e
n.d. Guedes
Acacia 6429 BR3629 III - Embrapa Mesorhizobium (1999),
angustissima 6430 BR3630 Agrobiologia amorphae Faria e
(FJ025124) Mello
(1998) e
Menna et
al. (2006)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Bradyrhizobium
(1999),
elkanii et al.
Faria e
6387 BR3609 III - Embrapa (AY904778)
A. auriculiformis Mello
6391 BR3624 Agrobiologia Bradyrhizobium
(1998),
elkanii et al.
Menna et
(AY904780)
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993)

A. farnesiana 6430 BR3630 III - Embrapa Mesorhizobium Faria


6436 BR9002 Agrobiologia amorphae (2002),
(FJ025124) Faria e
Burkholderia sp. Guedes
(1999) e
Menna et
al. (2006)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Bradyrhizobium (1999),
elkanii et al. Faria e
6387 BR3609 III - Embrapa (AY904778) Mello
A. mangium
6420 BR 3617 Agrobiologia B. elkanii (1998),
(M55490) Menna et
(AY904786) al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993,
1998)

Faria
(1997),
Faria e
Guedes
(1999),
Bradyrhizobium
A. mearnsii Faria e
6164 BR3608 II - Embrapa japonicum
(syn. A. Mello
6390 BR3614(2) Agrobiologia (AY904765)
decurrens) (1998),
Burkholderia sp.
Menna et
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993)
A. podalyriifolia 6388 BR3611 II - Embrapa Bradyrhizobium Faria
6389 BR3612 Agrobiologia elkanii (1997),
B. elkanii Faria e
(FJ025113) Guedes
(1999),
Faria e
Mello
(1998),
Menna et
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993)

De-Lajudie
et al.
(1998),
Faria
(1997),
Faria e
Mesorhizobium
Guedes
plurifarium
(1999),
6392 BR3804 III - Embrapa (Y14159)
A. salicina Faria e
6400 BR5005 Agrobiologia Bradyrhizobium
Mello
elkanii
(1998),
(FJ025114)
Menna et
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993,
1998)

Faria
(1997),
Bradyrhizobium Faria e
elkanii Guedes
6096 BR8601 II - Embrapa (FJ025115) (1998),
A. saligna
6428 BR3628 Agrobiologia Bradyrhizobium Faria e
elkanii Mello
(FJ025116) (1998) e
Menna et
al. (2006)

Acosmium 6443 BR4901 III - Embrapa Bradyrhizobium Faria


nitens 6444 BR4902 Agrobiologia sp. (FJ390932) (2002),
n.d Faria e
Guedes
(1999) e
Menna et
al. (2006)

Faria
(1997),
Faria e
Guedes
(1999),
Bradyrhizobium
Faria e
elkanii
6160 BR5610 III - Embrapa Mello
Albizia lebbeck (AY904762)
6432 Br5611 Agrobiologia (1998),
Bradyrhizobium
Menna et
elkanii (M55490)
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993,
1998)

Faria
(1997),
Faria e
Guedes
(1999),
Bradyrhizobium
Faria e
Balizia 6396 BR6816 III - Embrapa japonicum
Mello
pedicellaris 6408 BR6815 Agrobiologia (FJ025099)
(1998),
Rhizobium sp.
Menna et
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993)

Bowdichia 6096 BR8603(2) III - Embrapa Bradyrhizobium Faria


(2)
virgilioides 6414 BR8604 Agrobiologia sp. (1997),
Faria e
Guedes
(1999), e
Faria e
Mello
(1998)

Faria
(1997),
Faria e
Guedes
(1999),
Rhizobium sp.
BR4301 Faria e
6395 II - Embrapa Rhizobium sp.
C. surinamensis BR4302 Mello
6423 Agrobiologia ((FJ025132)
BR4303(2) (1998),
Rhizobium sp.
Menna et
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993)

De-Lajudie
et al.
(1998),
Faria
(1997),
Faria e
Mesorhizobium
Chamaecrista II - Embrapa Guedes
6392 BR3804 plurifarium
ensiformis Agrobiologia (1999),
(Y14159)
Faria e
Mello
(1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)

Clitoria 6411 BR8007(2) III - Embrapa Burkholderia sp. Faria


(2)
fairchildiana 6412 BR8008 Agrobiologia (baseado em (1997),
estirpes Faria e
homólogas) Guedes
(1999),
Faria e
Mello
(1998) e
Moreira
(2001)

Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Bradyrhizobium
(1999),
6413 BR8402 III - Embrapa elkanii
Dalbergia nigra Faria e
6101 BR8404 Agrobiologia Bradyrhizobium
Mello
elkanii (M55490)
(1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)

Faria
Bradyrhizobium
(1997),
elkanii
Menna et
Dimorphandra 6099 BR5004 II - Embrapa (FJ3903941)
al. (2006)
jorgei 6400 BR5005 Agrobiologia Bradyrhizobium
e Moreira
elkanii
et al.
(FJ025114)
(1993)

Faria
(1997),
Faria e
Bradyrhizobium Guedes
elkanii (1999),
Enterolobium 6159 BR4406 III - Embrapa
(AJ003235) Faria e
contortisiliquum 6397? BR4407(2) Agrobiologia
Bradyrhizobium Mello
elkanii (1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)

E. cyclocarpum 6159 BR4406 II - Embrapa Bradyrhizobium Faria


6403 BR6205 Agrobiologia elkanii (1997),
(AJ003235) Faria e
Bradyrhizobium Guedes
elkanii (1999),
(FJ0251120) Faria e
Mello
(1998),
Menna et
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993,
1998)

Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Bradyrhizobium (1999),
elkanii Faria e
6159 BR4406 III - Embrapa (AJ003235) Mello
E. timbouva
6397 BR4407 Agrobiologia Bradyrhizobium (1998),
elkanii et al. Menna et
(FJ025139) al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993,
1998)

Erythrina 6388 BR3611 Embrapa Bradyrhizobium Moreira et


poeppigiana 6426 BR3696 Agrobiologia japonicum al. (1993)

E. speciosa 6393 BR4101 II - Embrapa Ochrobactrum Faria


6395 BR4301 Agrobiologia sp. (1997),
Rhizobium sp. Faria e
Guedes
(1999),
Faria e
Mello
(1998),
Moreira
(2001) e
Moreira et
al. (1993,
1998)

Faria
(2002),
Faria e
Guedes
Rhizobium sp. (1999),
6388 BR3611 III - Embrapa
E. verna Bradyrhizobium Menna et
6100 BR5609 Agrobiologia
elkanii (M55490) al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993,
1998)

Faria
(1997,
2000),
Faria e
Bradyrhizobium Guedes
Falcataria elkanii (M55490) (1999),
moluccana (syn. 6100 BR5609 Bradyrhizobium Faria e
III - Embrapa
Paraserianthes 6432 BR5611 elkanii (M55490) Mello
Agrobiologia
facataria, Albizia 6169 BR5612 Bradyrhizobium (1998),
falcata) elkanii Menna et
(FJ025110) al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993,
1998)
Gliricidia sepium 6168 BR8801 III - Embrapa Rhizobium Faria
6435 BR8802 Agrobiologia leguminosarum (1997),
(AJ003239) Faria e
Rhizobium Guedes
leguminosarum (1999),
Faria e
Mello
(1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)

Faria
(1997),
Bradyrhizobium
Faria e
sp. (FJ025105)
6433 BR6609 III - Embrapa Guedes
Inga marginata Bradyrhizobium
6434 BR 6610 Agrobiologia (1999) e
elkanii
Faria e
(FJ390934)
Mello
(1998)

Faria
(1997),
Faria e
Ensifer Guedes
(Sinorhizobium) (1999),
Leucaena 6153 BR827(2) III - Embrapa
fredii (X67231) Faria e
diversifolia 6164 BR3608(2) Agrobiologia
Bradyrhizobium Mello
japonicum (1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)

Faria
(1997),
Faria e
Ensifer Guedes
L. leucocephala (Sinorhizobium) (1999),
6153 BR827 III - Embrapa
var. k72, k8, fredii (X67231) Faria e
6069 BR814(2) Agrobiologia
Peru Rhizobium sp. Mello
(D12788) (1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)
L. leucocephala 6069 DF-10/BR814 III - Embrapa Rhizobium sp. Moreira et
var. cunningham 6070 BR801 Cerrados e (D12788) al. (1993,
Agrobiologia Ensifer 1998)
(Sinorhizobium)
fredii (X67231)

Faria
(1997),
Faria e
Bradyrhizobium Guedes
elkanii (1999),
Lonchocarpus 6399 BR6009 II - Embrapa
(AJ003235) Faria e
costatus 6404 BR6010 Agrobiologia
Bradyrhizobium Mello
elkanii (1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)

Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Melanoxylon II - Embrapa Bradyrhizobium (1999),
6381 BR3901
brauna Agrobiologia japonicum Faria e
Mello
(1998) e
Moreira et
al. (1993)

Mimosa 6383 BR3407 III - Embrapa Burkholderia Chen et al.


acutistipula 6384 BR3446 Agrobiologia sabiae (2005,
(AY773186) 2008),
Burkholderia sp. Faria
(1997),
Faria e
Guedes
(1999) e
Faria e
Mello
(1998)

Burkholderia
Chen et al.
gladioli
M. 6386 BR3460 II - Embrapa (2007) e
Burkholderia
bimucromanata 6421 BR3461 Agrobiologia Faria
nodosa
(1997)
(AY533861)

Chen et al.
(2008),
Faria
Burkholderia (1997),
M. 6382 BR3405 III - Embrapa sabiae Faria e
caesalpiniifolia 6410 BR3451 Agrobiologia (AY773185) Guedes
Burkholderia sp. (1999) e
Faria e
Mello
(1998)

Chen et al.
6417 BR3462 II - Embrapa Burkholderia sp. (2005) e
M. flocculosa
6422 BR3463 Agrobiologia Burkholderia sp. Faria
(1997)
Chen et al.
(2006),
Faria
(1997),
Burkholderia
III - Embrapa Faria e
M. scabrella 6165 BR3454 mimosarum
Agrobiologia Guedes
(AY533860)
(1999) e
Faria e
Mello
(1998)
Ochrobactrum
6393 BR4101 II - Embrapa Moreira
Ormosia nítida sp.
6394 BR4103 Agrobiologia (2001)
Burkholderia sp.
P. pterosperma 6415 BR9001 II - Embrapa Burkholderia sp. Faria
6416? BR9004(2) Agrobiologia Burkholderia sp. (1997),
Faria e
Guedes
(1999) e
Faria e
Mello
(1998)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Ensifer
(1999),
Parapiptadenia 6153? BR827 II - Embrapa (Sinorhizobium)
Faria e
rígida 6416 BR9002(2) Agrobiologia fredii (X67231)
Mello
Burkholderia sp.
(1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)
Faria
(1997),
Faria e
6385 (= BR3452
Piptadenia III - Embrapa Burkholderia Guedes
6167) UFC-832.55/
gonoacantha Agrobiologia Burkholderia sp. (1999) e
6398 BR4812
Faria e
Mello
(1998)
Faria
(1997),
Faria e
Rhizobium etli
Pithecellobium 6406 BR6812 II - Embrapa Guedes
(FJ025116)
tortum 6407 BR6813 Agrobiologia (1999) e
Methylobacterium
Faria e
Mello
(1998)
Poecilanthe 6403 BR8205 II - Embrapa Bradyrhizobium Faria
parviflora Agrobiologia japonicum (1997),
(FJ025112) Faria e
Guedes
(1999),
Faria e
Mello
(1998),
Menna et
al. (2006) e
Moreira et
al. (1993)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Ensifer
(1999),
(Sinorhizobium)
BR4002 Faria e
6161 III - Embrapa sp. (AY904763)
Prosopis juliflora UFC- Mello
6162 Agrobiologia Ensifer
933.52/BR4007 (1998),
(Sinorhizobium)
Menna et
sp. (X90810)
al. (2006) e
Moreira et
al. (1993,
1998)
Faria
(1997),
Faria e
Pseudosamanea
6403 BR6205 III - Embrapa B. elkanii Guedes
(syn. Albizia)
6409 BR6821 Agrobiologia n.d (1999) e
guachapele
Faria e
Mello
(1998)
Samanea 6403 BR6205 III - Embrapa B. elkanii Faria e
saman 6405 BR6212 Agrobiologia B. elkanii Guedes
(FJ025109) (1999),
Faria e
Mello
(1998),
Menna et
al. (2006) e
Moreira et
al. (1993)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
B. elkanii
Sclerolobium 6420 BR3617 III - Embrapa (1999),
(M55490)
paniculatum 6413 BR8402(2) Agrobiologia Faria e
B. elkanii
Mello
(1998) e
Moreira et
al. (1993)
Faria
(1997),
Gonçalves
Azorhizobium
e Moreira
6401 Sm 1/BR5401 II - Embrapa doebereinerae
Sesbania virgata (2004) e
6402 Sm 5/BR5404 Agrobiologia (AJ003237)
Moreira et
(AY626222)
al. (1993,
1998,
2006)
II - Bradyrhizobium Menna et
Tipuana tipu 6192 Semia 6192
Fepagro/UFRGS sp. (AY904772) al. (2006)
I - Em tubos; II - Vasos de Leonard; III - Vasos com solo; IV - Experimentos de campo;
(1)

estirpes que não constam da IN e/ou código Semia


(2)

não confere, mas cuja recomendação é corroborada pelo(s) trabalho(s) indicado(s).

6.2. Seleção de estirpes de rizóbio de alta eficiência na


FBN

A seleção de estirpes eficientes para maximizar a FBN em


espécies vegetais de importância econômica tem sido um dos
principais alvos da pesquisa. A obtenção de estirpes de rizóbio
eficientes na FBN é um processo lento que requer tempo para sua
conclusão; às vezes, dependendo da espécie, são necessários anos
de experimentação até se chegar a uma indicação que ainda poderá
ser melhorada com a obtenção de novas estirpes de bactérias que
substituirão as previamente selecionadas, ou que estarão mais
adaptadas a outras condições climáticas e edáficas. Além da alta
eficiência, essas estirpes devem apresentar outras características,
como serem boas competidoras por sítios de infecção em relação às
populações de estirpes nativas e ter boa sobrevivência e adaptação
às condições edáficas e climáticas onde serão introduzidas. O proces‐
so de seleção de estirpes para determinada espécie vegetal envolve
em geral quatro estádios, sendo os dois primeiros em condições
axênicas e os dois últimos em solo, cada um desses se constitui na
base de recomendação de estirpe (Tabela 1).

6.2.1. Condições gerais dos quatro estádios


Em todos os estádios de seleção de estirpes são adicionados três
tratamentos controle, sendo dois sem inoculação: (1) sem nitrogênio
mineral e outro (2) com nitrogênio mineral. O terceiro controle (3) é
inoculado com estirpe eficiente previamente selecionada (autorizada
pelo Mapa) para a espécie (Tabela 1) e/ou com estirpe capaz de
nodular a espécie. A inclusão do tratamento controle (3) é opcional,
pois dependendo da espécie, estirpe(s) já selecionada(s) e/ou que a
nodulem podem não ser disponíveis em nenhuma coleção. No entan‐
to, deve-se ressaltar que é obrigatória a inclusão de estirpe autorizada
pelo Mapa se ela for disponível.
O primeiro controle visa verificar se as condições de assepsia
foram adequadas e, consequentemente, a ausência de contaminação
no experimento, principalmente com outras BFN que não as testadas.
Caso ocorram nódulos nesse controle, o experimento está perdido, e
seus resultados não devem ser considerados. O segundo e o terceiro
controle servem como referência para verificar o grau de eficiência da
estirpe (o grau de eficiência também pode ser comparado ao controle
1) e também indicam se as condições experimentais foram adequa‐
das para expressão da nodulação e fixação biológica de N2 e do
crescimento vegetal. Todos os tratamentos devem ter no mínimo três
repetições e satisfazer as condições para análise estatística
adequada (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
O controle com nitrogênio mineral pode recebê-lo sob diferentes
formas (NH4NO3, KNO3 e NH4SO4), porque as espécies respondem
diferentemente ao nitrato ou ao amônio.
As bactérias são colocadas para crescer em meio de cultura 79
semissólido ou líquido (FRED; WAKSMAN, 1928) e inoculadas junto
às sementes no ato do plantio.
As sementes, quando ortodoxas, são escarificadas como men
cionado anteriormente. Depois são esterilizadas superficialmente com
peróxido de hidrogênio por cerca de quatro minutos ou com hipo
clorito de sódio, lavadas abundantemente com água estéril e
colocadas para germinar em papel filtro e algodão dentro de placas
de Petri, previamente esterilizadas. Posteriormente são acondicio‐
nadas em câmara de germinação.
As soluções nutritivas podem ser de Jensen, Norris (VINCENT,
1970), Hoagland e Arnon (1938) ou outras.

6.2.2. Ensaios em condições axênicas


No primeiro estádio é verificada em câmara de crescimento
(condições ótimas e controladas de temperatura, umidade, lumino‐
sidade e nutrientes) a capacidade de nodular e fixar nitrogênio de um
número elevado de estirpes, testadas separadamente em recipientes
menores (sacos plásticos, tubos, ou outros tipos de frascos de vidro
autoclaváveis) com solução nutritiva livre de nitrogênio na forma
mineral, com ou sem ágar em condições estéreis. Esse estádio visa
principalmente à autenticação de isolados, ou seja, a confirmação de
que são capazes de nodular a espécie de onde foram isolados. Essa
etapa é fundamental, uma vez que dentro do nódulo podem ocorrer
organismos endofíticos não nodulíferos ou pode também ocorrer
contaminação durante o processo de isolamento. Esse procedimento
também pode ser aplicado como estádio inicial na seleção para outra
espécie que não a de origem. A recomendação de estirpes com base
neste estádio é raramente usada. A autenticação dos isolados na
espécie de origem é preferível. No entanto, muitas vezes não há
disponibilidade de sementes dessa espécie, ou as suas sementes
perdem a viabilidade rapidamente ou são difíceis de serem
manipuladas (muito grandes e/ou de difícil desinfestação superficial)
e, portanto, não poderão ser avaliadas neste estádio e no estádio
posterior. Nesse caso, utiliza-se espécie de leguminosa promíscua em
relação à BFN, como o siratro (Macroptilium atropurpureum), que é
fácil de manipular em condições controladas e tem muita dispo‐
nibilidade de sementes. Nem sempre os resultados com espécie
promíscua no lugar da de origem são conclusivos, uma vez que
apesar de promíscuas, espécies como o siratro não são universais,
isto é, não nodulam com todas as estirpes de BFN. No entanto, se os
isolados nodularem, é obtida a confirmação se são BFN. Informação
qualitativa sobre a eficiência do isolado na espécie alvo, caso seja a
mesma de origem, poderá ser obtida por meio do teste de atividade
da nitrogenase realizado no campo e mencionado anteriormente.
No segundo estádio, para a base de recomendação II, os trata‐
mentos são constituídos das estirpes de bactérias que foram auten‐
ticadas ou confirmadas como nodulíferas no hospedeiro alvo na fase
anterior e são testadas em recipientes maiores com solução nutritiva
sem N-mineral ou com pequena dose de “arranque”, contendo ou não
mistura de areia mais vermiculita, ou outro suporte esterilizado (e.g.
vasos de Leonard) em casa de vegetação. Esse tipo de recipiente
permite maior crescimento e evidencia melhor as diferenças entre os
tratamentos, o que nem sempre pode ocorrer no estádio anterior. O
delineamento experimental é, em geral, de blocos casualizados, com
três ou mais repetições, dependendo da disponibilidade de sementes.
Os vasos de Leonard são preparados com uma mistura de areia e
vermiculita na proporção de 2:1 (v:v) e depois esterilizados em
autoclave (VINCENT, 1970).
A colheita das plantas é realizada, entre 3 e 4 meses (em geral) ou
mais após o plantio, quando elas apresentarem diferenças entre os
tratamentos. Os seguintes parâmetros são avaliados: peso da parte
aérea seca e número e peso dos nódulos secos. Os teores de
nitrogênio e de clorofila nas folhas também podem ser analisados. Por
meio desses parâmetros é possível confirmar se o isolado é
realmente rizóbio e a eficiência de cada estirpe para a espécie alvo.
Estirpes que não tenham boa performance nos estádios 1 e 2 são
eliminadas do processo de seleção para a espécie alvo, pois, se não
estabelecem simbiose eficiente em condições nutricionais e
ambientais adequadas, também não o farão nas condições estres‐
santes do solo. No entanto, poderão ser utilizadas em testes com
outras espécies vegetais.

6.2.3. Ensaios em condições não esterilizadas no solo


Para o estabelecimento e funcionamento da simbiose entre BFN e
leguminosas, além da compatibilidade entre elas, é necessário que
elas estejam adaptadas a uma série de fatores físicos, químicos,
biológicos e ambientais que são característicos da complexidade e
dinâmica e heterogeneidade de cada um dos diversos tipos de solo e
regiões. De modo geral, todos os fatores que interferem no desenvol‐
vimento da planta e/ou da bactéria podem afetar direta ou indireta‐
mente a simbiose e a eficiência de fixação do N2. Fatores
relacionados com características genéticas de ambos os simbiontes,
fatores edáficos (e.g. pH associado ou não à toxicidade por Al e Mn;
teores de nutriente, teores de N mineral ou orgânico, teores de
elementos tóxicos como metais pesados, defensivos agrícolas,
umidade e salinidade, temperatura, práticas de manejo) podem alterar
significativamente tanto o estabelecimento como o funcionamento da
simbiose. Além dos fatores citados, as diversas comunidades
biológicas, incluindo as comunidades de rizóbios nativos, podem
exercer relações antagônicas ou benéficas diversas que influenciam
marcantemente a simbiose (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Como já
mencionado, estirpes que não apresentarem boa performance nas
condições ótimas dos estádios 1 e 2 não apresentarão boa
performance nas diversas condições limitantes do solo. Porém, nem
todas as estirpes selecionadas nos estádios anteriores poderão
apresentar a mesma eficiência sob condições edáficas.
Portanto, de posse dos resultados da seleção de estirpes na etapa
anterior (em condições esterilizadas), são escolhidas cinco ou mais
estirpes, dependendo da disponibilidade de recursos do laboratório,
de melhor desempenho na promoção do crescimento da espécie alvo
para esta etapa que envolve os testes com solo. O objetivo desses
experimentos, em solo, é então conhecer se os isolados são
competitivos com as estirpes de rizóbios presentes no solo e se estão
adaptados às condições físicas, químicas e biológicas características
desse solo.
No estádio 3, vasos de polietileno de capacidade de 4 kg aproxi‐
madamente, dependendo da espécie, são preenchidos com camada
de solo superficial de 0 cm a 20 cm de preferência do local onde será
realizado o teste de campo (estádio 4). Nesse solo é feita a calagem e
adubação conforme as recomendações das análises de fertilidade
(baseadas nas exigências nutricionais da espécie, se for conhecida,
ou, se não, nas exigências da cultura do feijoeiro). No caso de espé‐
cies florestais cuja adubação não seja economicamente viável, deve-
se adubar nas mesmas condições do manejo comumente adotado.
Os procedimentos adotados para as condições esterilizadas são os
mesmos para esta fase, como o crescimento das culturas de
bactérias, inoculação, preparação das sementes, colheita e os
parâmetros avaliados. Assim como em vasos de Leonard,
semanalmente é feita a aplicação de nitrogênio nos controles
nitrogenados.
A eficiência da estirpe inoculada é avaliada pelo crescimento inicial
da planta comparando-a com os dois controles (sem e com N-
mineral). De posse dos resultados de massa seca da parte aérea ou
massa de nódulos seca dos tratamentos, determinam-se a eficiência
e a eficácia de cada estirpe testada. A eficiência se refere à
contribuição da estirpe para o parâmetro avaliado (massa da parte
aérea seca ou N total acumulado na biomassa) em relação ao
tratamento não inoculado (controle absoluto). E a eficácia mostra o
desempenho da estirpe para o parâmetro avaliado (massa da parte
aérea seca ou N total acumulado na biomassa) comparado com o
controle nitrogenado.
A avaliação de espécies arbóreas no estádio 4 é muito demorada,
em virtude do longo tempo de desenvolvimento das mesmas; no
entanto, um parâmetro comumente utilizado com sucesso para avaliar
o benefício da inoculação neste estádio é a sobrevivência e o
desenvolvimento das mudas inoculadas comparada às não inocula‐
das.

6.2.4. Fatores limitantes específicos de áreas de mineração


Especificamente em áreas de mineração, as restrições podem ser
várias ao crescimento de bactérias e plantas. Pela própria natureza
da exploração mineral, é nítido que a perda da estrutura original do
solo leva a problemas relacionados à dinâmica de água e do ar do
substrato exposto. Na maioria das vezes, esses impedimentos físicos
podem ser contornados pela subsolagem, aplicação de camadas de
top soil ou de resíduos orgânicos de diversas origens (CAMPELLO,
1998, FRANCO et al., 2001). Restrições de ordem química são muito
comuns em áreas de mineração (BALIEIRO et al., 2005; DIAS, 1998;
FRANCO et al., 2001; FORTES, 2000). Em algumas situações, como
áreas de empréstimo e taludes, a baixa fertilidade e acidez excessiva
são facilmente contornadas por meio da adição de corretivos, adubos
e/ou resíduos orgânicos (FRANCO; FARIA, 1997; REIS, 2006); porém
em outras, com problemas relacionados à oxidação de sulfetos como
pirita, calcopirita e galena, muito comuns em áreas de mineração de
ouro e carvão, a elevação da força iônica da solução e a solubilização
de metais nocivos apresentam-se como fatores restritivos ao desen‐
volvimento e estabelecimento de plantas e microrganismos à área
(DIAS, 1998). Embora alguns metais como Zn, Cu, Ni e Cr sejam
essenciais ou benéficos às plantas e microrganismos, outros como
Cd, Hg e Pb não possuem funções biológicas/fisiológicas conhecidas.
Todos esses metais, no entanto, em menor ou maior escala, podem
apresentar toxicidade aos microrganismos (DIAS-JÚNIOR et al.,
1998; GADD, 1992; GILLER et al., 1989; LAKZIAN et al., 2007;
MATSUDA et al., 2002a; PEREIRA et al., 2006; ZABALOY; GÓMEZ,
2005). No Brasil, importantes estudos visando à seleção de rizóbios
eficientes na FBN e tolerantes a metais pesados para inoculação de
leguminosas arbóreas com potencial para revegetação de áreas
degradadas por mineração têm sido realizados (MATSUDA et al.,
2002b).
Apesar dessas limitações sob certos tipos de mineração como a
de bauxita, diversidade significativa de BFN e de fungos micorrízicos
foram encontrados em áreas reabilitadas com vários tipos de revege‐
tação (MELLONI et al., 2003, 2006), e alguns apresentaram alta efi‐
ciência em simbiose com espécies florestais (SANTOS et al., 2008),
indicando que mesmo solos que passaram por períodos de estresse
podem ser fonte de recursos genéticos com potencial para uso em
inoculantes.
De forma quase que generalizada para as leguminosas herbáceas
utilizadas nos agroecossistemas, há uma relação inversa entre a FBN
e a disponibilidade de N do solo; esse efeito parece ser menos
acentuado nas espécies arbóreas, que possuem aptidão diferenciada
quanto ao uso do N do solo e do ar (BUSTAMANTE et al., 2004;
SPRENT, 1993). De um modo geral, em áreas degradadas, o teor de
matéria orgânica do solo é baixo e por consequência os de N
também. Dessa forma, uma vez sanados os fatores restritivos ao
desenvolvimento dos microssimbiontes e da planta, pode-se afirmar
que a nodulação e a fixação biológica de N2 representarão ganhos
ambientais indubitáveis à área.

6.2.5. Identificação de BFN


Até 1988, quando a espécie Azorhizobium caulinodans foi descrita,
as espécies de BFN eram baseadas em estirpes que nodulavam
leguminosas de grãos, principalmente de área temperadas. A partir da
década de 1990 intensificou-se o estudo de estirpes oriundas de
áreas tropicais e de espécies florestais. Nessa mesma década ocorre‐
ram avanços significativos da biologia molecular que revolucionaram
a taxonomia bacteriana. O estudo das estirpes de espécies florestais
no Brasil acompanhou esses avanços como pode se notar pelos
trabalhos publicados relacionados na Tabela 1. Seis novas espécies
foram descritas e aceitas pelo comitê de sistemática bacteriana:
Mesorhizobium plurifarium, Mesorhizobium amorphae, Azorhizobium
doebereinerae, Burkholderia mimosarum, Burkholderia sabiae e
Burkholderia nodosa. Estas foram baseadas em estirpes nativas de
solos brasileiros, incluindo inoculantes. Apesar desses resultados
significativos, a maior parte da diversidade de BFN nativas ainda
precisa ser desvendada.

6.2.6. Seleção de estirpes de rizóbio para espécies dependentes


de fungos micorrízicos
É bem documentado o efeito da micorrização sobre a nodulação e
o crescimento de plantas que não se desenvolvem bem em condições
esterilizadas. Em geral são espécies dos gêneros Piptadenia,
Parapiptadenia, Anadenanthera e algumas mimosas e acácias
(FARIA, 1995; JESUS et al., 2005). Essas espécies mostram uma
grande dependência a micorrizas para seu desenvolvimento e até
para sua nodulação (JESUS et al., 2005; JESUS; FARIA, 2000, 2001)
e podem também não responder a adubação nitrogenada (JESUS et
al., 2005) como mostrado na Figura 3.
Figura 3. Mimosa scabrella cultivada em solo esterilizado e inoculada com Burkholderia
nodosa BR 3437 (R) e fungos micorrízicos Glomus clarum e Gigaspora margarita (M): da
esquerda para a direira: R+M; R; CN: controle com nitrogênio e CA: controle absoluto.
Foto: S. M. Faria

Para essas espécies que apresentam problemas de crescimento


nas condições normais de seleção de estirpes em vasos de Leonard,
são implantados experimentos com a presença de fungos micorrízicos
arbusculares (FMA). O inoculante de FMA mais usado é constituído,
normalmente, de esporos produzidos em condições assépticas das
espécies Gigaspora margarita Becker & Hall e Glomus clarum
Nicolson & Schenck.
Os experimentos são montados em geral no esquema fatorial com
tratamentos adicionais, sendo o arranjo: 2 x 2+3. O delineamento
experimental mais usado é de blocos casualizados, com três a cinco
repetições, variando em função da disponibilidade de sementes. Os
fatores são as estirpes de BFN e inoculação com FMAs. O fator
estirpe de rizóbio é subdivido em dois níveis ou mais, de acordo com
o número de estirpes de BFN testadas. O fator FMA se subdivide nos
níveis presença e ausência de fungos micorrízicos, sendo que em
alguns casos é testada mais do que uma estirpe de fungo. Os trata‐
mentos adicionais são os controles com nitrogênio mineral, com
nitrogênio mineral e FMA e controle absoluto. Um controle com adubo
fosfatado também pode ser incluído.
Os experimentos são realizados em casa de vegetação em vasos
de polietileno com 4 kg de solo e areia na proporção 1:1(v:v). O
substrato é autoclavado em cubas de metal por 2 períodos de 2 horas
cada. As sementes são desinfestadas em hipoclorito de sódio 0,5%,
por 10 minutos, lavadas com água esterilizada até a remoção do
desinfestante e pré-germinadas em bandejas com areia e vermiculita
autoclavada. Após germinação, as sementes são transplantadas para
os vasos. No centro de cada vaso são abertas pequenas covas que
recebem, ao fundo, o inoculante contendo os fungos micorrízicos e
onde são introduzidas as plântulas. Após a semeadura, é feita a
inoculação com as bactérias, cerca de 1 mL de cultura na fase
log/planta.
O controle com adição de nitrogênio mineral recebe, semanal‐
mente, a aplicação de 10 mg de N inicialmente, e, dependendo do
crescimento, a quantidade é aumentada sempre na forma de nitrato
de amônio (NH4NO3) quando não se conhece a forma de N preferen‐
cial da espécie.
Os parâmetros avaliados nos experimentos são: massa da parte
aérea seca, das raízes e dos nódulos, número de nódulos e coloni‐
zação micorrízica. A colonização micorrízica é avaliada em amostras
de raízes finas clarificadas e coradas, de acordo com o método utili‐
zado por Koske e Gemma (1989), e a taxa de colonização micorrízica
é estimada pelo método de interseção em placa quadriculada de
Giovannetti e Mosse (1980).

6.3. Isolamento e seleção de fungos micorrízicos


arbusculares (FMA)

Os FMA são biotróficos obrigatórios requerendo o estabelecimento


de colonização com raízes de plantas compatíveis para que possam
completar seu ciclo de vida. Em virtude dessa característica, todo o
processo de isolamento em cultura pura e produção de inóculo são
conduzidos com a utilização de plantas micotróficas/hospedeiras.
Culturas de FMA podem ser estabelecidas a partir de três tipos de
propágulos: esporos, micélio e/ou fragmentos de raízes colonizadas.
No entanto, a eficiência de cada tipo de propágulo varia com as
espécies de fungo (SOUZA et al., 2005), sendo recomendada a
utilização de solo, esporos e raízes como fonte de inóculo para isola‐
mento de FMA de amostras ambientais. Os resultados obtidos com
cada uma dessas fontes de inóculo, em geral, são diferentes. Assim,
para recuperar com maior eficiência a diversidade de FMA de um
ambiente, além de promover sua multiplicação, é recomendado o
estabelecimento de culturas a partir dessas três fontes de propágulos
separadamente. Culturas estabelecidas, utilizando solo, raízes e
esporos coletados do ambiente, são denominadas culturas armadilha,
e as espécies de plantas hospedeiras utilizadas são denominadas de
plantas isca.
O cultivo armadilha deve ser estabelecido, de preferência, com
duas ou mais espécies de plantas micotróficas de famílias distintas,
como gramíneas (e.g. Brachiaria spp., Sorghum spp., Paspalum spp.)
e leguminosas (e.g. Trevo-Lupinus spp., Siratro-Macroptilium atropur‐
pureum; Estilosantes-Stylosanthes spp., caupi-Vigna unguiculata).
A duração do período de crescimento das culturas armadilha é
variável e deve ser determinada experimentalmente. Em geral, perío‐
dos mínimos de quatro meses são necessários; no entanto, algumas
espécies de FMA requerem períodos mais longos de 8 a 12 meses
(BRUNDRETT et al., 1999a, 1999b). Após o período de crescimento,
a rega dos vasos deve ser suspensa para que o substrato seque
naturalmente, e as plantas morram. O substrato seco pode ser
armazenado à temperatura ambiente à sombra por vários meses ou
em câmara fria. Esporos de algumas espécies de FMA perdem (ex.:
Gigaspora) a viabilidade após um ano de armazenamento, enquanto
que outras apresentam dormência de 6 ou mais meses.
Culturas puras, contendo propágulos viáveis e ativos, devem ser
utilizadas como fonte de inóculo para experimentos de seleção de
estirpes eficientes. A resposta de uma determinada espécie de planta
à inoculação com FMA varia em função do ambiente (tipo de solo, pH,
nível e disponibilidade de nutrientes) e compatibilidade genética entre
macro e microssimbionte. Os simbiontes devem ser selecionados em
função do ambiente final onde serão utilizados. Exemplo, se as
mudas inoculadas visam à revegetação de um substrato com
características de elevada acidez, reduzida disponibilidade de nutrien‐
tes e textura pesada, os fungos devem ser selecionados em função
dessas características visando a uma maior adaptação e, consequen‐
temente, ao sucesso na colonização do ambiente. Combinações
planta-fungo, com melhor desempenho em termos de produção de
biomassa, são selecionadas. Para recomposição ambiental, é reco‐
mendada a inoculação de estirpes de FMA pertencentes a diferentes
gêneros e famílias, visto que o recrutamento, a produtividade e a
diversidade de sistemas vegetais mais complexos, em geral, são mais
eficientes com o aumento da diversidade de FMA (HEIJDEN et al.,
1998; MAHERALI; KLIRONOMOS, 2007).
A diversidade de BFN e FMA no Brasil e métodos para sua
avaliação foram apresentados com detalhes recentemente
(BAGYARAJ; STÜRMER, 2008; 2010; MOREIRA, 2008a, 2008b;
2010; SOUZA et al., 2008; STÜRMER; SIQUEIRA, 2008).

7. Considerações finais

Vários trabalhos sobre as simbioses de espécies florestais com


BFN e FMA já foram realizados no Brasil. Esses trabalhos forneceram
tanto informações básicas (e.g. ocorrência, identificação e diversi‐
dade), como aplicadas, resultando na disponibilização de estirpes
inoculantes para cerca de 100 espécies de leguminosas. No entanto,
considerando as cerca de 2.000 espécies nativas de leguminosas,
uma diversidade ainda incalculável de espécies de BFN e FMA e suas
possíveis combinações, nos diversos tipos de solo e biomas brasilei‐
ros, muitos estudos ainda têm que ser conduzidos para que se possa
conhecer toda a diversidade de simbioses nativas, assim como seu
potencial de utilização. Espera-se que os métodos aqui apresentados
sejam úteis neste sentido.
Por outro lado, cerca de 99% de 25 milhões de doses de inocu‐
lante comercializadas no Brasil são para a cultura da soja, sendo
insignificante seu uso em espécies florestais. O novo cenário emer‐
gente, que visa maximizar a contribuição dos processos biológicos
nos sistemas de produção agrícola e florestal, economizando
recursos e garantindo a segurança alimentar e preservação
ambiental, certamente irá aumentar a utilização dessas espécies e
suas simbioses com BFN e FMA em diversos sistemas de manejo e
uso do solo.

8. Referências
ALLEN, E. K.; ALLEN, O. N. The Leguminosae: a source book of characteristics uses and
nodulation. Madison: University of Wisconsin Press, 1981. 812 p.
BAGYARAJ, J. D.; STURMER, S. L. Arbuscular mycorrhizal fungi. In: MOREIRA, F. M. S.;
HUISING, E. J.; BIGNELL, D. E. (Org.). A handbook of tropical soil biology: sampling &
characterization of below-ground biodiversity. Trowbridge: Earthscan, 2008. v. 1, p. 107-130.
BAGYARAJ, J. D.; STÜRMER, S.L. Fungos micorrízicos arbusculares (FMAs). In: MOREIRA,
F. M. A.; HUISING, E. J.; BIGNELL, D. E. (Org.). Manual de biologia dos solos tropicais:
amostragem e caracterização da biodiversidade. Lavras: UFLA, 2010. v. 1, p. 205-225.
BALIEIRO, F. C.; CHAER, G. M.; REIS, L. L.; FRANCO, N. O.; FRANCO, A. A. Qualidade do
solo em áreas degradadas. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIAS DO SOLO, 30.,
2005, Fortaleza. Anais... Viçosa: Sociedade Brasileira de Ciência do Solo, 2005. 1. CD-ROM.
BALIEIRO, F. C.; PEREIRA, M. G.; ALVES, B. A.; RESENDE, A. S.; FRANCO, A. A. Soil
carbon and nitrogen in pasture soil reforested with eucalyptus and guachapele. Revista
Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, v. 32, p. 1253-1260, 2008.
BARBERI, A.; CARNEIRO, M. A. C.; MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Nodulação em
leguminosas florestais em viveiros no sul de Minas Gerais. Cerne, Lavras, v. 4, n. 1, p. 145-
153, 1998.
BONETTI, R.; OLIVEIRA, L. A.; MAGALHÃES, F. M. M. Rhizobium populations and
mycorrhizal associations in some plantations of forest tree species. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, Brasília, DF, v. 19, p. 137-142, 1984.
BRUNDRETT, M. C.; ABBOTT, L. K.; JASPER, D. A. Glomalean mycorrhizal fungi from
tropical Australia: I. comparison of the effectiveness and specificity of different isolation
procedures. Mycorrhiza, Berlin, DE, v. 8, p. 305-314, 1999a.
BRUNDRETT, M. C.; JASPER, D. A.; ASHWATH, N. Glomalean mycorrhizal fungi from
tropical Australia: II. the effect of nutrient levels and host species on the isolation of fungi.
Mycorrhiza, Berlin, DE, v. 8, p. 315-321, 1999b.
BRUNDRETT, M. Coevolution of roots and mycorrhizas of land plants. New Phytologist,
Oxford, v. 154, p. 275-304, 2002.
BUSTAMANTE, M. M. C.; MARTINELLI, L. A.; SILVA, D. A.; CAMARGO, P. B.; KLINK, C. A.;
DOMINGUES, T. F.; SANTOS, R. V. N-15 Natural abundance in woody plants and soils of
Central Brazilian Savannas (Cerrado). Ecological Applications, Tempe, v. 14, p. 200-213,
2004.
CAMPELLO, E. F. C. Sucessão vegetal na recuperação de áreas degradadas. In: DIAS, L. E.;
MELLO, J. W. V. (Ed.). Recuperação de áreas degradadas. Viçosa: Universidade Federal de
Viçosa-Departamento de Solos; Sociedade Brasileira de Recuperação de Áreas Degradadas,
1998. p. 183-196.
CAMPELO, A. B.; DOBEREINER, J. Estudo sobre a inoculação cruzada de algumas
leguminosas florestais. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 4, p. 67-72, 1969.
CARVALHO, T. S.; MOREIRA, F. M. S. Simbioses tripartites leguminosas – fungos
micorrízicos e bactérias fixadoras de nitrogênio nodulíferas. In: SIQUEIRA, J. O.; CARDOSO,
E. J. B. N.; TSAI, S. M.; SOUZA, F. A. de. (Ed.). Micorrizas no Brasil: os primeiros 30 anos.
Lavras: Editora da Ufla, 2010.
CHADA, S.; CAMPELLO, E. F. C.; FARIA, S. M. de. Sucessão vegetal em uma encosta
reflorestada com leguminosas. Revista Árvore, Viçosa, v. 28, p. 801-809, 2004.
CHEN, W.; FARIA, S. M. de; CHOU, J.; JAMES, E. K.; ELLIOTT, G.; SPRENT, J. I.;
BONTEMPS, C.; YOUNG, P.W.; VANDAMME, P. Burkholderia sabiae sp. nov., isolated from
root nodules of Mimosa caesalpiniifolia. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, Washington, DC, v. 58, p. 2174-2179, 2008.
CHEN, W.; FARIA, S. M. de; JAMES, E. K.; ELLIOTT, G. N.; LIN, K.; CHOU, J.; SHEU, S.;
CNOCKAERT, M.; SPRENT, J. I.; VANDAMME, P. Burkholderia nodosa sp. nov., isolated from
root nodules of the woody legumes Mimosa bimucronata and Mimosa scabrella. International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Washington, DC, v. 57, p. 1055-1059,
2007.
CHEN, W.; FARIA, S. M. de; STRALIOTTO, R.; PITARD, R. M.; SIMÕES-ARAÚJO, J. L.;
CHOU, J.; CHOU, Y.; BARRIOS, E.; PRESCOTT, A. R.; ELLIOTT, G. N.; SPRENT, J. I.;
YOUNG, P. W.; JAMES, E. K. Proof that Burkholderia strains form effective symbioses with
legumes: a study of novel Mimosa-nodulating strains from South América. Applied and
Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 71, p. 7461-7471, 2005.
CHEN, W.; JAMES, E. K.; COENYE, T.; CHOU, J.; BARRIOS, E.; FARIA, S. M. de; ELLIOTT,
G. N.; SHEU, S.; SPRENT, J. I.; VANDAMME, P. Burkholderia mimosarum sp. nov., isolated
from root nodules of Mimosa spp. from Taiwan and South America. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology, Washington, DC, v. 56, p. 1847-1851, 2006.
DE-LAJUDIE, P. de; WILLEMS, A.; NICK, G.; MOREIRA, F.; MOLOUBA, F.; HOSTE, B.;
TORCK, U.; NEYRA, M.; COLLINS, M. D.; LINDSTROM, K.; DREYFUS, B.; GILLIS, M.
Characterization of tropical tree rhizobia and description of Mesorhizobium plurifarium sp. nov.
International Journal of Systematic Bacteriology, Washington, DC, v. 48, p. 369-382, 1998.
DIAS, L. E. Caracterização de substratos para fins de recuperação de áreas degradadas. In:
DIAS, L. E.; MELLO, J. W. V. (Ed.). Recuperação de áreas degradadas. Viçosa: Universidade
Federal de Viçosa-Departamento de Solos; Sociedade Brasileira de Recuperação de Áreas
Degradadas, 1998. p. 27-44.
DIAS-JÚNIOR, H. E.; MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O.; SILVA, R. Metais pesados,
densidade e atividade microbiana em solo contaminado por rejeitos de indústria de zinco.
Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, v. 22, p. 631-640, 1998.
DILWORTH, M. J. Acetylene reduction by nitrogen-fixing preparations from Clostridium
pasteurianum. Biochemica et Biophysica Acta, Amsterdam, NL, v. 127, p. 285-294, 1966.
DOMMERGUES, Y.; DUHOUX, E.; DIEM, H. G. Les arbres fixateurs d’azote caracteristiques
fondamentales et role dans l’amenagement des ecosystemes mediterraneens et tropicaux avec
reference particuliere aux zones subhumides et arides. Rome: CIRAD, 1999. 499 p.
FARIA, S. M. de. Obtenção de estirpes de rizóbio eficientes na fixação biológica de nitrogênio
para espécies florestais (aproximação 2000). Seropédica: Embrapa Agrobiologia, 2000. 10 p.
(Embrapa Agrobiologia. Documentos, 116).
FARIA, S. M. de. Obtenção de estirpes de rizóbio eficientes na fixação biológica de nitrogênio
para espécies florestais. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, 2002. 16 p. (Embrapa
Agrobiologia. Documentos, 134).
FARIA, S. M. de. Obtenção de estirpes de rizóbio eficientes na fixação de nitrogênio para espécies
florestais (Aproximação 1997). Seropédica: Embrapa-CNPAB, 1997. 4 p. (Embrapa-CNPAB.
Recomendação Técnica, 1).
FARIA, S. M. de. Ocurrence and rhizobial selection for legume trees adapted to acid soils. In:
EVANS, D. O.; SZOTT, T. (Ed.). Nitrogen fixing trees for acid soil. Morrilton: Nitrogen Fixing
Tree Association, 1995. p. 295-300.
FARIA, S. M. de; FRANCO, A. A.; JESUS, R. M.; MENANDRO, M. de S.; BAITELLO, J. B.;
MUCCI, E. S. F.; DÖBEREINER, J.; SPRENT, J. I. New nodulating trees from South-East
Brazil. New Phytologist, Oxford, v. 98, p. 317-328, 1984.
FARIA, S. M. de; GUEDES, R. E. Obtenção de estirpes de rizóbio eficientes na fixação biológica
de nitrogênio para espécies florestais (aproximação 1999). Seropédica: Embrapa Agrobiologia,
1999. 4 p. (Embrapa Agrobiologia. Recomendação Técnica, 5).
FARIA, S. M. de; LEWIS, G. P.; SPRENT, J. I.; SUTHERLAND, J. M. Occurrence of
nodulation in the leguminosae. New Phytologist, Oxford, v. 11, p. 607-619, 1989.
FARIA, S. M. de; LIMA, H. C. Additional studies of the nodulation status of legume species in
Brazil. Plant and Soil, The Hague, v. 200, p. 185-192, 1998.
FARIA, S. M. de; LIMA, H. C.; OLIVARES, F. L.; MELO, R. B.; XAVIER, R. P. Nodulação em
espécies florestais, especificidade hospedeira e implicações na sistemática de leguminosae.
In: SIQUEIRA, J. O.; MOREIRA, F. M. S.; LOPES, A. S.; GUILHERME, L. R. G.; FAQUIN, V.;
FURTINI NETO, A. E.; CARVALHO, J. G. (Ed.). Inter-relação fertilidade, biologia do solo e
nutrição de plantas. Viçosa: Sociedade Brasileira de Ciência do Solo; Lavras: Universidade
Federal de Lavras-Departamento de Ciência do Solo, 1999. p. 667-686.
FARIA, S. M. de; MELLO, R. B. Obtenção de estirpes de rizóbio eficientes na fixação biológica de
nitrogênio para espécies florestais. Seropédica: Embrapa-CNPAB, 1998. 4 p. (Embrapa-
CNPAB. Recomendação Técnica, 3).
FARIA, S. M.; LIMA, H. C.; FRANCO, A. A.; MUCCI, E. S. F.; SPRENT, J. I. Nodulation of
legume trees from SE Brazil. Plant and Soil, The Hague, v. 99, p. 347-356, 1987.
FORTES, J. L. O. Reabilitação de depósito de rejeito do refino e bauxita com o uso de resíduos
industriaise e leguminosas arbóreas. 2000. 185 f. Tese (Doutorado em Agronomia) -
Universidade Federal Rural do Rio De Janeiro, Seropédica.
FRANCO, A. A.; CAMPELLO, E. F. C.; CERQUEIRA, L. S. C.; LIMA, H. J. S. Afforestation of
red mud with nitrogen fixing legume trees aided by compost and topsoil addition. In:
INTERNATIONAL CONFERENCE ON LAND DEGRADATION, 3., 2001, Rio de Janeiro.
Proceedings... Rio de Janeiro: Embrapa Solos, 2001. 1 CD-ROM.
FRANCO, A. A.; FARIA, S. M. de. The contribution of N2-fixing tree legumes to land
reclamation and sustainability in the Tropics. Soil Biology Biochemistry, Oxford, v. 29, p. 897-
903, 1997.
FRED, E. B.; WAKSMAN, S. A. Laboratory manual of general microbiology with special
reference to the microrganisms of the soil. New York: Mc-Graw-Hill Book, 1928. 145 p.
GADD, G. M. Metals and microrganisms: a problem of definition. Fems Microbiology Letters,
Haren, v. 100, p. 197-203, 1992.
GILLER, K. E.; MCGRATH, S. P.; HIRSCH, P. R. Absence of nitrogen fixation in clover grown
on soil subject to long-term contamination with heavy metals is due to survival of only
ineffective Rhizobium. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 21, p. 841-848, 1989.
GIOVANNETTI, M.; MOSSE, B. An evaluation of techniques for measuring vesicular
arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytologist, Oxford, v. 84, p. 489-490, 1980.
GONÇALVES, M.; MOREIRA, F. M. S. Specificity of the legume Sesbania virgata (Caz.) pers.
and its nodule isolates Azorhizobium johannae with other legume hosts and rhizobia. I.
Symbiosis, Philadelphia, v. 36, p. 57-68, 2004.
GRAHAM, P. H. Identification and classification of root nodule bacteria. In: NUTMAN, P. S.
(Ed.). Symbiotic nitrogen fixation in plants. Cambridge: Cambridge University, 1976. p. 99-112.
(IBP, 7).
HEIJDEN, M. G. A. van der; KLIRONOMOS, J. N.; URSIC, M.; MOUTOGLIS, P.;
STREITWOLF, E. R.; BOLLER, T.; WIEMKEN, A.; SANDERS, I. R. Mycorrhizal fungal
diversity determines plant biodiversity, ecosystem variability and productivity. Nature, London,
UK, v. 396, p. 69-72, 1998.
HERRERA, M. A.; SALAMANCA, C. P.; BAREA, J. M. Inoculation of woody legumes with
selected arbuscular mycorrhizal fungi and rhizobia to recover desertified mediterranean
ecosystems. Applied Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 59, p. 129-133, 1993.
HOAGLAND, D. R.; ARNON, D. T. The water culture method for growing plants without soil.
Berkeley: California Agriculture Experiment Station, 1938. 39 p.
JESUS, E. C.; FARIA, S. M. de. Dependência de micorrizas na nodulação de “pau-jacaré’’
(Piptadenia gonoacantha (Mart.) Macbr. In: FERTBIO, 2000, Santa Maria. Anais... Santa
Maria: FertBio, 2000. p. 45-46.
JESUS, E. C.; FARIA, S. M. de. Dependência de micorrizas na nodulação de “maminha de
porca’’ (Piptadenia Paniculata Bentham). In: JORNADA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DA
UFRRJ, 11., 2001, Seropédica. Anais... [Seropédica: UFRRJ], 2001. v. 11, p. 9-10.
JESUS, E. C.; SCHIAVO, J. E.; FARIA, S. M. de. Dependência de micorrizas para a
nodulação de leguminosas arbóreas tropicais. Revista Árvore, Viçosa, v. 29, p. 545-552,
2005.
KOSKE, R. E.; GEMMA, J. N. A modified procedure for staining roots to detect VA
mycorrhizas. Mycology Research, Cambridge, v. 92, p. 488-505, 1989.
LACERDA, A. M.; MOREIRA, F. M. S.; ANDRADE, M. J. B.; SOARES, A. L. L. Efeito de
estirpes de rizóbio sobre a nodulação e produtividade do feijão-caupi. Revista Ceres, Viçosa,
v. 51, p. 67-82, 2004.
LAKZIAN, A.; MURPHY, P.; GILLER, K. Transfer and loss of naturally occurring plasmids
among isolates of Rhizobium Leguminosarum bv. viciae in heavy metal contaminated soils.
Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 39, n. 5, p. 1066-1077, 2007.
LIMA, A. S.; NÓBREGA, R. S. A.; BARBERI, A.; SILVA, K.; FERREIRA, D. F.; MOREIRA, F.
M. S. Nitrogen-fixing bacteria communities occurring in soils under different uses in the
Western Amazon Region as indicated by nodulation of siratro (Macroptilium atropurpureum).
Plant and Soil, The Hague, v. 319, n. 1-2, p. 127-145, 2009.
MACEDO, M. O.; RESENDE, A. S.; GARCIA, P. C.; BODDEY, R. M.; JANTALIA, C. P.;
URQUIAGA, S.; CAMPELLO, E. F. C.; FRANCO, A. A. Changes in soil C and N stocks and
nutrient dynamics 13 years after recovery of degraded land using leguminous nitrogen-fixing
trees. Forest Ecology and Management, Amsterdam, NL, v. 255, p. 1516-1524, 2008.
MAGALHÃES, F. M. M.; MAGALHÃES, L. M. S.; OLIVEIRA, L. A.; DÖBEREINER, J.
Ocorrência de nodulação em leguminosas florestais de terra firme nativas da região de
Manaus-AM. Acta Amazônica, Manaus, v. 12, p. 509-514, 1982.
MAGALHÃES, F. M. M.; SILVA, M. F. Associações rhizobium-leguminosas no estado de
Rondônia. Acta Amazônia, Manaus, v. 16/17, p. 7-17, 1986.
MAGALHÃES, L. S. M.; FERNANDES, N. P. Experimental stands of leguminous forests in the
Manaus region. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 19, p. 75-79, 1984.
MAHERALI, H.; KLIRONOMOS, J. N. Influence of Phylogeny on fungal community assembly
and ecosystem functioning. Science, Washington, DC, v. 316, p. 1746-1748, 2007.
MATSUDA, A.; MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Survival of Bradyrhizobium and
Azorhizobium in heavy metal contaminated soil. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa,
v. 26, p. 249-256, 2002a.
MATSUDA, A.; MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Tolerância de rizóbios de diferentes
procedências ao zinco, cobre e cádmio. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 37,
p. 343-355, 2002b.
MELLONI, R.; MOREIRA, F. M. S.; NÓBREGA, R. S. A.; SIQUEIRA, J. O. Eficiência e
diversidade fenotípica de bactérias diazotróficas que nodulam caupi (Vigna unguiculata (L.)
Walp) e feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) em solos de mineração de bauxita em reabilitação.
Revista Brasileira de Ciência do Solo, Campinas, v. 30, p. 235-246, 2006.
MELLONI, R.; SIQUEIRA, J. O.; MOREIRA, F. M. S. Fungos micorrízicos arbusculares em
áreas em solos de área de mineração de bauxita em reabilitação. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, Brasília, DF, v. 38, p. 267-276, 2003.
MENNA, P.; HUNGRIA, M.; BARCELLOS, F. G.; BANGEL, E. V.; HESS, P. N.; MARTINEZ-
ROMERO, E. Molecular phylogeny based on the 16S rRNA gene of elite rhizobial strains used
in Brazilian commercial inoculants. Systematic and Applied Microbiology, Stuttgart, v. 29, p.
315-332, 2006.
MOREIRA, F. M. S. Bactérias fixadoras de nitrogênio que nodulam espécies de Leguminosae.
In: MOREIRA, F. M. A.; HUISING, E. J.; BIGNELL, D. E. (Org.). Manual de biologia dos solos
tropicais: amostragem e caracterização da biodiversidade. Lavras: UFLA, 2010. v. 1, p. 279-
313.
MOREIRA, F. M. S. Bactérias fixadoras de nitogênio que nodulam leguminosas. In:
MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O.; BRUSSAARD, L. (Ed.). Biodiversidade do solo em
ecossistemas brasileiros. Lavras: UFLA, 2008b. p. 621-680.
MOREIRA, F. M. S. M.; PEREIRA, E. G. Microsymbionts: rhizobia. In: SWIFT, M.; BIGNELL,
D. (Ed.). Standard methods for assessment of soil biodiversity and land use practice. Bogor:
International Centre for Research in Agroforestry, 2001. p. 19-24. Disponível em:
<http://www.asb.cgiar.org/publications/asb%20lecture%20notes/default.asp>. Acesso em: 22
fev. 2010.
MOREIRA, F. M. S. Nitrogen-fixing Leguminosae nodulating bacteria. In: MOREIRA, F. M. S.;
HUISING, E. J.; BIGNELL, D. E. (Org.). A handbook of tropical soil biology: sampling &
characterization of below-ground biodiversity. Trowbridge: Earthscan, 2008a. v. 1, p. 107-130.
MOREIRA, F. M. S. Nodulação e crescimento de 49 leguminosas arbóreas nativas da
Amazônia em viveiro. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Campinas, v. 21, p. 581-590, 1997.
MOREIRA, F. M. S. Nodulação e crescimento de leguminosas em dois solos da Amazônia.
Revista Brasileira de Ciência do Solo, Campinas, v. 19, p. 197-204, 1995.
MOREIRA, F. M. S. Relatório de estágio de pós-doutorado na Michigan State University. [S.l.:
s.n.], 2001. Não Publicado.
MOREIRA, F. M. S.; CRUZ, L. M.; FARIA, S. M. de; MARSH, T.; MARTINEZ-ROMERO, E.;
PEDROSA, F. O.; PITARD, R.; YOUNG, P. J. W. Azorhizobium doebereinerae sp. nov.
microsymbiont of Sesbania virgata (Caz.) Pers. Systematic and Applied Microbiology,
Stuttgart, v. 29, p. 197-206, 2006.
MOREIRA, F. M. S.; GILLIS, M.; POT, B.; KERSTERS, K.; FRANCO, A. A. Characterization of
rhizobia isolated from different divergence groups of tropical Leguminosae by comparative
polyacrylamide gel electrophoresis of their total proteins. Systematic and Applied Microbiology,
Stuttgart, v. 16, p. 135-146, 1993.
MOREIRA, F. M. S.; HAUKKA, K.; YOUNG, J. P. W. Biodiversity of rhizobia isolated from a
wide range of forest legumes in Brazil. Molecular Ecology, Vancouver, v. 7, p. 889-895, 1998.
MOREIRA, F. M. S.; SILVA, M. F.; FARIA, S. M. de. Occurrence of nodulation in legume
species in the Amazon Region of Brazil. New Phytologist, Oxford, v. 121, p. 563-570, 1992.
MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e bioquímica do solo. 2. ed. Lavras: UFLA,
2006. 729 p.
PARROTA, J. A.; KNOWLES, O. H. Restoration of tropical moist forest on bauxite-mined
lands in the Brazilian Amazon. Restoration Ecology, Oxford, v. 7, p. 103-116, 1999.
PEREIRA, S. I. A.; LIMA, A. I. G.; FIGUEIRA, E. M. A. P. Heavy metal toxicity in Rhizobium
Leguminosarum biovar viciae isolated from soils subjected to different sources of heavy-metal
contamination: effects on protein expression. Applied Soil Ecology, Amsterdam, NL, v. 33, p.
286-293, 2006.
POLHILL, R. M. Complete synopsis of legume genera. In: BISBY, F. A.; BUCKINGHAM, J.;
HARBORNE, J. B. (Ed.). Phytochemical dictionary of the Leguminosae. London, UK: Chapman
& Hall, 1994. v. 1, p. xlix-lvii.
POLHILL, R. M.; RAVEN, P. H.; STIRTON, C. H. Evolution and systematics of the
Leguminosae. In: POLHILL, R. M.; RAVEN, P. H. (Ed.). Advances in legume systematics.
London, UK: Royal Botanic Gardens, 1981. p. 126.
REIS, L. L. Monitoramento da recuperação de ambiental de áreas de mineração de bauxita na
Floresta Nacional de Sacará-Taquera, Porto Trombetas (PA). 2006. 159 f. Tese (Doutorado) –
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, 2006.
RESH, S. C.; BINKLEY, D.; PARROTA, J. A. Greater soil carbon sequestration under nitrogen-
fixing trees compared with Eucalyptus species. Ecosystems, New York, v. 5, p. 217-231, 2002.
SANDERS, I. R. Preference, specificity and cheating in the arbuscular mycorrhizal symbiosis.
Trends in Plant Science, London, UK, v. 8, p. 143-145, 2003.
SANTOS, J. G. D.; SIQUEIRA, J. O.; MOREIRA, F. M. S. Eficiência de fungos micorrízicos
arbusculares isolados de solos de áreas de mineração de bauxita no crescimento inicial de
espécies nativas. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Campinas, v. 32, p. 141-150, 2008.
SCHEUBLIN, T. R.; RIDGWAY, K. P.; YOUNG, J. P.; HEIJDEN, M. G. A. van der.
Nonlegumes, legumes, and root nodules harbor different arbuscular mycorrhizal fungal
communities. Applied and Environmental Microbiology, Washington, DC, v. 70, p. 6240-6246,
2004.
SOARES, A. L. L.; FERREIRA, P. A. A.; PEREIRA, J. P. A. R.; VALE, H. M. M.; LIMA, A. S.;
ANDRADE, M. J. B.; MOREIRA, F. M. S. Eficiência agronômica de rizóbios selecionados e
diversidade de populações nodulíferas em Perdões:
II- feijoeiro. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Campinas, v. 30, p. 803-811, 2006.
SOUZA, F. A.; DALPE, Y.; DECLERCK, S.; PROVIDENCIA, I. E. de la; SEJALON-DELMAS,
N. Life history strategies in Gigasporaceae: insight from monoxenic culture. In: DECLERCK,
S.; STRULLU, D. G.; FORTIN, A. (Ed.). “In vitro culture of Mycorrhizas”. Berlin, DE: Springer;
New York: Heidelberg, 2005. v. 4, p. 73-91.
SOUZA, F. A.; SILVA, I. C. L.; BERBARA, R. L. L. Fungos micorrízicos arbusculares: muito
mais diversos do que se imaginava. In: MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O.; BRUSSAARD,
L. (Ed.). Biodiversidade do solo em ecossistemas brasileiros. Lavras: UFLA, 2008. p. 621-680.
SOUZA, L. A. G.; SILVA, M. F.; MOREIRA, F. W. Capacidade de nodulação de cem
leguminosas da região Amazônica. Acta Amazônica, Manaus, v. 24, p. 9-18, 1994.
SPRENT, J. I. Nodulation in leguminosae. London, UK: Kew Botanic Gardens, 2001. 146 p.
SPRENT, J. I. The role of the nitrogen fixation in primary succession on land. In: MILES, J.;
WALTON, D. W. H. (Ed.). Primary succession on land. Oxford: Backwell Scientific, 1993. p.
209-219.
STÜRMER, S. L.; SIQUEIRA, J. O. Diversidade de fungos micorrízicos arbusculares em
ecossistemas brasileiros. In: MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J. O.; BRUSSAARD, L. (Ed.).
Biodiversidade do solo em ecossistemas brasileiros. Lavras: UFLA, 2008. p. 621-680.
SYLVESTER-BRADLEY, R.; OLIVEIRA, L. A.; PODESTA-FILHO, J. A. de; SAINT JOHN, T. V.
Nodulation of legumes, nitrogenase activity of roots and occurrence of nitrogen-fixing
Azospirillum spp. in representative soils of Central Amazônia. Agro-Ecosystems, Amsterdam,
NL, v. 6, p. 249-266, 1980.
VANDENKOORNHUYSE, P.; HUSBAND, R.; DANIELL, T. J.; WATSON, I. J.; DUCK, J. M.;
FITTER, A. H.; YOUNG, J. P. W. Arbuscular mycorrhizal community composition associated
with two plant species in a grassland ecosystem. Molecular Ecology, Vancouver, v. 11, p.
1555-1564, 2002.
VANDENKOORNHUYSE, P.; RIDGWAY, K. P.; WATSON, I. J.; FITTER, A. H.; YOUNG, J. P.
W. Co-existing grass species have distinctive arbuscular mycorrhizal communities. Molecular
Ecology, Vancouver, v. 12, p. 3085-3095, 2003.
VINCENT, J. M. A manual for the practical study of root-nodule bacteria. Oxford: Blackwell
Scientific, 1970. 164 p.
ZABALOY, M. C.; GOMEZ, M. A. Diversity of rhizobia isolated from agricultural soil in
Argentina based on carbon utilization and effects of herbicides on growth. Biology and Fertility
of Soils, Berlin, DE, v. 42, p. 83-88, 2005.
Capítulo 4
Análise de imagens para
acompanhamento da nodulação
em leguminosas
Mario de Andrade Lira Junior
Rinaldo Luiz Caraciolo Ferreira
Karina Patrícia Vieira da Cunha
Márcia do Vale Barreto Figueiredo

1. Introdução

1.1. Nodulação

A interação entre leguminosas e rizóbios é um exemplo de


associação biológica intensamente estudada, cujos benefícios para
a sustentabilidade agrícola são reconhecidos em virtude do
processo de Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) (XAVIER et al.,
2006). Esse processo ocorre em nódulos radiculares induzidos pela
infecção bacteriana (URIBE, 1994). Os nódulos e a planta
hospedeira são perfeitamente interligados por meio de vasos
xilemáticos e floemáticos e totalmente integrados em termos
hormonais e nutricionais. O processo da FBN requer um suprimento
contínuo de carboidratos que fornecem tanto a energia para a
redução do nitrogênio quanto os esqueletos de carbono necessários
à assimilação da amônia produzida, sendo relativamente intensivo
em energia produzida na parte aérea da planta hospedeira
(SILVEIRA et al., 2003).
O estabelecimento bacteriano na rizosfera é uma condição
fundamental para que o microrganismo possa interagir com a planta.
Além disso, é necessário que a bactéria se espalhe ao longo da raiz
e não perca a capacidade de sobreviver e multiplicar-se de maneira
competitiva em relação à comunidade nativa. A colonização
radicular é um processo bastante complexo, pois diferentes
microrganismos estão sujeitos a diversos fatores bióticos e abióticos
(BENIZRI et al., 2001; FIGUEIREDO et al., 2008). A sobrevivência
do rizóbio e nodulação é frequentemente ligada com a competição
por substratos de carbono, produção de antibióticos, sideróforos ou
substâncias estimuladoras do crescimento vegetal (RUMJANEK et
al., 1995). Os sideróforos desempenham um papel fundamental na
formação do nódulo (REIGH; O´CONNELL, 1993). A capacidade de
produzir sideróforos parece ser mais difundida entre o gênero
Rhizobium do que entre o gênero Bradyrhizobium, que evoluiu em
solos ácidos, nos quais Fe está, normalmente, mais disponível
(GUERINOT, 1994). Além disso, os rizóbios podem utilizar
sideróforos de outros rizóbios, o que é chamado de sinergismo
interestirpe, desde que possuam proteínas receptoras da membrana
externa específica para o sideróforo em questão.

1.2. Nódulos indeterminados e determinados

Dependendo do sistema simbiótico, podemos encontrar dois


tipos de nódulos: indeterminados e determinados, em função de sua
origem no córtex interno ou externo. Ambos apresentam estrutura
anatômica distinta e diferem na forma em que se comportam a bac‐
téria no interior do nódulo em formação, embora a indução do ciclo
celular em ambos os sistemas siga a mesma regulação. Nos
nódulos indeterminados, que ocorrem em plantas dos gêneros
Medicago, Pisum, Trifolium, Vicia, entre outras, são as células do
córtex interior que reintroduzem a bactéria no ciclo celular, além de
possuírem um meristema permanente, que lhe outorga uma forma
cilíndrica com simetria radial na organização dos tecidos. Tem-se
então uma zona central, na qual o rizóbio se instala e realiza a FBN
(FOUCHER; KONDOROSI, 2000). Nos nódulos determinados, que
ocorrem em plantas dos gêneros Phaseolus, Glycine, Vigna, Lotus,
entre outras, não há um meristema permanente. Assim, seu
crescimento se baseia na expansão em vez da divisão celular, razão
pela qual apresentam uma morfologia esférica em vez de cilíndrica
(HIRSCH, 1992).

1.3. Agentes sinalizadores

Resultados de experimentos têm mostrado a possibilidade de se


obter incremento na nodulação, por exemplo, por meio do forneci‐
mento de sinais (flavonoides) que podem ser adicionados aos inocu‐
lantes. Diversos benefícios agronômicos, como aumento
significativo da nodulação de leguminosas e da capacidade
competitiva dos rizóbios, podem ser alcançados pelo aumento
quantitativo e/ou qualitativo dos indutores pelo hospedeiro
(ALMARAZ et al., 2007; LIRA JUNIOR et al., 2003; MABOOD et al.,
2006a, 2006b; POUSTINI et al., 2005). Para tanto, torna-se crucial
um melhor entendimento de trocas de sinais moleculares na
interação planta-microrganismos (ANTÓN, 2004).
O processo de infecção pelo rizóbio envolve diferentes sinaliza‐
dores entre a planta e a bactéria (TAÍZ; ZIEGER, 2004). Timmers et
al. (1999) relatam que a bactéria noduladora migra em direção às
raízes em função de uma resposta quimiostática. Essa resposta é
decorrente da atração pelos isoflavonoides e betaínas secretadas
pelas raízes. Esses compostos ativam enzimas que induzem a
transcrição de genes nod, que codificam moléculas sinalizadoras de
oligossacarídeos de lipoquitina, identificados após a secreção por
receptores, como lecitinas especiais produzidas nos pêlos
radiculares.
Quando as células dos pêlos radiculares reconhecem os fatores
de nodulação (Nod), inicia-se o enrolamento dos mesmos. Com a
evolução da infecção é formado um canal dentro do pelo radicular, e
enquanto no periciclo é iniciado o rearranjo do citoesqueleto
microtubular, na parte interna do córtex ocorre a ativação das
células que se dividem formando um primórdio. Posteriormente,
ocorre a infecção, localizada distanciadamente da área radicular
ativada. A ativação celular se estende progressivamente para o
meio e para a parte mais externa do córtex, seguindo gradientes de
diferenciação celular, o que resulta na formação de um primórdio
nodular (FAGAN et al., 2007). Os fatores nod são responsáveis, em
baixa concentração, pela síntese de proteínas, denominadas
nodulinas, que desempenham papel importante na formação e
manutenção do nódulo radicular (ALMARAZ et al., 2007).
Outro mecanismo de troca de sinal é a secreção de proteínas
pelo rizóbio. Desses mecanismos, os mais comuns são os de
secreção tipo III, isto é, mecanismos de exportação de proteínas
altamente conservados, em bactérias Gram negativas, que
atravessam as membranas bacterianas, liberando as proteínas no
citosol de células hospedeiras (SÜB et al., 2006). No caso rizobiano,
recentemente, diversas proteínas têm sido identificadas como
ligadas a esse sistema (SAAD et al., 2008). De modo geral, as
funções dessas proteínas ainda não estão esclarecidas, visto que
nem todas as estirpes apresentam esse sistema e que algumas
mutações não afetam a nodulação enquanto outras têm efeitos
deletérios (WASSEM et al., 2008).
Embora se conheça relativamente muito sobre genes dos rizó‐
bios envolvidos na nodulação, pouco se sabe sobre os genes das
leguminosas hospedeiras relacionados à simbiose. Nesse sentido,
tem-se buscado identificar genes da planta envolvidos na nodulação
(BUZAS; GRESSHOFF, 2007). Silverstein et al. (2006) encontraram
novas famílias de genes em leguminosas, denominadas de
proteínas ricas em glicina (GRP), prolina (PRP) e cisteina (CRP) que
estão envolvidas, principalmente, na nodulação e proteção dos
nódulos. Kuster et al. (2007) identificaram cerca de 100 genes das
leguminosas que ativam diferentes estádios durante a simbiose com
o rizóbio. Esses genes apresentam funções relacionadas à
eficiência simbiótica, e entre elas a facilitação dos processos de
transporte pelas membranas perissimbióticas, que cercam os
bacteroides nos nódulos.

1.4. Avaliação da nodulação

Em razão das diferenças na habilidade nodulífera de legumino‐


sas com estirpes nativas, a bioprospecção de rizóbios em solos
locais pode fornecer subsídios sobre a eficiência da nodulação
natural e da fixação de nitrogênio das espécies (SOUZA et al.,
2007). Essas eficiências poderão ser avaliadas por meio de
atividade da nitrogenase (HARDY et al., 1968); teor de ureídeos
(HERRIDGE; PEOPLES, 1990); abundância natural 15N (BODDEY
et al., 2001); teor de leghemoglobina (WILSON; REISENAUER,
1963); número e tamanho de nódulos; nodulação específica (GAN et
al., 2004), assim como por meio das nodulinas (proteínas
sintetizadas pelos nódulos) (FARNDEN; ROBERTSON, 1980).
Esses diversos métodos têm sido utilizados para avaliar eficiência e
eficácia das estirpes (FARIA; FRANCO, 2002), visando,
eventualmente, à recomendação de estirpes para o uso na
produção comercial de inoculantes. Uma característica comum da
maioria desses métodos é ser baseado em métodos destrutivos,
que não permitem, por exemplo, o acompanhamento de nódulos em
uma mesma planta ao longo do tempo, como é possível por técnicas
de análise de imagens (COSTA et al., 2006, 2007; LIRA JUNIOR et
al., 2005), o que torna o desenvolvimento e aprimoramento dessas
técnicas de grande valia.

2. Análise de imagens

Por muito tempo, as imagens foram utilizadas para simples


documentação, descrição qualitativa e ilustração dos fenômenos
observados pelos cientistas. Com o avanço tecnológico e a redução
dos custos dos computadores, foram desenvolvidos sistemas de
análise de imagem que representam, atualmente, um ponto de
apoio a diversas áreas de estudo, como conservação de recursos
naturais, manejo do solo e meteorologia; análises biomédicas,
metalográficas e de anatomia vegetal (BOUMA et al., 2000; BRITO
et al., 2004; COSTA et al., 2001; LIRA JUNIOR; SMITH, 2000;
TEIXEIRA et al., 2006; VIEIRA JUNIOR et al., 2006). Algumas das
maiores vantagens dessa análise estão na capacidade de diminuir a
subjetividade da análise humana, de superar inconvenientes de
análises manuais que são muitas vezes demoradas (BOUMA et al.,
2000) e de permitir o armazenamento rápido das imagens antes da
análise, seguido pelo processamento posterior em que o tempo
pode ser menos limitante.
A análise de imagens tem como objetivo principal extrair infor‐
mações úteis e relevantes para uma dada aplicação, expressando
quantitativamente características específicas de objetos ou cenas de
interesse dentro de uma imagem (VIEIRA JUNIOR et al., 2006).
Essa possibilidade deve-se ao fato de as imagens digitais serem
expressas como uma função matemática, após a digitalização de
imagens contínuas (DOUGHERTY, 1994). As imagens digitais
consistem em uma estrutura quadriculada formada por matrizes de
números inteiros, e cada elemento dessas matrizes é composto por
um pixel (picture element).
A partir da matriz de pixels da imagem, diversos tipos de proces‐
samento podem ser implementados por algoritmos computacionais,
que são a base para a análise de imagens digitais, caracterizada
pelo arquivamento de dados e/ou comparação de padrões
(TEIXEIRA et al., 2006).
Um sistema de análise de imagem é constituído de diversas
etapas que variam de acordo com seu objetivo imediato (Figura 1).
A etapa de aquisição engloba a formação da imagem e sua digita‐
lização, fornecendo como saída uma imagem digital. O
processamento digital de imagem (PDI) consiste na etapa de pré-
processamento, enquanto a análise digital de imagem (ADI)
compreende etapas de segmentação, pós-processamento, extração
de atributos, reconhecimento e classificação. No pré-processamento
e na segmentação, opera-se sobre os pixels da imagem. No pós-
processamento e na extração de atributos, os objetos são
modificados e, em seguida, medidos. Na etapa de reconhecimento e
classificação, são analisados os resultados das medidas, ou seja, os
dados quantitativos. Geralmente, o termo Análise de Imagens usado
na literatura engloba as etapas de aquisição, processamento e
análise digital de imagem propriamente dita (DOUGHERTY, 1994).

Figura 1. Etapas típicas de um sistema de processamento digital de imagens.


Fonte: adaptado de Albuquerque et al. (2005).
Vale salientar que essas etapas não representam uma sequência
obrigatória nesse processo, visto que há casos em que as imagens
são capturadas, e nenhum tratamento é necessário. No entanto, em
outros casos, a aplicação de técnicas refinadas de segmentação e
filtragem é necessária para melhorar o desempenho do sistema de
análise de imagem.
A aquisição e o pré-processamento de imagens são considera
dos etapas fundamentais para o sucesso dessa análise. Nessas
etapas, as imagens podem ser capturadas e digitalizadas,
compactadas, armazenadas e preparadas para as etapas
posteriores. No processo de aquisição das imagens, são utilizadas
as técnicas de projeção, digitalização ou tomografia, devendo ser
adotados protocolos padrões e considerado o número de amostras
necessárias à validação estatística dos dados ao final do processo
(BOUMA et al., 2000). O pré-processamento é a etapa que
intenciona melhorar a imagem, corrigindo defeitos oriundos da
aquisição e realçando detalhes de interesse, de modo a facilitar sua
visualização e prosseguir com as demais etapas de processamentos
necessárias. Assim, antes de se trabalhar com uma imagem, faz-se
necessário um processo de filtragem, que varre a imagem,
procurando as transições entre fases e virtualmente decidindo a
qual fase (por exemplo, objeto ou fundo) os pixels pertencem
(ALBUQUERQUE et al., 2005).
Em sistemas de análise de imagens, é muito importante a sub‐
divisão da imagem em suas partes constituintes ou objetos, técnica
conhecida como segmentação (SENA JÚNIOR et al., 2004). Essas
regiões ou objetos dentro da imagem são separadas ou
segmentadas a partir de características como forma, geometria,
topologia, textura, cor ou brilho, sendo escolhidas aquelas que
possibilitem melhor distinção entre o objeto e o restante da imagem,
ou seja, o fundo (VIEIRA JUNIOR et al., 2006). Após a
segmentação, tamanho, cor, forma, posição, número e textura dos
objetos são algumas das propriedades que podem ser
quantificadas, representando a etapa de extração de atributos
(DOUGHERTY, 1994). A partir dessa etapa, os objetos são
reconhecidos e classificados para posterior análise e interpretação
dos dados. A etapa final de um sistema de processamento de
imagens é aquela em que se extraem as informações úteis da
imagem processada. Quando o objetivo do processamento é obter
informações numéricas, realiza-se a extração de atributos da
imagem.
Como exemplo do processo de análise de imagens, temos o
estudo de raízes. De maneira geral, a avaliação de raízes tem sido
efetuada de duas formas: diretamente no perfil de solo ou por meio
de raízes lavadas. Embora, para raízes lavadas, a segmentação
seja bastante simples, a aquisição dessas imagens tem se mostrado
como um ponto importante e, dependendo do caso, limitante para a
utilização dessa técnica. Em geral, pode-se melhorar a imagem
adquirida, devendo-se apenas efetuar a eliminação de sombras
provenientes da aquisição, mas não acrescentar informação à
mesma. Além disso, os resultados encontrados na análise de
imagens digitais dependem diretamente da informação contida na
imagem. Levar em conta os cuidados na aquisição de uma imagem
facilita os processos de identificação de objetos e texturas e a
segmentação da mesma (JORGE; CRESTANA, 1996).
Em geral, as imagens de raízes lavadas são digitalizadas em
tons de cinza, e a fim de facilitar a etapa de segmentação, são
usuais correções de iluminação e usos de corantes que evidenciam
áreas de interesse a serem analisadas, durante a aquisição das
imagens. O uso de corantes é muito comum em técnicas de
microscopia para diferenciar estruturas celulares; corante pode ser
utilizado também para melhorar a visualização de raízes finas
durante o escaneamento para cálculo de comprimento, diâmetro
médio, número de nódulo nas raízes (BOUMA et al., 2000; COSTA
et al., 2001; SMIT et al., 1994). Bouma et al. (2000) sugerem que as
raízes finas sejam coradas para melhorar o contraste com o fundo e
evitar a subestimação dos valores de comprimento e diâmetro
médio das raízes. Esse tratamento, no entanto, pode dificultar a
comparação entre dados encontrados na literatura, uma vez que
períodos de colorações diferentes são usados. A dificuldade de
padronização desse protocolo é muitas vezes justificada pela
diferença entre sistemas radiculares apresentados pelas espécies.
Porém, colorações em períodos bem definidos e concentrações
fixas de corantes são essenciais para produção de resultados
confiáveis e reprodutíveis (BOUMA et al., 2000). É importante
salientar que as técnicas de coloração não são indicadas caso as
raízes necessitem ser submetidas a análises futuras, como
determinações bioquímicas e digestão do tecido vegetal, para
obtenção de teores de nutrientes e metais pesados acumulados.
Nesse caso, os autores recomendam o aumento da resolução de
digitalização e redução da densidade de distribuição de raízes sob o
scanner, que além de melhorar a visualização de estruturas finas,
reduz problemas de sobreposição e de sombreamento que pode
subestimar e superestimar, respectivamente, os resultados obtidos.
Outra técnica, sugerida por Teixeira et al. (2006), é o não
fechamento da tampa do scanner e a não iluminação diretamente
sobre o aparelho durante o procedimento de digitalização, o que
produz o efeito de fundo desejado para a formação das imagens
com o preto como cor predominante e as raízes em níveis de cinza,
melhorando o contraste na imagem e a detecção do comprimento e
diâmetro das raízes.
Para análise de imagens de raízes em perfis de solo, a presença
de solo, palha e outros detritos podem dificultar o processo de seg‐
mentação, principalmente, porque essas imagens geralmente são
coloridas. A aquisição da imagem a partir do perfil requer cuidados
que vão desde a abertura da trincheira, preparo do perfil, filmagem,
até digitalização (JORGE; CRESTANA, 1996), e em alguns casos
pode depender também do operador do sistema.
Um dos maiores desafios para utilização de análise de imagem
em campo é o controle da luminosidade. De fato, no campo, a ilumi‐
nação não é controlada, e as variações na cor da luz durante o dia e
as épocas do ano provocam alterações nas cores dos objetos nas
imagens capturadas (SENA JÚNIOR et al., 2004). Na análise de
imagem, a intensidade luminosa é um fator muito importante. Ela
influencia diretamente nos valores numéricos dos pixels em uma
imagem digital, uma vez que esses valores representam a energia
refletida pelos objetos e que será captada pelo sensor da câmera.
Para a captura de imagens no campo, é frequente o uso de su‐
portes verticais que centralizam a câmera sobre as parcelas e
evitam a interferência subjetiva de fotógrafos (BEHRENS;
DIEPENBROCK, 2006). Esses estudos usam, na maioria das vezes,
o atributo cor como fator discriminatório para identificação e
segmentação dos objetos dentro das imagens capturadas no
campo. De maneira geral, os sistemas de representação de cor
mais adequados para se obter resultados significativos no processo
de segmentação dessas imagens são aqueles cujos componentes
mostram-se menos correlacionados (LALIBERTE et al., 2007; LANA
et al., 2006). O sistema de cores RGB (vermelho, verde e azul), que
apresenta facilidades para a computação da informação cor, tem o
inconveniente de possuir componentes altamente correlacionadas,
responsáveis, na maioria das vezes, pela segmentação impura da
imagem (LANA et al., 2006). Nesses casos, durante a segmentação,
tem sido considerado mais adequado o sistema de cores HSI em
virtude da baixa correlação de suas componentes matiz (H),
saturação (S) e intensidade (I). Nesse modelo HSI, é fácil a
eliminação de um dos componentes, como a intensidade (I),
deixando assim a segmentação menos sensível às mudanças de
iluminação (LALIBERTE et al., 2007).
É possível notar que diferentes técnicas de análise de imagem
encontradas na literatura consistem em variações ou adaptações
das etapas gerais de processamento digital de imagem, testadas a
fim de se obter técnicas mais precisas e com maior aplicabilidade
para a determinada área de estudo. Com o avanço da tecnologia
computacional, métodos tradicionais têm sido substituídos por
técnicas sofisticadas para obtenção e análise de dados. Nesse
aspecto, os sistemas de análise de imagens se destacam no
melhoramento de imagens ou na medição e análise de grandezas
relevantes e como uma das áreas de maior desenvolvimento e
significância na resolução de diversos problemas nos respectivos
campos de estudo.
Uma motivação para o desenvolvimento e aprimoramento de
técnicas de análise de imagens aplicadas a estudos da interação
planta-ambiente é a possibilidade de se obter informações comple‐
mentares às técnicas experimentais convencionais, de tempo e
custos muito elevados, permitindo o desenvolvimento de
ferramentas mais precisas, rápidas e de custo reduzido. Um dos
mecanismos para redução de custo experimental permitido pela
análise de imagens é o acompanhamento do sistema radicular de
uma mesma planta, pela substituição de métodos mais
convencionais de análise destrutiva. Essas medições, ao serem
repetidas em uma mesma planta, necessitam de técnicas
adequadas para análise de dados.

3. Medições repetidas

Em várias áreas das ciências agrárias, tais como Agronomia,


Engenharia Florestal, Zootecnia, entre outras, é bastante frequente
a utilização de experimentos denominados de medidas repetidas no
tempo. Nesse tipo de experimento, o objetivo principal é comparar
as tendências dos tratamentos ao longo do tempo, ou seja, se os
perfis dos tratamentos são horizontais e se são paralelos entre si
(MALHEIROS, 2004).
O uso da análise de medidas repetidas exige a definição de pelo
menos um fator intraindivíduos, o qual vai indicar as variáveis que
contêm as medidas repetidas (NEMEC, 1996). Esse tipo de análise
geralmente tem sido abordada como um experimento fatorial, em
que o tratamento e o tempo são os dois fatores (VILLALOBOS et al.,
2007).
Na análise de variância desses experimentos, devemos consi‐
derar que as observações são feitas em uma mesma unidade
experimental e são naturalmente correlacionadas, visto que a
situação no tempo t+1 de uma dada unidade experimental terá sido
naturalmente afetada pela situação no tempo t. Conforme a
estrutura da matriz de covariância das observações, essa análise
pode ser realizada considerando um modelo univariado,
multivariado ou misto.
Uma consequência imediata de se ignorarem diferentes correla‐
ções entre dados mensurados no tempo é que a significância apa‐
rente da diferença entre as médias dos tratamentos é
grosseiramente exagerada, e a sensibilidade dos testes para
interação é seriamente reduzida (CECON et al., 2008).
Assim, a análise univariada só deve ser adotada quando são
atendidas suposições sobre a estrutura de covariância das observa
ções. Nesse caso, a análise é baseada no número total de
observações, ou seja, as medidas são tratadas separadamente,
sendo o tempo incluído como um fator no modelo Anova (NEMEC,
1996).
No caso de se adotar uma técnica multivariada, as suposições
sobre a estrutura de correlação das observações de um mesmo
indivíduo não são rígidas. A análise é baseada no número total de
unidades experimentais.
No entanto, tanto na análise univariada e na multivariada requer-
se que as variâncias e as correlações sejam homogêneas, o que as
diferenciam da análise mista, na qual a estrutura da matriz de cova
riâncias pode ser modelada da forma que melhor represente os
dados, ou seja, pode levar em consideração se os dados são
independentes, dependentes, correlacionados ou ainda apresentar
outra relação que a matriz de covariâncias usual não consegue
explicar (XAVIER; DIAS, 2001).
Segundo Villalobos et al. (2007), o procedimento mais simples
para esse tipo de experimento é o de parcelas subdivididas, na qual
a parcela principal é a unidade experimental, e as subparcelas são
formadas pelo tempo. No entanto, Malheiros (2004) afirmou que isso
nem sempre é correto, pois esse esquema pressupõe que a matriz
de covariâncias (∑) tenha uma estrutura homogênea, que nem
sempre se verifica. Para que esse procedimento seja válido, requer-
se a condição de Huynh-Feldt (HUYNH; FELDT, 1970), ou seja, que
as medições tenham a mesma variância em todos os períodos, e a
correlação entre duas medições sucessivas ou separadas no tempo
sobre um mesmo indivíduo ou objeto seja igual.
A condição de Huynh-Feldt (H-F) é necessária e suficiente para
que o teste F da análise de variância usual, no esquema de parcelas
subdivididas no tempo, seja válido. Quando a condição H-F é
atendida, pode-se afirmar que a variável aleatória é igualmente
correlacionada e tem variâncias iguais, considerando as diferentes
ocasiões. A matriz de covariância com essas características tem
uma forma chamada de simetria composta e atende a condição para
que o teste F seja válido, em nível de subparcelas, para o fator
tempo e interação tempo x tratamento.
Fernández (1991) também ressaltou que, ao se considerar um
esquema de parcelas subdivididas, os níveis do tempo não podem
ser aleatorizados para seus intervalos, pois a análise de variância
usual pode não ser válida. Isso porque, com a falta de aleatorização,
os erros correspondentes às respectivas unidades experimentais
podem ter uma matriz de covariâncias que não possua variâncias
homogêneas, acarretando, assim, um inflacionamento na probabili‐
dade de rejeitar a hipótese nula quando ela corresponde à verdade
(probabilidade do erro de tipo I).
Cole e Grizzle (1966), considerando que as observações obtidas
nos experimentos de medidas repetidas estão correlacionadas e,
portanto, são essencialmente de natureza multivariada, sugeriram
que o método adequado para analisar esses experimentos é o
procedimento multivariado, pois permite uma matriz de covariância
com qualquer estrutura.
Vale salientar que antes dos procedimentos multivariados serem
bem compreendidos, diversas aproximações foram introduzidas
para compensar as violações (BOX, 1954a, 1954b; GEISSER;
GREENHOUSE, 1958; HUYNH; FELDT, 1976), e essas técnicas
são ainda amplamente utilizadas. No entanto, quando os dados são
balanceados, a utilização de métodos multivariados é mais
adequada considerando que ignora a presunção da existência de
simetria e de esfericidade.
Para se verificar se a matriz de covariâncias atende a condição
de H-F, Mauchly (1940) propôs um teste chamado teste de esferici‐
dade, que verifica se uma população multivariada apresenta
variâncias iguais e correlações nulas.
Fernández (1991) sugeriu as seguintes observações: a) se a
condição de H-F para a matriz de covariâncias for satisfeita (teste de
esfericidade não significativo), o teste univariado pode ser utilizado;
b) se o teste de esfericidade apresentar entre 0,05 e 0,01 de signifi‐
cância, poderão ser utilizados a correção para os números de graus
de liberdade ou os testes multivariados; e c) se a condição de H-F
para a matriz de covariâncias for rejeitada, com um nível de signifi‐
cância menor que 0,01, somente testes multivariados deverão ser
utilizados.
Segundo Vallejo e Lozano (2006), quando a suposição de esferi‐
cidade é satisfeita, a análise de variância univariada pode ser
empregada. Caso contrário, se as matrizes de covariância são
homogêneas, pode-se optar por um enfoque univariado com os
graus de liberdade corrigidos mediante algum dos métodos
existentes ou utilizar uma análise de variância multivariada. No
entanto, ambos os enfoques são inválidos quando as matrizes são
heterogêneas, especialmente quando os dados não têm distribuição
normal e estão desbalanceados.
Xavier e Dias (2001) afirmaram que uma técnica alternativa aos
modelos uni e multivariado seria a análise com modelos mistos que
são uma extensão do modelo linear geral. Esses modelos englobam
análise de curvas de crescimento, ou curvas polinomiais, que levam
em conta a estrutura da matriz de covariâncias que melhor explica o
comportamento das observações, tendo a vantagem de ajustar mo‐
delos que reduzem o número de parâmetros.
Um ponto importante nesse procedimento de análise é a escolha
do modelo de covariância mais adequado para os dados, tendo em
vista a existência de literalmente dezenas deles. O procedimento
mais comumente recomendado é essencialmente um processo de
tentativa e erro, em que o modelo é ajustado, determinando, por
exemplo, medidas de informação como AIC, e, após o ajuste de
todos os modelos avaliados, o que apresentou os melhores valores
para AIC é adotado (LITTELL et al., 1998, 2000; MILLIKEN, 2003;
SAS INSTITUTE, 2006; WOLFINGER; CHANG, 2006). Esse
procedimento é repetido para cada variável sob análise.

4. Emprego de análise de imagens no estudo


da nodulação

A literatura indica, até o momento, três aplicações principais da


análise de imagens em estudos de nodulação. Uma das aplicações
é a avaliação de características micromorfólogicas dos nódulos ou
pelos radiculares, em que plantas são submetidas a determinados
tratamentos, e, após processamento adequado do tecido, o que é
dependente do estudo, as imagens obtidas são avaliadas,
qualitativa ou quantitativamente (CHOVANEC et al., 2008; DAZZO
et al., 1990; EHRHARDT et al., 1996; VIKMAN; VESSEY, 1993). Na
segunda aplicação, a análise de imagem é utilizada para permitir a
obtenção de medidas de tamanho de nódulos, que normalmente
não seriam utilizadas em razão do esforço necessário, em particular
considerando a rápida degradação do tecido nodular (LIRA JUNIOR
et al., 2003). Essa variável pouco habitual é baseada em trabalhos
bastante antigos que indicam relação entre eficiência de fixação e
tamanho do nódulo (DÖBEREINER, 1966; DÖBEREINER et al.,
1966), tendo sido confirmado em publicação recente que encontrou
alta correlação entre tamanho do nódulo e matéria seca de nódulos,
tanto para determinação por paquímetro (r = 0,97), quanto para
determinação em uma imagem obtida sem a eliminação da planta (r
= 0,89) (COSTA et al., 2007). O terceiro grupo de aplicações incluiria
estudos em que medições destrutivas são, ao menos parcialmente,
substituídas por medições não destrutivas da nodulação (ARAÚJO
et al., 2005; CAMPANHARO, 2006; COSTA et al., 2005; LIRA
JUNIOR et al., 2005; SOUSA et al., 2005; TAVARES, 2008).
Uma dificuldade comum é que geralmente nas medições não
destrutivas a determinação do que é o nódulo é efetuada pelo
operador do sistema, sendo frequentemente bastante difícil, em
razão da semelhança entre as características visuais do nódulo e
seu fundo visual, bem como, ocasionalmente, entre nódulos de um
mesmo agrupamento. Por outro lado, o desenvolvimento dos
nódulos, ao longo do tempo, é bastante claro, como pode ser
observado na Figura 2.

Figura 2. Desenvolvimento do sistema radicular e da nodulação de caupi (Vigna


unguiculata) dos 7 aos 70 dias após a emergência. Dias após a emergência (A) 7, (B) 14,
(C) 21, (D) 28, (E) 35, F (42), G (49), H (56), I (63), J (70). Pontos em destaque indicam a
presença e o tamanho dos nódulos visíveis.
Fonte: Costa et al. (2007).
Fotos: Mário de Andrade Lira Junior
Uma grande possibilidade desse tipo de estudo não destrutivo é
avaliar o efeito de estresses ambientais sobre a nodulação, como
indicado por alguns trabalhos realizados pelo grupo de pesquisa sob
a coordenação de um dos autores do capítulo (CAMPANHARO,
2006; LIRA JUNIOR et al., 2005; TAVARES, 2008). Enquanto um
dos trabalhos foi realizado em hidroponia (LIRA JUNIOR et al.,
2005), utilizando sacos plásticos para crescimento de plantas, os
demais foram efetuados utilizando vasos de acrílico, dimensionados
para representar aproximadamente o espaço ocupado por uma
planta de feijão em uma linha de plantio, admitindo o espaçamento
recomendado para a cultura (COSTA, 2005), com a maior dimensão
representando o perfil do solo, limitado pelo tamanho dos
digitalizadores mais comuns no mercado.
A grande vantagem desse sistema é que, ao permitir o acom‐
panhamento de uma mesma planta ao longo do tempo, reduz o
número de parcelas necessário para avaliar cada tratamento. Como
exemplo, admitiremos que queiramos avaliar o efeito de 5 doses de
fósforo na nodulação de 2 variedades de feijão, e que serão
utilizadas 4 repetições. Assim, temos que em um experimento mais
convencional normalmente seriam adotadas 2 idades de
amostragem, no florescimento e na colheita final, totalizando 80
vasos (5x2x4x2), mas sem condição de avaliar o efeito desses
tratamentos ao longo do tempo, que frequentemente ajuda a
entender o resultado final. Se utilizarmos essa técnica de análise de
imagem, com um vaso transparente, com os mesmos 80 vasos, nós
poderíamos observar o desenvolvimento do sistema radicular e dos
nódulos a qualquer intervalo desejado.
Evidentemente, não é possível ter ganhos sem custos. Nesse
caso, embora os vasos sejam comparativamente caros, eles têm
demonstrado durabilidade suficiente para que o aumento de custo
financeiro seja relativamente baixo. No caso particular do nosso
grupo de pesquisa, os vasos têm demonstrado, além de alta
durabilidade, baixo índice de perdas e a possibilidade de serem
reaproveitados, como exemplo das três dissertações do nosso
grupo. Assim, o principal aumento de custo é no nível de trabalho
durante e depois do experimento. Tipicamente, utilizando a
resolução que tem apresentado melhores resultados, 200 pontos
por polegada, para a obtenção das imagens a partir da digitalização
de todos os vasos de um experimento semelhante ao descrito
acima, seriam necessárias 3 pessoas dia-1, com um dia
provavelmente bastante longo.
Após essa digitalização, haveria necessidade ainda de realizar a
análise de imagens propriamente dita. Até o momento, a equipe que
tem realizado esses trabalhos não conseguiu desenvolver procedi‐
mentos automatizados para distinguir os nódulos do solo, em virtude
da semelhança de cores e irregularidade no formato dos nódulos.
Assim, a identificação dos nódulos necessita ser feita por pesquisa‐
dores treinados no aspecto, embora em nossa experiência o treina‐
mento seja relativamente simples, com pouca variação entre os
resultados de diferentes pesquisadores. Novamente, com base na
experiência acumulada nos trabalhos anteriormente mencionados,
uma equipe composta por 3 pessoas, por exemplo, 1 mestrando e 2
alunos de iniciação científica, deve levar algo em torno de 10 dias
de trabalho para analisarem as imagens obtidas, admitindo que a
nodulação seja razoavelmente abundante.
Finalmente, embora em teoria seja possível acompanhar um
nódulo individual ao longo de seu desenvolvimento, a prática tem
indicado que esse acompanhamento não é viável por dificuldades
de organização dos dados. Assim, a análise de dados deve seguir
as premissas descritas acima de análise de medições repetidas,
considerando cada vaso como sendo a unidade básica que foi
repetida nas diversas medições.

5. Considerações finais

O conjunto de técnicas descrito neste capítulo não deve ser


considerado, na opinião dos autores, como possível substituto das
técnicas mais convencionais descritas na primeira seção do
trabalho, mas sim como uma técnica adicional, que permite observar
características que dificilmente poderiam ser observadas com as
medidas, como massa seca de nódulos, em razão de seu caráter
necessariamente destrutivo.

6. Referências

ALBUQUERQUE, M. P.; ALBUQUERQUE, M. P.; CANER, E. S.; GESUALDI, A. R. Análise


de imagens e visão computacional. In: ESCOLA DO CBPF, 5., 2004, Rio de Janeiro.
Anais… Rio de Janeiro: CBPF, 2005. p. 145-176.
ALMARAZ, J. J.; ZHOU, X.; SOULEIMANOV, A.; SMITH, D. L. Gas exchange
characteristics and dry matter accumulation of soybean treated with Nod factors. Journal of
Plant Physiology, Stuttgart, v. 164, p. 1391-1393, 2007.
ANTÓN, M. R. D. F. Interacciones microorganismos-suelo-planta en la preservación del
Medio Ambiente y la Salud. Anales de la Real Academia Nacional de Farmacia, Madrid, ES,
v. 70, p. 743-776, 2004.
ARAÚJO, F. A. S.; SOUSA, C. A. D.; CAMPANHARO, M.; COSTA, J. V. T. D.; LIRA
JUNIOR, M. A.; STAMFORD, N. P.; FERREIRA, R. L. C. Representação da população de
nódulos pelos nódulos visíveis, através de análise de imagem. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE CIÊNCIA DO SOLO, 30., 2005, Recife. Anais... Recife: Sociedade
Brasileira de Ciência do Solo, 2005. 1 CD-ROM.
BEHRENS, T.; DIEPENBROCK, W. Using digital image analysis to describe canopies of
winter oilseed rape (Brassica napus L.) during vegetative developmental stages. Journal of
Agronomy and Crop Science, Berlin, DE, v. 192, p. 295-302, 2006.
BENIZRI, E.; BAUDOIN, E.; GUCKERT, A. Root colonization by inoculated plant growth
promoting rhizobacteria. Biocontrol Science and Technology, Oxford, v. 11, p. 557-574, 2001.
BODDEY, R. M.; POLIDORO, J. C.; RESENDE, A. S.; ALVES, B. J. R.; URQUIAGA, S. Use
of the 15N natural abundance technique for the quantification of the contribution of N2
fixation to sugarcane and other grasses. Australian Journal of Plant Physiology, Stuttgart, v.
28, p. 889-895, 2001.
BOUMA, T. J.; NIELSEN, K. L.; KOUTSTAAL, B. Sample preparation and scanning protocol
for computerised analysis of root length and diameter. Plant and Soil, The Hague, v. 218, p.
185-196, 2000.
BOX, G. E. P. Some theorems on quadratic forms applied in the study of analysis of
variance problems: I. effects of inequality of variance in the one-way classification. Annals of
the Mathematical Statistics, Washington, DC, v. 25, p. 290-302, 1954a.
BOX, G. E. P. Some theorems on quadratic forms applied in the study of analysis of
variance problems: II. effects of inequality of variance and of correlation between erros in
the two-way classification. Annals of the Mathematical Statistics, Washington, DC, v. 25, p.
484-498, 1954b.
BRITO, C. J. F. A. de; RODELLA, R. A.; DESCHAMPS, F. C. Anatomia quantitativa da folha
e do colmo de Brachiaria brizantha Stapf e B. humidicola. Revista Brasileira de Zootecnia,
Viçosa, v. 33, p. 519-528, 2004.
BUZAS, D. M.; GRESSHOFF, P. M. Short and long-distance control of root development by
LjHARI during the juvenile stafe of Lotus japonicus. Journal of Plant Physiology, Stuttgart, v.
164, p. 452-459, 2007.
CAMPANHARO, M. Acidez do solo na fixação biológica do nitrogênio em feijão. 2006. 72 f.
Dissertação (Mestrado em Ciência do Solo) - Universidade Federal Rural de Pernambuco,
Recife, 2006.
CECON, P. R.; SILVA, F. F. E.; FERREIRA, A.; FERRÃO, R. G.; CARNEIRO, A. P. S.;
DETMANN, E.; FARIA, P. N.; MORAIS, T. S. S. Análise de medidas repetidas na avaliação
de clones de café ‘Conilon’. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 43, p. 1171-
1176, 2008.
CHOVANEC, P.; HOVORKA, O.; NOVÁK, K. Visualization of symbiotic tissue in intact root
nodules of Vicia tetrasperma using GFP-marked Rhizobium leguminosarum bv. viciae. Folia
Microbiologica, Prague, CZ, v. 53, p. 139-146, 2008.
COLE, V. W. L.; GRIZZLE, J. E. Applications of multivariate analysis of variance to repeated
measures experiments. Biometrics, Washington, DC, v. 41, p. 505-514, 1966.
COSTA, C.; DWYER, L. M.; HAMEL, C.; MUAMBA, D. F.; WANG, X. L.; NANTAIS, L.;
SMITH, D. L. Root contrast enhancement for measurement with optical scanner-based
image analysis. Canadian Journal of Botany, Ottawa, CA, v. 79, p. 23-29, 2001.
COSTA, J. V. T. D. Metodologia para análise não destrutiva da nodulação. 2005. 43 f.
Dissertação (Mestrado em Ciência do Solo) - Universidade Federal Rural de Pernambuco,
2005.
COSTA, J. V. T. D.; LIRA JUNIOR, M. A.; FERREIRA, R. L. C.; STAMFORD, N. P.;
CAMPANHARO, M.; SOUSA, C. A. D.; ARAÚJO, F. A. S. Relacionamento entre tamanho
do nódulo e medições convencionais da nodulação. Acta Scientiarum, Maringá, v. 29, p. 47-
54, 2007.
COSTA, J. V. T. D.; LIRA JUNIOR, M. A.; STAMFORD, N. P.; FERREIRA, R. L. C.;
CAMPANHARO, M.; SOUSA, C. A. D.; ARAÚJO, F. A. S. Avaliação do desenvolvimento de
caupi e da nodulação através de determinações destrutiva e não destrutiva. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA DO SOLO, 30., 2005, Recife. Anais... Recife:
Sociedade Brasileira de Ciência do Solo, 2005. 1 CD-ROM.
COSTA, J. V. T.; LIRA JUNIOR, M. A.; FERREIRA, R. L. C.; STAMFORD, N. P.; ARAÚJO,
F. A. S. Desenvolvimento de nódulos e plantas de caupi (Vigna unguiculata) por métodos
destrutivo e não destrutivo. Caatinga, Mossoró, v. 19, p. 11-19, 2006.
DAZZO, F. B.; HOLLINGSWORTH, R. I.; PHILIP-HOLLINGWORTH, S.; SQUARTINI, A.;
CHAPMAN, K. A.; CARGILL, L. C.; SALZWEDEL, J.; PETERSEN, M.; PANKRATZ, S.;
ORGAMBIDE, G.; TROCH, P. de; OLEN, T. A.; BAKER, D.; MAYA-FLORES, J.;
AGGARWAL, A.; HOLLANDER, G. Recent studies on the Rhizobium-legume symbiosis. In:
GRESSHOFF, P. M.; ROTH, L. E.; STACEY, G.; NEWTON, W. E. Nitrogen fixation:
achievements and objectives. New York: Chapman and Hall, 1990. p. 199-200.
DÖBEREINER, J. Evaluation of nitrogen fixation in legumes by the regression of total plant
nitrogen with nodule weight. Nature, London, UK, v. 210, p. 850-852, 1966.
DÖBEREINER, J.; ARRUDA, N. B.; PENTEADO, A. F. Avaliação da fixação do nitrogênio,
em leguminosas, pela regressão do nitrogênio total das plantas sobre o peso dos nódulos.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 1, p. 233-237, 1966.
DOUGHERTY, E. R. Digital image processing methods. New York: CRC, 1994.
EHRHARDT, D. W.; WAIS, R.; LONG, S. R. Calcium spiking in plant root hairs responding
to Rhizobium nodulation signals. Cell, Cambridge, v. 85, p. 673-681, 1996.
FAGAN, E. B.; MEDEIROS, S. L. P.; MANFRON, P. A.; CASAROLI, D.; SIMON, J.;
DOURADO NETO, D.; LIER, Q. J. van; SANTOS, O. S. Fisiologia da fixação biológica de
nitrogênio em soja. Revista da Faculdade de Zootecnia, Veterinária e Agronomia,
Uruguaiana, v. 14, p. 89-106, 2007.
FARIA, S. M.; FRANCO, A. A. Identificação de bactérias eficientes na fixação biológica de
nitrogênio para espécies leguminosas arbóreas. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, 2002. 16
p. (Embrapa Agrobiologia. Documentos, 158).
FARNDEN, K. L. F.; ROBERTSON, J. G. Methods for studying enzymes involved in
metabolism related to nitrogenase. In: BERGERSEN, J. F. Methods of evaluating biological
nitrogen fixation. Chichester: John Wiley and Sons, 1980. p. 265-316.
FERNÁNDEZ, G. C. J. Repeated measure analysis of line-source sprinkler experiments.
Hortscience, Alexandria, v. 26, p. 339-342, 1991.
FIGUEIREDO, M. V. B.; LIRA JUNIOR, M. A.; ARAÚJO, A. S. F.; MARTINEZ, C. R. Fatores
bióticos e abióticos à fixação biológica de N2. In: FIGUEIREDO, M. V. B.; BURITY, H. A.;
STAMFORD, N. P.; SANTOS, C. E. R. S. Microrganismos e agrobiodiversidade: o novo
desafio para agricultura. Guaíba: AgroLivros, 2008. p. 43-68.
FOUCHER, F.; KONDOROSI, E. Cell cycle regulation in the course of nodule
organogenesis in Medicago. Plant Molecular Biology, Dordrecht, v. 43, p. 773-778, 2000.
GAN, Y.; STULEN, I.; KEULEN, H. van; KUIPER, P. J. C. Low concentrations of nitrate and
ammonium stimulate nodulation and N2 fixation while inhibiting specific nodulation (nodule
DW g-1 root dry weight) and specific N2 fixation (N2 fixed g-1 root dry weight) in soybean.
Plant and Soil, The Hague, v. 258, p. 281-292, 2004.
GEISSER, J.; GREENHOUSE, S. W. An extension of Box’s results on the use of the F
distribution in multivariate analysis. Annals of the Mathematical Statistics, Washington, DC,
v. 29, p. 855-891, 1958.
GUERINOT, M. L. Microbial iron transport. Annual Review of Microbiology, Palo Alto, v. 48,
p. 734-772, 1994.
HARDY, R. W. F.; HOLSTEN, R. D.; JACKSON, E. K.; BURNS, R. C. The acetylene-
ethylene assay for N2 fixation: laboratory and field evaluation. Plant Physiology, Bethesda, v.
43, p. 1185-1207, 1968.
HERRIDGE, D. F.; PEOPLES, M. B. The ureide assay for measuring nitrogen fixation by
nodulated soybean calibrated by 15N methods. Plant Physiology, Bethesda, v. 93, p. 495-
503, 1990.
HIRSCH, A. M. Developmental biology of legume nodulation. New Phytologist, Oxford, v.
122, p. 211-237, 1992.
HUYNH, H.; FELDT, L. S. Condition under which mean square ratios in repeated
measurements designs have exact F-distributions. Journal of the American Statistical
Association, Washington, DC, v. 65, p. 1582-1589, 1970.
HUYNH, H.; FELDT, L. S. Estimation of the Box correction for degrees of freedom from
sample data in the randomized block and split-plot designs. Journal of Educational Statistics,
Washington, DC, v. 1, p. 69-82, 1976.
JORGE, L. A. C.; CRESTANA, S. Recomendações práticas para utilização do SIARCS 3.0 nos
estudos de raízes, cobertura vegetal, folhas e outras aplicações. São Carlos: Embrapa
Instrumentação Agropecuária, 1996. Não paginado. (Embrapa Instrumentação
Agropecuária. Recomendação Técnica, 4).
KUSTER, H.; VIEWEG, M. F.; MANTHEY, K.; BAIER, M. C.; HOHNJEC, N.; PERLICK, A.
M. Identification and expression regulation of symbiotically activated legume genes.
Phytochemistry, Elmsford, v. 68, p. 8-18, 2007.
LALIBERTE, A. S.; RANGO, A.; HERRICK, J. E.; FREDRICKSON, E. L.; BURKETT, L. An
object-based image analysis approach for determining fractional cover of senescent and
green vegetation with digital plot photography. Journal of Arid Environments, London, UK, v.
69, p. 1-14, 2007.
LANA, M. M.; TIJSKENS, L. M. M.; KOOTEN, O. van. Effects of storage temperature and
stage of ripening on RGB colour aspects of fresh-cut tomato pericarp using video image
analysis. Journal of Food Engineering, Essex, v. 77, p. 871-879, 2006.
LIRA JUNIOR, M. A.; COSTA, C.; SMITH, D. L. Effects of addition of flavonoid signals and
environmental factors on nodulation and nodule development in the pea (Pisum sativum)-
Rhizobium leguminosarum bv. viciae symbiosis. Australian Journal of Soil Research,
Collingwood, v. 41, p. 267-276, 2003.
LIRA JUNIOR, M. A.; LIMA, A. S. T.; ARRUDA, J. R. F.; SMITH, D. L. Effect of root
temperature on nodule development of bean, lentil and pea. Soil Biology and Biochemistry,
Oxford, v. 37, p. 235-239, 2005.
LIRA JUNIOR, M. A.; SMITH, D. L. Use of a standard TWAIN scanner and software for
nodule number determination on different legume species. Soil Biology and Biochemistry,
Oxford, v. 32, p. 1463-1467, 2000.
LITTELL, R. C.; HENRY, P. R.; AMMERMAN, C. B. Statistical analysis of repeated
measures data using SAS procedures. Journal of Animal Science, Champaign, v. 76, p.
1216-1231, 1998.
LITTELL, R. C.; PENDERCAST, J.; NATARAJAN, R. Modelling covariance structure in the
analysis of repeated measures data. Statistics in Medicine, New York, v. 19, p. 1793-1819,
2000.
MABOOD, F.; GRAY, E. J.; LEE, K. D.; SMITH, D. L. Exploiting inter-organismal chemical
communication for improved inoculants. Canadian Journal of Plant Science, Ottawa, CA, v.
86, p. 951-966, 2006a.
MABOOD, F.; ZHOU, X.; LEE, K. D.; SMITH, D. L. Methyl jasmonate, alone or in
combination with genistein, and Bradyrhizobium japonicum increases soybean (Glycine
max L.) plant dry matter production and grain yield under short season conditions. Field
Crops Research, Amsterdam, NL, v. 95, p. 412-419, 2006b.
MALHEIROS, E. B. Precisão de testes F univariados usados em experimentos com
medidas repetidas no tempo, quando a condição de esfericidade da matriz de covariâncias
não é verificada. Revista Matemática e Estatística, Marília, v. 22, p. 23-29, 2004.
MAUCHLY, J. W. Signficance test for sphericity of a normal n-variate distribution. Annals of
the Mathematical Statistics, Washington, DC, v. 11, p. 204-209, 1940.

MILLIKEN, G. A. Multilevel designs and their analyses. In: ANNUAL SAS ®


USERS GROUP
INTERNATIONAL CONFERENCE, 28., 2003, Cary. Proceedings... Cary: SAS Institute,
2003. p. 263-268.
NEMEC, A. F. L. Analysis of repeated measures and time series: an introduction with forestry
examples. Victoria: Biometric Information Handbook, 1996. 83 p.
POUSTINI, K.; MABOOD, F.; SMITH, D. L. Low root zone temperature effects on bean
(Phaseolus vulgaris L.) plants inoculated with Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli pre-
incubated with methyl jasmonate and/or genistein. Acta Agriculturae Scandinavica - Section
B: Soil and Plant Science, Copenhagen, DK, v. 55, p. 293-298, 2005.
REIGH, G.; O´CONNELL, M. Siderophore-mediated iron transport correlates with the
presence of specific iron-regulated proteins in the membrane of Rhizobium meliloti. Journal
of Bacteriology, Washington, DC, v. 175, p. 94, 1993.
RUMJANEK, N. G., GAMA, A. S., TRIPLETT, E. W. Bacteriocin production by
Bradyrhizobium strains. In: INTERNATIONAL CONGRESS ON NITROGEN FIXATION, 10.
Abstracts... St. Petersburg: International Congress on Nitrogen Fixation, 1995. p 433-433.
SAAD, M. M., STAEHELIN, C., BROUGHTON, W. J., DEAKIN, W. J. Protein-protein
interactions within type III secretion system-dependent pili of Rhizobium sp. strain NGR234.
Journal of Bacteriology, Washington, DC, v. 190,
p. 750-754, 2008.
SAS INSTITUTE. Repeated measures in the analyst application example: repeated measures.
2006. Disponível em: <http://support.sas.com/rnd/app/da/analyst/example.html>. Acesso
em:.
SENA JÚNIOR, D. G.; SANTOS, N. T.; PINTO, F. A. C.; QUEIROZ, D. M.; ZANDONADI, R.
S. Efeito da iluminação na segmentação de imagens de plantas de milho atacadas pela
lagarta do cartucho. Engenharia na Agricultura, Viçosa, v. 12, p. 280-289, 2004.
SILVEIRA, J. A. G.; VIEGAS, R. A.; FIGUEIREDO, M. V. B.; OLIVEIRA, J. T. A.; COSTA, R.
C. L. N-compound accumulation and carbohydrate shortage on N2 fixation in drought-
stressed and rewatered cowpea plants. Spanish Journal of Agricultural Research, Madrid,
ES, v. 3, p. 65-76, 2003.
SILVERSTEIN, K. A. T.; GRAHAM, M. A.; VANDENBOSCH, K. A. Novel paralogous gene
families with potential function in legume nodules and seeds. Current Opinion in Plant
Biology, Oxford, v. 9, p. 142-146, 2006.
SMIT, A. L.; SPRANGERS, J. F. C. M.; SABLIK, P. W.; GROENWOLD, J. Automated
measurement of root length with a three-dimensional high-resolution scanner and image
analysis. Plant and Soil, The Hague, v. 158, p. 145-149, 1994.
SOUSA, C. A. D.; ARAÚJO, F. A. S.; CAMPANHARO, M.; COSTA, J. V. T. D.; LIRA
JUNIOR, M. A.; STAMFORD, N. P.; FERREIRA, R. L. C. Nodulação e produção de feijão
por método destrutivo e não destrutivo. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA DO
SOLO, 30., 2005, Recife. Anais... Recife: Sociedade Brasileira de Ciência do Solo, 2005. 1
CD-ROM.
SOUZA, L. A. G.; BEZERRA NETO, E.; SANTOS, C. E. R. S.; STAMFORD, N. P.
Desenvolvimento e nodulação natural de leguminosas arbóreas em solos de Pernambuco.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 42, p. 207-217, 2007.
SÜB, C.; HEMPEL, J.; ZEHNER, S.; KRAUSE, A.; PATSCHKOWSKI, T.; GÖTTFERT, M.
Identification of genistein-inducible and type III-secreted proteins of Bradyrhizobium
japonicum. Journal of Biotechnology, Amsterdam, NL, v. 126, p. 69-77, 2006.
TAÍZ, L.; ZIEGER, E. Fisiologia vegetal. Porto Alegre: Artemed, 2004.
TAVARES, D. B. Manejo de siratro nos diferentes estágios fenológicos sobre a dinâmica da
nodulação. 2008. 48 f. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Rural de
Pernambuco.
TEIXEIRA, E. F.; CICERO, S. M.; DOURADO NETO, D. Análise de imagens digitais de
plântulas para avaliação do vigor de sementes de milho. Revista Brasileira de Sementes,
Brasília, DF, v. 28, p. 159-167, 2006.
TIMMERS, A. C.; AURIAC, M. C.; TRUCHET, G. Refined analysis of early symbiotic steps
of the Rhizobium medicago interaction in relationship with microtubular cytoskeleton
rearrangements. Development, Cambridge, v. 126, p. 3617-3628, 1999.
URIBE, L. Formacción de nodulos de Rhizobium; factores que pueden conferir ventaja
competitiva. Agronomia Costarricense, San José, CR, v. 18, p. 121-131, 1994.
VALLEJO, G.; LOZANO, L. M. Modelos de análisis para los diseños multivariados de
medidas repetidas. Psicothema, Oviedo, v. 18, p. 293-299, 2006.
VIEIRA JUNIOR, P. A.; DOURADO NETO, D.; CICERO, S. M.; JORGE, L. A. C.;
MANFRON, P. A.; MARTIN, T. N. Estimativa da área foliar em milho através de análise de
imagens. Revista Brasileira de Milho e Sorgo, Sete Lagoas, v. 5, p. 58-66, 2006.
VIKMAN, P. A.; VESSEY, J. K. Ontogenetic changes in root nodule subpopulations of
common bean (Phaseolus vulgaris L.). III. Nodule formation, growth and degradation.
Journal of Experimental Botany, London, UK, v. 44, p. 579-586, 1993.
VILLALOBOS, D. M. G.; LLAQUE, J. G.; MORENO, A. A. Q.; GUILLÉN, J. L. R.; MÉNDEZ,
J. A. A. Análisis de tres procedimientos estadísticos para la evaluación del crecimiento de
mautas mestizas bajo diferentes regímenes nutricionales. Revista Científica, Campo
Grande, v. 17, p. 136-142, 2007.
WASSEM, R.; KOBAYASHI, H.; KAMBARA, K.; LE, Q.; WALKER, G. C.; BROUGHTON, W.
J.; DEAKIN, W. J. TtsI regulates symbiotic genes in Rhizobium species NGR234 by binding
to tts boxes. Molecular Microbiology, Oxford, v. 68, p. 736-748, 2008.
WILSON, D. O.; REISENAUER, H. M. Determination of leghemoglobin in legumes nodules.
Analytical Biochemistry, New York, v. 6, p. 27-30, 1963.
WOLFINGER, R.; CHANG, M. Comparing the SAS® GLM and MIXED procedures for
repeated measures. [Cary: SAS Institute], 2006.
XAVIER, G. R.; MARTINS, L. M. V.; RIBEIRO, J. R. A.; RUMJANEK, N. G. Especificidade
simbiótica entre rizóbios e acessos de feijão-caupi de diferentes nacionalidades. Caatinga,
Mossoró, v. 19, p. 25-33, 2006.
XAVIER, L. H.; DIAS, C. T. S. Acurácia do modelo univariado para análise de medidas
repetidas por simulação multidimensional. Scientia Agricola, Piracicaba, v. 58, p. 241-250,
2001.
Capítulo 5
Abundância natural do 15N para
quantificação da fixação biológica
do nitrogênio em plantas
Ana Dolores Santiago de Freitas
Everardo Valadares de Sá Barretto Sampaio
Carolina Etienne de Rosália e Silva Santos

1. Introdução

A fixação biológica do nitrogênio (FBN) por meio da associação


leguminosas-rizóbios é um dos principais processos de entrada do
elemento em ecossistemas naturais. Em sistemas agrícolas, a
importância desse processo está relacionada a diferentes aspectos,
de acordo com as características dos modelos de exploração
adotados. Em modelos intensivos e extensivos, a FBN pode
despontar como uma possibilidade de prevenir a degradação do
meio ambiente e a insegurança alimentar. Para a agricultura de
subsistência, em que o fertilizante nitrogenado é frequentemente
indisponível, muitas vezes o aporte de nitrogênio atmosférico via
cultivo de leguminosas é a única possibilidade de viabilização e
sustentabilidade (DAKORA; KEYA, 1997; VANCE, 2001).
As quantidades de nitrogênio fixadas em ecossistemas naturais
ou agrícolas são influenciadas por diversos fatores ambientais e
práticas de manejo. Para estabelecer manejos adequados e a
máxima realização dos benefícios da associação planta-
microrganismo, é necessário estimar quanto de nitrogênio é fixado
em diferentes condições. Existem diversos métodos para se
quantificar a FBN, tanto em leguminosas cultivadas quanto em
ambientes naturais, todos eles apresentando vantagens e
desvantagens, de acordo com o sistema estudado. Neste capítulo,
será abordada a metodologia da abundância natural do 15N (ou do
d15N), método isotópico baseado na variação de concentrações do
isótopo entre plantas fixadoras e plantas não fixadoras. O objetivo é
descrever a metodologia de maneira a servir de guia a
pesquisadores interessados em quantificações do N fixado. Aos
interessados em revisões aprofundadas, com discussões sobre
aspectos teóricos e dificuldades de interpretação associadas ao
método, recomendam-se os trabalhos de Boddey et al. (2000),
Handley e Scrimgeour (1997), Högberg (1997) e Shearer e Kohl
(1986).

2. Bases isotópicas da metodologia

O núcleo de um átomo contém duas partículas subatômicas


principais, os prótons (p) e os nêutrons (n). O átomo de um dado
elemento tem um número fixo de prótons, e este é chamado de
número atômico. O número de prótons + nêutrons é chamado de
número de massa. Um elemento particular pode ter diferentes
números de nêutrons e, consequentemente, diferentes números de
massa, porém sempre o mesmo número de prótons. Essas formas
do mesmo elemento com diferentes massas são denominadas de
isótopos e têm características químicas praticamente idênticas. No
núcleo, os prótons, que são positivamente carregados, podem se
repelir. A presença de nêutrons, entretanto, mantém os prótons
juntos e estabiliza o núcleo. A estabilidade depende da relação
nêutrons:prótons (n:p). Quando a razão de nêutrons e prótons é
alta, o núcleo se torna instável e emite partículas (a e b) e/ou
radiação eletromagnética (γ), e tal elemento é dito radioativo. Se a
relação não fica fora de uma certa faixa de estabilidade, o elemento,
espontaneamente, não emite partículas e/ou radiação γ e é
chamado de estável. Os diferentes isótopos de um elemento
(radiativo ou estável) podem ser usados para seguir seus caminhos,
ao longo de diferentes reações, processos metabólicos e ciclos
biológicos e geoquímicos. As passagens por essas rotas podem ser
seguidas não só qualitativa mas também quantitativamente. Por
essa razão, os isótopos são considerados traçadores das reações,
processos e ciclos biogeoquímicos.
O nitrogênio tem dois isótopos estáveis, o 15N e o 14N, e suas
proporções variam na biosfera em razão do fracionamento isotópico
nos processos físicos, químicos e biológicos. O fracionamento isotó‐
pico é resultado de efeitos cinéticos e de equilíbrio. Moléculas ou
íons mais pesados estão mais fortemente ligados (logo, uma
energia de ativação maior é requerida para dissociá-los) e reagem
mais lentamente que análogos isotopicamente mais leves. Dessa
forma, para uma dada reação incompleta A↔B, o produto B será
menos enriquecido em 15N que A.
As razões entre os dois isótopos estáveis do nitrogênio, o 15N e o
14
N, variam na biosfera em razão do fracionamento isotópico nos
processos físicos, químicos e biológicos. O N2 atmosférico, que tem
uma abundância constante de 0,3663 atom% de 15N, é aceito como
o padrão (HÖGBERG, 1997). A composição isotópica de amostras
de solos e tecidos de plantas é o resultado líquido de processos
(mineralização, volatilização de amônia, nitrificação, denitrificação,
troca de íons, difusão, absorção pelas plantas e micorrizas, fixação
biológica do N2, herbivoria, etc.) que envolvem diferentes
magnitudes e direções de fracionamento isotópico (SHEARER;
KOHL, 1989), com efeitos potenciais sobre a concentração de 15N
no sistema solo-planta (HÖGBERG, 1997).

3. O valor d
Por conveniência, a abundância natural de 15N é expressa em
unidades de d ( ‰), que é o desvio, em relação ao N2 atmosférico,
da razão entre as massas de 15N e 14N do nitrogênio contido na
amostra (SHEARER; KOHL, 1989):

em que Ramostra e Rpadrão são as razões 15N:14N da amostra e do


padrão (N2 atmosférico), respectivamente.
Como o N2 atmosférico é o padrão, por definição seu d15N é 0‰.
Dessa forma, se uma amostra tiver uma concentração de 15N maior
que a do ar, ou seja, maior que 0,3663 atom% de 15N, seu valor de
d15N será positivo (+). Ao contrário, amostras com concentração de
15
N menor que a do ar apresentam d15N negativo (-). Um d15N é
1/1.000 da abundância de 15N do N2 atmosférico, ou seja, 0,0003663
atom%15N.
O d15N do N total do solo é determinado pelo sinal isotópico do
compartimento de N orgânico, que é altamente estável e não varia
durante décadas. Em contraste, os compartimentos biologicamente
ativos, que são os disponíveis para as plantas, são uma fração dimi‐
nuta do N total do solo e possuem uma dinâmica bastante rápida,
variando em pequenos períodos de tempo (dias ou semanas).
Dessa forma, o d15N do N total do solo não é, em geral, uma boa
aproximação do d15N do N disponível para as plantas. As plantas
são integradoras do d15N de todas as fontes de N disponível,
incluindo o N inorgânico e formas simples de N orgânico
(HÖGBERG, 1997). Materiais biológicos, em geral, apresentam
valores de d15N variando entre -5 a +10‰. Apesar dessas diferenças
de abundância de 15N serem pequenas, elas podem ser facilmente
determinadas, com instrumentação apropriada e cuidados na
preparação das amostras (SHEARER; KOHL, 1989).
4. Determinação da abundância natural do
15
N

A determinação da concentração natural de 15N numa amostra é


feita por meio da técnica de espectrometria de massa. Essa técnica
baseia-se na diferença de massa entre isótopos estáveis e tem a
precisão requerida para leituras das pequenas diferenças de
concentrações entre amostras. Para a determinação, as formas
orgânicas ou inorgânicas de N das amostras têm de ser convertidas
em N2. Essa conversão geralmente é feita por etapas, sendo a
primeira uma digestão, que resulta em N amoniacal, podendo haver
uma redução prévia no caso de formas oxidadas de N (nitratos e
nitritos do solo, por exemplo). O sal amoniacal é então oxidado com
hipobromito formando N2. O N2 precisa ser separado do vapor de
água e óxidos de C e de N que possam estar presentes. A
conversão em N2 também pode ser feita por combustão direta, em
equipamento acoplado diretamente ao espectrômetro, em aparelhos
mais modernos. Quando ela é feita antes, o N2 resultante do
processo é armazenado em ampolas de vidro, que podem ser
guardadas para leituras posteriores. Eventualmente, as ampolas são
quebradas, e o gás arrastado para a parte de detecção do
espectrômetro. No processo integrado, o N2 produzido é, em
seguida, arrastado para o aparelho. No espectrômetro, o gás é
ionizado e passa por um campo magnético que faz com que as três
formas de N2 (14N-14N, 14N-15N e 15N-15N) sejam defletidas
diferencialmente, em função de suas massas. Os feixes de íons de
cada uma das formas são, então, detectados em coletores
especiais, nos quais as intensidades das correntes geradas são
proporcionais às concentrações das formas. As etapas seguintes
são arranjos eletrônicos de processamento dos sinais, da
amplificação ao registro dos resultados. Nos aparelhos mais moder‐
nos, toda essa parte é feita por computação, baseada em
programas que calculam proporções, fazem correções, etc. (IAEA,
2001).

5. Descrição da metodologia do d15N

A metodologia da abundância natural do 15N, para estimar a


proporção do N da planta derivado da fixação biológica, baseia-se
na comparação entre a abundância de 15N de uma espécie fixadora
de N, que obtém N do N2 atmosférico em adição às fontes de N do
solo, e a abundância de uma espécie referência não fixadora que
conta apenas com o N derivado do solo (SHEARER; KOHL, 1986).
Ou seja, espera-se que plantas não fixadoras que retiram todo seu
N do solo sejam mais abundantes em 15N que plantas fixadoras que
retiram parte de seu N do ar.
A metodologia da abundância natural é, basicamente, uma
técnica de diluição isotópica, exceto que a marcação do solo ocorre
naturalmente. Para calcular a proporção do N da planta que é
derivado da atmosfera (ou seja, fixado via FBN) é feita uma
interpolação entre as abundâncias de 15N do N fixado e do N de
outras fontes disponíveis para a planta.
Idealmente, a técnica da abundância natural é mais eficiente
quando: (i) existem apenas duas fontes de N para absorção pela
leguminosa fixadora (o N do solo disponível para a planta e o N2 do
ar); (ii) as duas fontes são suficientemente diferentes em
abundância de 15N para determinação por um espectrômetro de
massa; e (iii) a variabilidade biológica dessas abundâncias é
pequena comparada com as diferenças entre elas (BODDEY et al.,
2000).
A expressão para o cálculo do percentual de N da planta
derivado do ar é (SHEARER; KOHL, 1989):
em que %Ndda é o percentual de N da planta fixadora que é
derivado do ar, d15N(referência) é a abundância de 15N da planta controle
não fixadora, d15N(fixadora) é a abundância de 15N da planta fixadora e
B (também chamado valor B) é o valor de d15N para plantas
fixadoras cultivadas na ausência de N (ou seja, é abundância de 15N
do N fixado na planta fixadora).

6. A planta controle e o valor B

Como dito anteriormente, o d15N do N do solo absorvido pelas


plantas crescidas num determinado solo é a integralização dos d15N
de todas as formas de N disponível para as plantas (N inorgânico e
formas simples de N orgânico) naquele solo (HÖGBERG, 1997). Na
expressão para o cálculo do %Ndda, é assumido que a
concentração de 15N da planta controle (ou referência) reflete o sinal
de 15N do N do solo disponível para as plantas (controle e fixadora).
Na verdade, como as estratégias para absorção de N podem variar
entre plantas de diferentes espécies, hábitos de crescimento,
distribuição do sistema radical, associações com micorrizas, etc.,
essa premissa pode se afastar da realidade. Além disso, diferenças
espaciais do solo também podem determinar variações de sinais de
d15N do N disponível para as plantas. Dessa forma, é importante
selecionar uma planta controle que explore um volume de solo e
absorva nutrientes num padrão de tempo semelhante ao da planta
alvo (espécie fixadora). Ou seja, é importante que as plantas
controle e alvo tenham fenologias e hábitos de crescimento
semelhantes. Além disso, pode ser vantajoso coletar plantas
fixadoras e plantas referência de maneira pareada, próximas umas
das outras, bem como coletar várias espécies de plantas não
fixadoras (HÖGBERG, 1997; PATE et al., 1994; SHEARER; KOHL,
1986).
O valor B é incluído na fórmula de %Ndda para corrigir o fracio‐
namento isotópico durante o processo de fixação do N e
corresponde ao valor de d15N da planta fixadora cultivada
dependendo exclusivamente do N2 do ar. Esse valor pode ser
determinado cultivando leguminosas inoculadas com estirpes
efetivas de rizóbios em substratos livres de N. Para leguminosas de
ambientes naturais e/ou espécies arbóreas, em que existem
maiores complicações metodológicas para determinação do valor B,
recomenda-se que seja testada a importância potencial de valores
extremos reportados na literatura – a maioria dos valores de B
determinados para leguminosas oscilam entre -2,0 e +1,0 ‰
(BODDEY et al., 2000; HÖGBERG, 1997).

7. Vantagens e desvantagens da
metodologia

A grande vantagem da técnica da abundância natural do 15N para


estimar a FBN é que é um método que não perturba o ambiente
(nada precisa ser adicionado ou destruído) e que integra o efeito do
processo de FBN ao longo do tempo. Por conta disso, é o método
mais utilizado para estimativas da FBN em árvores, em sistemas
naturais ou agroflorestais (ARNDT et al., 2004; FREITAS et al.,
2010; GALIANA et al., 2002; GATHUMBI et al., 2002; GEHRING;
VLEK, 2004; KHADKA; TATSUMI, 2006; KOPONEN et al., 2003;
KREIBICH et al., 2006; RADDAD et al., 2005; SALAS et al., 2001;
SPRIGGS et al., 2003). Embora o método seja particularmente útil
para ecossistemas naturais, principalmente no caso de árvores e
arbustos, para os quais é muito difícil marcar o substrato, também
pode ser utilizado para leguminosas anuais cultivadas (SANFORD
et al., 1995).
O sucesso da quantificação da fixação de N2 utilizando a técnica
do 15N e abundâncias naturais depende do padrão isotópico do N no
sistema. Estimativas precisas requerem uma grande diferença (+5
ou -5‰) nos d15N das espécies referência e das espécies fixadoras.
Diferenças menores que 2 ‰ entre espécies devem ser discutidas
com cautela, mesmo que sejam estatisticamente significativas
(HÖGBERG, 1997). Em determinados ambientes, principalmente
florestas tropicais, essas diferenças não são detectadas (GEHRING;
VLEK, 2004; HANDLEY et al., 1994; ROGGY et al., 1999), tornando
o método inadequado para fazer estimativas da FBN.

8. Estratégia de coleta e preparo das


amostras

Aspectos da estratégia de amostragem que precisam ser consi‐


derados em estudos envolvendo a metodologia da abundância
natural do 15N para estimativas da FBN são: a época de
amostragem, a parte da planta a ser amostrada e a maneira que as
amostras são coletadas em uma base espacial.
Para plantas anuais, a amostragem deve ser feita antes da
senescência da planta, pois podem ocorrer mudanças no delta da
planta durante a maturação que não seja em virtude de fixação de
N2 ou absorção de N do solo. Reciclagem de N dentro da planta
durante o enchimento de grãos pode levar a perdas gasosas de
compostos nitrogenados (NH3), com efeitos potenciais sobre o d15N
da planta. Para a maioria das leguminosas anuais, a fixação de N2 e
a absorção de N cessam aproximadamente no meio do
florescimento, e cálculos do %Ndda depois dessa época, utilizando
a metodologia do d15N, não serão válidos. Também pode haver
diferenças no d15N entre as diferentes partes da planta, reflexo do
fracionamento isotópico que ocorre durante o transporte e ciclagem
internos do N. Em consequência disso, em plantas herbáceas, deve-
se coletar toda a parte aérea para integrar essas variações
(UNKOVICH, 1996).
Para plantas arbóreas, a coleta da planta inteira é extremamente
difícil, se não impossível. Alguns poucos estudos disponíveis
demonstram que as diferenças de concentração de 15N nos
diferentes tecidos (folhas, troncos, ramos, etc.) são de magnitudes
variáveis, de acordo com a espécie e o local. Considerando que as
folhas representem o maior compartimento de N da planta e que
diferenças entre suas abundâncias de 15N e a de outras partes não
sejam grandes, o tecido foliar é a amostra mais conveniente e válida
para estimativas da FBN (BODDEY et al., 2000). As folhas
coletadas devem estar verdes, completamente expandidas e sadias,
de preferência retiradas de vários locais da copa de modo a formar
uma amostra composta.
Finalmente, para minimizar o impacto de variações espaciais no
d N do solo, é recomendado coletar plantas referência tão perto
15

quanto possível da leguminosa estudada, preferencialmente dentro


de 2 m (UNKOVICH, 1996).
Para evitar fracionamento isotópico em razão de perdas de NH3,
as amostras vegetais devem ser postas para secar em estufa o mais
rapidamente possível, a uma temperatura máxima de 80 °C. Após a
secagem, as amostras devem ser moídas a pó fino e estocadas em
recipiente hermético e livre de umidade até a digestão.

9. Quantificação do N adicionado aos


sistemas

A produtividade de um sistema agrícola ou florestal só é mantida


se houver entradas de nutrientes que compensem as quantidades
perdidas e removidas com a exportação de biomassa vegetal. Uma
avaliação realística da sustentabilidade de tais sistemas deve incluir
a quantificação da contribuição da FBN, entretanto essas
informações são praticamente inexistentes para sistemas tropicais.
Um dos problemas da falta de dados sobre as quantidades de N
fixadas, em kg/ha/ano, é a dificuldade de medir simultaneamente a
produção de biomassa, que em ambientes naturais pode ser feita
por meio de equações alométricas ou determinação da massa de
folhedo, e as proporções de N derivadas da fixação (%Ndda), nessa
biomassa (BODDEY et al., 2000).
Num esforço para quantificar a quantidade de N fixado anual‐
mente no globo, Cleveland et al. (1999) fizeram diversas estimativas
das quantidades de N fixadas em diferentes ecossistemas. Para a
maioria das florestas tropicais, em virtude da escassez de informa‐
ções específicas, as estimativas foram baseadas em informações
disponíveis para ambientes supostamente semelhantes. Para o
caso das florestas xeromórficas brasileiras (Caatinga), resultados
preliminares têm apontado para quantidades bem menores de N
adicionado anualmente pela fixação (FREITAS et al., 2010). Para
fazer essas estimativas, os autores utilizaram a metodologia da
abundância natural do 15N para determinar o %Ndda em espécies
arbóreas da Caatinga. Juntando esses resultados com os de teores
de N total nas espécies fixadoras e informações disponíveis em
outros trabalhos (proporção de fixadoras e produção anual de
folhas) para estimar a massa de folhas de fixadoras produzida
anualmente, foi possível estimar as quantidades de N adicionadas
anualmente aos sistemas pela FBN. A Tabela 1 a seguir exemplifica
os cálculos feitos para estimar a quantidade de N fixado anualmente
em folhas de leguminosas arbóreas em dois fragmentos de
Caatinga.

Tabela 1. Biomassa total, nitrogênio total e nitrogênio fixado em


folhas de leguminosas em dois locais de Caatinga do Semiárido
brasileiro (Serra Talhada, PE, e Remígio, PB).
Variável Local

Serra Remígio
Talhada

Biomassa total de folhas (t/ha) 6,6 5,3

Proporção de leguminosas fixadoras na vegetação (%) 2,4 11,8

Biomassa de folhas de leguminosas fixadoras (kg/ha) 170 625

Teor de N nas folhas de leguminosas fixadoras (%) 2,88 3,90

Quantidade de N total nas folhas de leguminosas fixadoras


4,9 24,4
(kg/ha)

%Ndda, com B = 0 (kg/ha) 68 49

%Ndda, com B = -2 (kg/ha) 52 41

Quantidade de N fixado, com B = 0 (kg/ha) 3,3 11,2

Quantidade de N fixado, com B = -2 (kg/ha) 2,5 9,3


Fonte: Freitas et al. (2010).

10. Referências

ARNDT, S. K.; KAHMEN, A.; ARAMPATSIS, C.; POPP, M.; ADAMS, M. Nitrogen fixation
and metabolism by groundwater-dependent perennial plants in a hyperarid desert.
Oecologia, Berlin, DE, v. 141, p. 385-394, 2004.

BODDEY, R. M.; PEOPLES, M. B.; PALMER, B.; DART, P. Use of the 15N natural
abundance technique to quantify biological nitrogen fixation by woody perennials. Nutrient
Cycling in Agroecosystems, Dordrecht, v. 57, p. 235-270, 2000.
CLEVELAND, C. C.; TOWNSEND, A. R.; SCHIMEL, D. S.; FISHER, H.; HOWARTH, R. W.;
HEDIN, L. O.; PERAKIS, S. S.; LATTY, E. F.; FISCHER, J. C. von; ELSEROAD, A.;
WASSON, N. F. Global patterns of terrestrial biological nitrogen (N2) fixation in natural
ecosystems. Global Biogeochemical Cycles, Washington, DC, v. 13, p. 623-645, 1999.
DAKORA, F. D.; KEYA, S. O. Nitrogen fixation in sustainable agriculture: the African
experience. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 29, p. 809-818, 1997.
FREITAS, A. D. S.; SAMPAIO, E. V. S. B.; SANTOS, C. E. R. S.; FERNANDES, A. R.
Biological nitrogen fixation in tree legumes of the Brazilian semi-arid caatinga. Journal of
Arid Environments, London, UK, v. 74, p. 344-349, 2010.
GALIANA, A.; BALLE, P.; KANGA, A. N’G.; DOMENACH, A. M. Nitrogen fixation estimated
by the 15N natural abundance method in Acacia mangium Willd. inoculated with
Bradyrhizobium sp. and grown in silvicultural conditions. Soil Biology and Biochemistry,
Oxford, v. 34, p. 251-262, 2002.

GATHUMBI, S. M.; CADISCH, G.; GILLER, K. E. 15N natural abundance as a tool for
assessing N2-fixation of herbaceous, shrub and tree legumes in improved fallows. Soil
Biology and Biochemistry, Oxford, v. 34, p. 1059-1071, 2002.

GEHRING, C.; VLEK, P. L. G. Limitations of the 15N natural abundance method for
estimating biological nitrogen fixation in Amazonian forest legumes. Basic and Applied
Ecology, München, v. 5, p. 567-580, 2004.

HANDLEY, L. L.; ODEE, D.; SCRIMGEOUR, C. M. d15N and d13C in savanna vegetation:
dependence on water availability and disturbance. Functional Ecology, London, UK, v. 8, p.
306-314, 1994.

HANDLEY, L. L.; SCRIMGEOUR, C. M. Terrestrial plant ecology and 15N natural


abundance: the present limits to interpretation for uncultived sustems with original data from
a Scottish old field. Advances in Ecological Research, New York, v. 27, p. 133-212, 1997.

HÖGBERG, P. 15N natural abundance in soil-plant systems. New Phytologist, Oxford, v. 137,
p. 179-203, 1997.

IAEA. International Atomic Energy Agency. Use of 15N to quantify biological nitrogen fixation
in legumes. In: IAEA. International Atomic Energy Agency. Use of isotope and radiation
methods in soil and water management and crop nutrition: manual. Vienna, AT: International
Atomic Energy Agency, 2001. p. 57-69. (Training Course Series, 14).

KHADKA, J.; TATSUMI, J. Difference in d15N signatures among plant parts of perennial
species subjected to drought stress with specieal reference to the contribution of symbiotic
N2-fixation to Plant N. Plant Production Science, Tokyo, JP, v. 9, p. 115-122, 2006.

KOPONEN, P.; NYGTREN, P.; DOMENACH, A. M.; LE ROUX, C.; SAUR, E.; ROGGY, J. C.
Nodulation and dinitrogen fixation of legume trees in a tropical freshwater swamp forest in
French Guiana. Journal of Tropical Ecology, New York, v. 19, p. 655-666, 2003.
KREIBICH, H.; KERN, J.; CAMARGO, P. B.; MOREIRA, M. Z.; VICTÓRIA, R. L.; WERNER,
D. Estimation of symbiotic N2 fixation in an Amazon floodplain forest. Oecologia, Berlin, DE,
v. 147, p. 359-368, 2006.
PATE, J. S.; UNKOVICH, M. J.; ARMSTRONG, E. L.; SANFORD, P. Selection of reference
plants for 15N natural abundance assessment of N2 fixation by crop and pasture legumes in
southwest Australia. Australian Journal of Agricultural Research, Melbourne, v. 45, p. 165-
181, 1994.
RADDAD, A. Y.; SALIH, A. A.; EL FADL, M.; KAARAKKA, V.; LUUKKANEN, O. Symbiotic
nitrogen fixation in eigth Acacia Senegal provenances in dryland clays of the Blue Nile
Sudan estimated by the 15N natural abundance method. Plant and Soil, The Hague, v. 275,
p. 261-269, 2005.
ROGGY, J. C.; PRÉVOST, M. F.; GOURBIERE, F.; CASABIANCA, H.; GARBAYE, J.;
DOMENACH, A. M. Leaf natural 15N abundance and total N concentration as potential
indicators of plant nutrition in legumes and pioneer species in a rain forest of French
Guiana. Oecologia, Berlin, DE, v. 120, p. 171-182, 1999.
SALAS, E.; NYGREN, P.; DOMENACH, A. M.; BERNINGER, F.; RAMÍREZ, C. Estimating
biological N2 fixation by a tropical legume tree using the
non-nodulating phenophase as the reference in the 15N natural abundance method. Soil
Biology and Biochemistry, Oxford, v. 33, p. 1859-1868, 2001.
SANFORD, P.; PATE, J. S.; UNOVICH, M. J.; THOMPSON, A. N. Nitrogen fixation in
grazed and ungrazed subterranean clover pasture in south-west Australia assessed by the
15
N abundance technique. Australian Journal of Agricultural Research, Melbourne, v. 46, p.
1427-1443, 1995.
SHEARER, G.; KOHL, D. H. Estimates of N2 fixation in ecosystems: the need and basis of
the 15N abundance method. In: RUNDEL, P. W.; EHLERINGER, J. R.; NAGY, K. A. (Ed.).
Stable isotopes in ecological research. New York: Springer-Verlag, 1989. p. 342-347.

SHEARER, G.; KOHL, D. H. N2-fixation in field settings: estimations based on natural 15N
abundance. Australian Journal of Plant Physiology, Melbourne, v. 13, p. 699-756, 1986.
SPRIGGS, A.; STOCK, W. D.; DAKORA, F. D. Influence of mycorrhizal associations on
foliar d15N values of legume and non-legume shrubs and trees in the fynbos of South Africa:
implications for estimating N2 fixation using 15N natural abundance method. Plant and Soil,
The Hague, v. 255, p. 495-502, 2003.
UNKOVICH, M. The natural abundance of nitrogen-15 and its use in estimating nitrogen
fixation by annual legumes. [Crawley: University of Western Australia], 1996. 11th Intensive
Biological Nitrogen Course.
VANCE, C. P. Symbiotic nitrogen fixation and phosphorus acquisition: plant nutrition in a
world of declining renewable resources. Plant Physiology, Bethesda, v. 127, p. 390-397,
2001.
Capítulo 6
Proteína do solo relacionada à
glomalina: uma alternativa para
avaliação da qualidade do solo
Cristiane Figueira da Silva
Jean Luiz Simões de Araújo
Eliane Maria Ribeiro da Silva

1. Introdução

A glomalina é uma glicoproteína componente da parede celular


das hifas de fungos micorrízicos arbusculares (FMA), insolúvel em
água e imunorreativa (WRIGHT, 2000; WRIGHT; UPADHYAYA,
1998; WRIGHT et al., 1996), e acumula-se no solo após o processo
de decomposição das hifas por microrganismos edáficos (DRIVER
et al., 2005). Desde sua descoberta em 1996 (WRIGHT et al., 1996)
vem despertando interesse por parte da comunidade científica em
função das suas características e da sua correlação com algumas
propriedades do solo. A glomalina pode ser extraída do solo a partir
de ciclos consecutivos em altas temperaturas, o que sugere que
seja uma molécula extremamente estável, uma vez que as proteínas
normalmente se desnaturam quando submetidas a elevadas
temperaturas. Estimativas sobre sua permanência no solo mostram
que, para sua completa mineralização ocorrer, pode ser necessário
um período de 6 a 42 anos, tempo bem superior ao de hifas, que
não ultrapassa de 5 a 7 dias (RILLIG et al., 2001; ZHU; MILLER,
2003), ou de raízes, que varia de 10 dias até a morte da planta
arbórea (FITTER; MOYERSOEN, 1996).
A glomalina tem sido relacionada com diversos processos do
solo, por exemplo, biorremediação em solos e sedimentos contami‐
nados com metais pesados (CHRISTIE et al., 2004; CHERN et al.,
2007; GONZÁLEZ-CHÁVEZ et al., 2004). Contudo, grande parte
dos trabalhos realizados com essa glicoproteína concentra-se na
sua relação com a estabilidade de agregados e o estoque de
carbono do solo (BEDINI et al., 2007; PURIN, 2005; RILLIG, 2004;
RILLIG; STEINBERG, 2002; RILLIG et al., 1999, 2001, 2002, 2003a;
WRIGHT, 2000; WRIGHT; ANDERSON, 2000; WRIGHT;
UPADHYAYA, 1998; WRIGHT et al., 1999, 2007). Isso se deve
principalmente às seguintes características: produção abundante,
aderência às partículas do solo, recalcitrância, características
hidrofóbicas (WRIGHT, 2000; WRIGHT; UPADHYAYA, 1998) e
elevada concentração de Fe (0,8% a 8,8%) na constituição da
glomalina (WRIGHT; UPHADYAYA, 1998). Além disso, a glomalina
está fortemente correlacionada com o C e o N do solo (NICHOLS;
WRIGHT, 2005; RILLIG et al., 2003b), o que sugere que essa
molécula desempenha um papel importante no estoque desses
elementos no solo (RILLIG et al., 2001, 2003b), constituindo-se num
importante reservatório global de C (TRESEDER; TURNER, 2007).
Em áreas degradadas e revegetadas com eucalipto e leguminosas,
foi observada uma alta correlação (r = 0,82; p < 0,05) entre a
proteína do solo reativa a Bradford (PSRB) e o carbono orgânico
(SILVA, 2009). O mesmo tipo de correlação foi observado em solos
temperados submetidos a três tipos de manejo (monocultivo de
milho, floresta não manejada e campo nativo), sugerindo que o
conteúdo de C e PSRB estão sujeitos a dinâmicas similares de
deposição e decomposição (BEDINI et al., 2007). A quantidade de
glomalina produzida pelos FMAs pode variar de acordo com a
espécie e com o hospedeiro (WRIGHT, 2000). Além disso, grande
parte dos trabalhos realizados até o momento demonstra que a
quantidade de glomalina é sensível às práticas de manejo do solo
(PURIN, 2005; RILLIG et al., 2003b; WRIGHT; ANDERSON, 2000;
WRIGHT et al., 1999).
A correlação positiva da glomalina com a estabilidade de
agregados em água, bem como com o carbono, e a resposta destes
componentes às mudanças no tipo de uso do solo, sugerem que a
glomalina possa ser utilizada como um indicador de recuperação de
ecossistemas (RILLIG et al., 2003a).

2. Métodos de extração e quantificação

A glomalina, termo geral utilizado para denominar essa glicopro‐


teína, pode ser classificada de acordo com os processos de
extração e quantificação. No momento há uma grande discussão em
relação a sua denominação. Diversos autores têm sugerido termos
em função basicamente da metodologia utilizada para a extração e
quantificação da glomalina (JANOS et al., 2008). De acordo com
Rillig (2004) e Rosier et al. (2006), a glomalina, quando quantificada
pelo método de Bradford, pode receber as seguintes denominações:
proteína do solo reativa a Bradford (PSRB), a qual é obtida com
extrator de alta molaridade (citrato de sódio 50 mM, pH 8,0) e ciclos
sucessivos de autoclavagem (121 oC, 60 minutos); e PSRB
facilmente extraível (PSRB-FE) que é a fração da PSRB removida
com apenas um ciclo de extração, quando os solos são
autoclavados a 121 oC por 30 minutos, em 20 mM de citrato de
sódio, pH 7,0. Quando o método de quantificação utilizado é o
ELISA, os termos utilizados são: proteína do solo imunorreativa
(PSIR) que é a parte da fração PSRB que exibe imunorreatividade
com o anticorpo MAb32B11, produzido por meio de esporos de
Glomus intraradices; e PSIR – facilmente extraível (PSIR-FE), parte
da fração PSRB-FE que exibe imunorreatividade com o anticorpo
MAb32B11(RILLIG, 2004; ROSIER et al., 2006; WRIGHT;
UPADHYAYA, 1996).

2.1. Método de extração da glomalina


O procedimento para extração da glomalina inicialmente foi
estabelecido por Wright e Upadhyaya (1996, 1998) e Wright et al.
(1996) e tem sido amplamente utilizado para diferentes solos e
condições ambientais. O protocolo descrito abaixo se baseia no
procedimento desses autores com pequenas modificações.

2.1.1. Extração da proteína total


Durante a etapa de extração das amostras de interesse, é
extremamente importante extrair concomitantemente a glomalina
presente em potes utilizados para cultivos e multiplicação de fungos
micorrízicos arbusculares. Esse material será utilizado para a
obtenção da curva padrão para a quantificação por ELISA.
1) Pesar 1 g de solo e adicionar em tubos de centrífuga auto‐
clavavéis (tubos cônicos tipo Falcon) de 15 mL.
2) Adicionar 8 mL de citrato de sódio 50 mM pH 8,0 e sus‐
pender o solo.
3) Autoclavar por 60 minutos a 121 ºC.
4) Centrifugar a 5.000 rpm (3.200 g) por 15 minutos imedia‐
tamente após a extração (autoclavagem).
5) Remover o sobrenadante contendo a proteína e estocar a 4
ºC.
6) Repetir as etapas de 2 a 5 até que o sobrenadante tenha
uma aparência amarelo-clara (Figura 1).
Figura 1. Aparência das amostras após 10 ciclos de extração, sendo a coloração mais
escura os ciclos inicias e a mais clara os ciclos finais.
Foto: Cristiane Figueira da Silva

7) Medir o volume total do sobrenadante obtido nos vários


ciclos e estocar a 4 ºC por no máximo 2 a 4 semanas.
8) Quantificar a glomalina total por meio dos métodos de
Bradford e/ou ELISA.

2.1.2. Extração da proteína (glomalina) facilmente extraível


1) Pesar 1 g de solo e adicionar em tubos de centrífuga autocla‐
vavéis (tubos cônicos tipo Falcon) de 15 mL.
2) Adicionar 8 mL de citrato de sódio 20 mM pH 7,4 e suspen‐
der o solo.
3) Autoclavar por 30 minutos a 121 ºC. Utilizar apenas um ciclo
de autoclavagem.
4) Centrifugar a 5.000 rpm (3.200 g) por 15 minutos imediata‐
mente após a extração (autoclavagem).
5) Remover o sobrenadante contendo a proteína e estocar a 4
ºC.
6) Medir o volume total do extrato e estocar a 4 ºC por no
máximo 2 a 4 semanas.
7) Quantificar a glomalina facilmente extraível por Bradford e/ou
ELISA.

2.2. Métodos de quantificação

2.2.1. Bradford para quantificação da glomalina (BRADFORD,


1976; WRIGHT et al., 1996)
1) Preparar a curva padrão, usando albumina de soro bovino
(BSA):
A. Preparar a solução estoque de BSA na concentração de 50
ng/µL em tampão PBS, pH 7,2 e congelar a -20 ºC.
B. A partir da solução estoque, preparar as diluições para a
curva padrão de acordo com a faixa de proteína esperada para
as amostras, conforme o exemplo abaixo (Tabela 1).

Tabela 1. Curva padrão com BSA para quantificação de proteína pelo método Bradford.

Identificação do poço µg/poço Solução estoque de BSA (µL) TFS (µL)

Branco 0 0 200

Padrão 1 1,25 25 175

Padrão 2 2,5 50 150

Padrão 3 3,75 75 125

Padrão 4 5 100 100


Fonte: adaptado de Bradford (1976) e Wright et al. (1996).

2) Distribuir o extrato na placa de 96 poços. O volume de


extrato a ser adicionado dependerá da coloração da amostra
conforme exemplo na Tabela 2. O volume de extrato deverá ser
adicionado de forma que a quantidade de proteína em cada
amostra não ultrapasse a faixa de concentração utilizada na
curva padrão.

Tabela 2. Volume de extrato a ser adicionado no poço em função da coloração da


amostra.

Cor da amostra µL amostra/poço

Amarelo claro > 50

Amarelo amarronzado 25–50

Marrom 10–25

Marrom avermelhado 5–10

Preto 1–5
Fonte: adaptado de Bradford (1976) e Wright et al. (1996).

3) Adicionar o tampão PBS em quantidade suficiente para com‐


pletar um volume de 200 µL em cada poço; por exemplo, caso
seja adicionado 5 µL da amostra em cada poço, deverá ser
adicionado 195 µL de PBS.
4) Adicionar 50 µL de corante de Bradford (Bio-Rad, cat nº 500-
0006) em cada poço, misturando levemente com a pipeta para
evitar a formação de bolhas. Caso não ocorra uma boa
homogeneização, selar a placa com filme plástico apropriado e
misturar em agitador tipo Vortex, centrifugar rapidamente e
realizar a leitura em espectrofotômetro com filtro para 590 nm
ou 595 nm. Esta etapa deverá ser realizada em um tempo
máximo de 5 minutos.
5) A partir dos dados de espectrometria determinar a equação
para a curva padrão e utilizar esta equação para determinar a
quantidade de proteínas nos poços contendo o extrato.
6) A partir destes dados, calcular a quantidade de proteína em
mg/g de solo utilizando a seguinte equação:
2.2.2. ELISA para quantificação da glomalina
A metodologia de ELISA permite a quantificação da glomalina de
maneira específica pelo uso de dois anticorpos: o anticorpo primário
específico para glomalina e o secundário conjugando a biotina, bem
como a metodologia descrita por Wright et al. (1996), que
produziram um anticorpo monoclonal (MAb32B11) contra esporos
Glomus intraradicies capaz de reconhecer a glomalina de todos os
fungos do filo Glomeromycota testados.

A) Preparação da curva padrão


1) A partir da amostra de referência (proteína extraída de hifas
frescas de FMA ou de solo de potes de cultivos), preparar uma
solução estoque com 0,8 ng/µL em PBS. A proteína deve estar
com aproximadamente 100% de imunorreatividade.
2) Adicionar 50 µL de tampão PBS em 4 poços para obtenção
do branco.
3) Adicionar 100 µL da solução estoque (0,8 ng/µL) em dois
poços.
4) Preparar 6 poços para a diluição seriada adicionando 50 µL
de tampão PBS.
5) Preparar uma diluição seriada transferindo 50 µL do poço
contendo a solução estoque para um poço vizinho contendo 50
µL de tampão PBS. Misturar lentamente com auxílio da
micropipeta.
6) Repetir a etapa de diluição pelo menos 4 vezes para obten
ção de uma curva com faixa de concentração de 0 a 0,8 ng/µL
em cada poço.
7) Após a última diluição, retirar 50 µL dos últimos poços para
manter o volume de todos os poços semelhante.

B) Preparação das amostras


1) Adicionar 20 ng de proteína por poço a partir da quantificação
realizada pelo Bradford.
2) Completar o volume do poço para 50 µL com PBS. Para
facilitar a distribuição das amostras e do tampão PBS, a
concentração das amostras pode ser ajustada de forma a
permitir a adição de um mesmo volume de amostra e tampão
nos poços.
3) Centrifugar por 1 minuto a placa com todas as amostras, o
branco e a curva.
4) Deixar a placa aberta por pelo menos 16 horas para evapo‐
ração completa de toda a solução.
5) Adicionar 250 µL de leite em pó desnatado (2% em PBS) por
poço e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
6) Descartar o sobrenadante por rápida inversão da placa.
7) Adicionar 50 µL por poço do anticorpo primário MAb32B11
diluído (1 mL em 5 mL de PBS) e incubar por 1 hora sob leve
agitação.
8) Descartar o sobrenadante, secar a placa com papel toalha e
lavar 3 vezes os poços com PBST.
9) Adicionar 50 µL do anticorpo secundário IgM biotinilado
(Sigma, Cat. B-6398) diluído (1:2.500 em BSA 1%) e incubar
sob leve agitação por 1 hora.
10) Descartar o sobrenadante por rápida inversão da placa e
lavar 3 vezes os poços com PBST.
11) Adicionar 50 µL de ExtrAvidin peroxidase (Sigma, Cat. E-
8386) diluído (1:2.000 em BSA 1%) e incubar por 1 hora sob
leve agitação.
12) Descartar o sobrenadante por rápida inversão da placa e
lavar 4 vezes os poços com PBST.

C) Desenvolvedor de cor
O desenvolvedor de cor deve ser preparado imediatamente antes
do uso; caso esteja analisando mais de uma placa ao mesmo
tempo, o desenvolvedor deve ser preparado para cada placa indivi‐
dualmente.
1) Preparo das soluções:
Tampão citrato: para 100 mL, utilizar 1,05 g de ácido cítrico e
ajustar o pH para 4 com NaOH 2 ou 6 N.
Solução de ABTS: utilizar 0,015 g de 2,2´azino-di-(ácido 3-
etilbezetiaolina sulfônico) em 1 mL de água.
Peróxido de hidrogênio: diluir 1:1.000 de H2O2 30% em PBS.
2) Preparar o desenvolvedor de cor de acordo com a Tabela 3.

Tabela 3. Preparação da solução para desenvolvimento da cor de acordo com o volume


desejado.

Tampão citrato (mL) Solução ABTS (µL) H2O2 30% (µL)

10 200 10

7,5 150 7,5

5 100 5

2,5 50 2,5
Fonte: Wright et al. (1987, 1996).

3) Adicionar 50 µL do desenvolvedor de cor por poço e incubar


por 15 minutos sob leve agitação.
4) Fazer a leitura em espectrofotômetro utilizando o filtro de 405
nm e determinar a concentração em mg/g a partir da utilização
da equação obtida com a curva padrão.
5) A partir desses dados, calcular a quantidade de proteína em
mg/g de solo utilizando a seguinte equação:

6) A partir da quantificação da proteína total obtida por Bradford


e os valores obtidos por ELISA, é possível calcular a porcen‐
tagem de proteína imunorreativa (% IR) utilizando a seguinte
equação:

3. Considerações finais

Diversos indicadores químicos, físicos e biológicos têm sido utili‐


zados para avaliação da qualidade do solo, bem como sua alteração
em função do tipo de manejo. Para ser um bom indicador, é
necessário que o mesmo não se modifique frente a variações
ambientais, mas que ao mesmo tempo seja sensível às
modificações impostas pelo manejo. Além disso, deve ser capaz de
definir os processos do ecossistema (DORAN, 1997). A glomalina,
por atender a essas premissas e por estar fortemente
correlacionada com algumas propriedades do solo, pode ser
considerada como uma alternativa para avaliação da qualidade do
solo.
A quantificação da glomalina vem sendo realizada por dois
métodos: Bradford e ELISA. O método Bradford vem sofrendo diver‐
sas críticas, principalmente por não ser um método de extração
específico para a glomalina. Proteínas presentes em folhas de
plantas podem estar presentes após a extração da glomalina como
observado por Rosier et al. (2006). Como o Bradford quantifica a
proteína total presente na amostra e não apenas a glomalina, pode
haver uma superestimativa da quantidade de glomalina. Além disso,
compostos polifenólicos como tanino (HALVORSON; GONZALEZ,
2006, 2008; WHIFFEN et al., 2007) e ácidos húmicos (WHIFFEN et
al., 2007) também podem ser encontrados em extratos de proteína
do solo relacionados à glomalina (SCHINDLER et al., 2006) e
podem influenciar na quantificação da proteína do solo reativa a
Bradford (PSRB).
Embora o método Bradford superestime a quantidade de
glomalina e seu uso seja bastante questionado na literatura
(HALVORSON; GONZALEZ, 2006, 2008; WHIFFEN et al., 2007), a
correlação direta entre os resultados obtidos por este método e pelo
método de ELISA indica a sua eficiência para fornecer uma
estimativa relativa do conteúdo dessa glicoproteína no solo
(ROSIER et al., 2006).
O método de ELISA, embora seja o mais indicado para quanti‐
ficação da glomalina, visto que o anticorpo utilizado é específico
para detectar essa proteína, também é influenciado pela matéria
orgânica do solo (ROSIER et al., 2006). Esta pode reduzir a
sensibilidade do método por meio da retenção ou interferência
parcial. A retenção parcial ocorre quando os compostos orgânicos
se ligam ao antígeno impedindo que o mesmo esteja disponível para
a reação após o processo de extração. A interferência parcial se dá
quando componentes solúveis do solo se ligam à parede das
microplacas impedindo que o antígeno de interesse possa se aderir
(OTTEN et al., 1997).
Embora existam algumas limitações em relação aos métodos de
extração e quantificação, a PSRB por si só, ou junto com os
resultados obtidos pelo método de ELISA, têm sido usados tanto
para quantificar os estoques e avaliar o ciclo da glomalina no solo,
como para inferir as relações funcionais entre a glomalina e as
propriedades físicas e químicas do solo (HALVORSON;
GONZALEZ, 2006).

4. Referências

BEDINI, S.; AVIO, L.; ARGESE, E.; GIOVANNETTI, M. Effects of long-term land use on
arbuscular mycorrhizal fungi and glomalin-related soil protein. Agriculture Ecosystems &
Environment, Amsterdam, NL, v. 120, p. 463-466, 2007.
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry,
New York, v. 72, p. 248-254, 1976.
CHERN, E. C.; TSAI, D. W.; OGUNSEITAN, O. A. Deposition of glomalin-related soil protein
and sequestered toxic metals into watersheds. Environmental Science and Technology,
Washington, DC, v. 41, p. 3566-3572, 2007.
CHRISTIE, P.; LI, X. L.; CHEN, B. D. Arbuscular mycorrhiza can depress translocation of
zinc to shoots of host plants in soils moderately polluted with zinc. Plant and Soil, The
Hague, v. 261, p. 209-217, 2004.
DORAN, J. W. Soil quality and sustainability. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA
DO SOLO, 26., 1997, Rio de Janeiro. Palestras... Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira de
Ciência do Solo, 1997. 1 CD-ROM.
DRIVER, J. D.; HOLBEN, W. E.; RILLIG, M. C. Characterization of glomalin as a hyphal
wall component of arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 37,
p. 101-106, 2005.
FITTER, A. M.; MOYERSOEN, B. Evolutionary trends in root-microbe symbioses.
Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Series B, London, UK, v. 351, p.
1367-1375, 1996.
GONZÁLEZ-CHÁVEZ, M. C.; CARRILLO-GONZALEZ, R.; WRIGHT, S. F.; NICHOLS, K. A.
The role of glomalin, a protein produced by arbuscular mycorrhizal fungi, in sequestering
potentially toxic elements. Environmental Pollution, Essex, v. 130, p. 317-323, 2004.
HALVORSON, J. J.; GONZALEZ, J. M. Bradford reactive soil protein in Appalachian soils:
distribution and response to incubation, extraction reagent and tannins. Plant and Soil, The
Hague, v. 286, p. 339-356, 2006.
HALVORSON, J. J.; GONZALEZ, J. M. Tannic acid reduces recovery of water-soluble
carbon and nitrogen from soil and affects the composition of Bradford-reactive soil protein.
Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 40, p. 186-197, 2008.
JANOS, P. D.; GARAMSZEGI, S.; BELTRAN, B. Glomalin extraction and measurement. Soil
Biology & Biochemistry, Oxford, v. 40, p. 728-739, 2008.
NICHOLS, K. A.; WRIGHT, S. F. Comparison of glomalin and humic acid in eight native US
soils. Soil Science, Baltimore, v. 170, p. 985-997, 2005.
OTTEN, W.; GILLIGAN, C. A.; THORNTON, C. R. Quantification of fungal antigens in soil
with monoclonal antibody-based ELISA: analysis and reduction of soil-specific bias.
Phytopathology, Saint Paul, v. 87, p. 730-736, 1997.
PURIN, S. Fungos micorrízicos arbusculares: atividade, diversidade e aspectos funcionais em
sistemas de produção de maçã. 2005. 148 f. Dissertação (Mestrado em Ciência do Solo) -
Universidade do Estado de Santa Catarina, Lages, 2005.
RILLIG, M. C. Arbuscular mycorrhizae, glomalin, and soil aggregation. Canadian Journal of
Soil Science, Ottawa, CA, v. 84, p. 355-363, 2004.
RILLIG, M. C.; MAESTRE, F. T.; LAMIT, L. J. Microsite differences in fungal hyphal length,
glomalin, and soil aggregate stability in semiarid Mediterranean steppes. Soil Biology
&Biochemestry, Oxford, v. 35, p. 1257-1260, 2003a.
RILLIG, M. C.; RAMSEY, P. W.; MORRIS, S.; PAUL, E. A. Glomalin, an arbuscular-
mycorrhizal fungal soil protein, responds to land-use change. Plant and Soil, The Hague, v.
253, p. 293-299, 2003b.
RILLIG, M. C.; STEINBERG, P. D. Glomalin production by an arbuscular mycorrhizal
fungus: a mechanism of habitat modification? Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 34, p.
1371-1374, 2002.
RILLIG, M. C.; WRIGHT, S. F.; ALLEN, M. F.; FIELD, C. B. Rise in carbon dioxide changes
soil structure. Nature, London, UK, v. 400, p. 628, 1999.
RILLIG, M. C.; WRIGHT, S. F.; EVINER, V. T. The role of arbuscular mycorrhizal fungi and
glomalin in soil aggregation: comparing effects of five plant species. Plant and Soil, The
Hague, v. 238, p. 325-333, 2002.
RILLIG, M. C.; WRIGHT, S. F.; NICHOLS, K. A.; SCHMIDT, W. F.; TORN, M. S. Large
contribution of arbuscular mycorrhizal fungi to soil carbon pools in tropical forest soils. Plant
and Soil, The Hague, v. 233, p. 167-177, 2001.
ROSIER, C. L.; HOYE, A. T.; RILLIG, M. C. Glomalin-related soil protein: assessment of
current detection and quantification tools. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 38, p.
2205-2211, 2006.
SCHINDLER, F. V.; MERCERB, E. J.; JAMES, A. Rice chemical characteristics of glomalin-
related soil protein (GRSP) extracted from soils of varying organic matter content. Soil
Biology & Biochemestry, Oxford, v. 39, p. 320-329, 2006.
SILVA, C. F. Atributos químicos e biológicos em cavas de extração de argila revegetadas com
eucalipto e leguminosas. 2009. 172 f. Tese (Doutorado em Produção Vegetal) – Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias, Universidade Estadual do Norte Fluminense,
Campos dos Goytacazes, 2009.
TRESEDER, K. K.; TURNER, K. M. Glomalin in ecosystems. Soil Science Society of America
Journal, Madison, v. 71, p. 1257-1266, 2007.
WHIFFEN, L. K.; MIDGLEY, D. J.; MCGEE, P. A. Polyphenolic compounds interfere with
quantification of protein in soil extracts using the Bradford method. Soil Biology &
Biochemestry, Oxford, v. 39, p. 691-694, 2007.
WRIGHT, S. F. A fluorescent antibody assay for hyphae and glomalin from arbuscular
mycorrhizal fungi. Plant and Soil, The Hague, v. 226, p. 171-177, 2000.
WRIGHT, S. F.; ANDERSON, R. L. Aggregate stability and glomalin in alternative crop
rotations for the central Great Plain. Biology and Fertility of Soils, Berlin, DE, v. 31, p. 249-
253, 2000.
WRIGHT, S. F.; FRANKE-SNYDER, F. M.; MORTON, J. B.; UPADHYAYA, A. Time-course
study and partial characterization of a protein on arbuscular mycorrhizal hyphae during
active colonization of roots. Plant and Soil, The Hague, v. 181, p. 193-203, 1996.
WRIGHT, S. F.; GREEN, V. S.; CAVIGELLI, M. A. Glomalin in aggregate size classes from
three different farming systems. Soil and Tillage Research, Amsterdam, NL, v. 94, p. 546-
549, 2007.
WRIGHT, S. F.; MORTON, J. B.; SWOROBUK, J. E. Identification of a vesicular-arbuscular
mycorrhizal fungus by using monoclonal antibodies in an enzyme-linked immunosorbent
assay. Applied Environmental Microbiology, Washington, v. 53, p. 2222–2225, 1987.
WRIGHT, S. F.; STARR, J. L.; PALTINEANU, I. C. Changes in aggregate stability and
concentration of glomalin during tillage management transition. Soil Science Society of
America Journal, Madison, v. 63, p. 1825-1829, 1999.
WRIGHT, S. F.; UPADHYAYA, A. A survey of soils for aggregate stability and glomalin, a
glycoprotein produced by hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi. Plant & Soil, The Hague,
v. 198, p. 97-107, 1998.
WRIGHT, S. F.; UPADHYAYA, A. Extraction of an abundant and unusual protein from soil
and comparison with hyphal protein of Arbuscular Mycorrhizal Fungi. Soil Science, Baltimore,
v. 161, p. 575-586, 1996.
ZHU, Y.; MILLER, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil–plant
systems. TRENDS in Plant Science, Oxford, v. 8, p. 408, 2003.
Capítulo 7
Inoculantes de fungos
ectomicorrízicos
Cláudia Elizabete Pereira de Lima
Bartolomeu Acioli-Santos
Zaida Inês Antoniolli
Márcio José Rossi

1. Introdução

Os fungos ectomicorrízicos (FEM) têm grande importância no


crescimento e sobrevivência de plantas de interesse florestal; e, ao
colonizarem os hospedeiros, estabelecem uma série de relações
inter e intraespecíficas, com benefícios mútuos para os simbiontes.
Nessa associação, a planta fornece ao fungo fotossintatos, e este, a
partir do micélio circundante à raiz, capta água e nutrientes do
substrato e os transfere à planta (READ, 1999). Os benefícios
proporcionados à planta incluem aumento na absorção de nutrientes
(ALVES et al., 2001), resistência a patógenos de raízes (MORIN et
al., 1999; SEN, 2001), tolerância às condições adversas do solo,
como excesso de metais pesados (KHAN et al., 2000; TICHELEN et
al., 1999) e estresse hídrico (BOGEAT-TRIBOULOT et al., 2004).
A habilidade dos FEM para colonizar e beneficiar as plantas varia
de acordo com o isolado fúngico, a espécie vegetal e as condições
ambientais (OLIVEIRA et al., 1994; SMITH; READ, 2008). Assim,
estudos sobre as melhores combinações fungo-hospedeiro são
necessários, para que se possa alcançar o controle da micorrização
(GARBAYE, 1984). Esse processo inicia-se com a identificação, o
isolamento e a seleção de FEM e culmina com a produção de inocu‐
lantes eficientes na promoção do crescimento e da sobrevivência de
plantas dependentes da associação ectomicorrízica (ALVES et al.,
2001; GIACHINI et al., 2000; SOUZA et al., 2004, 2008).
A dificuldade para produção de inoculantes em escala industrial
tem sido uma das principais limitações ao uso rotineiro dos fungos
ectomicorrízicos nos programas de reflorestamento.
Assim, neste capítulo, serão abordados os principais métodos
utilizados para a produção de inoculantes de fungos
ectomicorrízicos, apresentando-se as principais vantagens e
desvantagens de cada método e o estado atual de conhecimento e
aplicação.

2. Isolamento de fungos ectomicorrízicos

As técnicas mais simples de isolamento de FEM para obtenção


de culturas puras utilizam os corpos de frutificação (ascomas e basi
diomas) desses fungos (BRUNDRETT et al., 1996; MOLINA;
PALMER, 1982). O isolamento pode ser feito diretamente no campo,
ou no laboratório, o mais cedo possível após a coleta. As
frutificações devem ser jovens e cuidadosamente abertas para obter
tecidos internos que não tenham sido expostos ao ar ou
contaminados com solo ou por insetos. Para os fungos que
possuem o himênio excluso, por exemplo, os cogumelos, os tecidos
do ápice do estipe são os mais indicados. Para os que possuem o
himênio incluso, os tecidos imaturos internos são os ideais.
Geralmente, quanto mais jovem o corpo de frutificação, maiores
as chances de isolamento, pois os espécimes velhos têm maior pos‐
sibilidade de contaminação com bactérias e/ou outros fungos.
Alguns FEM são mais fáceis de ser isolados a partir dos corpos de
frutificação, por exemplo, as espécies de Amanita, Pisolithus,
Scleroderma e Rhizopogon, enquanto espécies de Russula,
Laccaria e Tuber são mais difíceis de isolamento, quer por seus
diminutos corpos de frutificação (ex.: Laccaria), quer pela dificuldade
de crescer nos meios de cultura convencionais (Russula, Tuber).
Os FEM também podem ser isolados a partir das micorrizas
(CHU-CHOU, 1979). Essa é uma tarefa delicada que exige maior
número de tentativas. Uma grande desvantagem desse
procedimento reside no fato de que a identificação do fungo
simbionte torna-se muito mais difícil, a menos que se conheça
antecipadamente o fungo colonizador (inoculação controlada). Além
disso, é necessária a desinfestação superficial da raiz com produtos
químicos, como hipoclorito de sódio, bicloreto de mercúrio, entre
outros, que, além de sua toxidez para o manipulador, podem
inviabilizar o fungo, tornando o isolamento um processo ainda mais
complicado.
Vários meios de cultura podem ser usados para o isolamento
(BRUNDRETT et al., 1996), sendo preferível usar meios mais
pobres e de baixo pH para a primeira etapa, diminuindo assim os
riscos de contaminação por bactérias (CHU-CHOU, 1979). Na
Tabela 1 é apresentada a formulação do meio de Hagem (1910),
modificado e suplementado com antibióticos. Depois de detectado o
crescimento do fungo a partir dos pedaços de tecido ou das
micorrizas, é necessária sua repicagem para meio mais rico para
garantir a sobrevivência da cultura. Igualmente uma grande
variedade de meios pode ser usada, destacando-se o meio Melin-
Norkrans modificado (MARX, 1969) (Tabela 2), que também pode
ser complementado com micronutrientes (Tabela 3).

Tabela 1. Meio de cultura Hagem para isolamento de fungos ectomicorrízicos.

Componente Quantidade

NH4Cl 0,5 g

KH2PO4 0,5 g

MgSO4.7H20 0,5 g

Glicose 5,0 g
Tiamina – HCl 50,0 µg

FeCl3 (solução a 1%) 0,5 mL

Ágar 10,0 g

Água destilada 1.000,0 mL


Fonte: Hagem (1910).

Tabela 2. Meios de cultura recomendados para cultivo de fungos ectomicorrízicos.

MNM PGK MC
Componente
(g/L)(1) (g/L) (g/L)

Glicose 10,0 10,0 10,0

Peptona de soja - 3,33 2,5

Extrato de levedura - 0,67 -

Extrato de malte 3,0 - 1,5

CaCl2 0,050 - -

NaCl 0,025 - -

NH4NO3 - 1,0 0,7

(NH4)2HPO4 0,75 - -

NH2CONH2 - - 0,10

KH2PO4 0,50 0,264 0,185

K2HPO4 - 0,628 0,440

MgSO4.7H2O 0,15 0,330 0,230

CuSO4.5H2O - 0,0021 0,0015

MnCl2.4H2O - 0,0004 0,0004

ZnSO4.7H2O - 0,0006 0,0004

FeSO4.7H2O - 0,0005 0,0003

FeCl3 (solução 1%) 1,2 - -

Tiamina – HCl 100,0 µg - -


Relação C/N 14/1 10/1 13/1
(1)
Exceto para FeCl3 e Tiamina-HCl, que têm unidades diferentes.

Tabela 3. Micronutrientes para complementação dos meios de cultura.

Componente Quantidade (g/L)

Na2Mo4.2H2O 0,00200

H3BO3 0,00300

CoCl2.6H2O 0,00003

KI 0,00075
Fonte: Rossi (2006).

Antes da repicagem para meio mais rico, o isolamento deve ser


cuidadosamente inspecionado para detectar o crescimento do fungo
e eventuais contaminações. Esse exame pode ser feito a olho nu e
ao microscópio estereoscópico. A maioria dos FEM tem crescimento
lento, e as culturas devem ser monitoradas diariamente para obser‐
vação da emergência de hifas a partir do material inoculado. Isso
pode ser visualizado em microscópio estereoscópico, em pequeno
aumento (20 a 30 vezes). Também é necessário considerar que a
velocidade de crescimento dos FEM é variável, dependendo da
espécie ou mesmo do isolado, e alguns podem parar de crescer
logo após o isolamento.
Características como a cor e a textura do micélio podem ser
valiosas para distinção de espécies. Muitos basidiomicetos são
reconhecidos em cultura pela presença de fíbulas em suas hifas.
Para os ascomicetos ectomicorrízicos, o reconhecimento não é tão
fácil, pois esses não apresentam essas estruturas. Em adição,
alguns fungos contaminantes podem não esporular rapidamente, o
que dificulta distingui-los dos FEM em cultura. A natureza
micorrízica de alguns isolados só poderá ser confirmada pela
formação de micorrizas em testes de inoculação usando hospedeiro
suscetível.
2.1. Material e meio de cultura

– Corpos de frutificação frescos coletados no campo.


– Placas de Petri com meio de cultura sólido Hagem modificado.
– Pinças.
– Bico de Bunsen.
– Álcool etílico 70%.
– Bisturis ou outro tipo de lâmina.
– Canetas para identificação.
– Estufa incubadora a 25 ºC.
– Capela de fluxo laminar.
– Placas de Petri com meio MNM sólido com 0,2% de carvão
ativo para posterior repicagem dos fungos isolados.
O meio deve ser esterilizado a 120 ºC durante 20 minutos. O pH
após autoclavagem deverá estar entre 4,5 e 4,8. Acrescentar ao
meio fundido (50 ºC), no momento da distribuição, os seguintes
antibióticos:
– Cloranfenicol – 100 mg, dissolvido em 1 mL de etanol (p.a.).
– Rifampicina – 100 mg, dissolvido em 1 mL de metanol (p.a.).
A acidez do meio, seu baixo teor de açúcar e os antibióticos
retardam ou suprimem o crescimento de bactérias, mas mutantes
resistentes espontâneos podem aparecer rapidamente. É
necessário repicar o fungo para um meio de cultura de uso rotineiro
(ex.: MNM) ou contendo 50 mg/L de rifampicina logo que o fungo
começar a crescer. Os antibióticos devem ser manipulados no
momento do preparo do meio de cultura para evitar sua
precipitação. A rifampicina é tóxica, devendo-se utilizar luvas e
máscara contra pó quando da pesagem e preparo da solução.

2.1.1. Procedimento
1. Limpar os corpos de frutificação com ajuda de um pincel para
eliminar o solo agregado.
2. Esterilizar pinças e lâminas com álcool e fogo.
3. Abrir os corpos de frutificação com a mão (não usar lâmina)
para expor os tecidos internos.
4. Selecionar pequenas peças de tecido com o auxílio de pinças
ou do bisturi estéreis e depositar na superfície do meio Hagem
em placa.
5. Identificar as culturas.
6. Repetir essa operação com diferentes porções do corpo de
frutificação.
7. Incubar em temperatura constante (25 °C).
8. Observar diariamente para detectar o crescimento miceliano;
se necessário, retirar assepticamente uma porção do micélio e
examinar ao microscópio.
9. Repicar para meio MNM e incubar sob as mesmas condições.
10. Uma vez confirmado o isolamento, manter os isolados por
subcultura com repicagens periódicas para meio MNM (de 20 a
30 dias para utilização em cultivos e de 60 a 180 dias para
armazenamento).
11. Os corpos de frutificação devem ser herborizados em se‐
guida, para fins de identificação, colocando-se inicialmente em
sacos de papel e secando-se em estufa ventilada (de 35 ºC a
40 ºC). Em seguida, armazenar o material em armário seco
com naftalina ou cravo-da índia e, quando possível, depositar
uma amostra em herbário credenciado.

3. Seleção de fungos ectomicorrízicos


A seleção de isolados de FEM é realizada geralmente com base
na capacidade do fungo de colonizar as raízes e promover o cresci‐
mento da planta hospedeira (GARBAYE, 1990; OLIVEIRA et al.,
1994; SOUZA et al., 2004, 2008). A eficiência de um isolado pode
ser comprovada a partir da avaliação de parâmetros representativos
do crescimento do hospedeiro, tal como matéria seca (GARBAYE,
1990; MARX et al., 1991), altura da planta, diâmetro do caule,
porcentagem de sobrevivência das mudas (GARBAYE, 1990), área
foliar e conteúdo nutricional da planta, sendo este último parâmetro
bastante relacionado ao teor de fósforo (ALVES et al., 2001;
NARLOCH, 2002; SOUZA et al., 2004).
Além da infectividade e eficiência do isolado em relação à planta
de interesse, outros critérios de seleção de FEM podem ser utiliza‐
dos. De acordo com Brundrett et al. (1996), devem ser consideradas
as seguintes características:
• Facilidade de isolamento e cultivo em meios convencionais e
em substratos disponíveis, a baixo custo. A maioria dos fungos
ectomicorrízicos é de crescimento lento, razão pela qual é
preferível selecionar os fungos que apresentem maior
velocidade de crescimento.
• Competitividade na interação desse fungo com a microbiota
nativa do solo.
• Baixa especificidade para o conjunto de hospedeiros impor‐
tantes na região.
• Adaptabilidade às condições climáticas e edáficas na região.
Outro critério de grande importância, mas pouco considerado na
prática, está relacionado com a capacidade de multiplicação do
fungo em grande escala, em que a cinética de crescimento, avaliada
em cultivo durante um estudo nutricional, é também fundamental
para a etapa de seleção. Um isolado fúngico de FEM, com ótima
capacidade de promover o crescimento da planta, pode ser inviável
para a etapa de produção do inoculante em escala comercial caso
apresente velocidade de crescimento muito baixa. Considerando
que comparados aos microrganismos de vida livre, os fungos
ectomicorrízicos apresentam baixa velocidade de crescimento
(GARBAYE, 1990; ROSSI, 2001, 2006; ROSSI et al., 2002, 2003,
2005), esse fator torna-se muito importante na seleção de isolados.
Além dos problemas técnicos na operação dos biorreatores,
períodos longos de cultivo, acima de 20 dias, podem comprometer a
viabilidade do inoculante, em razão da diminuição do potencial do
inóculo (LAPEYRIE; BRUCHET, 1985), além do acúmulo de
metabólitos tóxicos (DUARTE et al., 2008).
Assim, estudos da cinética de crescimento do fungo e também
aqueles que envolvam o conhecimento das melhores combinações
na relação fungo-planta-ambiente são necessários para o adequado
controle da micorrização, especialmente em programas de
inoculação de mudas de essências florestais.

4. Inoculantes ectomicorrízicos

Além da seleção dos fungos mais eficientes, o controle da mi‐


corrização exige o estabelecimento de métodos de produção de ino‐
culantes de FEM, seja em pequena ou larga escala e com diferentes
finalidades (experimental ou aplicada). O inóculo fúngico deve
conter essencialmente micélio ativo e estar livre de contaminação
por outros organismos. Embora a eficiência de um inoculante seja,
em última análise, determinada por sua capacidade de propagar a
associação, os seguintes critérios devem ser considerados:
a) Eficiência na promoção do crescimento da planta.
b) Baixa relação custo-benefício.
c) Facilidade e constância de produção com a tecnologia dispo‐
nível.
d) Facilidade de transporte e armazenamento.
e) Viabilidade prolongada.
Nas últimas décadas, diversos tipos de inoculantes ectomicor‐
rízicos, naturais ou artificiais, foram produzidos e utilizados de
acordo com a necessidade e praticidade exigida.
Os inoculantes naturais podem ser produzidos à base de solo ou
de esporos. Quando a inoculação é realizada a partir de solo, utili‐
zam-se os propágulos que estão naturalmente ligados à rizosfera ou
serrapilheira das plantas anteriormente existentes no local.
Estruturas fúngicas como raízes colonizadas, micélio circundante à
raiz, rizomorfas, esclerócios e esporos são retiradas juntamente com
o solo e incorporadas às novas plantações. Entretanto, ao introduzir
o solo como inóculo, o produtor adiciona, também, possíveis
patógenos de raízes, plantas invasoras e outros organismos
indesejáveis, interferindo negativamente no cultivo. Apesar dessas
desvantagens e da elevada quantidade exigida, esse método é
bastante utilizado em virtude da facilidade na obtenção de
inoculante e do baixo custo que apresenta. Em alguns casos,
porém, se o local de coleta for distante da nova plantação, será
adicionado o custo do transporte, pois os inoculantes à base de solo
são, em geral, muito volumosos.
Os inoculantes à base de solo deram importante contribuição à
silvicultura em diversos países. Citam-se os casos de introdução de
Pinus exóticos na América Central (BRISCOE, 1959; LAMB, 1956
citados por MIKOLA, 1973) e na África (MIKOLA, 1973), tornada
possível em razão da introdução de solo das plantações originais.
A inoculação à base de esporos utiliza ascomas ou basidiomas
coletados em plantações ou florestas (MARX; CORDELL, 1990).
Esse tipo de inoculante pode ser aplicado de diferentes formas: na
superfície das sementes (MARX et al., 1984) de modo semelhante
ao empregado para inoculação de sementes de soja com rizóbios;
aplicado seco e misturado ao substrato de plantio (CASTELLANO;
TRAPPE, 1985); aplicado na forma de suspensão em água (ex.:
Ecto® Spore Spray da empresa norte americana Plant Health Care
Inc.); aplicado na forma de pellets; ou, ainda, encapsulado em
hidrogel.
Assim como ocorre com os inoculantes à base de solo, a inocu‐
lação com esporos não assegura a eficiência dos FEM em promover
o crescimento do hospedeiro. Grandes quantidades de inóculo são
exigidas quando da aplicação, o que a torna uma técnica limitada, já
que a produção de frutificações é um fenômeno sazonal. Exemplo
expressivo de sua utilização é representado pela produção de trufas
na França, onde plantas inoculadas com esporos de espécies de
Tuber, e colonizadas por esses fungos, são produzidas e vendidas a
produtores (CHEVALIER; GRENTE, 1979). Na região Noroeste dos
Estados Unidos, o Departamento de Agricultura (Usda) desenvolveu
um programa bem sucedido de inoculação de coníferas em viveiro
utilizando esporos de fungos ectomicorrízicos em suspensão
(CASTELLANO; MOLINA, 1989; MARX et al., 1992). Além das
trufas, os FEM que produzem grandes quantidades de frutificações
e de esporos são gasteromicetos como os gêneros Pisolithus,
Rhizopogon e Scleroderma.

5. Inoculantes ectomicorrízicos micelianos

Várias pesquisas têm procurado desenvolver inoculantes


alternativos que possam contribuir para eliminar ou reduzir as
limitações impostas pelos inoculantes naturais. Os inoculantes
micelianos, constituídos pelo sistema vegetativo do fungo (micélio)
produzido em culturas puras, parecem preencher esses requisitos. A
grande vantagem é que se pode testar previamente a infectividade e
a eficiência dos fungos em relação à planta de interesse, antes de
sua introdução nos sistemas de produção de mudas (MARX, 1980).
As culturas puras são obtidas pelo isolamento do fungo a partir
de frutificações, esporos ou outros propágulos. Essas culturas são
mantidas e multiplicadas assepticamente em meio de cultura apro‐
priado, contendo nutrientes para o crescimento vegetativo dos FEM.
O micélio retirado dessas culturas pode ser utilizado diretamente
para inocular plântulas in vitro ou para inocular frascos com meio de
cultura líquido que, após crescimento do micélio e trituração em
liquidificador, irá formar uma suspensão miceliana. Tanto o micélio
original quanto as suspensões micelianas podem ser utilizadas para
inocular frascos com uma mistura turfa-vermiculita em meio de
cultura líquido, para se obter inoculantes em substrato sólido.
Alternativamente, após obtenção das suspensões micelianas em
meio líquido, esse material pode ser encapsulado em alginato de
cálcio (MAUPERIN et al., 1987), produzindo esferas de tamanho
variável, sendo esta uma técnica mais sofisticada e de uso mais
recente (ROSSI, 2001, 2006).
Assim, os isolados previamente selecionados, mais eficientes na
colonização e na promoção do crescimento das plantas, podem ser
multiplicados e aplicados em larga escala. Porém, esse tipo de
inoculante requer mão de obra especializada e fungos que possam
ser isolados e que cresçam em meio de cultura (BRUNDRETT et al.,
1996), não sendo, portanto, aplicável a todos os FEM. Alguns
desses fungos não foram, até o presente, cultivados em meio de
cultura, ou o fizeram com crescimento muito lento para uma
produção economicamente viável. O custo relativamente alto da
técnica, quando comparada aos inoculantes naturais, também é um
fator que deve ser considerado.
Os inoculantes micelianos podem ser produzidos por dois
procedimentos: cultivo em substrato sólido e cultivo submerso. Os
dois processos utilizam meios de cultura artificiais. O meio MNM e
variações do meio Pridham-Gottlieb – PGK e MC (ROSSI et al.,
2002, 2007) têm sido utilizados com sucesso para o cultivo axênico
de FEM. A composição desses meios é apresentada nas Tabelas 2
e 3, sendo que a quantidade de nitrogênio do meio MNM,
originalmente de 0,25 g/L (C/N 50/1, mais apropriada para o
armazenamento das culturas), foi alterada para 0,75 g/L, pois a
modificação na formulação original feita por Marx (1969) deixou o
meio desbalanceado para a finalidade de produção de biomassa.
Também se recomenda a adição de 0,2% de carvão ativo
neutralizado para os meios de cultura sólidos.
5.1. Cultivo em substrato sólido

No cultivo em substrato sólido, o fungo é multiplicado em material


poroso suplementado com meio nutritivo líquido. Para a produção
dos inoculantes de FEM, tem sido utilizada a mistura turfa-
vermiculita embebida com meio de cultura em frascos de vidro ou
em sacos plásticos, munidos de membranas ou dispositivos para
troca de gases (MARX et al., 1992). Essa técnica é uma adaptação
das técnicas de produção de inoculantes de fungos comestíveis. A
vermiculita promove suporte mecânico às hifas do fungo, que
crescem entre suas lâminas, mantendo sua viabilidade até a
formação das raízes receptivas quando da inoculação, e a turfa
permite o ajuste do pH a um valor mais adequado, na faixa usual
entre 4,8 e 5,5 (ALVES et al., 2001; GARBAYE, 1990; SMITH;
READ, 2008). Essa técnica tem sido bastante útil para inoculações
em pequena escala, mas torna-se pouco viável quando se trata da
produção de grandes quantidades de inoculante, normalmente
necessárias para inocular o grande volume de mudas produzidas
pelas empresas florestais (GARBAYE, 1990; LE TACON et al., 1983;
SMITH; READ, 2008).
Inoculantes produzidos por substrato sólido (mistura turfa-
vermiculita) têm sido utilizados extensivamente em alguns países,
notadamente França e Estados Unidos, onde se registraram expe‐
riências de industrialização. No primeiro país, inoculante de Laccaria
laccata (Scop.) Cooke foi produzido e utilizado comercialmente na
década de 1980 por uma associação entre um instituto de pesquisa,
viveiristas e uma empresa de produção de inoculantes, mas o
empreendimento teve curta duração. Nos Estados Unidos,
inoculantes de P. tinctorius (Pers.) Coker & Couch e de Hebeloma
crustuliniforme (Bull.) Quél. constituem a linha de inoculantes
Mycortree® da empresa Plant Health Care Inc.
A seguir, é descrito um protocolo para produzir inoculante em
substrato sólido, que permite obter inoculante suficiente para 450
mudas. Para um número menor ou maior de plantas, as quantidades
devem ser multiplicadas pelo fator de redução ou aumento de
escala.

5.1.1. Material de meios de cultura


– Filme de PVC ou parafilme.
– Cortador de discos de meio de cultura com micélio (tubo de
aço inox com Ø 7 mm a 8 mm e 6 cm comprimento, com um
lado afiado).
– 6 frascos de vidro tipo conserva de 1 L de capacidade. As
tampas devem ter 2 furos de Ø 10 mm para troca de gases. A
esterilidade deve ser garantida pela colocação de 2 tiras de
esparadrapo tipo Micropore® nos furos, uma internamente e
outra externamente (Figura 1).
– 2,7 L de vermiculita com partículas tamanho médio.
– 0,7 L de turfa peneirada.
– 1,2 L de meio de cultura.
– 4 placas com meio de cultura sólido.
– Utensílios básicos para trabalhar em capela (alça de platina,
bisturi, álcool etílico, algodão hidrofílico).

5.1.1.1. Inóculo e condições de cultivo


– 2 a 4 placas com o fungo cultivado durante 20 a 30 dias
(Figura 1).
– Incubar em estufa a 25 °C.
– Todos os procedimentos com o fungo deverão ser realizados
em capela de fluxo laminar.

5.1.1.2. Procedimento
1. Cortar cerca de 55 discos de cultura com micélio e distribuir
em 2 placas com meio de cultura. Incubar durante 2 a 3 dias
para verificar a viabilidade por meio da visualização, sob lupa,
de hifas novas emergindo dos discos.
2. Preparar uma mistura de vermiculita e turfa na proporção de
4:1.
3. Distribuir essa mistura em frascos de vidro até 1/2 do volume.
Adicionar à mistura um volume de meio de cultura líquido de
45% do volume do substrato seco (225 mL para 500 mL de
substrato) (Figura 1).

Figura 1. Representação de um sistema de produção de inoculante de FEM em substrato


sólido. A partir da cultura inicial são feitos os discos de inóculo que, após a confirmação da
viabilidade, são inoculados no substrato sólido dentro de frascos.
Ilustração: Márcio José Rossi

4. Autoclavar a mistura durante 20 minutos a 120 °C.


5. Inocular em capela de fluxo laminar o substrato de cada
frasco com 8 discos de cultura com micélio (ou suspensão
miceliana conforme o procedimento do item 5.2 – nesse caso
diminuir o volume de meio para 35%).
6. Tampar e selar as bordas dos frascos com filme de PVC.
7. Incubar a 25 °C durante 30 dias, examinando o crescimento
do fungo de 2 em 2 dias.
8. Após a colonização total do substrato, o inoculante pode ser
armazenado sob refrigeração ou prontamente utilizado. Inocular
uma pequena porção em 2 placas com meio sólido para
verificar a viabilidade antes do uso.
Existem recomendações para lavagem do inoculante para
remoção de açúcares residuais antes do uso. Essa operação resulta
numa perda considerável de biomassa. Por outro lado, foi verificado
que o inoculante lavado pode manter uma excelente viabilidade por
até 6 meses de armazenamento (ROSSI, 2006). Durante o longo
período de crescimento, além da incorporação de água pelo fungo,
ocorre uma perda de umidade significativa através dos furos da
tampa do frasco. Assim, a lavagem proporciona uma
homogeneização da umidade, o que favorece a manutenção da
viabilidade. O balanceamento correto do meio de cultura permite a
exaustão completa dos açúcares e dispensa a etapa de lavagem.
Desse modo, apenas uma hidratação do inoculante seria necessária
para o caso de estocagem.

5.1.1.3. Aplicação do inoculante


O inoculante deve ser misturado ao substrato de plantio previa‐
mente umedecido na proporção de 10% em volume. O fósforo é um
fator determinante para a colonização das raízes pelo fungo; se
muito elevado, inibirá a colonização. Recomenda-se 0,25
g/recipiente de plantio (geralmente tubete de PVC de 60 mL) de
adubo de liberação lenta (tipo Osmocote®) com N-P-K 14-8-8, o
que equivale a 4 mg de P por planta. O substrato de plantio deve ser
distribuído nos tubetes previamente desinfetados (com hipoclorito de
sódio a 2% durante 12 horas e posterior enxágue), seguido da
semeadura das sementes.

5.2. Cultivo em meio líquido


Uma técnica mais sofisticada consiste no cultivo desses fungos
em meio líquido, permitindo o uso de fermentadores, com posterior
inclusão (encapsulamento) do micélio num gel (LE TACON et al.,
1983, 1985; MAUPERIN et al., 1987; ROSSI, 2006). Estudos em
viveiros demonstraram que esse inoculante é mais eficiente que o
inoculante sólido, provavelmente em virtude da maior proteção do
micélio no interior do gel contra fatores bióticos e abióticos. Além
disso, apresenta maior facilidade de armazenamento e transporte e
maior longevidade, permitindo, dessa forma, reduzir a quantidade a
ser empregada para inoculação das plantas (KUEK et al., 1992; LE
TACON et al., 1983, 1985).
A primeira experiência de produção comercial de inoculante de
FEM encapsulado ocorreu na Austrália na década de 1990 com o
nome comercial Mycobeads® pela Biosynthetics Pty. Ltd. (KUEK et
al., 1992). Nessa mesma década, a França iniciou a produção de
inoculante ectomicorrízico em larga escala por esse método. Trata-
se de uma união de empresas viveiristas (GIE Forêt-Mycorhizes)
para produção de mudas de Pseudotsuga menziesii (Mirbel) Franco
colonizadas por Laccaria bicolor (Maire) P.D. Orton, sob licença,
supervisão e controle de qualidade do ‘Institut National de la
Recherche Agronomique’ (Inra). O fungo é cultivado em meio líquido
em biorreator e, em seguida, fragmentado e encapsulado em
alginato de cálcio. Com esse método, reduziu-se consideravelmente
a dose de inoculação necessária, em comparação com o inoculante
em turfa-vermiculita. Apenas 100 mg de micélio (base seca) são
suficientes para inocular 1 m2 de viveiro.
A técnica é promissora, mas sua utilização continua restrita
apesar de quase duas décadas de estudos. A principal razão para
isso está relacionada a dificuldades na multiplicação dos fungos
ectomicorrízicos por processos submersos. O crescimento lento dos
fungos ectomicorrízicos, em comparação aos fungos sapróbios,
contribui para contaminações frequentes que inviabilizam a cultura.
Contribui, também, para essa situação a falta de conhecimentos
específicos de engenharia quanto aos fenômenos de transporte
envolvidos. Partindo-se da premissa de que o fungo necessita de
contato com nutrientes e com o oxigênio, a fermentação submersa
é, apesar das dificuldades apontadas, a mais indicada para a
produção comercial desses inoculantes.
Quando se necessita de uma maior transferência de massa gás-
líquido, em condições de baixo cisalhamento, biorreatores do tipo
airlift são mais apropriados. Estes são reatores pneumáticos,
diferentes do reator de coluna de bolhas, dividindo-se em duas
zonas de escoamento que possibilitam a circulação de líquido em
grande escala ao redor do corpo do reator. Os mesmos são de
construção simples, possibilitando uma manutenção fácil e barata.
Como não existem partes mecânicas móveis necessárias para a
agitação, há redução do risco de contaminação, pois facilita a
limpeza e a esterilização. Estudos recentes demonstraram que esse
tipo de biorreator é eficiente para a produção de biomassa de FEM
(ROSSI, 2001, 2006), por apresentar produtividade superior aos
biorreatores convencionais utilizados para esse fim.
A seguir é descrito um protocolo para produzir inoculante
encapsulado em gel de alginato, suficiente para inocular cerca de
450 mudas. Para um aumento de escala de até 15 vezes, pode-se
utilizar um Erlenmeyer de 3 L de capacidade com 2 L de meio de
cultura. Nesse caso, o cultivo deverá ser aerado (pode-se utilizar
uma bomba de ar do tipo aquário), com o ar de entrada sendo
filtrado com membrana de até 0,2 µm. Como inóculo, deve ser
utilizado uma suspensão miceliana preparada conforme o
procedimento descrito a seguir.
A produção em série nesse modelo pode levar à multiplicação
dessa escala para inoculação, que pode chegar à ordem de 1
milhão de mudas. Para inocular acima de 1 milhão de mudas, deve-
se recorrer à utilização de biorreatores onde maiores volumes
podem ser operados. Nessas condições de processo, outras
importantes variáveis devem ser consideradas, sendo que os
estudos ainda são poucos. Maiores informações para processos em
biorreatores podem ser obtidas no trabalho de Rossi (2006). É
importante salientar que alguns fungos não crescem nas condições
de cultivo aerado. Além disso, observou-se que durante a
preparação da suspensão miceliana pode ocorrer perda da
viabilidade fúngica em virtude de uma autointoxicação por produtos
intercelulares, liberados pela fragmentação e oxidados ao contato
com o ar. Nesse caso, enquanto essas questões não forem
resolvidas, deve-se procurar selecionar isolados que não
apresentem essas limitações para as condições da fermentação
submersa.

5.2.1. Material e meio de cultura


– Liquidificador com jarra esterilizável.
– Filme de PVC ou parafilme.
– Pinça grande (∼25 cm).
– Cortador de discos de cultura (tubo de aço inox com Ø 7 mm
e 6 cm comprimento com um lado afiado).
– Pipeta de vidro ou ponteiras de 5 mL (para pipetas automá‐
ticas) protegidas com filtro de algodão.
– 1 frasco Erlenmeyer de 500 mL com 150 mL de solução de
NaCl a 0,85%.
– 0,25 g de carvão ativo neutralizado num Erlenmeyer com 50
mL de água destilada.
– 3 placas com meio de cultura sólido.
– 125 mL de meio de cultura líquido distribuídos em 5 frascos
Erlenmeyer de 250 mL capacidade. Os frascos devem ser
tampados com 3 camadas de papel alumínio e 1 camada
externa de papel Kraft presa com barbante ou elástico.
– Utensílios básicos para trabalhar em capela de fluxo laminar
(alça de platina, bisturi, álcool, algodão hidrofílico, canetas para
identificação).
5.2.1.1. Inóculo e condições de cultivo
– 2 placas com o fungo cultivado durante 20 a 30 dias.
– Incubar estaticamente em estufa a 25 °C.
– Todos os procedimentos com o fungo deverão ser realizados
assepticamente em capela de fluxo laminar.
– Material e meios deverão ser esterilizados a 120 °C durante
20 minutos.

5.2.1.2. Procedimento
1. Cortar cerca de 30 discos de cultura com micélio e distribuir
em 1 placa com meio de cultura. Incubar durante 2 a 3 dias
(Figura 2) para verificar a viabilidade por meio da visualização,
sob lupa, de hifas novas emergindo dos discos.
Figura 2. Representação da produção de inoculante de FEM em meio líquido. A partir da
cultura inicial, são feitos os discos de inóculo que, após a confirmação da viabilidade, são
inoculados em meio líquido em frascos. O micélio obtido é fragmentado em solução salina
onde, em seguida, adiciona-se o carvão ativo.
Ilustração: Márcio José Rossi.

2. Destampar os frascos com cuidado e inocular 5 discos


viáveis em cada frasco. Recolocar as camadas de alumínio e
selar os frascos com o filme de PVC ou parafilme (importante
para garantir a assepsia do cultivo).
3. Colocar os frascos na estufa para crescimento durante 10 a
15 dias. O tempo dependerá de cada isolado fúngico.
4. Utilizando a pinça, retirar o micélio dos frascos e transferir
para a jarra do liquidificador (Figura 2). Adicionar a solução
salina e fragmentar durante 20 segundos.
5. Transferir a suspensão (cerca de 0,4 g/L de biomassa) para o
frasco de 500 mL, adicionar o carvão ativo e agitar com
cuidado.
6. Pipetar e distribuir 1,5 mL da suspensão em 1 placa e incu‐
bar para verificar a viabilidade, que deve ocorrer no período de
até 1 semana, dependendo do fungo. Também é aconselhável
selar as placas com 2 camadas de filme de PVC.
7. Tampar o frasco com as camadas de alumínio, selar com
filme de PVC e guardar a suspensão sob refrigeração até
confirmação da viabilidade.
O inoculante (suspensão miceliana) produzido por esse proces‐
so, diferentemente do inoculante obtido em cultivo sólido, em que o
micélio fica protegido pelas lâminas da vermiculita, contém a
biomassa pura, e, se utilizado diretamente para inoculação de
mudas, poderá sofrer uma desidratação brusca em contato com o
substrato de plantio, podendo perder a viabilidade. Assim, é
recomendado utilizar um veículo para proteção do micélio. Para
esse fim, uma técnica interessante que vem sendo empregada é a
do encapsulamento em gel de alginato.
5.3. Encapsulamento da biomassa em gel de alginato de
cálcio

5.3.1. Material esterilizado necessário


– 1 béquer de 500 mL.
– 1 colher de sopa de inox.
– 1 placa de Petri grande (15 cm) com barra magnética.
– 1 frasco Erlenmeyer de 400 mL, com saída para gotejamento
(tubo de Ø 3 mm com registro para controle da vazão) e com
barra magnética.
– 1 peneira metálica.
– 2 agitadores magnéticos (desinfetar com álcool 70%).
– 1 frasco de 300 mL com tampa para armazenamento das
cápsulas.
– Filme de PVC para vedação de placas e frascos.
– Béquer de 1 L para descartes.
– 1 frasco Erlenmeyer com 100 mL de solução de NaCl a
0,85%.
– 500 mL de água destilada.
– 400 mL de solução de CaCl2 0,5 M.
– 150 mL de solução de alginato de sódio a 2%.
– 2 placas com meio de cultura MNM sólido.
– Utensílios básicos para trabalhar em capela (alça de platina,
bisturi, álcool etílico, algodão hidrofílico, canetas para identifi‐
cação).

5.3.1.1. Procedimento
1. Juntar a suspensão miceliana obtida pelo processo descrito
anteriormente com o alginato de sódio no frasco gotejador.
2. Montar o sistema para gotejamento (Figura 3) e ligar a agi‐
tação.

Figura 3. Encapsulamento da biomassa em gel de alginato. A suspensão miceliana é


misturada com o alginato e gotejada em cloreto de cálcio. Após a solidificação completa, as
cápsulas são lavadas com água destilada.
Fonte: adaptada de Rossi (2006).

3. Gotejar a suspensão biomassa + alginato no cloreto de


cálcio.
4. À medida que as cápsulas vão sendo produzidas, removê-las
da placa e colocá-las no béquer com um pouco de CaCl2 para
ocorrer a cura (gelificação total da cápsula).
5. A cura demora cerca de 30 minutos, período em que as
cápsulas irão sofrer desidratação e submergirão com o
aumento da densidade, indicando o final do processo.
6. Retirar as cápsulas da solução de CaCl2 utilizando a peneira
e lavá-las rapidamente 3 vezes para remover o excesso de
cloretos.
7. Colocar as cápsulas no frasco de 300 mL para armazena‐
mento e adicionar um pouco de solução salina.
8. Distribuir cerca de 20 cápsulas numa placa (em duplicata e
seladas com 2 camadas de filme de PVC) para verificar a
viabilidade.
9. Rotular e armazenar sob refrigeração, estando pronto para
utilização.
Nessas condições, o inoculante pode permanecer viável por
períodos superiores a seis meses. Entretanto, essa é uma caracte‐
rística que depende também de cada fungo.

5.3.1.2. Aplicação do inoculante


Para experimentos em condições de casa de vegetação, com
pequeno número de repetições, 2 a 3 cápsulas do inoculante podem
ser aplicadas individualmente em cada recipiente de plantio, geral‐
mente tubete de PVC de 60 mL, e logo abaixo da semente. Para
inoculação em escala maior, sob condições de viveiro, o inoculante
pode ser misturado ao substrato de plantio no momento da
adubação. Nesse caso, como o processo de mistura e
fracionamento do substrato pode interferir na distribuição das
cápsulas no interior do substrato, recomenda-se uma dosagem
maior do inoculante, de modo a obter pelo menos 6 cápsulas por
tubete de 60 mL (ou 100 cápsulas/L).
Diferentes substratos de plantio podem ser utilizados, mas
alguns cuidados devem ser observados:
1) Desinfetar o substrato de plantio e os tubetes.
2) Desinfetar a betoneira ou o recipiente onde o inoculante será
misturado ao substrato de plantio, o que pode ser feito com
uma solução de hipoclorito de sódio a 2%, com posterior
enxágue.
3) Com o substrato já na betoneira, este deverá ser umedecido
com água ou com a solução fertilizante, para só depois adi‐
cionar-se o inoculante, evitando, assim, o estresse osmótico ao
fungo.
4) Depois de umedecido, adicionar o inoculante e seguir o
procedimento normal.
5) Recomenda-se, conforme o caso anterior, 0,25 g/tubete de
adubo de liberação lenta (Osmocote) com N-P-K 14-8-8,
equivalendo a 4 mg de P por planta.

6. Considerações finais

O uso de inoculantes micelianos de fungos ectomicorrízicos tem


comprovado a sua capacidade de estimular o crescimento e
sobrevivência de espécies florestais. Apesar disso, poucas
empresas no mundo estão voltadas para essa atividade, tanto que
no Brasil não se tem conhecimento de nenhuma empresa nessa
área. Uma possível explicação, além das dificuldades tecnológicas e
elevado grau de especialização que o processo requer, pode estar
relacionada com a demora em se verificar os resultados da
inoculação no campo. Durante o período de produção das mudas,
geralmente de 3 meses, sua qualidade é facilmente alcançada com
os adubos e defensivos químicos; logo, o produtor de mudas parece
não se interessar suficientemente para encorajar empreendimentos
com elevado risco de mercado, como o de inoculante de fungos
ectomicorrízicos. Um plano governamental com incentivos para o
controle da micorrização poderia ser a alavanca propulsora desse
negócio no Brasil, que é um País notadamente expressivo na área
florestal. Embora os ganhos com o controle da micorrização sejam
elevados, novas tecnologias devem ser desenvolvidas com custos
baixos e de fácil aplicação. Protocolos padronizados e testados
nacionalmente são necessários para implantação de um sistema de
produção de inoculante e inoculação de fungos ectomicorrízicos em
espécies florestais, sejam elas cultivadas para fins econômicos ou
para fins de preservação ambiental. Assim, recomenda-se que as
empresas da área florestal procurem os laboratórios que realizam
pesquisas com esses fungos para desenvolver parcerias para
implantação de áreas experimentais e, dessa forma, a difusão do
conhecimento e o desenvolvimento das técnicas, despertando cada
vez mais a atenção do mercado e estabelecendo de forma
permanente essa promissora tecnologia.

7. Referências

ALVES, J. R.; SOUZA, O.; PODLECH, P. A. S.; GIACHINI, A. J.; OLIVEIRA, V. L. Efeito de
inoculante ectomicorrízico produzido por fermentação semi-sólida sobre o crescimento de
Eucalyptus dunnii Maiden. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 36, p. 307-313,
2001.
BOGEAT-TRIBOULOT, M. B.; BARTOLI, F.; GARBAYE, J.; MARMEISSE, R.; TAGU, D.
Fungal ectomycorrhizal community and drought affect root hydraulic properties and soil
adherence to roots of Pinus pinaster seedlings. Plant and Soil, The Hague, v. 267, p. 213-
223, 2004.
BRUNDRETT, M.; BOUGHER, N. L.; DELL, B.; GROVE, T.; MALAJCZUK, N. Working with
mycorrhizas in forestry and agriculture. Canberra: Australian Centre for International
Agriculture Research, 1996. 374 p.
CASTELLANO, M. A.; MOLINA, R. Mycorrhizae. In: LANDIS, T. D.; TINUS, R. W.;
MCDONALD, S. E.; BARNETT, J. P. (Ed.). The biological components: nursery pests and
mycorrhizae: the container tree nursery manual. Washington, DC: US-Department of
Agriculture-Forest Service, 1989. p. 101-171.
CASTELLANO, M. A.; TRAPPE, J. M. Ectomycorrhizal formation and plantation
performance of Douglas-fir nursery stock inoculated with Rhizopogon spores. Canadian
Journal of Forest Research, Ottawa, CA, v. 15, p. 613-617, 1985.
CHEVALIER, G.; GRENTE, J. Application pratique de la symbiose ectomycorhizienne:
production á grande échelle de plants mycorhizés par la truffe (Tuber melanosporum Vitt.).
Mushroom Science, Eugene, v. 10,
p. 483-505, 1979.
CHU-CHOU, M. Mycorrhizal fungi of Pinus radiata in New Zealand. Soil Biology and
Biochemistry, Oxford, v. 11, p. 557-562, 1979.
DUARTE, P. F.; OLIVEIRA, V. L.; ROSSI, M. J.; FÚRIGO JÚNIOR, A. Inibição do
crescimento de fungos ectomicorrízicos por seus metabólitos secundários. In: REUNIÃO
BRASILEIRA DE FERTILIDADE DO SOLO E NUTRIÇÃO DE PLANTAS, 28.; REUNIÃO
BRASILEIRA SOBRE MICORRIZAS, 12.; SIMPÓSIO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA
DO SOLO, 10.; REUNIÃO BRASILEIRA DE BIOLOGIA DO SOLO, 7., 2008, Londrina.
FertBio 2008: desafios para o uso do solo com eficiência e qualidade ambiental: anais.
Londrina: Embrapa Soja: SBCS: IAPAR: UEL, 2008. 1 CD-ROM.
GARBAYE, J. Competitivité des champignons ectomycorhiziens: prèmiers résultats et
application à la sélection de souches pour la mycorhization contrôlée du hêtre et du chêne
rouvre dans le nord-est de la France. Revue Forestière Française, Nancy, v. 6, p. 33-43,
1984.
GARBAYE, J. Utilisation des mycorhizes em sylviculture. In: STRULLU, D. G. (Ed.). Les
mycorhizes des arbres et plantes cultivées. Paris, FR: Lavoisier, 1990. p. 197-248.
GIACHINI, A. J.; OLIVEIRA, V. L.; CASTELLANO, M. A.; TRAPPE, J. M. Ectomycorrhizal
fungi in Eucalyptus and Pinus plantations in southern Brazil. Mycologia, New York, v. 92, p.
1166-1177, 2000.
HAGEM, O. Untersuchungen über norwegishe mucorineen II. Skift. Videnskabs-Selskabet I
Christiana 1910. I. Mathematisch Naturvidenskabelize Klullback-Leibler, Christiania, v. 4, p.
1-152, 1910.
KHAN, A. G.; KUEK, C.; CHAUDHRY, T. M.; KHOO, C. S.; HAYES, W. J. Role of plants,
mycorrhizae and phytochelators in heavy metal contaminated land remediation.
Chemosphere, New York, v. 41, p. 197-207, 2000.
KUEK, C.; TOMMERUP, I. C.; MALAJCZUCK, N. Hydrogel bead inocula for the production
of ectomycorrhizal eucalyptus for plantations. Mycological Research, Cambridge, v. 96, p.
273-277, 1992.
LAPEYRIE, F. F.; BRUCHET, G. Some factors influencing viability of ectomycorrhizal fungal
inoculum. New Phytologist, Oxford, v. 100, p. 585-593, 1985.
LE TACON, F.; JUNG, G.; MUGNIER, J.; MICHELOT, P. Efficacité en pépiniére forestière
d’un inoculum de champignon ectomycorhizien produit en fermenteur et inclus dans une
matrice de polymères. Annals of Forest Science, Les Ulis, v. 40, p. 165-176, 1983.
LE TACON, F.; JUNG, G.; MUGNIER, J.; MICHELOT, P. Efficiency in a forest nursery of an
ectomycorrhizal fungus inoculum produced in a fermentor and entrapped in polymeric gels.
Canadian Journal of Botany, Ottawa, CA, v. 63, p. 1664-1668, 1985.
MARX, D. H. Ectomycorrhizal fungus inoculation: a tool for improving forest pratices. In:
MIKOLA, P. (Ed.). Ectomycorrhiza research. Oxford: Clarendon, 1980. p. 13-71.
MARX, D. H. The influence of ectotrophic mycorrhizal fungi on the resistence of pine roots
to pathogenic infections: I. antagonism of mycorrhizal fungi to root pathogenic fungi and soil
bacteria. Phytopathology, Saint Paul, v. 59, p. 153-163, 1969.
MARX, D. H.; CORDELL, C. E. Inoculation of fall- and spring-sown longleaf pine seedlings
with Pisolithus tinctorius. Asheville: US-Department of Agriculture-Forest Service-
Southeastern Forest Experiment Station, 1990. 5 p. (Research Note SE, 358).
MARX, D. H.; JARL, K.; RUEHLE, J. L.; BELL, W. Development of Pisolithus tinctorius
ectomycorrhizae on pine seedlings using basidiosporeencapsulated seed. Forest Science,
Washington, DC, v. 30, p. 897-907, 1984.
MARX, D. H.; MAUL, S. B.; CORDELL, C. E. Aplication of specific ectomycorrhizal fungi
world forestry. In: LEATHAM, G. F. (Ed.). Frontiers in industrial mycology. New York:
Chapman & Hall, 1992. p. 78-98.
MARX, D. H.; RUEHLE, J. L.; CORDELL, C. E. Methods for studying nursery and field
response of trees to specific ectomycorrrhiza. In: NORRIS, J. R.; READ, D. J.; VARNA, A.
K. (Ed.). Methods in microbiology. London, UK: Academic, 1991. v. 23, p. 383-411.
MAUPERIN, C. H.; MORTIER, F.; GARBAYE, J.; LE TACON, F.; CARR, G. Viability of an
ectomycorrhizal inoculum produced in a liquid medium and entrapped in a calcium alginate
gel. Canadian Journal of Botany, Ottawa, CA, v. 65, p. 2326-2329, 1987.
MIKOLA, P. Application of mycorrhizal symbiosis in forestry practices. In: MARKS, G. C.;
KOZLOWSKI, T. T. (Ed.). Ectomycorrhizae: their ecology and physiology. New York:
Academic, 1973. p. 383-411.
MOLINA, R.; PALMER, J. G. Isolation, maintenance and pure culture manipulation of
ectomycorrhizal fungi. In: SCHENCK, N. C. (Ed.). Methods and principles of mycorrhizal
research. Saint Paul: The American Phytopathological Society, 1982. p. 115-129.
MORIN, C.; SAMSON, J.; DESSUREAULT, M. Protection of black spruce seedlings against
Cylindrocladium root rot with ectomycorrhizal fungi. Canadian Journal of Botany, Ottawa,
CA, v. 77, p. 169-174, 1999.
NARLOCH, C. Interação microrganismos solubilizadores de fosfatos-fungos ectomicorrízicos e
o crescimento de Pinus taeda L. 2002. 153 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) -
Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
OLIVEIRA, V. L.; SCHMIDT, V. D. B.; GOMES, N. C.; MAIA, D. C. Spécificité de
champignons ectomcyorhiziens vis-à-vis d’Eucalyptus viminalis Labill et E. dunnii Maiden.
Agronomie, Paris, FR, v. 14, p. 57-62, 1994.
READ, D. J. Mycorrhiza: the state of the art. In: VARMA, A.; HOCK, B. (Ed.). Mycorrhiza:
structure, function, molecular biology, and biotechnology. New York: Springer, 1999. p. 3-49.
ROSSI, M. J. Produção de inoculante de fungo ectomicorrízico utilizando fermentação no
estado líquido em biorreator tipo airlift. 2001. 93 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia
Química) - Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
ROSSI, M. J. Tecnologia para produção de inoculantes de fungos ectomicorrízicos utilizando
cultivo submerso em biorreator airlift. 2006. 188 f. Tese (Doutorado em Engenharia
Química) - Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
ROSSI, M. J.; FURIGO JÚNIOR, A.; OLIVEIRA, V. L. Inoculant production of
ectomycorrhizal fungi by solid and submerged fermentations (A review). Food Technology
and Biotechnology, Zagreb, HR, v. 45, p. 277-286, 2007.
ROSSI, M. J.; PERCINOTTI, C. C.; FURIGO JÚNIOR, A.; OLIVEIRA, V. L. Produção de
inoculante de fungos ectomicorrízicos em biorreator airlift para aplicação em viveiros
florestais. In: SIMPÓSIO NACIONAL DE FERMENTAÇÕES, 14., 2003, Florianópolis.
Anais... Florianópolis: UFSC, 2003. 1 CD-ROM.
ROSSI, M. J.; SOUZA, J. A. R.; OLIVEIRA, V. L. Inoculum production of the
ectomycorrhyzal fungus Pisolithus microcarpus in an airlift bioreactor. Applied Microbiology
and Biotechnology, Berlin, DE, v. 59, p. 175-181, 2002.
ROSSI, M. J.; STREIT, H. C.; OLIVEIRA, V. L.; FURIGO JÚNIOR, A. Transferência e
consumo de oxigênio durante o cultivo de fungo ectomicorrízico em biorreator airlift com
circulação externa: determinação do kLa e da QO2. In: SIMPÓSIO NACIONAL DE
BIOPROCESSOS, 15., 2005, Recife. Anais... Recife: UFPE, 2005. 1 CD-ROM.
SEN, R. Multitrophic interactions between a Rhizoctonia sp. and mycorrhizal fungi affect
Scots pine seedling performance in nursery soil. New Phytologist, Oxford, v. 152, p. 543-
553, 2001.

SMITH, S. E.; READ, D. J. Mycorrhizal symbiosis. 3rd ed. London, UK: Academic, 2008.
800 p.
SOUZA, L. A. B.; BONNASSIS, P. A. P.; OLIVEIRA, V. L.; SILVA FILHO, G. N. New isolates
of ectomycorrhizal fungi and the growth of eucalypt. Pesquisa Agropecuária Brasileira,
Brasília, DF, v. 43, p. 235-241, 2008.
SOUZA, L. A. B.; SILVA FILHO, G. N.; OLIVEIRA, V. L. Eficiência de fungos
ectomicorrízicos na absorção de fósforo e na promoção do crescimento de eucalipto.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 39, p. 349-355, 2004.
TICHELEN, K. K. van; VANSTRAELEN, T.; COLPAERT, J. V. Nutrient uptake by intact
mycorrhizal Pinus sylvestris seedlings: a diagnostic tool to delet cooper toxicity. Tree
Physiology, Victoria, v. 19, p. 189-196, 1999.
Capítulo 8
Microrganismos solubilizadores
de minerais
Newton Pereira Stamford
Ely Nahas

1. Introdução

Vários microrganismos apresentam potencial para produzir


ácidos, principalmente ácidos orgânicos, e, portanto, podem dispo‐
nibilizar minerais contidos nas rochas. Entretanto, dentre esses, as
bactérias oxidantes do enxofre, que produzem ácido sulfúrico, pos‐
suem condições privilegiadas para promover a liberação de
elementos contidos nos minerais. A atuação dos microrganismos
reveste-se de maior importância quando utilizam rochas com fósforo
e com potássio, tendo em vista a maior necessidade destes
nutrientes para as plantas, em especial o caso do fósforo em solos
tropicais.

1.1. Fungos solubilizadores de minerais

Em virtude da carência generalizada de fosfato solúvel e da alta


capacidade de fixação do fósforo no solo, a produtividade vegetal é
geralmente limitada nas regiões de clima tropical
(FRANZLUEBBERS et al., 2002; OBERSON et al., 2001). Em solos
ácidos e altamente intemperizados, a quantidade de fosfato
disponível é baixa, constituindo uma pequena porção dos fosfatos
inorgânicos totais. Os teores de P disponível observados em
diversos solos variam de 4,8 mg/kg a 12,0 mg/kg e, de uma maneira
geral, constituem apenas uma porcentagem muito baixa, menos de
10% de P total do solo (BARROSO; NAHAS, 2007). Outra
perspectiva que se apresenta é a transformação da forma
indisponível do fosfato ou adicionada no solo para a forma
disponível, acessível para absorção pelas raízes das plantas
(NAHAS, 2007).
A frequência de microrganismos com habilidade de produzir
fosfatases no solo, enzimas que hidrolisam o P orgânico em fosfato
inorgânico, pode ser bastante alta. Enquanto 9% a 45% do total de
bactérias produziram fosfatase ácida e 7% a 47% fosfatase alcalina,
o número de fungos produtores da fosfatase ácida variou de 14% a
98%, e da fosfatase alcalina de 6% a 47% (NAHAS et al., 1994).
O fósforo inorgânico ocorre em geral na forma de fosfatos de
ferro e de alumínio em solos ácidos e fosfatos de cálcio em solo
alcalinos (SYLVIA et al., 2005). A solubilidade desses fosfatos em
água é extremamente baixa, e a sua dissolução no solo é bastante
reduzida, mesmo considerando longo período de tempo. Contudo,
microrganismos e raízes das plantas podem dissolver fosfatos
insolúveis do solo produzindo fosfatos assimiláveis pelas plantas e
proporcionar aumento da produtividade. Com essa perspectiva,
esforços têm sido feitos para avaliar o papel dos microrganismos na
solubilização de fosfatos inorgânicos e aumento da disponibilidade
de fosfatos para o crescimento das plantas (NAHAS, 1999, 2007).
Os microrganismos solubilizadores de fosfato mineral atuam
produzindo ácidos orgânicos ou inorgânicos ou diminuindo o pH (HE
et al., 1996). Por exemplo, na solubilização da apatita há liberação
de Ca2+, H2PO4- e de um íon que depende da composição da apatita,
podendo ser OH- ou CO32- ou F-. A secreção de prótons resultantes
da absorção de NH4+ é outro mecanismo sugerido para solubilização
de fosfato. Esse mecanismo foi constatado em trabalhos com
Penicillium aurantiogriseum e Pseudomonas sp., e possibilitaram a
solubilização de fosfatos de cálcio como resultado da excreção de
prótons acompanhando a respiração ou assimilação de NH4+
(ILLMER; SCHINNER, 1995).
Os ácidos orgânicos como acético, cetoglucônico, cítrico, glucô‐
nico, lático, oxálico, succínico, tartárico são os mais importantes e
complexam cátions como Al3+, Ca2+ e Fe3+ dos fosfatos minerais,
liberando P solúvel, ou seja, P disponível para as plantas
(WHITELAW et al., 1999). A capacidade de solubilização dos ácidos
orgânicos varia com o fosfato mineral e o tipo de ácido produzido
pelos microrganismos. Os resultados de estudos em condições
abióticas mostraram que os ácidos orgânicos solubilizam mais
CaHPO4 do que AlPO4 (BARROSO et al., 2006). Além do mais, ficou
comprovado que, enquanto a solubilização do CaHPO4 foi
decrescente na seguinte ordem: maleico>ox-
álico>cítrico=láctico>tartárico, a do AlPO4 seguiu a seguinte sequên‐
cia: oxálico>cítrico>láctico>maleico>tartárico. Portanto, a dissolução
do fosfato depende do ácido orgânico secretado pelo
microrganismo.
Embora a capacidade de solubilização esteja relacionada com a
produção de ácidos ou diminuição do pH pelos microrganismos,
nem sempre esses fatores se correlacionam com a quantidade de
fosfato solúvel produzida. Além desses fatores, deve-se considerar
que o crescimento do fungo ou da bactéria constitui outro fator
importante para a solubilização (BARROSO et al., 2006; NAHAS,
1999). No ambiente natural, como os solos, os microrganismos
tendem a obter nutrientes necessários para o seu crescimento. A
disponibilidade desses nutrientes influi bastante na habilidade de
solubilização do fosfato no solo. Isso significa que a capacidade de
produzir ácidos quantitativa e qualitativamente e/ou a diminuição do
pH dependem da fonte de C, N e P (NAHAS, 2007). Em outros
termos, esses fatores podem influir controlando o processo de
solubilização. Esse fato foi demonstrado em diversos trabalhos que
mostraram que a habilidade de solubilização dos diferentes fosfatos
minerais depende do microrganismo e das fontes de C e de N
(AHUJA et al., 2007; BARROSO et al., 2006; CHUN-CHAO et al.,
2007; REDDY et al., 2002; REYES et al., 2006).
A presença de microrganismos solubilizadores de P já foi cons‐
tatada na maioria dos solos (AHUJA et al., 2007; BARROSO;
NAHAS, 2005; KANG et al., 2002; NAHAS et al., 1994; REYES et
al., 2006; SILVA FILHO et al., 2002). Essas pesquisas envolveram
tanto a constatação da presença e quantidade de microrganismos
solubilizadores como de sua atividade de solubilização.
A constatação de fungos no solo com capacidade de solubiliza‐
ção de fosfatos inorgânicos possibilita o isolamento e também averi‐
guar a habilidade de o microrganismo ser utilizado na produção de
biofertilizantes de plantas. Inúmeros estudos mostraram a possibili‐
dade de empregar esses fungos para solubilizar fosfatos minerais,
propiciando fosfato solúvel, além das suas necessidades, com maior
aproveitamento do nutriente pelas plantas (CHUN-CHAO et al.,
2007; MEDINA et al., 2007; NARLOCH et al., 2002; VASSILEV et
al., 2006).

1.2. Bactérias solubilizadoras de minerais

As bactérias oxidantes do enxofre, que possuem a propriedade


de produzir ácido sulfúrico e, portanto, apresentam maior potencial
para liberar nutrientes de minerais, estão presentes em quase todos
os solos (GARCIA JÚNIOR, 1991). Em princípio as bactérias
oxidantes do enxofre foram mais utilizadas visando melhorar o
condicionamento de solos salinos e sódicos e, posteriormente, na
liberação de minerais (STAMFORD et al., 2002, 2006); e, pela
habilidade de produzir ácido sulfúrico, elas também foram utilizadas
na biolixiviação de minérios com metais pesados como ouro, prata e
urânio (GARCIA JÚNIOR, 1991; GARCIA JÚNIOR; BEVILAQUA,
2008).
O enxofre inorgânico pode apresentar vários estados de oxida‐
ção, mas predominam as formas de sulfetos (S2-), enxofre elementar
(S0) e sulfatos (S6+). As bactérias oxidantes do enxofre do gênero
Acidithiobacillus têm capacidade de obter energia para fixar o CO2
atmosférico a partir da oxidação do S. Elas têm seu crescimento
acelerado em condições ácidas (pH < 2,0) e são organismos
mesófilos (< 40 ºC) e somente oxidam formas reduzidas de enxofre
sendo capazes de produzir ácido sulfúrico (GARCIA JUNIOR, 1992),
de acordo com a seguinte reação:

S0 (S2)- + 11/2 O2 + H2O → H2SO4


No Brasil, a utilização de S elementar vem sendo estudada,
tendo sido relatada a importância do efeito do enxofre elementar
inoculado com Acidithiobacillus no condicionamento de solos salinos
e principalmente sódicos em virtude do pH bastante elevado (STAM‐
FORD et al., 2002, 2003). Mais recentemente, Stamford et al. (2007,
2008a) mostraram os efeitos da aplicação conjunta do enxofre
inoculado com Acidithiobacillus em mistura com gesso como condi‐
cionador em solos sódicos, com resultados bastante satisfatórios.
Também foi demonstrado que, com a atuação da bactéria, ocorre
simultaneamente aumento no teor de nutrientes do solo, principal‐
mente cátions trocáveis como potássio, cálcio e magnésio, e no
fósforo disponível para as plantas (EL-TARABILY et al., 2006;
STAMFORD et al., 2007, 2008a).
A formação de H2SO4, momentaneamente, promove redução no
pH, e, em contato com as partículas de fosfato natural, favorece
reações de solubilização de P (EL-TARABILY et al., 2006; HE et al.,
1996; STAMFORD et al., 2005). No Brasil estão sendo
desenvolvidas pesquisas objetivando avaliar o efeito de mistura do
enxofre elementar com rochas fosfáticas (GABER; ABDEL-
MOTAAL, 2005; RICHART et al., 2006; STAMFORD et al., 2004,
2006; STEINER et al., 2009) e com rochas potássicas (LIMA et al.,
2007; MOURA et al., 2007; STAMFORD et al., 2007, 2008b).

2. Técnicas de isolamento de solubilizadores


de minerais
2.1. Isolamento de fungos solubilizadores de minerais

2.1.1. Amostragens dos solos


Na coleta de amostras visando ao isolamento de fungos solubili‐
zadores de minerais, a superfície do solo deve ser limpa,
eliminando-se folhas caídas, detritos e restos de cultura. Retirar
amostras, se possível com auxílio de trado, na profundidade de 0
cm a 20 cm, ou outra profundidade de acordo com o objetivo do
trabalho. Em bandeja, separar raízes, insetos, folhas, etc., peneirar
(peneira com 2 mm de malha), e em seguida armazenar as
amostras à temperatura de 4 ºC, até o momento de utilização, que
deve ser o mais breve possível. O número de repetições das
amostras deve depender do delineamento experimental.

2.1.2. Contagem dos fungos totais e solubilizadores


As amostras devem ser diluídas em série, utilizando-se os
procedimentos mais comuns para contagem de fungos. Alíquotas
dessas diluições são usadas para inocular o meio de cultura (Tabela
1). Há duas opções: 1ª) utilizar meio para contagem e isolamento
dos fungos totais (exemplo, meio de Martin, 1950); e 2ª) meio
específico contendo fosfato insolúvel para contagem dos fungos
totais e solubilizadores. Na 1ª opção, os fungos são isolados em
tubos com meio complexo (por exemplo, Sabouraud ágar, BDA,
batata-dextrose-ágar) e depois inoculados em meio específico
contendo fosfato insolúvel para avaliar a capacidade de
solubilização. Sugere-se o meio descrito por Nahas et al. (1994).

Tabela 1. Meio de cultura para avaliação da atividade de solubilização de fosfatos.

Reagente Quantidade

NaCl 0,1 g

NH4 Cl 1,0 g

KCl 0,2 g

CaCl2.2H2O 0,1 g
MgSO4.7H2O 1,2 g

Glucose 10,0 g

Extrato de levedura 0,5 g

Fonte de P(1) -

Ágar 20 g

H2O (q.s.p.) 1.000 mL


(1)
Para cada 50 mL de meio são colocados 1,5 mL de solução de CaCl2 10% e 1 mL de
solução de K2HPO4 10% (esterilizados separadamente), para produzir um precipitado de
fosfato inorgânico, CaHPO4.

O pH do meio deve ser ajustado para 7,0 antes e após esteri‐


lização. A fonte de P poderá ser substituída por outro tipo de fosfato.
O meio de cultura assim preparado torna-se opaco, como resultado
da adição do fosfato insolúvel ou precipitado.
Diferentes tipos de fosfatos têm sido utilizados no meio de cultura
para investigar a habilidade de solubilização dos fungos. Os mais
genericamente utilizados são os fosfatos de cálcio, incluindo as
apatitas, como fluorapatita, hidroxiapatita, fosfatos de rocha, fosfato
tricálcico [(Ca3(PO4)2], fosfato dicálcico (CaHPO4) e hidroxiapatita
recém-precipitada (ACHAL et al., 2007; MEDINA et al., 2007;
NAHAS et al., 1994; REDDY et al., 2002; WAKELIN et al., 2004).
Além desses, foram utilizados os fosfatos de alumínio e de ferro e
os respectivos minerais (BARROSO; NAHAS, 2006, 2007; CHUN-
CHAO et al., 2007; KANG et al., 2002; REYES et al., 2001).

2.1.3. Observação dos cultivos nas placas


Os fungos são incubados em temperatura que varia de 25 ºC a
30 ºC, dependendo do enfoque do trabalho, por tempo necessário
até observação dos halos de solubilização. Em volta da colônia do
fungo, forma-se uma zona clara onde o fosfato adicionado ao meio é
solubilizado, contrastando com o resto do meio opaco.

2.1.4. Atividade de solubilização


A atividade de solubilização (AS) é determinada pela relação
entre os diâmetros da colônia (Dc) e do halo de solubilização (Ds)
após o crescimento do fungo nas placas. Quanto maior a relação,
maior a AS.

A atividade de solubilização de cada fungo pode ser determinada


utilizando-se meio líquido. Essa determinação tem sido adotada por
inúmeros autores e dá informações do crescimento do fungo e a sua
capacidade de solubilização.
Em linhas gerais, consiste em retirar inóculo do fungo cultivado
em meio sólido e adicionar a um meio líquido. O inóculo pode ser
um volume determinado de uma suspensão com concentração
conhecida de esporos. A incubação do fungo é conduzida em
condições agitadas ou não a determinadas temperaturas e tempos
dependendo das condições estabelecidas no trabalho. O controle
consistirá de meio de cultura não inoculado contendo a mesma
composição e fonte de fósforo do meio inoculado. Após crescimento
do fungo, alíquotas do meio de cultura após filtração serão utilizadas
para determinar a quantidade de fosfato solubilizado, a acidez
titulável e o pH final do meio de cultura (BARROSO; NAHAS, 2005).
O crescimento do fungo pode ser determinado após secagem da
massa de micélio retida na filtração por 24 horas a 105 oC. No meio
de cultura, também podem ser determinados vários parâmetros
como a fonte de C residual, a atividade enzimática, etc. que
possibilitarão conclusões mais acertadas sobre a atividade de
solubilização.

2.2. Isolamento de bactérias oxidantes do enxofre

Os meios mais utilizados para isolamento de bactérias oxidantes


do enxofre são apresentados nas Tabelas 2, 3 e 4.
Tabela 2. Meio SMS (Starkey Mineral Salts) para oxidantes do enxofre.(1)

Reagente Quantidade (g)

K2HPO4 1,0

MgSO4. 7H2O 0,2

FeSO4. 7H2O 0,05

CaCl2 0,02

MnCl2. 4 H2O 0,002

NaMoO4. 2 H2O 0,001

NH4Cl 0,1

S0 ou Na2S203. 7H2O 7,0

Completar para 1.000 mL com água deionizada (ou destilada estéril) e ajustar o pH para
(1)

7,0.
Fonte: Starkey (1935).

Tabela 3. Meio 9K modificado para isolamento de Acidithiobacillus thiooxidans.

Reagente Quantidade

(NH4)2 SO4 3,0 g

KCl 0,1 g

K2HPO4 0,5 g

MgSO4.7. H20 0,5 g

Ca (NO3)2 4H2O 0,01 g

H2SO410N 1,0 mL

Enxofre elementar (sublimado) 10,0 g


Fonte: Garcia Júnior (1991).

Completar para 1.000 mL com água deionizada (ou água desti‐


lada estéril) e ajustar o pH para 1,8. Esterilizar em autoclave. Na
prática deve-se colocar 1 g de enxofre sublimado em microtubos e
autoclavar em separado. Depois de autoclavados (meio e enxofre
sublimado), adicionar 1 g de enxofre para cada 100 mL de meio
(SMS ou 9K). Colocar em agitação por 15 dias.

Tabela 4. Meio 9K modificado para isolamento de Acidithiobacillus ferrooxidans.

Solução (a) fonte de sais

Reagente Quantidade

(NH4)2 SO4 3,0 g

KCl 0,1 g

K2HPO4 0,5 g

MgSO4 7H20 0,5 g

Ca (NO3)2 4H2O 0,01 g

H2SO410N 1,0 mL

H2O 700 mL

Solução (b) fonte de energia

Reagente Quantidade

Sulfato ferroso (FeSO4 7 H2O 44,22 g

H2O 300 mL

Para o preparo da solução (b), pesar 44,22 g de sulfato ferroso,


colocar em balão volumétrico de 300 mL e completar o volume para
300 mL. Homogeneizar até a completa dissolução do sulfato ferroso
e esterilizar por filtração em membrana com porosidade de 0,20 µm.
Para o preparo do meio, usar em mistura 700 mL da solução (a)
(fonte de sais) e 300 mL da solução (b) (fonte de energia). Juntar as
soluções (a) e (b), e com todos os cuidados de assepsia, distribuir
volumes de 10 mL em tubos de ensaio (16 mm x 150 mm), estéreis
e tamponados. Os tubos de ensaio, contendo o meio 9K modificado,
podem ser armazenados sob refrigeração durante o período máximo
de 15 dias.
2.3. Técnicas para isolamento de bactérias oxidantes do
enxofre

2.3.1. Amostragem do solo


Coletar amostras de cada área diferente. Se possível usar 10
amostras, por área. Passar em peneira de 2 mm; enriquecer com
enxofre (em pó, de preferência enxofre sublimado), adicionando 300
g de S elementar por kg de solo. Adicionar água até a retenção
máxima, sem lâmina excessiva. Adição de água correspondente à
umidade equivalente. Análise que poderá ser determinada em
laboratório de física do solo. Incubar as amostras a 30 oC ± 2 oC.
Manter no escuro, visando aumentar a população e a atividade das
bactérias oxidantes do enxofre.
Após 3 semanas, estocar as amostras em recipientes de vidro
esterilizados e identificados ou em sacos de plástico selados e rotu‐
lados (identificados), mantendo a 5 oC et al., até o uso.

2.3.2. Protocolo utilizado para o isolamento


Se possível, usar 5 repetições para cada amostra (10 g de solo
para cada amostra). Colocar em 100 mL de solução, contendo ágar
estéril, de preferência Sigma (1 g/L). Usar água deionizada, e
colocar por amostra 20 g de bolinhas de vidro (glass beads) com
cerca de 3 mm de diâmetro.
Misturar a suspensão de solo (agitação manual), e em seguida
colocar em ultrassonicador, na frequência de 55.000 ciclos/segundo,
durante 20 segundos. Colocar a suspensão de solo em agitador
rotatório (shaker) a 350 rpm (rotações por minuto), por 35 minutos, a
30 oC. Fazer diluições de 10-2 a 10-6, em água deionizada (ou
destilada estéril) e fazer esfregaço (espalhar) ou adicionar alíquotas
de 0,2 mL. Distribuir, com bastão de vidro (estéril), na superfície de
meio mineral (SMS – Ágar) ou (meio 9K agarose) corrigido com
tiosulfato de sódio e azul de bromotimol (pH 1,8). Utilizar placas de
Petri, de preferência de plástico, esterilizadas. Usar 4 placas por
diluição, secar em capela de fluxo laminar por 15 minutos, e incubar
a 30 oC no escuro.

2.3.3. Observações nas placas


Colônias com coloração amarela ao redor e abaixo, em placas
após 10 dias de incubação, devem ser consideradas como colônias
de bactérias oxidantes do enxofre. Estas serão repicadas para
placas com meio SMS – Ágar ou 9K agarose, corrigidas com
tiosulfato de sódio. De preferência, para garantia de purificação,
repicar duas vezes.

3. Uso de microrganismos solubilizadores de


minerais na agricultura

3.1. Produção e eficiência de biofertilizantes de rochas

3.1.1. Biofertilizantes de rochas fosfatadas


O fósforo é o nutriente recomendado em maior proporção nas
adubações de base e talvez seja o fator mais limitante de produtivi‐
dade na maioria das culturas, principalmente em solos tropicais.
Normalmente o fósforo é aplicado como fertilizante solúvel em
doses superiores à extração e à exigência das plantas, e esse fato é
explicado pela rápida reação de adsorção do nutriente com argilas,
óxidos de ferro (Fe) e de alumínio (Al) e compostos orgânicos, além
de reações de precipitação com Ca, Fe e Al (MALAVOLTA et al.,
2002).
O aumento dos teores de P no solo pode ser obtido pela incor‐
poração de fertilizantes minerais ou de matéria orgânica. Os
fertilizantes fosfatados disponíveis no mercado oferecem
concentração de P, na forma de P2O5, normalmente como
superfosfato simples, superfosfato triplo, fosfato monoamônio (MAP)
e fosfato diamônio (DAP).
Os fosfatos naturais apresentam menor eficiência agronômica
em função da baixa solubilidade, principalmente para culturas
anuais; entretanto, pelo baixo custo, pode ser uma alternativa de
substituição a fertilizantes solúveis, principalmente pela liberação
mais gradual, o que minimiza o processo de fixação do fósforo,
principalmente em solos tropicais (STAMFORD et al., 2008).
As rochas fosfáticas de origem ígnea com estrutura cristalina
dura apresentam baixa reatividade, e é o caso da maioria das
rochas nacionais: fosfato natural de Araxá, fosfato natural de Patos,
fosfato natural de Jacutinga e fosfato natural de Catalão. As rochas
fosfáticas de origem sedimentar, conhecidas como fosfatos reativos,
apresentam alta reatividade em função do maior grau de
substituição isomórfica, resultante de cristalização imperfeita da
rocha que confere maior porosidade e facilidade de hidrólise. Como
exemplos, podem ser citados o fosfato natural de Arad (Israel),
Bayovar (Peru), Carolina do Norte (EUA), Djebel Ônk (Argélia),
Gafsa (Tunísia), Daoui (Marrocos), de acordo com Straaten (2002,
2007).
A solubilização dos fosfatos naturais é favorecida quando utili‐
zados em solos ácidos, com pH em água inferior a 6,0. Na presença
de H+, a rocha fosfática moída dissocia-se e libera moléculas de
Ca2+ e fosfato (H2PO4-). Entretanto, Stamford et al. (2007, 2008)
consideram que em função da produção de ácido sulfúrico,
promovida por Acidithiobacillus, a utilização de biofertilizantes de
rochas pode ser mais indicada em solos salinos e/ou sódicos, em
razão da redução do pH do solo e lixiviação de sódio trocável.
Nos trabalhos desenvolvidos no Núcleo de Fixação Biológica do
Nitrogênio nos Trópicos (NFBNT) da Universidade Federal Rural de
Pernambuco (UFRPE), para a produção de biofertilizantes é
utilizado o sistema em laboratório (bandejas) e em escala piloto
(campo). Para a produção em campo, são usados canteiros com 10
m de comprimento, 1 m de largura e profundidade de 0,5 cm.
Adiciona-se 4 t de rocha e 400 kg de enxofre elementar, distribuídos
em 3 camadas com a mesma quantidade dos produtos. Em cada
camada o Acidithiobacillus é adicionado diluindo-se 1.000 mL de
meio (108 UFC) em 10 L de água esterilizada, e pulverizando-se a
camada de rocha e enxofre (20 cm) com um irrigador manual. A
adição de água deve ser feita diariamente, mantendo a umidade
próxima à capacidade de campo. Após 60 dias de incubação para a
produção de biofertilizantes de rochas (fosfatadas e potássicas),
determinou-se pH (H20), P e K disponíveis (Tabela 5).

Tabela 5. Resultados de pH e P disponível nos ensaios em placas de Petri e em bandejas


para os biofertilizantes a partir de rocha fosfatada (apatita de Gafsa) e do superfosfato
triplo (média de 6 repetições).

Incubação em placas de Petri Bandejas

Fonte de P 30 dias 45 dias 60 dias 60 dias pH

----------- P disponível - Mehlich 1 (%) -----------H2O

Fosfato de Gafsa 1,9bA 1,9bA 2,0bA 1,1c 5,4a

Biofertilizante 200 (FN+S) - - - 1,6c 5,2a

Biofertilizante 50 (FN+S*) 6,5aA 7,6aA 7,7aA 4,7b 4,2b

Biofertilizante 100 (FN+S*) 6,1aA 6,5aA 6,5aA 5,5ab 4,1b

Biofertilizante 150 (FN+S*) 5,8aB 5,8aB 7,7aA 6,0a 4,1b

Biofertilizante 200 (FN+S*) 6,1aA 6,5aA 7,0aA 6,1a 4,1b

Superfosfato triplo (SFT) - - - 6,0a 5,0b

C.V. (%) 8,93 7,56 6,78


(FN+S*) = fosfato natural mais enxofre inoculado com Acidithiobacillus. (FN+S) = fosfato
natural mais enxofre sem Acidithiobacillus. Valores seguidos por letras diferentes são
diferentes (Tukey a 5%).

3.1.2. Biofertilizantes de rochas potássicas


Em função dos resultados satisfatórios obtidos em experimentos
realizados para produção de biofertilizantes com rochas fosfatadas,
em seguida foram realizados trabalhos utilizando rocha com
potássio. Os biofertilizantes foram inicialmente produzidos em
laboratório (placas de Petri e bandejas) e posteriormente em campo.
Para a produção de biofertilizante em campo, com rocha fosfatada,
foi usada a apatita de Irecê (Bahia) contendo 28% de P total e 0,1%
de P disponível e biofertilizante com K usando a rocha potássica
biotita xisto de Santa Luzia (Paraíba), com 10% de K total e 0,01%
de K disponível. Os resultados obtidos nos ensaios em placas de
Petri (30, 45 e 60 dias), em bandeja (60 dias) e em campo
encontram-se na Tabela 6.

Tabela 6. pH, P e K disponíveis nos biofertilizantes e nas rochas com P e K (apatita de


Irecê, BA, e biotita de Santa Luzia, PB), nos ensaios em placas de Petri, em bandejas e
no campo após 60 dias de incubação.

pH P disponível K disponível
Ensaio Material usado
(H2O) g/kg

Apatita 5,4 10 -

Biotita 8,8 - 1,0

Biofertilizante P 5,0 60 -
Placa de Petri
Biofertilizante K 3,9 - 3,2

Superfosfato triplo 5,4 67 -

KCl - - -

Apatita 5,4 10 -

Biotita 8,8 - 0,8


Bandeja
Biofertilizante P 4,1 60 -

Biofertilizante K 3,4 - 3,0

Biofertilizante P 3,3 50 -
Campo (canteiros)
Biofertilizante K 3,0 - 1,5

3.2. Produção e eficiência de biofertilizantes orgânicos


Em geral é bastante discutida a definição de fertilizantes e de
adubos, embora existam pontos que permitam a diferenciação entre
os termos. Fertilizantes compreendem produtos que possuem
formulação mais ou menos definida, e os seus componentes
principais são devidamente conhecidos. Podem ser considerados
como adubos produtos que normalmente tendem a aumentar a
produtividade das culturas, mas que não apresentam formulação
definida, ou seja, os seus componentes não são bem conhecidos e,
de uma maneira geral, são passíveis de inúmeras transformações,
principalmente microbianas. Em linhas gerais, pode-se considerar
que todo fertilizante é basicamente um adubo, entretanto os adubos
não devem ser considerados como fertilizantes.
É reconhecido que as fontes de matéria orgânica do solo partici‐
pam no suprimento de nutrientes, e é importante a sua contribuição,
principalmente no aporte de nitrogênio e fósforo liberados pelos
microrganismos. A relação C:P foi considerada por Zaharah e Bah
(1997) como o principal fator que controla a disponibilidade de P no
solo.
A utilização de materiais orgânicos na adubação das plantas
normalmente envolve várias transformações, e nesse aspecto os
microrganismos exercem funções das mais importantes, como a
mineralização da matéria orgânica, que promove a disponibilização
de nutrientes, principalmente nitrogênio, fósforo e potássio e
também alguns micronutrientes, em virtude da produção de ácidos
orgânicos (OBERSON et al., 2001).
Pesquisa realizada por Illmer e Schinner (1995) relatam que,
quando utilizado o fungo solubilizador de fosfatos Penicillium sp. em
um meio com P inorgânico em pH neutro, nenhum dos 24 ácidos
orgânicos avaliados foram produzidos em quantidade apreciável.
Aspergillus niger e Trichoderma viride foram usados por Zayed e
Abdel-Motaal (2005) como ativadores fúngicos na degradação de
estrume de curral usando bagaço enriquecido com rocha fosfática,
não tendo sido observado efeito da inoculação na qualidade do
composto produzido, e os resultados mostraram que a
decomposição não foi completa com até 105 dias de fermentação.
De maneira geral é reconhecido pela maioria dos pesquisadores
que a solubilização de P por fungos é inferior à realizada por
bactérias, em razão de características destes últimos em colonizar
as raízes das plantas (CHUN-CHAO et al., 2007). Os fungos em
geral são mais tolerantes a condições de acidez, o que, em
determinadas situações, podem torná-los mais atuantes na
solubilização de fósforo.

4. Considerações finais

A microbiologia do solo e, em sua plenitude, a biotecnologia


aplicada na agricultura e no ambiente são aspectos da maior impor‐
tância e representam função e papel estratégico na construção de
modelos alternativos de produção agrícola. Por meio de estudos
realizados com essas áreas do conhecimento, são descobertas
condições que possibilitam aumento significativo de linhas de
pesquisa, que permitem o desenvolvimento de novas tecnologias e
processos, para incremento da produção agrícola com bases
sustentáveis.
Em geral, os solos apresentam limitações nas quantidades de
fósforo disponível para satisfazer as necessidades das plantas. Os
microrganismos do solo têm reconhecido potencial em disponibilizar
fosfatos assimiláveis para o crescimento das plantas a partir de
fontes não disponíveis de fósforo. Uma dessas medidas envolve a
utilização de biofertilizantes, isto é, a aplicação de microrganismos
com a finalidade de melhorar a fertilidade do solo e promover o
crescimento das plantas.
É importante conhecer os fatores que influem nos
microrganismos, sua prevalência no solo e sua interação com as
plantas. Considerando a complexidade das interações que ocorrem
no solo, especialmente após a aplicação de biofertilizantes e adubos
orgânicos, fatores de ordem fisiológica e bioquímica devem ser
extensivamente estudados para tornar possível a obtenção de
resultados satisfatórios.
Portanto, a utilização de microrganismos na agricultura depende
do conhecimento sobre sua diversidade, mecanismos de interação
bactéria-planta e da habilidade de manter, manipular e modificar
populações benéficas, principalmente sob condições de campo.
A potencialidade dos microrganismos na agricultura ainda é bas‐
tante incipiente e restrita a alguns poucos grupos, e muitos
problemas para o seu uso são decorrentes da descontinuidade e
fragmentação das pesquisas no Brasil. Assim, torna-se necessária a
adoção de um programa de grande amplitude e sem entraves
metodológicos, o que só poderá ser conseguido com a unidade
entre os diferentes grupos de pesquisa que atuam nas diversas
regiões do País. Para que resultados mais consistentes e amplos
sejam obtidos, são necessárias mais pesquisas com diferentes
microrganismos com o objetivo de atender as individualidades das
diferentes plantas cultivadas.
Visando aos efeitos desejados para a utilização das bactérias e
fungos na biofertilização e na proteção de plantas (bioproteção), a
introdução de bactérias benéficas diretamente no ambiente deve ser
considerada como uma condição desafiadora em virtude dos proble‐
mas de competitividade no ambiente solo e principalmente pela
complexa relação solo-planta-microrganismo.

5. Referências

ACHAL, V.; SAVANTB, V. V.; REDDY, M. S. Phosphate solubilization by a wild type strain
and UV-induced mutants of Aspergillus tubingensis. Soil Biology and Biochemistry, Oxford,
v. 39, p. 695-699, 2007.
AHUJA, A.; GHOSH, S. B.; D’SOUZA, S. F. Isolation of a starch utilizing, phosphate
solubilizing fungus on buffered medium and its characterization. Bioresource Technology,
Essex, v. 98, p. 3408-3411, 2007.
BARROSO, C. B.; NAHAS, E. Solubilization of hardly soluble iron and aluminum
phosphates by the fungus Aspergillus niger in the soil. In: VELÁZQUEZ PEREZ, E.;
RODRÍGUEZ BARRUECO, C. (Ed.). First international meeting on microbial phosphate
solubilization: Salamanca, Spain, 16-19 July 2002. Dordrecht: Springer, 2007. p. 193-198.
(Development in Plant and Soil Sciences, 102).
BARROSO, C. B.; NAHAS, E. Solubilization of iron phosphate by free or immobilized
spores and pellets of Aspergillus niger. Research Journal of Microbiology, New York, v. 1, p.
210-219, 2006.
BARROSO, C. B.; NAHAS, E. The status of soil phosphate fractions and the ability of fungi
to dissolve hardly soluble phosphates. Applied Soil Ecology, Amsterdam, NL, v. 29, p. 73-
83, 2005.
BARROSO, C. B.; PEREIRA, G. T.; NAHAS, E. Solubilization of CaHPO4 and AlPO4 by
Aspergillus niger in culture media with different carbon and nitrogen sources. Brazilian
Journal Microbiology, São Paulo, v. 37, p. 434-438, 2006.
CHUN-CHAO, C.; YU-LIN, K.; CHEN-CHING, C.; WEI-LIANG, C. Solubilization of inorganic
phosphates and plant growth promotion by Aspergillus niger. Biology and Fertility of Soils,
Berlin, DE, v. 43, p. 575-584, 2007.
El-TARABILY, K. A.; SOAUD, A. A.; SALEH, M. E.; MATSUMOTO, S. Isolation and
characterization of sulfur-bacteria, including strains of Rhizobium from calcareous soils and
their effects on nutrient uptake and growth of maize (Zea mays L.). Australian Journal
Agricultural Research, Melbourne, v. 57, p. 101-111, 2006.
FRANZLUEBBERS, A. J.; STUEDEMANN, J. A.; WILKINSON, S. R. Bermudagrass
management in the southern Piedmont USA: II. Soil phosphorus. Soil Science Society of
American Journal, Madison, v. 66, p. 291-298, 2002.
GABER, Z.; ABDEL-MOTAAL, H. Bio-production of compost with low pH and high soluble
phosphorus from sugar cane bagasse enriched with rock phosphate. World Journal of
Microbiology and Biotechnology, Oxford, v. 21, p. 747-752, 2005.
GARCIA JÚNIOR, O. Isolation and characterization of Thiobacillus thiooxidans and
Thiobacillus ferrooxidans from mineral mines. Revista Brasileira de Microbiologia, São
Paulo, v. 20, p. 1-5, 1991.
GARCIA JÚNIOR, O. O enxofre e suas transformações microbianas. In: CARDOSO, E.;
SAITO, M. T.; NEVES, M. C. P. Microbiologia do solo. Campinas: SBCS, 1992. p. 243-255.
GARCIA JÚNIOR, O.; BEVILAQUA, D. Microrganismos, minerais e metais. In: MELO, I. S.;
AZEVEDO, J. L. (Org.). Microbiologia ambiental. 2. ed. Jaguariúna: Embrapa Meio
Ambiente, 2008. v. 1, p. 49-82.
HE, Z. L.; BALIGAR, V. C.; MARTENS, D. C.; RITCHEY, K. D.; KEMPER, W. D. Factors
affecting phosphate rock dissolution in acid soil amended with liming materials and
cellulose. Soil Science Society of American Journal, Madison, v. 60, p. 1596-1601, 1996.
ILLMER, P.; SCHINNER, F. Solubilization of inorganic calcium phosphates-solubilization
mechanisms. Soil Biological and Biochemistry, Oxford, v. 27, p. 257-263, 1995.
KANG, S. C.; CHUL, G. H.; TAE, G. L.; MAHESHWARI, D. K. Solubilization of insoluble
inorganic phosphates by a soil-inhabiting fungus Fomitopsis sp. PS 102. Current Science,
Bangalore, v. 82, p. 439-442, 2002.
LIMA, R. C. M.; STAMFORD, N. P.; SANTOS, C. E. R. S.; DIAS, S. H. L. Rendimento da
alface e atributos químicos de um Latossolo em função da aplicação de biofertilizantes de
rochas com fósforo e potássio. Horticultura Brasileira, Brasília, DF, v. 25, p. 224-229, 2007.
MALAVOLTA, E.; PIMENTEL-GOMES, F.; ALCARDE, J. C. Adubos e adubações. São Paulo:
Nobel, 2002. 200 p.
MEDINA, A.; JAKOBSEN, I.; VASSILEV, N.; AZCÓN, R.; LARSEN, J. Fermentation of
sugar beet by Aspergillus niger facilitates growth and P uptake of external mycelium of
mixed populations of arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v.
39, p. 485-492, 2007.
MOURA, P. M.; STAMFORD, N. P.; DUENHAS, L. H.; SANTOS, C. E. R. S.; NUNES, G. H.
S. Eficiência de biofertilizantes de rochas em melão no Vale do São Francisco. Revista
Brasileira de Ciências Agrárias, Recife, v. 2, p. 1-7, 2007.
NAHAS, E. Phosphate solubilizing microorganisms: effect of carbon, nitrogen, and
phosphorus sources. In: VELÁZQUEZ-PEREZ, E.; RODRÍGUEZ-BARRUECO, C. (Ed.).
First international meeting on microbial phosphate solubilization: Salamanca, Spain, 16-19
July 2002. Dordrecht: Springer, 2007. p. 111-115. (Development in Plant and Soil Sciences,
102).
NAHAS, E. Solubilização microbiana de fosfatos e de outros elementos. In: SIQUEIRA, J.
O.; MOREIRA, F. M. S.; LOPES, A. S.; GUILHERME, L. R. G.; FAGUIEN, U.; FURTINI
NETO, A. E.; CARVALHO, J. G. (Ed.). Inter-relação fertilidade, biologia do solo e nutrição de
plantas. Viçosa: SBCS, 1999. p. 467-486.
NAHAS, E.; CENTURION, J. F.; ASSIS, L. C. Microrganismos solubilizadores de fosfato e
produtores de fosfatases de vários solos. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Campinas, v.
18, p. 43-48, 1994.
NARLOCH, C.; OLIVEIRA, V. L.; ANJOS, J. T.; SILVA FILHO, G. N. Resposta da cultura do
rabanete à inoculação de fungos solubilizadores de fosfatos. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, Brasília, DF, v. 37, p. 841-845, 2002.
OBERSON, A.; FRIESEN, D. K.; RAO, I. M.; BÜHLER, S.; FROSSARD, E. Phosphorus
transformations in an oxisol under contrasting land-use systems: the role of the soil
microbial biomass. Plant and Soil, The Hague, v. 237, p. 197-210, 2001.
REDDY, M. S.; KUMAR, S.; BABITA, K.; REDDY, M. S. Biosolubilization of poorly soluble
rock phosphates by Aspergillus tubingensis and Aspergillus niger. Bioresource Technology,
Essex, v. 84, p. 187-189, 2002.
REYES, I.; BAZIRAMAKENGA, R.; BERNIER, L.; ANTOUN, H. Solubilization of phosphate
rocks and minerals by a wild-type strain and two UV-induced mutants of Penicillium
rugulosum. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 33, p. 1741-1747, 2001.
REYES, I.; VALERY, A.; VALDUZ, Z. Phosphate-solubilizing microorganisms isolated from
rhizospheric and bulk soils of colonizer plants at an abandoned rock phosphate mine. Plant
and Soil, The Hague, v. 287, p. 69-75, 2006.
RICHART, A.; LANA, M. C.; SCHULZ, L. R.; BERTONI, J. C.; BRACCINI, A. L.
Disponibilidade de fósforo e enxofre para a cultura da soja e produção de biomassa da
aveia na presença de fosfato natural reativo, superfosfato triplo e enxofre elementar.
Revista Brasileira de Ciência do Solo, Viçosa, v. 30, p. 695-705, 2006.
SILVA FILHO, G. N.; NARLOCH, C.; SCHARF, R. Solubilização de fosfatos naturais por
microrganismos isolados de cultivo de Pinus e Eucalyptus de Santa Catarina. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 37, p. 847-854, 2002.
STAMFORD, N. P.; FREITAS, A. D. S.; FERRAZ, D. S.; SANTOS, C. E. R. S. Effect of
sulphur inoculated with Thiobacillus on saline soils amendment and growth of cowpea and
yam bean legumes. Journal of Agricultural Science, Cambridge, v. 139, p. 275-281, 2002.
STAMFORD, N. P.; FREITAS, A. D. S.; SANTOS, C. E. R. S.; FERRAZ, D. S.;
MONTENEGRO, A. Nitrogen fixation and growth of cowpea and yam bean in a sodic soil as
affected by gypsum and sulphur inoculated with Thiobacillus and rhizobia. Tropical
Grasslands, Brisbane, v. 37, p. 11-17, 2003.
STAMFORD, N. P.; LIMA, R. A.; LIRA, M. A.; SANTOS, C. E. R. S. Effectiveness of
phosphate and potash rocks with Acidithiobacillus on sugarcane yield and their effects in
soil chemical attributes. World Journal of Microbiology and Biotechnology, Oxford, v. 24, p.
2061-2066, 2008a.
STAMFORD, N. P.; RIBEIRO, M. R.; FREITAS, A. D. S.; CUNHA, K. P. V.; SANTOS, C. E.
R. S.; DIAS, H. L. Effectiveness of sulfur with Acidithiobacillus and gypsum in chemical
attributes of a Brazilian sodic soil. World Journal of Microbiology and Biotechnology, Oxford,
v. 3, p. 1433-1439, 2007.
STAMFORD, N. P.; SANTOS, C. E. R. S.; SANTOS, P. R.; SANTOS, K. S. R.;
MONTENEGRO, A. Effects of rock phosphate, sulphur with and without Acidithiobacillus
and organic byproducts on mimosa (Mimosa caesalpiniifolia) grown in a Brazilian tableland
soil. Tropical Grasslands, Brisbane, v. 39, p. 54-61, 2005.
STAMFORD, N. P.; SANTOS, C. E. R. S.; SILVA JÚNIOR, S.; LIMA, R. A.; FIGUEIREDO,
M. V. B. Effects of rhizobia and rock biofertilizers with Acidithiobacillus on cowpea
nodulation and nutrient uptake in a tableland soil. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, Oxford, v. 23, p. 261-265, 2008b.
STAMFORD, N. P.; SANTOS, C. E. R. S.; STAMFORD JÚNIOR, W. P.; DIAS, S. L.
Biofertilizantes de rocha fosfatada com Acidithiobacillus como adubação alternativa de
caupi em solo com baixo P disponível. Revista Analítica, São Paulo, v. 3, n. 9, p. 48-53,
2004.
STAMFORD, N. P.; SANTOS, P. R.; SANTOS, C. E. R. S.; FREITAS, A. D. S.; DIAS, S. H.
L.; LIRA JÚNIOR, M. A. Agronomic effectiveness of biofertilizers with phosphate rock,
sulphur and Acidithiobacillus, for yam bean grown on a Brazilian tableland acidic soil.
Bioresource Technology, Essex, v. 98, p. 1311-1318, 2006.
STARKEY, R. Isolation of some bactéria which oxidize thiosulphate. Soil Science, Baltimore,
v. 39, p. 197-219, 1935.
STEINER, F.; LANA, M. C.; FRANDOLOSO, J. F.; FEY, R. Fosfato de Gafsa e fungos
solubilizadores de fosfato e seus efeitos na cultura do trigo. Cultivando o Saber, v. 2, p. 156-
164, 2009.
STRAATEN, P. van. Agrogeology: the use of rocks for crops. Cambridge: Enviroquest, 2007.
440 p.
STRAATEN, P. van. Rocks for crops: agrominerals of Sub-Saharan Africa. Nairobi, KE:
ICRAF, 2002.
SYLVIA, D. M.; HARTEL, P. G.; FUHRMANN, J. J.; ZUBERER, D. A. Principles and
applications of soil microbiology. New Jersey: Pearson Prentice Hall, 2005. 640 p.
VASSILEV, N.; MEDINA, A.; AZCÓN, R.; VASSILEVA, M. Microbial solubilization of rock
phosphate on media containing agro-industrial wastes and effect of the resulting products
on plant growth and P uptake. Plant and Soil, The Hague, v. 287, p. 77-84, 2006.
WAKELIN, S. A.; WARREN, R. A.; HARVEY, P. R.; RYDER, M. H. Phosphate solubilization
by Penicillium spp. closely associated with wheat roots. Biology and Fertility of Soils, Berlin,
DE, v. 40, p. 36-43, 2004.
WHITELAW, M. A.; HARDEN, T. J.; HELYAR, K. R. Phosphate solubilization in solution
culture by the soil fungus Penicillium radicum. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 32,
p. 655-665, 1999.
ZAHARAH, A. R.; BAH, A. R. Effect of green manures on P solubilization and uptake from
phosphate rocks. Nutrient Cycling in Agroecosystems, Dordrecht, v. 48, p. 247-255, 1997.
ZAYED, G.; ABDEL-MOTAAL, H. Bio-active composts from rice straw enriched with rock
phosphate and their effect on the phosphorous nutrition and microbial community in
rhizosphere of cowpea. Bioresource and Technology, Essex, v. 96, p. 929-935, 2005.
Capítulo 9
Determinação da biomassa
microbiana do solo
Ademir Sérgio Ferreira de Araújo
Valdinar Bezerra dos Santos
Wanderley José de Melo
Philip C. Brookes

1. Introdução

A biomassa microbiana do solo (BMS) é definida como o com‐


ponente vivo da matéria orgânica excluindo a macrofauna e as
raízes das plantas. A proporção presente de células microbianas
vivas contendo C (C-microbiano, em mg/kg de solo) geralmente
compreende de 1% a 5% do carbono orgânico total (COT),
enquanto que para o N (N-microbiano, em mg/kg de solo)
compreende de 1% a 6% do nitrogênio total (NT) (JENKINSON;
LADD, 1981).
A BMS é um dos componentes que controlam funções chaves no
solo como a decomposição, o acúmulo de resíduos orgânicos e as
transformações envolvendo a mineralização da matéria orgânica (Fi‐
gura 1). Representa, ainda, uma reserva considerável de nutrientes
(N, P e S), os quais são continuamente assimilados durante os
ciclos de crescimento dos diferentes organismos que compõem o
ecossistema. A BMS é considerada importante fonte e dreno de
nutrientes no solo, ora promovendo a mineralização de compostos
orgânicos em substâncias minerais solúveis ou gasosas (NH4+, NO3-,
H2PO4-, SO42-, CO2) e a consequente liberação de nutrientes, ora
imobilizando-os em sua biomassa para sua manutenção e
crescimento (CERRI et al., 1992). Consequentemente, os solos que
mantêm um alto conteúdo de BMS são capazes não somente de
estocar, mas também de ciclar mais ativamente nutrientes no
sistema (GREGORICH et al., 1994).
Figura 1. A função da biomassa microbiana do solo na ciclagem de nutrientes.
Fonte: adaptado de Brookes (2001).

A atividade da BMS é, geralmente, avaliada pela respiração do


solo (ALEF, 1995), que é a oxidação biológica da matéria orgânica a
CO2 pelos microrganismos aeróbios, e ocupa uma posição chave no
ciclo do carbono nos ecossistemas terrestres. A combinação das
medidas da BMS e a respiração do solo fornecem a quantidade de
CO2 evoluída por unidade de biomassa, denominada quociente
metabólico ou respiratório (qCO2). O qCO2 indica a eficiência da
biomassa microbiana em utilizar o carbono disponível para
biossíntese, sendo sensível indicador para estimar a atividade
biológica e a qualidade do substrato.
A BMS pode ser avaliada por métodos diretos e indiretos. Os
métodos diretos envolvem a microscopia dos componentes da
biomassa microbiana (bactérias e fungos). A microscopia é o
método mais antigo e vem sendo substituído, ultimamente, por
métodos indiretos. Os métodos indiretos para determinação da
biomassa microbiana são a fumigação-extração, fumigação-
incubação e a respiração induzida pelo substrato. Recentemente,
tem se utilizado a quantidade de ácidos graxos ligados a ésteres de
fosfolipídios (PFLAs) em solo como um método alternativo de
determinação da biomassa microbiana (BLOEM; BREURE, 2002).
PFLAs são encontrados em membranas de bactérias e fungos e,
após extração de amostras de solo, podem ser quantificados por
cromatografia gasosa (ZELLES, 1999). A técnica de PFLAs pode,
ainda, fornecer informações sobre a biodiversidade e a razão entre
a biomassa fúngica e bacteriana.

2. Amostragem do solo e pré-tratamento das


amostras
A correta amostragem do solo é vital para obtenção de resulta‐
dos satisfatórios sobre a biomassa e atividade microbiana do solo.
Esse passo, geralmente, é realizado de forma errada e ocasiona,
com frequência, falhas nos resultados das análises. O solo, para
estudos microbiológicos, normalmente é coletado na profundidade
de 0 cm a 20 cm (camada arável) em solos agrícolas e de 0 cm a 10
cm em solos de florestas ou pastagens. As amostras de solo devem
ser tomadas ao acaso em uma área homogênea e representativa
quanto à textura e ao tipo de solo, manejo, tipo de vegetação, às
características ambientais, observando-se a topografia,
profundidade do solo, densidade, presença de pedras, umidade, etc.
Usar um trado ou uma pá para a amostragem, e, dependendo do
objetivo do trabalho, o trado é um equipamento mais adequado. Os
pontos de coleta devem estar distribuídos ao acaso na área,
garantindo uma amostragem significativa. Recomenda-se coletar, no
mínimo, 20% mais solo do que irá realmente utilizar durante as
análises.
Durante a amostragem, devem-se eliminar restos de plantas,
insetos ou resíduos orgânicos que se encontram na superfície do
solo. Em caso de encontrar o solo muito úmido ou encharcado,
pode-se planejar outra ocasião para a amostragem. Caso contrário,
pode-se coletar o solo úmido e proceder a secagem
cuidadosamente, sem permitir que o solo seque totalmente. O ideal
é que o solo apresente umidade por volta de 40% da capacidade de
campo.
A amostra deve ser colocada em sacos plásticos (insira uma
folha de papel toalha dobrada no topo do saco e amarre com
elástico, para permitir as trocas gasosas) e transportadas do campo
até o laboratório sob temperatura baixa (4 oC) utilizando caixas
térmicas com gelo.
No laboratório, as amostras de solo devem ser peneiradas (2 mm
de malha) e armazenadas, a 4 ºC, até o uso. Devem-se utilizar as
amostras o mais rápido possível. Caso seja necessário armazena‐
mento da amostra, este não deve ultrapassar três meses.
Após o período de armazenamento e antes de iniciar as análises,
devem-se deixar as amostras em um período de pré-incubação para
que sejam normalizados os processos biológicos do solo
(STENBERG et al., 1998). A pré-incubação deve ser feita com o
solo com umidade ajustada de 40% a 60% da capacidade de campo
(CC) utilizando-se água deionizada. Deixa-se a amostra de solo
incubada por uma semana (25 oC) e após esse período ela está
pronta para análise.

2.1. Determinação da umidade (U) e capacidade de


campo (CC)

Na determinação da umidade, subamostras de solo de no míni‐


mo 10 g são pesadas, colocadas em recipientes tarados e levadas
para secar em estufa à temperatura de 105 oC por 24 horas, em 3
repetições. Após esse período, os recipientes com as subamostras
são colocadas em dessecador e em seguida são pesados. A
umidade é determinada, em porcentagem, pela diferença das
massas do solo antes e após a secagem em estufa.

em que
MSU = massa do solo úmido (g); MSS = massa do solo seco (g);
100 = fator para transformação em porcentagem.
Na determinação da capacidade de campo (CC), subamostra de
20 g de solo com umidade natural, em triplicata, deve ser colocada
sobre papel de filtro acondicionado em funil e montado sobre um
frasco coletor previamente pesado. Adicionam-se, lentamente, 100 g
de água deionizada pesada em balança analítica e deixa-se por
uma noite. Cobrir o conjunto com papel alumínio ou filme plástico,
para evitar evaporação. Após esse período, dar uma pequena batida
na haste do funil para liberar as últimas gotas de água. Pesar
novamente o frasco coletor. A testemunha (sem solo), em triplicata,
deve ser procedida da mesma forma.

em que
CC = capacidade de campo (%); MAP = massa da água percolada
(g); U = umidade inicial do solo (%); MSS = massa do solo seco (g);
100 = fator para transformação em porcentagem.

3. Determinação da biomassa microbiana do


solo (BMS)

3.1. Método da fumigação-incubação (JENKINSON;


POWLSON, 1976)

3.1.1. Princípio
A fumigação-incubação foi o método pioneiro de quantificação da
BMS. O método consiste na fumigação do solo com clorofórmio
(CHCl3) causando um fluxo de CO2 e NH4 após a remoção do
fumigante e posterior incubação do solo. O fluxo é gerado pela
decomposição dos microrganismos mortos pela fumigação.

3.1.2. Metodologia
A amostra de solo é dividida em subamostras, em três repeti‐
ções, que passarão por fumigação seguida por incubação
(subamostra fumigada) ou incubação imediata (subamostra não
fumigada). O procedimento consiste na fumigação das subamostras,
por 24 horas, com clorofórmio isento de etanol. Acondicionam-se 25
g de solo em frasco (capacidade de 60 mL a 100 mL), sendo, em
seguida, transferidos para dessecador juntamente com um frasco
com água e um outro contendo 25 mL de clorofórmio isento de
etanol, permanecendo sob fumigação em sala de incubação
mantida no escuro, com temperatura controlada (25 ºC a 28 ºC), por
24 horas. Em seguida, o clorofórmio é removido por aspirações
sucessivas, aproximadamente 6 aspirações.

3.1.3. Determinação do C da BMS


(Cmic) pela técnica da fumigação-incubação
Após a fumigação e a retirada do clorofórmio, o solo fumigado é,
normalmente, reinoculado com uma pequena subamostra de solo,
geralmente em uma relação de peso de 1:9, inóculo:solo fumigado.
Em seguida, as amostras fumigadas e não fumigadas (controle) são
incubadas a 25 oC em jarros herméticos de 1 L a 2 L, juntamente
com 10 mL a 20 mL de hidróxido de sódio (NaOH), em
concentrações que podem variar de 0,05 mol/L a 1,0 mol/L. O CO2
liberado é medido por titulação do NaOH residual com ácido
clorídrico (HCl), em concentrações que podem variar de 0,05 mol/L
a 1,0 mol/L, após precipitação do carbonato com o cloreto de bário
(BaCl2), usando fenolftaleína como indicador. O carbono fumigado e
o não fumigado são calculados, respectivamente.
em que
CO2 F = CO2 liberado das amostras fumigadas (mgCO2/g solo/dia);
CO2 NF = CO2 liberado das amostras não fumigadas (mgCO2/g
solo/dia); B = volume de HCl consumido pelas provas em branco
(mL); F = volume de HCl consumido pelas amostras fumigadas
(mL); NF = volume de HCl consumido pelas amostras não
fumigadas (mL); N = normalidade padronizada do HCl (mol/L); 22 =
fator de correção para CO2; MSS = massa do solo seco (g).
O Cmicrobiano é calculado pela equação 5:

em que
Cmicrobiano = carbono da biomassa microbiana (µg/g); CO2 F = CO2
liberado das amostras fumigadas (mg CO2/g solo/dia); CO2 NF =
CO2 liberado das amostras não fumigadas (mg CO2/g solo/dia); KIC =
0,41 (constante de incubação a 22 oC); KIC = 0,45 (constante de
incubação a 25 oC).

3.2. Método da fumigação-extração (VANCE et al., 1987)

3.2.1. Princípio
A fumigação do solo com clorofórmio promove a lise celular dos
microrganismos com consequente liberação do citoplasma para o
ambiente. Assim, o C, N e P podem ser extraídos por K2SO4 e
quantificados, estimando o C, N e P da BMS.

3.2.2. Metodologia
A amostra de solo é dividida em subamostras, em três repeti‐
ções, que passarão por fumigação seguida de extração (subamostra
fumigada) ou extração imediata (subamostra não fumigada). O
procedimento consiste na fumigação das subamostras, por 24
horas, com clorofórmio isento de etanol. Acondicionam-se 20 g de
solo em frasco (capacidade de 60 mL a 100 mL), sendo, em
seguida, transferidos para dessecador juntamente com um frasco
com água e um outro contendo 25 mL de clorofórmio isento de
etanol, permanecendo sob fumigação em sala de incubação
mantida no escuro, com temperatura controlada de 25 ºC a 28 ºC,
por 24 horas. Em seguida, o clorofórmio é removido por aspirações
sucessivas (aproximadamente 6 aspirações).
As amostras fumigadas e não fumigadas são submetidas à
extração com 80 mL K2SO4 0,5 mol/L por 30 minutos, em agitador
rotatório circular. Deve-se observar que a proporção solo:extrator
deve ser 1:4. Deixar decantar e filtrar em papel de filtro. O extrato
pode ser armazenado em refrigerador por, no máximo, uma
semana. Entretanto, o ideal é que seja quantificado logo após a
extração.

3.2.2.1. Reagente para extração


K2SO4 0,5 mol/L – pesar 87,13 g de K2SO4, transferir para um
becker de 1.000 mL e dissolver em ± 700 mL de água destilada.
Transferir para um balão volumétrico de 1.000 mL e completar o
volume com água destilada. O pH deve ser ajustado para 6,5 a 6,8
(com NaOH 1 mol/L ou H2SO4 a 20%).

3.2.3. Determinação do C da BMS (Cmic) pela técnica da


fumigação-extração
A determinação do C nos extratos fumigados e não fumigados é
feita utilizando-se de 10 mL a 20 mL do extrato e adicionando-se,
em seguida, 2 mL de K2Cr2O7 (0,066 mol/L), 10 mL de H2SO4
concentrado e 5 mL de H3PO4 concentrado. Após o resfriamento,
adicionam-se 50 mL de água deionizada. Adicionar 3 gotas de
indicador ferroin e titular com [(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O 0,04 mol/L)].
A padronização do (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O é feita utilizando-se os
valores das provas em branco.

em que
Npadronizada = normalidade padronizada do sulfato ferroso amoniacal;
Vdicromato = volume do dicromato de potássio usado (2 mL); Cdicromato =
concentração do dicromato de potássio usada (0,066 mol/L); Vgasto =
volume do sulfato ferroso gasto na prova em branco (L).
O C extraído do solo é calculado pela equação 7.

em que
C extratos F e NF = carbono dos extratos fumigados e não
fumigados (ug/g); Vbranco = volume do (NH4)2Fe(SO4)2 gasto na
titulação da solução controle (branco) (mL); Vamostra = volume do
(NH4)2Fe(SO4)2 gasto na titulação da amostra (mL); N = normalidade
padronizada do (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O (calculada na equação 6);
Vextrator = volume do extrator (mL); Vextrato = volume do extrato (mL);
MSS = massa de solo seco (g).
O Cmic é calculado pela equação 8.

em que
Cmic = carbono microbiano (μg/g); C extrato F = carbono do extrato
fumigado (μg/g); C extrato NF = carbono do extrato não fumigado (μg/g);
KEC = constante proposta por 0,38.
É recomendado que o volume gasto de sulfato ferroso amoniacal
na titulação das amostras fumigadas e não fumigadas esteja entre
10% e 75% do valor do branco, conforme equação.

3.2.3.1. Reagentes para Cmic


Dicromato de potássio (K2Cr2O7) 0,066 mol/L – pesar 19,62 g de
dicromato de potássio seco em estufa por 2 horas a 105 oC,
transferir para um becker de 1.000 mL e dissolver em 500 mL de
água destilada. Transferir para um balão volumétrico de 1.000 mL e
completar o volume com água destilada.
Sulfato ferroso amoniacal [(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O] 0,040 mol/L –
pesar 15,68 g de sulfato ferroso amoniacal, transferir para um
becker de 100 mL e adicionar com cuidado 10 mL de H2SO4
concentrado e com um bastão de vidro agitar para dissolver
completamente. Após esfriar, transferir todo o conteúdo do becker
para um balão de 1.000 mL e completar o volume com água
destilada.
Indicador Ferroin – pesar 1,48 g de o-fenantrolina, 0,695 g de
sulfato ferroso hepta-hidratado, transferir para um becker de 100 mL
e dissolver em ± 70 mL de água destilada. Transferir todo o
conteúdo do becker para um balão de 100 mL e completar o volume
com água destilada.

3.2.4. Determinação do N da BMS (Nmic) pela técnica da


fumigação-extração
O mesmo extrato de solo utilizado para determinação do Cmic
pode ser utilizado para determinação do Nmic. Nesse caso, utilizam-
se 20 mL do extrato e adicionam-se em tubos de digestão de 100
mL. Em seguida adicionam-se 0,7 g da mistura digestora e 5 mL de
H2SO4. Colocar os tubos em um bloco digestor e aquecê-lo
cuidadosamente até a temperatura de 360 oC, de forma que o
conteúdo do frasco fique claro, depois deixar em ebulição (cerca de
360 oC) por 2 horas.
Devem-se cobrir os tubos com um pequeno funil de vidro
(diâmetro de 25 mm). Para evitar perda do extrato, a temperatura do
bloco deve ser regulada de modo que o H2SO4 se condense a uma
altura de cerca de 1/3 do tubo digestor. Sugerimos a Tabela 1 como
recomendação para aumento regulado da temperatura do bloco
digestor.

Tabela 1. Recomendação para aumento regulado da temperatura do bloco digestor.

Tempo Aumento regulado

Até a 1a h Elevar a temperatura para 120 oC

Após a 1a h Elevar a temperatura para 180 oC

Após a 2a h Elevar a temperatura para 250 oC

Após a 3a h Elevar a temperatura para 360 oC


Após esse período, espera o resfriamento dos tubos e adicio‐
nam-se 10 mL de água. A destilação do N é realizada
acrescentando-se 20 mL de NaOH 10 mol/L aos tubos. O destilado
é coletado em 5 mL de ácido bórico a 2% e titulado com HCl 0,1
mol/L. O nitrogênio presente na BMS é calculado pela equação:

em que
N extrato F e NF = nitrogênio microbiano (μg/g); Vamostra = volume do HCl
gasto na titulação da amostra (mL); Vbranco = volume do HCl gasto na
titulação da solução controle (branco) (mL); N = normalidade
padronizada do HCl; 14 = massa do nitrogênio (g); 1.000 = fator
para conversão em micrograma; Vextrator = volume do extrator (L);
Vextrato = volume do extrato (L); MSS = massa de solo seco (g).
O Nmic é calculado pela equação 11:

em que
Nmic = nitrogênio microbiano (μg/g); Nextrato fumigado = nitrogênio do
extrato fumigado (μg/g); Nextrato não fumigado = nitrogênio do extrato não
fumigado (μg/g); KEN = 0,45.

3.2.4.1. Reagentes para Nmic


Mistura digestora – moer em almofariz separadamente 100 g de
K2SO4 seco em estufa a 105 oC, 10 g de CuSO4.5H2O e 1 g de
selênio (metálico).
Ácido bórico a 2% – pesar e dissolver 20 g de ácido bórico, em
becker de 500 mL, com água destilada quente. Deixar esfriar
(solução 1). Pesar e dissolver 0,660 g de verde de bromocresol e
0,330 g de vermelho de metila em 1.000 mL de etanol 95% (solução
2). Transferir a solução 1 para balão de 1.000 mL e adicionar 20 mL
da solução 2. Misturar a solução e completar o volume para 1.000
mL com água deionizada.

3.2.5. Determinação do P da BMS (Pmic)


O P da biomassa microbiana do solo (Pmic) pode ser determinado
pelo método proposto por Brookes et al. (1982). O Pmic é calculado
pela diferença entre o P extraído, utilizando reagente de Olsen, de
um solo fumigado e outro não fumigado. A determinação do P
inorgânico é realizada por colorimetria (MURPHY; RILEY, 1962).

3.2.5.1. Extração do solo


Para cada solo, amostra fumigada e não fumigada, 200 mL do
reagente de Olsen são adicionados a 9 frascos de 250 mL, devida‐
mente numerados. Adicionar 1 mL de água em cada frasco e em
seguida 1 mL de KH2PO4 (250 µg P/mL). As amostras são agitadas
por 30 minutos a 150 rpm, sendo em seguida filtradas (Whatman 42)
em plásticos limpos.

3.2.5.2. Procedimento
Adicionar 1 mL de ácido clorídrico (5 mol/L) a 10 mL de água, em
frasco volumétrico. Em seguida, 10 mL do extrato de solo extraído
por Olsen ou o branco, apenas o reagente de Olsen, são
adicionados ao frasco. Após cessar a efervescência do conteúdo no
frasco, adicionar 8 mL do reagente de Murphy-Riley e misturar. Após
cessar a efervescência do conteúdo no frasco, o volume é ajustado
para 100 mL. A leitura é feita em espectrofotômetro a 710 nm ou
882 nm.
O Pmic é calculado pela equação a seguir.

P mic = nitrogênio microbiano (μg g-1); P extrato fumigado = fósforo do


extrato fumigado (μg/g); P extrato não fumigado = fósforo do extrato não
fumigado (μg/g); KP = 0,40 (constante para conversão de P em Pmic);
R = porcentagem de recuperação da curva para P.

3.2.5.3. Reagentes para Pmic


Reagente de Olsen, 0,5 mol/L – pesar 420 g de NaHCO3 em
aproximadamente 9 L de água. Dissolver 7,2 g de NaOH, em água,
e adicionar ao volume anterior. Ajustar o pH para 8,5, com NaOH 10
mol/L, e completar o volume para 10 L.
Solução padrão de P – transferir 1,0975 g de KH2PO4 para balão
de 1.000 mL e ajustar o volume com água. Esta solução tem con‐
centração de 250 μg/mL.
Molibdato de amônio – pesar 40 g de (NH4)6MO7O24.4H2O e
dissolver em 900 mL de água e ajustar o volume para 1 L.
Tartarato de potássio e antimônio – pesar 1,454 g de
KSbO.C4H4O6 e dissolver em 450 mL de água.
Ácido ascórbico – dissolver 26,4 g de C6H8O6 em 1 L de água
(preparar antes da análise).
Ácido sulfúrico 2,5 mol/L – aproximadamente 1,5 L de água são
colocados em um balão e adicionados, lentamente, 278 mL de
H2SO4, misturando cuidadosamente. Ajustar o volume para 2 L.
Reagente de Murphy-Riley – adicionar 250 mL de ácido sulfúrico
juntamente com 75 mL de molibdato de amônio. Em seguida,
adicionar 50 mL de ácido ascórbico e misturar. Adicionar 25 mL de
tartarato de potássio e antimônio. Finalmente, ajustar o volume para
500 mL com água.
Solução padrão contendo 40 mg P/L – dissolver 0,1757 g de
KH2PO4 em 900 mL de água e completar o volume para 1 L. Esta
solução pode ser diluída para 5 µg/L, 10 µg/L, 25 µg/L, 50 µg/L, 75
µg/L, 100 µg/L.

3.3. Determinação da BMS pela técnica dos compostos


reativos à ninidrina (JOERGENSEN; BROOKES, 1990)

3.3.1. Princípio
Ninidrina forma um complexo púrpuro com moléculas contendo
aminoácidos, proteínas e peptídeos. A quantidade de compostos
reativos com a ninidrina, liberados pela BMS após a fumigação, é
fortemente correlacionada com o conteúdo de C da biomassa micro‐
biana (AMATO; LADD, 1988).

3.3.2. Metodologia
Utilizando o extrato de solo após a extração com K2SO4, retira-se
uma alíquota de 0,6 mL do extrato + 1,4 mL de ácido cítrico (0,2
mol/L), pH 5,0, e adiciona-se em tubo de ensaio de 20 mL. Em
seguida, adiciona-se, lentamente, 1 mL de reagente ninidrina. O
tubo é incubado a 100 oC, em banho-maria, por 25 minutos. Após
resfriamento, adiciona-se 4 mL da mistura etanol:água (1:1) e
procede-se a leitura em espectrofotômetro a 570 nm. Os resultados
são comparados a uma curva padrão de leucina.
Cálculos:
em que
N-ninF = quantidade de compostos reativos à ninidrina (µg/g solo) na
amostra fumigada; N-ninNF = quantidade de compostos reativos à
ninidrina (µg/g solo) na amostra não fumigada; 20,5 = fator de
correção para Cmic; 6,5 = fator de correção para Nmic.

3.3.3. Reagentes para Nnin


Reagente ninidrina – pesar 2 g de ninidrina + 0,3 g de hydrinda‐
tina e dissolver em 75 mL de dimetilsulfoxido (DMSO); adicionar, em
seguida, 25 mL de acetato de lítio (4 mol/L), pH 5,2.
Ácido cítrico (0,2 mol/L, pH 5,0) – pesar 42 g de ácido cítrico + 16
g de NaOH e dissolver em 900 mL de água. Ajustar o pH para 5,0
com NaOH e completar o volume para 1.000 mL.

3.4. Irradiação-extração e irradiação-incubação

Recentemente o uso da irradiação vem sendo proposto como


uma alternativa ao clorofórmio. Esse método consiste na exposição
de uma amostra de solo à irradiação com micro-ondas durante
alguns minutos. Após a irradiação, as amostras irradiadas e não
irradiadas são analisadas conforme os métodos da extração ou
incubação, descritos anteriormente.
No procedimento de irradiação, devem-se pesar 2 amostras de
25 g de solo de cada tratamento e colocar 1 das amostras em
Erlenmeyer de 125 mL. Deve-se irradiar a amostra em micro-ondas
com cálculo da potência real do micro-ondas. Proceder a extração
ou incubação conforme descrito anteriormente.
Devem-se colocar apenas Erlenmeyers no micro-ondas e irradiá-
los por 4 vezes dividindo-se o tempo real de exposição por 4. Em
cada etapa, mudar os frascos de lugar e proceder uma breve
agitação, a fim de favorecer a irradiação completa da amostra.
Cálculo da potência do micro-ondas e o tempo de exposição da
amostra – aquecer 1 L de água e medir a variação de temperatura
da água antes e após 120 segundos da exposição ao micro-ondas.
Calcular a potência real do aparelho pela equação 15:

em que
P = potência real do aparelho (W); Cp = 1 J/mL/ok, capacidade da
água de receber calor; K = 4,184, fator de correção de cal/m/oK para
Watts (J/s); ∆t = variação de temperatura de 1 L de água em 2
minutos de exposição, em oC; m = 1.000, massa da água (g); t =
120, tempo de exposição da água ao micro-ondas (s).
Em seguida determinar o tempo de exposição das amostras de
solo à irradiação do micro-ondas pela equação 16.

em que
t = tempo real de exposição das amostras ao micro-ondas (s); r =
800 J/g de solo, quantidade de energia necessária para a
exposição; mt = peso total das amostras a serem irradiadas (g); P =
potência real do aparelho (W).

3.5. Respiração induzida pelo substrato (ANDERSON;


DOMSCH, 1978)

O método da respiração induzida pelo substrato consiste na


adição de glicose em uma amostra de solo e posterior avaliação da
respiração, antes que o crescimento microbiano ocorra.
Aproximadamente após 2 horas, o aumento no CO2 é proporcional
ao tamanho do Cmic.
A amostra de solo, com umidade ajustada entre 50% e 75% da
CC, é dividida em subamostra, em três repetições. Pesar a
subamostra e em seguida adicionar entre 4 mg e 6 mg de glicose
PA por grama de solo utilizado, misturando completamente. Colocar
em recipientes hermeticamente fechados e medir a liberação de
CO2, durante o período de 2 horas, utilizando cromatógrafo gasoso.
O Cmic é calculado pela equação 17.

em que X = respiração do solo.

3.6. Determinação de ácidos graxos ligados a ésteres de


fosfolipídios (PFLA)

Os ácidos graxos ligados a ésteres de fosfolípidios (PFLAs) são


encontrados em todas as células vivas. Exocelularmente, os PFLAs
existem em pequena concentração comparados à biomassa
microbiana total e são rapidamente degradados em células mortas,
solos e sedimentos. Os PFLAs microbianos podem ser extraídos do
solo, e a sua identificação e quantificação podem fornecer
informações importantes sobre a estrutura da comunidade
microbiana do solo.

3.6.1. Extração e separação dos lípidios (WHITE et al., 1979)


Amostra de solo (25 g) é congelada durante a noite, sendo então
colocada em frascos de 250 mL. Adicionam-se 30 mL de tampão
fosfato (50 mM), 75 mL de metanol anidro e 37,5 mL de clorofórmio.
A mistura é agitada no escuro a 200 rpm (2 horas, oC) para extrair
os lipídios. Volumes iguais de (37,5 mL) água e clorofórmio são
adicionados e os frascos são agitados novamente (100 rpm, 5
minutos) sendo os componentes separados durante a noite a 4 oC.
As próximas etapas devem ser realizadas a 4 oC e em luz reduzida.
A fase água-metanol é removida por sucção, e a fase clorofórmio
contendo os lipídios é separada por filtração usando um funil
contendo uma camada de 2 cm de Celite 545. O extrato é filtrado,
novamente, com água (Whatman 2) contendo 20 g de Na2SO4
anidro. O clorofórmio é evaporado utilizando um rotaevaporador a
30 oC, obtendo-se um volume final de 1 mL, sendo transferido para
tubos de vidro.
O clorofórmio é evaporado sob N2 e chamado de lipídios totais,
sendo armazenado a -20 oC. O total de PFLA nos lipídios totais é
medido após digestão com ácido sulfúrico concentrado e green
malachite (MURPHY; RILEY, 1962) e estimado o total de ácidos
graxos (FINDLAY, 1996; WHITE et al., 1979).

3.6.2. Reagentes
Tampão fosfato – (8,7 g K2HPO4 em 1 L de água deionizada) com
pH ajustado para 7,4 com HCl 1 mol/L.
Cellite 545 (diatomaceous silica).
3.6.3. Separação dos fosfolipídios
Os lipídios são fracionados em colunas com glicol e fosfolipídios
sobre sílica (SPE-Si, Supelco, Bellefonte, USA). As colunas são
conectadas a bombas de vácuo.
Extração dos PFLAs – inicialmente, 2 mL de metanol são adicio‐
nados às colunas e succionados pela bomba de vácuo, para
condicionamento da coluna. Em seguida, 1 mL de clorofórmio é
adicionado e passa pela coluna por gravidade. O procedimento é
repetido mais uma vez, com adição de 2 mL de água no intervalo. A
fração lipídica é dissolvida em clorofórmio (200 µL) sendo
adicionada no tubo. O tubo é lavado 3 vezes com 200 mL. Os
lipídios são eluídos com clorofórmio, e os glicolipídios e fosfolipídios
são eluídos com acetona-metanol (1:1). Em cada caso, alíquotas de
1 mL e 3 separações são usadas. As 3 frações são separadas em
tubos de vidro, e os solventes evaporados sob N2. Os resíduos são
armazenados a -20 oC, até a análise.
A fração de PLFA é dissolvida em metanol:tolueno (1:1 v:v) e
adicionada a 0,5 mL de KOH 0,2 mol/L. Os tubos são selados com
PTFE, agitados em vórtex e aquecidos (37 oC, 15 minutos) em
chapa aquecedora. Em seguida, os tubos são esfriados à
temperatura ambiente e neutralizados com 0,5 mL de ácido acético
0,2 mol/L. Após isso, são adicionados 2 mL de clorofórmio e 2 mL
de água e agitados em vórtex. A mistura é separada em 2 fases. A
separação pode ser melhorada utilizando uma centrifugação a 2.500
rpm por 5 minutos. A solução com clorofórmio é transferida para
tubos limpos, utilizando pipeta Pasteur, e evaporada sob N2.

3.6.4. Separação dos PFLAs


Colunas de aminopropil (SPE-NH2, Supelco, Supelco, Bellefonte,
USA) são condicionadas com diclorometano e hexano (1 mL cada).
Essas são conectadas a uma bomba de vácuo. Os PFLAs são redis‐
solvidos em hexane-diclorometano (200 µL) e adicionados à coluna,
usando uma pipeta Pasteur.
As frações dos PFLAs são eluídas consecutivamente com 2 mL,
cada, de hexane-diclorometano (3:1,v/v), diclorometano-etilacetato
(9:1v/v) e ácido acético diluído em metanol (2%) para as frações não
substituídas, hidroxilas-substituídas e não saponificadas dos PFLAs,
respectivamente. Cada fração é coletada separadamente, e os sol‐
ventes são evaporados sob N2. Os fosfolipídios são armazenados a
-20 oC até a análise. Somente as frações não substituídas e as
hidroxilas-substituídas serão determinadas.

3.6.5. Cromatografia gasosa


Os PFLAs são dissolvidos em 200 µL de hexano, sendo 0,7 µL
ou 1 µL do extrato injetado no cromatógrafo. No Laboratório de
Solos da Estação de Rothamsted (UK), o grupo do Dr. Philip
Brookes utiliza cromatógrafos Shimadzu GC-9A ou Hewlett Packard
GC series 5980.
Os resultados do PLFA são expressos como nmol PLFA/g/solo;
% PFLA; µg individual PLFA g/solo.

3.7. Determinação da adenosina trifosfato (ATP)

Adenosina trifosfato (ATP) é um importante componente ener‐


gético para o metabolismo dos organismos vivos. O ATP do solo é
fortemente correlacionado com outros indicadores, tais como C e N,
podendo servir para estimar o conteúdo de biomassa microbiana do
solo.

3.7.1. Extração do ATP


Seis porções de solo (cada porção de 5 g de solo seco) são
colocadas em tubos de centrífuga e mantidas em gelo. O extrator A
é adicionado ao primeiro tubo e ultrassonicado por 2 minutos a 760
MHz. O tubo é esfriado, em gelo, por 5 minutos. Os próximos 2
tubos são tratados da mesma forma. Em seguida, procede-se a
extração com o extrato B. 3 tubos contendo o extrato A e 3 tubos
contendo o extrato B, cada um sem solo, servem como a prova em
branco. Os extratos são filtrados (Whatman 42) e aproximadamente
5 mL do extrato ou branco são coletados, esfriados em gelo e
armazenados a -15 oC. Esses extratos são estáveis por 3 meses.

3.7.2. Determinação do ATP (JENKINSON; OADES, 1979)


O método é baseado na extração do ATP com reagente TCA. O
ATP é determinado após a adição da enzima luciferina-luciferase. O
ensaio enzimático é realizado seguindo as recomendações do fabri‐
cante da enzima.

3.7.3. Solução padrão de ATP (0,1 mM)


A solução estoque de ATP é preparada dissolvendo di-Na ATP
tetra-hidratado (59,9 mg) em água deionizada e completando o volu‐
me para 1 L. Essa solução deve ser armazenada a -15 oC e em
alíquotas menores (150 mL ou 200 mL) para facilitar o uso. A
solução é estável por 1 mês.

3.7.4. Preparação do reagente de extração do ATP


Ácido tricloroacético (TCA) (81,6 g) e Na2HPO4.12H2O (89,6 g)
são dissolvidos em 600 mL de água. Em seguida, adiciona-se
Paraquat (1,1-dimethyl-4,4’-bipyridinium dichloride) (70 mL, 36%) e
ajusta-se a solução para 1.000 mL com água. A solução é esfriada
em gelo para evitar a formação de cristais e armazenada a -15 oC.
Extrator A – preparar utilizando 5 mL da solução estoque de ATP
(0,1 mM) em 1 L de água.
Extrator B – preparar utilizando 10 mL da solução estoque de
ATP (0,1 mM) em 950 mL do extrator A e completando o volume
para 1 L.
Preparação das soluções padrão de ATP – 1 mL de ATP 0,1 mM
é pipetado em balão volumétrico de 50 mL e completado o volume
com o extrator A. Essa solução é de 100 pmol ATP/50 μL de solução
padrão. As outras diluições podem ser feitas a partir desta. A curva
de calibração é linear.
4. Respiração do solo

A respiração é um dos mais frequentes métodos para estimar a


atividade microbiana do solo (ALEF, 1995). A taxa de respiração do
solo pode ser quantificada em laboratório e em campo e consiste na
quantificação do fluxo de CO2 liberado pelos microrganismos
durante um período de tempo. A respiração pode ser determinada
usando técnicas simples, absorção de CO2 por NaOH e
determinação por titulação com HCl, ou sofisticadas, equipamento
cromatógrafo a gás. Os principais métodos de determinação da
respiração em campo ou laboratório serão descritos a seguir.

4.1. Respiração do solo em laboratório

O método consiste na estimativa do CO2 liberado durante a


incubação do solo em um sistema fechado. O CO2 é capturado por
uma solução de NaOH, que posteriormente é titulada com HCl.
O procedimento padrão consiste na incubação de uma amostra
de solo, geralmente de 50 g a 100 g, em 3 repetições, com umidade
ajustada para 50% a 60% da capacidade de campo durante 3 dias
(25 oC) em jarros herméticos de 1 L a 2 L, juntamente com 10 mL a
20 mL de hidróxido de sódio (NaOH), em concentrações que podem
variar de 0,05 mol/L a 1,0 mol/L. O CO2 liberado é medido por titu‐
lação do NaOH residual com ácido clorídrico (HCl), em
concentrações que podem variar de 0,05 mol/L a 1,0 mol/L, após
precipitação do carbonato com 1,0 mL a 5,0 mL de cloreto de bário
(BaCl2), em concentrações que podem variar de 0,5 mol/L a 3,0
mol/L, usando fenolftaleína a 1% como indicador.
A taxa de respiração é calculada pela equação 18.
em que
Resp_basal = respiração basal ou atividade microbiana (mg CO2/g
solo/h); Vbranco = volume de HCl consumido pelas provas em branco
(mL); Vamostra = volume de HCl consumido pelas amostras (mL); N =
normalidade do HCl (mol/L); fc = fator de correção para CO2 (22) ou
C (6); NH = número de horas da incubação (h).

4.2. Respiração do solo em campo

Este método é baseado na determinação do CO2 liberado em


solo não perturbado. A solução de NaOH é colocada sobre a
superfície do solo dentro de um tubo de plástico ou metal com área
conhecida e tampado na parte superior. O CO2 é capturado pela
solução e posteriormente é titulado com HCl.
O procedimento consiste na colocação de um recipiente con‐
tendo 20 mL de uma solução de NaOH, geralmente 1,0 mol/L, sobre
um tripé na superfície do solo e dentro de um cilindro de metal ou
plástico com área conhecida, em que a extremidade inferior está
enterrada até 5 cm, e a extremidade superior é fechada com tampa
removível. Após incubação de 24 horas, a tampa do cilindro é
retirada, sendo coletada a solução de NaOH e transportada ao
laboratório. A titulação é feita de acordo com a descrição anterior,
utilizando HCl 1,0 mol/L, após precipitação com BaCL2. O controle é
feito utilizando a incubação de uma solução de NaOH em um
cilindro fechado nas duas extremidades.
A taxa de respiração é calculada pela seguinte equação.
em que
Taxa_resp = taxa de respiração ou atividade microbiana (mg
CO2/m2/h); Vbranco = volume de HCl consumido pelas provas em
branco; Vamostra = volume de HCl consumido pelas amostras; Nreal =
normalidade real do HCl; Fc = fator de correção para CO2 (22) ou C
(6); Acilindro = área do cilindro de metal ou plástico (m2); NH = número
de horas da incubação (h).

5. Quociente respiratório ou atividade


respiratória específica (qCO2)

O quociente respiratório é obtido pela expressão da taxa de


respiração em termos de biomassa microbiana. Essa medida é
conhecida, também, por respiração específica e é usualmente
expressa como µg CO2/dia/mg de carbono da biomassa microbiana
ou unidades equivalentes.

6. Referências

ALEF, K. Estimation of soil respiration. In: ALEF, K.; NANNIPIERI, P. (Ed.). Methods in soil
microbiology and biochemistry. New York: Academic, 1995. p. 464-470.
AMATO, M.; LADD, J. N. Assay for microbial biomass based on ninhydrin reactive nitrogen
in extracts of fumigated soils. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 20, p. 107-114, 1988.
ANDERSON, J. P. E.; DOMSCH, K. H. A physiological method for the quantitative
measurement of microbial biomass in soils. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 10, n. 3,
p. 215-221, 1978.
BLOEM, J.; BREURE, A. M. Microbial indicators. In: BREURE, A. M.; MARKET, B.;
ZECHMEISTER, H. G. (Ed.). Bioindicators/biomonitors: principles, assesment, concept.
Amsterdam, NL: Elsevier, 2002. p. 43-61.
BROOKES, P. C. The soil microbial biomass: concept, measurement and applications in
soil ecosystem research. Microbes and Environment, Tokyo, v. 16, p. 131-140, 2001.
BROOKES, P. C.; POWLSON, D. S.; JENKINSON, D. S. Measurement of microbial
biomass phosphorus in soil. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 14, p. 319-321, 1982.
CERRI, C. C.; ANDREAUX, F.; EDUARDO, B. P. O ciclo do carbono no solo. In:
CARDOSO, E. J. B. N.; TSAI, S. M.; NEVES, M. C. P. Microbiologia do solo. Campinas:
Sociedade Brasileira de Ciências do Solo, 1992. p. 73-90.
FINDLAY, R. H. The use of phospholipids fatty acids to determine microbial community
structure. In: AKKERMANS, A. D.; ELSAS, J. D. van; BRUIJN, F. J. de. (Ed.). Molecular
Microbiology Manual. Dordrecht: Kluwer Academic, 1996. p. 1-17.
GREGORICH, E. G.; CARTER, M. R.; ANGERS, D. A.; MONREALL, C. M.; ELLERT, B. H.
Towards a minimum data set to assess soil organic-matter quality in agricultural soils.
Canadian Journal of Soil Science, Ottawa, CA, v. 74, p. 367-385, 1994.
JENKINSON, D. S.; LADD, J. N. Microbial biomass in soil: measurement and turnover. In:
PAUL, E. A.; LADD, J. N. (Org.). Soil biochemistry. New York: Marcel Dekker, 1981. p. 415-
471.
JENKINSON, D. S.; OADES, J. M. A method for measuring adenosine triphosphate in soil.
Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 11, p. 193-199, 1979.
JENKINSON, D. S.; POWLSON, D. S. The effects of biocidal treatments on metabolism in
soil: I. Fumigation with chloroform. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 8, p. 167-177,
1976.
JOERGENSEN, R. G.; BROOKES, P. C. Ninhydrin-reactive nitrogen measurements of
microbial biomass in 0.5 M K2SO4 soil extracts. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 22,
p. 1023-1027, 1990.
MURPHY, J. P.; RILEY, J. P. A modified single solution method for the determination of
phosphate in soils: 1. Extraction Method. Analytical Chimica Acta, Amsterdam, NL, v. 27, p.
31-36, 1962.
STENBERG, B.; JOHANSSON, M.; PELL, M.; SJODAHL-SVENSSON, K.; STENSTROM,
J.; TORSTENSSON, L. Microbial biomass and activities in soil as affected by frozen and
cold atorage. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 30, p. 393-402, 1998.
VANCE, E. D.; BROOKES, P. C.; JENKINSON, D. S. An extraction method for measuring
soil microbial biomass C. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 19, p. 703-707, 1987.
WHITE, D. C.; DAVIS, W. M.; NICKELS, J. S.; KING, J. C.; BOBBIE, R. J. Determination of
the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia, Berlin, DE, v.
40, p. 51-62, 1979.
ZELLES, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the
characterization of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils,
Berlin, DE, v. 29, p. 111-129, 1999.
Parte 5
Técnicas biotecnológicas
aplicadas à agricultura
Capítulo 1
Produção de biolarvicidas à base
de Bacillus sphaericuse Bacillus
thuringiensis var. israelensis para
o controle de insetos
Christine Lamenha Luna Finkler
Amaro de Castro Lira Neto
Carlos Henrique Madeiros Castelletti
Liane Maria de Almeida Castro Maranhão

1. Introdução

A crescente demanda pela proteção ambiental tem incentivado a


adoção de métodos alternativos de controle de pragas da agricultura
e vetores de doenças humanas visando à redução dos riscos do uso
intensivo de produtos químicos e de sua permanência no ambiente.
Nesse contexto, os agentes de controle biológico têm propiciado
muitos benefícios para a humanidade, pois, além de não poluírem o
meio ambiente, são inócuos a animais e plantas. Entre esses, a utili‐
zação de produtos à base de microrganismos tem se tornado cada
vez mais importante nas áreas de agropecuária, saúde e indústria.
O interesse pela utilização de microrganismos entomopatogê‐
nicos para o controle de populações de insetos prejudiciais levou o
homem a pesquisar com maior profundidade as bactérias esporulan‐
tes. A produção de esporos, por se tratar de uma característica de
persistência, tem sido considerada como um pré-requisito para que
um agente possa ser produzido em escala comercial. Entre as
bactérias promissoras estão às pertencentes ao gênero Bacillus
(família Bacillacea) em virtude, principalmente, de características
como formação de endósporo e produção de uma grande variedade
de toxinas e enzimas. De acordo com Habib e Andrade (1998),
dentre as espécies com entomopatogenicidade relatada destacam-
se B. alvei (Cheshire & Cheine, 1885), B. cereus (Frankland &
Frankland, 1887), B. sphaericus (Neide, 1904), B. larvae (White,
1906), B. thuringiensis (Berliner, 1909), B. popilliae e B. lentimorbus
(Dutky, 1940). A espécie mais estudada e utilizada em campo é B.
thuringiensis, que apresenta dezenas de variedades tóxicas contra
insetos das ordens Lepidoptera (lagartas), Coleoptera (besouros) e
Diptera (mosquitos e moscas), enquanto que B. sphaericus
apresenta maior especificidade contra insetos da ordem Diptera.
B. sphaericus é uma bactéria aeróbica Gram positiva que produz
um esporo esférico na porção terminal da cápsula bacteriana. Seu
efeito larvicida é produzido principalmente a partir de duas toxinas
(Bin 1 e Bin 2) que atuam em sinergia. As toxinas apresentam uma
alta toxicidade às larvas de Culex quinquefasciatus (Diptera:
Culicidae), o que resulta no sucesso da sua utilização como
biolarvicida para o controle dessa espécie de Culicidae. Além disso,
B. sphaericus apresenta a característica de persistir no ambiente por
até 60 semanas, reciclando-se no tecido de larvas mortas
(GANUSHKINA et al., 2000).
No Brasil, biolarvicidas produzidos com o princípio ativo de B.
sphaericus vêm sendo desenvolvidos e comercializados para o
controle biológico de algumas espécies de mosquitos da família
Culicidae (SILVA-FILHA et al., 2001). Contudo, é importante
ressaltar que melhores resultados podem ser obtidos a partir da
implementação de estudos que permitam desenvolver meios de
cultivo de baixo custo e elevada concentração de toxinas e
processos de separação de biomassa viáveis economicamente.
B. thuringiensis é uma bactéria aeróbica ou anaeróbica faculta
tiva formadora de esporo, do mesmo grupo de B. cereus,
distinguindo-se pela sua capacidade de produzir d-endotoxinas
durante sua fase de esporulação (BRAVO et al., 2005). Essas d-
endotoxinas, também chamadas de proteínas Cry, são específicas
para os insetos das ordens Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera e
Diptera (BRAVO et al., 2005; SCHNEPF et al., 1998). Uma
característica marcante dessas toxinas é sua a especificidade,
sendo, portanto, tóxicas apenas para os insetos alvo e inofensivas
para o homem e demais vertebrados. Por essa razão, essas
proteínas têm sido largamente utilizadas contra vetores de doenças
humanas e pragas agrícolas, tanto na forma de produtos biológicos
quanto em plantas transgênicas (BRAVO et al., 2005).
Os bacilos apresentam atividade entomopatogênica em virtude
das pró-toxinas que são produzidas durante a fase de esporulação.
Essas estruturas proteicas são ingeridas pelas larvas dos
mosquitos, e os intestinos das mesmas, sofrendo a ação de
enzimas, as transformam em proteínas que se interligam a
receptores situados nas membranas celulares e causam
desarranjos nessas células, que levam à paralisia e à morte das
larvas.
O Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) vem desenvol‐
vendo com sucesso, desde 1996, a produção de um caldo fermenta‐
do à base de B. sphaericus (BS-1) para o controle da larva da
muriçoca (C. quinquefasciatus) no Estado de Pernambuco. Os
resultados de controle obtidos alcançam entre 80% e 100% de
mortalidade larval, na dependência do tipo e da característica dos
criadouros (dados não publicados). Todo o desenvolvimento
tecnológico da pesquisa e produção desse larvicida foi obtido
localmente, por meio de cooperação técnica com outras instituições
parceiras, a exemplo do Departamento de Antibióticos da
Universidade Federal de Pernambuco e do Centro de Pesquisas
Aggeu Magalhães (Fiocruz). Testes que também comprovaram a
eficiência do caldo fermentado BS-1 em campo e o desenvolvimento
de formulações à base desse biolarvicida são verificados nos
trabalhos de Medeiros (2001) e Silva (2000).
Luna (2004) desenvolveu uma formulação em comprimido à base
de B. thuringiensis var. israelensis contra larvas de Aedes aegypti,
sendo observada uma mortalidade de 100% quando o produto era
aplicado em recipientes contendo de 30 L a 50 L de água, enquanto
que para um volume de 100 L a mortalidade observada foi de 88%.

2. Técnicas de preservação

A manutenção de uma coleção de isolados em um laboratório de


biotecnologia é de extrema importância e tem como principal
objetivo assegurar a viabilidade dos organismos utilizados, além de
proporcionar um banco genético para estudos posteriores. As
culturas devem ser mantidas em condições que garantam as suas
características fenotípicas e genotípicas originais, sendo, para isso,
utilizadas técnicas padronizadas de preservação.
Nem todas as espécies respondem de maneira similar aos
métodos de preservação. No entanto, é importante enfatizar que o
seu sucesso depende da escolha apropriada do meio de cultura,
dos procedimentos de cultivo e do tempo de conservação.
Alguns dos principais métodos para a preservação de linhagens
de Bacillus são citados abaixo.

2.1. Tiras de papel de filtro

Nesta técnica, as cepas de Bacillus podem ser mantidas sob a


forma de esporos sobre a superfície de papel de filtro. Inicialmente
as estirpes são cultivadas por 48 horas em meio Ágar Nutriente
(AN), observando-se microscopicamente a esporulação do
microrganismo e a pureza do material. Uma suspensão densa é
então realizada, e a concentração dos esporos determinada por
contagem de colônias crescidas sobre a superfície de placas de
Petri contendo o mesmo meio.
Para quantificar a concentração de esporos, a suspensão é
diluída 10 vezes em tubo contendo água estéril e submetida a
choque térmico a 80 °C durante 12 minutos e em gelo por 5
minutos, para eliminação das células vegetativas. Após diluições
sucessivas, o microrganismo é distribuído por meio de 5
semeaduras de volume conhecido (10 µL ou 5 µL) por placa e
incubado a 30 °C durante 20 a 22 horas. As colônias são contadas,
e os resultados analisados estatisticamente para o cálculo da
concentração de esporos na amostra, sendo expressos em
Unidades Formadoras de Colônias por mL (UFC/mL).
As tiras de papel de filtro, previamente autoclavadas em placas
de Petri, são impregnadas com alíquotas de 20 µL da suspensão
bacteriana. Posteriormente, as mesmas são colocadas para secar
em estufa a 35 ± 1 ºC durante 24 horas, transferidas para tubos de
ensaio estéreis e conservadas sob refrigeração a 5 ± 1 ºC.

2.2. Método de subculturas periódicas

Este método é indicado apenas para culturas temporárias, em


que a técnica de preservação de longo prazo ainda não foi definida.
Para linhagens de Bacillus, recomenda-se que as células sejam
cultivadas semanalmente (FLICKINGER; DREW, 1999).
Consiste em transferir o microrganismo para tubos inclinados
contendo meio adequado, sendo incubado por 48 a 72 horas. A
cultura deve ser observada microscopicamente para verificação de
sua pureza, e os tubos conservados em geladeira ou câmara fria a 4
± 1 ºC.
A principal desvantagem deste método é a facilidade de conta‐
minação e a possibilidade de seleção de uma cepa modificada
geneticamente. Dessa forma, a pureza das culturas deve ser
examinada a cada transferência, sendo ainda recomendada a
realização de testes periódicos de caracterização.
2.3. Método do óleo mineral

Este método é similar ao anterior, entretanto com a vantagem de


que a preservação pode se estender por vários anos. Consiste no
impedimento da dessecação e oxigenação das células por uma
camada de óleo mineral, deixando o microrganismo em estado de
latência.
A cepa é cultivada em tubos de penicilina contendo meio sólido
por 48 a 72 horas. Após a incubação e verificação da sua pureza, a
cultura é recoberta com uma camada de aproximadamente 2 cm de
óleo mineral tipo Nujol, previamente autoclavado por 60 minutos a
121 ºC e posteriormente em estufa a 110 ºC por 1 hora. O armaze‐
namento dos tubos de penicilina pode ser realizado à temperatura
ambiente (28 ± 1 ºC).

2.4. Método da liofilização (freeze-drying)

A liofilização é o método mais empregado para a preservação de


microrganismos em longo prazo. De acordo com Flickinger e Drew
(1999), muitas espécies bacterianas têm sido preservadas e perma‐
necidas viáveis por mais de 60 anos.
O processo consiste na remoção de água por sublimação a partir
do estado de congelamento, sendo dividido em 3 estágios: (1)
congelamento da suspensão; (2) secagem primária durante a qual a
maioria da água presente na amostra é removida por sublimação;
(3) secagem secundária para a remoção da água ligada.
Uma pequena quantidade da suspensão bacteriana (de 0,1 mL a
0,2 mL) contendo um agente crioprotetor é transferida para ampolas
estéreis, sendo estas imersas em um banho de gelo seco contendo
etileno glicol (50%) de forma a promover o congelamento da
suspensão. A secagem é então iniciada, sendo feito o vácuo e reti‐
rada a umidade. No final do ciclo de secagem, as ampolas são
seladas e mantidas em geladeira a temperaturas de 2 oC a 8 oC.
3. Preparo do inóculo

A etapa de preparação do inóculo é de fundamental importância


para o sucesso de um cultivo microbiano. Deve ser garantido o
desenvolvimento do microrganismo em condições que assegurem
uma produção de células viáveis para a etapa de acúmulo de
biomassa ou formação do produto desejado.
Os principais fatores que influenciam a preparação do inóculo
são: condições de estocagem do microrganismo; condições de
desenvolvimento do inóculo; dinâmica de crescimento microbiano;
critérios de transferência do inóculo (número de transferências, volu‐
me e concentração de células).
Qualquer possível variação nas características genotípicas ou
fenotípicas da cultura estoque influencia diretamente no cultivo
microbiano, de forma que o processo fermentativo deve envolver um
sistema robusto de manutenção do microrganismo, incluindo o esta‐
belecimento de um protocolo padrão para assegurar o seu
manuseio e a sua preservação.
O estabelecimento dos critérios para a obtenção das condições
ótimas de propagação do inóculo deve ser determinado experimen
talmente, avaliando-se cada estágio do processo de maneira
individual. Vale salientar que o uso de meios de cultura complexos
pode ocasionar variações no processo, exigindo um maior controle
da operação e das condições de crescimento.
Embora existam poucos estudos sobre a influência do inóculo
nos estágios finais da fermentação de bactérias entomopatógenas,
certamente a etapa de preparo do inóculo irá afetar o estágio final
do processo fermentativo. Alguns dos principais fatores incluem as
condições de estocagem da cultura, o tipo de meio de cultivo,
tamanho do inóculo, as condições de incubação e os critérios de
transferência do inóculo. Esses critérios devem ser determinados
experimentalmente e cada estágio examinado individualmente, de
forma a ser estabelecido um protocolo experimental do processo. A
Figura 1 ilustra como estudos relacionados ao desenvolvimento do
inóculo podem ser incorporados de forma a ser obtida uma elevada
produtividade do processo.

Figura 1. Estágios para o desenvolvimento de um processo fermentativo com alta


produtividade.
Fonte: adaptado de Flickinger e Drew (1999).

O preparo do inóculo na produção de Bacillus entomopatógenos


em larga escala necessita de estágios múltiplos de crescimento. A
formulação do meio de cultura na etapa inicial deve garantir um bom
crescimento vegetativo em um curto período de tempo. Além disso,
a metodologia deve ser escolhida com base no tipo de protocolo de
preservação da cultura. No Laboratório de Produção de Bactérias
Entomopatogênicas do IPA, o cultivo de B. sphaericus segue as
etapas apresentadas na Figura 2.
Figura 2. Etapas do desenvolvimento do inóculo realizadas no Laboratório de Produção de
Bactérias Entomopatogênicas do IPA.

3.1. Pré-inóculo (Inóculo I)

Esta etapa é realizada a partir de duas tiras de papel impreg‐


nadas com a cultura esporulada. O crescimento vegetativo das
cepas de Bacillus ocorre em frasco do tipo Erlenmeyer de 250 mL
de capacidade, contendo 100 mL do meio de cultura CSEL (Tabela
1), sob agitação de 200 rpm, durante 12 horas a 28 ºC ± 2 ºC.
Tabela 1. Composição do meio CSEL.

Componente Quantidade
Extrato de levedura 5,0 g
Extrato de carne 3,0 g
Peptona de carne 5,0 g
Água destilada 1.000 mL
pH 7,0
3.2. Inóculo II

São utilizados frascos do tipo Erlenmeyer de 250 mL de capa‐


cidade, contendo 85 mL do meio de cultura CSEL adicionado de 10
mL do inóculo e 5 mL de uma solução de CaCl2 a 0,2% (v/v). O
inóculo I é transferido para o inóculo II a uma concentração de cerca
de 10% (v/v) em cada frasco, e o cultivo realizado sob as mesmas
condições do inóculo I.

3.3. Inóculo III

Nesta etapa é utilizado um garrafão de 20 L de capacidade


contendo 14,16 L do meio de cultura CSEL, 15 mL de solução de
CaCl2 a 10% (v/v), 15 mL da solução de micronutrientes (Tabela 2) e
10 mL de antiespumante. O sistema é inoculado a uma
concentração de 5,3% (v/v), sendo aerado a 0,5 vvm. A temperatura
é controlada a 28 oC ± 2 oC, e o cultivo ocorre durante 12 horas.
Tabela 2. Composição da solução de micronutrientes.

Componente Quantidade
Sulfato de zinco 10 g
Sulfato ferroso 10 g
Sulfato de manganês 10 g
Água destilada (1)
1.000 mL
(1)
Adicionar 1 mL de ácido sulfúrico.

4. Cultivo de B. sphaericus em reator

Nesta fase, a produção de B. sphaericus é conduzida em reator


de 1.000 L operado em batelada, contendo 800 L de volume útil. Os
cultivos são realizados utilizando-se um meio de cultura industrial
baseado em substratos de baixo custo, à base de leite desnatado,
milhocina e sais minerais, a uma temperatura de 30 ºC ± 2 oC, sem
controle de pH e de aeração, durante 48 horas. O reator possui 4
chicanas diametralmente opostas e um sistema de agitação
mecânica contendo 1 turbina com 2 hélices de 8 pás planas.
Após a esterilização e o resfriamento do meio de cultura até 30
o
C, o inóculo III é transferido para o fermentador por pressurização
estéril de forma a ser obtida uma concentração de 1,5% a 2,0%
(v/v). Durante o cultivo é adicionado periodicamente o
antiespumante, visando controlar a formação de espuma. As
adições são realizadas a cada 12 horas, com volumes variando
entre 20 mL e 40 mL. Durante a adição do antiespumante, a válvula
de entrada de ar é fechada, enquanto que a válvula de quebra-
vácuo é aberta, visando evitar uma pressurização do reator.
Vale salientar que uma avaliação microscópica para verificação
das características morfológicas e pureza do cultivo é efetuada
durante cada estágio do desenvolvimento do inóculo e do processo
fermentativo, sendo retiradas amostras do reator com 24, 36 e 48
horas após a inoculação. Testes de pureza microbiológica também
são realizados por meio de plaqueamento em meio de cultura
específico, avaliando-se a possível presença de fungos, leveduras e
bactérias contaminantes, como as do tipo coliformes.
Após o término da fermentação, o material é bombeado para o
sistema de envase (tanque, tubulações e torneiras), previamente
submetido às esterilizações a vapor e química com hipoclorito de
sódio. Posteriormente, o caldo fermentado é distribuído em
bombonas de 5 L e acondicionado em câmara fria a 5 ºC ± 1 oC.
Como o meio de cultura utilizado nesta etapa contém um elevado
teor de partículas insolúveis, a esterilização é realizada de acordo
com as seguintes etapas:
– Esterilização do corpo do fermentador, tubulações, conexões,
caixa de envase, torneiras de envase, válvula de retirada de
amostras e tubo de entrada de antiespumante – colocam-se
200 L de água no interior do fermentador aguardando que a
temperatura alcance 120 oC por meio de uma caldeira, quando
então as válvulas que compõem todos os sistemas são abertas
uma de cada vez, com saída de vapor fluente durante cerca de
3 minutos. Terminado o expurgo, as válvulas são fechadas uma
a uma.
– Resfriamento do fermentador por meio de circulação de água
fria na camisa com auxílio de uma torre de resfriamento.
– Esterilização da água de processo – adição de 600 L de água
no interior do fermentador, fechamento das válvulas e esteri‐
lização a 120 oC por 2 horas.
– Resfriamento da água até uma temperatura de aproximada‐
mente 45 oC. Nesta etapa são retiradas amostras para a
realização de testes microbiológicos de pureza da água de
processo. Caso os testes sejam satisfatórios, prossegue-se
com o processo de esterilização do meio de cultura.
– Esterilização do meio de cultura – introdução dos componentes
do meio de cultura, fechamento das válvulas e esterilização a
110 oC por 1 hora.
A maioria das espécies de Bacillus pode ser cultivada em meios
à base de sais contendo amônia ou aminoácidos como fonte de
nitrogênio. É o caso das espécies B. larvae e B. popilliae, que
requerem a adição de tiamina para seu crescimento. Glicose ou
outros açúcares simples são utilizados como fonte de carbono e
energia, por exemplo, B. thuringiensis que utiliza a glicose, assim
como a L-arabinose, D-xilose e D-manitol, sendo que algumas
cepas utilizam a sacarose. Por outro lado, B. sphaericus não é
capaz de utilizar açúcares, necessitando de meios de crescimento à
base de proteínas (LUNA, 2004).
Embora muitas espécies esporulem facilmente, alguns cuidados
são necessários para uma esporulação eficiente, como a adição de
íons Ca++ e Mg++. Os principais componentes dos meios de cultivo
para a produção de B. sphaericus e B. thuringiensis var. israelensis
são fontes de carbono e nitrogênio e elementos traços.
Como observado na Tabela 3, diversos substratos de baixo custo
podem ser utilizados na composição dos meios. A escolha
adequada dos ingredientes do meio é fundamental para o sucesso
da produção comercial, tendo como objetivo a obtenção de uma
maior atividade tóxica por volume de caldo fermentado.
Tabela 3. Ingredientes para fermentações de Bacillus sphaericus e Bacillus thuringiensis var.
israelensis.

Ingrediente Concentração (g/L)


Farinha de soja 20–40
Farinha de semente de algodão 14–30
Milhocina 15–30
Glicose 10–30
Peptona 2–5
Xarope de milho 20–45
Melaço 1–18,6
Glicerol 2–10
Amido de milho 10–15
Extrato de levedura 2
KH2PO4 1
K2HPO4 1
FeSO4 0,02
FeSO4.7H2O 0,0005–0,02
MgSO4.7H2O 0,3
MnSO4.H2O 0,02
ZnSO4.7H2O 0,02
(NH4)2SO4 2
CaCO3 1–1,5

Fonte: Beegle et al. (1991) e Rowe et al. (1987).

As fermentações comerciais das bactérias entomopatógenas


podem ser realizadas em batelada, batelada alimentada e na forma
contínua. Os principais parâmetros monitorados durante o processo
fermentativo são temperatura, oxigênio dissolvido, pH e
concentração de açúcar. Em virtude do grande consumo de oxigênio
durante o cultivo, o controle deste parâmetro é muito importante,
não devendo atingir valores abaixo de 20% (COUCH, 2000). A
maioria das espécies entomopatogênicas de Bacillus crescem sob
condições aeróbias, sendo utilizados normalmente frascos sob
agitação orbital a 200 rpm.
Existem controvérsias com relação à necessidade do controle de
pH durante a fermentação. Segundo Couch (2000), alguns
produtores utilizam meios tamponados por não possuírem um
sistema adequado de controle. Outros autores verificaram um
aumento na atividade inseticida dos caldos fermentados de B.
sphaericus (YOUSTEN; WALLIS, 1987) e de B. thuringiensis var.
israelensis (SMITH, 1982) quando a fermentação era realizada sem
controle de pH.
Em bateladas alimentadas, os níveis de açúcar para o caso de B.
thuringiensis var. israelensis não devem ser inferiores a 2 g/L. A
temperatura deve ser mantida em 30 °C ± 2 °C; valores maiores
inibem a produção das toxinas (ROWE et al., 1987).
Normalmente os nutrientes são disponibilizados em excesso, e o
crescimento continua até que um substrato particular seja exaurido,
ou os níveis de oxigênio decresçam até concentrações inibitórias.
A esterilização do meio deve ser planejada de forma a minimizar
a perda de vitaminas e prevenir a precipitação dos elementos
traços. Dessa forma, os sais de cálcio, magnésio e ferro são
esterilizados separadamente, assim como quando é utilizada a
glicose ou outro açúcar.

5. Recuperação e concentração de células

A remoção de células microbianas de caldos fermentados cons‐


titui uma das etapas mais importantes da maioria dos processos
biotecnológicos. Essas partículas, por possuírem dimensões da
ordem de micrômetros e baixa densidade, muitas vezes necessitam
de pré-tratamentos para a obtenção de recuperações eficientes nos
processos de separação por filtração ou sedimentação gravitacional,
e a indução da floculação das células é uma das alternativas mais
utilizadas.
A separação de células de Bacillus sp. pode ser realizada a partir
de um processo de floculação, seguindo-se de uma sedimentação
gravitacional. Esse processo foi investigado por Luna (2004), que
avaliou o efeito do pH e a adição de agentes floculantes sobre a
eficiência de separação de células de B. sphaericus e B.
thuringiensis var. israelensis, sendo obtidos resultados de eficiência
de recuperação acima de 90%. O processo possui a vantagem de
substituir o uso de centrífugas, uma operação de alto custo em se
tratando de processos em larga escala.
A etapa de separação de células de Bacillus sp. consiste
inicialmente na adição de um floculante em uma concentração que
proporcione a melhor eficiência de floculação das células. Podem
ser empregadas as substâncias CaCl2.2H2O, FeCl3.6H2O, Al2(SO4)3
e tanino (Tanfloc SG), conforme descrito por Luna (2004). Após a
floculação das células, a suspensão é submetida à sedimentação
gravitacional em um tanque de sedimentação, sendo retirado o
sobrenadante. O sedimento obtido pode então ser utilizado nas
etapas posteriores visando à formulação do produto final desejado.

6. Considerações finais

Agentes de controle biológico à base de bactérias entomopa‐


togênicas têm se destacado entre os diversos métodos utilizados
nos programas de manejo integrado de larvas de mosquitos. A
utilização de biolarvicidas à base de B. sphaericus e B. thuringiensis
var. israelensis constitui uma importante alternativa no combate a
culicídeos vetores de doenças. A eficácia desses agentes em
programas de controle biológico requer a aplicação de manejo
adequado, baseada nos estudos do modo de ação das toxinas
inseticidas e dos mecanismos de resistência, de forma a se evitar a
seleção de populações de insetos resistentes, sobretudo ao B.
sphaericus.
Pesquisas de isolamento e avaliação de novas linhagens de
Bacillus estão sendo desenvolvidas em nosso País com o objetivo
de se obter estirpes que apresentem alta atividade letal contra
mosquitos transmissores de doenças humanas e de pragas
agrícolas. Apesar da eficácia no controle de insetos, poucos
biolarvicidas estão disponíveis no mercado brasileiro. O
desenvolvimento de larvicidas microbianos nacionais, adequados ao
combate a vetores regionais, traz resultados mais eficazes e
econômicos. Medidas de incentivo por parte dos órgãos
governamentais e o interesse da iniciativa privada, com a parceria
público-privada, devem ser intensificadas para o desenvolvimento
de novas tecnologias e da produção comercial ampliando a
disponibilidade desses produtos no mercado interno.

7. Referências

BEEGLE, C. C.; ROSE, R. I.; ZINIU, Y. Mass Production of Bacillus thuringiensis and B.
sphaericus for microbial control of insect pests. In: MARAMOROSCH, K. B. Biotechnology
for biological control of pests and vectors. Boca Raton: CRC, 1991. p. 195-216.
BRAVO, A.; GILL, S. S.; SOBERÓN, M. Bacillus thuringiensis mechanisms and use. In:
GILBERT, L. I.; IATROU, K.; GILL, S. S. Comprehensive molecular insect science. New York:
Elsevier, 2005. p. 175-206.
COUCH, T. L. Industrial fermentation and formulation of entomopathogenic bacteria. In:
CHARLES, J. F.; DELÉCLUSE, A.; NIELSEN-LEROUX, C. Entomopathogenic bacteria: from
laboratory to field application. Dordrecht: Kluwer Academic, 2000. p. 297-314.
FLICKINGER, M. C.; DREW, S. W. Encyclopedia of bioprocess technology: fermentation,
biocatalysis, and bioseparation. New York: John Wiley & Sons, 1999. 2756 p.
GANUSHKINA, L. A.; LEBEDEVA, N. N.; AZIZBEKYAN, R. R.; SERGIYEV, V. P. The
duration of the larvicidal effects of sporocrystalline mass of the bacteria Bacillus
thuringiensis spp. israelensis and Bacillus sphaericus in the laboratory setting.
Meditsinskaya Parazitologiya i Parazitarnye Bolezni, Moscow, RU, n. 4, p. 25-29, 2000.
HABIB, M. E. M.; ANDRADE, C. F. S. Bactérias entomopatogênicas. In: ALVES, S. B.
Controle microbiano de insetos. 2. ed. Piracicaba: FEALQ, 1998. p. 383-446.
LUNA, C. L. Avaliação de técnicas de separação fluido-sólido na produção de bioinseticidas a
partir de Bacillus sphaericus e Bacillus thuringiensis var. israelensis. 2004. 130 f. Tese
(Doutorado em Engenharia Química) - COPPE, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
MEDEIROS, F. P. M. Desenvolvimento de formulações à base de Bacillus sphaericus para
obtenção de um biolarvicida. 2001. 105 f. Dissertação (Mestrado em Ciências
Farmacêuticas) - Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de
Pernambuco, Recife.
ROWE, G. E.; MARGARITIS, A. DULMAGE, H. T. Bioprocess developments in the
production of bioinsecticides by Bacillus thuringiensis. CRC Critical Reviews in
Biotechnology, Boca Raton, v. 6, n. 1, p. 87-127, 1987.
SCHNEPF, E.; CRICKMORE, N.; RIE, J. von; LERECLUS, D.; BAUM, J.; FEITELSON, J.;
ZEIGLER, D. R.; DEAN, D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.
Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 62, p. 775–806, 1998.
SILVA, S. B. Avaliação de produtos à base de bactérias entomopatógenas para o controle de
Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). 2000. 92 f. Dissertação (Mestrado em Biologia
Animal) - Departamento de Zoologia, Universidade Federal de Pernambuco, Recife.
SILVA-FILHA, M. H.; REGIS, L.; OLIVEIRA, C. M. F.; FURTADO, A. F. Impact of a 26-month
Bacillus sphaericus trial on the preimaginal density of Culex quinquefasciatus in an urban
area of Recife, Brazil. Journal of the American Mosquito Control Association, Lake Charles,
LA, v. 17, n. 1, p. 45-50, 2001.
SMITH, R. A. Effect of strain and medium variation on mosquito toxin production by Bacillus
thuringiensis var. israelensis. Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, CA, v. 28, n. 9, p.
1089-1092, 1982.
YOUSTEN, A. A.; WALLIS, D. A. Batch and continuous culture of the mosquito larval toxin
of Bacillus sphaericus 2362. Journal of Industrial Microbiology, Amsterdam, NL, p. 277-
283, 1987.
Capítulo 2
Controle biológico de pragas:
considerações e aplicabilidade em
Pernambuco
Deise Maria Passos da Silva
Vanildo Alberto L. B. Cavalcanti
Romualdo Camelo Sena
Geraldo Pereira de Arruda

1. Introdução

Nos últimos anos a produção agrícola de alimentos e fibras foi


suficiente para atender a demanda mundial de uma população cres‐
cente. Segundo a Organização das Nações Unidas para Agricultura
e Alimentação (FAO, 2009), a população mundial tinha aumentado
em 93,5% chegando a 6,453 bilhões de habitantes e uma produção
de 2.219,4 bilhões de toneladas, em uma área colhida de 681,7
milhões de hectares. Estudo elaborado, em 2002, pela FAO, mostra
o panorama da agricultura para o período de 2015 a 2030, indicando
que os países em desenvolvimento deverão tornar-se cada vez mais
dependentes das importações de cereais, carnes e produtos
lácteos, visto que a produção local não será capaz de atender as
necessidades alimentares da população. Com isso, estima-se que
serão necessários 1 bilhão de tonelada de cereais adicionais para
atender a demanda (CAMARGO, 2009).
Nesse contexto, o Brasil é um dos principais produtores mundiais
de alimentos e fibras participando com mais de 4% do valor total das
exportações mundiais do agronegócio. Mesmo assim, em 2003
ocupou o 7º lugar no ranking mundial das exportações agrícolas,
com o valor de US$ 21,442 bilhões. Além disso, há perspectivas de
aumento da participação do Brasil no comércio internacional de
produtos do agronegócio, por possuir áreas agricultáveis ainda inex‐
ploradas e em várias cadeias produtivas com possibilidade concreta
de iniciar ou dar continuidade aos ganhos expressivos de produti‐
vidade motivados por inovações tecnológicas (SCOLARI, 2006).
As perdas ocasionadas por organismos nocivos, especialmente
os insetos pragas, atingem aproximadamente 30% da produção
mundial (ESTRUCH et al., 1997). Estima-se que cerca de 67 mil
espécies de insetos causem danos às plantações, sendo as regiões
tropicais, normalmente as mais pobres do mundo, as que mais
sofrem com a alta incidência de pragas (HERRERA-ESTRELLA,
1999). Diante disso, o setor agrícola vem buscando alternativas
biotecnológicas que possibilitem soluções para uma agricultura
sustentável que considere a integração de fatores econômicos,
sociais e ecológicos (ALTIERI, 1987, 1989, 1991, 2002).
Os insetos são o maior grupamento animal representando cerca
de 70% de todo o reino (MARANHÃO, 1976). Desse modo são
considerados implacáveis concorrentes do homem no usufruto e
domínio da terra (CARRERA, 1980). Diante dessa perspectiva, o
método de controle biológico de pragas torna-se uma ferramenta
fundamental no manejo de pragas agrícolas, pelos benefícios
voltados à preservação e qualidade do meio ambiente, por agir de
forma específica, não deixar resíduos, por ser de custo
relativamente mais baixo e de menor risco à saúde humana e aos
agroecossistemas (GALLO et al., 2002).

2. Considerações sobre controle biológico


de pragas
O controle biológico é uma expressão que foi usada pela primeira
vez em 1919, pelo pesquisador Harry S. Smith, quando se referiu ao
uso de inimigos naturais no controle de insetos pragas (BERTI
FILHO; CIOCIOLA, 2002). O termo praga aplica-se a animais que
são capazes de reduzir a quantidade de alimentos, rações, fibras,
flores, madeiras, etc. (PASCHOAL, 1979). No entanto, as pragas,
especialmente os insetos, não são de modo algum calamidades
acidentais, devendo ser consideradas como consequências das
práticas e das transformações efetuadas pelo homem nos habitats
naturais (KUENEN, 1960).
De acordo com DeBach (1964), controle biológico é a ação de
parasitos, predadores ou patógenos que mantêm a densidade
populacional de outros organismos numa média mais baixa do que
ocorreria em sua ausência. Já Caltagirone (1988) considera que
esse método consiste na regulação de populações de organismos
vivos resultantes de interações antagonísticas como parasitismo,
predatismo e competição. Para Gallo et al. (2002), o controle
biológico é um fenômeno natural que se fundamenta na regulação
do número de plantas e animais por meio de inimigos naturais,
denominados agentes de mortalidade biótica. Esse método visa à
redução de prejuízos por meio de ações selecionadas, após os
conhecimentos dos processos biológicos tanto dos inimigos naturais
como das pragas terem sido compreendidos, e as consequências
ecológicas, bem como as econômicas, tenham sido previstas, o
mais acuradamente possível, para o melhor interesse da sociedade
(AGUIAR-MENEZES, 2003).
Um programa estruturado de controle biológico envolve uma
ampla gama de atividades, desde a simples conservação de
inimigos naturais por meio de uma criteriosa seleção no uso de um
pesticida que lhes seja menos tóxico, até a liberação deliberada ou
introdução de inimigos naturais (MORETTI, 2008). Nesse contexto,
esse método é comumente operacionalizado dentro de programas
inter e multidisciplinares de Manejo Integrado de Pragas (MIP). Esse
se conceitua como sendo um sistema de decisão para uso de
táticas de controle empregadas de forma isolada ou associadas
harmonicamente e baseadas em análises custo-benefício
considerando o interesse e/ou impacto nos produtores, sociedade e
ambiente (GALLO et al., 2002). Esta combinação de técnicas e
recursos tem por objetivo manter a população de insetos a níveis
abaixo da densidade em que acarrete prejuízos econômicos à
cultura (CROCOMO, 1990; PEREIRA et al., 1998).
O controle biológico operacionalmente é aplicado de três formas
denominadas controle biológico clássico, natural e aplicado.

2.1. Controle biológico clássico

Este tipo de controle envolve a importação de agentes de


controle biológico da região de origem da praga, seja de um país
para outro, ou de uma região para outra, de modo a estabelecê-los
permanentemente como novos elementos da fauna local. No Brasil,
a instituição credenciada para operar neste controle é o Laboratório
de Quarentena Costa Lima vinculado ao Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (Mapa). Este iniciou suas atividades em
1991 e está localizado na Embrapa Meio Ambiente (Jaguariúna,
SP). Desempenha funções relativas à introdução de agentes de
controle biológico, fazendo trabalho de quarentena e mantendo
informações sobre as espécies de organismos úteis introduzidas no
Brasil (MORETTI, 2008).

2.2. Controle biológico natural ou conservação

Consiste na manutenção dos inimigos naturais nos agroecos‐


sistemas favorecendo ou fornecendo condições de sobrevivência e
reprodução e, consequentemente, aumentando sua efetividade.
Nesse sentido, essa estratégia envolve o manejo do habitat por
meio de práticas agronômicas adequadas que vise ao aumento e à
preservação desses biocontroladores.
2.3. Controle biológico aplicado ou propagação

Compreende a produção massal de predadores ou parasitoides


em laboratório, visando liberá-los em campo em momentos
adequados, baseando-se na biologia da praga alvo, de modo a
sincronizar as liberações quando a praga encontra-se em seu
estágio mais susceptível. Nos últimos anos, este método evoluiu
consideravelmente com o avanço dos estudos das dietas artificiais
para insetos.
Os inimigos naturais ou agentes biocontroladores de insetos
pragas são agrupados em três categorias: predadores, parasitoides
e patógenos. Os dois primeiros são denominados agentes
entomófagos e podem ser vertebrados (sapo, pássaro, morcego,
peixe, etc.) ou invertebrados (insetos, ácaros, aranhas, etc.), sendo
que apenas os insetos estão na categoria parasitoides. A última
categoria compreende os entomopatógenos (fungos, vírus,
bactérias, nematoides e outros microrganismos) capazes de causar
doença em insetos (AGUIAR-MENEZES, 2003; GALLO et al., 2002).
Registros de controle biológico datam desde o século III a.C.,
quando os chineses observaram que as formigas predadoras redu‐
ziam as populações de pragas dos citros. Outro marco importante
foi a descoberta de Aldrovandi, em 1602, que relatou o parasitismo
da lagarta-das-crucíferas por Apanteles glomeratus, considerado o
primeiro registro de controle biológico com parasitoides. Entretanto,
em 1888, na Califórnia, EUA, é que foi realizado o primeiro
programa de controle biológico clássico de sucesso com a
introdução da joaninha Rodolia cardinalis, trazida da Austrália, para
o controle da cochonilha Icerya purchasi. Desde então, o controle
biológico aplicado tem sido praticado, utilizando-se,
aproximadamente, mil espécies de inimigos naturais no controle de
cerca de 300 espécies de pragas em 350 programas de controle
biológico desenvolvidos mundialmente. No Brasil, há casos de
sucesso, como os programas de controle biológico das pragas da
cana-de-açúcar, dos pulgões-do-trigo, da lagarta e do percevejo-da-
cana, da cochonilha-das-pastagens, da minadora-dos-citros, da
cochonilha-da-mandioca e de lepidópteros – pragas, utilizando-se
tanto insetos entomófagos como agentes entomopatogênicos:
Trichogramma spp. (Hymenoptera: Trichogrammatidae), Cotesia
flavipes (Cam.,1891) (Hym., Braconidae), Metarhizium anisopliae
(Metsch.) Sorok. (Hyphomycetes, Moniliaceae), Beauveria bassiana
(Bals.) Vuill., dentre outros. (AGUIAR-MENEZES, 2003; NAVA,
2007).

3. Exemplos de controle biológico no


agroecossistema pernambucano

3.1. Cigarrinhas-da-cana-de-açúcar

O cultivo da cana-de-açúcar no Brasil encontra-se, atualmente,


em expansão, em virtude da adoção de técnicas agrícolas
avançadas. A aquisição de novas cultivares obtidas em programas
de melhoramento, a utilização de controle biológico de pragas e
doenças, aplicação de tratamentos fitossanitários, dentre outros
parâmetros, têm levado a aumentos significativos na produção de
açúcar e álcool (CASTRO; CHRISTOFFOLETI, 2005).
De acordo com dados da Companhia Nacional de Abastecimento
(Conab), a estimativa da safra de cana-de-açúcar para a região Nor‐
deste, representada pelos estados de Alagoas, Pernambuco e
Paraíba, foi de 67,8 milhões de toneladas. Para o açúcar, a
estimativa foi de crescimento, passando de 4,86 milhões de
toneladas na safra passada para 5,01 milhões, significando um
aumento de 3,13%. No que confere ao álcool, estimou-se um
aumento de 2,75%, passando de um total de 2,22 bilhões de litros
para 2,28 bilhões (CONAB, 2008).
A família Cercopidae (ordem Hemíptera) envolve todos os gêne‐
ros de cigarrinhas-da-cana-de-açúcar e das-pastagens. Apresenta
distribuição geográfica desde o México (América Central) até a
América do Sul, e tem como plantas hospedeiras as gramíneas e
algumas ciperáceas (MENDONÇA et al., 2005).
A classificação taxonômica, segundo Fennah (1968) e Gallo et al.
(2002), compreende a seguinte etapa: ordem – Hemíptera;
subordem – Auchenorrhyncha; superfamília – Cercopoidea; família –
Cercopidae; subfamília – Tomaspidinae; tribo – Tomaspidini;
Gêneros – Aeneolamia, Deois, Mahanarva, Prosapia e Zulia. Os
gêneros que ocorrem no Brasil e que apresentam pouca expressão
econômica são: Deois, Aeneolamia e Zulia (GUAGLIUMI, 1962;
MENEZES, 1982). No entanto, o gênero Mahanarva possui quatro
espécies de grande importância econômica: M. posticata (Stal), M.
fimbriolata (Stal), M. andígena (Jacobi) e M. rubicunda (Walker)
(MENDONÇA et al., 2005).

3.1.1. Cigarrinha-da-folha – Mahanarva posticata


M. posticata é considerada uma das principais pragas da cana-
de-açúcar no Nordeste, principalmente nos estados da Paraíba, de
Pernambuco e de Alagoas, onde são registrados os maiores danos
econômicos. No entanto, sua distribuição no Brasil ficou, até a
década de 1960, limitada aos estados: Rio de Janeiro, Espírito
Santo, Bahia, Minas Gerais, São Paulo, Paraná e Santa Catarina
(GUAGLIUMI, 1973).
Os machos adultos medem de 12 mm a 13 mm de comprimento
por 5 mm de largura. As fêmeas são um pouco maiores com 16 mm
de comprimento por 6 mm de largura. Possuem coloração castanha,
sendo mais escura nas fêmeas. Apresentam nas asas duas
pequenas manchas circulares ou pintas, de cores variando do
amarelo até o vermelho, sendo mais acentuadas nos machos
(MENEZES, 1982). O ciclo biológico dura aproximadamente 67 dias,
e a longevidade média dos machos adultos é de sete dias, e a das
fêmeas de 11 dias. No Nordeste, é comum durante o período de
inverno ocorrer em média três gerações anuais (GUAGLIUMI, 1973;
MENDONÇA et al., 1996).
3.1.1.1. Sintomatologia e perdas da cigarrinha-das-folhas
Em virtude do hábito alimentar de sucção contínua de seiva e
injeção de toxina, a cigarrinha-das-folhas provoca a queima das
folhas e o aparecimento de estrias longitudinais de coloração
amarelada. Consequentemente desencadeia intoxicação sistêmica e
seca das folhas, definhamento da planta, redução dos colmos e
diminuição da concentração de açúcar (GALLO et al., 2002). As
perdas econômicas foram estudadas por Marques e Vilas Boas
(1978) e Marques et al. (1981), e demonstraram que infestações
médias de 0,81 adulto por colmo e de 10 ninfas por colmo causaram
reduções de 11,2% na produção agrícola e 14,9% no rendimento
industrial.

3.1.1.2. Nível de dano econômico e nível de controle


A pesquisa recomenda que o nível de dano econômico (NDE)
seja de 5 ninfas por cana e de 1 adulto por cana. O nível de controle
(NC) corresponde às infestações a partir de 2,5 ninfas por cana e de
0,5 adulto por cana (MENDONÇA; MARQUES, 2005).

3.1.1.3. Considerações sobre a praga


A primeira referência dessa praga no Brasil foi feita por Moreira
(1921) em Campos, no Rio de Janeiro, identificada como Tomaspis
(Mahanarva) indicata. Seu registro em Pernambuco ocorreu em
1960, por Pietro Guagliumi, consultor da FAO e pesquisador do
Instituto do Açúcar e Álcool (IAA). Esse pesquisador, em 1968,
enviou amostras desse inseto ao Museu de Londres, cujo
taxonomista R. G. Fennah informou tratar-se da espécie Mahanarva
posticata (Stal, 1855) (GUAGLIUMI, 1973). A introdução dessa
praga nos canaviais pernambucanos ocorreu possivelmente pelo
transporte de canas – sementes, e daí partiu para os canaviais de
Alagoas. Poucos anos depois sua disseminação atingiu os outros
estados do Nordeste (MENDONÇA; MARQUES, 2005).
Um grande projeto governamental executado em Pernambuco,
nas décadas de 1960 e 1970, pelo IAA e pela Comissão Executiva
de Defesa Fitossanitária da Lavoura Canavieira de Pernambuco
(Codecap), deu início a várias pesquisas na área de controle
biológico dessa cigarrinha, utilizando o fungo entomopatogênico M.
anisopliae (Metsch.) Sorok. As aplicações foram realizadas em larga
escala e em grandes áreas nos canaviais nordestinos (GUAGLIUMI,
1969, 1971, 1973). A tecnologia de produção massal de M.
anisopliae no Brasil foi melhorada por Aquino et al. (1975),
empregando a utilização de arroz autoclavado como substrato sólido
em sacos plásticos feitos de polipropileno, o que serviu de modelo
básico para vários outros cientistas brasileiros e até de outros
países.
O pioneirismo desse programa no Nordeste (Pernambuco e
Alagoas) possibilitou a implantação de uma grande rede constituída
por 16 laboratórios oficiais e particulares (9 instalados em Alagoas,
6 em Pernambuco e 1 na Paraíba). A produção foi em torno de 70
toneladas de conídios de fungo, cobrindo uma área de
aproximadamente 800 mil hectares de cana-de-açúcar
(MENDONÇA; MARQUES, 2005). Atualmente encontram-se em
funcionamento os laboratórios de produção de fungo do Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA), a Associação dos Fornecedores
de Cana de Pernambuco, Usinas Central Olho Dágua, Cruangi e
União Indústria. A empresa Biotech Controle Biológico Ltda., com
matriz em Maceió, AL, e filial em Ribeirão Preto, SP, atualmente
com 26 anos de existência, tem capacidade de produção mensal de
aproximadamente 60 toneladas de fungo Biotech-G. (MARQUES et
al., 2005; MENDONÇA; MARQUES, 2005).

3.1.2. Cigarrinha-das-raízes – Mahanarva fimbriolata

3.1.2.1. Bioecologia de Mahanarva fimbriolata (Stal)


(Hemiptera; Cercopidae)
Esta espécie encontra-se largamente disseminada nos estados
de São Paulo, Paraná, Mato Grosso e sul de Minas Gerais. O
aumento das áreas de corte mecanizado da cana crua, deixando
sobre o solo as camadas de palha, tem contribuído para o
desenvolvimento dessa praga. O macho apresenta 13 mm de
comprimento por 6,4 de largura. A coloração do macho é vermelha
com as tégminas orladas de preto, formando uma faixa longitudinal
de mesma cor. A fêmea é mais escura marrom-avermelhada. Há
variações intraespecíficas na coloração dos machos, acentuando o
dimorfismo entre os sexos. A fêmea deposita os ovos no solo,
próximo às touceiras, porém nunca são encontrados nas bainhas da
planta. As ninfas habitam as raízes onde se fixam para sugar a
seiva. O ciclo evolutivo completo, sem envolver o tempo em que os
ovos passam em diapausa, que pode durar de 2 a 3 meses, pode
variar de 30 a 40 dias (GALLO et al., 2002). No entanto, pode
desenvolver de 3 a 4 gerações anuais dependendo do período do
ano (MENDONÇA; MENDONÇA, 2005).
O nível de controle para essa praga, segundo Mendonça (2003),
é de 0,5 ninfa por metro linear de sulco. Essa recomendação
concorda com a indicada por Dinardo-Miranda (2003), sendo de 0,5
a 1,0 inseto por metro.

3.2. Broca comum Diatraea spp. (Lepidoptera;


Crambidae)

Praga muito comum no Nordeste do Brasil, é responsável por


prejuízos aos canaviais pela ação conjunta do complexo com as
podridões vermelhas. Em canas jovens, provoca o coração morto
pela morte da gema apical. Em cana adulta, também provoca a
morte da gema apical, brotações laterais, atrofia dos entrenós e, em
decorrência disso, sérias perdas industriais, sobretudo em virtude da
ação do complexo broca-podridões. Seu ciclo biológico é
apresentado na Tabela 1.

Tabela 1. Ciclo biológico de Diatraea saccharalis e Diatraea flavipennella em cana-de-


açúcar.

Longevidade em dias (média)


Espécie
Ovo Lagarta Pupa Adulto
D. saccharalis(1) 4a8 40 6 a 14 7

D. flavipennella(2) 4a8 25 a 27 10 a 17 7
(1)
Ciclo médio de 52 a 62 dias. Podem ocorrer até 4 gerações/ano dessa espécie, e a
lagarta
poderá também entrar em diapausa por um período de 100 a 150 dias, com predomínio de
inverno frio e/ou seco.
(2)
Ciclo médio de 39 a 51 dias.
Fonte: adaptado de Guagliumi (1969).

3.2.1. Roteiro para levantamento de infestação


Entre os métodos de avaliação de perdas provocadas pela broca
comum, também chamada de broca pequena, em nível de campo e
usina, sugerimos o seguinte roteiro:
• Dentro de seu universo, ao acaso, examinar no campo,
durante o corte, 100 canas inteiras.
• Anotar para cada uma o nº total de entrenós e os dos
perfurados pela broca.
• Para o cálculo de infestações – o valor é direto, ou seja, a
porcentagem de colmos perfurados entre o total dos
examinados.
• Para intensidade de infestação, em que a precisão é maior em
termos de levantamentos para uma possível ação de controle,
abre-se longitudinalmente cada colmo e contam-se os
internódios brocados.
• O cálculo da intensidade de infestação é fornecido pela
fórmula:

em que
I = intensidade de infestação; Ib = nº de internódios brocados; Ic =
nº total de internódios contados na amostra.
Após as análises dos dados e catalogação dos resultados,
determina-se o grau de infestação, utilizando a Tabela 2.

Tabela 2. Parâmetros do grau e da intensidade de infestação utilizados para Diatraea


saccharalis e Telchin licus em cana-de-açúcar.

Infestação (%) Intensidade(%) Grau de infestação

0 a 25 0a5 Baixo

26 a 50 6 a 10 Moderado

51 a 75 11 a 15 Mediano

76 a 95 16 a 25 Elevado
96 a 100 Além de 26 Muito elevado
Fonte: adaptado de Guagliumi (1969).

3.2.2. Controle biológico


Quando a intensidade de infestação do canavial for acima de
10%, de imediato deve-se realizar a liberação de Cotesia flavipes
(Cam., 1891) (Hym., Braconidae), na razão de 4 mil a 5 mil
indivíduos por hectare, em locais pré-definidos pelos levantamentos.
Em Pernambuco, experiência em controle biológico utilizando C.
flavipes data de 1973, com a implantação de um programa nacional
de melhoramento da cana e controle da D. saccharalis pelo
(IAA/Planalsucar). Foram implantados vários laboratórios em
unidades industriais e com associações de plantadores de cana
para multiplicação em larga escala desse parasitoide (ARAÚJO,
1987).

3.3. Controle biológico da palma forrageira

O Semiárido do Nordeste ocupa uma área de aproximadamente


900 mil km, representando cerca de 10% da área total do País.
Abriga uma vegetação composta por plantas xerófilas, de
composição florística bastante variada denominada caatinga. Essa
ocupa cerca de 800 mil km2 do Nordeste, o que corresponde a 70%
dessa região (RANGEL et al., 2009).
As condições edafoclimáticas são bastante complexas, em razão
de uma acentuada variabilidade das precipitações pluviométricas,
diferenciações térmicas, além de solos rasos, pedregosos e/ ou
arenosos dispondo de baixos teores de matéria orgânica
(EMBRAPA, 1993). Nessa região, é comum a ocorrência do
fenômeno natural da seca, ocasionando graves prejuízos aos
pecuaristas, como a perda de peso dos animais, queda na produção
de leite e o aumento da mortalidade do rebanho, resultante do déficit
parcial ou total de água e forragem (FARIAS et al., 2000).
Nesse contexto, a palma forrageira, representada pelas espécies
Opuntia ficus-indica Mill, com as cultivares Gigante e Redonda e
Nopalea cochenillifera Salm Dyck, conhecida como palma Miúda ou
Doce, constitui o principal alimento de subsistência para os
rebanhos. Atualmente, seu cultivo no Nordeste ocupa uma área de
aproximadamente 600 mil hectares, sendo considerada a maior
reserva de forragem do mundo (PRADO, 2008). Sua importância
está relacionada ao elevado grau de resistência à seca e às altas
temperaturas, adaptabilidade a solos pouco férteis, à alta
produtividade, a qualidades nutricionais e de palatabilidade, além de
suas múltiplas utilidades. A palma forrageira, dependendo da
espécie e variedade, produz inúmeros rendimentos econômicos ao
agricultor, tais como produção de frutas e verduras para consumo
humano, produtos farmacêuticos, cosméticos, mucilagens para
indústrias alimentícias, além do seu uso como substrato na
multiplicação da cochonilha-do-carmim, que origina o corante
natural carmim, produzido em países como o Peru, Chile, México,
dentre outros (BARBERA et al., 2001; MENEZES et al., 2005).
Apesar de apresentar poucas exigências edafoclimáticas ao seu
desenvolvimento vegetativo, tem como fator limitante a ocorrência
de pragas e doenças. Dentre as pragas, estão as cochonilhas
Diaspis echinocacti (Bouché, 1833) (Hemiptera: Diaspididae),
conhecida como cochonilha-de-escamas, e a Dactylopius spp.
(Hemiptera: Dactylopiidae), conhecida vulgarmente como
cochonilha-de-sangue. Esta última, atualmente, vem sendo
considerada a principal praga da cultura, especialmente nos estados
de Pernambuco e da Paraíba (SANTOS et al., 2006). Em
Pernambuco, nos últimos anos, a sua disseminação nos sertões do
Pajeú, Moxotó e Central vem ocasionando graves prejuízos aos
pecuaristas.

3.3.1. Considerações sobre Diaspis echinocacti – cochonilha-


de-escama
A cochonilha-de-escama é um inseto cosmopolita e específico
das cactáceas (ALBUQUERQUE; SANTOS, 2005). Ocorreu pela pri‐
meira vez no Brasil, em 1900, na cidade do Rio de Janeiro
(HEMPEL, 1900), provavelmente junto com as cactáceas Opuntia e
Nopalea, trazidas do México pelos portugueses na época da
colonização, com objetivo de cultivo da cochonilha que produzia o
corante carmim (DOMINGUES, 1963). Em Pernambuco, o primeiro
registro dessa praga ocorreu nos municípios de Caruaru, São Bento
do Una, Arcoverde Pedra, em 1966, na oportunidade de uma
expedição de pesquisa por técnicos do IPA. Naquele momento,
foram assinalados ainda o predador Coccidophilus citricola (Brethes)
e os parasitoides Plagiomerus cyaneus (Ashmead) e Prospaltella
aurantii (Howard). No final dos anos 1960, houve a ocorrência dessa
praga na região da bacia leiteira do Estado de Alagoas (CARVALHO
et al., 1978; WARUMBY et al., 1993). Atualmente, encontra-se
distribuída nos estados da Bahia, de Sergipe, de Alagoas, de
Pernambuco, da Paraíba, do Rio Grande do Norte e do Ceará
(WARUMBY et al., 2005).
No México, é conhecida como escama blindada por apresentar
dificuldades às medidas de controle. É facilmente reconhecida no
campo pela forma aglomerada e irregular de se estabelecer,
apresentando duas formas de escamas: arredondada (fêmeas) e
alongada (machos), ambas de coloração marrom-clara. Formas em
desenvolvimento e fêmeas adultas causam dano direto pela sucção
contínua da seiva desencadeando clorose. Consequentemente,
ocorrem os danos indiretos pela injeção de toxinas, possibilitando a
penetração de microrganismos que provocam apodrecimento e
queda das raquetes, chegando a matar a planta (ALBUQUERQUE;
SANTOS, 2005; WARUMBY et al., 2005).
O ciclo biológico completo desta praga é de aproximadamente 35
dias, passando por 3 fases de ninfa. Os ovos são depositados sob
as carapaças das fêmeas maduras, levando de 2 a 3 dias para eclo‐
direm. As ninfas caminhantes deslocam-se de uma planta para
outra, e o período até seu estabelecimento leva aproximadamente
dois dias. A partir da fixação, essas ninfas de primeiro estádio
passam um período de 9,1 ± 0,2 a 10,0 ± 0,4 dias para
transformarem em ninfas de segundo estádio. Esse segundo estádio
ninfal dura 7,8 ± 0,3 a 8,7 ± 0,3 dias para alcançarem o terceiro
estádio. Essas completam seu desenvolvimento no período de 11,2
± 0,2 a 12,5 ± 0,3 dias. A reprodução se dá por anfigonia e por
partenogênese telítoca, que é a forma mais comum observada em
campo. O potencial reprodutivo anual de uma fêmea chega a atingir
64 bilhões de indivíduos cultivados em palma doce e 54 bilhões de
indivíduos para a palma gigante, com um número de até 7 gerações
(ARRUDA, 1983; ARRUDA FILHO; ARRUDA, 2002; SILVA;
BARBOSA, 1988).
Os inimigos naturais registrados para a cultura da palma
forrageira são os parasitoides Plagiomerus cyaneus (Hymenoptera,
Encyrtidae); Prospaltella aurantii (Hymenoptera, Aphelinidae), e os
predadores Zagreus bimaculosus (Mulsant), Coccidophilus citricola
Brèthes, Chilocorus nigrita (Fabricius) (Figura 1), Pentilia sp.,
Zagloba beautimonti, Calloeneis sp. (Coleoptera: Coccinelidae) e o
sirfídeo Salpingogaster conopida Philipi (Diptera: Syrphidae)
(CARVALHO et al., 1978; LIMA et al., 1991; LOPES et al., 2007;
SILVA, 1990; SILVA; BARBOSA, 1988; SILVA et al., 2006;
WARUMBY et al., 1993).
Figura 1. Ninfas e adultos de Chilocorus nigrita – predador da cochonilha-de-escama
Diaspis echinocacti em palma forrageira.
Foto: Deise Maria Passos da Silva

O controle biológico aplicado dessa praga foi pioneiro em Per‐


nambuco com a multiplicação e liberação dos predadores
Chilocorus nigrita (Coleoptera, Coccinellidae) e Zagreus
bimaculosus (Coleoptera, Coccinellidae), anteriormente
denominados Curinus sp. e Fagreus bimaculosus, respectivamente.
Foi desenvolvido pelo Laboratório de Entomologia da Universidade
Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) em parceria com o IPA, no
período entre 1978 e 1985. Trabalho semelhante foi conduzido em
Alagoas, no período de 1983 a 1987, pela Empresa de Pesquisas
Agropecuária do Estado de Alagoas (Epeal), que realizou no
Município de Batalha a produção em larga escala do predador
Curinus sp. (Coleoptera; Coccinellidae). A técnica de criação em
larga escala para Chilocorus nigrita, tanto em insetário como em
propriedades particulares, foi desenvolvida por Silva e Silva (1991).
Neste trabalho, recomenda-se uma quantidade de 3.200 C. nigrita
para cada 1 hectare. Uma proposta de avaliação de controle
biológico dessa praga foi realizada por Silva (1991) em 14 proprie‐
dades particulares distribuídas em 4 municípios de Pernambuco:
Venturosa, Pedra, Afogados da Ingazeira e Floresta. Utilizou-se uma
escala de notas de 0 a 4 para avaliar a intensidade de infestação da
praga e liberação dos predadores Z. bimaculosus, C. citricola e C.
nigrita. Os resultados mostraram a eficiência na aplicabilidade da
escala, e o percentual de controle foi em torno de 33% a 80%.

3.3.1.1. Recomendações de controle


O controle mais indicado para D. Echinocacti é o manejo
integrado de pragas com ênfase ao biológico, uma vez que já são
conhecidos diversos inimigos naturais, atuando principalmente nos
estados de Pernambuco e Alagoas (ALMEIDA, 1990; CARVALHO et
al., 1978; SILVA, 1990). O manejo integrado dessa praga reúne
algumas técnicas possíveis de serem aplicadas e que foram
baseadas em trabalhos desenvolvidos nos Estados de Pernambuco
e Alagoas (ARRUDA FILHO; ARRUDA, 2006; SILVA, 1991;
WARUMBY et al., 2005), com as seguintes recomendações:
• Realizar corretamente o plantio na época indicada, com ra‐
quetes sadias sem vestígios da praga, procurando certificar-se
sobre a procedência deste material.
• Procurar identificar a presença da cochonilha na área cultiva‐
da com a palma logo no início. Esse monitoramento facilitará a
erradicação das plantas infestadas.
• Manter a cultura no limpo para evitar competição com ervas
daninhas, procurando efetuar adubação química ou orgânica,
de acordo com as recomendações da cultura.
• Procurar identificar novos focos em outras propriedades para
evitar que homens e animais possam transitar de um local para
outro, facilitando a disseminação da praga.
• Eliminar os focos da cochonilha nas áreas cultivadas, desde
que as raquetes infestadas não apresentem os inimigos
naturais. Essa eliminação consiste em cortar as raquetes
atacadas e utilizá-las na alimentação do gado. Essa medida
reduz consideravelmente a população da praga.
• Realizar o controle biológico utilizando os inimigos naturais da
praga, como joaninhas (predadores), especialmente a espécie
C. nigrita, e vespinhas (parasitoides). Esses agentes são
liberados ou remanejados de uma área atacada para outra, por
meio de coleta e novas colonizações. O procedimento dessa
técnica deve ser orientado por um técnico da área. Esse
facilitará as orientações para o conhecimento dos inimigos
naturais, assim como para a obtenção dos inimigos naturais em
laboratório.
• Reconhecimento e separação de machos e fêmeas. O pro‐
cedimento consiste na introdução de machos nas áreas onde
só ocorrem fêmeas visando auxiliar no controle da praga. Para
isso, basta coletar raquetes infestadas onde predominem
escamas alongadas que representam os machos e,
posteriormente, levá-las para outras áreas que estejam
infestadas com predominância de fêmeas. Em seguida é só
amarrar as raquetes nas plantas atacadas com auxílio de um
cordão. Essa medida pode reduzir em até 50% a população de
fêmeas.
• Utilizar novos plantios de cultivares que apresentem resis‐
tência a essa praga. A palma doce ou miúda é a mais
suscetível à praga do que a gigante ou a redonda.
• Antes de tomar qualquer medida é importante constatar se as
cochonilhas estão realmente vivas em desenvolvimento. Para
isso, basta realizar um simples atrito com os dedos sobre as
colônias, e se as carapaças se soltarem facilmente, mostrando
estarem ressecadas, isso comprova que elas já estão mortas,
não havendo necessidade da aplicação de medidas de controle
(CAVALCANTI et al., 2001; WARUMBY et al., 1993).
• Não há registro de produto químico para essa cultura.
Atualmente, a multiplicação de predadores, especialmente C.
nigrita, vem sendo desenvolvida, em pequena escala no Laboratório
de Entomologia do IPA, objetivando conduzir as pesquisas
relacionadas com o programa de manejo integrado de pragas, com
ênfase no controle biológico dessa praga.

3.3.2. Considerações sobre Dactylopius opuntiae – cochonilha-


do-carmim
Nos últimos anos, a produção de palma vem sofrendo sérios
prejuízos causados principalmente pelo ataque da cochonilha-do-
carmim, considerada atualmente a principal praga da palma
forrageira, principalmente nos estados de Pernambuco e da Paraíba
(SANTOS et al., 2006). Foi identificada recentemente pelo Museu
Natural de Londres como pertencente à espécie Dactylopius
opuntiae (Cockerell) (Hemiptera: Dactylopiidae) (LOPES et al.,
2007). No entanto, segundo Costa (1958), esse gênero foi
registrado em Pernambuco em 1830 por Luis Jacques Brunet.
Outras três espécies nativas, D. ceylonicus, D. indicus e D.
subterraneus, são citadas por Silva et al. (1968) em território
nacional.
O gênero Dactylopius é o único da família Dactylopiidae
(superfamília Coccoidea: Hemiptera) que apresenta nove espécies:
D. tomentosus Lamark 1801, D. confusus Cockerell 1893, D.
opuntiae Cockerell 1896, D. ceylonicus Green 1896, D. confertus De
Lotto 1974, D. austrinus De Lotto 1974, D. salmianus De Lotto 1974,
D. zimmermanni De Lotto 1974 e D. coccus Costa 1829
(PORTILLO, 2005).
D. opuntiae é um inseto pequeno, parasito e fitófago, que vive
como hospedeiro específico das cactáceas, preferencialmente O.
ficus-indica (FLORES-FLORES; TEKELENBURG, 2001). Suas colô‐
nias formadas de cera branca flocada são semelhantes a flocos de
algodão que abrigam as formas biológicas do inseto. As fêmeas
adultas apresentam um corpo ovalado, de cor vermelho-escura,
intumescido de ácido carmínico. Os machos se desenvolvem em
casulos de cera alongados, aglomerados, semelhantes a pencas
(WARUMBY et al., 2005). Um recente estudo da biologia desse
inseto, criada sobre O. megacantha Salm Dyck, foi realizado no
Nordeste do México, obtendo os seguintes dados biológicos: a
duração das fêmeas adultas foi de 38,4 dias, e a do macho de 4,2
dias. O ciclo biológico da fêmea foi de 77 dias, e o do macho de 43
dias. As fases ninfais tiveram períodos semelhantes entre 18,1 e
19,8 dias. O período de pré-oviposição foi de 18,8 dias, e o período
de oviposição foi de 21 dias, com uma média de 131 insetos por
fêmea. A razão sexual foi de 1:1, podendo também ocorrer
partenogênese (FLORES-HERNÁNDEZ et al., 2006). Aspectos
biológicos de Dactylopius sp. também foram observados no
Laboratório de Entomologia do IPA em Recife, PE, por Warumby et
al. (1998). Verificaram que a duração do ciclo de vida foi de
aproximadamente 35 dias para o período de verão e de 45 dias nos
meses mais frios. O período de oviposição durou cerca de 15 dias.
A duração das formas migrantes ou ninfas de primeiro estádio foi de
24 horas, período que corresponde à fase de disseminação da
praga em campo.
Nas condições do agreste e sertões do Pajeú, Moxotó e Central,
essa praga encontrou condições apropriadas para o seu desenvolvi‐
mento. No período de seca, quando as raquetes encontram-se
naturalmente em estresse hídrico, o ataque é mais intenso, levando
à exaustão das plantas e à queda das raquetes. Em virtude do seu
hábito alimentar, as feridas causadas pela sucção do inseto
possibilitam a instalação e estabelecimento de patógenos, mais
intensamente logo após o período chuvoso.
Poucos são os estudos realizados sobre os inimigos naturais das
espécies de Dactylopius, mesmo nos países produtores de carmim
como o Perú, Chile, México, Bolívia e Ilhas Canárias onde esses
agentes são considerados ofensivos. Esse conceito refere-se à
necessidade de se manter a produção da cochonilha-do-carmim D.
coccus (Costa, 1829), conhecida como gram fina, sem interferências
de agentes de mortalidade biótica, visando à qualidade na obtenção
do ácido carmínico (FLORES-FLORES; TEKELENBURG, 2001). Os
trabalhos de Diodato et al. (2004), Mena Covarrubias e Rosas
Gallegos (2007) e Portillo e Vigueras (2006) apontam diversos
insetos entomófagos, destacando principalmente os coleópteros da
família Coccinellidae, com os representantes Chilocorus cacti,
Chilocorus sp., Exochomus flavipes, Hyperaspis conclusa, Scymnus
intrusus, Cryptolaemus montrouzieri, Cybocephalus sp. Um dos
levantamentos mais completos de inimigos naturais que citam a
ocorrência dos parasitoides Salambona analamprella (Lepidoptera,
Pyralidae) e Simpherobius marmoratipennis (Neuroptera, Hemerobi‐
dae) foi realizado por Diodato et al. (2004). Esse trabalho registra
ainda a ocorrência de mais uma espécie de cochonilha do gênero
Dactylopius, o qual assinalou pela primeira vez a espécie D. bassi
(Targioni Tozzetti 1866).
Estudos relacionados com o levantamento de inimigos naturais
de Dactylopius sp. vem sendo conduzidos por pesquisadores do
IPA, desde 2005, em diversos municípios infestados de
Pernambuco. Silva et al. (2006) registraram os predadores Zagreus
bimaculosus (Mulsant), Coccidophilus citricola Brèthes,
Salpingogaster conopida (Philipi) (Diptera: Syrphidae).
Recentemente foram encontrados Exochomus sp. (Coleoptera,
Coccinellidae) e Chrysopa sp. (Neuroptera, Chrysopidae). Até o
momento não foi observado em campo presença de parasitoides
dessa praga. O predador C. montrouzieri Mulsant vem sendo
multiplicado sobre Dactylopius sp. no Laboratório de Entomologia da
Embrapa Semiárido.
Estudos da bioecologia dessa praga vêm sendo desenvolvidos
em duas áreas experimentais nos municípios de Pedra e Serra
Talhada, por meio de um projeto em parceria entre o IPA e a
Embrapa Semiárido.
O estudo de variedades resistentes de palma forrageira vem
sendo desenvolvido há anos pelo IPA e recentemente em parceria
com a Embrapa. As variedades miúda, orelha de elefante mexicana
e a IPA Sertânia são as mais promissoras e estão sendo
multiplicadas, em cultura de tecido, em pequena escala (SANTOS et
al., 2005). Entretanto, a substituição desses materiais na
comunidade agrícola será em longo prazo, necessitando de novas
alternativas de controle.

4. Considerações finais

As pragas de importância agrícola que acometem as culturas da


cana-de-açúcar e da palma forrageira representam ainda uma
diversidade a ser explorada, principalmente em razão da sua
elevada capacidade de disseminação e adaptação às condições
adversas do meio ambiente.
No Nordeste, os resultados já alcançados nos programas de
manejo integrado, especialmente o controle biológico das
cigarrinhas-da-cana-de-açúcar e da broca D. saccharalis, incentivam
o desafio para novas pesquisas voltadas para o controle da
cochonilha-do-carmim Dactylopius spp. Para isso, o conhecimento
da bioecologia, biologia, identificações moleculares das demais
espécies ocorrentes e de seus inimigos naturais precisam ser
desvendados para consolidar direcionamentos efetivos nos
programas de manejo integrado da cochonilha-da-palma-forrageira.

5. Referências

AGUIAR-MENEZES, E. de L. Controle biológico de pragas: princípios e estratégias de


aplicação em ecossistemas agrícolas. Seropédica: Embrapa Agrobiologia, 2003. 44 p.
(Embrapa Agrobiologia. Documentos, 164).
ALBUQUERQUE, S. G.; SANTOS, D. C. Palma forrageira. In: KIILL, L. H. P.; MENEZES, E.
A. (Ed.). Espécies vegetais exóticas com potencialidades para o semi-árido. Brasília, DF:
Embrapa Informação Tecnológica, 2005. p. 91-127.
ALMEIDA, R. P. Aspectos bioecológicos de predadores (Coleoptera, Coccinellidae) sobre a
cochonilha da palma forrageira Diaspis echinocacti Bouché, 1833 (Homoptera, Diaspididae) em
condições de laboratório. 1990. 138 p. Dissertação (Mestrado em Nutrição Animal) –
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, 1990.
ALTIERI, M. A. Agroecologia: as bases científicas da agricultura alternativa. 2. ed. Rio de
Janeiro: PTA-FASE, 1989. 240 p.
ALTIERI, M. A. Agroecologia: bases científicas para uma agricultura sustentável. Guaíba:
Agropecuária, 2002. 592 p.
ALTIERI, M. A. Agroecology: the scientific basis of alternative agriculture. Boulder: Westview
Press, 1987. 240 p.
ALTIERI, M. A. Classical biological control and social equity. Bulletin of Entomological
Research, London, UK, v. 81, p. 365-369, 1991.
AQUINO, M. L. N.; CAVALCANTI, V. A. L. B.; SENA, R. C.; QUEIROZ, G. F. Nova tecnologia
de multiplicação do fungo Metarhizium anisopliae. Recife: CODECAP, 1975. 29 p.
(CODECAP. Boletim Técnico, 4).
ARAÚJO, J. R. Guia prático para criação da broca da cana-de-açúcar e de seus parasitóides
em laboratório. Piracicaba: Programa Nacional de Melhoramento da cana-de-açúcar, 1987.
36 p.
ARRUDA FILHO, G. P. de; ARRUDA, G. P. de. Manejo integrado da cochonilha Diaspis
echinocacti praga da palma forrageira no Brasil: manejo integrado de pragas. Turrialba,
San José, CR, v. 64, p. 1-6, 2002.
ARRUDA FILHO, G. P. de; ARRUDA, G. P. de. Manejo integrado de cochonilha Diaspis
echinocacti praga da palma forrageira em Brasil. In: MANEJO integrado de plagas y
agroecológia: haja técnica. Disponível em: <www.wweb.catie.ac.cr/informacion? RMIP/ver.
64/>. Acesso em: 20 abr. 2006.
ARRUDA, G. P. de. Aspectos etológicos da cochonilha da palma forrageira Diaspis echinocacti
(Bouché, 1833) (Homoptera, Diaspididae). 1983. 122 p. Tese (Mestrado) - Universidade
Federal Rural de Pernambuco, Recife, 1983.
BARBERA, G.; INGLESE, P.; BARRIOS, E. P. Apresentação. In: BARBERA, G.; INGLESE,
P.; BARRIOS, E. P. Agroecologia, cultivo e usos da palma forrageira. João Pessoa: Sebrae,
2001. p. 23. (Estudo da FAO em Produção Vegetal, 132).
BERTI FILHO, E.; CIOCIOLA, A. I. Parasitóides ou predadores?: vantagens e
desvantagens. In: PARRA, J. R. P.; BOTELHO, P. S. M.; CORRÊA-FERREIRA, B. S.;
BENTO, J. M. S. (Ed.). Controle biológico no Brasil: parasitóides e predadores. São Paulo:
Manole, 2002. p. 29.
CALTAGIRONE, L. E. Definitions and principles of biological control. In: INTERNATIONAL
SHORT COURSE IN BIOLOGICAL CONTROL, 2., 1988. Berkeley. Proceedings… Berkeley:
[s.n.], 1988.
CAMARGO, H. T. Produção agrícola e alimentação: tendências para o futuro. Revista de
Informação Legislativa, Brasília, DF, v. 39, n. 155, p. 18, jul./set. 2002. Disponível em:
<www.senado.gov.br/web/cegraf/ril/Pdf/pdf_155/R155>. Acesso em: 10 fev. 2009.
CARRERA, M. Entomologia para você. 5. ed. São Paulo: Nobel, 1980.
CARVALHO, H. B. de; ARRUDA, G. P. de; ARRUDA, E. C. de. A cochonilha da palma
forrageira Diaspis calyptroides (Homóptera, Diaspididae) e seus inimigos naturais em
Pernambuco e Alagoas. Caderno Omega, Recife, v. 2, n. 1, p. 125-130, 1978.
CASTRO, P. R. C.; CHRISTOFFOLETI, P. J. Fisiologia da cana-de-açúcar. In:
MENDONÇA, A. F. Cigarrinhas da cana-de-açúcar: controle biológico. Maceió: Insecta,
2005. p. 3-48.
CAVALCANTI, V. A. L. B.; SENA, R. C.; COUTINHO, J. L. B.; ARRUDA, G. P. de;
RODRIGUES, F. B. Controle das cochonilhas da palma forrageira. Recife: Empresa
Pernambucana de Pesquisa Agropecuária-IPA, 2001. 2 p. (IPA Responde, 39).
CONAB. Companhia Nacional de Abastecimento. Disponível em: <www.conab.org.br>.
Acesso em: 29 out. 2008.
COSTA, F. A. P. Anais Pernambucanos do Arquivo Público Estadual, Recife, v. 7, p. 23-26,
1958.
CROCOMO, W. B. O que é o manejo de pragas. In: CROCOMO, W. B. (Ed.). Manejo de
pragas. Botucatu: UNESP, 1990. p. 9-34.
DEBACH, P. Biological control of insect pests and weeds. New York: Reihold, 1964.
DINARDO-MIRANDA, L. L. Cigarrinhas das raízes em cana-de-açúcar. Campinas: IAC, 2003.
70 p.
DIODATO, L.; ITURRE, M.; PAZ, M. E. Especies de Dactylopius em Argentina y factores
que inciden em su producción. Revista de Ciências Forestales Quebracho, Santiago, CL, n.
11, p. 67-72, 2004.
DOMINGUES, O. Origem e introdução da palma forrageira no Nordeste. Recife: Instituto
Joaquim Nabuco de Pesquisa Sociais, 1963. 76 p.
EMBRAPA. Centro de Pesquisa Agropecuária do Tropico Semi-Árido. Zoneamento
agroecológico do Nordeste. Petrolina: EMBRAPA-CPATSA, 1993. 155 p.
ESTRUCH, J. J.; CAROZZI, N. B.; DESAI, N.; DUCK, N. B.; WARREN, G. W.; KOZIEL, M.
G. Transgenic plants: an emerging approach to pest control. Nature Biotechnology, New
York, v. 15, p. 137-141, 1997.
FAO. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Statistical databases:
agriculture. 2005. Disponível em: <http://www.fao.org/faostat>. Acesso em: 14 jan. 2009.
FARIAS, I.; LIRA, M. A.; SANTOS, D. C.; TAVARES FILHO, J. J.; SANTOS, M. V. F. dos;
FERNANDES, A. P. M.; SANTOS, V. F. Manejo de colheita e espaçamento da palma
forrageira, em consórcio com sorgo granífero, no Agreste de Pernambuco. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 35, n. 2 p. 341-347, 2000.
FENNAH, R. G. Revisionary notes on the new world genera of cercopid froghoppers
(Homoptera: Cercopidae). Bulletin of Entomological Research, London, UK, v. 58, p. 165-
190, 1968.
FLORES-FLORES, V.; TEKELENBURG, A. Produção de corante Dacti (Dactylopius
coccus). In: BARBERA, G.; INGLESE, P.; BARRIOS, E. P. Agroecologia, cultivo e utilizações
da palma forrageira. João Pessoa: Sebrae, 2001. p. 169-186.
FLORES-HERNANDEZ, A.; MURILLO-AMADOR, B.; RUEDA-PUENTE, E. O.; SALAZAR-
TORRES, J. C.; HERNANDEZ-GARCÍA, J. L.; TROYO-DIÉGUEZ, E. Reproducción de
cochinilla silvestre Dactylopius opuntiae (Homóptera: Dactylopiidae). Revista Mexicana de
Biodiversidad, México, DF, v. 77, p. 97-102, 2006.
GALLO, D.; NAKANO, O.; SILVEIRA NETO, S.; CARVALHO, R. P. L.; BAPTISTA, G. C. de
V.; BERTI FILHO, E.; PARRA, J. R. P.; ZUCCHI, R. A.; ALVES, S. B.; VENDRAMIM, J. D.;
LOPES, J. R. S.; OMOTO, C. Entomologia agrícola. 2. ed. São Paulo: Agronômica Ceres,
2002. 649 p.
GUAGLIUMI, P. Entomofauna della canna da zucchero nel Nord- Est Del Brasile. Firenze
Instituto Agronomico per I” Oltremar. Rivista di Agricoltura Subtropicale e Tropicale, Firenze,
v. 65, p. 4-6, apr./giugno 1971.
GUAGLIUMI, P. Las “cigarrinhas dos canaviais” em Brasil: aspectos generales del
problema, com especial referencia a Mahanarva posticata em los Estados de Pernambuco
y de Alagoas. Turrialba, San José, CR, v. 19, n. 3, p. 321-331, 1969.
GUAGLIUMI, P. Las plagas de la caña de azúcar. Maracay: Ministério de Agricultura y Cria,
1962. v. 1, 428 p.
GUAGLIUMI, P. Pragas da cana-de-açúcar: nordeste do Brasil. São Paulo: Instituto do
Açúcar e do Álcool, 1973. 622 p. (Coleção Canavieira, 10).
HEMPEL, A. As Coccidas brasileiras. Revista do Museu Paulista, São Paulo, v. 4, p. 520,
1900.
HERRERA-ESTRELLA, L. Transgenic plants for tropical regions: some consideration about
their development and their transfer to the small farmer. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, Washington, DC, v. 96, p. 5978-5981,
1999.
KUENEN, D. J. The ecological effects of chemical and biological control of indesirable plants
and insects: general introduction. Warsaw, PL: UICN., 1960. 6 p. (Relatório. Reunião
Técnica, 8).
LIMA, I. M. de M.; VEIGA, A. F. de S. L.; GOMES, D. N. D.; ALMEIDA, R. P. de. Registro de
ocorrência de Zilus beaumonti CASEY (Coleoptera, Coccinellidae) como novo predador de
Diaspis echinocacti Bouché, 1833 (Homoptera, Diaspididae), em Pernambuco. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE ENTOMOLOGIA, 13., 1991, Recife. Resumos... Recife:
SBE, 1991. p. 605.
LOPES, E. B.; BATISTA, J. L.; BRITO, C. H.; SANTOS, D. C. Pragas da palma. In: LOPES,
E. B. (Ed.). Palma forrageira: cultivo, uso atual e perspectivas de utilização no semi-árido
nordestino. João Pessoa: EMEPA-FAEPA, 2007.
p. 34-40. 1 CD-ROM.
MARANHÃO, Z. C. Entomologia geral. São Paulo: Nobel, 1976. 514 p.
MARQUES, E. J.; LIMA, R. O. R. de L.; VILAS BOAS, A. M.; PEREIRA, C. E. F. Controle
biológico da cigarrinha da folha Mahanarva posticata (Stal) (Hemiptera: Cercopidae) em
cana-de-açúcar nos Estados de Pernambuco, Paraíba e Rio Grande do Norte. In:
MENDONÇA, A. F. Cigarrinha da cana-de-açúcar: controle biológico. Maceió: Insecta, 2005.
p. 295-301.
MARQUES, E. J.; VILAS BOAS, A. M. Avaliação de danos de Mahanarva posticata (Stal,
1855) (Hom.: Cercopidae) em cana-de-açúcar. Anais da Sociedade Entomológica do Brasil,
Jaboticabal, v. 7, n. 2, p. 99-104, 1978.
MARQUES, E. J.; VILAS BOAS, A. M.; PEREIRA, C. E. F. Orientações técnicas para a
produção do fungo entomopatógeno Metarhizium anisopliae (Mestsch) em laboratórios
setoriais. Boletim Técnico Planalsucar, Piracicaba, v. 3, n. 2, p. 5-23, 1981.
MENA COVARRUBIAS, J.; ROSAS GALLEGOS, S. Guia para el manejo integrado de las
plagas del nopal tunero. Calera de Victor Rosales: INIFAP, 2007. 34 p. (INIFAP. Publicación
Especial, 14).
MENDONÇA, A. F. Controle da cigarrinha da raiz na cana. IDEA News, Ribeirão Preto, v.
38, p. 48-53, 2003.
MENDONÇA, A. F.; BARBOSA, G. V. S.; MARQUES, E. J. As cigarrinhas da cana-de-
açúcar (Hemíptera; Cercopidae) no Brasil. In: MENDONÇA, A. F. (Ed.). Pragas da cana-de-
açúcar. Maceió: Insetos & Cia, 1996. 239 p.
MENDONÇA, A. F.; FLORES, S.; SÁENZ, C. S. E. Cigarrinhas da cana-de-açúcar na
América Latina e Caribe. In: MENDONÇA, A. F. Cigarrinha da cana-de-açúcar: controle
biológico. Maceió: Insecta, 2005. p. 51-90.
MENDONÇA, A. F.; MARQUES, E. J. Cigarrinha da folha Mahanarva posticata (Stal)
(Hemiptera: Cercopidae). In: MENDONÇA, A. F. Cigarrinha da cana-de-açúcar: controle
biológico. Maceió: Insecta, 2005. p. 141-163.
MENDONÇA, A. F.; MENDONÇA, I. C. B. R. Cigarrinha da raiz Mahanarva fimbriolata
(Hemiptera: Cercopidae). In: MENDONÇA, A. F. Cigarrinha da cana-de-açúcar: controle
biológico. Maceió: Insecta, 2005. p. 95-136.
MENEZES, M. As cigarrinhas das pastagens (Homoptera; Cercopidae) na região sul da Bahia,
Brasil: identificação, distribuição geográfica e plantas hospedeiras. Ilhéus: Ceplac, 1982. 48
p. (CEPLAC. Boletim Técnico, 104).
MENEZES, R. C.; SIMÕES, D. A.; SAMPAIO, E. V. S. B. A palma no Nordeste do Brasil:
conhecimento atual e perspectivas de uso. Recife: UFPE, 2005. p. 65-80.
MOREIRA, C. Entomologia agrícola brasileira. Rio de Janeiro: Imprensa Nacional, 1921. v.
1, 170 p. (Boletim do Instituto de Biologia e Defesa Agrícola, 1).
MORETTI, P. E. Controle biológico de pragas agrícolas. In: MICROBIOLOGIA:
fundamentos & aplicações. 2008. Disponível em:
<http://www.fam.br/microrganismos/microbiologia_ambiental>. Acesso em: 2 dez. 2008.
NAVA, D. E. Controle biológico de insetos-praga em frutíferas de clima temperado: uma
opção viável, mas desafiadora. Pelotas: Embrapa Clima Temperado, 2007. 20p. (Embrapa
Clima Temperado. Documentos, 208).
PASCHOAL, A. S. Pragas, praguicidas e a crise ambiental: problemas e soluções. Rio de
Janeiro: Fundação Getúlio Vargas, 1979. 102 p.
PECK, D. C. Diversidad y distribuición: seminario 1. In:TALLER SOBRE LA BIOECOLOGIA
Y MANEJO DE CERCOPIDIOS EN GRAMÍNEAS, 2001, Santa Maria, GT. Seminário...
Santa Maria, GT: Cencicaña, 2001. p. S1-S16.
PEREIRA, R. M.; ALVES, S. B.; REIS, P. R. Controle microbiano de insetos. In: ALVES, S.
B. (Ed.). Segurança no emprego de entomógenos. Piracicaba: FEALQ, 1998. p. 171-194.
PORTILLO, L. Origen de Dactylopius coccus Costa (Hemiptera: Dactylopiidae): Norte o
Sudamérica? Dugesiana, Guadalajara, v. 12, n. 1, p. 1-8, 2005.
PORTILLO, M. L.; VIGUERAS, A. L. A review on the cochineal species in México, host and
natural enemies. Acta Horticulturae, The Hague, n. 728, p. 249-255, 2006.
PRADO, J. Projeto palmas para o semi-árido. União Rural: informativo FAEC/SENAR,
Fortaleza, ano 14, n. 140, p. 3, 2008.
RANGEL, A. H. do N.; LIMA JUNIOR, D. M. de; BRAGA, A. P.; SIMPLÍCIO, A. A.
Suprimento e demanda de nutrientes em sistemas em não equilíbrio. Revista Verde,
Mossoró, v. 4, n. 1, p. 14-30, 2009.
SANTOS, D. C.; LIRA, M.; DIAS, F. M. Melhoramento genético da palma forrageira. In:
MENEZES, R. S. C.; SIMÕES, D. A.; SAMPAIO, E. V. S. B. A palma no Nordeste do Brasil:
conhecimento atual e novas perspectivas de uso. Recife: UFPE, 2005. p. 27-42.
SANTOS, D. C.; LIRA, M.; FARIAS, I.; DIAS, F. M.; COSTA, A. F.; PEREIRA, V. L. A.;
SILVA, D. M. P. Seleção de clones de palma forrageira resistentes à cochonilha do carmim
Dactylopius sp, em condições de campo. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE
BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 43., 2006, João Pessoa. Anais... João Pessoa: SBZ, 2006.
1 CD-ROM.
SCOLARI, D. D. G. Produção agrícola mundial: o potencial do Brasil. Disponível em:
<http://www.ripa.com.br/index.php?
id=814&tx_ttnews%5Btt_news%5D=403&tx_ttnews%5BbackPid%5D=471&cHash=ff227dd
c5f>. Acesso em: 30 jun. 2006.
SILVA, A. G. A.; CINCINNATO, R. G.; GALVÃO, D. M.; GONÇALVES, A. J. L.; GOMES, J.;
SILVA, M. do N.; SIMONE, L. Quarto catálogo dos insetos que vivem nas plantas do Brasil
seus parasitos e predadores. Rio de Janeiro: Ministério da Agricultura-Laboratório Central de
Patologia Vegetal, 1968. pt. 2, t. 1, p. 174.
SILVA, C. C. A. de; BARBOSA, S. M. de. Aspectos biológicos de Curinus sp, um predador
da cochonilha-da-palma forrageira. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 23, n.
2, p. 103-105, 1988.
SILVA, C. C. de; SILVA, D. M. P. da. Flutuação populacional da cochonilha da palma
forrageira Diaspis echinocacti ( Bouché, 1833) no Município de Batalha, Al. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE ENTOMOLOGIA, 13., 1991, Recife. Resumos... Recife:
SBE, 1991. p. 604.
SILVA, D. M. P. da. Ocorrência de Calloeneis sp. sobre a cochonilha da palma em Alagoas.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 25, n. 2, p. 281-282, 1990.
SILVA, D. M. P. da; CAVALCANTI, V. A. L. B.; FERREIRA, W. M.; SANTOS, J. M. dos;
PEREIRA, V. L. A.; COSTA, A. F. da; ARRUDA, G. P. de. Inimigos naturais da cochonilha-
do-carmim Dactylopius opuntiae (Hemiptera, Dactylopiidae) encontrados em Pernambuco.
In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENTOMOLOGIA, 21., 2006, Recife. Resumos... Recife:
Sociedade Brasileira de Entomologia, 2006. 1 CD-ROM.
SILVA, S. Q. da. Avaliação do controle biológico da cochonilha Diaspis echinocacti (Bouché,
1833) (Homoptera, Diaspididae) da palma forrageira em Pernambuco. 1991. 103 p.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, 1991.
WARUMBY, J. F.; ARRUDA FILHO, G. P.; CAVALCANTI, V. A. L. B.; ARRUDA, G. P.
Pragas da palma. In: MENEZES, R. S. C.; SIMÕES, D. A.; SAMPAIO, E. V. S. B. A palma
no Nordeste do Brasil: conhecimento atual e novas perspectivas de uso. Recife: UFPE, 2005.
p. 65-80.
WARUMBY, J. F.; ARRUDA, G. P.; PESSOA, L. G. A.; ARCHANJO NETO, M. M. Etologia
de la cochinilla del carmim (Dactylopius spp.) (Homoptera, Dactylopiidae) em el
Departamento Pernambuco – Brasil. In: CONGRESSO INTERNACIONAL DE GRANA
COCHINILLA Y COLORANTES NATURALES, 1998, Oaxaca. Memorias... Oaxaca:
Bioderivados S.A.-Instituto Tecnológico Agropecuário, 1998. v. 23, p. 68.
WARUMBY, J. F.; TAVARES FILHO, J. J.; SANTOS, D. C. dos; ARRUDA, G. P. Controle
integrado da cochonilha Diaspis echinocacti (Homóptera, Diaspididae) que ocorre sobre a
palma forrageira no Nordeste. Recife: IPA, 1993 7 p. (IPA. Comunicado Técnico, 57).
Capítulo 3
Cultura de tecidos vegetais:
técnicas utilizadas para
multiplicação acelerada da palma
forrageira
Andréa Guimarães Vieira de Vasconcelos
Virginia Maria Tenório Sabino Donato
Júlio Zoé de Brito
Mario de Andrade Lira

1. Introdução

As palmas forrageiras (Opuntia e Nopalea) são plantas adapta‐


das às condições edafoclimáticas da região semiárida e se
constituem na base da alimentação de ruminantes nessa região.
Apresentam altas produções de matéria seca por unidades de área,
é uma excelente fonte de energia, rica em carboidratos não fibrosos
e nutrientes digestíveis totais, além de suprir parte das
necessidades de água dos animais. Acredita-se que existam
atualmente 600 mil hectares de palma plantados no Nordeste, dos
quais 100 mil no Estado de Pernambuco (SANTOS et al., 2006).
Apesar da sua adaptação às condições de cultivo da região
semiárida, a ocorrência de pragas e doenças vem provocando res‐
trições na exploração da cultura. Assim, de forma a evitar um
decréscimo da produção, pesquisas vêm sendo realizadas no
sentido de obter clones mais adaptados às condições de cultivo em
parte do Semiárido nordestino, que apresentam restrições
edafoclimáticas e fitossanitárias para o desenvolvimento da cultura.
A palma se multiplica de forma vegetativa (assexuada) por
estaquia de cladódios. A propagação sexual, por sementes,
apresenta problemas, dentre eles a segregação genética, uma longa
fase juvenil e uma baixa velocidade de crescimento.
A fonte de material vegetativo para implantação da palma são as
plantações comerciais, apesar de essas apresentarem as desvan‐
tagens de propagação de doença e falta de certificação genética.
Além disso, a necessidade de grande quantidade de material
demandada para implantação da cultura é um sério problema
prático.
A limitação desse sistema de propagação pode ser superada
pela utilização de tecnologias disponíveis, como a cultura de tecidos
vegetais. O cultivo in vitro de tecidos vegetais apresenta grande apli‐
cação na agricultura. No caso de plantas que se propagam de forma
lenta, como a palma, é uma alternativa possível de ser utilizada para
a multiplicação e difusão de cultivares promissoras.
A cultura de tecidos vegetais se fundamenta na teoria da totipo‐
tência vegetal, que considera que células vegetais manifestam, em
momentos diferentes e sob estímulo apropriado, a potencialidade de
iniciar um novo indivíduo multicelular (KERBAUY, 1997). Assim, utili‐
zando fragmentos de tecidos vegetais, sob adequadas condições de
assepsia, nutrição e fatores ambientais como luz, temperatura, 02 e
CO2, é possível a regeneração de uma planta inteira com as
mesmas características das plantas originais.
Com o advento da biotecnologia, a técnica de micropropagação
teve um forte impacto sobre a produção de plantas em larga escala,
e centenas de protocolos foram estabelecidos visando à produção
comercial de mudas e à preservação de espécies vegetais
ameaçadas de extinção (SOUZA; PEREIRA, 2007).
Segundo Hartmann et al. (1998), a propagação de plantas in vitro
é constituída de quatro fases: estabelecimento dos explantes in
vitro; multiplicação dos explantes; enraizamento das brotações e
aclimatação de plantas. A fase de estabelecimento dos explantes
tem como objetivo a obtenção de uma cultura isenta de patógenos.
A fase de multiplicação visa estimular a produção do maior número
possível de brotações. Para isso, são utilizados reguladores de
crescimento, geralmente auxinas, citocininas e giberelinas. Para o
estímulo à formação de raízes, as brotações são transferidas para
um meio de cultura específico de enraizamento, suplementado com
reguladores de crescimento, geralmente auxinas como o ácido
indolbutírico (IBA) e ácido naftalenoacético (ANA). Finalmente a
última fase, a aclimatização, consiste na adaptação da planta a um
novo ambiente, onde não mais terá os nutrientes prontamente
disponíveis do meio de cultura, iniciando-se assim a fase de
autotrofia (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
Para o estabelecimento in vitro, é necessário estudos de com‐
binações ótimas de fatores (genótipo x fonte de explante x
condições de cultivo) para que o processo seja bem sucedido.
Llamoca-Zárate (1999) iniciou o desenvolvimento de protocolo para
multiplicação in vitro da Opuntia fícus-indica. Vasconcelos et al.
(2002) trabalharam na multiplicação da espécie Nopalea
cochenellifera. A partir desses trabalhos, foi possível identificar que
um dos principais problemas na micropropagação da cultura é a
etapa de multiplicação. O número de brotos obtidos tem se
mostrado bem inferior às brotações de outros vegetais como o
abacaxi e a cana-de-açúcar, que têm protocolos comerciais de
micropropagação estabelecidos (LORENZO et al., 1998; SILVA et
al., 2007).
A definição completa de um protocolo precisa contemplar todas
as etapas envolvidas na multiplicação até a disponibilização de
material vegetativo para plantio de novos clones. Esse texto visa
descrever as etapas e protocolos definidos para a multiplicação in
vitro da palma forrageira.

2. Estabelecimento dos explantes in vitro


2.1. Explantes

Dentro da terminologia da cultura de tecidos, explante é qualquer


segmento de tecido oriundo de uma planta para iniciar uma cultura
in vitro.
Geralmente, para iniciar-se o cultivo in vitro são utilizados
explantes de tecidos jovens com tamanhos que podem variar de 0,2
mm a 20 mm ou mais. O tamanho do explante, em geral, está
relacionado com o objetivo do trabalho, devendo ser o menor
possível quando se trata de obter a limpeza clonal. Por outro lado, o
tamanho do explante determina suas chances de sobrevivência e
desenvolvimento.
A planta matriz é aquela da qual serão retirados os explantes. A
sanidade da planta matriz é um importante fator no que tange à
facilidade de descontaminação do explante no processo de estabe‐
lecimento da cultura in vitro. Para a cultura da palma, verificou-se a
viabilidade de inoculação de seguimentos contendo pelo menos 1
gema com tamanho variando entre 0,5 cm2 e 1 cm2 obtidos de
cladódios jovens, brotados das plantas matrizes colhidas nos
campos de produção.

2.2. Desinfestação

A desinfestação é um processo de esterilização da superfície do


explante, visando eliminar os microrganismos como bactérias,
fungos e leveduras. Esse processo é necessário, pois além de
competir pelos nutrientes do meio de cultura, esses agentes podem
produzir toxinas que influenciam o processo de regeneração do
explante.
Para assegurar a sanidade dos explantes utilizados na intro‐
dução da cultura, sugere-se um pré-tratamento aplicado no cladódio
matriz. Os cladódios colhidos no campo devem ser lavados com o
auxílio de uma esponja e detergente neutro e em seguida tratados
com solução de fungicida (Carbendazin 1,3 mL/L), secos ao ar e
acondicionados em câmara de germinação tipo BOD (30 oC ±1 oC e
16 horas de luz). Esse acondicionamento visa estimular a formação
dos brotos que serão utilizados como fonte de explantes para início
do processo de multiplicação in vitro.
As brotações devem ser pulverizadas com o mesmo fungicida, e,
após 15 dias, os cladódios jovens, entre 5 cm e 8 cm, podem ser
submetidos ao processo de desinfestação para introdução in vitro.
Para desinfestação dos explantes, podem ser utilizadas diversas
substâncias de ação germicida. Entre as mais utilizadas estão o
etanol, o hipoclorito de sódio e o de cálcio. Além desses, também
são usados o cloreto de mercúrio, ácido clorídrico, peróxido de
hidrogênio, entre outros.
Para a palma forrageira, um método eficiente de desinfestação
consiste na lavagem do material com álcool etílico a 70% durante
um minuto, seguida de imersão em solução de hipoclorito de sódio a
2% por 10 minutos.
Após esse processo de desinfestação, os tecidos devem ser
lavados por três vezes com água destilada autoclavada, já em
ambiente estéril (câmara de fluxo laminar), para em seguida
proceder o isolamento e a inoculação dos explantes no meio de
cultivo.

2.3. Isolamento

O isolamento dos explantes consiste na sua extração, propria‐


mente dita, e só deve ser feita em câmara de fluxo estéril, com
flambagem de todos os instrumentos utilizados. É recomendável
utilizar mais de um conjunto de pinças e bisturis, de maneira que,
após a flambagem, o material possa esfriar antes de ser utilizado.
Antes do início dos trabalhos, a câmara deve ser limpa com
etanol e esterilizada com lâmpada germicida por um mínimo de 20
minutos. O fluxo de ar deve ser acionado antes que seja desco‐
nectada a luz germicida. A manipulação do explante deve ser rápida
e precisa para evitar sua desidratação. Após o isolamento, os
explantes devem ser inoculados no meio de cultura adequado.

2.4. Meios de cultura

Os meios nutritivos utilizados para a cultura de células, tecidos e


órgãos de plantas fornecem as substâncias essenciais para o
crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão de
desenvolvimento in vitro. As mesmas vias bioquímicas e
metabólicas básicas que funcionam nas plantas são conservadas
nas células cultivadas, embora alguns processos, como
fotossíntese, possam ser inativados pelas condições de cultivo e
pelo estado de diferenciação das células. Por isso, os meios
nutritivos se baseiam nas exigências das plantas quanto aos
nutrientes minerais, com algumas modificações para atender às
necessidades específicas in vitro. Complementando as substâncias
biossintetizadas pelas células, vários compostos orgânicos são
adicionados ao meio para suprirem as necessidades metabólicas,
energéticas e estruturais das células.
As formulações dos meios de cultura básicos são inúmeras, não
existindo um meio padrão, embora o mais amplamente difundido
seja o meio idealizado por Murashige e Skoog, em 1962, conhecido
mundialmente como meio MS, descrito na Tabela 1.

Tabela 1. Composição do meio de cultura de Murashige e Skoog (1962).

Constituinte Quantidade (mg/L)

Inorgânico

NH4NO3 1.650

KNO3 1.900

CaCl2 2 H2O 440

MgSO4 7 H2O 370

KH2PO4 170
KI 0,83

H3BO3 6,2

MnSO4 4 H2O 22,3

ZnSO4 7 H2O 8,6

Na2MoO4 2 H2O 0,25

CuSO4 5 H2O 0,025

CoCl2 6 H2O 0,025

FeSO4 7 H2O 27,8

Na2 EDTA 2 H2O 37,3

Orgânico

Inositol 100

Tiamina Hl 0,1

Ácido nicotínico 0,5

Piridoxina HCl 0,5

Glicina 2,0

Sacarose 30.000

Ágar 0,8%
Fonte: Murashige e Skoog (1962).

2.4.1. Componentes de meios nutritivos


A composição dos meios nutritivos deve abranger todos os
minerais essenciais à nutrição vegetal, além de fornecer uma fonte
de carbono, em geral um carboidrato, tendo em vista a reduzida
capacidade, ou mesmo a total incapacidade, fotossintética dos
explantes. Algumas vitaminas e aminoácidos também podem ser
incorporados ao meio nutritivo. No desenvolvimento dos meios
nutritivos para a cultura de tecidos de plantas, houve, desde o início,
uma procura de meios definidos de composição conhecida e
controlada. Assim, torna-se possível a reprodução dos resultados
em qualquer época ou lugar.

2.4.1.1. Água
A água é o componente de maior quantidade no meio. É uma
fonte potencial de impurezas que podem afetar o crescimento de
tecidos in vitro. A água destilada e deionizada, ou bidestilada,
normalmente, é suficiente pura para uso nos meios. No entanto,
dependendo da fonte da água do laboratório (poço artesiano, por
exemplo), podem ser encontrados contaminantes orgânicos voláteis,
que permanecem após a destilação e inibem o crescimento das
culturas.

2.4.1.2. Macronutrientes
Os nutrientes empregados nos meios de cultura são os mesmos
estabelecidos para a nutrição mineral básica das plantas no campo.
Os elementos exigidos em maiores quantidades para o cresci‐
mento de plantas inteiras são incluídos nos meios nutritivos na
forma de sais inorgânicos; são eles o nitrogênio, fósforo, potássio,
cálcio, magnésio e enxofre.

2.4.1.3. Micronutrientes
Os micronutrientes incluem todos aqueles elementos minerais
aceitos atualmente como essenciais para plantas clorofiladas
(manganês, zinco, boro, cobre, cloro, ferro e molibdênio, além do
cobalto e iodo).

2.4.1.4. Carboidratos
As células, tecidos e plântulas cultivadas in vitro não encontram
condições adequadas de iluminação e concentração de CO2 e, às
vezes, não apresentam teores de clorofila suficiente para realizar
fotossíntese que sustenta o crescimento. Portanto, a sacarose é o
carboidrato mais utilizado nos meios nutritivos, sendo que esse
açúcar suporta as mais altas taxas de crescimento na maioria das
espécies. A concentração de sacarose também é um fator
importante para obter crescimento ótimo, dependendo do explante.
Os carboidratos mais usados nos meios de cultura são a saca‐
rose, a glicose e a frutose nos níveis de 2% a 5% (p/p) (GEORGE,
1993). A concentração de 3% é a mais usada. Concentrações de
sacarose entre 6% e 12% podem ser usadas em cultura de em‐
briões, frutos e anteras, enquanto que o nível de 1,5% é usado em
cultura de protoplastos.
No que se refere à concentração de sacarose, para a palma
forrageira, Vasconcelos et al. (2002) observaram as maiores
porcentagens de multiplicação no material cultivado com 30 g/L de
sacarose. Entretanto, diversos autores (ESCOBAR et al., 1986;
LLAMOCA-ZÁRATE, 1999; VILLALOBOS et al., 2001) relatam que,
para cactáceas do gênero Opuntia, a concentração ideal de
sacarose é de 50 g/L.
A sacarose, além de fornecer energia metabólica e esqueleto
carbônico para uma diversidade de compostos orgânicos, desempe‐
nha um importante papel como componente do potencial osmótico
do meio de cultura.

2.4.1.5. Vitaminas
Os primeiros estudos com cultura de raízes definiram a mistura
básica de vitaminas utilizadas até hoje. Essa mistura consiste de
tiamina (vitamina B1), ácido nicotínico (niacina) e piridoxina (vitamina
B6), a qual normalmente se adiciona o aminoácido glicina.

2.4.1.6. Mio-Inositol
O mio-inositol é um componente do meio MS e da maioria dos
outros meios em uso atualmente. A concentração mais usada de
mio-inositol nos meios é de 100 mg/L.

2.4.1.7. Reguladores de crescimento


A composição e concentração de hormônios no meio são fatores
determinantes no crescimento e no padrão de desenvolvimento na
maioria dos sistemas de cultura de tecidos. As auxinas e as
citocininas são as classes de reguladores de crescimento mais
utilizadas na cultura de tecidos. A formação de raiz, parte aérea e
calo em cultura de tecidos é regulada pela disponibilidade e
interação dessas duas classes de reguladores de crescimento.
Existem várias substâncias que pertencem a cada uma dessas
classes de reguladores e que são usadas, de acordo com o objetivo
do estudo, nos meios de cultura. As várias auxinas (AIA – ácido 3-
indolacético, AIB – ácido indolbutírico e 2,4-D ácido 2,4-diclorofeno‐
xiacético, entre outras) dão respostas diferentes in vitro. As auxinas
nos meios variam de 0,01 mg/L a 10 mg/L. As auxinas mais usadas
são AIA, AIB, ANA (ácido naftaleno acético), 2,4-D e picloran. O AIA
é a auxina natural e a menos estável, sendo destruído em pH baixo.
A não ser o 2,4-D e ANA, as soluções estoques não devem ser
armazenadas por mais de uma semana. A dissolução das auxinas é
feita em NaOH 1N. Utiliza-se 0,3 mL desta base para dissolver 10
mg de auxina.
Também existem diferenças entre as citocininas, sendo que o
BAP – 6-benzilaminopurina induz a formação de grandes números
de brotos e alta taxa de multiplicação em muitos sistemas de
micropropagação.
As citocininas são derivadas da adenina (aminopurina) e têm um
papel fundamental na diferenciação e regeneração de plantas na
maioria das espécies (SANTIAGO et al., 2001). Induzem a divisão
celular, proliferação e morfogênese da parte aérea. As citocininas
mais usadas em cultura de tecidos são a cinetina (CIN),
benziladenina (BA), zeatina (Zea), isopentenil adenina (2ip) e
thidiazuron (TDZ).
Poucas culturas in vitro mostram respostas às giberelinas.
Também não verificamos relatos da utilização desse regulador para
a palma forrageira.
2.4.1.8. Ágar e semelhantes
Os meios nutritivos podem ser líquidos ou sólidos, sendo que a
cultura em meio líquido normalmente exige algum tipo de suporte ou
agitação para fornecer o oxigênio necessário para a respiração do
explante. Os meios líquidos possuem a vantagem de preparo mais
rápido e mais barato do que os sólidos.
Os meios sólidos ou semissólidos, tradicionalmente, são solidi‐
ficados com ágar (polissacarídeo extraído de algas marinhas). A
concentração de ágar usada varia de 0,6% a 1% (de 6 g/L a 10 g/L)
o qual é dissolvido em água fervente sendo responsável pela
consistência do meio que depende de sua concentração. É
necessária a aquisição de ágar de boa qualidade, pois este pode ser
tóxico em algumas condições de cultivo.
Outros produtos gelificantes são Gelrite (Calbiochem) e Phytagel
(Sigma). São mais puros que o ágar e provenientes de
fermentações bacterianas e usados na concentração de 0,2%.
Alguns laboratórios fazem o uso de polvilho de mandioca ou de
milho (maizena) como gelificantes, porém apresentam restrições
quanto à longevidade por degradar ao longo do cultivo.

2.4.1.9. pH
O pH dos meios nutritivos em culturas de células vegetais é
normalmente ajustado com HCl ou NaOH, depois de adicionar todos
os componentes para um valor ligeiramente ácido, entre 5 e 6,
normalmente 5,8 (TORRES et al., 1998). Recomenda-se este valor
para formulações líquidas. Em meios gelificados com ágar, o pH
deve ser ajustado em 5,7, pois em pH 5,0 ocorre a hidrólise de
polissacarídeos, enquanto que em pH 6,0–6,2 verifica-se a
precipitação de sais. No ajuste do pH, lava-se primeiramente o
eletrôdo, e, em seguida, faz-se a leitura em tampão 4,0.
Posteriormente lava-se o eletrôdo e dessa maneira o potenciômetro
estará calibrado para uso. O pH varia durante o período de cultura.
2.4.2. Preparação dos meios
Em diferentes laboratórios, procedimentos diversos são utilizados
para preparar os meios nutritivos. Normalmente, mantêm-se
soluções estoque dos sais minerais na geladeira em concentrações
mais elevadas, a partir das quais a preparação do meio é efetuada.
O preparo de soluções estoque tem por objetivo facilitar o
preparo final dos meios de cultivo e precisão na dosagem dos
componentes.
Normalmente mantêm-se os macronutrientes em soluções
estoque em concentrações 10 vezes superiores ao da concentração
final (TORRES et al., 1998). Os micronutrientes são mantidos em
concentração estoque, 1.000 vezes superior à concentração final; e
os quelatos EDTA Fe são mantidos em solução estoque 50 vezes
superior. As porções são mantidas em geladeira e por um período
não superior a uma semana para a maioria das soluções estoque,
principalmente aquelas que apresentam precipitação.
Soluções estoque das vitaminas podem ser mantidas na gela‐
deira ou no congelador; a sacarose e o mio-inositol, que são
utilizados em quantidades elevadas, são pesados sempre que se
prepara um meio nutritivo.
Após preparação, os meios são esterilizados após serem distri‐
buídos nos frascos ou vasilhames de cultura, por autoclavagem, a
121 oC (1 kg/cm2) por 15 a 20 minutos.

2.4.3. Meio de introdução para palma forrageira


Vasconcelos et al. (2007) definiram a associação de 2,0 mg/L de
BAP (Benzilaminopurina) e 0,1 mg/L de AIA (Ácido Indolacético) em
meio de cultura MS completo, suplementado com de 30 g/L de
sacarose e solidificado com 6,5 g/L de ágar-ágar, para introdução da
espécie Nopalea cochenellifera. Os explantes submetidos a esse
tratamento apresentaram maior número de brotações e menor
índice de necrose ou de explantes sem brotação, quando
comparados aos inoculados sem AIA ou na concentração de 0,25
mg/L. Frota et al. (2004) sugerem a associação de BAP a 2,00 mg/L
e AIA a 0,25 mg/L com 50 g/L de sacarose para a espécie Opuntia
fícus indica.
No laboratório de cultura de tecidos vegetais do Instituto Agro‐
nômico de Pernambuco (IPA), a rotina de introdução da cultura in
vitro, para as diferentes espécies, é a associação de 1,0 mg/L de
BAP e 0,1 mg/L de AIA em meio de cultura MS completo, suplemen‐
tado com de 30 g/L de sacarose. O resumo do estabelecimento da
palma forrageira in vitro pode ser verificado na Figura 1.
Figura 1. Esquema resumido para estabelecimento da cultura da palma forrageira in vitro.

3. Multiplicação dos explantes

A micropropagação permite uma propagação segura de culti‐


vares desejáveis, de forma rápida e com alto coeficiente de multipli‐
cação. O estoque de plantas in vitro permite um fluxo contínuo de
produção de mudas livre de patógeno em todas as épocas do ano e
com uniformidade genética.

3.1. Regeneração dos explantes

Existem três fatores que afetam a regeneração da planta in vitro:


o genótipo (espécie, cultivar ou variedade), a fonte de explante (raiz,
caule, meristemas, etc.), e a condição da cultura (meio de cultivo,
luz, temperatura, etc.).
É interessante notar que variedades de uma mesma espécie
respondem de maneira diferente às condições de cultivo. No
entanto, alguns autores consideram que toda espécie e toda cultivar
são capazes de responder às condições de cultivo in vitro desde
que sejam utilizadas combinações corretas dos demais fatores
(MANTELL et al., 1994).
A fonte de explante também é um fator importante no sucesso de
regeneração in vitro, pois a capacidade de regeneração, entre
outros fatores, depende da maturidade, do estado fisiológico e do
tecido utilizado. Segundo Taiz e Zeiger (2004), as gemas axilares
são meristemas secundários que apresentam estrutura e potencial
de desenvolvimento similar àquele do meristema apical. Ápices
caulinares, gemas axilares e meristemas isolados são os explantes
mais indicados na propagação clonal in vitro. Eles possuem
determinação para o crescimento vegetativo e, satisfeitas as
necessidades nutricionais, irão se desenvolver naturalmente em
plantas (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Seu desenvolvimento
se dá por meio de divisões celulares e requer substâncias de
reserva, por isso o tamanho do explante é um fator que determina
suas possibilidades de sobrevivência e capacidade de crescimento.
As condições de cultura, principalmente o meio de cultura, são
decisivas para o sucesso da regeneração in vitro. O meio de cultura
é constituído de sais minerais, nitrogênio reduzido, uma fonte de
carbono, vitaminas e reguladores de crescimento, necessários para
manter a divisão celular e a proliferação dos explantes (ANDRADE
et al., 2000).
Para palma forrageira, foi testado o meio MS com modificações
nas concentrações de sacarose e associações de dosagens de hor‐
mônios nos diversos processos de micropropagação, desde a intro‐
dução ao enraizamento. Para introdução, a depender da espécie a
ser utilizada, a composição mais recomendada é a associação de
1,0 mg/L de BAP e 0,1 mg/L de AIA em meio de cultura MS com‐
pleto, suplementado com de 30 g/L de sacarose.
As condições ambientais em que serão mantidos os explantes
após sua inoculação no meio nutritivo também interferem na regene‐
ração dos explantes. Luz e temperatura são dois fatores importantes
nas salas de cultura, onde devem ser controlados para que as
plantas ali mantidas se desenvolvam adequadamente.
São raras as salas de cultura com iluminação constante. A luz é
importante para a planta sob três pontos de vista: do ponto de vista
da fotossíntese, da fotomorfogênese e do fototropismo. As condi‐
ções de luminosidade podem variar desde o escuro total, especial‐
mente no início do cultivo, até uma faixa de 100 mmol/m2/s a 110
mmol/m2/s, com um fotoperíodo de 12 a 16 horas. No laboratório de
cultura de tecidos vegetais do IPA, a palma forrageira é mantida sob
luz fluorescente com intensidade de 90 mmol/m2/s a 110 mmol/m2/s
com fotoperíodo de 16 horas.
A maioria das culturas desenvolve-se bem na faixa de 20 oC a 27
o
C. A temperatura nas salas de incubação ou crescimento, em geral,
é mantida na faixa dos 25 oC ± 2 oC. É importantíssimo contar com
um sistema de refrigeração acionado por termostato para manter
fixa a temperatura. A palma forrageira se desenvolve bem quando
mantida em sala de crescimento a uma temperatura de 27 ºC ± 2
ºC.

3.2. Crescimento e multiplicação

Os protocolos estabelecidos para multiplicação da palma e cres‐


cimento dos brotos envolvem o cultivo sequencial dos explantes em
meio semissólido advindos de gemas axilares (ESCOBAR et al.,
1986; LLAMOCA-ZÁRATE, 1999; VASCONCELOS et al., 2007).
Entretanto, o emprego comercial dessa técnica é reduzido em
virtude dos altos custos de produção, principalmente com mão de
obra, baixa taxa de multiplicação e perdas durante o processo.
Para utilizar essa técnica com a finalidade de disponibilizar novos
clones da cultura, existe a necessidade de aumentar a velocidade
de multiplicação dessa cultura. Assim, novas alternativas de
multiplicação acelerada, por meio da utilização do fracionamento de
explantes in vitro e do sistema de imersão temporária, vêm sendo
estudadas para os diversos clones.
Para a Nopalea cochenellifera, o fracionamento longitudinal dos
explantes, inoculados no meio semissólido, promoveu um aumento
significativo nas brotações. A realização do corte longitudinal propor‐
cionou um aumento em torno de 70% no número de brotos obtidos.
Essa maior multiplicação do material se justifica pela exposição de
uma área maior do broto ao BAP, facilitando o desenvolvimento de
novos brotos a partir das gemas axilares pré-existentes. Além disso,
o corte também possibilitou a quebra da dominância apical, favo‐
recendo uma maior brotação das gemas laterais. Nesse trabalho, os
explantes foram mantidos em sala de crescimento a uma tempe‐
ratura de 27 ºC ± 2 ºC, sob luz fluorescente com intensidade de 50
µmols/m2/s a 60 µmols m-2 s-1 e fotoperíodo de 16 horas.
Para a espécie Opuntia stricta Haw., conhecida como Orelha de
Elefante Mexicana, os explantes inoculados sem corte proporcio‐
naram maior número de brotações, aproximadamente 6,0 brotações
por explante, demonstrando que, para esse clone, o corte, tanto
longitudinal como transversal, dos explantes não favorece o
aumento da multiplicação. Nesse trabalho, os explantes foram
mantidos em sala de crescimento a uma temperatura de 27 ºC + 2
ºC, sob luz fluorescente com intensidade de 90 µmols/m2/s a 110
µmols/m2/s com fotoperíodo de 16 horas. Os explantes (brotações
de 2,0 cm de comprimento e 0,5 cm de largura, com
aproximadamente 100 dias de cultivo) foram cultivados em meio MS
completo, suplementado com de 30 g/L de sacarose, 1,0 mg/L de
BAP (benzilaminopurina) e 0,1 mg/L de AIA (ácido indolacético) e
solidificados com 6,5 g/L de ágar-ágar.
A brotação in vitro está relacionada com as concentrações
endógenas e exógenas de citocininas e o balanço auxina x
citocinina. As citocininas são necessárias para a divisão das células
vegetais in vitro (TAIZ; ZEIGER, 2004). O tipo de citocinina e sua
concentração são os fatores que mais influenciam o sucesso da
multiplicação in vitro (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Assim, é
fundamental a utilização de citocinina no meio de cultura para obter
boas taxas de multiplicação. A escolha de citocinina e da
concentração utilizada dependerá do material utilizado. O BAP tem
sido muito eficaz para promover multiplicação em diversas espécies,
e parece ser a citocinina por excelência para multiplicação de partes
aéreas e indução de gemas adventícias, além de ser a mais barata
de todas. As citocininas apresentam grande habilidade na indução
da divisão celular em culturas de tecido, juntamente com as auxinas.
A maior produção de citocininas ocorre nos meristemas das
raízes, sendo que elas se translocam para as outras partes a partir
do xilema. As auxinas fazem o caminho inverso e, por meio do
floema, vai do ápice caulinar para a base. Segundo Raven et al.
(1999), em plantas intactas, as citocininas promovem o crescimento
das gemas laterais, atuando de maneira oposta aos efeitos das
auxinas.
As auxinas estão relacionadas com a extensão do caule, princi‐
palmente pela promoção do alongamento celular. Também exerce
papel na diferenciação de tecidos vasculares e inicia a divisão do
câmbio vascular. Frequentemente inibe o crescimento de gemas
laterais, mantendo a dominância apical (RAVEN et al., 1999).
A proliferação de brotos in vitro pode ser maximizada com o
emprego de dois ou mais reguladores de crescimento. Andrade et
al. (2000) e Sabá et al. (2002) verificaram que baixas concentrações
de BAP promoveram maior número de brotos em jaborandi
(Polycarpus microphyllus) e aroeira (Myracrodrum urundeuva).
Contudo, Guerra et al. (1999) observaram que altas concentrações
de BAP propiciaram melhores resultados na multiplicação de brotos
de abacaxizeiro.
É interessante ressaltar que os reguladores de crescimento
vegetal e suas concentrações adequadas para proporcionar a maior
quantidade de brotos variam de acordo com o genótipo da planta
considerada e devem ser determinados para cada espécie.
Segundo Serafini et al. (2001), os tratamentos acrescidos de
pequenas concentrações de citocininas, além de menos onerosos,
apresentam ainda menor probabilidade de indução de variação
somaclonal, que é uma característica imprópria para um protocolo
de micropropagação por promover alterações genéticas nesses
indivíduos que podem levar à perda das características desejadas.
Face ao exposto, a definição do tipo de concentração ótima de
citocinina para a multiplicação constitui em passo importante para
determinação de protocolo de micropropagação. Experimentos tes‐
tando diversas combinações de citocininas com outros fitorregula‐
dores são muito comuns para o ajustamento de meios. Muito ainda
precisa ser conhecido sobre os mecanismos de hormônios vegetais
e sobre os processos que controlam as brotações da palma
forrageira. Possivelmente uma maior proliferação de brotos de
palma necessite da combinação de citocininas com maiores níveis
de auxinas.
No trabalho de Vasconcelos et al. (2002), o maior número médio
de brotos (15/explante) obteve-se a partir de explantes cortados e
mantidos em meio com 30 g/L de sacarose que proporciona a
obtenção de 8.910 plantas enraizadas em 6 meses de cultivo,
considerando uma contaminação de 10% e uma indução de 60%
dos explantes inoculados e 60% dos brotos cortados. Sem
considerar perdas nos processo de multiplicação, é possível a
obtenção de 24.300 plantas em 6 meses de cultivo. Escobar et al.
(1986), trabalhando com Opuntia amylacea, obteve também uma
média de 15 brotos por cada explante inoculado em meio MS com
50 g/L de sacarose e 10 µM de BA, 25 dias após o corte longitudinal
dos brotos iniciais. Assim, partindo de uma raquete de 5 cm e
inoculando 30 gemas, foi possível a obtenção de 25 mil plantas em
85 dias de cultivo, sem considerar as perdas do processo. Para a
Opuntia ficus-indica cv. Gigante, Llamoca-Zárate (1999) obteve
1.258 plantas em um ciclo de cultivo (120 dias), partindo de uma
raquete com, aproximadamente, 50 explantes.
Em contraste com o cultivo em meio semissólido, o cultivo de
explantes em meio líquido possibilita a automação do processo de
micropropagação, redução de trabalho e, consequentemente, a
redução dos custos relativos à mão de obra. Várias pesquisas
utilizando sistemas de automação, principalmente o uso de
biorreatores para a micropropagação em meio líquido, têm sido
relatadas (ESCALONA et al., 1999; LEMOS et al., 2001; SILVA et
al., 2007). O emprego de biorreatores em cultivo líquido pode
apresentar maior eficiência na produção de biomassa, maior número
de brotos viáveis à aclimatização e maior crescimento dos explantes
quando comparado com a micropropagação convencional.
O sistema de biorreator de imersão temporária é constituído por
dois frascos conectados por tubos de silicone; um dos frascos
contém o meio de cultura e no outro ocorre o cultivo dos explantes,
modelo similar ao sistema de frascos gêmeos-BIT, utilizado por
Escalona et al. (1999), que foi desenvolvido por Teixeira (2002).
Nesse sistema, o ar fornecido por um compressor é esterilizado por
uma membrana de 0,22 μm, entra no frasco que contém o meio de
cultura e faz com que o líquido chegue ao outro frasco que contém
os explantes.
Após um tempo de imersão, ocorre reversão do processo, e o
meio nutritivo retorna para seu frasco. A frequência e o tempo de
imersão são controlados por timers eletrônicos e válvulas solenoides
(ESCALONA et al., 1999). O tempo de imersão pode variar, e o ar
promove a renovação da atmosfera do frasco.
No laboratório de cultura de tecidos do IPA, o sistema de imersão
temporária vem sendo testado a fim de definir um protocolo que
promova o aumento da brotação, crescimento e até enraizamento
das plantas. Nesses trabalhos, são usados frascos de 5 L, contendo
1.000 mL de meio de cultura. Em função dos trabalhos experimen‐
tais, são usados 10, 15 e até 30 explantes por frasco, mantidos em
sala de crescimento a uma temperatura de 27 ºC + 2 ºC, sob luz
fluorescente com intensidade de 90 µmols/m2/s a 110 µmols/m2/s
com fotoperíodo de 16 horas. Nesse sistema, os primeiros estudos
testaram a imersão no meio de cultura a cada 3, 6 e 8 horas, por 4
minutos, sendo 3 minutos de imersão, mais 1 minuto de bombea‐
mento do meio, que permanece em contato com os explantes. Foi
utilizado meio MS suplementado com 1 mg/L de BAP, 0,1 mg/L de
ANA, pH ajustado para 5,8.
O que se tem observado na utilização desse processo é que,
apesar da promoção de uma maior brotação, quando comparado ao
sistema convencional de micropropagação, o maior tempo de
exposição dos explantes ao meio de cultura promove a
hiperidricidade dos brotos. Essa não é uma característica desejada,
uma vez que esse fenômeno pode afetar a sobrevivência e
adaptação das plantas cultivadas in vitro após sua transferência
para o solo.
Como alternativa a esse problema, vem sendo testada uma
redução no tempo de imersão associada a uma redução na frequên‐
cia. Mas não existem resultados conclusivos sobre esse processo.
4. Enraizamento

O enraizamento é uma etapa que define o resultado final da


microropagação, é a etapa onde ocorre a formação de raízes adven‐
tícias nas partes aéreas. Pode ser dividido em indução, iniciação e
alongamento das raízes (TORRES et al., 1998). Pode ser realizado
in vitro como no ambiente externo, porém resultados mais
satisfatórios para a maioria das espécies têm sido obtidos no
enraizamento ex vitro.
A vantagem do enraizamento in vitro é o melhor controle das
condições em que se trabalha, e, com isso, a obtenção de um alto
percentual de enraizamento. Por outro lado, a desvantagem do
método é que as raízes formadas in vitro nem sempre são eficientes
na absorção de água e de nutrientes, no momento da passagem
das mudas para o substrato. Raízes produzidas in vitro podem
possuir poucos pêlos radiculares e conexões vasculares, e só
começarem a desenvolver o câmbio secundário quando são
removidas do frasco de cultura.
Auxinas como o AIB (ácido indolbutírico), AIA (ácido indolacético)
e ANA (ácido naftalenoacético) são os principais reguladores
envolvidos no processo de enraizamento in vitro. As concentrações
mais utilizadas para induzir rizogênese normalmente estão entre 1,0
mg/L e 10,0 mg/L para AIA; 0,05 mg/L e 1,0 mg/L para ANA; e 0,5
mg/L e 3,0 mg/L para AIB (SOARES et al., 2001).
Associadas às auxinas, outras substâncias também interferem de
forma direta ou indireta no enraizamento dos explantes. Poliaminas,
ácido sulfúrico, cloreto de magnésio e compostos fenólicos, como o
floroglucin, atuam, por exemplo, estimulando a síntese de AIA ou
liberando a auxina existente no explante. Já as citocininas,
geralmente utilizadas para estimular a formação de brotações,
costumam inibir o enraizamento. Existem poucos casos em que uma
citocinina não interfere ou estimula a formação das raízes. As
giberelinas funcionam como as citocininas, inibindo, na maioria das
vezes, a rizogênese.
A concentração de sais no meio de cultura pode ser regulada de
acordo com cada espécie, de forma que a redução da concentração
iônica dos meios (50% ou 75% da força total do meio) também pode
favorecer essa etapa do processo.
Vasconcelos et al. (2007) obtiveram bons resultados de enraiza‐
mento em meio de cultura MS básico, suplementado com 30 g/L de
sacarose. Frota et al. (2004) recomendam a suplementação do meio
de cultura com 5,0 mg de ANA para desenvolvimento, enraizamento
e posterior aclimatização. No laboratório de cultura de tecidos do
IPA, o que se tem verificado é que brotos transferidos para meio MS
sem adição de reguladores de crescimento e com 30 g/L de
sacarose apresentaram raízes em quantidade e com um grau de
desenvolvimento compatíveis com aclimatação, 30 dias após essa
transferência.
No cultivo em sistema de imersão, o enraizamento é bastante
reduzido. É preciso realizar estudos a partir de estímulos hormonais
para promoção do enraizamento dos explantes nessa condição de
cultivo.

5. Aclimatização

Aclimatização e aclimatação são termos que apresentam cono‐


tações diferentes. O primeiro trata dos processos para a passagem
da planta que está in vitro para o ambiente e é definido como a
adaptação climática de um organismo, especialmente uma planta,
que é transferido para um novo ambiente, sendo todo esse processo
realizado artificialmente. O termo aclimatação tem um significado
similar, mas é um processo no qual as plantas ou outros organismos
se tornam ajustados a um novo clima ou situação, como resultado
de um processo essencialmente natural.
Os principais problemas dessa etapa do processo são:
a) Baixa capacidade fotossintética
A estrutura e a morfologia interna das plantas micropropagadas
são, inicialmente, muito diferentes daquelas cultivadas em
condições de campo. Essa variação na anatomia ou ultraestrutura
pode afetar o processo de fotossíntese. As organelas que
apresentam capacidade autotrófica não estão bem desenvolvidas, e,
consequentemente, existe uma dificuldade em aclimatização.
No estágio de aclimatização, as plântulas sofrem uma mudança
drástica quando são removidas dos frascos onde a luz e as trocas
gasosas são limitadas, e existe grande disponibilidade de açúcar.
Essa passagem faz com que mudem de heterotróficas para auto‐
tróficas, com grande gasto de energia.
b) Desidratação
A desidratação é causada pela elevada perda de água pelas
plantas, principalmente nas folhas, ou por absorção inadequada de
água pelas raízes. Em geral, é o maior problema no processo de
transplante e aclimatização. In vitro, as plântulas se desenvolvem
com baixa luminosidade e elevada umidade relativa com
consequente redução do fluxo respiratório. Ao serem expostas a um
ambiente com alta luminosidade e baixa umidade relativa, a taxa de
transpiração aumenta, surgindo um déficit hídrico na planta.
As plantas que são levadas às casas de vegetação são
desprovidas de cutícula na folha e possuem muitos estômatos não
funcionais. Quando expostas ao ambiente, ocorrem elevada perda
de água e um agravamento osmótico intracelular.
c) Absorção de nutrientes
Plantas in vitro quase sempre produzem raízes não funcionais,
ou seja, não apresentam capacidade de absorção de água e
nutrientes quando colocadas em contato com o solo. As plântulas in
vitro, ao serem aclimatizadas, passam de um meio onde tem à
disposição alta concentração de nutrientes para um substrato no
qual são forçadas a iniciar o processo de absorção de sais para seu
desenvolvimento. A emissão de novas raízes é muito importante,
pois as formadas in vitro têm pouca capacidade de absorção e não
respondem imediatamente ao momento do transplante, além de
serem pouco funcionais, delicadas e propensas ao ataque de
microrganismos.
d) Doenças
Problemas de doenças podem facilmente aparecer nas culturas
que são levadas às casas de vegetação, pois a falta de pressão de
inóculo e a dependência do meio não estimularam as plantas a
desenvolver o sistema de defesa contra microrganismos. A
fragilidade da plântula in vitro aliada à alta umidade relativa, na qual
é aclimatizada, favorece o crescimento de fungos e bactérias. É
essencial, portanto, que se faça uma prevenção de doenças para o
sucesso do transplante, durante e após a aclimatização.
Vasconcelos et al. (2002) aclimatizaram as plantas em bandeja
de inoculação com 40 células. As plantas foram aclimatizadas com
um comprimento médio de 2,71 cm em areia lavada e de 2,89 cm no
substrato Plant Mix, num total de 20 repetições. As plantas foram
regadas 3 vezes por semana, utilizando 20 mL de solução nutritiva,
composta pelo fertilizante solúvel Kristalon® (742,86 mg/L) e Barco
Viking® (840 mg/L). A solução de irrigação continha a seguinte
composição: 18% de N, 11% de P2O5, 38% de K2O, 4% de MgO,
11% de S, 19% de Ca e micronutrientes.
Trinta dias após a aclimatização, a altura média das plantas era
6,06 cm para areia lavada e 5,11 cm no substrato comercial. Nesse
período não ocorreu morte de nenhuma planta, totalizando uma
eficiência de 100% na aclimatação.

6. Considerações finais
A micropropagação convencional, pelo cultivo sequenciado de
explantes em meio semissólido, promove uma taxa de multiplicação
bem superior à propagação convencional da palma forrageira, entre‐
tanto técnicas precisam ser mais estudas de forma a aumentar essa
taxa de multiplicação e eficiência no enraizamento.
Para cultura da palma forrageira, é clara a variabilidade existente
entre genótipos em resposta ao cultivo in vitro.

7. Referências

ANDRADE, M. W.; LUZ, J. M. Q.; LACERDA, A. R.; MELO, P. D. A. Micropropagação de


Aroeira (Myracrodruon urundeuva Fr. All). Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 1, p.
174-180, 2000.
ESCALONA, M.; LORENZO, J. C.; GONZALEZ, B. L.; DANQUITA, M.; GONZALES, J. L.;
DESJARDINS, Y.; BORROTO, C. G. Pineapple (Ananas comosus (L.) Merr.)
micropropagation in temporary immersion systems. Plant Cell Reports, New York, v. 18, p.
743-748, 1999.
ESCOBAR, A.; VILLALOBOS, A.; VILLEGAS, M. A. Opuntia micropopagation by axillary
proliferation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Berlin, DE, v. 7, p. 269-277, 1986.
FROTA, H. M.; CARNEIRO, M. S. de S.; LLAMOCA-ZÁRATE, R. M.; CAMPOS, F. de A. de
P. Efeitos do BAP e do AIA na indução e no crescimento in vitro de brotos de dez clones de
palma forrageira. Ciência Agronômica, Fortaleza, v. 35, n. especial, p. 279-283, 2004.
GEORGE, E. F. Plant propagation by tissue culture. London, UK: The Technology Exegetics,
1993. 574 p.
GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L.
S.; BUSO, J. A. (Org.). Cultura de tecidos vegetais e transformação genética de plantas.
Brasília, DF: Embrapa-SPI, 1998.
p. 183-260.
GUERRA, P. G.; VESCO, L. L. D.; PESCADOR, R.; SCHUELTER, A.; NODAR, R. O.
Estabelecimento de um protocolo regenerativo para a micropropagação do abacaxizeiro.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 34, n. 9, p. 1557-1563, 1999.
HARTMANN, H. T.; KESTER, D. E.; DAVIES JUNIOR, F. T.; GENEVE, R. L. Plant
propagation: principles and practices. New Jersey: Prentice-Hall, 1998. 880 p.
KERBAUY, G. B. Clonagem de plantas in vitro. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento,
Brasília, DF, v. 1, n. 1, p. 30-33, maio 1997.
LEMOS, E. E. P.; FERREIRA, M. S.; ALENCAR, L. M. C.; OLIVEIRA, J. G. L.;
MAGALHÃES, V. S. Micropropagação de clones de banana cv. terra em biorreator de
imersão temporária. Revista Brasileira de Fruticultura, Cruz das Almas, v. 23, p. 482-487,
2001.
LLAMOCA-ZÁRATE, R. M. Cultura de tecidos e transformação genética da palma forrageira
Opuntia fincus-indica Mill. 1999. 178 f. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará,
Fortaleza, 1999.
LORENZO, J. C.; GONZALES, B. L.; ESCALONA, M.; TEISSON, C.; ESPINOSA, P.;
BORROTO, C. Sugarcane shoot formation in an improved temporary immersion system.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Berlin, DE, v. 54, p. 197-200, 1998.
MANTELL, S. H.; MATTHEWS, J. A.; MCKEE, R. A. Técnicas de cultura de teciso. In:
MANTELL, S. H.; MATTHEWS, J. A.; MCKEE, R. A. Princípios de biotecnologia em plantas:
uma introdução à engenharia genética em plantas. Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de
Genética, 1994. p. 101-181.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, Copenhagen, DK, v. 15, p. 473-497, 1962.
RAVEN, P. H.; EVERT, R. F.; EICHHORN, S. E. Biologia vegetal. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 1999. 906 p.
SABÁ, R. T.; LAMEIRA, O. A.; LUZ, J. M. P.; GOMES, A. P. R.; INECCO, R.
Micropropagação de Jaborandi. Horticultura Brasileira, Brasília, DF, v. 20, n. 1, p. 106-109,
2002.
SANTIAGO, E. J. A.; PAIVA, R.; PAIVA, P. D. O.; SANTANA, J. R. F.; GOMES, G. A. C.
Meios de cultura: cultura de tecidos. Lavras: UFLA, 2001. v. 3,
p. 22-35.
SANTOS, D. C. dos; FARIAS, I.; LIRA, M. de A.; SANTOS, M. V. F. dos; ARRUDA, G. P. de;
COELHO, R. S. B.; DIAS, F. M.; MELO, J. N. de M. Manejo e utilização da palma forrageira
(Opuntia e Nopalea) em Pernambuco. Recife: IPA, 2006. 48 p. (IPA. Documentos, 30).
SERAFINI, L. A.; BARROS, N. A.; AZEVEDO, J. L. Biotecnologia na agricultura e na
agroindústria. Guaíba: Agrishow, 2001. 463 p.
SILVA, A. B. da; PASQUAL, M.; TEIXEIRA, J. B.; ARAUJO, A. G. de. Métodos de
micropropagação de abacaxizeiro. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 42, n. 9,
p. 1257-1260, set. 2007.
SOARES, A. S.; PAIVA, R.; PAIVA, P. D. O.; SANTANA, J. R. F.; PAIVA, L. V. Enraizamento.
In: CULTURA de tecidos. Lavras: UFLA, 2001. v. 6, p. 58-63.
SOUZA, A. V.; PEREIRA, A. M. S. Enraizamento de plantas cultivadas in vitro. Revista
Brasileira de Plantas Medicinais, Botucatu, v. 9, n. 4, p. 103-117, 2007.
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2004. 719 p.
TEIXEIRA, J. B. Biorreatores. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, Uberlândia, v. 4, p.
36-41, 2002.
TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; FERREIRA, A. T. Retrospectiva da cultura de tecidos de
plantas. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação
genética de plantas. Brasília, DF: Embrapa-SPI: EMBRAPA-CNPH, 1998. v. 1, p. 11-20.
VASCONCELOS, A. G. V. de; LIRA, M. de A.; CAVALCANTI, V. A. L. B.; SANTOS, M. V. F.
dos; CAMARA, T.; WILLADINO, L. Micropropagação de palma forrageira cv. Miúda
(Nopalea cochenillifera - Salm Dyck). Revista Brasileira de Ciências Agrárias, Recife, v. 2, n.
1, p. 28-31, jan./mar. 2007.
VASCONCELOS, A. G. V. de; WILLADINO, L.; CAMARA, T. R.; TORRES, A. C.; LIRA, M.
A.; CAVALCANTI, V. A. L. B. Micropropagação da palma forrageira cv. Miúda. ABCTP
Notícias, Recife, v. 42, p. 4-7, abr. 2002.
VILLALOBOS,V. M. A. Aplicação do cultivo de tecidos para a micropropagação de
Opuntias. In: IGLESES, P.; BARBERA, G.; BARRIOS, E. P. (Ed.). Agroecologia, cultivo e
utilizações da palma forrageira. João Pessoa: Sebrae-PB, 2001.
Capítulo 4
Fermentação semissólida no
enriquecimento proteico de
produtos para a alimentação
animal a partir da cana-de-açúcar,
do sorgo sacarino e da palma
forrageira
José Nildo Tabosa
Fernando Gomes da Silva
José Teodorico de Araújo Filho
Edma Carvalho de Miranda

1. Introdução

A bioconversão de resíduos agrícolas apresenta importância


fundamental e necessária para o desenvolvimento das cadeias
produtivas no âmbito das agroindústrias. Nesse sentido, os
resíduos oriundos de agroindústrias e que seriam destinados a
aterros sanitários ou mesmo usados sem tratamento devido para
ração animal poderão ser redirecionados para o uso da
bioconversão (LAUFENBERG et al., 2003). Assim há a possibilidade
desses materiais residuais representarem condições para a síntese
de produtos utilizáveis na alimentação animal, dentre outras
aplicações (PINTO et al., 2005). Todavia, a bioconversão não é só
utilizada no aproveitamento de resíduos agroindustriais com vistas à
alimentação animal e ao processamento de fertilizantes. Esse
segmento pode ser de importante utilização no enriquecimento
proteico de material vegetal deficiente em nitrogênio, fósforo e
outros elementos, como é o caso de produtos usados na
alimentação animal elaborados a partir da biomassa vegetal, por
exemplo, a da cana-de-açúcar, do sorgo sacarino e da palma
forrageira.
Nesse contexto, é relatada, no presente documento, parte das
atividades que vem sendo desenvolvidas e recomendadas pelo
Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), visando à geração de
produtos para a alimentação animal (sacharina da cana-de-açúcar,
do sorgo sacarino e obtenção e enriquecimento de farelos a partir
de resíduos vegetais das Centrais de Abastecimento – Ceasas).
Além disso, é também relatada a tecnologia de obtenção e
enriquecimento do farelo da palma forrageira, desenvolvida pela
Diretoria de Pesquisa da Secretaria de Agricultura de Alagoas
(Seagri), com o apoio da Universidade Federal de Alagoas (Ufal) e
do IPA. Em todas as atividades foi utilizada a bioconversão a partir
da fermentação em estado sólido.
A fermentação em estado sólido (FES) é importante no enrique
cimento de farelos vegetais, notadamente pelo crescimento
microbiano, favorecendo a síntese de diversos compostos que
apresentam interesse econômico (PINTO et al., 2005). Atualmente,
em muitos países, no âmbito da fermentação em estado sólido,
desponta a técnica do enriquecimento proteico de resíduos
agroindustriais, em que por meio de microrganismos há aumento do
teor de proteína microbiana. Com isso há a possibilidade desses
materiais serem utilizados na alimentação animal dentre outros usos
(PANDEY, 2003; RAIMBAULT, 1998). Além do uso no
aproveitamento de resíduos agroindustriais, essa tecnologia poderá
também ser utilizada no enriquecimento proteico de farelos
elaborados e desidratados a partir do colmo integral do sorgo
sacarino, da cana-de-açúcar e do segmento articular da palma
forrageira visando à elaboração da proteína microbiana (TABOSA et
al., 2006).
De acordo com Raimbault (1998), esse tipo de fermentação
refere-se à fermentação em estado sólido, fermentação semissólida
ou mesmo fermentação em meio sólido, e aplica-se ao processo de
crescimento microbiano sobre substratos sólidos sem a presença de
água livre. Por sua vez, a fração aquosa presente no sistema encon‐
tra-se ligada à fase sólida, formando uma fina camada superficial
sobre as partículas. As principais características da fermentação em
estado sólido são as seguintes, de acordo com Pinto et al. (2005): a)
a fase sólida atua como fonte de carbono e nitrogênio e funciona
como suporte para o crescimento de células microbianas; b) o cres‐
cimento dos microrganismos ocorre em condições mais próximas às
dos habitats naturais; c) o meio representa elevada
heterogeneidade, e os substratos não estão prontamente acessíveis
aos microrganismos. Assim, diferentes tipos de microrganismos
como bactérias, leveduras e fungos filamentosos podem crescer em
substratos sólidos (AIDOO et al., 1982). Além disso, de acordo com
Gervais e Molin (2003), de todos os parâmetros que influenciaram o
processo fermentativo, a água apresenta papel de destaque na
fermentação em estado sólido, em face do seu elevado grau de
interação com as substâncias.
No caso da elaboração da sacharina da cana-de-açúcar, a fer‐
mentação em estado sólido é empregada no produto integral a partir
de colmos picados sem a presença de pontas e palhas. A partir daí,
é adicionada uma mistura mineral à biomassa vegetal com vistas à
ocorrência de um processo fermentativo. Elias et al. (1990), no
Instituto de Ciência Animal (ICA) em Cuba, relataram que a
produção desse produto denominado de sacharina baseia-se na
disponibilidade dos carboidratos solúveis e do conteúdo celular.
Além disso, nesse processo, os açúcares da cana-de-açúcar e o
nitrogênio que foram adicionados a partir da mistura mineral são
utilizados para o crescimento da microbiota epifítica da cana-de-
açúcar, o que por sua vez resultará no aumento da proteína
microbiana (proteína verdadeira), presente no produto final. Nesse
caso, o produto resultante apresenta menores teores de
carboidratos solúveis e maiores teores de proteína bruta e nitrogênio
precipitável em ácido tricloroacético, o qual corresponde ao
nitrogênio presente na proteína verdadeira.
Ações de pesquisa foram desenvolvidas no IPA em 1989 (ENRI‐
QUECIMENTO..., 1992) na elaboração da sacharina a partir da
cana-de-açúcar e também a partir de colmos integrais de sorgo
sacarino. Essa tecnologia foi adaptada do processo de fermentação
em estado sólido da cana-de-açúcar desenvolvido por
pesquisadores do ICA e descrito por Elias (1990). Nessa pesquisa,
a sacharina obtida a partir da cana-de-açúcar e do sorgo sacarino
apresentou teores de 6% de proteína microbiana e de 12% de
proteína bruta. Vale frisar que a biomassa original apresentava,
antes do processo fermentativo, teores de 3% e 2% de proteína
bruta, para o sorgo sacarino e para a cana-de-açúcar,
respectivamente. A mistura mineral utilizada e adicionada à
biomassa vegetal em ambos os casos (cana-de-açúcar e sorgo
sacarino) funcionou basicamente como combustível utilizado pela
flora microbiana na elevação da proteína, no transcurso do processo
fermentativo (ALMEIDA, 1997; ENRIQUECIMENTO..., 1992; VIVAS;
CARVAJAL, 2004).
Segundo Ricardo e Sanches (2007), tanto a cana-de-açúcar
como os seus resíduos agroindustriais podem ser utilizados para a
produção de alimento animal enriquecido pela fermentação em
estado sólido – a sacharina. Assim, de acordo com o procedimento
empregado para a fermentação e a forma de desidratar o produto
final podem-se obter três tipos de sacharina: industrial (condições
controladas de fermentação e de secagem), semi-industrial
(condições controladas de fermentação, porém com secagem ao
sol) e rústica (todo processo de fermentação e de secagem ocorrem
em uma plataforma cimentada) (STUART, 2002). Por sua vez, o
processo de obtenção da sacharina da cana-de-açúcar é
relativamente simples, porém com resultados muito variáveis quanto
à eficácia de conversão dos açúcares da matéria-prima em proteína
de origem unicelular. Esse fato se deve fundamentalmente em
utilizar como inóculo a flora epifítica da cana-de-açúcar. Além disso,
considerando outras variantes do processo, podem-se ainda incluir
níveis de farelo de milho no processo fermentativo da sacharina,
buscando assim melhores resultados da alimentação de
monogástricos (ELIAS; LEZCANO, 1994). Também a partir da cana-
de-açúcar integral triturada pode-se utilizar uma cepa de Aspergillus
Níger + sulfato de amônio + fosfato monobásico de amônio, obje‐
tivando o enriquecimento microbiano do produto final (ROURA et al.,
1992).
A tecnologia para produção do farelo enriquecido da palma
forrageira como alimento animal foi adaptada a partir da sacharina
da cana-de-açúcar, tecnologia definida e recomendada.
Desenvolvida inicialmente pelo ICA, foi introduzida em 1989, sendo
adaptada pelo IPA, visando atender as condições locais juntamente
com a tecnologia de desenvolvimento da sacharina do sorgo
sacarino, que foi concebida pelo IPA. O farelo enriquecido da palma
forrageira é fruto de uma tecnologia que vem sendo desenvolvida
pela Secretaria Executiva de Agricultura de Alagoas (Seagri), em
parceria com o Governo do Estado, Banco do Nordeste do Brasil
(BNB), e com o apoio das cooperativas de laticínios locais. Tabosa
et al. (2006) evidenciaram a importância do farelo enriquecido da
palma forrageira obtido a partir do processo fermentativo em estado
sólido. Na confecção do produto foi adicionada uma mistura mineral
(ureia, micronutrientes, sulfato de magnésio, cloreto de sódio e MAP
– fosfato monobásico) para cada tonelada de biomassa da palma
forrageira. Após 24 horas de fermentação, os principais resultados
experimentais atingiram os seguintes valores levando em
consideração o farelo da palma in natura em comparação com o
farelo enriquecido: a) os valores de proteína microbiana passaram
de 1,5% para 20%; b) o teor de fósforo foi praticamente triplicado,
passando de 0,08% para 0,26%.

2. A importância da cana-de-açúcar (matéria-


prima na confecção da sacharina)
O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, atingindo
cerca de 528 milhões de toneladas em uma área de plantio de 6,6
milhões de hectares. A produtividade média é de 80 t/ha. Dessa
produção, 89% destina-se à indústria sucroalcooleira (CONAB,
2007). As principais regiões produtoras são a Centro-Sul com 82%
da produção nacional e a região Norte-Nordeste com 18%. O
Estado de São Paulo detém 60% da produção nacional com
produtividade de 89 t/ha, Minas Gerais com cerca de 8% e
produtividade de 83 t/ha, Alagoas com 5,2% e produtividade de 63
t/ha e Pernambuco com 3,5% e produtividade média de 52,5 t/ha
(ANUÁRIO..., 2007; CONAB, 2007).

2.1. Valor nutricional da cana-de-açúcar

Esta característica está correlacionada diretamente com o seu


elevado teor de açúcar, que fica em torno de 40% a 50% na matéria
seca. Por outro lado, o teor de proteína bruta é baixíssimo, ficando
em torno de 1% a 3%. Desse modo, configura-se como um alimento
animal nutricionalmente desbalanceado. Quando oferecido como
único componente da dieta, o consumo é baixo, não sendo capaz de
atender nem mesmo as necessidades de mantença dos animais.
Assim, para suprir essa deficiência e possibilitar ganho de peso nos
animais, é necessário ser suplementado. Nesse âmbito, de acordo
com Thiago e Vieira (2002), a opção mais simples é usar o
nitrogênio não proteico (ureia + sulfato de amônio). Desse modo, há
necessidade de enriquecimento desse alimento, visando sobretudo
aos aspectos econômicos, sem que haja necessidade de
complementação com concentrados comerciais.

2.2. Sacharina da cana-de-açúcar

Produto inicialmente desenvolvido em Cuba, no ICA, conforme


metodologia de Elias et al. (1990). Consiste na transformação da
cana-de-açúcar picada em um farelo enriquecido pelo processo de
fermentação em estado sólido. Nesse contexto, há antes do
processo fermentativo a adição ao material picado de uma mistura
mineral (ureia + micronutrientes + cloreto de sódio + fonte de
fósforo), na proporção de 22 kg desta mistura para cada tonelada de
biomassa da cana-de-açúcar.

2.2.1. Dinâmica da fermentação – sacharina da cana-de-açúcar


Segundo Elias et al. (1990), deve-se considerar no processo fer‐
mentativo (fermentação em estado sólido) a composição da cana-
de-açúcar, que, por sua vez, apresenta elevados teores de
carboidratos solúveis e conteúdo celular. Esses componentes estão
provavelmente relacionados com a elevada digestibilidade de
matéria orgânica. Além disso, face ao baixo teor de proteína bruta
no produto final, há a possibilidade de uso de uma fonte de
nitrogênio não proteico com o objetivo de adequação à síntese de
proteína microbiana ou verdadeira. Outro fato observado, segundo
Pereira (1995), é que, com o crescimento da proteína microbiana,
há uma diminuição dos teores de carboidratos solúveis, indicando
assim que estes foram utilizados para o crescimento dos
microrganismos formadores da mencionada proteína. Outro ponto
importante observado se prende ao tempo transcorrido entre o corte
da cana-de-açúcar e o transporte, que pode provocar mudanças
morfofisiológicas favorecendo o crescimento microbiano. Isso se dá
por meio da velocidade de crescimento e pelo tamanho das células,
de acordo com Elias et al. (1990). Nesse aspecto, Valiño et al.
(1992), avaliando a dinâmica de crescimento da microbiota da cana-
de-açúcar na produção da sacharina, verificaram que a contagem
máxima de leveduras e bactérias viáveis era ocorrida 24 horas após
a colheita. Todavia, vale frisar que há evidências de uma grande
variabilidade na composição das sacharinas produzidas em diversas
regiões do Brasil. Esse fato é em razão, de acordo com Resende e
Inácio Neto (2001), dos diferentes tipos varietais de cana-de-açúcar
utilizadas, idade de corte, teor de carboidratos presentes,
características edáficas do substrato, umidade relativa do ar,
amplitude térmica das regiões produtoras, etc. Com relação às
espécies de bactérias identificadas na sacharina, as ureolíticas
como Acinetobacter cacoaceticus, Klebsiella pneumoniae, Proteus
vulgaris exercem papel fundamental na hidrólise da ureia e amônia.
Esse fato é importante para a síntese celular de algumas espécies
(ELIAS et al., 1990). Dentre as leveduras, foram identificadas a
Candida maltosa e C. guillesmonddi como mais eficientes durante o
processo fermentativo. Além disso, de acordo com Vivas e Carvajal
(2004), os microrganismos que se desenvolveram a partir da
microflora epifítica presente na biomassa da cana-de-açúcar utilizam
os açúcares presentes onde o crescimento dessa é favorecido pela
adição de ureia e sais minerais. Esse processo se realiza mediante
a fermentação em estado sólido. Ainda segundo esses autores,
tendo em vista as condições de elevação da proteína microbiana no
processo fermentativo, fica evidenciada uma alternativa de
resolução da relação proteína-energia, que está presente na cana-
de-açúcar. Os principais grupos de leveduras que participam do pro‐
cesso (ELIAS et al., 1990) são: Candida pentolopessi,
Sacharomyces cervisiae, Candida tropicalis, Candida intermédia,
Candida crusei, etc. É atribuído a Candida crusei a atividade
ureológica, que não utiliza sacarose e depende para o suporte
energético, desdobrando a ureia para fornecer amoníaco na síntese
proteica. Com respeito às bactérias, uma parte é autóctone e o
restante é adquirido durante a manipulação.

2.2.2. Resultados obtidos da sacharina da cana-de-açúcar –


antecedentes
A formulação original empregada no processo produtivo da
sacharina, conforme orientação de Elias et al. (1990), consiste em
15 kg de ureia, 5 kg de uma mistura mineral com macro e micronu‐
trientes, e mais 2 kg de sulfato de amônio. Essa mistura é
adicionada à biomassa da cana-de-açúcar picada. A cana com a
mistura mineral é distribuída em um piso de revestido (camadas de
5 cm a 10 cm), coberto, mas bem ventilado (à sombra). Deve-se
manter a cana mais a mistura em uma camada espessa, entre 20
cm e 25 cm, com o objetivo de assegurar adequação de umidade
necessária à fermentação. Esse processo deve durar de 24 a 48
horas. Após esse processo fermentativo, o produto já pode ser
fornecido aos animais ou ser submetido a uma secagem (10% a
15% de umidade) e estocá-lo para uso posterior, por períodos de até
6 meses (THIAGO; VIEIRA, 2002). Com essa formulação, os
principais resultados obtidos de proteína bruta e verdadeira
(microbiana) e a porcentagem de matéria seca são apresentados na
Tabela 1. Além desses resultados obtidos no ICA em Cuba, por
Elias et al. (1990), constam também na Tabela 1 resultados de
diferentes autores, obtidos em diferentes regiões do Brasil conforme
Resende e Inácio Neto (2001).

Tabela 1. Valores obtidos de proteína bruta (PB), microbiana (PV) e porcentagem de


matéria seca.

Resultado obtido Resultado médio obtido


Parâmetro
em Cuba(1) no Brasil(2)

Matéria seca (%) 87 a 89 87

PB (%) 11 a 16 14,2

PV (%) 8,9 a 13,9 3,5

(PV/PB).100(%) 80,9 a 86,9 24,6


Elias (1990).
(1)

Almeida (1997), Carvalho (1995), Inácio Neto (1999), Oliveira (1998), Pereira (1995) e
(2)

Reis (1996).

2.2.3. Resultados obtidos em Pernambuco – sacharina da cana-


de-açúcar
A primeira experiência realizada em Pernambuco com relação à
obtenção da sacharina foi em 1989. Nessa ocasião, foram utilizados
como matéria-prima para o produto final enriquecido colmos da
variedade de cana-de-açúcar CB-15-3 e também da variedade de
sorgo sacarino IPA 467-4-2 (ENRIQUECIMENTO..., 1992). Visando
atender o processo fermentativo, a mistura mineral foi modificada a
partir da formulação original de conformidade com Elias et al.
(1990). Além disso, a mencionada mistura mineral foi adaptada para
atender também a produção da sacharina a partir do sorgo sacarino,
que foi uma iniciativa tecnológica do IPA. Para cada tonelada de
colmos, foi adicionada a mistura mineral (Tabela 2), 48 horas após a
colheita.

Tabela 2. Mistura mineral utilizada na sacharina do sorgo sacarino e da cana-de-açúcar


(1991).

Ingrediente Kg/t de colmo (%)

Ureia(1) 15 1,5

Sulfato de magnésio(2) 2 0,2

Cloreto de sódio(3) 2 0,2

Fonte de fósforo + microelementos(4) 3 0,3


(1)
Ureia pecuária ou fertilizante.
(2)
Fertilizante.
(3)
Sal de cozinha, fino.
(4)
Produto comercial (suplemento mineral com 130 g de P2O5/kg + macro e
micronutrientes).
Fonte: Tabosa (2009).

A biomassa vegetal do sorgo sacarino e da cana-de-açúcar,


caracterizada antes do processo de fermentação, apresentou 31%
de matéria seca (pré-secagem), proteína bruta de 2,5% a 3,0%, e o
brix do caldo em torno de 18% a 20%. Após o processo de
fermentação, ficou sinalizado que a fermentação desejável ocorreu,
promovendo incremento na proteína microbiana (Tabela 3).

Tabela 3. Valores de proteína bruta (PB) e proteína microbiana (PV) após fermentação.

Proteína bruta(3) Proteína microbiana(3) PV/PB


Material
(%) (%) (%)

Sorgo sacarino(1) 11,6 ± 1,17 5,1 ± 0,73 44

Cana-de-açúcar(2) 11,9 ± 1,17 5,8 ± 0,73 49


(1)
Var. IPA 467-4-2.
(2)
CB 45-3.
(3)
Não significativo (P < 0,05), pelo teste t.
Fonte: Enriquecimento... (1992).

A relação proteína microbiana-proteína bruta, com valores entre


44% e 49%, para o sorgo sacarino e a cana-de-açúcar respectiva‐
mente, não está de acordo com os resultados obtidos por Elias et al.
(1990).

2.2.4. Sacharina (rústica) da cana-de-açúcar em Pernambuco –


formulação modificada
O principal objetivo que se busca em fermentar a cana-de-açúcar
é a obtenção de um produto que seja contemplado com elevados
níveis e qualidade de proteína. É importante frisar que, nesse
processo, a formulação da proteína microbiana se dá mediante os
microrganismos que se desenvolvem a partir da microflora epifítica,
presente na biomassa da cana-de-açúcar. Por conseguinte, essa
microflora é alimentada dos açúcares presentes, além de necessitar
de pequenas quantidades de uma mistura mineral, contendo
basicamente ureia e fósforo. Todo esse processo tecnológico é
fundamentado e sustentado na literatura científica em várias regiões
do mundo (BACKES et al., 2007; ELIAS et al., 1990; INÁCIO NETO,
2003; RESENDE; INÁCIO NETO, 2001; RICARDO; SANCHES,
2007; THIAGO; VIEIRA, 2002; VIVAS; CARVAJAL, 2004; ZANETTI
et al., 1993).
No sentido de atualizar e tornar mais eficiente a tecnologia de
produção da sacharina da cana-de-açúcar, foi realizada pelo IPA
uma avaliação de 15 diferentes formulações a partir da formulação
mineral original. Consta, na Tabela 4, a nova formulação
selecionada em comparação à original, em que ocorreram
modificações de ordem qualitativa e quantitativa. O critério de
seleção dessa nova formulação foi promover reflexos na elevação
da proteína microbiana de forma e intensidade de maior magnitude
quando comparada às demais formulações. (TABOSA, 2009).

Tabela 4. Mistura mineral utilizada na elaboração da sacharina da cana-de-açúcar.


Componente Formulação (kg/t biomassa)

Original Modificada

Ureia(1) 15 8

Suplemento mineral 3 8

Sulfato de magnésio(2) 2 2

Cloreto de sódio 2 2

MAP(3) - 7
Suplemento mineral – Suprafós 130 ou Guyo sal 900 ou Fosbovi 30.
(1)
Pecuária ou fertilizante.
(2)
Fertilizante.
(3)
Fosfato monoamônico fertilizante.
Fonte: Tabosa (2009).

Novos resultados foram obtidos com essa nova formulação, em


que foi adicionado o MAP, na proporção de 7 kg/t de biomassa e
reduzida a ureia de 15 para 8 kg/t de biomassa, mostrando o total
da mistura inalterado, em 22 kg/t de biomassa. Vale frisar que na
composição do MAP há 48% de P2O5 e 11% de nitrogênio. Por sua
vez o MAP possivelmente forneceu maior quantitativo de fósforo, o
que favoreceu um maior desenvolvimento dos microrganismos e da
proteína microbiana. Os resultados obtidos com essa formulação
são mostrados na Tabela 5, para proteína bruta e microbiana.

Tabela 5. Teores de proteína bruta (PB), proteína verdadeira (PV) e PV/PB, em diferentes
amostras de sacharina de cana sob formulação modificada.

Matéria seca PB PV PV/PB


Amostra(1)
(%) (%) (%) (%)

015-A1 91 16,9 8,8 52

016-A2 92 15,5 9,7 62

012-A3 95 16,8 6,7 39

001-A4 96 15,9 5,1 32

921-A5 91 19,4 7,5 39


Cana in natura 90 2,6 1,0 38

Lotes de 0,5 t a 1,0 t de sacharina rústica, analisados no laboratório de Análise de


(1)

Plantas e Rações – Lapra/IPA. Amostras de conformidade com as remessas nº 003/08,


004/08, 01/08 e 37/07 dos respectivos boletins de análise.
Fonte: Tabosa (2009).

Considerando que os resultados obtidos (Tabela 7) para proteína


microbiana foram oriundos de lotes de magnitude comercial (0,5 t a
1,0 t), vale salientar que são adequados ao patamar esperado, de
conformidade com Elias et al. (1990), bem como a relação proteína
microbiana-proteína bruta, em que ocorreram percentuais acima de
50%. Ademais, Vivas e Carvajal (2004) relatam que a formulação
equivalente a 15 kg de ureia + 5 kg de sais minerais + 2 kg de
sulfato de cálcio ou sódio + 3 kg de Magnesita por tonelada de cana
resultou em um teor de 13,0% de proteína bruta e de 82% de
carboidratos solúveis. Com relação à sacharina produzida mediante
inoculação conforme relatado por Pereira (1995), em comparação à
confecção da sacharina tradicional, foi concluído que havia um
aumento da proteína microbiana e também da proteína bruta
quando foi adicionado o inóculo (levedura de panificação). Contudo,
foi concluído que a sacharina tradicional (sem inoculação) parece
ser a mais adequada pelo fato de ser mais facilmente obtida e
apresentar menor custo.

3. Sacharina do sorgo sacarino – primeiros


resultados obtidos envolvendo tamanho de
partículas e tempo de fermentação

O sorgo sacarino (em muitas regiões utilizado como forrageiro)


poderá apresentar adequação técnica para a confecção da
sacharina. Esse fato poderá ser observado em face do seu alto
potencial de produção de biomassa e principalmente por apresentar
elevado teor de açúcares (brix de 15% a 20%). Os primeiros
resultados de produção de sacharina do sorgo sacarino foram
realizados em Pernambuco, no IPA, a partir da variedade IPA 467-4-
2. É uma cultivar desenvolvida pelo IPA, recomendada para a região
semiárida. Apresenta ciclo total de 130 dias do plantio à colheita,
potencial de produção de biomassa da ordem de 40 t/ha a 60 t/ha
(TABOSA et al., 1996, 2007).
Na Tabela 6, constam os resultados obtidos para sacharina do
sorgo sacarino envolvendo tempo de fermentação em presença do
tamanho de partículas.

Tabela 6. Avaliação do tamanho de partículas sob tempo de fermentação no processo de


obtenção da sacharina de sorgo sacarino. Resultados de PB e de PV (%). IPA, Recife,
1998.

Tamanho de partículas

Tempo de fermentação (h) 4 cm 6 cm 8 cm

PB PV PB PV PB PV

6 17,8a 1,2b 15,9b 1,6b 18,9a 1,6b

12 16,3a 2,1b 15,2b 3,5ab 16,4a 2,8b

18 17,1a 6,2a 18,3a 6,7a 18,4a 2,9b

24 17,9a 7,5a 20,6a 6,3a 20,3a 6,8a


PB – Proteína bruta; PV – proteína verdadeira ou microbiana/médias seguidas pela
mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (P < 0,05).
Fonte: Araújo et al. (1996) e Tabosa et al. (2006).

Os resultados obtidos de proteína microbiana no processo de


produção da sacharina sinalizam que o tamanho das partículas de 4
cm a 6 cm apresentaram-se mais favoráveis quando comparados
com os resultados obtidos quando a partícula era de 8 cm, conside‐
rando o tempo de fermentação entre 18 e 24 horas. Além disso, a
análise de regressão da proteína microbiana para tempo de fermen‐
tação revelou significância (P < 0,01) para efeito linear, em que a
equação encontrada foi y = 0,5503 + 0,322509X, com r2 = 98,69%.
Esses resultados de 15% a 20 % de PB provavelmente refletem os
efeitos do nitrogênio adicionado via ureia. Elevados valores de PB
não indicam necessariamente que ocorreu fermentação desejável,
como aquela que eleva o teor de proteína microbiana. A mistura
mineral utilizada na confecção da sacharina rústica a partir do sorgo
sacarino foi a mesma utilizada para a elaboração da sacharina da
cana-de-açúcar, conforme descrita na Tabela 2.

4. A importância da palma forrageira para a


pecuária regional

A palma forrageira variedade gigante, redonda e clone 20 do IPA


(Opuntia fícus-indica Mill) bem como a palma da variedade miúda ou
doce, variedade Alagoas ou Sertânia (Nopalea cochenillifera
Sal.Dick) poderão apresentar adequação técnica na confecção do
farelo enriquecido, face o elevado potencial de produção de
biomassa e, principalmente, por apresentar elevado teor de
carboidratos solúveis. De acordo com Flores Valdez e Gallegos
Vasquez (1993) e Santos et al. (2006), o teor de carboidratos das
variedades gigante e redonda (Opuntia) e miúda ou doce (Nopalea)
são 30% e 60%, respectivamente. Na região Nordeste do Brasil, há
registro de cerca de mais de 600 mil hectares cultivados,
predominantemente nos estados de Pernambuco, Alagoas e
Paraíba (CHAGAS, 1992; SANTOS et al., 2006; SOARES et al.,
2004; TABOSA et al., 2004). No caso particular do Estado de
Alagoas, onde a cana-de-açúcar ocupa uma área de cerca de 400
mil hectares, a palma forrageira corresponde a segunda cultura,
perdendo só para a cana-de-açúcar (ARAÚJO FILHO, 2008).
Segundo relato de Arruda Filho e Arruda (2006), Bravo (1978) e
Domingues (1963), essas espécies botânicas, que são nativas do
México, foram introduzidas no Brasil ainda no período imperial, no
início do século 19, objetivando assim a produção do corante natural
(carmim) a partir da cochonilha de mesmo nome (Dactilopius cacti
L.). Com relação à introdução da palma no Nordeste do Brasil, é
importante evidenciar os seguintes registros:
a) No início do século passado, dois dos maiores empresários
da indústria têxtil regional (Delmiro Goulveia e Hermann
Lundgren) a importaram do México visando à produção do
corante natural (carmim). O objetivo principal era o emprego do
carmim no processo de tingimento industrial. A partir daí a
palma foi identificada na região, possivelmente como alternativa
forrageira, pelo fato de resistir à falta de água (SUASSUNA,
2004).
b) Há registros de que a palma forrageira foi disseminada no
Nordeste brasileiro por ordem do governo, após a seca de
1932, passando assim a ser reconhecida como um dos
principais recursos de subsistência da pecuária no Semiárido
(DUQUE, 1973).
A palma pertence ao grupo de plantas cujo metabolismo é
denominado de CAM – metabolismo ácido das crassuláceas –, cuja
característica fundamental é a sua suculência. Essa se manifesta
das seguintes formas: em nível de suas raquetes; em nível
anatômico, pela dimensão elevada dos vacúolos completamente
tomados por água. Outro aspecto da palma forrageira é a sua
elevada eficiência em uso de água, que pode variar de 50 kg H2O
por kg a 150 kg H2O por kg de matéria seca produzida (FARIAS et
al., 1984). Nesse aspecto, o sorgo para produzir a mesma
quantidade de matéria seca demandaria 250 kg H2O por kg de MS
(TABOSA et al., 1986). Com relação ao seu valor nutricional, a
palma apresenta 85% do valor do milho, considerado como de até
75% de Nutrientes Digestivos Totais (NDT) (FARIAS et al., 1984;
TABOSA et al., 2004). O IPA vem desenvolvendo ações de pesquisa
com essa cactácea desde 1958 em parceria com outros órgãos
locais. Nesse ínterim foram avaliados diferentes aspectos da
espécie, principalmente no âmbito do valor nutricional e na
avaliação de consumo por ruminantes. Foram relatados níveis de
produtividade de 300 t/ha a 400 t/ha, sendo a cultura devidamente
atendida em todos os seus tratos culturais.
4.1. O farelo não enriquecido – um precedente para o
enriquecimento proteico

Estudos envolvendo o farelo da palma forrageira sem a utilização


da tecnologia da fermentação em estado sólido foram realizados em
Pernambuco na Universidade Federal Rural de Pernambuco
(UFRPE). Pelos resultados alcançados, há uma sinalização do
potencial de uso do farelo da palma que, na condição de
enriquecimento protéico, poderá ser apresentado como de elevado
valor nutricional para ruminantes e também para não ruminantes.
Nesse contexto, Véras et al. (2002) avaliaram o farelo in natura da
palma forrageira em substituição ao milho na proporção de até 75%
por meio do consumo e da digestibilidade aparente em cordeiros.
Os resultados evidenciaram que, com a inclusão do farelo in natura,
o coeficiente de digestibilidade da matéria seca, matéria orgânica,
fibra em detergente neutro, carboidratos totais, extrato etéreo e
proteína bruta não foi influenciado. Todavia, para a fibra em
detergente ácido foi verificado um aumento linear. Ainda Véras et al.
(2005a), estudando outros níveis (0,33%, 67% e 100%) de
substituição do milho pelo farelo de palma in natura no desempenho
de ovinos em crescimento, relataram que os consumos de matéria
seca, proteína bruta, matéria orgânica, carboidratos totais e o
rendimento da carcaça não foram influenciados quando o milho foi
substituído pelo farelo de palma. Além disso, em ovinos em
crescimento, na avaliação do consumo e da digestibilidade, foi verifi‐
cado que os coeficientes de digestibilidade aparente da matéria
seca e matéria orgânica diminuíram linearmente enquanto os
coeficientes da proteína bruta e FDN não foram influenciados. Não
houve efeito da substituição do milho pelo farelo de palma in natura
sobre os consumos de matéria seca e proteína bruta, porém o
consumo de NDT diminuiu linearmente (VÉRAS et al., 2005b).
Com relação ao uso do farelo in natura da palma forrageira na
formulação de rações para monogástricos, no caso da galinha
caipira, Ludke et al. (2005) relatam que existe potencial para o uso
do farelo da palma forrageira in natura na alimentação de galináceos
em face dos coeficientes de metabolismo e dos valores de energia
metabolizável calculados (973 kcal/kg a 997 kcal/kg).
Avaliando níveis de substituição da raspa de mandioca por farelo
de palma forrageira in natura em ovinos, em que foi medido o
consumo de nutrientes, Araújo et al. (2006) relataram que o farelo
da palma forrageira substitui a raspa da mandioca possibilitando um
maior consumo; todavia, os níveis nutricionais das dietas não foram
significantes para atender as demandas totais de nutrientes. Em
face do exposto, sobre o valor nutricional do farelo não enriquecido
da palma forrageira e a sua respectiva utilização na alimentação
animal, evidenciam-se os seguintes pontos: a) pode ser
recomendado tanto para ruminantes como para não ruminantes; no
entanto, pode ser considerado deficiente em alguns pontos, por
exemplo, interferir na redução do NDT e da conversão alimentar; b)
o valor obtido para energia metabolizável pode ser considerado
baixo (970 kcal/kg – 1.100 kcal/kg) se comparado com os valores
obtidos para sorgo ou milho.
Assim, procurando adequar o valor nutricional do referido farelo
para um alimento rico, foi utilizada a tecnologia da fermentação em
estado sólido no sentido de proceder o enriquecimento proteico, via
proteína microbiana. Com isso, presume-se que o farelo enriquecido
provavelmente irá suprir as deficiências alimentares detectadas
quando da ingestão pelos animais do farelo in natura.

4.2. O farelo enriquecido da palma forrageira (FEP)

No âmbito da fermentação em estado sólido (FES), as atuais


linhas de pesquisa em todo o mundo são voltadas para o
enriquecimento proteico de resíduos agroindustriais (PANDEY, 2003;
RAIMBAULT, 1998). Com isso, os microrganismos existentes no
processo elevaram o teor proteico do produto, que por sua vez
poderá ser utilizado como alimento animal. Trata-se, portanto, de
uma tecnologia definida e que também poderá ser estendida a
outros produtos in natura não residuais, como cana-de-açúcar,
sorgo sacarino (ambos ricos em açúcares) e palma forrageira (rica
em carboidratos). De acordo com Pinto et al. (2005), na fermentação
em estado sólido a água presente na biomassa vegetal interage
com dois parâmetros: a umidade, que corresponde ao percentual de
água na massa total do meio, e a atividade de água (aw) que
corresponde a um parâmetro termodinâmico interligado ao potencial
químico da água, ou seja, à quantidade de moléculas de água
disponíveis nas proximidades (adjacências) das partículas do
substrato. No contexto da fermentação em estado sólido, a aw é
mais importante do que a umidade, pois afeta diretamente o
crescimento microbiano. Nesse contexto, de acordo com Pandey
(2003), a biomassa homogênea, composta por hemicelulose,
lignina, amido, pectina e proteínas, atende como fonte de carbono e
energia de suporte para o crescimento da microbiota que se
encontra presente na própria biomassa.
No enriquecimento proteico da palma forrageira por meio da
fermentação semissólida, a atividade da água (aw) se constitui em
uma das variáveis que mais afetam o processo fermentativo. Nesse
contexto, Araújo et al. (2005) realizaram trabalho com o objetivo de
obter isotermas de dessorção da biomassa nas temperaturas usuais
de fermentação (30 °C, 35 °C e 40 °C) correlacionando a aw e a
umidade. Os resultados sinalizam que, para iniciar o processo de
fermentação para o enriquecimento, a umidade da biomassa da
palma deverá partir de 90%, e a aw acima de 0,9.
Utilizando a tecnologia de inoculação de microrganismos, na
biomassa da palma forrageira, visando à elevação da proteína bruta,
Araújo et al. (2005, 2008) relatam que, nas concentrações de 5%,
10% e 15% da levedura Saccharomyces cerevisiae, foram obtidos
valores de 14,4%, 22% e 26%, respectivamente. Os autores não
mencionam resultados de proteína microbiana. Outro resultado
relatado por Lima et al. (2004) evidencia que o produto resultante da
fermentação, com ou sem levedura, poderá ser usado na
alimentação de ruminantes. Foram relatados valores de 26,52% de
proteína bruta.
4.2.1. Mistura mineral utilizada no farelo enriquecido da palma
forrageira (FEP)
No processo de bioconversão da palma forrageira, foi utilizada a
fermentação em estado sólido. Nesse processo biotecnológico não
foi utilizado inoculação de leveduras ou nenhum outro
microrganismo. A fermentação foi completada a partir da flora
epifítica existente na biomassa da palma forrageira. Para que o
crescimento microbiano fosse realizado e completado no transcurso
de um período de 24 horas, houve uma adição à biomassa de uma
mistura mineral. Desse modo, nesse processo fermentativo, a ação
de microrganismos em presença da mistura provoca, por sua vez,
uma elevação e multiplicação da proteína microbiana. Os
quantitativos dos componentes da mistura mineral para cada
tonelada de biomassa da palma forrageira podem ser vistos na
Tabela 7.

Tabela 7. Quantitativo da mistura mineral utilizada na biomassa da palma forrageira para


obtenção do farelo enriquecido.

Componente da mistura Kg/t de palma in natura

Ureia(1) 8,0

Suplemento mineral(2) 3,0

Sulfato de magnésio(3) 2,0

Cloreto de sódio 2,0

MAP (Fosfato monoamônico)(3) 8,0


(1)
Fertilizante ou ureia pecuária.
(2)
Suprafós 130 ou Guyio Sal 900 ou Fosbovi 30.
(3)
Fertilizante.
Fonte: Tabosa (2009).

O processo metodológico de obtenção obedece aos seguintes


passos: 1) selecionar os cladódios (raquetes), retirando os mais
velhos e fibrosos; 2) triturar o material em máquina forrageira
apropriada, de forma que o material fique bem uniforme; 3) espalhar
o material triturado em piso de cimento, chão batido ou em lona, de
modo que fique com uma camada de aproximadamente 10 cm de
altura; 4) adicionar a este material a mistura mineral, revolvendo e
tornando a espalhar o mesmo, formando novamente uma camada
de 10 cm de altura; 5) repetir a operação de revolvimento a cada 6
horas; nessa fase, o material deverá permanecer à sombra e em
ambiente arejado, por um período de 24 horas. Após esse período o
material pode ser oferecido aos animais. No caso de
armazenamento (15% de umidade), sua validade é de 6 meses a 1
ano.

4.2.2. Valor nutritivo e consumo voluntário do farelo


enriquecido da palma forrageira
Foi realizada, em 2004, na Universidade Federal Rural de Per‐
nambuco – Departamento de Zootecnia, sob a supervisão do Prof.
Edvaldo Correia de Araújo, uma ação de pesquisa com animais,
objetivando avaliar o valor nutritivo do farelo enriquecido da palma
forrageira, por meio de um ensaio de digestibilidade in vivo e
mensurar o seu consumo voluntário quando fornecido à vontade aos
animais. Para obtenção do farelo enriquecido, utilizou-se a palma
forrageira Miúda, predominante em Alagoas, oriunda do Município
de Batalha. O processo utilizado foi o mesmo empregado na
obtenção da sacharina da cana-de-açúcar. Foram utilizados quatro
ovinos machos com peso médio inicial de 30 kg, em gaiolas
metabólicas por um período de 28 dias. Os coeficientes de
digestibilidade dos componentes químicos da palma enriquecida
(MS – matéria seca, PB – proteína bruta, FDN – fibra em detergente
neutro, FDA – fibra em detergente ácido, CND – carboidratos não
estruturais, EE – extrato etéreo, MO – matéria orgânica, cinzas, e
NDT – nutrientes digestivos totais) foram calculados. Os dados são
apresentados na Tabela 8.

Tabela 8. Coeficientes de digestibilidade dos componentes químicos e nutrientes


digestivos totais (NDT) da palma enriquecida calculados com base na matéria seca (105
°C).

Componente químico (%)


MS PB FDN FDA CND EE MO CINZAS NDT

80,61 76,94 72,18 70,27 92,40 15,19 85,10 49,32 75,60

O consumo voluntário de matéria seca expresso em porcen‐


tagem do peso vivo foi de 2,0%. A energia metabolizável (EM
Bovino) e o NDT calculados a partir do ensaio de digestibilidade foi
de 2.721 kcal/kg e 75%, respectivamente. Vale frisar que, na palma
forrageira in natura, os valores encontrados para NDT são de 63%
(MELO et al., 2003; PESSOA et al., 2004). Os resultados
preliminares obtidos pela pesquisa para a caracterização do produto
(farelo da palma enriquecido) depois da fermentação são mostrados
na Tabela 9.

Tabela 9. Valores de proteína bruta e verdadeira ou microbiana no farelo enriquecido.

Matéria seca Proteína bruta Proteína verdadeira


Produto
(%) (%) (%)

FEP 1 Batalha – AL 90 18–26 8,0–19,0

FEP 4 SBU – PE 88 15–26 7,0–12

Palma in natura 90 2,9–5,2 1,4–2,0


FEP 1 e 4 – após processo fermentativo. Palma in natura – biomassa original e sem
fermentação. Proteína verdadeira – originária do N microbiano.

4.2.3. Farelo enriquecido da palma forrageira – novos


resultados obtidos
Novos resultados foram obtidos para proteína bruta, proteína
microbiana, FDN (fibra em detergente neutro) e FDA (fibra em deter‐
gente ácido) no Laboratório de Enzimologia Aplicada e Bromatologia
da Ufal conforme consta na Tabela 10.

Tabela 10. Resultados obtidos de proteína bruta, microbiana, FDN (fibra em detergente
neutro) e FDA (fibra em detergente ácido).

PB PV PV/PB FDA FDN


Amostra Matéria seca (%)
(%) (%) (%) (%) (%)
MI-C 94 4,1 2,5 60 13,3 63,1

MI-01 94 12,5 9,7 80 12,9 67,2

MI-02 94 21,0 16,7 79 14,6 35,1

SI-C 93 4,5 2,1 56 6,3 61,1

SI-01 92 18,9 10,8 57 19,6 56,4

SI-02 93 17,9 10,6 62 18,3 62,9


MI-C – amostra do farelo de palma forrageira in natura oriunda da localidade de Major
Izidoro, AL. SI-C – amostra do farelo in natura oriunda da localidade de Santana do
Ipanema, AL. MI-01 e MI-02 – amostras do farelo de palma enriquecido oriundas do
Município de Major Izidoro, AL. SI-01 e SI-02 – amostras de farelo de palma enriquecido
oriundas do Município de Santana do Ipanema, AL.

5. Uso da bioconversão no enriquecimento


de resíduos vegetais por fermentação em
estado sólido – uma experiência em
Pernambuco com frutas e hortaliças

Um dos maiores problemas dos grandes centros urbanos é a


geração de resíduos e de subprodutos sem destinação. Face aos
princípios da preservação ambiental, torna-se necessário e
imperioso equilibrar a produção de bens, principalmente de
alimentos, no âmbito do maior desempenho da economia de
mercado, levando em consideração os aspectos de equilíbrio social
e de sustentabilidade ambiental (PINTO et al., 2005). Backes et al.
(2007) relatam que existem, no Brasil, cerca de 44 milhões e, no
mundo, 1 bilhão de seres humanos que não têm acesso ao direito
básico de comer, enquanto que em certos lugares como no Centro
de Abastecimento Alimentar de Pernambuco (Ceasa – PE), em
feiras e mercados são desperdiçadas dezenas de toneladas de
alimento diariamente, sendo que essa quantidade seria suficiente
para alimentar milhares de famílias. Vale ressaltar que grande parte
desses resíduos possui elevado potencial de reaproveitamento, e,
portanto, torna-se interessante a busca de outros destinos que não
o do aterro sanitário. Para isso existem várias alternativas que
podem ser adotadas no sentido de melhorar a utilização desses
resíduos, tais como: a) uso de partes nobres como frutas, legumes e
hortaliças em bom estado de conservação para alimentação
humana; b) partes menos nobres podem ser utilizadas na
alimentação animal. Trabalhos desenvolvidos por Andrade (2000) e
Klafke (2002) relatam sobre o assunto.

5.1. A tecnologia utilizada

A proposta se fundamenta na experiência realizada pelo IPA,


cujo resultado foi a obtenção da sacharina da cana-de-açúcar e do
sorgo sacarino. Essa mesma tecnologia pode ser utilizada para o
aproveitamento de resíduos vegetais (frutas hortaliças e tuberosas)
da Ceasa. O produto final consistiu no enriquecimento proteico pela
fermentação aeróbica de produtos sólidos. Com isso, foi obtido um
produto enriquecido proteicamente e com possibilidades de
utilização na alimentação animal, como é o caso da sacharina da
cana-de-açúcar.
O princípio do enriquecimento proteico fundamenta-se na ação
microbiana, em condições aeróbicas, em meio seco, com elevado
teor de umidade, com disponibilidade de minerais essenciais
(incorporados) da digestão de carboidratos (açúcares e celulose)
pelos microrganismos presentes, naturalmente, na massa de tecidos
vegetais disponíveis. Os carboidratos agem como combustível, e os
minerais como catalisadores. Em pouco tempo toda a massa
vegetal primitiva resulta numa massa disforme, de odor agradável,
composta de microrganismos mortos. O produto resultante tem
predominância de proteína no lugar dos carboidratos.

5.2. Resíduos vegetais na Ceasa – Recife (a matéria-


prima)
Fundamentado na tecnologia descrita acima, procurou-se
adaptá-la experimentalmente ao aproveitamento de resíduos
vegetais da Ceasa, que recolhe mensalmente entre 600 e 700
toneladas de resíduos de frutas, hortaliças folhosas, raízes,
tubérculos e outras. Basicamente, tudo isso é levado aos lixões,
onde ocorrem problemas diversos. Desse quantitativo, ressalta-se
que aproximadamente 80% (entre 480 e 560 toneladas) são de
origem orgânica.

5.3. Avaliação preliminar no processamento dos


resíduos

Em trabalho prévio realizado pelo IPA, já foi possível classificar


os resíduos em quatro grandes grupos, conforme descritos a seguir:
Grupo 1 – frutas; Grupo 2 – tubérculos e raízes; Grupo 3 – hortaliças
folhosas; Grupo 4 – hortaliças não folhosas. Foi utilizada, na
biomassa de resíduos, a mesma mistura mineral recomendada na
obtenção do farelo enriquecido da palma (22 kg da mistura/t de
resíduos). Os resultados preliminares de proteína microbiana e bruta
são apresentados na Tabela 11.

Tabela 11. Resultados obtidos via fermentação em estado sólido – resíduos vegetais da
Ceasa.

Teor de proteína (%)


Nº da amostra Material utilizado
Microbiana Bruta

929 Cenoura 6,5 31,7

930 Batata doce 4,1 13,8

931 Batata inglesa 7,4 23,5

932 Beterraba 9,6 33,6

933 Jerimum 21,3 34,3

934 Chuchu 17,5 41,3

022 Maracujá 8,5 23,6


024 Repolho 17,0 24,9

Da Tabela 11, evidenciam-se os seguintes aspectos: a) o valor


muito elevado de proteína bruta, sem uma correspondente elevação
da proteína microbiana, indica que não ocorreu fermentação
adequada, fato não verificado nessa ação; b) mesmo um valor de
4,18% de proteína verdadeira para batata doce é considerado um
resultado elevado, haja vista os valores encontrados na literatura no
material in natura; c) os produtos que se mostraram bem
desidratados, bem apresentáveis e com cheiro agradável foram:
batata doce, batata inglesa, maracujá e beterraba que secaram
totalmente com 72 horas, ao sol; d) o jerimum, repolho e chuchu
apresentaram-se com elevados resultados de PB e PV; e) no geral,
os resultados obtidos nessa primeira instância foram considerados
promissores, indicando viabilidade do processo em escala. Além
desses resultados, há relato de que o melhor método de
processamento de resíduo sólido orgânico é a trituração e posterior
secagem ao sol (BACKES et al., 2007). Ademais, Lousada Júnior et
al. (2006) relatam que os teores de carboidratos não fibrosos (CNF),
de 13% na goiaba e de 23% no maracujá, mostraram que esses
resíduos podem ser utilizados como fontes de CNF.

6. Considerações finais

A bioconversão via fermentação em estado sólido pode ser


utilizada na confecção do farelo enriquecido de açúcares ou
carboidratos, como é o caso da cana-de-açúcar, do sorgo sacarino e
da palma forrageira, visando à obtenção de um produto para a
alimentação animal. Nesse processo, há um desenvolvimento da
flora epifítica mediante a adição de uma mistura mineral,
favorecendo o crescimento da proteína microbiana. Na Figura 1,
consta a identificação da matéria-prima utilizada no mencionado
processo.
O produto final obtido da sacharina da cana-de-açúcar e do
sorgo sacarino e do farelo enriquecido da palma forrageira podem
apresentar valores médios de proteína microbiana da ordem de 8%
a 20%. Outro aumento significativo é do teor de fósforo, de até
0,26%. Esse produto pode ser utilizado pelos animais logo após o
processo ou ser armazenado por um período de seis meses a um
ano. Na Figura 2, consta um registro do produto obtido, a partir da
cana-de-açúcar e da palma forrageira.

Figura 1. Materiais vegetais avaliados na obtenção do farelo enriquecido via fermentação


em estado sólido. (1) cana-de-açúcar variedade industrial; (2) palma forrageira Nopalea
variedade Alagoas ou IPA Sertânia; (3) sorgo sacarino variedade IPA 2502.
Fotos: José Nildo Tabosa
Figura 2. Processamento do farelo enriquecido. (1) Cana-de-açúcar e sorgo sacarino na
fase de secagem a céu aberto; (2) Farelo enriquecido da palma forrageira antes da
secagem; (3) farelo enriquecido da palma forrageira após secagem.
Fotos: José Nildo Tabosa

7. Referências

AIDOO, K. E.; HENRY, R.; WOOD, B. J. B. S. Solid state fermentations. Advances in


Applied Microbiology, Madison, v. 28, p. 201-237, 1982.
ALMEIDA, R. G. de. Sacharina para vacas lactantes. 1997. 54 p. Dissertação (Mestrado em
Zootecnia) – Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 1997.
ANDRADE, J. A. Novas experiências de gestão pública e cidadania. Rio de Janeiro: FGV,
2000. 296 p.
ANUÁRIO brasileiro da cana-de-açúcar 2007. Santa Cruz do Sul: Gazeta Santa Cruz,
2007. 128 p. Disponível em: <www.anuarios.com.br>. Acesso em: 3 fev. 2008.
ARAÚJO FILHO, J. T. de. Desempenho e características de ovinos deslanados submetidos a
diferentes dietas em confinamento. 2008. 86 p. Tese (Doutorado Integrado em Zootecnia) -
Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2008.
ARAÚJO, E. C. de; TABOSA, J. N.; ARCOVERDE, A. S. S.; CANTARELLI, R. F. Efeito do
tamanho da partícula e do tempo de revolvimento na qualidade da sacharina produzida
com sorgo. In: CONGRESSO NACIONAL DE MILHO E SORGO, 21., 1996, Londrina.
Resumos... Londrina: IAPAR, 1996. p. 174.
ARAÚJO, G. G. L. de; BADE, P. L.; SOCORRO, E. P. de; OLIVEIRA, G. J. C. de;
MENEZES, D. R. Consumo de nutrientes em dietas com diferentes níveis de farelo de
palma forrageira em substituição à raspa de mandioca para ovinos. In: REUNIÃO ANUAL
DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 43., 2006, João Pessoa. Anais... João
Pessoa: SBZ, 2006. 1 CD-ROM.
ARAÚJO, L. de F.; OLIVEIRA, L. de S. C.; PERRAZZO NETO, A.; ALSINA, O. L. S. de;
SILVA, F. L. H. da. Equilíbrio higroscópico da palma forrageira: relação com a umidade
ótima para fermentação sólida. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental,
Campina Grande, v. 9, n. 3, p. 379-384, 2005.
ARAÚJO, L. F.; SILVA, F. L. H.; BRITO, E. A.; OLIVEIRA JÚNIOR, S.; SANTOS, E. S.
Enriquecimento protéico de palma forrageira com Saccharomyces cerevisiae para
alimentação de ruminantes. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo
Horizonte, v. 60, n. 2, p. 401-407, 2008.
ARRUDA FILHO, G. P. de; ARRUDA, G. P. de. Manejo integrado de cochonilha Diaspis
echinocacti praga da palma forrageira em Brasil. In: MANEJO integrado de plagas y
agroecológia: haja técnica. Disponível em: <www.wweb.catie.ac.cr/informacion?
RMIP/ver.64/>. Acesso em: 20 abr. 2006.
BACKES, A. A.; RONER, M. N. B.; OLIVEIRA, V. S. de; FERREIRA, A. C. D.
Aproveitamento de resíduo sólidos orgânicos na alimentação humana e animal. Revista da
Fapese, Aracaju, v. 3, n. 2, p. 17-24, 2007.
BRAVO, H. Lãs cactáceas de México. 2. ed. México, DF: Universidade Nacional, 1978. v. 1.
CARVALHO, R. C. R. Valor nutritivo de dietas à base de sacharina e silagem de capim elefante
(Pennisetum purpureum) cv. Napier. 1995. 52 p. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) –
Universidade Federal de Lavras, Lavras, 1995.
CHAGAS, A. J. C. Adoção de tecnologia na pecuária pernambucana. In: SIMPÓSIO
NORDESTINO DE ALIMENTAÇÃO DE RUMINANTES, 4., 1992, Recife. Anais... Recife:
UFRPE, 1992. p. 108-116.
CONAB. Companhia Nacional de Abastecimento. Disponível em: <www.conab.gov.br>.
Acesso em: 2 ago. 2007.
DOMINGUES, O. Origem e introdução da palma forrageira no Nordeste. Recife: Instituto
Joaquim Nabuco de Pesquisa Sociais, 1963. 74 p.
DUQUE, J. G. O Nordeste e as lavouras xerófilas. 2. ed. Fortaleza: Banco do Nordeste do
Brasil, 1973. 238 p.
ELIAS, A.; LEZCANO, O. Effect of inclusion of levels of maize on the fermentation of sugar
cane. Cuban Journal Agricultural Science, Havana, CU, v. 28, p. 321, 1994.
ELIAS, A.; ORQUIDEA, L. P.; CORDEIRO, J.; QUINTANA, L. Reseña descriptiva sobre el
desarrollo de una tecnología de enriquecimiento protéico em la caña de azúcar mediante
fermentación em estado sólido (Sacharina). Revista Cubana de Ciencia Agrícola, Habana,
CU, v. 24, n. 1, p. 1-12, 1990.
ENRIQUECIMENTO protéico do sorgo sacarino x cana-de-açúcar, alteração de
fermentação em estado sólido: uma alternativa de utilização na alimentação animal. Recife:
Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária, 1992. 8 p. (IPA. Comunicado Técnico,
42).
FARIAS, I.; FERNANDES, A. de P. M.; LIMA, M. de A.; SANTOS, D. C. dos; FRANÇA, M.
P. Cultivo da palma forrageira em Pernambuco. Recife: Empresa Pernambucana de
Pesquisa Agropecuária, 1984. 4 p. (IPA. Instruções Técnicas, 21).
FLORES VALDEZ, C. A.; GALLEGOS VASQUEZ, C. Situacion y perpectivas de la
produccion de Tuna em la region centro-norte de México. Chapingo: Universidad Autonoma-
Ciestaam, 1993. 42 p.
GERVAIS, P.; MOLIN, P. The sole of water in solid state fermentation. Biochemical
Engineering Journal, Amsterdam, NL, v. 13, n. 2/3, p. 85-101, 2003.
INÁCIO NETO, A. Avaliação da saccharina enriquecida com diferentes fontes de amido. 2003.
125 p. Tese (Doutorado em Zootecnia) – Universidade Federal de Lavras, Lavras.
INÁCIO NETO, A. Silagem mista suplementada com sacharina no desempenho de novilhas
holandezas-zebu em confinamento. 1999. 51 p. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) –
Universidade Federal de Lavras, Lavras, 1999.
KLAFKE, G. J. Projeto piloto de beneficiamento industrial de resíduos sólidos gerados no
CEASA–POA. 2002. 123 p. Dissertação (Mestrado em Engenharia Mecânica) -
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2002.
LAUFENBERG, G.; KUNZ, B.; NYSTROM, M. Transformation of vegetables waste into
value added products: (A) The upgrading concept; (B) Practical implementations.
Bioresource Technology, Essex, v. 87, n. 2, p. 167-198, 2003.
LIMA, C. D. S.; GOMES, H. de S.; DETONI, C. E. Adição da uréia e da levedura
(Saccharomyces cerevisiae) no enriquecimento protéico da palma forrageira (Opuntia fícus-
indica L.) cv. Miúda. Magistra, Cruz das Almas, v. 16, n. 1, p. 1-8, 2004.
LOUSADA JÚNIOR, J. E.; COSTA, J. M. C. da; NEIVA, J. N. M.; RODRIGUEZ, N. M.
Caracterização físico-química de subprodutos obtidos do processamento de frutas tropicais
visando seu aproveitamento na alimentação animal. Ciência Agronômica, Fortaleza, v. 37,
n. 1, p. 70-76, 2006.
LUDKE, I. V.; LUDKE, M. do C. M. M.; ZANOTTO, D. L.; FREITAS, C. R. G. de; SANTOS,
M. J. B. dos. Características nutricionais de ingredientes eco-regionais para a agricultura
agroecológica 1: farelo de palma forrageira. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE
AGROECOLOGIA, 3.; SEMINÁRIO ESTADUAL DE AGROECOLOGIA, 3., 2005,
Florianópolis. Anais... Florianópolis: SBA, 2005. 5 p. 1 CD-ROM.
MELO, A. A. de; FERREIRA, M. de A.; VÉRAS, A. C. C.; LIRA, M. de A.; LIMA, L. E. de;
VILELA, M. da S.; MELO, E. O. S. de; ARAÚJO, P. R. B. de. Substituição parcial do farelo
de soja por uréia e palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill.) em dietas para vacas em
lactação: desempenho. Revista Brasileira de Zootecnia, Viçosa, v. 32, n. 3, p. 727-736,
2003.
OLIVEIRA, P. S. Desempenho de bezerros holandês-zebu alimentados com associação de
sacharina e silagem de capim elefante (Pennisetum purpureum ) cv. Napier. 1998. 44 p.
Dissertação (Mestrado em Produção Animal) – Universidade Federal de Lavras, Lavras,
1998.
PANDEY, A. Solid state fermentation. Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, NL, v.
13, n. 2/3, p. 81-84, 2003.
PEREIRA, O. G. Valor nutritivo da cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) sob as formas
integral, sacharina e como desidratado, para bovinos e ovinos. 1995. 87 p. Tese (Doutorado) -
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 1995.
PESSOA, R. A. S.; FERREIRA, M. de A.; LIMA, L. E.; LIRA, M. A.; VÉRAS, A. S. C. SILVA,
A. E. V. N.; SOSA, M. Y.; AZEVEDO, M.; MIRANDA, K. F.; SILVA, F. M.; MELO, A. A. S.;
LÓPEZ, O. R. M. Desempenho de vacas leiteiras submetidas a diferentes estratégias
alimentares. Archivos de Zootecnia, Córdoba, v. 53, n. 203, p. 309-320, 2004.
PINTO, G. A. S.; BRITO, E. S. de; ANDRADE, A. M. R.; FRAGA, S. I. P.; TEIXEIRA, R. B.
Fermentação em estado sólido: uma alternativa para o aproveitamento e valorização de
resíduos agroindustriais tropicais. Fortaleza: Embrapa Agroindústria, 2005. 5 p. (Embrapa
Agroindústria. Comunicado Técnico, 102).
RAIMBAULT, M. General and microbiological aspects of solid substrate fermentation.
Electronic Journal of Biotechnology, Valparaíso, v. 1, n. 3, p. 174-187, 1998.
REIS, A. B. de. Desempenho de bezerros holandês-zebu alimentados com associação de
sacharina e capim elefante (Pennisetum purpureum, Schum) cv. Napier. Lavras: UFLA, 1996.
48 p. Dissertação de Mestrado em produção animal.
RESENDE, C. A. P. de; INÁCIO NETO, A. Sacharina: uma abordagem nacional. In:
SIMPÓSIO DE FORRAGICULTURA E PASTAGEM, 2., 2001, Lavras. Anais... Lavras:
UFLA, 2001. p. 15-25.
RICARDO, M. C. I.; SANCHES, L. B. R. Fermentacíon em estado sólido (I): Producción de
alimento animal. Tecnologia Quimica, Camagüey, v. 27, n. 3, p. 17-22, 2007.
ROURA, G. Proceso para la producción de un forage enriquecido en proteina a partir de la
fermentación en estado sólido de la caña de azúcar. Patente cubana A23 II/14, A23K 1/14, La
Habana, CU, 1992.
SANTOS, D. C. dos; FARIAS, I.; LIRA, M. de A.; SANTOS, M. V. F. dos; ARRUDA, G. P. de;
COELHO, R. S. B.; DIAS, F. M.; MELO, J. N. de. Manejo e utilização da palma forrageira
(Opuntia e Nopalea) em Pernambuco. Recife: IPA, 2006. 48 p. (IPA. Documentos, 30).
SOARES, A.; SANTOS, D. C. dos; GONDIM, C. A. P. Projeto palma: relatório técnico.
Recife: Datamétrica-FAEP, 2004. 107 p.
STUART, R. La experiência cubana en la utilización de la proteína vegetal unicelular y em la
megasomiento protéico de los resíduos agroindustriales, taller Internacional: manejo de la
proteína em la producción de ganado bovino. La Habana, CU: [s.n.], 2002.
SUASSUNA, P. O Projeto Palma no tropico brasileiro. Biblioteca virtual de tropicologia.
Conferências. 2004. Disponível em: <www.tropicologia.org.br/conferencia/2004.projeto–
palma.html>. Acesso em: 20 abr. 2006.
TABOSA, J. N. Sacharina rústica da cana-de-açúcar e do sorgo sacarino: uma alternativa
alimentar para a pecuária. Recife: Instituto Agronômico de Pernambuco, 2009. 10 p.
Cartilha.
TABOSA, J. N.; ARAÚJO, E. C. de; SILVA, F. G. da; ARAÚJO FILHO, J. T. de; TAVARES
FILHO, J. J.; MONTEIRO, M. C. D.; SANTOS, R. S. M. dos; MESQUITA, F. L. T. de.
Elaboração do farelo enriquecido de palma forrageira e sua utilização na alimentação de
ruminantes. In: ENCONTRO NACIONAL DE PRODUÇÃO DE CAPRINOS E OVINOS, 1.,
2006, Campina Grande. Anais... Campina Grande: ENCAPRI, 2006. p. 207-244.
TABOSA, J. N.; ARCOVERDE, A. A. S.; ARAÚJO, E. C. de. Enriquecimento protéico do
sorgo sacarino através da fermentação em estado sólido destinado a alimentação animal.
In: CONGRESSO NACIONAL DE MILHO E SORGO, 21., 1996, Londrina. Resumos...
Londrina: IAPAR, 1996. p. 172.
TABOSA, J. N.; COLAÇO, W.; REIS, O. V. dos; SIMPLÍCIO, J. B.; CARVALHO, H. W. J. de;
DIAS, F. M. Sorghum genotypes evolution under salinity levels and gamma ray doses.
Revista Brasileira de Milho e Sorgo, Sete Lagoas, v. 6, n. 3, p. 339-350, 2007.
TABOSA, J. N.; SIMPLÍCIO, J. B.; TAVARES FILHO, J. J.; DIAS, F. M.; FARIAS, L.;
SANTOS, M. do C. S. dos; ARAÚJO, E. C. de; SILVA, F. G. da; MONTEIRO, M. C. D.
Enriched forage cactus meal to free ruminants. In: CONGRESSO INTERNACIONAL
SOBRE CONOICIMENTO Y APROVEITAMENTO DEL NOPAL Y OTRAS CACTÁCEAS DE
VALOR ECONÔMICO, 8., 2004, Chapingo. Anais... Chapingo: [s.n.], 2004. 1 CD ROM.
TABOSA, J. N.; TAVARES FILHO, J. J.; ARAÚJO, M. R. A. de; LIRA, M. de A.;
ENCARNAÇÃO, C. R. F. da; BURITY, H. A. de. Water use efficiency in sorghum and corn
cultivar under Field conditions. Sorghum Newsletter, Tucson, v. 30, p. 91-92, 1986.
THIAGO, L. R. L.; VIEIRA, J. M. Cana-de-açúcar: uma alternativa de alimentação para a
seca. Campo Grande: Embrapa Milho e Sorgo, 2002. 4 p. (Embrapa Milho e Sorgo.
Comunicado Técnico, 23).
VALIÑO, E.; ELIAS, A.; ALVAREZ, E.; REGALADO, E.; CORDEIRO, J. Dynamics of growth
of sugar cane microbiote in sacharina production. Cuban Journal of Agricultural Science,
Havana, CU, v. 26, n. 3, p. 299-305, 1992.
VÉRAS, R. M. L.; FERREIRA, M. de A.; CARVALHO, F. F. R. de; VÉRAS, A. S. C. Farelo
de palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill) em substituição ao milho: 1. Digestibilidade
aparente de nutrientes. Revista Brasileira de Zootecnia, Viçosa, v. 31, n. 3, p. 1302-1306,
2002.
VÉRAS, R. M. L.; FERREIRA, M. de A.; CAVALCANTI, C. J. de A.; VÉRAS, A. S. C.;
CARVALHO, F. F. R. de; SANTOS, G. R. A. dos; ALVES, K. S.; SOUTO MAIOR JÚNIOR,
R. J. de. Substituição do milho por farelo de palma forrageira: dietas de ovinos em
crescimento: desempenho. Revista Brasileira de Zootecnia, Viçosa, v. 34, n. 1, p. 249-259,
2005a.
VÉRAS, R. M. L.; FERREIRA, M. de A.; VÉRAS, A. S. C.; CARVALHO, F. F. R. de;
CAVALCANTI, C. V. de A.; SANTOS, G. R. A.; MEDONÇA, S. de S.; SOARES, C. A.;
SAMPAIO, C. B. Substituição do milho por farelo de palma forrageira em dietas para ovinos
em crescimento: consumo e digestibilidade. Revista Brasileira de Zootecnia, Viçosa, v. 34, n.
1, p. 351-350, 2005b.
VIVAS, N. J.; CARVAJAL, J. Saccharina rustica una aplicación biotecnologica para la
alimentación animal. Revista da Facultad de Ciencias Agropecuarias, Bogotá, DC, v. 2, n. 1,
p. 43-48, 2004.
ZANETTI, M. A.; VELLOSO, L.; MELLOTI, L.; RUIZ, R. L.; CARRER, C. da C.
Disponibilidade aparente e balanço de nitrogênio em ovinos consumindo sacharina.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 28, n. 12, p. 1431-1435, 1993.
Capítulo 5
Metodologia analítica para
produtos naturais
Arminda Saconi Messias
Ed Paschoal Carrazzoni

1. Introdução

A magnitude da biodiversidade brasileira não é conhecida com


precisão, estimando-se a existência de mais de 2 milhões de
espécies distintas de plantas, animais e microrganismos. O Brasil
dispõe da maior diversidade vegetal do mundo, cerca de 550 mil
espécies, com apenas 10% catalogadas. As florestas tropicais da
América do Sul, África e Ásia totalizam a megadiversidade global,
mas são as florestas tropicais do Equador, da Colômbia e do Peru
que guardam a maior riqueza do planeta, cerca de 300 espécies
diferentes por hectare, apenas 2% da superfície da Terra. O
interesse econômico de uma planta encontra suporte das indústrias
químicas e farmacêuticas, que empregam matérias-primas vegetais
na formulação de seus produtos; por isso, há demandas por novas
tecnologias para assegurar suas necessidades, levando-se em
consideração a importância do uso responsável e sustentável dos
recursos naturais. O uso de componentes das plantas na área
farmacêutica tem gradualmente aumentado no Brasil. As
substâncias naturais, produzidas pelas espécies vegetais, têm
atraído pesquisadores de diversas áreas. Nos países em desenvol‐
vimento, cerca de dois terços da população utilizam-se de plantas
como fonte de fármacos sem nenhum embasamento científico,
prática essa que pode dar origem a intoxicações agudas ou crônicas
(HARVEY, 2000).
No Brasil isso também é uma realidade, acrescida de um agra‐
vante, em virtude de se ter, em abundância, espécies vegetais
desconhecidas tanto química quanto taxonomicamente. Portanto,
estudos que possibilitem traçar o perfil químico, toxicológico e
farmacológico dessa riqueza biológica são cada vez mais
necessários (BALANDRIN et al., 1985). Óleos essenciais de plantas
geralmente são agentes que apresentam atividade antimicrobiana
contra um grande número de microrganismos, incluindo espécies
resistentes a antibióticos e antifúngicos (SOARES; CURY, 2001). A
composição química de óleos essenciais depende do clima, da
estação do ano, condições geográficas, período de colheita e a
técnica de destilação (SIMÕES et al., 2004). Eles podem apresentar
ação tanto contra bactérias Gram positivas quanto Gram negativas e
ainda leveduras e fungos filamentosos.
O Brasil é muito rico em dados etnobotânicos, o que facilita a
busca de novos ativos de origem vegetal, os quais compreendem
amplo espectro de atividades biológicas. Assim, o caminho para o
uso racional de produtos naturais de origem vegetal
necessariamente passa pelos laboratórios, pois só diante de uma
avaliação fitoquímica e de modelos experimentais é possível uma
avaliação do potencial farmacológico e/ou fitocosmetológico. Isso
viabiliza apontar o grau de segurança e eficácia, uma vez que a
diversidade de substâncias químicas contidas em uma mesma
planta nos alerta para questão do risco x benefício. Ou seja, até que
ponto o fitocomplexo (micromoléculas biologicamente ativas)
apresenta efeitos desejáveis, pois as reações colaterais,
desencadeadas por intolerância e toxicidades, também estão
presentes em produtos naturais, seja por meio de um fitoterápico ou
fitocosmético (LIMA, 2008).

2. Procedimento experimental
Existem dezenas de roteiros utilizados para a separação dos
constituintes de uma mistura em que se desconhece a natureza das
substâncias. O importante a ser observado é que a separação seja
feita de maneira sistematizada.
Quando há necessidade de extrair os constituintes de uma mis‐
tura, é importante que se consiga, pelo menos, separar as diversas
substâncias agrupando-as em uma mesma função orgânica; e é
baseado nesse princípio que se utiliza a marcha química. O material
previamente seco e moído é extraído, normalmente, com três tipos
de solventes: extração com benzeno, clorofórmio e etanol, traba‐
lhando-se, portanto, com três extratos, independentemente.
A palavra extrato está sendo utilizada para indicar o produto de
uma extração com um determinado solvente e cujo solvente foi
evaporado, trata-se, portanto, de um resíduo (geralmente pastoso)
que não mais contém o solvente que foi utilizado para a extração.
Quando se faz referência, por exemplo, a um extrato benzênico,
tratase de um material que foi extraído com benzeno, mas que não
contém benzeno. Quando se trabalha com misturas que não são
solúveis em solventes orgânicos não se deve utilizar o termo
extrato, e sim, solução.
A metodologia a seguir descrita pode ser aplicada a qualquer tipo
de extrato.

2.1. Tratamento com solução de ácido clorídrico – HCl a


3%

O extrato benzênico, alcoólico ou um outro extrato qualquer, é


tratado, em funil de decantação, com uma solução de ácido
clorídrico a 3%.
Como o tratamento com HCl é aquoso, a solução dessa mistura
deve, obrigatoriamente, ser tratada com um solvente imiscível em
água, a fim de que se possa separar as duas fases em funil de
decantação.
Neutraliza-se a fase aquosa com hidróxido de amônio (ou uma
outra base), a fim de liberar a base livre, extraindo-se esta, a seguir,
com um solvente imiscível em água (clorofórmio, por exemplo).

Método 2.1
Colocar o extrato em funil de decantação. Adicionar cerca de
10% do volume do extrato e uma solução de ácido clorídrico a 3%.
Agitar, pelo menos, 5 vezes. Separar as 2 fases (camada aquosa e
extrato) e reservar o extrato. À solução aquosa, adicionar uma
solução de hidróxido de sódio a 3% (ou hidróxido de amônio),
sempre agitando, até ficar com pH 7. Extrair com clorofórmio, em
pequenos volumes, até a solução clorofórmica ficar incolor.
Nesta etapa, há 2 tipos de solução: solução aquosa (desprezar)
e solução clorofórmica. À solução clorofórmica, adicionar 10,0 g de
sulfato de sódio anidro, agitar e filtrar. Evaporar a solução
clorofórmica até secura, sempre observando se ocorre uma
cristalização. Se houver formação de cristais, parar o processo de
evaporação e filtrar, a fim de separar os cristais. Se não cristalizar,
continuar a evaporação, a fim de se obter um resíduo contendo as
bases.

2.2. Tratamento com bicarbonato de sódio – NaHCO3

O bicarbonato de sódio, que é uma base fraca, solubiliza os


ácidos carboxílicos fortes e fenóis fortes.

De idêntica maneira como se procedeu na extração anterior, é


necessário neutralizar o meio a fim de liberar os ácidos carboxílicos
e fenóis de seus sais. Nesse caso, a neutralização se fará com
ácido clorídrico diluído. O restante do esquema de tratamento é
idêntico àquele da extração das bases.
Método 2.2
Colocar o extrato do método 2.1 em funil de decantação. Adicio‐
nar cerca de 10% do volume do extrato e 20,0 mL de uma solução
concentrada de bicarbonato de sódio. Agitar, pelo menos, 5 vezes.
Separar as 2 fases (camada aquosa e extrato) e reservar o extrato.
À solução aquosa, adicionar uma solução de ácido clorídrico a 3%,
até ficar com pH 7. Extrair com clorofórmio, em pequenos volumes,
até a solução clorofórmica ficar incolor. Nesta etapa, há 2 tipos de
solução: solução aquosa (desprezar) e solução clorofórmica. À
solução clorofórmica, adicionar 10,0 g de sulfato de sódio anidro,
agitar e filtrar. Evaporar a solução clorofórmica à secura, sempre
observando se ocorre uma cristalização. Se houver formação de
cristais, parar o processo de evaporação e filtrar, a fim de separar os
cristais. Se não cristalizar, continuar a evaporação, a fim de obter
um resíduo contendo uma mistura de ácidos fortes e fenóis fortes.

2.3. Tratamento com carbonato de sódio – Na2CO3


Como já foram extraídos os ácidos carboxílicos e fenóis fortes,
nesta etapa serão extraídos os compostos da mesma função, mas
de acidez média.

Método 2.3
Colocar o extrato do método 2.2 em funil de decantação. Adicio‐
nar cerca de 10% do volume do extrato e 20,0 mL de uma solução
concentrada de carbonato de sódio. Agitar, pelo menos, 5 vezes.
Separar as 2 fases (camada aquosa e extrato) e reservar o extrato.
À solução aquosa, adicionar uma solução de ácido clorídrico a 3%,
até ficar com pH 7. Extrair com clorofórmio, em pequenos volumes,
até a solução clorofórmica ficar incolor.
Nesta etapa, há 2 tipos de solução: solução aquosa (desprezar)
e solução clorofórmica. À solução clorofórmica, adicionar 10,0 g de
sulfato de sódio anidro, agitar e filtrar. Evaporar a solução
clorofórmica à secura, sempre observando se ocorre uma
cristalização. Se houver formação de cristais, parar o processo de
evaporação e filtrar, a fim de separar os cristais. Se não cristalizar,
continuar a evaporação, a fim de obter um resíduo contendo uma
mistura de ácidos carboxílicos e fenóis.
2.4. Tratamento com hidróxido de sódio – NaOH

Geralmente utilizam-se soluções aquosas entre 3% e 5%. Como


já foram extraídos os ácidos fortes, ácidos carboxílicos de acidez
média, fenóis fortes e médios, restam, para serem extraídos, os
ácidos carboxílicos fracos e lactonas.

Método 2.4
Colocar o extrato do método 2.3 em funil de decantação. Adicio‐
nar cerca de 10% do volume do extrato e 10,0 mL de uma solução
de hidróxido de sódio a 3%. Agitar, pelo menos, 5 vezes. Separar as
2 fases (camada aquosa e extrato) e reservar o extrato. À solução
aquosa, adicionar uma solução de ácido clorídrico a 3%, até ficar
com pH 7. Extrair com clorofórmio, em pequenos volumes, até a
solução clorofórmica ficar incolor.
Nesta etapa, há 2 tipos de solução: solução aquosa (desprezar)
e solução clorofórmica. Na solução clorofórmica, adicionar 10,0 g de
sulfato de sódio anidro, agitar e filtrar. Evaporar a solução
clorofórmica à secura, sempre observando se ocorre uma
cristalização. Se houver formação de cristais, parar o processo de
evaporação e filtrar, a fim de separar os cristais. Se não cristalizar,
continuar a evaporação, a fim de obter um resíduo contendo uma
mistura de ácidos carboxílicos fracos e lactonas.

2.5. Extração de compostos carbonílicos

As substâncias carbonílicas (aldeídicas e cetônicas) podem ser


extraídas transformando-as em substâncias solúveis em água, ou
transformando-as em substâncias que possam ser separadas por
processos físicos.
No caso da marcha química dessa sequência, utiliza-se a reação
de Bertagnini, isto é, tratamento com uma solução saturada de
bissulfito de sódio.

Quando se adiciona a solução saturada de bissulfito de sódio ao


extrato ou a uma solução, duas coisas podem ocorrer:
a) Quando existe uma boa quantidade do composto carbonílico,
ocorre a precipitação do bissulfito do aldeído ou da cetona.
Nesse caso, separa-se o precipitado por filtração, tratando-se, a
seguir, o resíduo, com uma solução de ácido clorídrico diluído
para liberar o composto carbonílico.
Nessa hipótese, duas novas alternativas podem ocorrer: o com‐
posto carbonílico precipita em virtude de sua insolubilidade em
água, e, nesse caso, o composto é separado por filtração; ou o
composto é solúvel em água, necessitando, pois, extrair com um
solvente imiscível (clorofórmio) em funil de decantação. Evapora-se
o solvente à secura, obtendo-se como resíduo o composto
carbonílico puro ou uma mistura de compostos carbonílicos
aldeídicos e cetônicos.
b) Quando existe uma pequena quantidade do composto carbo
nílico, ele fica dissolvido na solução aquosa, sendo necessário
extrair com clorofórmio ou um outro solvente imiscível, em funil
de decantação. Separadas as duas fases, evapora-se a fase
orgânica (clorofórmica, se for o caso) à secura, obtendo-se
como resíduo o(s) composto(s) carbonílico(s).
Método 2.5
Colocar o extrato do método 2.4 em funil de decantação. Adi‐
cionar cerca de 10% do volume do extrato e 10,0 mL de uma
solução concentrada de bissulfito de sódio. Agitar, pelo menos, 5
vezes. Separar as 2 fases (camada aquosa e extrato) e reservar o
extrato. À solução aquosa, adicionar uma solução de ácido clorídrico
a 3%, até ficar com pH 7. Extrair com clorofórmio, em pequenos
volumes, até a solução clorofórmica ficar incolor.
Nesta etapa, há 2 alternativas:
Alternativa 1 – Ocorrendo a formação de cristais, filtrar e des‐
prezar o filtrado. Tratar o resíduo com uma solução de ácido
clorídrico a 3% (o mínimo necessário para cobrir o resíduo), agitar e
extrair com clorofórmio. Desprezar a solução aquosa. Evaporar a
solução clorofórmica à secura, a fim de obter uma mistura de
aldeídos e cetonas.
Alternativa 2 – Extrair com clorofórmio, obtendo-se duas cama‐
das: camada aquosa (desprezar) e camada clorofórmica. Evaporar a
solução clorofórmica à secura ou cristalizar, a fim de obter os
aldeídos e cetonas.
São utilizados também os reagentes de Girard e Sandulesco.
Embora sejam reagentes mais sensíveis e, portanto, com melhor
capacidade de reação, são pouco utilizados em virtude de seu alto
custo, quando comparados com o custo do bissulfito de sódio.
A grande vantagem do uso desses reativos é que formam hidra‐
zonas a frio, solúveis em água acidulada, permitindo, portanto,
retirar da fase orgânica todos os componentes carbonílicos.

Reagente T (trimetilamônioacetilhidrazida)

(CH3)3N+-CH2-CONHNH2

Dos compostos dessa série, o reagente T é o menos utilizado por


ser o mais higroscópico.

Reagente de Girard P (piridilacetilhidrazida)

Reagente de Sandulesco (dimetilaminoacetilhidrazida)

(CH3)2N-CH2-CONHNH2
São compostos facilmente sintetizados.

Seus derivados são solúveis em água porque seus produtos são


sais de amônio.

Além desses reagentes, é bastante utilizado o 2,4-dinitrofenilhi‐


drazina por ser, dentre as hidrazinas, a mais reativa e de mais baixo
custo. O seu emprego usual é na caracterização dos compostos car‐
bonílicos e não como reagente para extração. Na verdade, é um dos
reativos de maior valia para a extração de compostos carbonílicos
de baixo peso molecular (líquido) porque seus derivados são sólidos
e, portanto, de mais fácil manipulação.

2.6. Extração de álcoois

A extração pode ser feita seletivamente com o emprego do


anidrido ftálico permitindo não somente a extração dos álcoois em
geral, mas, dentre eles, separando os álcoois primários, secundários
e terciários.

Originalmente a reação era utilizada para separar os álcoois


(reação de Schotten-Bauer) e não para caracterização.
O processo consiste em adicionar o anidrido ftálico e a piridina, à
temperatura ambiente, ou o anidrido ftálico e benzeno, e fazer o
refluxo. O primeiro sistema é preferível porque a reação se processa
a frio.
Os álcoois secundários reagem mais lentamente do que os
álcoois primários, enquanto os álcoois terciários não reagem com o
anidrido ftálico.
Se for conveniente, os álcoois terciários podem ser extraídos por
reação com o anidrido tetracloroftálico.

Um método pouco usado é o da boratização: todos os álcoois


formam boratos com o ácido bórico. Os produtos são pouco voláteis,
razão pela qual o processo somente deve ser empregado quando o
resto do extrato é volátil (por exemplo, óleos essenciais).
Método 2.6
1) Colocar o extrato do método 2.5 em funil de decantação.
Podem ser utilizadas várias alternativas e, dentre elas:
Alternativa 1 – Adiciona-se uma mistura (1:1) de anidrido ftálico e
piridina. Neste caso a reação se processa a frio, mas tem o inconve‐
niente da piridina ser mais cara.
Alternativa 2 – Adiciona-se anidrido ftálico e benzeno. Refluxar
de 3 a 5 horas. O tempo variará dependendo dos tipos de álcoois.
Nesta etapa há 2 tipos de solução: solução aquosa (desprezar) e
solução clorofórmica (extrato). Evaporar ou cristalizar a solução
clorofórmica, obtendo-se um resíduo que deve ser tratado com uma
solução de hidróxido de sódio a 3%, a quente. Esfriar, extrair com
clorofórmio e evaporar à secura, obtendo-se os álcoois.

2.7. Extração de hidrocarbonetos

Os hidrocarbonetos aromáticos podem ser extraídos por com


plexação com ácido pícrico. Na realidade, não se forma ligação
química entre o ácido pícrico e os hidrocarbonetos aromáticos. O
núcleo pobre em elétrons do ácido pícrico superpõe-se ao composto
aromático rico em elétrons. Os complexos de adição se separam
simplesmente pela adição de solventes adequados.

Os hidrocarbonetos alifáticos podem ser separados por formação


de produtos de inclusão com a ureia.
A análise pelos raios X mostra que a ureia possui um canal
cilíndrico que é preenchido por hidrocarbonetos alifáticos normais. O
complexo pode ser obtido por simples agitação do hidrocarboneto
líquido com a ureia em pó, finamente dividida. O hidrocarboneto
pode ser retirado dissolvendo-se o complexo em água, ou por um
solvente que dissolva o hidrocarboneto deixando a ureia como
resíduo.
A proporção molar da ureia no complexo aumenta com o com‐
primento da cadeia do hidrocarboneto. Assim, n-C7H16 combina com
6 moles de ureia; n-C10H22 com 8,3 moles; n-C16H34 com 12 moles e
n-C28H58 com 21 moles.
A lacuna na ureia tem um diâmetro de 5,3 Å que é a medida justa
para acomodar um ziguezague normal da molécula do hidrocar‐
boneto alifático, mas não uma estrutura que possua qualquer ramifi‐
cação na molécula.
A presença de um grupo funcional terminal não altera o espaço,
razão pela qual a ureia forma, também, compostos de inclusão com
álcoois primários, aldeídos, ácidos carboxílicos e aminas primárias,
desde que suas cadeias não possuam ramificações.
A estabilidade da rede cristalina é o resultado da ligação entre o
hidrogênio e a ureia e as forças de Wan der Waals, e, ainda, entre
as moléculas da ureia e do hidrocarboneto.
Os hidrocarbonetos alifáticos ramificados podem ser separados
com a tioureia, que forma canais com diâmetro de 6,5 Å.
Apesar de afirmado que a ureia não extraia hidrocarbonetos
ramificados, a extração poderá ser feita, caso se considere, por
exemplo, a estrutura do hidrocarboneto aromático representado a
seguir.

Embora a ureia não incorpore o radical fenil, todo o restante da


cadeia será ocluída, razão pela qual o composto será extraído,
desde que o hidrocarboneto possua mais de seis átomos de
carbono na cadeia principal.

Método 2.7
Colocar o extrato do método 2.6, alternativa 2, em funil de
decantação. Adicionar 5,0 g de ureia e 20,0 mL de água deionizada.
Separar em funil de decantação, obtendo-se camada aquosa e
extrato.
Camada aquosa – Destilar, obtendo-se os hidrocarbonetos alifá‐
ticos não ramificados ou com substituintes aromáticos em um dos
carbonos primários.
Extrato – Reservar e adicionar tioureia. Adicionar água
deionizada. Separar em funil de decantação, obtendo-se duas
camadas: a camada aquosa é destilada, obtendo-se os
hidrocarbonetos ramificados.

3. SCREEN

Ao contrário da marcha química, em que se pode trabalhar com


maiores quantidades, nesse processo analisa-se a amostra do
ponto de vista qualitativo, com pequenas quantidades.
Dividir a amostra, devidamente moída, em 2 partes (com 10,00 g
e com 300,00 g).
Amostra com 10,00 g – Colocar em um Erlenmeyer de 250,0 mL
com tampa. Adicionar 50,0 mL de água deionizada e 1,00 mL de
solução de ácido sulfúrico 1 N. Prender a tampa em uma fita de
papel embebida com picrato de sódio, sem deixar tocar no líquido.
Aquecer 2 horas, entre 50 ºC e 60 ºC. O desenvolvimento de cor
indicará a presença de heterosídeos cianogênicos.
Amostra com 300,00 g – Colocar em um Soxhlet de 250,0 mL.
Adicionar uma solução aquosa de etanol a 30%. Extrair até esgota‐
mento, obtendo-se uma solução hidroalcoólica. Diluir a solução
hidroalcoólica obtida com água deionizada na proporção de 1:3.
Dividir em 8 partes:
Tubo 1 contendo aproximadamente 5,0 mL da solução hidroal‐
coólica – Adicionar 3 gotas de solução de cloreto férrico a 5%.
Agitar. Observar variação de cor ou formação de um precipitado,
comparando com um teste em branco. Coloração variável entre azul
e vermelha indica a presença de fenóis (precipitado azul-escuro
indica taninos pirogálicos, e precipitado verde indica taninos
catéquicos).
Tubos 2, 3 e 4 contendo, cada um, 5,0 mL da solução hidroal‐
coólica – Adicionar ao tubo 2 uma solução de ácido clorídrico a 3%
até pH 3. Adicionar ao tubo 3 uma solução de hidróxido de sódio a
3% até pH 8,5. Adicionar ao tubo 4 uma solução de hidróxido de
sódio a 3% até pH 11.
Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 1.

Tabela 1. Resultados obtidos pelo método screen.

pH = 3 pH = 8,5 pH = 11

Antocianinas
Vermelha Lilás Azul-púrpura
Antocianidinas

Flavonas
Flavonóis - - Amarela
Xantonas

Chalconas
Vermelha Vermelho-púrpura
Auronas

Tubo 5 contendo aproximadamente 5,0 mL da solução hidroal‐


coólica – Adicionar uma solução de ácido clorídrico a 3% até pH
entre 1 e 3. Aquecer em lâmpada de álcool durante 2 a 3 minutos. O
desenvolvimento de cor vermelha indica a presença de
leucoantocianidinas. O desenvolvimento de cor pardo-amarelada
indica a presença de catequinas.
Tubo 6 contendo aproximadamente 5,0 mL da solução hidroal‐
coólica – Adicionar uma solução de hidróxido de sódio a 3% até pH
= 11. Aquecer em lâmpada de álcool durante 2 a 3 minutos. O
desenvolvimento de cor vermelho-alaranjada indica a presença de
flavanonas.
Tubo 7 contendo aproximadamente 5,0 mL da solução hidroal‐
coólica – Adicionar ao tubo de ensaio alguns decigramas de
magnésio granulado ou em aparas. Adicionar 0,5 mL de uma
solução de ácido clorídrico a 3%. Aguardar o término da reação (fim
da efervescência). Comparar o aparecimento de cor com o tubo 5;
se a reação for positiva, indica a presença de flavanóis e/ou
flavononas e/ou flavanonóis e/ou xantonas.
Tubo 8 – Umedecer bem a madeira de um palito de fósforo na
solução hidroalcoólica. Evaporar o solvente. Umedecer uma face do
palito com uma solução de ácido clorídrico concentrado, com o
auxílio de um bastão de vidro. Aquecer o palito de 2 a 3 minutos em
chama de álcool, evitando que ele fique tostado. Observar se houve
o aparecimento de coloração no lado acidulado do palito: cor
vermelha ou pardo-amarelada indica a presença de catequinas.
Béquer 1 – Tarar o béquer e colocar 10,0 mL da solução hidro‐
alcoólica. Evaporar à secura e colocar no dessecador. Calcular o
rendimento em relação ao material seco. Observar se houve a
formação de cristais. O resíduo deve conter açúcares, hexitóis, KCl,
entre outros.
Béquer 2 – Colocar 10,0 mL da solução hidroalcoólica e evaporar
até secura. Extrair com clorofórmio (2 a 3 vezes), triturando com o
bastão todo o resíduo. Filtrar para funil fechado contendo bolinhas
de algodão coberto com alguns cristais de sulfato de sódio anidro.
Separar as duas frações (filtrado e resíduo).
No filtrado, adicionar 1,0 mL de anidrido acético e agitar suave‐
mente. Adicionar 3 gotas de uma solução de ácido sulfúrico a 10% e
observar se há rápido desenvolvimento de cor. O desenvolvimento
de coloração azul evanescente seguida para verde permanente
indica a presença de esteroides livres; o desenvolvimento de cor
parda até vermelha indica a presença de triterpenos pentacíclicos.
No resíduo, adicionar 10,0 mL de água deionizada e filtrar para
tubo de ensaio, descartando o novo resíduo. Agitar o filtrado durante
2 minutos. Uma espuma consistente e abundante indica a presença
de saponinas. Adicionar 2,0 mL de ácido clorídrico concentrado e
deixar esfriar. Neutralizar com uma solução de hidróxido de sódio a
10% e agitar. A formação de um precipitado e não formação de
espuma confirma a presença de saponinas. O tratamento hidrolisa
as saponinas, precipitando as agliconas, que podem ser extraídas
com clorofórmio e submetidas ao teste de Liebermann-Buchardt.

4. Extração de aminoácidos livres e aqueles


resultantes da hidrólise das proteínas,
carboidratos e ácidos orgânicos

Amostra com 160,0 g


• Homogeneizar com 600,0 mL de água deionizada. Prensar.
Obtêm-se duas fases:
• Resíduo 1.
• Camada aquosa.
• Centrifugar a camada aquosa (1).
• Adicionar 2,5 vezes o volume de acetona.
• Colocar na geladeira durante, pelo menos, 1 hora.
• Centrifugar.
• Evaporar à secura.
• Dissolver e completar a 5,0 mL com água deionizada.
• Colocar em uma coluna de Dowex 50.
• Passar 500,0 mL de água deionizada.
• Nesta etapa, há uma coluna de Dowex (1) e uma solução
aquosa (2).
• Passar na coluna Dowex 250,00 mL de solução de hidróxido
de amônio 5N.
• Evaporar a solução obtida à secura.
• Dissolver e completar o volume a 2,0 mL com solução de
isopropanol a 10%.
• Desenvolver a cromatografia em sílica gel a fim de se obter os
aminoácidos livres.
• A solução aquosa (2) é colocada em uma coluna de amberlite
IR-45 e tratada com 500,0 mL de água deionizada.
• Evaporar à secura a solução aquosa (2) e fazer a
cromatografia.
• Passar na coluna de amberlite (3) 250,00 mL de uma solução
de ácido clorídrico 2N.
• A solução obtida (4) é evaporada à secura.
• Dissolver o resíduo em 2,0 mL de uma solução de i-propanol a
10%.
• Fazer a cromatografia (sílica gel).
• Serão isolados os ácidos orgânicos.
• Regenerar a coluna de amberlite.
Resíduo 1
Dividir o resíduo 1 em duas partes (resíduo 2 e resíduo 3).
Resíduo 2
• Pesar 2,50 g.
• Colocar em equipamento para fazer um refluxo.
• Adicionar uma mistura de 12,0 mL de solução de ácido
clorídrico 6N + 12,0 mL de solução de ácido fórmico a 85%.
• Fazer o refluxo durante 20 horas.
• Filtrar.
• Evaporar o filtrado à secura.
• Dissolver o resíduo na menor quantidade possível com água
deionizada.
• Evaporar à secura, novamente.
• Dissolver e completar 5,0 mL com água deionizada.
• Passar numa coluna de Dowex 50.
• Passar 250,0 mL de solução de hidróxido de amônio 5N, e
separar a coluna de amberlite para regeneração.
• A solução aquosa obtida é evaporada à secura.
• Dissolver o resíduo com 2,0 mL de uma solução de i-propanol
a 10%.
• Cromatografar (em sílica gel), a fim de obter os aminoácidos
resultantes da hidrólise das proteínas.

5. Regeneração das colunas

5.1. Dowex

Lavar com água deionizada até pH 7. Passar 250,0 mL de


solução de hidróxido de amônio a 10% (ou hidróxido de sódio a 3%);
água deionizada até pH 7; 250,0 mL de uma solução de ácido
clorídrico 2N; água deionizada até pH 7.

5.2. Amberlite IR 45

Passar água deionizada até pH 7; 250,0 mL de solução de


hidróxido de amônio 5 N; água deionizada até pH 7.

5.3. Cromatografia monodimensional para aminoácidos


Existem várias alternativas, e, dentre elas:
Alternativa 1 – Preparar uma solução tampão de pH = 12 (50,00
mL de solução de Na2HPOH 0,067 M + 50,00 mL de solução de
NaOH 0,067 M). Solvente: fenol saturado com a solução tampão.
Tempo: 24 horas. Método: ascendente.
Alternativa 2 – Preparar uma solução tampão (50,00 mL de
solução de H3BO3 0,067 M + 8,55 mL de solução de NaOH 0,067
M). Solvente: m-cresol saturado com a solução tampão. Tempo: 24
horas. Método: ascendente.
Alternativa 3 – Preparar uma solução de n-butanol 5N, na
proporção de 8:2. Método: descendente. Tempo: 72 horas.
Alternativa 4 – Preparar uma solução de n-propanol e hidróxido
do ácido a 8%, na proporção de 8:2. Método: descendente. Tempo:
60 horas. Repetir o mesmo sistema com 120 horas. Repetir o
mesmo sistema durante 8 dias.
Os aminoácidos resultantes de cada uma das quatro alternativas
encontram-se na Tabela 2.

Tabela 2. Aminoácidos resultantes das quatro alternativas.

Alternativa
Aminoácido
1 2 3 4

Ácido aspártico x

Ácido glutâmico x

Alanina x x x

Arginina x

Asparagina

Cisteína

Cistina

Fenilalanina x

Glicina x
Hidroxiprolina x

Histamina x

Histidina x

Isoleucina x

Leucina x

Metionina x x

Prolina x

Serina x

Tirosina x x

Treonina x x

Valina x x

6. Referências

BALANDRIN, M. F.; KLOCKE, J. A.; WURTELE, E. S.; BOLLINGER, W. H. Natural plant


chemicals sources of industrial and medicinal materials. Science, Washington, DC, v. 228, p.
1154, 1985.
HARVEY, A. Strategies for discovering drugs from previously unexplored natural products.
Drug Discovery Today, Amsterdam, NL, v. 5, p. 294, 2000.
LIMA, G. S. F. Biodiversidade vegetal e a busca de produtos naturais. São Paulo: Fatec-
Oswaldo Cruz, 2008. Texto das disciplinas de Fitocosméticos e Controle de Qualidade em
Fitocosméticos - Tecnologia em Cosméticos.
SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.;
PETROVICK, P. R. (Org.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5. ed. rev. ampl.
Porto Alegre: UFSC, 2004. 1102 p.
SOARES, M. M. S. R.; CURY, A. E. In vitro activity of antifungal and antiseptic agents
against dermatophyte isolates from patients with tinea pedis. Brazilian Journal of
Microbiology, São Paulo, v. 32, p. 130-134, 2001.
Capítulo 6
Caracterização da quitosana e sua
aplicação na nanotecnologia
Thatiana Montenegro Stamford Arnaud
Thayza Christina Montenegro Stamford

1. Introdução

Quitosana é um heteropolímero natural, composto por unidades


β-1,4 D-glucosamina ligadas a resíduos de N-acetilglucosamina,
podendo ser encontrado na natureza, na parede celular de alguns
fungos, principalmente da classe Zygomycetes e em alguns
moluscos (CHATTERJEE et al., 2005; SILVA et al., 2006;
STAMFORD et al., 2007). A quitosana é obtida na indústria pela
hidrólise química da quitina (AMORIM et al., 2006; FRANCO et al.,
2005; OKAWA et al., 2003; POCHANAVANICH; SUNTORNSUK,
2002). Quitina é um polímero natural, insolúvel, linear que apresenta
o mesmo tipo de unidade monomérica β-1,4 N-acetilglucosamina, e,
com exceção da celulose, é o polissacarídeo mais abundante e
largamente distribuído na natureza (CANELLA; GARCIA, 2001). A
quitina é encontrada no exoesqueleto dos crustáceos, insetos,
artrópodes e na parede celular de fungos (CAMPOS-TAKAKI, 2005;
STAMFORD et al., 2008).
Existem vários derivados da quitosana, os quais podem se dife‐
renciar pelo grau de desacetilação, disposição dos grupos N-acetil
residuais na cadeia do polímero e pela reação específica do grupo -
NH2 no carbono 2 (C2) ou inespecífica com o grupo -OH nos
carbonos de posição 3 ou 6 (C3 ou C6) da quitosana com outros
grupos funcionais, gerando derivados tais como: O- ou N-
carboximetilquitosana, quitosana-6-O-Sulfato, trimetilquitosana
amonio, entre outros. Essas reações causam diferenças na
quitosana quanto a sua solubilidade, estabilidade térmica,
reatividade com outras substâncias, especificidade quanto ao sítio
de ligação, proporcionando diversas aplicações biológicas da
quitosana (RINAUDO, 2006; STAMFORD et al., 2007).
A quitosana é um polímero caracterizado por propriedades
específicas que revelam seu potencial para inúmeras aplicações em
vários produtos comerciais. As principais propriedades desse
polissacarídeo são: bioatividade, biodegradabilidade,
biocompatibilidade, reatividade do grupo amino deacetilado,
permeabilidade seletiva, ação polieletrolítica, habilidade em formar
gel e filme, habilidade de quelação e capacidade adsortiva
(SYNOWIECKI; AL-KHATEEB, 2003; THARANATHAN; KITTUR,
2003).

2. Aplicações da quitosana

No pH biológico, a quitosana apresenta-se como um policátion.


Em meio ácido, os grupos amino da quitosana captam íons
hidrogênio do meio, resultando uma carga global positiva ao
polímero, o que permite a sua interação com moléculas carregadas
negativamente, tais como gorduras, tecidos animais ou vegetais,
membrana celular, entre outras formas (HÖRNER et al., 1997;
PAWTLOWSKA, 1997). As possibilidades de aplicações são ainda
ampliadas pelo fato de que a quitosana pode ser preparada em
diferentes formas, como soluções de viscosidade controlada, géis,
filmes e membranas, microesferas e nanopartículas (CAMPANA
FILHO et al., 2007; JAYAKUMAR et al., 2007; SEZER et al., 2007;
WONGPANIT et al., 2007).
A quitosana vem sendo extensivamente estudada em razão das
suas propriedades peculiares que lhe conferem um aproveitamento
bastante versátil, por exemplo, carreador de fármacos de liberação
controlada e DNA (KIM et al., 2004; PARK et al., 2004), regeneração
de tecidos epiteliais (CHO et al., 1999; MAIA et al., 2006; ÖLMEZ et
al., 2007), confecção de membranas artificiais (COSTA et al., 2006),
promotor de osteogênese (MURUGAN; RAMAKRISHNA, 2004),
antibacteriano (CAO; SUN, 2008; CHUNG et al., 2004; IKINCI et al.,
2002; YADAV; BHISE, 2004), coadjuvante da higiene oral (SANO et
al., 2002, 2003), absorção de gordura e redução do colesterol sérico
(GADES; STERN, 2005), componente de cosméticos (KOHEI;
MAKI, 2006), remoção e recuperação de diferentes resíduos
(VIVEK; TORRES, 2000), biotransformação e detecção de
pesticidas (DU et al., 2007; YOSHIZUKA et al., 2000), recobrimento
de sementes na agricultura (VELÁSQUEZ, 2003), degradação de
corantes, aminoácidos e proteínas (BORDERÍAS et al., 2005),
agente de floculação no tratamento de efluentes aquosos
(SYNOWIECKI; AL-KHATEEB, 2003; THARANATHAN; KITTUR,
2003).
Embora a aplicação da quitosana já esteja bem estabelecida, as
pesquisas em novas aplicações têm aumentado exponencialmente
em diversas áreas, como na agricultura, indústria de alimentos e
meio ambiente (STAMFORD et al., 2008). Contudo, a aplicabilidade
da quitosana está diretamente relacionada com suas características
físicas e químicas, uma vez que fontes de obtenção distintas,
processos diferentes de extração e purificação causam alterações
no grau de desacetilação, peso molecular, estabilidade térmica e
grau de cristalinidade.

3. Caracterização da quitosana

Diversas técnicas são realizadas para caracterizar a quitosana. A


caracterização estrutural desse polímero pode ser realizada por
espectroscopia vibracional na região do infravermelho, e o grau de
umidade e a análise térmica são determinados por termogravimetria
(TGA) e calorimetria diferencial exploratória (DSC),
respectivamente. A cristalinidade da amostra pode ser obtida pela
difração de raio-X; no entanto, as propriedades físico-químicas da
quitosana estão relacionadas principalmente ao seu grau de
desacetilação e a massa molar média.
O grau de desacetilação da quitosana deve ser determinado por
diferentes técnicas: espectroscopia vibracional na região do infraver‐
melho, ressonância magnética nuclear (RMN 1H), análise elementar
e titulação condutimétrica. A determinação da massa molar média
de polímeros pode ser realizada por cromatografia de permeação
em gel (GPC) ou por medidas de viscosidades (STAMFORD, 2008).

3.1. Características estruturais: espectroscopia


vibracional na região do infravermelho

O espectro no infravermelho é obtido em espectrofotômetro na


região entre 4.000 cm-1 e 400 cm-1. Aproximadamente 1,5 mg de
quitosana é seca em estufa a vácuo durante 15 horas a 60 °C. Em
seguida, é adicionado 100 mg de KBr e a mistura homogeneizada
em almofariz de ágata. A pastilha é preparada e deixada na estufa a
vácuo a 110 °C durante 20 horas. Por tanto, o espectro do pó da
quitosana é obtido utilizando pastilha de KBr como suporte.
A espectroscopia na região do infravermelho permite observar e
classificar algumas bandas relativas a vibrações características dos
grupos funcionais presentes na estrutura da quitosana como pode
ser observado na Tabela 1.

Tabela 1. Atribuição das bandas do infravermelho para a quitosana.

Número de onda (cm-1) Tentativa de atribuições

800 a 1.200 Anéis piranosídicos

1.374 (-CH2 – OH) νC-O

1.428 (amida) νC-N


1.607 (amida II) δNH

1.655 (amida I) νC = O

2.888 ν C-H

3.450 ν O-H

3.450 (amina) δNH

O espectro da quitosana mostra um pico largo em torno de 3.450


cm , na região correspondente ao estiramento OH, o qual pode
-1

aparecer sobreposto à banda de deformação axial NH do grupo


amina. O pico próximo a 2.888 cm-1 representa o estiramento C-H
alifático, e o pico em torno de 1.655 cm-1 corresponde à banda de
deformação axial C = O do grupo amida I da quitina, indicando que
a amostra não está totalmente desacetilada. O modo vibracional da
deformação angular da ligação N-H (amida II) deve aparecer como
um ombro próximo a 1.607 cm-1. O pico em 1.374 cm-1 representa o
estiramento C-O do grupo alcoólico primário (-CH2 – OH). A
deformação axial de C-N da amida aparece em torno de 1.428 cm-1.
E a banda intensa entre 800 cm-1 e 1.200 cm-1 está relacionada aos
anéis piranosídicos. Podem ser observadas pequenas oscilações
nos espectros de diferentes tipos de quitosanas, em virtude das
diversas fontes de obtenção desse polímero e das variações dos
graus de desacetilação.

3.2. Grau de desacetilação

O grau de desacetilação é considerado um dos principais


parâmetros na caracterização da quitina e da quitosana. Ele é
definido como sendo o número de grupos amina em relação ao
número de grupos amida da cadeia polimérica.
Vários métodos já foram propostos para a sua determinação:
espectroscopia no infravermelho, RMN 1H, análise elementar e
titulações condutimétricas. Entretanto, existe certa discrepância
entre os valores encontrados pelas diferentes técnicas, por isso até
hoje ainda busca-se o método mais adequado para sua
determinação.

3.2.1. Espectroscopia vibracional na região do infravermelho


A espectroscopia no infravermelho é uma técnica que, além de
caracterizar a estrutura do polímero, também é utilizada para
determinar o grau de desacetilação da quitosana por meio da
relação entre as absorbâncias nos números de ondas de 1.655 cm-1
e 3.450 cm-1. Para medir a absorbância em um espectro de
transmitância versus número de onda é preciso: 1) traçar as linhas
de base; 2) calcular a diferença de transmitância; 3) converter os
valores de transmitância para absorbância (A = logT1/T2); e 4)
aplicar os valores nas equações propostas por Domszy e Roberts
(1985) (equação 1) e/ou por Baxter et al. (1992) (equação 2) que
utilizam linhas de base diferentes para calcular a absorbância no
número de onda 1.655 cm-1. No entanto, as duas equações
apresentam um mesmo objetivo: calcular o grau de desacetilação da
quitosana relacionando os picos característicos do grupo amina e
acetamida do heteropolímero.

em que
A1.655 é a absorbância no número de onda 1.655 cm-1 obtida
utilizando a linha de base (a) proposta por Domszy e Roberts
(1985). Essa banda de absorção é característica da vibração entre
os átomos de carbono e oxigênio (VC = O) do grupo amida I da quitina
residual presente na quitosana. A 3.450 é a banda de absorção no
número de onda 3.450 cm-1 correspondente ao estiramento OH e a
deformação axial NH do grupo amina presente na quitosana. O
número 1,33 equivale ao valor de A1.655/A3.450 encontrado na quitina
pura. Pode-se visualizar nas Figuras 1 e 2 o traçado das diferentes
linhas de base.

Figura 1. Traçado da linha de base (a) em um espectro da quitosana no infravermelho.

em que
A 1.655 é a absorbância no número de onda 1.655 cm-1 obtido
utilizando a linha de base (b) proposta por Baxter et al. (1992), e A
3.450 é a absorbância medida no número de onda 3.450 cm
-1

empregando a mesma linha de base usada por Domszy e Roberts


(1985). O valor de (A 1.655/A 3.450) para a quitina pura encontrado por
Baxter et al. (1992) quando traçada a linha de base (b) é
aproximadamente 0,87. Para introduzir esse número na sua
equação em vez de multiplicar (A1.655/A3.450) por 100 e dividir por
0,87, os autores decidiram simplificar a fórmula multiplicando
(A1.655/A3.450) por 115.

Figura 2. Traçado da linha de base (b) em um espectro da quitosana no infravermelho.

3.2.2. Ressonância magnética nuclear


O espectro de RMN 1H é obtido a partir de um procedimento
descrito por Signini et al. (2000). A solução de quitosana é
preparada pela dissolução de 10 mg de quitosana em 1 mL de
solução de HCl/D2O 1% (v/v), durante 24 horas, formando uma
solução viscosa. Uma alíquota dessa solução é colocada em tubo
de 5 mm de diâmetro para a análise a 50 °C, com tempo de
relaxação de 6 segundos e pulso de 90º.
A ressonância magnética nuclear de 1H é uma técnica que
permite a quantificação de alto grau de desacetilação. A preparação
da amostra é simples por diversos motivos, como: não há
necessidade de preparar curva analítica; utiliza uma pequena
quantidade de substância (mg) e não precisa purificá-la (caso os
picos de impurezas não tenham o mesmo deslocamento químico
dos picos relevantes da quitosana).
Segundo Lavertu et al. (2003), a determinação do grau de
desacetilação por RMN 1H é feita utilizando uma relação entre os
picos referentes aos prótons do grupo acetoamido da quitina e os
outros prótons, exceto o próton do carbono anomérico (C1) da
quitosana/quitina (Figura 3).

Figura 3. Esquema da quitina/quitosana com a numeração dos prótons que aparecem no


RMN 1H.
Fonte: Anjos (2005).

Nessa técnica a amostra de quitosana é dissolvida em solução


de ácido clorídrico deuterado (solução viscosa). É necessário que a
medida seja realizada a 50 ºC para impedir interações
intermoleculares e intramoleculares. Essas interações modificam o
tempo de relaxação responsável pela integração dos picos
influenciando o valor do grau de desacetilação. Também é
necessário que as medidas sejam realizadas rapidamente, de modo
a minimizar problemas causados pela hidrólise da quitosana, ou
seja, a quebra das ligações glicosídicas que formam o biopolímero.
A Figura 4 mostra os picos referentes a cada próton caracterís‐
ticos da estrutura da quitosana. Os picos podem variar de acordo
com os diferentes tipos de quitosana.

Figura 4. Espectro de RMN 1H de uma quitosana comercial.

O grau de desacetilação é calculado pela equação 3 proposta


por Hirai et al. (1991), que utiliza os sinais dos prótons H2, H3, H4, H5,
H6, H6’ (H2-6) de ambos os monômeros e o pico referente aos núcleos
do hidrogênio do grupo acetoamido (Hac).

O grau de desacetilação também é calculado pela equação 4


proposta por Signini et al. (2000), que utiliza a área do pico na
região de 2 ppm atribuído aos núcleos de hidrogênio do grupo
acetoamido (Hac) e a área do pico em 3,4 ppm referente ao núcleo
de hidrogênio na posição 2 do anel glicopiranosídico (H2).

A equação 4 só leva em conta os picos do grupo acetoamido


(H ) e dos hidrogênios do carbono na posição 2 do anel glicopirano‐
ac

sídico (H2). A escolha desses dois picos se deve ao fato de que as


áreas relativas a núcleos dos grupos metila presentes no grupo
acetoamido e ao núcleo na posição 2 do anel glicopiranosídico
estão relativamente livres das influências do pico de HOD.
A espectroscopia de RMN e a vibracional no IV estão relaciona‐
das respectivamente com o envolvimento de núcleos e elétrons no
processo de absorção de energia, o que torna essas técnicas
capazes de fornecer informações precisas. Contudo, é preciso saber
usá-las corretamente a fim de se obter os dados desejados. Por
isso, devem-se usar duas equações de cada técnica para
determinar o GD da quitosana e, posteriormente, poder verificar a
mais adequada para a amostra estudada. Como a substância
analisada é um polímero, vale salientar que a RMN é uma técnica
bastante utilizada para analisar polímeros e determinar a pureza de
amostras, o que a torna um método confiável.

3.2.3. Análise elementar


A análise elementar é outra ferramenta que pode ser utilizada
para a determinação do grau de desacetilação da quitosana. Apesar
de ser um método preciso, deve ser usado com muita cautela em
virtude dos diferentes teores de hidratação, que variam de acordo
com as condições de armazenamento e tratamento prévio da
amostra. A equação 5 é proposta por Kassai et al. (2000) para
determinar o grau de desacetilação da quitosana tendo em vista a
relação entre carbono e nitrogênio a qual pode ser obtida pela
análise elementar.
em que
C/N é a razão de carbono/nitrogênio. Essa razão, de acordo com
Kassai et al. (2000), varia de 5,145 em quitosana completamente
desacetilada (monômero da quitosana) a 6,816 em quitina
inteiramente acetilada (monômero da quitina).
Esse método só apresenta resultados precisos para a quitosana
que não tem resíduos de proteínas; caso contrário, é necessário
purificar o respectivo polímero.

3.2.4. Titulação condutimétrica


A determinação do grau de desacetilação da quitosana por
titulação condutimétrica é um método indireto bastante utilizado nas
indústrias por ser uma técnica simples e de baixo custo.
Para preparar a solução de quitosana é preciso dissolver 102 mg
do polímero em 20 mL de ácido clorídrico 0,05 M sob agitação
constante por 24 horas. Paralelamente deve ser feita a
padronização da solução de hidróxido de sódio, visto que essa
base, tanto no estado sólido como em solução, absorve
rapidamente CO2 da atmosfera produzindo carbonato de sódio. A
solução padrão de NaOH 0,17 M é preparada a partir do ácido
biftalato de potássio por ser a substância primária frequentemente
utilizada na aferição de soluções básicas.
A solução de quitosana é titulada com NaOH, e a condutância é
medida em µS/cm a cada volume de base acrescentada. Dessa
forma, é traçada a curva de titulação condutimétrica do polímero
(condutividade versus volume de NaOH). O primeiro ramo da curva
representa a neutralização do ácido presente, o segundo
corresponde à neutralização de prótons dos grupos amino da
quitosana, e o terceiro conjunto de pontos refere-se ao excesso de
base, após o ponto de equivalência.
Para estimar o grau de desacetilação da quitosana por meio da
titulação condutimétrica deve-se usar a seguinte equação.

em que
GD é o grau médio de desacetilação; V1 é o volume de base usado
para a neutralização de HCl em excesso (mL); V2 – V1 é o volume
de base usado para a neutralização dos grupos ácidos de quitosana
(mL); [base] é a concentração da base usada; e m é a massa da
amostra de quitosana.

3.3. Grau de umidade e análise térmica

3.3.1. Análise termogravimétrica (TGA)


A análise térmica é realizada para verificar as perdas de massa
com o aumento da temperatura. Essa técnica é utilizada para carac‐
terizar a estabilidade térmica do material. A medida termogravi‐
métrica é efetuada usando suporte de platina e uma massa de
aproximadamente 9 mg de quitosana. A taxa de aquecimento é de
10 ºC/min, dentro da faixa de 30 ºC a 400 ºC, sob fluxo de nitrogênio
de 50 mL/min.
Os polissacarídeos geralmente têm forte afinidade por água, e no
estado sólido essas macromoléculas têm uma estrutura
desordenada que é facilmente hidratada. Assim, a análise
termogravimétrica (TGA) da quitosana apresenta uma primeira
perda de massa em torno de 90 ºC referente à desidratação da
quitosana e uma segunda perda de massa que começa em
aproximadamente 260 ºC, que é referente ao início da
termodecomposição do polímero, com a geração de um resíduo
carbonizado.
3.3.2. Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
O experimento de calorimetria exploratória diferencial (DSC) é
realizado para identificar os eventos endotérmicos e exotérmicos
que ocorrem durante o aquecimento da amostra, ocorrendo ou não
perda de massa. A medida de DSC é efetuada usando uma massa
de aproximadamente 9 mg de quitosana e uma taxa de aquecimento
é de 10 ºC/min, dentro da faixa de 30 ºC a 400 ºC, sob fluxo de
nitrogênio de 50 mL/min.
A curva da calorimetria exploratória diferencial da quitosana deve
apresentar dois picos: o primeiro é um evento térmico característico
de um pico largo endotérmico entre 25 ºC e 175 ºC, correspondente
à perda de água de hidratação, e o segundo evento térmico
representa um pico exotérmico aproximadamente entre 260 ºC e
325 ºC, que é relacionado à decomposição da quitosana. Os dois
processos devem ser coerentes com os eventos observados nas
curvas TGA. Os valores desses eventos térmicos podem apresentar
pequenas variações dependendo da quitosana analisada.

3.4. Cristalinidade

3.4.1. Difração de raio X


A difração de raio X é uma técnica usada para conhecer o interior
dos sólidos no que diz respeito ao arranjo dos átomos, ao
comprimento e ângulo de ligações. Na técnica de difração de pó, um
feixe de raio X monocromático de Cu-Ka é direcionado para a
amostra (λ = 1,5406 Aº), espalhada em um suporte, e a intensidade
de difração é medida quando o detector é movido em diferentes
ângulos (faixa de varredura entre 3º e 80º com taxa de 0,02º/min). A
equação central para analisar os resultados de um experimento de
difração de raio X é a equação 7 de Bragg
que relaciona o ângulo (q) no qual a interferência construtiva ocorre
com o espaçamento (d) das camadas de átomos na amostra para o
raio X de determinado número de onda (λ). Observa-se interferência
construtiva principalmente em 2q = 9º e 20º que correspondem a
dois picos característicos da quitosana.
O índice de cristalinidade, ou grau de ordenamento, da quitosana
é calculado pela equação proposta por Focher et al. (1990) descrita
a seguir.

em que

ICR é o índice de cristalinidade, e IC e IA são as intensidades de


difrações relativas às regiões cristalinas (2q≈20º) e amorfas
(2q≈9º), respectivamente.
Jaworska et al. (2003) verificaram, por difração de raio X, a
cristalinidade de diversas quitosanas e observaram que o índice de
cristalinidade sofre alteração dependendo do tipo de quitosana e do
método empregado para a sua obtenção. Esses pesquisadores
encontraram para alguns desses métodos a seguinte ordem
crescente do índice de cristalinidade: fungo < molusco < crustáceo,
e para outros métodos de obtenção da quitosana a ordem foi: fungo
< crustáceo < molusco. Esses resultados também demonstram que
a cristalinidade apresenta uma relação com o grau de desacetilação
da quitosana.
De uma maneira geral, verifica-se que a quitosana possui menor
grau de cristalinidade do que a quitina, e, conforme aumenta o grau
de desacetilação, diminui o grau de cristalinidade. A diminuição do
grau de cristalinidade durante a desacetilação da quitina não está
associada apenas à remoção dos grupos acetil na quitosana, mas
também às drásticas condições de processamento da quitina e da
quitosana (MONTEIRO JÚNIOR, 1999; ORNUM, 1992). Portanto, o
resultado esperado para a cristalinidade do biopolímero estudado
deve ser coerente com os demais resultados obtidos para o grau de
desacetilação, visto que o grau de ordenamento da quitosana deve
ser característico de um material amorfo.

3.5. Massa molar média

As propriedades físico-químicas da quitosana dependem não


somente do grau de desacetilação, mas também da sua massa
molar média. As determinações da massa molar média de polímeros
podem ser realizadas por cromatografia de permeação em gel
(GPC) ou por medidas de viscosidades.
A cromatografia de permeação em gel é o método mais utilizado
para a determinação da distribuição da massa molar de polímeros
(STEVENS, 1999). Uma coluna cromatográfica separa as frações
cujas massas molares apresentam pequena variação, mas no caso
da quitosana tem sido discutido o efeito da natureza química dos
padrões de calibração sobre a determinação de massa molar por
GPC. Alguns trabalhos mostram melhores resultados por meio de
padrões de calibração da própria quitosana (TSAIH; CHEN, 1999);
todavia, a maior dificuldade é a inexistência de amostras comerciais.

3.5.1. Medidas de viscosidade


O peso molecular da quitosana pode ser determinado por visco‐
sidade, segundo a metodologia proposta por Santos et al. (2003). A
medida de viscosidade é realizada utilizando um capilar de vidro tipo
Cannon-Fenske termostatizado a 25 ºC ± 0,01 ºC. Para determinar a
viscosidade intrínseca [h], é necessário preparar cinco soluções de
quitosana, com concentrações diferentes, utilizando o tampão de
ácido acético como solvente para obter os respectivos tempos de
escoamento. Devem-se realizar quatro ou cinco medidas de cada
amostra e em seguida calcular a média.
A viscosidade de soluções poliméricas é a medida do volume
hidrodinâmico (tamanho ou extensão no espaço) do polímero em
solução. A viscosidade de soluções poliméricas diluídas é
consideravelmente maior que a do solvente puro, ou de soluções
diluídas de pequenas moléculas. Isso se deve à grande diferença de
tamanho entre as moléculas do polímero e a do solvente. A
viscosidade aumenta à medida que as dimensões das moléculas
poliméricas em solução aumentam. Assim, a viscosidade polimérica
é o resultado da comparação entre o tempo de escoamento do
solvente em um capilar e o tempo de escoamento da solução
polimérica a determinada concentração e temperatura. Embora seja
um método não absoluto, a medida de viscosidade pode ser
utilizada para estimar/determinar a massa molar média de
polímeros.
A razão do tempo de escoamento da solução do polímero pelo
tempo de escoamento da solução do solvente é chamada de visco‐
sidade relativa. A viscosidade específica é o aumento fracionário em
viscosidade e é calculada aplicando a média dos tempos de escoa‐
mento na equação abaixo.

em que

hesp = viscosidade específica da amostra; t = tempo de escoamento


da solução no viscosímetro; to = tempo de escoamento do solvente
puro no viscosímetro.
Viscosidade reduzida é a viscosidade específica dividida pela
concentração e tem como dimensão o inverso da concentração.
em que

hred = viscosidade reduzida da amostra; C = concentração em


gramas de polímero em 100 mL de solução.
A viscosidade intrínseca é encontrada pela extrapolação do
gráfico de viscosidade reduzida versus concentração à diluição
infinita, com base na equação 11 de Huggins (1942) mostrada
abaixo.

A viscosidade intrínseca de uma solução polimérica está relacio‐


nada com a massa molar viscosimétrica média por meio da equação
de Mark-Houving (equação 12). O valor das constantes K e a
depende do polímero, do solvente e da temperatura. Os valores
propostos por Rinaudo et al. (1993) quando o polímero é a
quitosana e o solvente é o ácido acético (na temperatura ambiente)
é de 0,076 e 0,76 para K e a, respectivamente.

A massa molar média da quitosana está entre 1 x 104 g/mol a 5 x


105 g/mol dependendo do meio de obtenção do biopolímero
(ANJOS, 2005; SANTOS et al., 2003).

4. Aplicação da quitosana na nanotecnologia


Partículas maiores que 1 µm são denominadas micropartículas.
A nanotecnologia estende a ciência de materiais para o domínio de
partículas e interfaces com dimensões extremamente pequenas,
menores que 1 µm. As nanopartículas apresentam uma grande área
superficial e, com grande freqüência, exibem propriedades
mecânicas, ópticas, magnéticas ou químicas distintas de partículas
e superfícies macroscópicas. O aproveitamento dessas
propriedades em aplicações tecnológicas forma a base da
nanotecnologia de materiais (QUINA, 2004).
A ciência moderna vem demonstrando grande interesse em
pesquisas com materiais nanoestruturados, uma vez que possuem
alto potencial de aplicabilidade em várias áreas científicas e
tecnológicas, como computação e tecnologia da informação,
biotecnologia, agricultura, meio ambiente, ciências da saúde,
medicina, materiais manufaturados, indústrias farmacêutica e
química (AZEVEDO, 2002; MONTEIRO et al., 1999; PUSZTAY et
al., 2002).
Quando aplicada nas ciências da vida, a nanotecnologia passa a
ser denominada de nanobiotecnologia. A nanobiotecnologia envolve
aspectos multidisciplinares de biologia, medicina, física, química e
engenharia. Apresenta aplicações em várias linhas de pesquisas,
como a genômica, robótica, descoberta de novas drogas e
processos químicos (AZEVEDO et al., 2003; LACAVA; MORAIS,
2004).
Dentro da nanobiotecnologia há um corrente interesse na pre‐
paração de materiais nanoestruturados para serem utilizados em
sistemas de liberação controlada de fármacos, frequentemente des‐
critos como drug delivery systems. Tais sistemas representam novas
estratégias para veiculação de ingredientes ativos, os quais incluem
aplicações importantes na ciência de polímeros e em soluções de
surfactantes, no preparo de espécies coloidais, administração de
vacinas, além da utilização de técnicas transdérmicas (JAIN et al.,
2002; YANO et al., 2002).
4.1. Liberação controlada de fármacos

A tecnologia de liberação controlada de fármacos representa um


desenvolvimento relativamente novo. Esse sistema oferece
inúmeras vantagens quando comparado aos sistemas
convencionais de administração de fármacos, como maior eficácia,
com liberação progressiva e controlada da substância ativa, a partir
da degradação da matriz; diminuição da toxicidade e maior tempo
de permanência na circulação; natureza e composição variadas dos
veículos; administração segura e conveniente; direcionamento a
alvos específicos, sem imobilização significativa das espécies
bioativas; podem incorporar substâncias hidrofílicas ou lipofilicas
(AZEVEDO, 2002; DUMITRIU, 2002; KAYSER et al., 2005).
Os sistemas de liberação controlada de fármacos usando nano‐
tecnologia têm sido desenvolvidos visando a inúmeras aplicações
terapêuticas, sendo planejados, principalmente, para administração
parenteral, oral ou oftálmica. Uma das áreas mais promissoras na
utilização das nanopartículas é a vetorização de fármacos
anticancerígenos e de antibióticos, principalmente pela
administração parenteral, almejando uma distribuição mais seletiva
dos mesmos e, assim, um aumento do índice terapêutico (BENITA,
1998; PINTO-ALPHANDARY et al., 2000; SCHAFFAZICK et al.,
2003).
Com relação à administração oral de nanopartículas, as pesqui‐
sas visam especialmente à diminuição dos efeitos colaterais de
fármacos degradáveis no trato gastrintestinal e à proteção da
mucosa do trato gastrintestinal (BECK et al., 2004; GUTERRES et
al., 2001; RAFFIN et al., 2003). Outro grande interesse nas
nanopartículas é a sua administração oftálmica, visando ao controle
da liberação, ao aumento da biodisponibilidade ocular e/ou à
diminuição dos efeitos colaterais em razão da absorção sistêmica de
certos fármacos (ALLÉMANN et al., 1993; JUNG et al., 2000;
MIYAZAKI et al., 2003).
O termo nanopartículas quando aplicado à liberação controlada
de fármacos é amplo e refere-se a dois tipos de estruturas
diferentes: nanoesferas e nanocápsulas. Denominam-se esferas
aqueles sistemas em que o fármaco encontra-se homogeneamente
disperso ou solubilizado no interior da matriz polimérica (sistema
monolítico). Nanocápsula constitui sistemas em que é possível se
identificar um núcleo diferenciado, que pode ser sólido ou líquido
(sistema reservatório). Ambos os métodos de obtenção são
semelhantes, com diferenças no mecanismo de polimerização
(AZEVEDO, 2002; MELO; PIMENTA, 2004).
Os métodos de preparação de nanopartículas mais destacados e
utilizados são os mecânicos e os físico-químicos. Independente do
método de formulação, as nanopartículas devem ser biodegradavéis
e biocompatíveis, o que contribui para diminuição dos efeitos colate‐
rais (AZEVEDO, 2002; OLIVEIRA et al., 2004; SOPPIMATH et al.,
2001).

4.2. Sistema de liberação de fármaco polimérico

Os sistemas de liberação controlada do tipo polimérico são


largamente utilizados, pois permitem uma liberação lenta e gradual
do ingrediente ativo, assim como podem possibilitar o
direcionamento a alvos específicos do organismo, como sítios de
inflamação ou tumor. Esse sistema utiliza polímeros naturais como
colágeno, celulose e quitosana ou sintéticos: polietileno,
poliacrilamidas, entre outros (MIDDLETON; TIPTON, 1998).
O sistema de liberação polimérico é classificado de acordo com o
controle da liberação do princípio ativo em dois tipos: controlado por
difusão e controlado quimicamente. Os sistemas controlados por
difusão são os mais comuns e são conhecidos dois tipos. No primei‐
ro, o agente bioativo (fármaco) forma uma partícula interna (caroço)
envolvida por uma barreira de difusão inerte. Esses sistemas
incluem membranas, cápsulas, nanocápsulas, lipossomas e fibras
ocas. O segundo tipo é um sólido monolítico no qual o agente ativo
é disperso ou dissolvido em um polímero inerte, e a difusão do
fármaco é a etapa limitante, sendo a taxa de liberação dependente
da escolha do polímero (AZEVEDO, 2002; PEPPES, 1987).
Os sistemas controlados quimicamente fazem uso da bioerosão
de polímeros, resultando na absorção dos resíduos pelo organismo.
A droga também pode estar ligada covalentemente ao polímero e
ser liberada por cisão da ligação por ação da água ou de enzimas.
Nos sistemas controlados por solvente, o agente ativo está
dissolvido ou disperso na matriz polimérica e não se difunde pela
matriz. Para que ocorra a difusão, o polímero deve se intumescer,
abaixando a temperatura de transição vítrea (Tg) e tornando o
material mais plástico. Desse modo, o fármaco contido na matriz
pode se difundir para o meio externo (BRANNON-PEPPAS;
BLANCHETTE, 2004).

4.3. Nanopartículas de quitosana

Várias pesquisas vêm sendo realizadas com nanopartículas de


polímeros sintéticos biodegradáveis, como o poli-e-copralactoneo
(PCL), polilactideo (PLA) e seus copolímeros, sendo biocompatíveis
e biodegradáveis. Contudo essas nanopartículas não são aplicáveis
para drogas hidrofílicas, em razão da sua alta hidrofobicidade. Para
suprir essa limitação, nanopartículas hidrofílicas têm sido
formuladas a partir do poliéster modificado, polietileno glicol (PEG),
que apresenta como desvantagem a utilização de solventes
orgânicos e surfactantes para sua preparação (HU et al., 2002).
Nanopartículas hidrofílicas têm recebido muita atenção como
liberador terapêutico de peptídeos, proteínas, antígenos,
oligonicleotídeos e genes, por administração via oral, intravenosa e
mucosa (JANES et al., 2001).
A quitosana foi selecionada para ser utilizada na preparação de
nanopartículas por sua propriedade hidrofílica, por ser bioadesiva,
por sua habilidade em aumentar a penetração de grandes moléculas
por superfícies mucosas (HUANG et al., 2005a, 2005b; ILIUM,
1998), ser biodegradável, biocompatível (ASPDEN et al., 1997;
TAKEUCHI et al., 2001) e por possibilitar a utilização de métodos
alternativos de formulação que não requerem a utilização de
solventes orgânicos e de surfactantes (HU et al., 2002).
Nanopartículas produzidas com quitosana vêm sendo estudadas
para preparação, modificação e propriedades de carregamento de
várias drogas. As características fisiológicas de nanopartículas de
quitosana ligadas a PLGA e PEO-PPO, insulina, DNA e drogas
anticâncer, também estão sendo investigadas (LUBBEN et al., 2001;
ROY et al., 1999).
Alguns fatores podem afetar as propriedades dos fármacos,
como parâmetros moleculares da quitosana: peso molecular e grau
de desacetilação. Com relação a sistemas de liberação de
proteínas, alguns estudos têm demonstrado que quitosana com
peso molecular entre 210 kDa e 115 kDa e grau de desacetilação
entre 85% e 92% apresentam melhores resultados (XU; DU, 2003).

5. Considerações finais

Este capítulo mostra que, para trabalhar com o polímero do


século – a quitosana –, é imprescindível saber caracterizá-la. Isso
se deve ao princípio básico da ciência de qualquer material que se
baseia no conhecimento da estrutura implicando diretamente nas
suas propriedades e consequentemente nas suas aplicações.
Portanto, é fundamental conhecer detalhadamente as técnicas de
caracterização desse biopolímero de tal forma que o pesquisador
consiga saber qual informação pode ser adquirida por cada técnica;
por exemplo, com a espectroscopia vibracional na região do
infravermelho, pode-se confirmar a estrutura da quitosana e fornecer
seu grau de desacetilação. Sabe-se também que mesmo um
material com estrutura química definida pode alterar suas
propriedades ópticas, mecânicas, magnéticas ou químicas quando
reduz o tamanho das suas partículas para a escala nano, e o
mesmo acontece com a quitosana. Por exemplo, a regeneração de
tecidos epiteliais é uma aplicação da quitosana com superfície
macroscópica; já como nanopartículas, pode ser usada como
biomarcador em diagnóstico de câncer. O aproveitamento dessas
novas propriedades tecnológicas forma a base da nanotecnologia
de materiais.

6. Referências

ALLÉMANN, E.; GURNY, R.; DOELKER, E. Drug-loaded nanoparticles: preparation


methods and drug targeting issues. European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics, Stuttgart, v. 39, p. 173-191, 1993.
AMORIM, R. V. S.; PEDROSA, R. P.; FUKUSHIMA, K.; MARTÍNEZ, C. R.; LEDINGHAM,
W. M.; CAMPOS-TAKAKI, G. M. Alternative carbon sources from sugar cane process for
submerged cultivation of Cunninghamella bertholletiae to produce chitosan. Food
Technology and Biotechnology, Zagreb, HR, v. 44, p. 519-523, 2006.
ANJOS, F. S. C. Filmes e beads à base de quitosana: incorporação de compostos
luminescentes e estudos de interações hospedeiro-hóspede. 2005. 93 f. Dissertação
(Mestrado em Química) - Universidade Federal de Pernambuco.
ASPDEN, T. J.; MASON, J. D.; JONES, N. S.; LOWE, J.; SKAUGRUD, O.; ILLUM, L.
Chitosan as a nasal delivery system: the effect of chitosan solutions on in vitro and in vivo
mucociliary transport rates in human turbinates and volunteers. Journal of Pharmaceutical
Sciences, Washington, DC, v. 86, p. 509-513, 1997.
AZEVEDO, M. M. M. de; OLIVEIRA, A. F. de; MINARINI, P. R.; SOUZA, A. O. de; SILVA, C.
L.; DURÁN, N. Micro and nanospheres of poly(E-caprolactone) in the antituberculosis drug
encapsulation. In: ANNUAL MEETING AND EXPOSITION CONTROLLED RELEASE
SOCIETY, 30., 2003, Glasgow. Proceedings... London, UK: Soc. Controlled Release, 2003.
v. 30, p. 1-2.
AZEVEDO, M. M. M. Nanoesferas e a liberação controlada de fármacos. 2002. 20 f.
Monografia (Graduação em Química) - Instituto de Química, Unicamp, São Paulo.
BAXTER, A.; DILLON, M.; TAYLOR, K. D. A.; ROBERTS, G. A. F. Improved method for i.r.
determination of the degree of N-acetylation of chitosan. International Journal of Biological
Macromolecules, Amsterdam, NL, v. 14, p. 166-169, 1992.
BECK, R. C. R.; POHLMANN, A. R.; GUTERRES, S. S. Nanoparticle coated microparticles:
preparation and characterization. Journal of Microencapsulation, London, UK, v. 21, n. 5, p.
499-512, 2004.
BENITA, S. Microparticulate drug delivery systems: release kinetic models. In: ARSHADY,
R. Microspheres, microcapsules and liposomes. London, UK: Citrus Books, 1998. p. 255-278.
BORDERÍAS, A. J.; SÁNCHEZ-ALONSO, I.; PÉREZ-MATEOS, M. New applications of
fibres in foods: addition to fishery products. Trends in Food Science & Technology, Oxford, v.
16, n. 10, p. 458-465, 2005.
BRANNON-PEPPAS, L.; BLANCHETTE, J. O. Nanoparticle and targeted systems for
cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews, Amsterdam, NL, v. 56, n. 11, p. 1649-
1659, 2004.
CAMPANA FILHO, S. P.; BRITTO, D.; CURTI, E.; ABREU, F. R.; CARDOSO, M. B.;
BATTISTI, M. V.; SIM, P. C.; GOY, R. C.; SIGNINI, R.; LAVALL, R. L. Extração, estrutura e
propriedades de alfa- e beta-quitina. Química Nova, São Paulo, v. 30, p. 644-650, 2007.
CAMPOS-TAKAKI, G. M. The fungal versatility on the copolymers chitin and chitosan
production. In: DUTTA, P. K. (Ed.). Chitin and chitosan opportunities and challenges.
Midnapore: SSM International, 2005.
CANELLA, K. M. N. C.; GARCIA, R. B. Caracterização de quitosana por cromatografia de
permeação em gel: influência do método de preparação e do solvente. Química Nova, São
Paulo, v. 24, p. 13-17, 2001.
CAO, Z.; SUN, Y. N-Halamine-based chitosan: preparation, characterization, and
antimicrobial function. Journal of Biomedical Materials Research Part A, Hoboken, v. 85, n.
1, p. 99-107, 2008.
CHATTERJEE, S.; ADHYA, M.; GUHA, A. K.; CHATTERJEE, B. P. Chitosan from Mucor
rouxii: production and physico-chemical characterization. Process Biochemistry, Watford, v.
40, p. 395-400, 2005.
CHO, Y.-W.; CHO, Y.-N.; CHUNG, S.-H.; YOO, G.; KO, S.-W. Water-soluble chitin as a
wound healing accelerator. Biomaterials, Amsterdam, NL, v. 20, n. 22, p. 2139-2145, 1999.
CHUNG, Y.-C.; SU, Y.-A.; CHEN, C.-C.; JIA, G.; WANG, H.-L.; WU, J. C. G.; LIN, J. G.
Relationship between antibacterial activity of chitosan and surface characteristics of cell
wall. Acta Pharmacologica Sinica, Shanghai, v. 25, p. 932-936, 2004.
COSTA, T. A. C.; ANDRADE, A. L.; BINOTTO, T. E.; PLEPSIS, A. M. G.; BEVILACQUA, L.;
SOUZA, W. M. Avaliações clínica e morfométrica da capacidade angiogênica da membrana
de quitosana em córneas de coelhos. Arquivos Brasileiros de Oftalmologia, São Paulo, v.
69, n. 6, p. 817-821, 2006.
DOMSZY, J. G.; ROBERTS, A. F. Evalution of infrared spectroscopic technique for
analyzing chitosan. Die Makromolekulare Chemie, Basel, v. 186, n. 8, p. 1671-1677, 1985.
DU, D.; DING, J.; CAI, J.; ZHANG, A. Determination of carbaryl pesticide using
amperometric acetylcholinesterase sensor formed by electrochemically deposited chitosan.
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, Amsterdam, NL, v. 58, n. 2, p. 145-150, 2007.

DUMITRIU, S. (Ed.). Polymeric biomaterials. 2nd ed. New Yok: Marcel Dekker, 2002. 1184
p.
FOCHER, B.; BELTRAME, P. L.; NAGGI, A.; TORRI, G. Alkaline N-deacetylation of chitin
enhanced by flash treatments: reaction kinetics and structure modifications. Carbohydrate
Polymers, London, UK, v. 12, n. 4, p. 405-418, 1990.
FRANCO, L. O.; STAMFORD, T. C. M.; STAMFORD, N. P.; CAMPOS-TAKAKI, G. M.
Cunninghamella elegans (IFM 46109) como fonte de quitina e quitosana. Analytica, São
Paulo, v. 3, n. 10, p. 40-44, 2005.
GADES, M. D.; STERN, J. S. Chitosan supplementation and fat absorption in men and
women. Journal of the American Dietetic Association, Philadelphia, v. 105, n. 1, p. 72-77,
2005.
GUTERRES, S. S.; MULLER, C. R.; MICHALOWSKI, C. B.; POHLMANN, A. R.; DALLA-
COSTA, T. Gastrointestinal tolerance after oral administration of spray-dried diclofenac-
loaded nanocapsules and nanospheres. STP Pharma Sciences, Paris, FR, v. 11, n. 3, p. 229-
233, 2001.
HIRAI, A.; ODANI, H.; NAKAJIMA, A. Determination of deacetylation of chitosan by 1H-
NMR spectroscopy. Polymer Bulletin, Berlin, DE, v. 26, p. 87-94, 1991.
HÖRNER, V.; PITTERMANN, W.; WACHER, R. Efficiency of high molecular weight chitosan
in skin care applications. In: DOMARD, A.; ROBERTS, G. A. F.; VARUM, K. M. (Ed.).
Advances in chitin science. Lyon: Jacques Andre, 1997. p. 671-677.
HU, Y.; JIANG, X.; DING, Y.; GE, H.; YUAN, Y.; YANG, C. Synthesis and characterization of
chitosan-(polyacrylic acid) nanoparticles. Biomaterials, Amsterdam, NL, v. 23, n. 15, p.
3193-3201, 2002.
HUANG, M.; FONG, C. W. KHOR, E.; LIM, L. Y. Transfection efficiency of chitosan vectors:
effect of polymer molecular weight and degree of deacetylation. Journal of Control Release,
Amsterdam, NL, v. 106, n. 3, p. 391-406, 2005a.
HUANG, Y. Z.; GAO, J. Q.; LIANG, W. Q.; NAKAGAWA, S. Preparation and characterization
of liposomes encapsulating chitosan nanoparticles. Biological & Pharmaceutical Bulletin,
Tokyo, JP, v. 28, n. 2, p. 387-390, 2005b.
HUGGINS, M. L. The viscosity of dilute solutions of long-chain molecules: IV. Dependence
on concentration. Journal of the American Chemistry Society, Columbus, v. 64, p. 2716-
2718, 1942.
IKINCI, G.; SENEL, S.; AKINCIBAY, H.; KAS, S.; ERCIS, S.; WILSON, C. G.; HINCAL, A. A.
Effect of chitosan on a periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. International
Journal of Pharmaceutics, Amsterdam, NL, v. 235, n. 1-2, p. 121-127, 2002.
ILIUM, L. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient. Pharmaceutical Research,
Amsterdam, NL, v. 15, n. 9, p. 1326-1331, 1998.
JAIN, A. K.; THOMAS, N. S.; PANCHAGNULA, R. Transdermal drug delivery hydrochloride:
I. Effect of terpenes. Journal of Controlled Release, Amsterdam, NL, v. 1-3, n. 79, p. 93-101,
2002.
JANES, K. A.; CALVO, P.; ALONSO, M. J. Polysaccharide colloidal particles as delivery
systems for macromolecules. Advanced Drug Delivery Reviews, Amsterdam, NL, v. 47, n. 1,
p. 83-97, 2001.
JAWORSKA, M.; SAKURAI, K.; GAUDON, P.; GUIBAL, E. Influence of chitosan
characteristics on polymer properties: I. Crystallographic properties. Polymer International,
New York, v. 52, n. 2, p. 198-205, 2003.
JAYAKUMAR, R.; REIS, R. L.; MANO, J. F. Synthesis and characterization of pH-sensitive
thiol-containing chitosan beads for controlled drug delivery applications. Drug Delivery,
London, UK, v. 14, n. 1, p. 9-17, 2007.
JUNG, T.; KAMM, W.; BREITENBACH, A.; KAISERLING, E.; XIAO, J. X.; KISSEL, T.
Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to
affect mucosal uptake? European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Stuttgart,
v. 50, n. 1, p. 147-160, 2000.
KASSAI, M. R.; ARUL, J.; CHARLET, G. Intrinsic viscosity–molecular weight relationship for
chitosan. Journal of Polymer Science: Part B: Polymer Physics, New York, v. 38, p. 2591-
2598, 2000.
KAYSER, O.; LEMKE, A.; HERNÁNDEZ-TREJO, N. The impact of nanobiotechnology on
the development of new drug delivery systems. Current Pharmaceutical Biotechnology,
Bussum, v. 6, n. 1, p. 3-5, 2005.
KIM, T. H.; PARK, I. K; NAH, J. W.; CHOI, Y. J.; CHO, C. S. Galactosylated chitosan/DNA
nanoparticles prepared using water-soluble chitosan as a gene carrier. Biomaterials,
Amsterdam, NL, v. 25, n. 17, p. 3783-3792, 2004.
KOHEI, H.; MAKI, O. Application of Carboxymethyl Chitin for cosmetics. Chitin and
Chitosan Research, Tokyo, JP, v. 12, n. 2, p. 86-87, 2006.
LACAVA, Z. G. M.; MORAIS, P. C. Aplicações biomédicas de nanoaprtículas magnéticas.
Parcerias Estratégicas, Brasília, DF, v. 18, p. 73-86, 2004.
LAVERTU, M.; XIA, Z.; SERREQI, A. N.; BERRADA, M.; RODRIGUES, A.; WANG, D.;
BUSCHMANN, M. D.; GUPTA, A. A validated 1H NMR method for the determination of the
degree of deacetylation of chitosan. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
Amsterdam, NL, v. 32, n. 6, p. 1149-1158, 2003.
LUBBEN, I. M. V. D.; VERHOEF, J. C.; BORCHARD, G.; JUNGINGER, H. E. Chitosan for
mucosal vaccination. Advanced Drug Delivery Reviews, Amsterdam, NL, v. 52, p. 139-144,
2001.
MAIA, R. C. C.; FRANCO, L. O.; STAMFORD, T. C. M.; FUKUSHIMA, K.; PORTO, A. L. F.;
CAMPOS-TAKAKI, G. M. Chitin producted by Cunnunghamella elegans (IFM 46109) and
applied to wound healing. Asian Chitin Journal, Contai, v. 2, p. 11-20, 2006.
MELO, C. P.; PIMENTA, M. Nanociência e nanotecnologia. Parcerias Estratégias, Brasília,
DF, v. 18, p. 9-22, 2004.
MIDDLETON, J. C.; TIPTON, A. J. Synthetic biodegradable polymers as medical devices.
Medical Plastics and Biomaterials, Los Angeles, p. 30, Mar. 1998.
MIYAZAKI, S.; TAKAHASHI, A.; KUBO, W.; BACHYNSKY, J.; LÖBENBERG, R. Poly N-
Butylcyanoacrylate (PNBCA) nanocapsules as a carrier for NSAIDs: in vitro release and in
vivo skin penetration. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences, Edmonton, v. 6, n. 2,
p. 238-245, 2003.
MONTEIRO JÚNIOR, A. O. Preparação, modificação química e calorimetria do biopolímero
quitosana. 1999. 101 f. Tese (Doutorado em Química Inorgânica) - Instituto de Química,
Universidade Estadual de Campinas, Campinas.
MONTEIRO, V. A. R.; SOUZA, E. F. de; AZEVEDO, M. M. M. de; GALEMBECK, F.
Aluminum polyphosphate nanoparticles: preparation, particle size determination, and
microchemistry. Journal of Colloid Interface Science, New York, v. 217, n. 2, p. 237-248,
1999.
MURUGAN, R.; RAMAKRISHNA, S. Bioresorbable composite bone paste using
polysaccharide based nano hydroxyapatite. Biomaterials, Amsterdam, NL, v. 25, p. 3829-
3835, 2004.
OKAWA, Y.; KOBAYASHI, M. A. B.; SUZUKI, S.; SUZUKI, M. Comparative study of
protective effects of chitin, chitosan, and N-acetyl chitohexaose against Pseudomonas
aeruginosa and Listeria monocytogenes infections in mice. Biological & Pharmaceutical
Bulletin, Tokyo, JP, v. 26, n. 6, p. 902-904, 2003.
OLIVEIRA, A. G.; SCARPA, M. V.; CORREA, M. A.; CERA, L. F. R.; FORMARIZ, T. P.
Microemulsões: estrutura e aplicações como sistema de liberação de fármacos. Química
Nova, São Paulo, v. 27, n. 1, p. 131-138, 2004.
ÖLMEZ, S. S.; KORKUSUZ, P.; BILGILI, H.; SENEL, S. Chitosan and alginate scaffolds for
bone tissue regeneration. Pharmazie, Eschborn, v. 62, n. 6, p. 423-431, 2007.
ORNUM, J. V. Shrimp waste-must it be wasted. Infofish International, Kuala Lumpur, MY, v.
6, p. 48-52, 1992.
PARK, J. H.; KWON, S.; NAM, J.-O.; PARK, R.-W.; CHUNG, H.; SEO, S. B.; KIM, I.-S.;
KWON, I. C.; JEONG, S. Y. Self-assembled nanoparticles based on glycol chitosan bearing
5b-cholanic acid for RGD peptide delivery. Journal of Controlled Release, Amsterdam, NL, v.
95, n. 3, p. 579-588, 2004.
PAWTLOWSKA, E. The assessment of influence of chitosan on the dental pulp in rats. In:
DOMARD, A.; ROBERTS, G. A. F.; VARUM, K. M. (Ed.). Advances in chitin science. Lyon:
Jacques Andre, 1997. p. 705-710.
PEPPES, N. A. Hydrogels in medicine and pharmacy. Boca Raton: CRC, 1987. 180 p.
PINTO-ALPHANDARY, H.; ANDREMONT, A.; COUVREUR, P. Targeted delivery of
antibiotics using liposomes and nanoparticles: research and applications. International
Journal of Antimicrobial Agents, Amsterdam, NL, v. 13, n. 3, p. 155-168, 2000.
POCHANAVANICH, P.; SUNTORNSUK, W. Fungal chitosan production and its
characterization. Letters in Applied Microbiology, Oxford, v. 35, n. 1, p. 17-21, 2002.
PUSZTAY, S. V.; WEI, A.; STAVENS, K. B.; ANDRES, R. P. Encagement of gold
nanoclusters in crosslinked resorcinarene shells. Supramolecular Chemistry, Cambridge, v.
14, n. 2-3, p. 291-294, 2002.
QUINA, F. H. Nanotecnologia e o meio ambiente: perspectivas e riscos. Química Nova, São
Paulo, v. 27, n. 6, p. 1028-1029, 2004.
RAFFIN, R. P.; OBACH, E. S.; MEZZALIRA, G.; POHLMANN, A. R.; GUTERRES, S. S.
Nanocapsulas poliméricas secas contendo indometacina: estudo de formulação e de
tolerância gastrintestinal em ratos. Acta Farm. Bonaerense, Buenos Aires, AR, v. 22, n. 2, p.
163-172, 2003.
RINAUDO, M. Chitin and chitosan: properties and applications. Progress in Polymer Science,
Oxford, v. 31, p. 603-632, 2006.
RINAUDO, M.; MILAS, M.; DUNG, P. L. Characterization of chitosan: influence of ionic
strength and degree of acetylation on chain expansion. International Journal of Biological
Macromolecules, Amsterdam, NL, v. 15, p. 281-285, 1993.
ROY, K.; MAO, H. Q.; HUANG, S. K.; LEONG, K. W. Oral gene delivery with DNA-chitosan
nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allergy. Nature
Medicine, New York, v. 5, n. 4, p. 387-391, 1999.
SANO, H.; SHIBASAKI, R.; MATSUKUBO, T.; TAKAESU, Y. Effect of chitosan rinsing on
reduction of dental plaque formation. Bulletin of Tokyo Dental College, Tokyo, JP, v. 44, n. 1,
p. 9-16, 2003.
SANO, H.; SHIBASAKI, R.; MATSUKUBO, T.; TAKAESU, Y. Effect of molecular mass and
degree of deacetylation of chitosan on adsorption of Streptococcus sobrinus 6715 to saliva
treated hydroxyapatite. Bulletin of Tokyo Dental College, Tokyo, JP, v.43, n. 2, p.75-82. 2002.
SANTOS, J. E.; SOARES, J. P.; DOCKAL, E. R.; CAMPANA FILHO, S. P.; CAVALHEIRO,
E. T. G. Caracterização de quitosanas comerciais de diferentes origens. Polímeros: Ciência
e Tecnologia, São Carlos, v. 13, n. 4, p. 242-249, 2003.
SCHAFFAZICK, S. R.; GUTERRES, S. S.; FREITAS, L. L.; POHLMANN, A. R.
Caracterização e estabilidade físico-química de sistemas poliméricos nanoparticulados
para administração de fármacos. Química Nova, São Paulo, v. 26, n. 5, p. 726-737, 2003.
SEZER, A. D.; HATIPOGLU, F.; CEVHER, E.; OGURTAN, Z.; BAS, A. L.; AKBUGA, J.
Chitosan film containing fucoidan as a wound dressing for dermal burn healing: preparation
and in vitro/in vivo evaluation. AAPS PharmSciTech, New York, v. 8, n. 2, p. 39, 2007.
SIGNINI, R.; DESBRIÈRESB, J.; CAMPANA FILHO, S. P. On the stifness of chitosan
hydrochloride in acid-free aqueous solutions. Carbohydrate Polymers, London, UK, v. 43, n.
4, p. 351-357, 2000.
SILVA, M. C. F.; STAMFORD, T. C. M.; FRANCO, L. O.; CAMPOS-TAKAKI, G. M. Effect of
salinity and glucose on chitin and chitosan production by Cunnunghamella elegans. Asian
Chitin Journal, Contai, v. 2, p. 29-38, 2006.
SOPPIMATH, K. S.; AMINABHAVI, T. M.; KULKARNI, A. R.; RUDZINSKI, W. E. J.
Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery devices. Journal of Controlled
Release, Amsterdam, NL, v. 70, n. 1-2, p. 1-20, 2001.
STAMFORD, T. C. M.; STAMFORD, T. L. M.; STAMFORD, N. P.; BARROS NETO, B. ;
CAMPOS-TAKAKI, G. M. Growth of Cunninghamella elegans UCP 542 and production of
chitin and chitosan using yam bean medium. Electronic Journal of Biotechnology,
Valparaíso, v. 10, n. 1, p. 61-68, 2007.
STAMFORD, T. C. M.; STAMFORD, T. L.; FRANCO, L. O. Produção, propriedades e
aplicações da quitosana na agricultura e no ambiente. In: FIQUEIREDO, M. V. B.; BURITY,
H. A.; STAMFORD, N. P.; ROSÁLIA, C. E.; SANTOS, S. (Org.). Microrganismos e
agrobiodiversidade: o novo desafio para a agricultura. São Paulo: Agrolivros, 2008. v. 1, p.
487-506.
STAMFORD, T. M. Caracterização e aplicação da quitosana no processo de des-
remineralização do esmalte dentário. 2008. 109 f. Dissertação (Mestrado em Ciência de
Materiais) - Universidade Federal de Pernambuco.

STEVENS, M. P. Polymer chemistry: an introduction. 3th ed. Oxford: Oxford University


Press, 1999.
SYNOWIECKI, J.; AL-KHATEEB, N. A. A. Production, properties, and some new
applications of chitin and its derivatives. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,
Boca Raton, v. 43, n. 2, p. 144-171, 2003.
TAKEUCHI, H.; YAMAMOTO, H.; KAWASHIMA, Y. Mucoadhesive nanoparticulate systems
for peptide drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, Amsterdam, NL, v. 47, n. 1, p.
39-54, 2001.
THARANATHAN, R. N.; KITTUR, F. S. Chitin: the undisputed biomolecule of great potential.
Critical Reviews in Food Science and Nutrition, Boca Raton, v. 43, n. 1, p. 61-87, 2003.
TSAIH, M. L.; CHEN, R. H. Molecular weight determination of 83% degree of deacetylation
chitosan with non-gaussian and wide range distribution by high-performance size exclusion
chromatography and capillary viscometry. Journal of Applied Polymer Science, New York, v.
71, p. 1905-1913, 1999.
VELÁSQUEZ, C. L. Algunos usos del quitosano en sistemas acuosos. Revista
Iberoamericana de Polímeros, [Santiago, CL], v. 4, n. 2, p. 91-109, 2003.
VIVEK, D. S.; TORRES, J. A. Chitosan-based coagulating agents for treatment of cheddar
cheese whey. Biotechnology Progress, New York, v. 16, n. 6, p. 1091-1097, 2000.
WONGPANIT, P.; TABATA, Y.; RUJIRAVANIT, R. Miscibility and biodegradability of silk
fibroin/carboxymethyl chitin blend films. Macromolecular Bioscience, Weinheim, v.7, n. 12, p.
1258-1271, 2007.
XU, Y.; DU, Y. Effect of molecular structure of chitosan on protein delivery properties of
chitosan nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics, Amsterdam, NL, v. 250, n. 1,
p. 215-226, 2003.
YADAV, A. V.; BHISE, S. B. Chitosan: a potencial biomaterial effective against typhoid.
Current Science, Bangalore, v. 87, n. 9, p.1176-1178, 2004.
YANO, H.; HIRAYAMA, F.; KAMADA, M.; ARIMA, H.; UEKAMA, K. J. Colon-specific delivery
of prednisolone-appended alpha-cyclodextrin conjugate: alleviation of systemic side effect
after oral administration. Journal of Controlled Release, Amsterdam, NL, v. 79, n. 1-3, p.103-
112, 2002.
YOSHIZUKA, K.; LOU, Z.; INOUE, K. Silver-complexed chitosan microparticles for pesticide
removal. Reactive & Functional Polymers, Amsterdam, NL, v. 44, n. 1, p. 47-54, 2000.
Notas
Parte 3

Capítulo 1

1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov
2 http://rdp.cme.msu.edu
3 Disponível em:
<http://www.operon.com/products/stock_oligos/OperonsRAPD10merSequences.xls>

Capítulo 2

1 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast>.


2 Disponível em: <http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/Blast/index.cgi>.
3 Disponível em: <http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast>.
4 Disponível em: <http://inismor.ucd.ie/~talign/index.html)>.

Capítulo 3

1 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/>.


2 Disponível em: <http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php>.
3 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html>
4 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html>.
5 Disponível em: <http://www.bioinformatics.nl/tools/haplosnper/>.
6 Disponível em: <http://frodo.wi.mit.edu/>.

Capítulo 4

1 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html>.


2 Disponível em: <http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi>
3 Disponível em: <http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi>
4 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Newsltr/ V15N2/ BLView.html>.
5 Disponível em: <http://conseq.bioinfo.tau.ac.il/>.

Capítulo 5
1 Disponível em:<http://www-gsd.lbl.gov/vista>.
2 Disponível em:<http://bio.cse.psu.edu/pipmaker>.
3 Disponível em: <http://www.plantgdb.org>.
4 Disponível em: <http://www.1000genomes.org/>.

Capítulo 6

1 Disponível em: <http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/TGI/gimain.pl?gudb = s


officinarum>.
2 Disponível em: <http://sucestfun.Org>.

Capítulo 7

1 Disponível em: <www.ncbi.nlm.nih.gov/>.


2 Disponível em: <www.ebi.ac.uk/embl/>.
3 Disponível em: <www.ddbj.nig.ac.jp>.
4 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html>.
5 Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html>.
6 Disponível em: <http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi>.

Parte 4

Capítulo 1

1 Acesso a coleções de cultura no mundo. Disponível em:


<http://wdcm.nig.ac.jp/hpcc.html>.

Capítulo 1

1 Entende-se por revegetação a recuperação da vegetação (da flora), o mais próximo do


estado original.
2 Entende-se por recomposição ambiental além da revegetação o retorno da
funcionalidade do ecossistema.

Você também pode gostar