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1ª edição
1ª impressão (2010): 2.000 exemplares
2ª edição
E-book (2012)
Todos os direitos reservados
Para uso exclusivo de #NOME#. A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou
em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610).
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Embrapa Informação Tecnológica
Biotecnologia aplicada à agricultura : textos de apoio e protocolos experimentais / editores técnicos,
Márcia do Vale Barreto Figueiredo, Hélio Almeida Burity, José de Paula Oliveira, Carolina Etienne
de Rosália e Silva Santos, Newton Pereira Stamford. – 2. ed. – Brasília, DF : Embrapa, 2012.
E-book, no formato ePub, convertido do livro impresso.
ISBN 978-85-7035-011-4
Bartolomeu Acioli-Santos
Biólogo, D.Sc. em Biologia Molecular, pesquisador da Fundação
Oswaldo Cruz, Recife, PE
bartacioli@hotmail.com
Ed Paschoal Carrazzoni
Químico, livre-docente, professor da Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE) e da Universidade Católica de Pernambuco
(Unicap), Recife, PE
edcarrazzoni@hotmail.com
Eduardo Romano
Biólogo, D.Sc. em Ciências Biológicas, pesquisador da Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
romano@cenargen.embrapa.br
Elaine Malosso
Bióloga, Ph.D. em Ecologia Microbiana, professora da Universidade
Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
elainemalosso@yahoo.com.br
Krystyna Gorlach-Lira
Bióloga, Ph.D. em Agronomia (Microbiologia do Solo), professora da
Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa, PB
krysgl@dbm.ufpb.br
Mariangela Hungria
Engenheira-agrônoma, D.S.c. em Agronomia (Ciências do Solo),
pesquisadora da Embrapa Soja, Londrina, PR
hungria@cnpso.embrapa.br
Philip C. Brookes
Engenheiro-agrônomo, Ph.D. em Ciências do Solo, pesquisador do
Rothamsted Research Institute, Harpenden, Hertfordshire, Reino
Unido
philip.brookes@bbsrc.ac.uk
Sérgio Crovella
Biólogo, D.Sc. em Antropologia Molecular, professor da
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE
crovelser@gmail.com
Stefan Schwab
Bioquímico, D.Sc. em Ciências (Bioquímica), pesquisador da
Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ
sschwab@cnpab.embrapa.br
1. Introdução
Modificações promovidas pela Lei n° 11.105 de 28/3/2005, regulamentada pelo Decreto n° 5591 de
22/11/2005.
• Reestruturação da CTNBio, delegando à comissão a competência para aprovar os OGMs para fins
de pesquisa e comercialização, autorizar as pesquisas, inclusive as de campo, e identificar as
atividades que necessitem de estudo de impacto ambiental.
• Permissão para uso de células-tronco embrionárias humanas para fins de pesquisa e terapia e
proibição de tecnologias genéticas de restrição de uso que resultam em OGMs com estruturas
reprodutivas estéreis (tecnologias Gurts).
Riscos à saúde humana e animal: toxicidade (alimentar e para rações); qualidade dos alimentos e
rações derivados de plantas GMs; alergenicidade; patogenicidade; resistência a drogas (antibióticos,
por exemplo); mercado seletivo (risco econômico).
• Soja tolerante a glifosato (epsps) (RoundUp Ready) evento GTS 40.3-2 (1998).
• Algodão resistente a insetos e tolerante a glifosato (cry1Ac+cp4epsps) evento MON 531 x MON
1445 (2009).
• Milho resistente a insetos e tolerante a glufosinato (cry 1F+bar) evento TC1507 (2008).
• Milho resistente a insetos e tolerante a glifosato (cp4 epsps+cry1Ab) evento MON810 x NK603
(2009).
• Milho resistente a inseto e tolerante a glifosato (cp4 epsps+cry1F+pat) evento TC1507 x NK 603
(2009).
• Facilidade para estabelecer e manter a um custo relativamente menor, uma vez que utilizam
sistemas agrícolas já em uso.
• Facilidade de estocagem, transporte e distribuição dos produtos derivados, pois a síntese do novo
produto ocorre diretamente em partes específicas da planta; por exemplo, na semente ou na raiz.
• Geralmente apresenta o novo produto na sua forma bioativa, o que não acontece atualmente com
culturas de microrganismos.
• Gera produto isento de risco de contaminação por agentes patogênicos ao ser humano (viroses
animais, príons, entre outros) como seria o caso de sistemas em cultura de células animais.
8. Considerações finais
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Parte 2
Enzimas
Capítulo 1
Ensaios enzimáticos de proteínas
e inibidores de proteases
envolvidos com a defesa de
plantas a patógenos
José Tadeu Abreu Oliveira
Darcy Mayra Furtado Gondim
Ilka Maria Vasconcelos
1. Introdução
2. Protocolos enzimáticos
2.1.2. Reagentes
A. Tampão fosfato de potássio 1 M, pH 7,8.
B. EDTA 1 mM.
C. Triton X-100 0,25%.
D. L-Metionina 130 mM.
E. Amostra em teste.
F. Água deionizada de alta qualidade.
G. Nitro azul de tetrazólio (NBT) 750 µM.
H. Riboflavina 100 mM.
2H2O2 → 2H2O + O2
2.2.2. Reagentes
A. Tampão fosfato de potássio 75 mM, pH 7,0.
B. Água deionizada de alta qualidade.
C. Peróxido de hidrogênio 112,5 mM preparado momentos antes do
ensaio.
2.3.2. Reagentes
A. Tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 6,0, contendo 0,5 mM de
ácido L-ascórbico (adicionar o ácido ascórbico momentos antes
da realização do ensaio, em tampão 2x concentrado e diluir para
50 mM, pH 6,0).
B. Peróxido de hidrogênio 2 mM (preparar momentos antes do
ensaio).
2.4.2. Reagentes
A. Tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2.
B. Guaiacol 20 mM (manter essa solução em vidro escuro).
C. Peróxido de hidrogênio 60 mM (preparar momentos antes do
ensaio).
2.5.2. Reagentes
A. Ácido trans-cinâmico 1 mM.
B. Tampão Tris-HCl 100 mM, pH 8,8.
C. β-Mercaptoetanol 50 mM.
D. Solução L-Fenilalanina 40 mM.
E. HCl 6 M.
2.6.2. Reagentes
A. Solução padrão de glucose (300 µg/mL = 1,7 x 106 nM). Preparar
em azida a 0,02%.
B. Tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2.
C. Composição:
Na2CO3 (anidro): 25 g
KNaC4H4O6·4H2O: 25 g
NaHCO3 : 20 g
Na2SO4 (anidro): 200 g
H2O deionizada (q.s.p.): 1.000 mL
D. Composição:
CuSO4 5H2O : 15 g
H2SO4 (concentrado): 1 a 2 gotas
H2O deionizada (q.s.p.): 100 mL
E. Misturar 1,0 mL do reagente D + 25,0 mL do reagente C
(preparar minutos antes do ensaio).
F. Composição:
H2O deionizada: 450 mL
H2SO4 (concentrado): 21 mL
(NH4)6Mo7 O24.4H2O: 25 g
Obs.: adicionar o ácido sulfúrico sobre a água, em banho de gelo,
estando protegido com óculos e vestimenta adequada. Dissolver o
molibdato de amônio nessa solução, agitando.
G. Composição:
Na2HAs04.7H20: 3 g
H2O deionizada: 25 mL
H. Misturar as soluções F e G, agitando. Deixar em repouso por 24
horas, 37 ºC, ou por 30 minutos, 55 ºC.
Obs.: manter a solução em vidro escuro.
I. Solução de laminarina (2 mg/mL). Dissolver a laminarina em água
deionizada. Aquecer a 60 ºC por 10 minutos. Dialisar, exaustiva‐
mente, contra água para remover glucose livre.
Obs.: essa solução deverá ser utilizada até 3 dias após ser
preparada.
2.7.2. Reagentes
A. NAG 1 mM. Preparar em água deionizada, contendo azida
0,02%. Diluir o reagente A para concentrações de 100 µM, 200
µM, 300 µM, 400 µM, 500 µM e 600 µM, momentos antes de
construir a curva padrão.
B. Tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,2.
C. Tetraborato de potássio 0,6 M.
D. DMAB 10%. Dissolver 10 g em 100 mL de ácido acético glacial
contendo 12,5% (v/v) de ácido clorídrico 11,5 M. Essa solução
deverá ser diluída duas vezes (1:2) com ácido acético glacial, no
momento de ser utilizada.
E. Quitina coloidal (10 mg/mL).
F. β-Glucoronidase (EC 3.2.1.31; 132.000 unidades/mL). Diluir 10x.
2.8.2. Reagentes
A. Tampão fosfato de sódio 0,25 M, pH 6,0.
B. Papaína (1 mg/mL de água deionizada). Diluir 50x com reagente
A.
C. Solução ativadora, constituída por 2 mM de EDTA (ácido etileno
diaminotetracético) e 3 mM de DTT (ditiotreitol), preparada no
reagente A.
D. Substrato sintético (BANA). Preparar, na concentração de 1 mM,
dissolvendo-o em 1 mL de DMSO (dimetilsulfóxido) e ajustando
volume final com o reagente A.
E. HCl 2% preparado em etanol.
F. DMACA 0,06%, preparado em etanol.
2.8.3. Procedimento (ABE et al., 1992)
Adicionar em tubos de ensaio, em triplicata, nesta ordem, em
banho de gelo (etapas 1 a 4):
• 20 µL do reagente B.
• 40 µL do reagente C.
• 240 µL do reagente A.
• 200 µL da amostra (diluir, previamente, com o reagente A, caso
necessário).
• Incubar, em banho-maria, a 37 ºC, por 10 minutos.
• 200 µL do reagente D. Continuar incubando a 37 ºC, por mais
20 minutos.
• 500 µL do reagente E. Deixar em repouso por 5 minutos à
temperatura ambiente (≈ 25 ºC).
• 500 µL do reagente F. Incubar por 30 minutos. Ler absorbân‐
cias a 540 nm.
Obs.: a) Para mensuração da atividade papainásica (100% de
atividade enzimática), os 200 µL da amostra contendo inibidor
devem ser substituídos por 200 µL do reagente A; b) Nas provas em
branco (controle), feitas para cada amostra, a reação será
interrompida com o reagente E (HCl) antes da adição do substrato
(BANA) e etapas subsequentes.
3. Considerações finais
A grande maioria dos ensaios enzimáticos é realizada utilizando-
se métodos espectrofotométricos que permitem quantificar a forma‐
ção de um produto final ou o desaparecimento do substrato sob
ação da enzima. Há vários protocolos para mensuração de
atividades enzimáticas citados na literatura que podem ser seguidos
ou mesmo adaptados para as condições de cada laboratório, em
particular, desde que obedecidas algumas regras básicas, como
manutenção das condições ótimas de pH, temperatura,
concentração do substrato e linearidade da velocidade de reação.
4. Referências
ABE, M.; ABE, K.; KURODA, M.; ARAI, S. Corn kernel cysteine proteinase inhibitor as a
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Capítulo 2
Redução de nitrato e assimilação
da amônia em sistemas vegetais:
mensuração de atividade
enzimática e metabólitos
Joaquim Albenisio Gomes Silveira
Marcio de Oliveira Martins
Aurenívia Bonifacio Lima
Sérgio Luiz Ferreira-Silva
1. Introdução
Figura 2. Esquema de transporte de elétrons que ocorre durante a reação processada pela
enzima redutase do nitrato.
b) Princípio do método
O método mais utilizado para a determinação da atividade de NR
se baseia na mensuração da quantidade do produto da reação, o
NO2-. Cuidados são tomados para evitar a redução enzimática e não
enzimática no nitrito o qual é muito instável. A quantidade de nitrito é
usualmente determinada por meio do método colorimétrico clássico
de Snell e Snell (1949), que se baseia na reação do NO2- com a
sulfanilamida em meio ácido, com formação de um sal de diazônio.
Em seguida, esse sal reage com N-1-naftiletilenodiamina (NNEDA),
resultando num complexo de cor rosa-vermelha estável, com
máximo de absorção em 540 nm. Esse complexo possui um
coeficiente de absortividade molar igual a 55 (E1mM = 55). Significa
que uma solução 1 mM de NO2- (a reação apresenta uma
estequiometria de 1:1 entre NO2- e o complexo formado) formará
uma solução com uma absorbância teórica de 55. Esse índice é
importante em duas situações: (1) para checar se os cálculos da
curva padrão estão corretos e (2) para calcular a concentração de
NO2- em situações que não que existe a curva padrão.
b) Princípio do método
O princípio do método é a medida do consumo do NO2- no meio
de reação por ação de NRi. Utiliza-se o mesmo método de Snell e
Snell (1949) previamente descrito no item 2.1 (b).
b) Princípio do método
O método para mensurar a atividade de GS que mais se apro‐
xima das condições fisiológicas é o método sintetase ou método
biossintético do hidroxamato que utiliza hidroxilamina no lugar da
amônia, conforme mostrado a seguir:
b) Princípio do método
A atividade da GOGAT dependente de NADH (raízes, nódulos,
frutos) pode ser determinada pelo decréscimo na absorbância de
NAD(P)H (340 nm), conforme a reação:
b) Princípio do método
A determinação da atividade aminante de GDH se baseia na
medida do decréscimo da absorbância do NAD(P)H a 340 nm, na
presença de NH3 e a-cetoglutarato, conforme equação mostrada
acima.
a) Características gerais
Sob condições normais de aeração no solo, o nitrato é a principal
fonte de nitrogênio, sendo, portanto, a forma inorgânica nitrogenada
mais absorvida preferencialmente pelas plantas. Uma vez absorvido
pelos vegetais, o nitrato é convertido em amônio e então
incorporado em aminoácidos e outros compostos nitrogenados que
vão levar a formação de proteínas e outras diversas
macromoléculas ou ainda pode ser armazenado nos vacúolos. O
nitrato na célula pode estar contido no citosol (pool de nitrato
metabolicamente ativo) ou armazenado nos vacúolos (pool de
reserva). A primeira fração, a despeito de ser muito menor, é a mais
importante como substrato – indutor da redutase do nitrato
(SILVEIRA et al., 2001c). Na realidade, em termos de indução de
NR, o fator mais importante é o fluxo de nitrato no citosol, o qual é
de difícil mensuração.
NO3- total
a) Características gerais
Em células vegetais, o nitrito (NO2-) é o produto da redução do
nitrato pela NR. As plantas também podem adquirir o nitrito do meio
externo, em pequena proporção. Em ambos os casos, por ser alta‐
mente tóxico, o nitrito, assim como a sua forma ácida, o ácido
nitroso (HNO2), não se acumula em altas concentrações. O nitrito é
produzido no citosol pela NR citosólica. Depois de formado, o nitrito
é imediatamente transportado para dentro dos cloroplastos ou
plastídios e reduzido a amônio pela NRi e, por essa razão, é
encontrado em baixíssimas concentrações nos tecidos. A utilização
do nitrito in vivo é evitada pela anaerobiose, e sob aeração o nitrito é
rapidamente convertido em amônia.
b) Princípio do método
O método de Snell e Snell (1949) é uma modificação do método
descrito por Griess em 1879. Este se baseia na formação de sal
diazônio durante uma reação em meio ácido, do nitrito com a
sulfanilamida, e o posterior estabelecimento de um complexo
colorido quando o sal diazônio reage com N-(1-naftil)etilenodiamina
(NNEDA) (Figura 5). O complexo resultante tem coloração rosa-
vermelho e tem um pico de absorção a 540 nm.
Figura 5. Formação do sal diazônio durante a reação em meio ácido do nitrito com a
sulfanilamida, e posterior estabelecimento de um complexo colorido quando o sal diazônio
reage com NNEDA.
a) Características gerais
O metabolismo que transforma amônio em aminoácidos e
amidas é o principal mecanismo de assimilação e detoxificação de
amônio nas plantas. A formação de glutamato e glutamina é a porta
de entrada da amônia oriunda do nitrato e da reciclagem do N que
envolve processos importantes, como fotorespiração, ciclo da ureia,
senescência, etc. Portanto, apesar de o amônio não ser acumulado
nas células em virtude de sua toxicidade elevada (acima de 5 mM),
sua reciclagem é intensa. Sob certas condições metabólicas,
durante a reciclagem parte do amônio é eliminada ou perdida para a
atmosfera.
b) Princípio do método
O método baseia-se na formação de um composto de coloração
azulada, o indofenol, após a reação da amônia com fenol e
hipoclorito em pH alcalino, induzido pela adição de NaOH na
solução de reação (FELKER, 1977; WEATHERBURN, 1967)
demonstrada na Figura 6. O indofenol pode ser quantificado em
espectrofotômetro com um máximo de absorção a 640 nm.
a) Características gerais
Os aminoácidos são os produtos primários da assimilação da
amônia oriunda da redução assimilatória do nitrato. Após formação
dos primeiros aminoácidos (glutamato, glutamina, aspartato e
asparagina), ocorre intensa interconversão, principalmente
catalisada pela transferases do grupo amino. Com decorrer do
metabolismo, duas frações de aminoácidos se estabelecem: um
grupo que segue a via de síntese proteica e de outras biomoléculas
nitrogenadas, e uma fração que permanece na forma livre,
constituindo um pool importante, envolvido com vários processos
fisiológicos. Na realidade, esses dois pools, ou seja, as frações de
aminoácidos, se interligam metabolicamente com a mediação dos a-
cetoácidos, que fornecem os esqueletos de carbono para a síntese
de novos aminoácidos e síntese proteica.
b) Princípio do método
O método se baseia na reação de um a-aminoácido livre com
duas moléculas de ninhidrina, sendo uma por vez. Inicialmente, uma
molécula de ninhidrina (agente fortemente oxidante) ocasiona a
oxidação descarboxilativa dos aminoácidos resultando em amônio e
hidridantina que então reagem com uma segunda molécula de
ninhidrina produzindo um composto de cor púrpura (YEMM;
COCKING, 1955) (Figura 7). Quando a reação ocorre com a prolina
e/ou hidroxiprolina, as quais não possuem o seu a-aminogrupo livre,
o produto resultante é um composto de cor amarela característica. A
intensidade de cor formada, assim como a absorbância, não é igual
para todos os aminoácidos. Portanto, o método apenas estima a
concentração dos aminoácidos livres totais, dependendo, portanto,
da composição da amostras.
Figura 7. Formação de um pigmento púrpuro a partir da ligação de duas moléculas de
ninhidrina com um aminoácido.
a) Características gerais
Historicamente, as proteínas vegetais são classificadas com
base em sua solubilidade em vários solventes. Existem as
albuminas, solúveis em água e em solução salina; globulinas,
insolúveis em água, mas solúveis em soluções salinas; glutelinas,
insolúveis em água e em soluções salinas, mas solúveis em ácidos
e bases diluídas; e as prolaminas, insolúveis em água, solução
salina ou ácida diluída e solúvel em etanol 70% a 80%. As proteínas
também podem ser classificadas em solúveis e proteínas insolúveis,
dependo de sua localização celular. As primeiras estão presentes no
citosol e matrizes organelares e são extraídas após ruptura das
membranas e separadas por centrifugação. Nessa fração localizam-
se a maioria das enzimas. A fração insolúvel compreende as
proteínas ligadas às membranas, de extração e separação mais
difícil.
b) Princípio do método
O método desenvolvido por Bradford (1976) baseia-se numa
reação de adsorção de peptídeos, por meio principalmente dos
aminoácidos básicos, no corante coomassie brilliant blue. A forma
aniônica do corante fixa preferencialmente os grupamentos
catiônicos das proteínas por meio de interações eletrostáticas. A
reação produz um complexo de coloração azulada que pode ser
mensurada pela absorbância a 595 nm. O complexo proteína-
corante possui alto coeficiente de extinção molar, e isso confere
grande sensibilidade ao método. Apesar de existirem outros
métodos como o de Lowry (1951), o de Bradford se destaca pela
sua sensibilidade, simplicidade e rapidez. Entretanto, como os
demais, apresenta limitações, tais como interferências, baixa
especificidade, diferentes coeficientes de absortividade molar para
diferentes proteínas, além de não reagir diretamente somente com
as proteínas. A estrutura final do complexo proteína-corante é
mostrada na Figura 8.
Figura 8. Complexo proteína-corante formado na reação de Bradford.
4. Considerações finais
A metodologia para determinação de atividades enzimáticas e
concentrações de metabólitos em tecidos vegetais representa um
passo fundamental para o sucesso de uma pesquisa e/ou controle
de qualidade de produtos biotecnológicos. Existe uma dificuldade
natural na qualidade daquelas mensurações imposta pela própria
complexidade da estrutura dos vegetais. Dessa maneira, a maioria
dos resultados obtidos reflete mais uma estimativa feita in vitro em
relação aos dados reais na situação in situ. Em virtude disso, a
interpretação dos resultados não é simples. Portanto, é necessário
ter a clareza dessa limitação e incentivar o aperfeiçoamento e
surgimento de novos métodos analíticos químicos e bioquímicos.
Essa é uma área da pesquisa que requer mais progresso como se
pode deduzir pela idade de muitos dos métodos clássicos ainda em
pleno uso. Como essa área envolve, muitas vezes, aspectos
essencialmente empíricos, é essencial que cada laboratório busque
adaptar e otimizar seus métodos antes de usá-los como uma receita
pronta. Especificamente no caso da assimilação do N inorgânico,
apesar da imensa quantidade de pesquisa realizada, muito ainda
precisa ser feito para possibilitar uma melhor compreensão dos
mecanismos a fim de possibilitar utilização biotecnológica desse
processo para o desenvolvimento de produtos de maior valor
agregado.
5. Referências
6. Literatura recomendada
1. Introdução
b) Método titulométrico
A determinação da atividade de lipases por titulometria é
baseada no método titulométrico, realizado de acordo com o método
empregado por Watanabe et al. (1977).
Procedimentos
– A reação enzimática é realizada em frascos Erlenmeyer de 125
mL de capacidade, em banho-maria a 30 °C, sob agitação (150
ciclos/min) durante 10 minutos.
– A mistura da reação: emulsão de óleo de oliva (25%, v/v) em
solução de álcool polivinílico a 2% p/v (5,0 mL); solução-tampão
Tris-HCl 0,02M pH 8,0 (4,0 mL-1) ou solução-tampão fosfato pH
6,0 (4,0 mL-1); preparação enzimática (1,0 mL-1).
– A reação é paralisada pela adição de 20 mL de solução
acetona/álcool etílico (1:1).
– Em paralelo fazer como controle (branco) a enzima inativada,
ou seja, a preparação enzimática deverá ser colocada em
banho-maria fervente durante 10 minutos.
– Em seguida, adicionar 5 gotas de solução indicadora de timol‐
ftaleína a 0,2%.
– Após homogeneização da mistura em reação, fazer a titulação
dos ácidos graxos liberados com uma solução padronizada de
hidróxido de sódio 0,05 M, até o ponto de viragem,
caracterizada pelo aparecimento da coloração azul clara, sendo
registrado o volume de hidróxido de sódio gasto em cada
titulação.
Obs.: uma unidade de atividade lipásica é definida como a
quantidade de enzima que libera 1 μmol de ácido graxo por minuto
nas condições de ensaio.
A atividade (em U/mL) é calculada multiplicando-se a diferença
de volumes gastos (mL) (reação e controle) de solução de hidróxido
de sódio pelo fator de diluição, dividido pelo tempo de incubação. O
resultado é multiplicado por 50 (fator aplicado para expressar o
resultado em micro moles de ácido graxo por mL da amostra).
7. Amilase
9. Referências
1. Introdução
2.1. Comentários
2.2. Reagentes
2.5. Cálculos
em que
At = atividade de celulase, expressa em mg de glicose por kg de
TFSE e por hora; Vs = volume, em mL, da solução de CMC; Vt =
volume, em mL, da solução tampão; Vh = volume, em mL, de água
desionizada adicionada após o período de incubação; Aa =
absorbância da amostra; Ab = absorbância do branco; b = constante
da equação da curva de calibração; Fc = fator de conversão de
umidade para TFSE; a = coeficiente angular da equação da curva
de calibração; m = massa, em gramas, de solo usada na
determinação da atividade enzimática; t = tempo de incubação, em
horas.
3.2. Reagentes
3.5. Cálculos
em que
At = atividade de amilases, expressa em mg de glicose por kg de
TFSE e por hora; Vs = volume, em mL, da solução de amido; Vt =
volume, em mL, da solução tampão; Aa = absorbância da amostra;
Ab = absorbância do branco; b = constante da curva de calibração;
Fc = fator de conversão de umidade para TFSE; a = coeficiente
angular da curva de calibração; m = massa, em gramas, de solo
usada na determinação da atividade enzimática; t = tempo de
incubação, em horas.
4.1. Comentários
As arilsulfatases constituem um grupo de enzimas que catalisam
a hidrólise da ligação éster de sulfato ligado ao radical aril.
A atividade de arilsulfatases correlaciona-se positivamente com o
teor de matéria orgânica, mas não com o teor de enxofre.
O método para estimar a atividade de arilsulfatases de uma
amostra de solo consiste na incubação desta com um substrato
artificial, o p-nitrofenilsulfato de potássio, e um inibidor de
crescimento microbiano, o toluol. Após o período de incubação,
determina-se o teor de p-nitrofenol liberado, substância que
apresenta coloração amarela.
A solução de p-nitrofenilsulfato de potássio é incolor, enquanto a
solução de p-nitrofenol apresenta cor amarela, o que permite leitura
direta em espectrofotômetro. Tabatabai e Bremner (1970) desenvol‐
veram uma metodologia para determinação da atividade de
arilsulfatases em amostras de solo com base neste princípio.
A atividade de arilsulfatase aumenta quando a amostra recém-
obtida é seca a 22 oC–24 oC.
4.2. Reagentes
4.5. Cálculos
em que
At = atividade de arilsulfatases, expressa em mg de PNF por kg
TFSE e por hora; Vt = volume, em mL, da solução tampão; Vs =
volume, em mL, da solução de p-nitrofenil sulfato de potássio; Vc =
volume, em mL, da solução de CaCl2.2H2O; Vh = volume, em mL, da
solução de NaOH; Aa = leitura da absorbância da amostra; Ab =
leitura da absorbância do branco; b = constante da equação da
curva de calibração; Fc = fator de correção de umidade para TFSE;
m = massa, em gramas, de solo usada para determinação da
atividade enzimática; t = tempo de incubação, em horas; a =
coeficiente angular da equação da curva de calibração.
5.1. Comentários
5.2. Reagentes
5.4. Cálculos
em que
At = atividade de urease, expressa em mg N-NH4 por kg de TFSE
por hora; N = normalidade da solução de ácido sulfúrico usada na
titulação do destilado; Vh = volume, em mL, de água desionizada;
Vs = volume, em mL, da solução de ureia; Ve = volume, em mL, da
solução de KCl; Va = volume, em mL, da solução de ácido sulfúrico
gasto na titulação da amostra; Vb = volume, em mL, da solução de
ácido sulfúrico gasto na titulação do branco; Fc = fator de correção
de umidade para TFSE; m = massa, em gramas, de solo usada na
incubação; Vd = volume, em mL, do extrato usado para destilação; t
= tempo de incubação, em horas.
6. Proteases
6.1. Comentários
6.2. Reagentes
6.5. Cálculos
em que
At = atividade de proteases, expressa em mg de tirosina por kg de
TFSE por hora; Vt = volume, em mL, da solução tampão; Vs =
volume, em mL, da solução de caseinato de sódio; Vp = volume, em
mL, da solução de TCA; Aa = absorbância da amostra; Ab =
absorbância do branco; b = constante da equação da curva de
calibração; a = coeficiente angular da equação da curva de
calibração. Fc = fator de conversão de umidade para TFSE; m =
massa, em gramas, da amostra de solo; t = tempo de incubação, em
horas.
7. Fosfatases
7.1. Comentários
7.2. Reagentes
7.5. Cálculos
em que
At = atividade, em mg, de p-nitrofenol por kg de TFSE por hora; Vt =
volume, em mL, do tampão; Vs = volume, em mL, de p-
nitrofenilfosfato de sódio; Vc = volume, em mL, de CaCl2.2H2O; Vh =
volume, em mL, de NaOH; Aa = absorbância da amostra; Ab =
absorbância do branco; b = constante da equação da curva de
calibração; Fc = fator de correção de umidade para TFSE; a =
coeficiente angular da equação da curva de calibração; m = massa,
em gramas, da amostra de solo; t = tempo de incubação, em horas.
8. Desidrogenases
8.1. Comentários
As desidrogenases são enzimas que catalisam a oxidação de
substratos orgânicos pela remoção de elétrons e hidrogênios, os
quais são recebidos por uma coezima como NAD+ ou FAD+. As desi‐
drogenases são enzimas ligadas às células e não enzimas
extracelulares.
Um dos métodos mais frequentemente usados para avaliar a
atividade de desidrogenases do solo tem como princípio usar o TTC
(cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio) como o aceptor dos elétrons e H+
(THALMANN, 1968), reduzindo-se a TPF (trifenilformazan), que
apresenta coloração vermelha, podendo ser facilmente determinado
por espectrofotometria na região do visível (Figura 1).
8.2. Reagentes
Solução padrão de trifenilformazan (TPF) 500 mg/L: pesar
0,0500 g de TPF e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar cerca
de 80 mL de acetona e dissolver. Transferir para balão volumétrico
de 100 mL e completar o volume com acetona. Armazenar em
frasco de cor âmbar.
Solução tampão Tris-HCl, pH 7,6: pesar 12,10 g de Tris
(hidroximetilaminometano) e colocar em béquer de 1.000 mL.
Adicionar cerca de 700 mL de água desionizada e dissolver.
Adicionar HCl até pH 7,6. Transferir para balão volumétrico de 1.000
mL e completar o volume com água desionizada.
Solução de cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC) a 3%: pesar
3,00 g de TTC e colocar em béquer de 250 mL. Adicionar cerca de
80 mL de tampão Tris-HCl, pH 7,6, e dissolver. Transferir para balão
volumétrico de 100 mL e completar o volume com o tampão Tris-
HCl. Armazenar em frasco de cor âmbar.
Pipetar 0, 0,5 mL, 1,0 mL, 2,0 mL, 3,0 mL, 4,0 mL da solução
padrão de TPF 500 mg/L para balões volumétricos de 50 mL.
Adicionar a cada balão 8,3 mL de tampão Tris-HCl, pH 7,6, e
completar o volume com água desionizada.
Ler a absorbância em comprimento de onda de 546 nm.
Repetir esse protocolo por mais duas vezes, de modo a obter
uma curva de calibração com três repetições.
Aos resultados obtidos, aplicar a regressão linear, de modo a se
obter a equação, relacionando absorbância (eixo Y) com
concentração de TPF em mg/L (eixo X).
8.5. Cálculos
em que
At = atividade de desidrogenases, expressa em mg de TPF por kg
de TFSE por hora; b = constante da equação da curva de
calibração; Va = volume, em mL, de acetona; Vs = volume, em mL,
da solução de TTC; Fc = fator de correção de umidade para TFSE;
a = coeficiente angular da equação da curva de calibração; t =
tempo de incubação, em horas; Aa = absorbância da amostra; Ab =
absorbância do branco.
9.1. Comentários
9.2. Reagentes
9.5. Cálculos
em que
At = atividade, em mg de fluoresceína por kg de TFSE por hora; Aa
= absorbância da amostra. Ab = absorbância do branco; b =
constante da equação de regressão da curva de calibração; Vf =
volume, em mL, de FDA; Vt = volume, em mL, de tampão; Va =
volume, em mL, de acetona; m = massa, em gramas, de solo; a =
coeficiente angular da equação de regressão da curva de
calibração; t = tempo de incubação, em horas; Fc = fator de
correção de umidade para amostra seca a 105 oC.
10.1. Comentários
10.5. Cálculos
11.1. Comentários
11.2. Reagentes
11.5. Cálculos
em que
At = atividade da invertase, expressa em mg, de glicose por kg de
TFSE por hora; Vt = volume, em mL, do tampão acetato; Vs =
volume, em mL, da solução de sacarose; Aa = absorbância da
amostra; Ab = absorbância do branco; b = constante da equação da
curva de calibração; Vc = volume, a mL, em que foi diluído o filtrado;
a = coeficiente angular da equação da curva de calibração; m =
massa, em gramas, da amostra de solo; Ve = volume de filtrado, em
mL, usado para diluição antes da determinação dos açúcares
redutores; t = tempo de incubação, em horas; Fc = fator de correção
de umidade para amostra seca em estufa a 105 oC até peso
constante.
12. Referências
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activity in soil. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 9, p. 67-70, 1977.
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cellulase, invertase, dehydrogenase and urease. Soil Science Society of America Proceeding,
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THALMANN, A. Zur methodik der bestimmung der dehydrogenase aktivita
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of a pineaple plantation. Biology and Fertility of Soils, Berlin, DE, v. 8, p. 178-182, 1989.
Parte 3
Técnicas moleculares e aplicação
da genética nas áreas agrícolas
Capítulo 1
Técnicas moleculares aplicadas
ao estudo da diversidade e à
identificação de bactérias e
fungos de interesse agrícola
Fernando Gomes Barcellos
Mariangela Hungria
1. Introdução
3. Protocolos
Tabela 1. Primers utilizados para a amplificação da região ITS1 – 5,8S – ITS2 de fungos.
Primer Sequência
PN3 5’ – CCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATC – 3’
PN10 5’ – TCCGCTTATTGATATGCTTAAG – 3’
3.1.3. RFLP
Para as análises de RFLP são realizadas quatro reações de
clivagem com as endonucleases HaeIII, HinfI, Hin6I e NdeII. Para as
reações de clivagem devem-se utilizar 5 µL do produto de PCR e 10
U de enzima de restrição em 10 µL de tampão da enzima, fornecido
pelo fabricante. As reações de clivagem devem ser incubadas por 1
hora (h) a 37 oC, posteriormente submetidas à eletroforese em gel
de agarose a 2%.
Primer Sequência
Tabela 4. Condições de amplificação por PCR para os genes 16S RNAr, dnaK, recA, gltA, glnII,
rpoA e atpD com o uso dos primers relacionados na Tabela 3.
1. Introdução
Tabela 2. Modelo para preparo da solução de digestão de DNA com enzima de restrição.
Quantidade para
Reagente Quantidade para 100 indivíduos
1 indivíduo
DNA 1,0 µL –
Ao se utilizar outras enzimas, deve-se verificar qual tampão é ideal para eficiente
digestão. Incubar a 37 ºC por 2 a 3 horas. Inativar as enzimas a 70 ºC por 15 minutos.
Estocar a -20 ºC.
5,6 µL do adaptador EcoRI foward (600 ng/µL) (5’CTC GTA GAC TGC GTA CC3’)
4,8 µL do adaptador EcoRI reverso (600 ng/µL) (5’AAT TGG TAC GCA GTC TAC3’)
13 µL de H2O ultrapura
Imediatamente após o preparo, os adaptadores deverão ser submetidos, em
termociclador, ao seguinte programa: 1) 65 ºC 10 minutos; 2) 37 ºC 10 minutos; 3) 25 ºC
10 minutos. Estocar os adaptadores a -20 ºC.
* Passo 2.
94 2 1
94 1
56 1 26
72 1
72 5 1
Após a pré-amplificação acrescentar 80 µL de água ultrapura. Estocar a -20 ºC.
94 2 1
94 0,3
65 0,3 12
72 1
94 0,3
56 0,3 23
72 1
72 2 1
Estocar a -20 ºC.
Oligo 1 E-GACTGCGTACCAATCAGC/M-GATGAGTCCTGAGTAACTG
Oligo 2 E-GACTGCGTACCAATCACA/M-GATGAGTCCTGAGTAACAG
Oligo 3 E-GACTGCGTACCAATCACG/M-GATGAGTCCTGAGTAACAG
Oligo 4 E-GACTGCGTACCAATCAGC/M-GATGAGTCCTGAGTAACAT
Oligo 5 E-GACTGCGTACCAATCACC/M-GATGAGTCCTGAGTAACAG
Oligo 6 E-GACTGCGTACCAATCAAG/M-GATGAGTCCTGAGTAACAA
Oligo 7 E-GACTGCGTACCAATCACG/M-GATGAGTCCTGAGTAACAC
Oligo 8 E-GACTGCGTACCAATCACC/M-GATGAGTCCTGAGTAACTG
Acrilamida 29,0 g
H2O destilada 9 mL
TBE 5X 3 mL
Temed 40 µL
Total 15 mL
Preparo das amostras: carregar normalmente o gel empregando um tampão de
carregamento com azul de bromofenol.
Eletroforese: 120 V em tampão TBE 1 X por 4 horas.
TBE 5 x 100 mL
Ureia 210 g
Temed 100 µL
Total 70 mL
Carregar as placas de vidro com o gel com cuidado para evitar a formação de bolhas. A
espessura do gel é de 0,2 mm a 0,5 mm.
Preparo das amostras: adicionar nas amostras de PCR, antes de
carregar no gel, um volume na proporção de 1:1/2 de tampão de
carregamento (95% formamida, 0,05% xylene cyanol, 0,05%
bromophenol blue, 12,5% sacarose, 10 mM NaOH). As amostras
são desnaturadas a 94 oC por 5 minutos e mantidas em gelo até o
carregamento.
Eletroforese: pré-corrida – 65 V por 40 a 60 minutos, até aquecer
o gel a 50 ºC–55 ºC; corrida – 50 V–60 V em tampão TBE 1 x por 2
horas.
1.780 mL de água
2.000 mL de água ultrapura
ultrapura
20 mL de ácido acético
30 mL de ácido nítrico
glacial
200 mL de etanol
Armazenar em geladeira.
absoluto
Armazenar em geladeira.
C) Solução de
D) Solução reveladora
impregnação
200 mL de água
2.000 mL de água ultrapura
ultrapura
E) Solução de bloqueio
1.900 mL de água
ultrapura
Armazenar em geladeira.
Fixação 10 minutos
A
Lavagem 1 minuto
Impregnação 20 minutos
C
Lavagem 2 x de 30 segundos
Bloqueio 5 minutos
C
Lavagem 1 minuto
MgCl2 1,5 mM
Mix dNTP’s 1 mM
Taq polimerase 2U
DNA molde 10 ng
ITS1F CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA
ITS4 CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG
95 5 minutos 1
95 45 segundos
55 45 segundos 26
72 1 minuto
72 5 minutos 1
MgCl2 2,5 mM
DNA molde 50 ng
2234C GTTTCCGTAGGTGAACCTGC
3126T ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT
94 2 min 1
94 15 s
55 15 s 30
72 45 s
72 5 min 1
Par de
ini- Mistura Condição da PCR no termociclador(2)
ciadores
FR1(GC)/ Componente
µL Temperatura 1× 25x–30× 1×
FF390(1) [Conc. estoque]
10 × NH4 3 94 °C 10 1 minuto -
minutos
45
10 mM dNTP 0,8 50 °C - -
segundos
50 mM MgCl2 1,6
1–
DNA molde [100 ng/µL]
3
H2O para 30
(1)
Fonte: Vainio e Hantula (2000).
(2)
Fonte: Malosso et al. (2006).
Poliacrilamida (37,5:1) 6%
Ureia 8 M
Glicerol 2%
Formamida 20%
T-RFs 2 μL
Volume total 5 μL
Uma mistura master (menos T-RFs) é preparada em volume
suficiente para todas as amostras e distribuída (3 μL) em cada
pocinho de uma placa de PCR de 96 poços, e então os 2 μL dos T-
RFs são adicionados. A placa é colocada em um termociclador a 94
°C por 2 a 4 minutos para a desnaturação do DNA e transferida
imediatamente para o gelo, onde será mantida até que as amostras
(aproximadamente 2 μL) sejam carregadas no gel.
O gel utilizado nesse caso é de poliacrilamida, preparado de
modo semelhante ao descrito para a análise de TGGE. Um técnico
responsável pela operação do sequenciador geralmente executa
essa etapa do trabalho. Algumas recomendações podem ser feitas
para os passos mais críticos do processo:
1) As duas placas de vidro do sequenciador devem ser lavadas
com sabão e água quente seguida de enxágue com água
desionizada e enxágue final com água ultrapura, tomando-se
cuidado especial na limpeza das faces internas que irão ter contato
direto com o gel.
2) Observar que os espaçadores devem ser umedecidos antes
de montados nas placas, e as outras partes deverão estar limpas e
secas; todo o trabalho com acrilamida deve ser realizado em capela
de exaustão.
3) Pode-se bater levemente na placa conforme o espaço do gel
for sendo preenchido para evitar a formação de bolhas. Colocar o
pente com a parte lisa (sem dentes) voltada para o gel e posicionar
os grampos na placa de vidro ao redor do pente. O gel deve ser
deixado para solidificar por pelo menos uma hora e meia.
4) Os lados de fora do conjunto de placas contendo o gel
polimerizado devem ser limpos para remover resíduos de acrilamida
que se queimariam nas placas, o que poderia também obstruir a
passagem do laser do leitor. O pente deve então ser removido, o
poço enxaguado com água ultrapura e o pente, depois de limpo com
água, novamente posicionado no poço com os dentes pressionados
aproximadamente 0,5 mm no gel.
5) Deve-se correr uma checagem da placa (comando ‘plate-
check’). Se forem observados picos nessa etapa, limpar as placas
novamente e correr outra checagem.
6) Carregar as amostras no gel aquecido a, no mínimo, 48 °C.
7) Após a corrida, checar visualmente se todas as canaletas
foram corretamente rastreadas; corrigir manualmente, se
necessário.
8) Os dados são fornecidos de duas formas: um eletroferograma
(série de picos coloridos representando a comunidade microbiana),
e uma tabela numérica que inclui o tamanho em pares de base e
altura do pico representando uma medida relativa da proporção de
cada população na comunidade.
Como ocorre com todas as técnicas de análise de comunidades
microbianas, a t-RFLP também apresenta limitações. Avis et al.
(2006) sugeriram que os estudos em que se emprega t-RFLP
necessitam incluir informações sobre fungos conhecidos,
identificados nos locais onde os estudos serão realizados e não
confiar apenas nos perfis de t-RFLP. Edwards e Turco (2005)
chamam a atenção para a escolha da enzima de restrição que pode
influenciar fortemente a distinção entre as sequências,
especialmente quando menos de três enzimas são usadas para
grupos de espécies proximamente relacionadas. Isso mostra a
necessidade de ter cautela na interpretação dos resultados, ainda
mais porque já foi mostrado que fragmentos terminais de restrição
(TRF) idênticos podem ser gerados para grupos de espécies não
relacionadas.
Em uma tentativa de facilitar a interpretação dos resultados das
análises de t-RFLP de comunidades microbianas complexas, Smith
et al. (2005) propuseram uma ferramenta com base na web. Essa
ferramenta4 (T-Align) – permite a comparação de múltiplos perfis de
t-RFLP para identificação de componentes microbianos únicos e
compartilhados de maneira mais rápida e com menor probabilidade
de erro. O funcionamento dessa rotina se dá pela geração de um
perfil consenso, baseado na comparação de repetições, contendo
apenas os fragmentos que ocorrem em todas as repetições. Os
perfis consenso das diferentes comunidades são comparados para
produzir uma lista que mostrará se um TRF está presente em uma
amostra em particular e também a sua fluorescência relativa.
9. Considerações finais
10. Referências
1. Introdução
PlantGDB http://www.zmdb.iastate.edu/PlantGDB
Figura 4. Tela parcial de resultados mostrando setas para tipo de informações (Display),
número de sequências por tela (Show), modo de ordenamento (Sort by) e enviar para
(Send to).
Figura 7. Página de resultado do CAP3. A seta indica link para sequências no formato
FASTA.
Figura 9. Página do ORFinder com os seis diferentes frames possíveis para o Contig 7 com
sequências de Heat Shock Protein para Glycine soja.
4. Identificação e classificação do
polimorfismo
Figura 10. Página inicial do HaploSNPer. A janela do lado esquerdo é utilizada para busca
de SNPs utilizando-se banco de dados disponibilizado pelo site. A janela da direita
restringe a busca contra um conjunto de sequências.
Figura 14. Página inicial do NEBcutter. Essa ferramenta fornece opções para restrição das
enzimas que serão utilizadas na análise logo abaixo da janela em que é depositada a
sequência.
Figura 15. Página de resultado do NEBcutter, mostrando graficamente a sequência com as
respectivas enzimas de restrição e seus sítios de ação.
ALTSCHUL, S. F.; GISH, M. G. W.; WEBB, M. E. W.; LIPMAN, D. J. Basic local alignment
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Anexo
Lista dos gi das sequências EST de Glycine soja utilizadas nas análises
do capítulo...
>gi|16281180|gb|BI944355.1|BI944355 saa56f01.y1 Gm-c1060 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1060-650 5’
similar to TR:O04056 O04056 HEAT SHOCK PROTEIN 70
PRECURSOR.
>gi|12689344|gb|BG155680.1|BG155680 saa64d11.y1 Gm-c1060 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1060-1342 5’
similar to TR:Q40867 Q40867 HEAT SHOCK PROTEIN 17.9. ;, mRNA
sequence
>gi|12689338|gb|BG155674.1|BG155674 saa64c06.y1 Gm-c1060 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1060-1284 5’
similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-
SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|12493448|gb|BG045577.1|BG045577 saa03c04.y1 Gm-c1058 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1058-127 5’
similar to SW:HS82_ARATH P55737 HEAT SHOCK PROTEIN 81-2 ;,
mRNA sequence
>gi|12492958|gb|BG045334.1|BG045334 saa40f03.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-1422 5’
similar to SW:HS82_TOBAC P36182 HEAT SHOCK PROTEIN 82 ;,
mRNA sequence
>gi|12492910|gb|BG045310.1|BG045310 saa40d01.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-1322 5’
similar to SW:HS82_ORYSA P33126 HEAT SHOCK PROTEIN 82. ;,
mRNA sequence
>gi|12492255|gb|BG044981.1|BG044981 saa36a01.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-794 5’
similar to TR:Q40694 Q40694 HEAT SHOCK PROTEIN HSP82 ;, mRNA
sequence
>gi|12490491|gb|BG044011.1|BG044011 saa23b09.y1 Gm-c1058 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1058-2009 5’
similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-
SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|12489475|gb|BG042997.1|BG042997 saa46g12.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-2232 5’
similar to TR:Q96269 Q96269 HEAT-SHOCK PROTEIN. [1] ;, mRNA
sequence
>gi|12488280|gb|BG041844.1|BG041844 saa41g12.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-1847 5’
similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-
SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|12488268|gb|BG041837.1|BG041837 saa41g03.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1059-1829 5’
similar to TR:O80982 O80982 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;,
mRNA sequence
>gi|12015538|gb|BF716266.1|BF716266 saa17c09.y1 Gm-c1058 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1058-1649 5’
similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-
SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|12489242|gb|BG042764.1|BG042764 sv13f04.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1056-1807 5’
similar to SW:HS11_LYCES P30221 17.8 KD CLASS I HEAT SHOCK
PROTEIN. [2] TR:Q9SYU9 ;, mRNA sequence
>gi|12487754|gb|BG041578.1|BG041578 sv36c04.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1057-1640 5’
similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-
SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|11691080|gb|BF598756.1|BF598756 sv21d05.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1057-177 5’
similar to TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-
SHOCK PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|11690967|gb|BF598643.1|BF598643 sv20a07.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1057-14 5’
similar to TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;,
mRNA sequence
>gi|11690757|gb|BF598433.1|BF598433 sv17e06.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1056-2147 5’
similar to TR:O80329 O80329 HEAT SHOCK PROTEIN 26 ;, mRNA
sequence
>gi|11690742|gb|BF598418.1|BF598418 sv17c11.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1056-2061 5’
similar to SW:HS2C_ARATH P31170 CHLOROPLAST SMALL HEAT
SHOCK PROTEIN PRECURSOR. ;, mRNA sequence
>gi|11690433|gb|BF598109.1|BF598109 sv03e02.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone GENOME SYSTEMS CLONE ID: Gm-c1056-963 5’
similar to TR:Q9XIF5 Q9XIF5 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;,
mRNA sequence
>gi|18849152|gb|BM568262.1|BM568262 sal02b06.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-3923 5’ similar to
TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA
sequence
>gi|18732190|gb|BM526900.1|BM526900 sal47a10.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1059-5036 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18731186|gb|BM526307.1|BM526307 sal39f05.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1059-4498 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18731104|gb|BM526260.1|BM526260 sal38h11.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1059-4605 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18727984|gb|BM524462.1|BM524462 sal16a05.y1 Gm-c1059 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1059-2313 5’ similar to
TR:Q9XCB2 Q9XCB2 HEAT SHOCK PROTEIN DNAJ. ;, mRNA
sequence
>gi|18727288|gb|BM524049.1|BM524049 sal06g12.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-4559 5’ similar to
SW:HS21_SOYBN P05477 17.9 KD CLASS II HEAT SHOCK PROTEIN.
;, mRNA sequence
>gi|18727056|gb|BM523910.1|BM523910 sal05b01.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-4274 5’ similar to
TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA
sequence
>gi|18691843|gb|BM520691.1|BM520691 sak97d04.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-3631 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18691767|gb|BM520615.1|BM520615 sak96d05.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-3610 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18691638|gb|BM520486.1|BM520486 sak94g12.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-3408 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18691076|gb|BM519924.1|BM519924 sak86c12.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-2448 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|18690990|gb|BM519838.1|BM519838 sak85a03.y1 Gm-c1057 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1057-2333 5’ similar to
TR:Q9SIL3 Q9SIL3 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA
sequence
>gi|26059251|gb|CA802165.1|CA802165 sat46b02.y2 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-4299 5’ similar to
TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA
sequence
>gi|26057001|gb|CA799915.1|CA799915 sat64c09.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-6257 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|26056878|gb|CA799792.1|CA799792 sat62f11.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-6045 5’ similar to
TR:Q96269 Q96269 HEAT-SHOCK PROTEIN. [1] ;, mRNA sequence
>gi|26056078|gb|CA798992.1|CA798992 sat73f06.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-7164 5’ similar to
SW:HS14_SOYBN P04794 17.5 KD CLASS I HEAT SHOCK PROTEIN
;, mRNA sequence
>gi|26047084|gb|CA783981.1|CA783981 sat59g11.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-5710 5’ similar to
SW:HS2C_ARATH P31170 CHLOROPLAST SMALL HEAT SHOCK
PROTEIN PRECURSOR. ;, mRNA sequence
>gi|26046400|gb|CA783579.1|CA783579 sat50c04.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-4735 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
>gi|26045556|gb|CA783102.1|CA783102 sat67g01.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-6458 5’ similar to
TR:Q9SR91 Q9SR91 PUTATIVE HEAT SHOCK PROTEIN. ;, mRNA
sequence
>gi|26044294|gb|CA782452.1|CA782452 sat29a03.y1 Gm-c1056 Glycine
soja cDNA clone SOYBEAN CLONE ID: Gm-c1056-2694 5’ similar to
TR:Q9ZPQ0 Q9ZPQ0 LOW MOLECULAR WEIGHT HEAT-SHOCK
PROTEIN. ;, mRNA sequence
Capítulo 4
Bioinformática aplicada ao estudo
de genomas expressos (EST) em
plantas
Laureen Michelle Houllou-Kido
Antonio Felix da Costa
Lílian Vieira de Medeiros
Meiriana X. Vila Nova
1. Introdução
30 minutos após
Suscetível 8
estresse
90 minutos após
Suscetível 8
estresse
30 minutos após
Resistente 8
estresse
90 minutos após
Resistente 8
estresse
3. Extração de RNA
8. Sequenciamento automático
Para o sequenciamento são utilizados os plasmídeos como
moldes, usando kits da Applied Biosystems (BygDye Cycle
Sequencing kit). Cada clone deve ser sequenciado separadamente,
utilizando-se os primers T7 (início em 3´) e T3 (início em 5´). Os pro‐
dutos são precipitados com etanol 95% usando de acetato de sódio
3 M e lavados com etanol 70%, antes de serem secos sob vácuo.
As reações secas podem ser estocadas a -20 oC, protegidas da luz.
Os produtos das reações de sequenciamento são analisados em
sequenciador (ex.: ABI 3100 – Applied Biosystems) que disponha de
programas específicos para coleta, análise dos dados, gerando
arquivo em formato abi, que pode ser interpretado pelo programa
Phred.
Figura 1. Página inicial do CAP3. Essa ferramenta é utilizada para agrupar os ESTs em
contigs.
Figura 4. Página do NCBI com o link para o pacote de programas do Basic Local Alignment
Search Tool (Blast).
Para o exemplo deste capítulo vamos utilizar a sequência EST
em formato FASTA a seguir:
Figura 7. Página de resultado do Blast com a lista das sequências que apresentaram
homologia com a sequência EST do exemplo.
Com esse resultado, já é possível fazer a primeira anotação
referente ao EST utilizado como exemplo neste capítulo. A
sequência EST, identificada como RESRZ30PL2P23, apresentou
homologia com várias sequência de mRNA de leguminosas como
Glycine, Phaseolus, etc.
11. Referências
ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHÄFFER, A. A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.; MILLER,
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1. Introdução
2. Bioinformática, Biotecnologia e
melhoramento genético
A redescoberta da Lei de Mendel, a identificação dos caracteres
genéticos em cromossomos e a descoberta da molécula de DNA
trouxeram grandes mudanças para a ciência e abriram perspectivas
inéditas como o desenvolvimento do DNA recombinante, a criação
das tecnologias de marcadores, mapeamento genético e sequencia‐
mento genômico entre muitas outras técnicas incluídas no campo da
Biotecnologia. Com o uso de conhecimento da genética,
citogenética e bioquímica que visem à melhoria de plantas, animais
ou microrganismos, a Biotecnologia se desenvolveu e gerou
ferramentas extremamente úteis ao melhoramento genético. A partir
daí tornou-se possível incorporar as bases da hereditariedade no
melhoramento de forma a orientar e acelerar fixação das
características desejadas.
O melhoramento genético, quando usa ferramentas avançadas
de Biotecnologia, normalmente também necessita do auxílio da
Bioinformática, não só para organizar os dados, mas principalmente
para analisá-los. A cada dia surgem inovações tecnológicas com
aplicações diretas em melhoramento genético que exigem o
desenvolvimento de novas ferramentas de Bioinformática, deixando
obsoletas as anteriores. Por esse motivo, o foco desta discussão
serão os problemas e não as ferramentas utilizadas, embora
algumas sejam mencionadas no decorrer do texto. Apenas para
efeito de ilustração, não faz muito tempo, ferramentas de
Bioinformática eram usadas para identificar microssatélites ou SNPs
em bases de dados de ESTs ou cDNAs. A partir de 2005, com o
advento das novas tecnologias de sequenciamento (SHENDURE;
JI, 2008) que produzem milhões de pares de bases (pb) em uma
única corrida a um custo médio de US$ 2,00 (dois dólares) por
megabase, a Bioinformática precisou desenvolver novos algoritmos
que pudessem lidar com tal volume de dados e com as
características próprias das sequências geradas por esses novos
equipamentos que geralmente têm comprimento menor que aquelas
produzidas pelos sequenciadores automáticos por capilares. O
problema não mudou em sua essência, ou seja, identificar
marcadores moleculares, mas o avanço tecnológico impôs novos
desafios.
Uma das premissas do melhoramento genético é que caracte‐
rísticas fenotípicas estão associadas a genes específicos, sem
esquecer, é claro, a interação com o meio ambiente. As técnicas de
melhoramento genético consolidadas usam a Genética Clássica em
seus programas de melhoramento sem estabelecer a relação entre
fenótipos e genes (o termo está no plural, pois mais de um gene
pode estar envolvido). Entretanto, saber qual gene(s) está
relacionado com um determinado fenótipo pode ser científica e
economicamente importante, pois além de possibilitar testes
diagnósticos, pode ainda abrir caminhos para o desenvolvimento de
organismos geneticamente modificados (OGM). Que a associação
de fenótipos e genes é possível, já está mais do que provado. Há,
entretanto, duas formas de estabelecer essa associação. A primeira
é a associação um-para-um, e a segunda, a de um-para-muitos. A
musculatura dupla, por exemplo, é um fenótipo que está associado
ao gene GDF8 (um único SNP). Esse é um exemplo clássico e bem
documentado na literatura de um gene associado a um fenótipo.
Entretanto, nem sempre, é possível estabelecer essa relação
unívoca (um-para-um). Em muitos casos, o máximo de informação
possível é estabelecer a associação entre um fenótipo e uma região
cromossômica, denominada Quantitative Trait Loci (QTL). Um
exemplo em bovino é o trabalho realizado por Gasparin et al. (2007)
que identificou QTLs em três cromossomos de Bos indicus
relacionados à resistência a carrapatos.
Assim, o melhoramento genético, que nos primórdios passou
pela simples domesticação, agora, com o auxílio da Biotecnologia e
consequentemente da Bioinformática, pode avançar ainda mais.
Pois, não utiliza apenas informações, grosso modo, visíveis a olho
nu, mas lança mão de recursos que possibilitam ir à informação
contida no próprio genoma dos animais e plantas.
Embora a divisão animal e vegetal pareça um tanto artificial no
contexto do melhoramento genético, optou-se por fazer a divisão
para enfatizar algumas idiossincrasias de cada caso
3. Aplicações
4. Novas perspectivas
5. Considerações finais
6. Referências
Algoritmo
Conjunto de passos (instruções/comandos) necessários para o
computador executar uma tarefa. Os programadores utilizam a
lógica algorítmica nas diversas linguagens de programação. O
computador, portanto, executa uma tarefa baseado nas instruções
definidas no algoritmo.
Alinhamento
É o processo de alinhar duas ou mais sequências que tem o
máximo nível de identidade (e conservação, no caso de sequências
de aminoácidos) com o propósito de avaliar o grau de similaridade e
a possibilidade de homologia.
Alinhamento global
Alinhamento de duas sequências nucleotídicas ou de aminoácidos
em toda a sua extensão.
Alinhamento local
É o processo de busca de alinhamento de regiões altamente
similares de duas sequências de DNA ou proteína.
Alinhamento múltiplo
É a comparação entre três ou mais sequências de nucleotídeos ou
aminoácidos, com objetivo de posicionar a maior quantidade de
elementos idênticos entre elas (similaridades).
Bioinformática
Ciência que analisa e administra dados biológicos utilizando-se de
técnicas computacionais.
Blast
Do inglês Basic Local Alignment Search Tool. É um algoritmo de
comparação sequêncial otimizado para buscas rápidas em bancos
de dados de sequências genômicas, visando a alinhamentos locais
otimizados.
Genômica
Área da ciência que estuda e sequencia o genoma de um
organismo.
Metabolômica
Área da ciência que estuda o conjunto de metabólitos e os perfis
metabólicos de um organismo.
Metagenômica
Área da ciência que sequencia e estuda os genomas de diversos
organismos em conjunto.
Ômica
Terminação associada às plataformas tecnológicas que têm o
objetivo de isolar e caracterizar o maior número possível de
biomoléculas de um mesmo grupo como DNA, RNA, proteínas e
metabólitos.
Proteômica
Área da ciência que estuda o conjunto de proteínas de uma célula.
Score
No resultado de um alinhamento entre sequências, o score é a
pontuação que uma determinada sequência recebe dependendo do
grau de correspondência encontrada no banco de dados. São pesos
(valores) das operações realizadas no alinhamento múltiplo. As
operações mais comuns são: inserção de espaço (gap´s), inserção
de um novo elemento (nucleotídeos ou aminoácidos), substituição
do elemento (de A para T, ou de G para C).
Similaridade
Sequências correlatas. A similaridade entre duas sequências pode
ser baseada no percentual de identidade e/ou conservação.
Sintenia
Refere-se à propriedade de dois ou mais genes estarem localizados
no mesmo cromossomo.
Capítulo 6
Transformação genética de cana-
de-açúcar
Djair dos Santos de Lima e Souza
Eduardo Romano
Hugo Bruno Correa Molinari
Maria Fátima Grossi-de-Sa
1. Introdução
Método de
Característica Gene Referência
transformação
Neomicina
nptII Biobalística Bower e Birch (1992)
fosfotransferase
Higromicina
Hpt Agrobacterium Arencibia et al. (1998)
fosfotransferase
Fosfinotricina acetil
Bar Agrobacterium Elliott et al. (1998)
transferase
Promotor Ubi4 e
Gfp Biobalística Wei et al. (2003)
Ubi9
Promotor de
Agrobacterium
superexpressão Gus Liu et al. (2003)
Biobalística
RUBQ2
Resistência a herbicidas
Resistência a doenças
FDVS9
Vírus Fiji Biobalística McQualter et al. (2004a)
ORF1
Escaldadura das
albD Biobalística Zhang et al. (1999)
folhas
Glucanase,
Puccinia
quitinase e Agrobacterium Enriquez et al. (2000)
melanocephala
ap24
Resistência a insetos
Scirpophaga
Aprotinina Biobalística Christy et al. (2008)
excerptalis
SKTI e
Broca-da-cana Biobalística Falco e Silva Filho (2003)
SBBI
Invertase
ácida
antisense
Acúmulo de Ma et al. (2000))
solúvel Biobalística
sacarose Botha et al. (2001)
Invertase
ácida
solúvel
phaA,
Polihidroxidobutirato phaB e Biobalística Brumbley et al. (2003)
phaC
Ácido
hch1 e cpl Biobalística McQualter et al. (2004b)
pHidroxibenzoico
Trehalose
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Capítulo 7
Análise do metagenoma do solo:
acesso à diversidade genética de
microrganismos e aplicações na
Biotecnologia
Krystyna Gorlach-Lira
Teresa Cristina Soares de Lima Grisi
1. Introdução
4. Análise da biblioteca
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<http://www.cnpab.embrapa.br/servicos/download/doc171.pdf>. Acesso em: 25 fev. 2009.
Parte 4
Microrganismos promotores do
crescimento de plantas
Capítulo 1
Bactérias promotoras do
crescimento de plantas: estratégia
para uma agricultura sustentável
Márcia do Vale Barreto Figueiredo
Júlia Kuklinsky Sobral
Tânia Lucia Montenegro Stamford
Janete Magali de Araújo
1. Introdução
Riboflavina (Riboflavin) Serve de vitaminas para plantas e bactéria West e Wilson (1938)
Promove populações microbianas no solo
Evolução do H2 por
Estimula a diversidade de fauna no solo Dong e Layzell (2001)
nitrogenase Aumenta o C no solo
Fonte: adaptado por Dakora (2003).
3.3.1. Pré-tratamento
Em geral as bactérias filamentosas apresentam um crescimento
muito lento durante o seu isolamento em meio de cultura sólido. Por
isso se faz necessário eliminar microrganismos indesejáveis como
as bactérias que são numericamente 10 vezes maiores que
Streptomyces, e o pré-tratamento da amostra por aquecimento a 45
°C, por 2 horas, ou 50 °C, por 10 minutos, elimina principalmente
bactérias Gram negativas que crescem rapidamente (LABEDA;
SHEARER, 1990). Outro pré-tratamento é a ativação dos esporos
de actinobactérias que é importante no isolamento de bactérias
filamentosas Gram positivas. Nessa técnica a suspensão do solo é
tratada com uma solução de extrato de levedura (6,0%) mais
dodecilsulfato de sódio – (SDS) (0,05%), a 40 °C por 20 minutos,
seguida da diluição seriada em água destilada esterilizada e
plaqueamento em meio sólido seletivo (NONOMURA; HAYAKAWA,
1992). Existem vários pré-tratamentos que podem ser realizados
visando a um gênero específico como relatado por Araújo (1998).
Para a determinação da diversidade de microrganismo cultivável
no solo, a técnica do isolamento e quantificação em placa ainda é a
mais indicada. Alguns métodos podem medir a função microbiana
por meio da determinação da velocidade do processo metabólico,
mas não é possível identificar a espécie microbiana (NANNIPIERI et
al., 2003).
4. Atividade antimicrobiana
5. Considerações finais
6. Referências
1. Introdução
Azospirillum
brasilense, A. NFb – ácido málico Döbereiner et al. (1995)
lipoferum
Azospirillum
LGI – açúcar cristal Baldani (1984) e Döbereiner et al. (1995)
amazonense
Herbaspirillum
seropedicae, JNFb Baldani et al. (1992)
H. rubrisubalbicans
200 µM de cada
Mistura de dNTP 10 mM 1 µL
dNTP
5. Considerações finais
6. Referências
1. Introdução
5. Levantamento da capacidade de
estabelecer simbiose com BFN em espécies
de leguminosas
6. Aplicações biotecnológicas
Faria
(1997),
Faria e
n.d. Guedes
Acacia 6429 BR3629 III - Embrapa Mesorhizobium (1999),
angustissima 6430 BR3630 Agrobiologia amorphae Faria e
(FJ025124) Mello
(1998) e
Menna et
al. (2006)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Bradyrhizobium
(1999),
elkanii et al.
Faria e
6387 BR3609 III - Embrapa (AY904778)
A. auriculiformis Mello
6391 BR3624 Agrobiologia Bradyrhizobium
(1998),
elkanii et al.
Menna et
(AY904780)
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
(1999),
Bradyrhizobium
A. mearnsii Faria e
6164 BR3608 II - Embrapa japonicum
(syn. A. Mello
6390 BR3614(2) Agrobiologia (AY904765)
decurrens) (1998),
Burkholderia sp.
Menna et
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993)
A. podalyriifolia 6388 BR3611 II - Embrapa Bradyrhizobium Faria
6389 BR3612 Agrobiologia elkanii (1997),
B. elkanii Faria e
(FJ025113) Guedes
(1999),
Faria e
Mello
(1998),
Menna et
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993)
De-Lajudie
et al.
(1998),
Faria
(1997),
Faria e
Mesorhizobium
Guedes
plurifarium
(1999),
6392 BR3804 III - Embrapa (Y14159)
A. salicina Faria e
6400 BR5005 Agrobiologia Bradyrhizobium
Mello
elkanii
(1998),
(FJ025114)
Menna et
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993,
1998)
Faria
(1997),
Bradyrhizobium Faria e
elkanii Guedes
6096 BR8601 II - Embrapa (FJ025115) (1998),
A. saligna
6428 BR3628 Agrobiologia Bradyrhizobium Faria e
elkanii Mello
(FJ025116) (1998) e
Menna et
al. (2006)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
(1999),
Bradyrhizobium
Faria e
elkanii
6160 BR5610 III - Embrapa Mello
Albizia lebbeck (AY904762)
6432 Br5611 Agrobiologia (1998),
Bradyrhizobium
Menna et
elkanii (M55490)
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993,
1998)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
(1999),
Bradyrhizobium
Faria e
Balizia 6396 BR6816 III - Embrapa japonicum
Mello
pedicellaris 6408 BR6815 Agrobiologia (FJ025099)
(1998),
Rhizobium sp.
Menna et
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
(1999),
Rhizobium sp.
BR4301 Faria e
6395 II - Embrapa Rhizobium sp.
C. surinamensis BR4302 Mello
6423 Agrobiologia ((FJ025132)
BR4303(2) (1998),
Rhizobium sp.
Menna et
al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993)
De-Lajudie
et al.
(1998),
Faria
(1997),
Faria e
Mesorhizobium
Chamaecrista II - Embrapa Guedes
6392 BR3804 plurifarium
ensiformis Agrobiologia (1999),
(Y14159)
Faria e
Mello
(1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Bradyrhizobium
(1999),
6413 BR8402 III - Embrapa elkanii
Dalbergia nigra Faria e
6101 BR8404 Agrobiologia Bradyrhizobium
Mello
elkanii (M55490)
(1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)
Faria
Bradyrhizobium
(1997),
elkanii
Menna et
Dimorphandra 6099 BR5004 II - Embrapa (FJ3903941)
al. (2006)
jorgei 6400 BR5005 Agrobiologia Bradyrhizobium
e Moreira
elkanii
et al.
(FJ025114)
(1993)
Faria
(1997),
Faria e
Bradyrhizobium Guedes
elkanii (1999),
Enterolobium 6159 BR4406 III - Embrapa
(AJ003235) Faria e
contortisiliquum 6397? BR4407(2) Agrobiologia
Bradyrhizobium Mello
elkanii (1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Bradyrhizobium (1999),
elkanii Faria e
6159 BR4406 III - Embrapa (AJ003235) Mello
E. timbouva
6397 BR4407 Agrobiologia Bradyrhizobium (1998),
elkanii et al. Menna et
(FJ025139) al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993,
1998)
Faria
(2002),
Faria e
Guedes
Rhizobium sp. (1999),
6388 BR3611 III - Embrapa
E. verna Bradyrhizobium Menna et
6100 BR5609 Agrobiologia
elkanii (M55490) al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993,
1998)
Faria
(1997,
2000),
Faria e
Bradyrhizobium Guedes
Falcataria elkanii (M55490) (1999),
moluccana (syn. 6100 BR5609 Bradyrhizobium Faria e
III - Embrapa
Paraserianthes 6432 BR5611 elkanii (M55490) Mello
Agrobiologia
facataria, Albizia 6169 BR5612 Bradyrhizobium (1998),
falcata) elkanii Menna et
(FJ025110) al. (2006)
e Moreira
et al.
(1993,
1998)
Gliricidia sepium 6168 BR8801 III - Embrapa Rhizobium Faria
6435 BR8802 Agrobiologia leguminosarum (1997),
(AJ003239) Faria e
Rhizobium Guedes
leguminosarum (1999),
Faria e
Mello
(1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)
Faria
(1997),
Bradyrhizobium
Faria e
sp. (FJ025105)
6433 BR6609 III - Embrapa Guedes
Inga marginata Bradyrhizobium
6434 BR 6610 Agrobiologia (1999) e
elkanii
Faria e
(FJ390934)
Mello
(1998)
Faria
(1997),
Faria e
Ensifer Guedes
(Sinorhizobium) (1999),
Leucaena 6153 BR827(2) III - Embrapa
fredii (X67231) Faria e
diversifolia 6164 BR3608(2) Agrobiologia
Bradyrhizobium Mello
japonicum (1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)
Faria
(1997),
Faria e
Ensifer Guedes
L. leucocephala (Sinorhizobium) (1999),
6153 BR827 III - Embrapa
var. k72, k8, fredii (X67231) Faria e
6069 BR814(2) Agrobiologia
Peru Rhizobium sp. Mello
(D12788) (1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)
L. leucocephala 6069 DF-10/BR814 III - Embrapa Rhizobium sp. Moreira et
var. cunningham 6070 BR801 Cerrados e (D12788) al. (1993,
Agrobiologia Ensifer 1998)
(Sinorhizobium)
fredii (X67231)
Faria
(1997),
Faria e
Bradyrhizobium Guedes
elkanii (1999),
Lonchocarpus 6399 BR6009 II - Embrapa
(AJ003235) Faria e
costatus 6404 BR6010 Agrobiologia
Bradyrhizobium Mello
elkanii (1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Melanoxylon II - Embrapa Bradyrhizobium (1999),
6381 BR3901
brauna Agrobiologia japonicum Faria e
Mello
(1998) e
Moreira et
al. (1993)
Burkholderia
Chen et al.
gladioli
M. 6386 BR3460 II - Embrapa (2007) e
Burkholderia
bimucromanata 6421 BR3461 Agrobiologia Faria
nodosa
(1997)
(AY533861)
Chen et al.
(2008),
Faria
Burkholderia (1997),
M. 6382 BR3405 III - Embrapa sabiae Faria e
caesalpiniifolia 6410 BR3451 Agrobiologia (AY773185) Guedes
Burkholderia sp. (1999) e
Faria e
Mello
(1998)
Chen et al.
6417 BR3462 II - Embrapa Burkholderia sp. (2005) e
M. flocculosa
6422 BR3463 Agrobiologia Burkholderia sp. Faria
(1997)
Chen et al.
(2006),
Faria
(1997),
Burkholderia
III - Embrapa Faria e
M. scabrella 6165 BR3454 mimosarum
Agrobiologia Guedes
(AY533860)
(1999) e
Faria e
Mello
(1998)
Ochrobactrum
6393 BR4101 II - Embrapa Moreira
Ormosia nítida sp.
6394 BR4103 Agrobiologia (2001)
Burkholderia sp.
P. pterosperma 6415 BR9001 II - Embrapa Burkholderia sp. Faria
6416? BR9004(2) Agrobiologia Burkholderia sp. (1997),
Faria e
Guedes
(1999) e
Faria e
Mello
(1998)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Ensifer
(1999),
Parapiptadenia 6153? BR827 II - Embrapa (Sinorhizobium)
Faria e
rígida 6416 BR9002(2) Agrobiologia fredii (X67231)
Mello
Burkholderia sp.
(1998) e
Moreira et
al. (1993,
1998)
Faria
(1997),
Faria e
6385 (= BR3452
Piptadenia III - Embrapa Burkholderia Guedes
6167) UFC-832.55/
gonoacantha Agrobiologia Burkholderia sp. (1999) e
6398 BR4812
Faria e
Mello
(1998)
Faria
(1997),
Faria e
Rhizobium etli
Pithecellobium 6406 BR6812 II - Embrapa Guedes
(FJ025116)
tortum 6407 BR6813 Agrobiologia (1999) e
Methylobacterium
Faria e
Mello
(1998)
Poecilanthe 6403 BR8205 II - Embrapa Bradyrhizobium Faria
parviflora Agrobiologia japonicum (1997),
(FJ025112) Faria e
Guedes
(1999),
Faria e
Mello
(1998),
Menna et
al. (2006) e
Moreira et
al. (1993)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
Ensifer
(1999),
(Sinorhizobium)
BR4002 Faria e
6161 III - Embrapa sp. (AY904763)
Prosopis juliflora UFC- Mello
6162 Agrobiologia Ensifer
933.52/BR4007 (1998),
(Sinorhizobium)
Menna et
sp. (X90810)
al. (2006) e
Moreira et
al. (1993,
1998)
Faria
(1997),
Faria e
Pseudosamanea
6403 BR6205 III - Embrapa B. elkanii Guedes
(syn. Albizia)
6409 BR6821 Agrobiologia n.d (1999) e
guachapele
Faria e
Mello
(1998)
Samanea 6403 BR6205 III - Embrapa B. elkanii Faria e
saman 6405 BR6212 Agrobiologia B. elkanii Guedes
(FJ025109) (1999),
Faria e
Mello
(1998),
Menna et
al. (2006) e
Moreira et
al. (1993)
Faria
(1997),
Faria e
Guedes
B. elkanii
Sclerolobium 6420 BR3617 III - Embrapa (1999),
(M55490)
paniculatum 6413 BR8402(2) Agrobiologia Faria e
B. elkanii
Mello
(1998) e
Moreira et
al. (1993)
Faria
(1997),
Gonçalves
Azorhizobium
e Moreira
6401 Sm 1/BR5401 II - Embrapa doebereinerae
Sesbania virgata (2004) e
6402 Sm 5/BR5404 Agrobiologia (AJ003237)
Moreira et
(AY626222)
al. (1993,
1998,
2006)
II - Bradyrhizobium Menna et
Tipuana tipu 6192 Semia 6192
Fepagro/UFRGS sp. (AY904772) al. (2006)
I - Em tubos; II - Vasos de Leonard; III - Vasos com solo; IV - Experimentos de campo;
(1)
7. Considerações finais
8. Referências
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Capítulo 4
Análise de imagens para
acompanhamento da nodulação
em leguminosas
Mario de Andrade Lira Junior
Rinaldo Luiz Caraciolo Ferreira
Karina Patrícia Vieira da Cunha
Márcia do Vale Barreto Figueiredo
1. Introdução
1.1. Nodulação
2. Análise de imagens
3. Medições repetidas
5. Considerações finais
6. Referências
1. Introdução
3. O valor d
Por conveniência, a abundância natural de 15N é expressa em
unidades de d ( ‰), que é o desvio, em relação ao N2 atmosférico,
da razão entre as massas de 15N e 14N do nitrogênio contido na
amostra (SHEARER; KOHL, 1989):
7. Vantagens e desvantagens da
metodologia
Serra Remígio
Talhada
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Capítulo 6
Proteína do solo relacionada à
glomalina: uma alternativa para
avaliação da qualidade do solo
Cristiane Figueira da Silva
Jean Luiz Simões de Araújo
Eliane Maria Ribeiro da Silva
1. Introdução
Tabela 1. Curva padrão com BSA para quantificação de proteína pelo método Bradford.
Branco 0 0 200
Marrom 10–25
Preto 1–5
Fonte: adaptado de Bradford (1976) e Wright et al. (1996).
C) Desenvolvedor de cor
O desenvolvedor de cor deve ser preparado imediatamente antes
do uso; caso esteja analisando mais de uma placa ao mesmo
tempo, o desenvolvedor deve ser preparado para cada placa indivi‐
dualmente.
1) Preparo das soluções:
Tampão citrato: para 100 mL, utilizar 1,05 g de ácido cítrico e
ajustar o pH para 4 com NaOH 2 ou 6 N.
Solução de ABTS: utilizar 0,015 g de 2,2´azino-di-(ácido 3-
etilbezetiaolina sulfônico) em 1 mL de água.
Peróxido de hidrogênio: diluir 1:1.000 de H2O2 30% em PBS.
2) Preparar o desenvolvedor de cor de acordo com a Tabela 3.
10 200 10
5 100 5
2,5 50 2,5
Fonte: Wright et al. (1987, 1996).
3. Considerações finais
4. Referências
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Capítulo 7
Inoculantes de fungos
ectomicorrízicos
Cláudia Elizabete Pereira de Lima
Bartolomeu Acioli-Santos
Zaida Inês Antoniolli
Márcio José Rossi
1. Introdução
Componente Quantidade
NH4Cl 0,5 g
KH2PO4 0,5 g
MgSO4.7H20 0,5 g
Glicose 5,0 g
Tiamina – HCl 50,0 µg
Ágar 10,0 g
MNM PGK MC
Componente
(g/L)(1) (g/L) (g/L)
CaCl2 0,050 - -
NaCl 0,025 - -
(NH4)2HPO4 0,75 - -
NH2CONH2 - - 0,10
Na2Mo4.2H2O 0,00200
H3BO3 0,00300
CoCl2.6H2O 0,00003
KI 0,00075
Fonte: Rossi (2006).
2.1.1. Procedimento
1. Limpar os corpos de frutificação com ajuda de um pincel para
eliminar o solo agregado.
2. Esterilizar pinças e lâminas com álcool e fogo.
3. Abrir os corpos de frutificação com a mão (não usar lâmina)
para expor os tecidos internos.
4. Selecionar pequenas peças de tecido com o auxílio de pinças
ou do bisturi estéreis e depositar na superfície do meio Hagem
em placa.
5. Identificar as culturas.
6. Repetir essa operação com diferentes porções do corpo de
frutificação.
7. Incubar em temperatura constante (25 °C).
8. Observar diariamente para detectar o crescimento miceliano;
se necessário, retirar assepticamente uma porção do micélio e
examinar ao microscópio.
9. Repicar para meio MNM e incubar sob as mesmas condições.
10. Uma vez confirmado o isolamento, manter os isolados por
subcultura com repicagens periódicas para meio MNM (de 20 a
30 dias para utilização em cultivos e de 60 a 180 dias para
armazenamento).
11. Os corpos de frutificação devem ser herborizados em se‐
guida, para fins de identificação, colocando-se inicialmente em
sacos de papel e secando-se em estufa ventilada (de 35 ºC a
40 ºC). Em seguida, armazenar o material em armário seco
com naftalina ou cravo-da índia e, quando possível, depositar
uma amostra em herbário credenciado.
4. Inoculantes ectomicorrízicos
5.1.1.2. Procedimento
1. Cortar cerca de 55 discos de cultura com micélio e distribuir
em 2 placas com meio de cultura. Incubar durante 2 a 3 dias
para verificar a viabilidade por meio da visualização, sob lupa,
de hifas novas emergindo dos discos.
2. Preparar uma mistura de vermiculita e turfa na proporção de
4:1.
3. Distribuir essa mistura em frascos de vidro até 1/2 do volume.
Adicionar à mistura um volume de meio de cultura líquido de
45% do volume do substrato seco (225 mL para 500 mL de
substrato) (Figura 1).
5.2.1.2. Procedimento
1. Cortar cerca de 30 discos de cultura com micélio e distribuir
em 1 placa com meio de cultura. Incubar durante 2 a 3 dias
(Figura 2) para verificar a viabilidade por meio da visualização,
sob lupa, de hifas novas emergindo dos discos.
Figura 2. Representação da produção de inoculante de FEM em meio líquido. A partir da
cultura inicial, são feitos os discos de inóculo que, após a confirmação da viabilidade, são
inoculados em meio líquido em frascos. O micélio obtido é fragmentado em solução salina
onde, em seguida, adiciona-se o carvão ativo.
Ilustração: Márcio José Rossi.
5.3.1.1. Procedimento
1. Juntar a suspensão miceliana obtida pelo processo descrito
anteriormente com o alginato de sódio no frasco gotejador.
2. Montar o sistema para gotejamento (Figura 3) e ligar a agi‐
tação.
6. Considerações finais
7. Referências
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Capítulo 8
Microrganismos solubilizadores
de minerais
Newton Pereira Stamford
Ely Nahas
1. Introdução
Reagente Quantidade
NaCl 0,1 g
NH4 Cl 1,0 g
KCl 0,2 g
CaCl2.2H2O 0,1 g
MgSO4.7H2O 1,2 g
Glucose 10,0 g
Fonte de P(1) -
Ágar 20 g
K2HPO4 1,0
CaCl2 0,02
NH4Cl 0,1
Completar para 1.000 mL com água deionizada (ou destilada estéril) e ajustar o pH para
(1)
7,0.
Fonte: Starkey (1935).
Reagente Quantidade
KCl 0,1 g
K2HPO4 0,5 g
H2SO410N 1,0 mL
Reagente Quantidade
KCl 0,1 g
K2HPO4 0,5 g
H2SO410N 1,0 mL
H2O 700 mL
Reagente Quantidade
H2O 300 mL
pH P disponível K disponível
Ensaio Material usado
(H2O) g/kg
Apatita 5,4 10 -
Biofertilizante P 5,0 60 -
Placa de Petri
Biofertilizante K 3,9 - 3,2
KCl - - -
Apatita 5,4 10 -
Biofertilizante P 3,3 50 -
Campo (canteiros)
Biofertilizante K 3,0 - 1,5
4. Considerações finais
5. Referências
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Capítulo 9
Determinação da biomassa
microbiana do solo
Ademir Sérgio Ferreira de Araújo
Valdinar Bezerra dos Santos
Wanderley José de Melo
Philip C. Brookes
1. Introdução
em que
MSU = massa do solo úmido (g); MSS = massa do solo seco (g);
100 = fator para transformação em porcentagem.
Na determinação da capacidade de campo (CC), subamostra de
20 g de solo com umidade natural, em triplicata, deve ser colocada
sobre papel de filtro acondicionado em funil e montado sobre um
frasco coletor previamente pesado. Adicionam-se, lentamente, 100 g
de água deionizada pesada em balança analítica e deixa-se por
uma noite. Cobrir o conjunto com papel alumínio ou filme plástico,
para evitar evaporação. Após esse período, dar uma pequena batida
na haste do funil para liberar as últimas gotas de água. Pesar
novamente o frasco coletor. A testemunha (sem solo), em triplicata,
deve ser procedida da mesma forma.
em que
CC = capacidade de campo (%); MAP = massa da água percolada
(g); U = umidade inicial do solo (%); MSS = massa do solo seco (g);
100 = fator para transformação em porcentagem.
3.1.1. Princípio
A fumigação-incubação foi o método pioneiro de quantificação da
BMS. O método consiste na fumigação do solo com clorofórmio
(CHCl3) causando um fluxo de CO2 e NH4 após a remoção do
fumigante e posterior incubação do solo. O fluxo é gerado pela
decomposição dos microrganismos mortos pela fumigação.
3.1.2. Metodologia
A amostra de solo é dividida em subamostras, em três repeti‐
ções, que passarão por fumigação seguida por incubação
(subamostra fumigada) ou incubação imediata (subamostra não
fumigada). O procedimento consiste na fumigação das subamostras,
por 24 horas, com clorofórmio isento de etanol. Acondicionam-se 25
g de solo em frasco (capacidade de 60 mL a 100 mL), sendo, em
seguida, transferidos para dessecador juntamente com um frasco
com água e um outro contendo 25 mL de clorofórmio isento de
etanol, permanecendo sob fumigação em sala de incubação
mantida no escuro, com temperatura controlada (25 ºC a 28 ºC), por
24 horas. Em seguida, o clorofórmio é removido por aspirações
sucessivas, aproximadamente 6 aspirações.
em que
Cmicrobiano = carbono da biomassa microbiana (µg/g); CO2 F = CO2
liberado das amostras fumigadas (mg CO2/g solo/dia); CO2 NF =
CO2 liberado das amostras não fumigadas (mg CO2/g solo/dia); KIC =
0,41 (constante de incubação a 22 oC); KIC = 0,45 (constante de
incubação a 25 oC).
3.2.1. Princípio
A fumigação do solo com clorofórmio promove a lise celular dos
microrganismos com consequente liberação do citoplasma para o
ambiente. Assim, o C, N e P podem ser extraídos por K2SO4 e
quantificados, estimando o C, N e P da BMS.
3.2.2. Metodologia
A amostra de solo é dividida em subamostras, em três repeti‐
ções, que passarão por fumigação seguida de extração (subamostra
fumigada) ou extração imediata (subamostra não fumigada). O
procedimento consiste na fumigação das subamostras, por 24
horas, com clorofórmio isento de etanol. Acondicionam-se 20 g de
solo em frasco (capacidade de 60 mL a 100 mL), sendo, em
seguida, transferidos para dessecador juntamente com um frasco
com água e um outro contendo 25 mL de clorofórmio isento de
etanol, permanecendo sob fumigação em sala de incubação
mantida no escuro, com temperatura controlada de 25 ºC a 28 ºC,
por 24 horas. Em seguida, o clorofórmio é removido por aspirações
sucessivas (aproximadamente 6 aspirações).
As amostras fumigadas e não fumigadas são submetidas à
extração com 80 mL K2SO4 0,5 mol/L por 30 minutos, em agitador
rotatório circular. Deve-se observar que a proporção solo:extrator
deve ser 1:4. Deixar decantar e filtrar em papel de filtro. O extrato
pode ser armazenado em refrigerador por, no máximo, uma
semana. Entretanto, o ideal é que seja quantificado logo após a
extração.
em que
Npadronizada = normalidade padronizada do sulfato ferroso amoniacal;
Vdicromato = volume do dicromato de potássio usado (2 mL); Cdicromato =
concentração do dicromato de potássio usada (0,066 mol/L); Vgasto =
volume do sulfato ferroso gasto na prova em branco (L).
O C extraído do solo é calculado pela equação 7.
em que
C extratos F e NF = carbono dos extratos fumigados e não
fumigados (ug/g); Vbranco = volume do (NH4)2Fe(SO4)2 gasto na
titulação da solução controle (branco) (mL); Vamostra = volume do
(NH4)2Fe(SO4)2 gasto na titulação da amostra (mL); N = normalidade
padronizada do (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O (calculada na equação 6);
Vextrator = volume do extrator (mL); Vextrato = volume do extrato (mL);
MSS = massa de solo seco (g).
O Cmic é calculado pela equação 8.
em que
Cmic = carbono microbiano (μg/g); C extrato F = carbono do extrato
fumigado (μg/g); C extrato NF = carbono do extrato não fumigado (μg/g);
KEC = constante proposta por 0,38.
É recomendado que o volume gasto de sulfato ferroso amoniacal
na titulação das amostras fumigadas e não fumigadas esteja entre
10% e 75% do valor do branco, conforme equação.
em que
N extrato F e NF = nitrogênio microbiano (μg/g); Vamostra = volume do HCl
gasto na titulação da amostra (mL); Vbranco = volume do HCl gasto na
titulação da solução controle (branco) (mL); N = normalidade
padronizada do HCl; 14 = massa do nitrogênio (g); 1.000 = fator
para conversão em micrograma; Vextrator = volume do extrator (L);
Vextrato = volume do extrato (L); MSS = massa de solo seco (g).
O Nmic é calculado pela equação 11:
em que
Nmic = nitrogênio microbiano (μg/g); Nextrato fumigado = nitrogênio do
extrato fumigado (μg/g); Nextrato não fumigado = nitrogênio do extrato não
fumigado (μg/g); KEN = 0,45.
3.2.5.2. Procedimento
Adicionar 1 mL de ácido clorídrico (5 mol/L) a 10 mL de água, em
frasco volumétrico. Em seguida, 10 mL do extrato de solo extraído
por Olsen ou o branco, apenas o reagente de Olsen, são
adicionados ao frasco. Após cessar a efervescência do conteúdo no
frasco, adicionar 8 mL do reagente de Murphy-Riley e misturar. Após
cessar a efervescência do conteúdo no frasco, o volume é ajustado
para 100 mL. A leitura é feita em espectrofotômetro a 710 nm ou
882 nm.
O Pmic é calculado pela equação a seguir.
3.3.1. Princípio
Ninidrina forma um complexo púrpuro com moléculas contendo
aminoácidos, proteínas e peptídeos. A quantidade de compostos
reativos com a ninidrina, liberados pela BMS após a fumigação, é
fortemente correlacionada com o conteúdo de C da biomassa micro‐
biana (AMATO; LADD, 1988).
3.3.2. Metodologia
Utilizando o extrato de solo após a extração com K2SO4, retira-se
uma alíquota de 0,6 mL do extrato + 1,4 mL de ácido cítrico (0,2
mol/L), pH 5,0, e adiciona-se em tubo de ensaio de 20 mL. Em
seguida, adiciona-se, lentamente, 1 mL de reagente ninidrina. O
tubo é incubado a 100 oC, em banho-maria, por 25 minutos. Após
resfriamento, adiciona-se 4 mL da mistura etanol:água (1:1) e
procede-se a leitura em espectrofotômetro a 570 nm. Os resultados
são comparados a uma curva padrão de leucina.
Cálculos:
em que
N-ninF = quantidade de compostos reativos à ninidrina (µg/g solo) na
amostra fumigada; N-ninNF = quantidade de compostos reativos à
ninidrina (µg/g solo) na amostra não fumigada; 20,5 = fator de
correção para Cmic; 6,5 = fator de correção para Nmic.
em que
P = potência real do aparelho (W); Cp = 1 J/mL/ok, capacidade da
água de receber calor; K = 4,184, fator de correção de cal/m/oK para
Watts (J/s); ∆t = variação de temperatura de 1 L de água em 2
minutos de exposição, em oC; m = 1.000, massa da água (g); t =
120, tempo de exposição da água ao micro-ondas (s).
Em seguida determinar o tempo de exposição das amostras de
solo à irradiação do micro-ondas pela equação 16.
em que
t = tempo real de exposição das amostras ao micro-ondas (s); r =
800 J/g de solo, quantidade de energia necessária para a
exposição; mt = peso total das amostras a serem irradiadas (g); P =
potência real do aparelho (W).
3.6.2. Reagentes
Tampão fosfato – (8,7 g K2HPO4 em 1 L de água deionizada) com
pH ajustado para 7,4 com HCl 1 mol/L.
Cellite 545 (diatomaceous silica).
3.6.3. Separação dos fosfolipídios
Os lipídios são fracionados em colunas com glicol e fosfolipídios
sobre sílica (SPE-Si, Supelco, Bellefonte, USA). As colunas são
conectadas a bombas de vácuo.
Extração dos PFLAs – inicialmente, 2 mL de metanol são adicio‐
nados às colunas e succionados pela bomba de vácuo, para
condicionamento da coluna. Em seguida, 1 mL de clorofórmio é
adicionado e passa pela coluna por gravidade. O procedimento é
repetido mais uma vez, com adição de 2 mL de água no intervalo. A
fração lipídica é dissolvida em clorofórmio (200 µL) sendo
adicionada no tubo. O tubo é lavado 3 vezes com 200 mL. Os
lipídios são eluídos com clorofórmio, e os glicolipídios e fosfolipídios
são eluídos com acetona-metanol (1:1). Em cada caso, alíquotas de
1 mL e 3 separações são usadas. As 3 frações são separadas em
tubos de vidro, e os solventes evaporados sob N2. Os resíduos são
armazenados a -20 oC, até a análise.
A fração de PLFA é dissolvida em metanol:tolueno (1:1 v:v) e
adicionada a 0,5 mL de KOH 0,2 mol/L. Os tubos são selados com
PTFE, agitados em vórtex e aquecidos (37 oC, 15 minutos) em
chapa aquecedora. Em seguida, os tubos são esfriados à
temperatura ambiente e neutralizados com 0,5 mL de ácido acético
0,2 mol/L. Após isso, são adicionados 2 mL de clorofórmio e 2 mL
de água e agitados em vórtex. A mistura é separada em 2 fases. A
separação pode ser melhorada utilizando uma centrifugação a 2.500
rpm por 5 minutos. A solução com clorofórmio é transferida para
tubos limpos, utilizando pipeta Pasteur, e evaporada sob N2.
6. Referências
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Parte 5
Técnicas biotecnológicas
aplicadas à agricultura
Capítulo 1
Produção de biolarvicidas à base
de Bacillus sphaericuse Bacillus
thuringiensis var. israelensis para
o controle de insetos
Christine Lamenha Luna Finkler
Amaro de Castro Lira Neto
Carlos Henrique Madeiros Castelletti
Liane Maria de Almeida Castro Maranhão
1. Introdução
2. Técnicas de preservação
Componente Quantidade
Extrato de levedura 5,0 g
Extrato de carne 3,0 g
Peptona de carne 5,0 g
Água destilada 1.000 mL
pH 7,0
3.2. Inóculo II
Componente Quantidade
Sulfato de zinco 10 g
Sulfato ferroso 10 g
Sulfato de manganês 10 g
Água destilada (1)
1.000 mL
(1)
Adicionar 1 mL de ácido sulfúrico.
6. Considerações finais
7. Referências
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283, 1987.
Capítulo 2
Controle biológico de pragas:
considerações e aplicabilidade em
Pernambuco
Deise Maria Passos da Silva
Vanildo Alberto L. B. Cavalcanti
Romualdo Camelo Sena
Geraldo Pereira de Arruda
1. Introdução
3.1. Cigarrinhas-da-cana-de-açúcar
D. flavipennella(2) 4a8 25 a 27 10 a 17 7
(1)
Ciclo médio de 52 a 62 dias. Podem ocorrer até 4 gerações/ano dessa espécie, e a
lagarta
poderá também entrar em diapausa por um período de 100 a 150 dias, com predomínio de
inverno frio e/ou seco.
(2)
Ciclo médio de 39 a 51 dias.
Fonte: adaptado de Guagliumi (1969).
em que
I = intensidade de infestação; Ib = nº de internódios brocados; Ic =
nº total de internódios contados na amostra.
Após as análises dos dados e catalogação dos resultados,
determina-se o grau de infestação, utilizando a Tabela 2.
0 a 25 0a5 Baixo
26 a 50 6 a 10 Moderado
51 a 75 11 a 15 Mediano
76 a 95 16 a 25 Elevado
96 a 100 Além de 26 Muito elevado
Fonte: adaptado de Guagliumi (1969).
4. Considerações finais
5. Referências
1. Introdução
2.2. Desinfestação
2.3. Isolamento
Inorgânico
NH4NO3 1.650
KNO3 1.900
KH2PO4 170
KI 0,83
H3BO3 6,2
Orgânico
Inositol 100
Tiamina Hl 0,1
Glicina 2,0
Sacarose 30.000
Ágar 0,8%
Fonte: Murashige e Skoog (1962).
2.4.1.1. Água
A água é o componente de maior quantidade no meio. É uma
fonte potencial de impurezas que podem afetar o crescimento de
tecidos in vitro. A água destilada e deionizada, ou bidestilada,
normalmente, é suficiente pura para uso nos meios. No entanto,
dependendo da fonte da água do laboratório (poço artesiano, por
exemplo), podem ser encontrados contaminantes orgânicos voláteis,
que permanecem após a destilação e inibem o crescimento das
culturas.
2.4.1.2. Macronutrientes
Os nutrientes empregados nos meios de cultura são os mesmos
estabelecidos para a nutrição mineral básica das plantas no campo.
Os elementos exigidos em maiores quantidades para o cresci‐
mento de plantas inteiras são incluídos nos meios nutritivos na
forma de sais inorgânicos; são eles o nitrogênio, fósforo, potássio,
cálcio, magnésio e enxofre.
2.4.1.3. Micronutrientes
Os micronutrientes incluem todos aqueles elementos minerais
aceitos atualmente como essenciais para plantas clorofiladas
(manganês, zinco, boro, cobre, cloro, ferro e molibdênio, além do
cobalto e iodo).
2.4.1.4. Carboidratos
As células, tecidos e plântulas cultivadas in vitro não encontram
condições adequadas de iluminação e concentração de CO2 e, às
vezes, não apresentam teores de clorofila suficiente para realizar
fotossíntese que sustenta o crescimento. Portanto, a sacarose é o
carboidrato mais utilizado nos meios nutritivos, sendo que esse
açúcar suporta as mais altas taxas de crescimento na maioria das
espécies. A concentração de sacarose também é um fator
importante para obter crescimento ótimo, dependendo do explante.
Os carboidratos mais usados nos meios de cultura são a saca‐
rose, a glicose e a frutose nos níveis de 2% a 5% (p/p) (GEORGE,
1993). A concentração de 3% é a mais usada. Concentrações de
sacarose entre 6% e 12% podem ser usadas em cultura de em‐
briões, frutos e anteras, enquanto que o nível de 1,5% é usado em
cultura de protoplastos.
No que se refere à concentração de sacarose, para a palma
forrageira, Vasconcelos et al. (2002) observaram as maiores
porcentagens de multiplicação no material cultivado com 30 g/L de
sacarose. Entretanto, diversos autores (ESCOBAR et al., 1986;
LLAMOCA-ZÁRATE, 1999; VILLALOBOS et al., 2001) relatam que,
para cactáceas do gênero Opuntia, a concentração ideal de
sacarose é de 50 g/L.
A sacarose, além de fornecer energia metabólica e esqueleto
carbônico para uma diversidade de compostos orgânicos, desempe‐
nha um importante papel como componente do potencial osmótico
do meio de cultura.
2.4.1.5. Vitaminas
Os primeiros estudos com cultura de raízes definiram a mistura
básica de vitaminas utilizadas até hoje. Essa mistura consiste de
tiamina (vitamina B1), ácido nicotínico (niacina) e piridoxina (vitamina
B6), a qual normalmente se adiciona o aminoácido glicina.
2.4.1.6. Mio-Inositol
O mio-inositol é um componente do meio MS e da maioria dos
outros meios em uso atualmente. A concentração mais usada de
mio-inositol nos meios é de 100 mg/L.
2.4.1.9. pH
O pH dos meios nutritivos em culturas de células vegetais é
normalmente ajustado com HCl ou NaOH, depois de adicionar todos
os componentes para um valor ligeiramente ácido, entre 5 e 6,
normalmente 5,8 (TORRES et al., 1998). Recomenda-se este valor
para formulações líquidas. Em meios gelificados com ágar, o pH
deve ser ajustado em 5,7, pois em pH 5,0 ocorre a hidrólise de
polissacarídeos, enquanto que em pH 6,0–6,2 verifica-se a
precipitação de sais. No ajuste do pH, lava-se primeiramente o
eletrôdo, e, em seguida, faz-se a leitura em tampão 4,0.
Posteriormente lava-se o eletrôdo e dessa maneira o potenciômetro
estará calibrado para uso. O pH varia durante o período de cultura.
2.4.2. Preparação dos meios
Em diferentes laboratórios, procedimentos diversos são utilizados
para preparar os meios nutritivos. Normalmente, mantêm-se
soluções estoque dos sais minerais na geladeira em concentrações
mais elevadas, a partir das quais a preparação do meio é efetuada.
O preparo de soluções estoque tem por objetivo facilitar o
preparo final dos meios de cultivo e precisão na dosagem dos
componentes.
Normalmente mantêm-se os macronutrientes em soluções
estoque em concentrações 10 vezes superiores ao da concentração
final (TORRES et al., 1998). Os micronutrientes são mantidos em
concentração estoque, 1.000 vezes superior à concentração final; e
os quelatos EDTA Fe são mantidos em solução estoque 50 vezes
superior. As porções são mantidas em geladeira e por um período
não superior a uma semana para a maioria das soluções estoque,
principalmente aquelas que apresentam precipitação.
Soluções estoque das vitaminas podem ser mantidas na gela‐
deira ou no congelador; a sacarose e o mio-inositol, que são
utilizados em quantidades elevadas, são pesados sempre que se
prepara um meio nutritivo.
Após preparação, os meios são esterilizados após serem distri‐
buídos nos frascos ou vasilhames de cultura, por autoclavagem, a
121 oC (1 kg/cm2) por 15 a 20 minutos.
5. Aclimatização
6. Considerações finais
A micropropagação convencional, pelo cultivo sequenciado de
explantes em meio semissólido, promove uma taxa de multiplicação
bem superior à propagação convencional da palma forrageira, entre‐
tanto técnicas precisam ser mais estudas de forma a aumentar essa
taxa de multiplicação e eficiência no enraizamento.
Para cultura da palma forrageira, é clara a variabilidade existente
entre genótipos em resposta ao cultivo in vitro.
7. Referências
1. Introdução
PB (%) 11 a 16 14,2
Almeida (1997), Carvalho (1995), Inácio Neto (1999), Oliveira (1998), Pereira (1995) e
(2)
Reis (1996).
Ureia(1) 15 1,5
Tabela 3. Valores de proteína bruta (PB) e proteína microbiana (PV) após fermentação.
Original Modificada
Ureia(1) 15 8
Suplemento mineral 3 8
Sulfato de magnésio(2) 2 2
Cloreto de sódio 2 2
MAP(3) - 7
Suplemento mineral – Suprafós 130 ou Guyo sal 900 ou Fosbovi 30.
(1)
Pecuária ou fertilizante.
(2)
Fertilizante.
(3)
Fosfato monoamônico fertilizante.
Fonte: Tabosa (2009).
Tabela 5. Teores de proteína bruta (PB), proteína verdadeira (PV) e PV/PB, em diferentes
amostras de sacharina de cana sob formulação modificada.
Tamanho de partículas
PB PV PB PV PB PV
Ureia(1) 8,0
Tabela 10. Resultados obtidos de proteína bruta, microbiana, FDN (fibra em detergente
neutro) e FDA (fibra em detergente ácido).
Tabela 11. Resultados obtidos via fermentação em estado sólido – resíduos vegetais da
Ceasa.
6. Considerações finais
7. Referências
1. Introdução
2. Procedimento experimental
Existem dezenas de roteiros utilizados para a separação dos
constituintes de uma mistura em que se desconhece a natureza das
substâncias. O importante a ser observado é que a separação seja
feita de maneira sistematizada.
Quando há necessidade de extrair os constituintes de uma mis‐
tura, é importante que se consiga, pelo menos, separar as diversas
substâncias agrupando-as em uma mesma função orgânica; e é
baseado nesse princípio que se utiliza a marcha química. O material
previamente seco e moído é extraído, normalmente, com três tipos
de solventes: extração com benzeno, clorofórmio e etanol, traba‐
lhando-se, portanto, com três extratos, independentemente.
A palavra extrato está sendo utilizada para indicar o produto de
uma extração com um determinado solvente e cujo solvente foi
evaporado, trata-se, portanto, de um resíduo (geralmente pastoso)
que não mais contém o solvente que foi utilizado para a extração.
Quando se faz referência, por exemplo, a um extrato benzênico,
tratase de um material que foi extraído com benzeno, mas que não
contém benzeno. Quando se trabalha com misturas que não são
solúveis em solventes orgânicos não se deve utilizar o termo
extrato, e sim, solução.
A metodologia a seguir descrita pode ser aplicada a qualquer tipo
de extrato.
Método 2.1
Colocar o extrato em funil de decantação. Adicionar cerca de
10% do volume do extrato e uma solução de ácido clorídrico a 3%.
Agitar, pelo menos, 5 vezes. Separar as 2 fases (camada aquosa e
extrato) e reservar o extrato. À solução aquosa, adicionar uma
solução de hidróxido de sódio a 3% (ou hidróxido de amônio),
sempre agitando, até ficar com pH 7. Extrair com clorofórmio, em
pequenos volumes, até a solução clorofórmica ficar incolor.
Nesta etapa, há 2 tipos de solução: solução aquosa (desprezar)
e solução clorofórmica. À solução clorofórmica, adicionar 10,0 g de
sulfato de sódio anidro, agitar e filtrar. Evaporar a solução
clorofórmica até secura, sempre observando se ocorre uma
cristalização. Se houver formação de cristais, parar o processo de
evaporação e filtrar, a fim de separar os cristais. Se não cristalizar,
continuar a evaporação, a fim de se obter um resíduo contendo as
bases.
Método 2.3
Colocar o extrato do método 2.2 em funil de decantação. Adicio‐
nar cerca de 10% do volume do extrato e 20,0 mL de uma solução
concentrada de carbonato de sódio. Agitar, pelo menos, 5 vezes.
Separar as 2 fases (camada aquosa e extrato) e reservar o extrato.
À solução aquosa, adicionar uma solução de ácido clorídrico a 3%,
até ficar com pH 7. Extrair com clorofórmio, em pequenos volumes,
até a solução clorofórmica ficar incolor.
Nesta etapa, há 2 tipos de solução: solução aquosa (desprezar)
e solução clorofórmica. À solução clorofórmica, adicionar 10,0 g de
sulfato de sódio anidro, agitar e filtrar. Evaporar a solução
clorofórmica à secura, sempre observando se ocorre uma
cristalização. Se houver formação de cristais, parar o processo de
evaporação e filtrar, a fim de separar os cristais. Se não cristalizar,
continuar a evaporação, a fim de obter um resíduo contendo uma
mistura de ácidos carboxílicos e fenóis.
2.4. Tratamento com hidróxido de sódio – NaOH
Método 2.4
Colocar o extrato do método 2.3 em funil de decantação. Adicio‐
nar cerca de 10% do volume do extrato e 10,0 mL de uma solução
de hidróxido de sódio a 3%. Agitar, pelo menos, 5 vezes. Separar as
2 fases (camada aquosa e extrato) e reservar o extrato. À solução
aquosa, adicionar uma solução de ácido clorídrico a 3%, até ficar
com pH 7. Extrair com clorofórmio, em pequenos volumes, até a
solução clorofórmica ficar incolor.
Nesta etapa, há 2 tipos de solução: solução aquosa (desprezar)
e solução clorofórmica. Na solução clorofórmica, adicionar 10,0 g de
sulfato de sódio anidro, agitar e filtrar. Evaporar a solução
clorofórmica à secura, sempre observando se ocorre uma
cristalização. Se houver formação de cristais, parar o processo de
evaporação e filtrar, a fim de separar os cristais. Se não cristalizar,
continuar a evaporação, a fim de obter um resíduo contendo uma
mistura de ácidos carboxílicos fracos e lactonas.
Reagente T (trimetilamônioacetilhidrazida)
(CH3)3N+-CH2-CONHNH2
(CH3)2N-CH2-CONHNH2
São compostos facilmente sintetizados.
Método 2.7
Colocar o extrato do método 2.6, alternativa 2, em funil de
decantação. Adicionar 5,0 g de ureia e 20,0 mL de água deionizada.
Separar em funil de decantação, obtendo-se camada aquosa e
extrato.
Camada aquosa – Destilar, obtendo-se os hidrocarbonetos alifá‐
ticos não ramificados ou com substituintes aromáticos em um dos
carbonos primários.
Extrato – Reservar e adicionar tioureia. Adicionar água
deionizada. Separar em funil de decantação, obtendo-se duas
camadas: a camada aquosa é destilada, obtendo-se os
hidrocarbonetos ramificados.
3. SCREEN
pH = 3 pH = 8,5 pH = 11
Antocianinas
Vermelha Lilás Azul-púrpura
Antocianidinas
Flavonas
Flavonóis - - Amarela
Xantonas
Chalconas
Vermelha Vermelho-púrpura
Auronas
5.1. Dowex
5.2. Amberlite IR 45
Alternativa
Aminoácido
1 2 3 4
Ácido aspártico x
Ácido glutâmico x
Alanina x x x
Arginina x
Asparagina
Cisteína
Cistina
Fenilalanina x
Glicina x
Hidroxiprolina x
Histamina x
Histidina x
Isoleucina x
Leucina x
Metionina x x
Prolina x
Serina x
Tirosina x x
Treonina x x
Valina x x
6. Referências
1. Introdução
2. Aplicações da quitosana
3. Caracterização da quitosana
1.655 (amida I) νC = O
2.888 ν C-H
3.450 ν O-H
em que
A1.655 é a absorbância no número de onda 1.655 cm-1 obtida
utilizando a linha de base (a) proposta por Domszy e Roberts
(1985). Essa banda de absorção é característica da vibração entre
os átomos de carbono e oxigênio (VC = O) do grupo amida I da quitina
residual presente na quitosana. A 3.450 é a banda de absorção no
número de onda 3.450 cm-1 correspondente ao estiramento OH e a
deformação axial NH do grupo amina presente na quitosana. O
número 1,33 equivale ao valor de A1.655/A3.450 encontrado na quitina
pura. Pode-se visualizar nas Figuras 1 e 2 o traçado das diferentes
linhas de base.
em que
A 1.655 é a absorbância no número de onda 1.655 cm-1 obtido
utilizando a linha de base (b) proposta por Baxter et al. (1992), e A
3.450 é a absorbância medida no número de onda 3.450 cm
-1
em que
GD é o grau médio de desacetilação; V1 é o volume de base usado
para a neutralização de HCl em excesso (mL); V2 – V1 é o volume
de base usado para a neutralização dos grupos ácidos de quitosana
(mL); [base] é a concentração da base usada; e m é a massa da
amostra de quitosana.
3.4. Cristalinidade
em que
em que
5. Considerações finais
6. Referências
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Capítulo 2
Capítulo 3
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3 Disponível em: <http://www.plantgdb.org>.
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Capítulo 6
Capítulo 7
Parte 4
Capítulo 1
Capítulo 1