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SAÚDE E MEDICAMENTOS Copyright © 2019

Os autores, alguns

Porphyromonas gingivalis em cérebros com doença de Alzheimer: evidências direitos reservados;

licenciado exclusivo

para a causa da doença e tratamento com inibidores de pequenas moléculas American Association
para o avanço
da Ciência. Nenhuma reivindicação

ao governo dos EUA original

Trabalho. Distribuído
Stephen S. Dominy 1 * †, Casey Lynch 1 *, Florian Ermini 1, Malgorzata Benedyk 2,3, Agata Marczyk 2,
sob um criativo
Andrei Konradi 1, Mai Nguyen 1, Ursula Haditsch 1, Raha humilde 1, Christina Griffin 1, Atribuição de Commons

Leslie J. Holsinger 1, Shirin Arastu-Kapur 1, Samer Kaba 1, Alexander Lee 1, Mark I. Ryder 4, Licença 4.0 (CC BY).

Barbara Potempa 5, Piotr Mydel 2,6, Annelie Hellvard 3,6, Karina Adamowicz 2, Hatice Hasturk 7,8,
Glenn D. Walker 9, Eric C. Reynolds 9, Richard LM Faull 10, Maurice A. Curtis 11,12,
Mike Dragunow 11,13, Jan Potempa 2,5 *

Porphyromonas gingivalis, o patógeno fundamental na periodontite crônica, foi identificado no cérebro de pacientes com doença de Alzheimer. As proteases
tóxicas da bactéria chamada de papa também foram identificadas no cérebro de pacientes com Alzheimer, e os níveis se correlacionaram com a patologia de tau e
ubiquitina. Oral P. gingivalis infecção em camundongos resultou em
colonização do cérebro e aumento da produção de A • 1-42, um componente das placas amilóides. Além disso, as gengivas eram neurotóxicas in vivo e in vitro,
exercendo efeitos prejudiciais sobre a tau, uma proteína necessária para a função neuronal normal.
ção. Para bloquear essa neurotoxicidade, projetamos e sintetizamos inibidores de pequenas moléculas que visam a gengiva.
A inibição da gengipaina reduziu a carga bacteriana de uma P. gingivalis infecção cerebral, bloqueado A • 1-42 produção, neuroinflamação
reduzida e neurônios resgatados no hipocampo. Estes dados sugerem que gin-
inibidores de gipain podem ser valiosos para o tratamento P. gingivalis colonização cerebral e neurodegeneração na doença de Alzheimer.

INTRODUÇÃO
Pacientes com doença de Alzheimer (DA) apresentam neuroinflamação consistente com
infecção, incluindo ativação microglial, ativação do inflamassoma, ativação do
complemento e perfis alterados de citocinas ( 1, 2). Agentes infecciosos foram encontrados
no cérebro e postulados como estando envolvidos com AD, mas evidências robustas de
causalidade não foram estabelecidas ( 3). A recente caracterização de amilóide • ( UMA •)
Escalas de Mini Exame do Estado Mental) ao longo de um período de 6 meses em comparação
com pacientes com DA sem CP ativa, levantando questões sobre possíveis mecanismos
subjacentes a esses achados ( 13). No Apoe - / - ratos, infecção oral com P. gingivalis, mas não
com duas outras bactérias orais, resulta em infecção cerebral e ativação da via do
complemento ( 14). Em camundongos transgênicos com superexpressão da proteína precursora
de amiloide humana mutada (hAPP-J20), infecção oral com P. gingivalis

como um peptídeo antimicrobiano renovou o interesse na identificação de uma possível causa
infecciosa de DA ( 4-6).
Periodontite crônica (PC) e infecção com Porphyromonas gingivalis— um
patógeno fundamental no desenvolvimento de CP ( 7) -
foram identificados como fatores de risco significativos para o desenvolvimento de A •
placas, demência e DA ( 8-12). Um estudo observacional prospectivo de pacientes
com DA com CP ativa relatou um declínio notável na cognição (Escala de Avaliação
da Doença de Alzheimer - Cognitiva e
1 Cortexyme, Inc., 269 East Grand Ave., South San Francisco, CA, EUA. 2 Departamento de Microbiologia,
Faculdade de Bioquímica, Biofísica e Biotecnologia, Universidade Jagiellonian, Cracóvia, Polônia. 3 Malopolska
Center of Biotechnology, JagiellonianUniversity, Cracóvia, Polônia. 4 Divisão de Periodontologia, Departamento
de Ciências Orofaciais, Universidade da Califórnia, São Francisco, São Francisco, CA, EUA. 5 Departamento de
Imunologia Oral e Doenças Infecciosas, Escola de Odontologia da Universidade de Louisville, Louisville, KY,
EUA. 6 Laboratório de Pesquisa Broegelman, Departamento de Ciências Clínicas, Universidade de Bergen,
Bergen, Noruega. 7 The Forsyth Institute, Cambridge, MA, EUA. 8 HarvardUniversity School of Dental Medicine,
Boston, MA, EUA. 9 Cooperative Research Centre for Oral Health Science, Melbourne Dental School e o Bio21
Institute ofMolecular Science and Biotechnology, University ofMelbourne, Melbourne, Victoria, Austrália. 10 Departamento
de Anatomia com Radiologia, Centro de Pesquisa do Cérebro e NeuroValida, Faculdade de Ciências Médicas e
da Saúde, Universidade de Auckland, Auckland, Nova Zelândia. 11 Centro de Pesquisa do Cérebro e
NeuroValida, Faculdade de Ciências Médicas e de Saúde da Universidade de Auckland, Auckland, Nova
Zelândia. 12 Departamento de Anatomia e Imagens Médicas, Faculdade de Ciências Médicas e da Saúde,
Universidade de Auckland, Auckland, Nova Zelândia. 13 Departamento de Farmacologia, Faculdade de Ciências
Médicas e da Saúde, Universidade de Auckland, Auckland, Nova Zelândia.
prejudica a função cognitiva, aumenta a deposição de placas semelhantes a AD e resulta em
perda óssea alveolar em comparação com camundongos hAPP-J20 de controle ( 15). P.
gingivalis lipopolissacarídeo foi detectado em cérebros humanos com DA ( 16), promovendo a
hipótese de que P. gingivalis
infecção do cérebro desempenha um papel na patogênese da DA ( 17).
P. gingivalis é encontrada principalmente durante infecções gengivais e periodontais; no entanto,
também pode ser encontrado em níveis baixos em 25% dos indivíduos saudáveis com doença oral ( 18).
Bacteremia transitória de P. gingivalis
pode ocorrer durante atividades comuns, como escovar, passar fio dental e mastigar, bem como
durante procedimentos odontológicos ( 19), resultando na translocação documentada para uma
variedade de tecidos, incluindo artérias coronárias ( 20), placenta ( 21), e fígado ( 22). Um estudo
recente descobriu que 100% dos pacientes com doença cardiovascular tinham P. gingivalis colonização
arterial ( 23).
P. gingivalis é um bactéria anaeróbia Gram-negativa assacarolítica que produz os
principais fatores de virulência conhecidos como gingipaina, que são proteases de
cisteína consistindo de lisina-gingipaina (Kgp), arginina-gengipaina A (RgpA) e
arginina-gingipain B (RgpB). As gengivas são secretadas, transportadas para as
superfícies da membrana bacteriana externa e parcialmente liberadas no meio
extracelular em formas solúveis e de vesícula da membrana externa (OMV) ( 24, 25).
Kgp e RgpA / B são essenciais para P. gingivalis sobrevivência e patogenicidade, desempenhando
papéis críticos na colonização do hospedeiro, inativação das defesas do hospedeiro, aquisição de ferro

* Esses autores contribuíram igualmente para este trabalho como co-autores seniores. †Autor
e nutrientes e destruição de tecidos ( 24, 26).
correspondente. Email: sdominy@cortexyme.com
Demonstrou-se que as gengipinas mediam a toxicidade de P. gingivalis

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em células endoteliais, fibroblastos e células epiteliais ( 27–29). Além disso, porque o
tratamento com antibióticos de amplo espectro raramente erradica P. gingivalis e pode
levar à resistência ( 30), gingipains estão implicados como alvos de virulência de espectro
estreito ( 24, 31–33).
O bloqueio da atividade proteolítica da gingipaina com análogos de peptídeos curtos reduz P.
gingivalis virulência ( 34).
Nós formulamos a hipótese de que P. gingivalis a infecção atua na patogênese da DA por
meio da secreção de gengivas para promover dano neuronal. Descobrimos que a
imunorreatividade (IR) da gingipaina em cérebros com DA foi significativamente maior do que
em cérebros de indivíduos não-controle com DA. Além disso, identificamos P. gingivalis DNA em
cérebros com DA e no líquido cefalorraquidiano (LCR) de sujeitos vivos com diagnóstico de AD
provável, sugerindo que LCR P. gingivalis O DNA pode servir como um marcador de diagnóstico
diferencial. Nós desenvolvemos e testamos inibidores de gingipaina de pequenas moléculas
potentes, seletivos, penetrantes no cérebro, in vivo. Nossos resultados indicam que a inibição
de pequenas moléculas de gingipains tem o potencial de ser modificador da doença na DA.
O diagnóstico de DA se correlaciona com a carga de gengiva no cérebro
Tissue microarrays (TMAs) contendo núcleos de tecido cerebral pareados por
sexo e idade do giro temporal médio (MTG) de pacientes com DA e de
indivíduos neurologicamente normais foram usados para estudos de
imuno-histoquímica (IHC) (tabelas S1 e S2). Anticorpos específicos para a
gengipaina, CAB101 e CAB102, direcionados a RgpB e Kgp, respectivamente,
foram usados para determinar a carga de gengiva em núcleos de tecido
cerebral. A carga de tau nos TMAs foi medida usando um anticorpo
(DAKOA0024) que reconhece tau não fosforilada e fosforilada. RgpB e Kgp
exibiram coloração intraneuronal pontilhada em tecido de cérebros AD (Fig. 1, A
e B, respectivamente). Com base na análise de limiar (consulte Materiais e
Métodos), 96% (51 de 53) das amostras de AD foram positivas para RgpB e
91% (49 de 54) das amostras de AD foram positivas para Kgp.
Em seguida, coramos para tau e encontramos uma correlação altamente significativa entre a
carga RgpB e a carga tau (Fig. 1E) e a carga Kgp e a carga tau (Fig. 1F). Foi demonstrado que a
patologia Tau se correlaciona com o comprometimento cognitivo na DA ( 35). Em seguida,
coramos os TMAs para ubiq-uitina, uma pequena etiqueta de proteína que marca proteínas
danificadas para degradação por proteassomas ( 36) e se acumula nos emaranhados tau e A •
placas ( 37). Houve uma correlação significativa entre a carga RgpB e a carga de ubiquitina
(Fig. 1G) e a carga Kgp e a carga de ubiquitina (Fig. 1H) nas TMAs. Deve-se notar que, em
tecidos de controle não-demidos, a coloração RgpB foi observada em 39% (18 de 46) das
amostras e a coloração Kgp foi observada em 52% (26 de 50) das amostras. As análises
de correlação entre a carga de gengiva e a carga de tau (Fig. 1, E e F) e entre a carga de
gengiva e ubiquitina (Fig. 1, GandH) nas amostras de controle não-demendadas revelaram
um continuum de gengiva e patologia AD já presente nos controles. Esses achados são
consistentes com o conceito de DA pré-clínica, ou seja, o estágio da doença quando a
patogênese começou, mas os sintomas clínicos ainda não estão presentes ( 38).
Para validar ainda mais o Gingipain IHC nos TMAs, realizamos uma análise de
correlação entre a carga RgpB e a carga Kgp e encontramos uma correlação
significativa entre os dois antígenos diferentes (Fig. 1I). Como um controle adicional de
IHC, TMAs cerebrais de várias doenças não neurológicas diferentes foram sondados
com o anticorpo CAB101. A imunocoloração de RgpB em MTG TMAs da doença de
Parkinson, doença de Huntington e esclerose lateral amiotrófica re-
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não revelaram diferenças significativas em comparação aos controles (fig. S1). Em resumo, os
antígenos RgpB e Kgp no cérebro demonstraram independentemente uma correlação
significativa com o diagnóstico de DA, carga de tau e carga de ubiquitina.
RgpB colocaliza com neurônios, astrócitos e patologia no hipocampo da
DA
Na DA, o hipocampo é uma das primeiras áreas do cérebro a ser danificada. Usando um
anticorpo diferente para RgpB do que CAB101 (18E6monoclonal; ver Materiais e Métodos),
RgpB-IR foi confirmado em neurônios do giro dentado e CA3, CA2 e CA1 do hipocampo
AD com microscopia de campo claro (Fig. 2A). A análise IHC de uma série de cérebros de
um banco de cérebros de uma universidade revelou um padrão semelhante de coloração
para RgpB (fig. S2). Usando imunofluorescência, RgpB-IR (CAB101) co-localizou
principalmente com neurônios [proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2)] (Fig. 2C), bem
como astrócitos ocasionais, mas não com microglia (Iba1) (Fig. 2D). Além disso, RgpB
co-localizou com patologia, incluindo emaranhados de tau e intraneuronal A • ( Fig. 2E).
Detecção de Kgp no córtex cerebral AD
A DA também está associada à atrofia da substância cinzenta do córtex cerebral. Os
lisados cerebrais do córtex cerebral de três cérebros com AD e seis cérebros de controle
não demen- trados foram imunoprecipitados (IP) com CAB102 e executados em um
Western blot (WB) (Fig. 3B). O anticorpo policlonal CAB102 reconhece os aminoácidos 22
a 400 de Kgp, cobrindo o propeptídeo e a região N-terminal do domínio catalítico (ver
Materiais e Métodos). O WB de todos os três cérebros AD revelou bandas Kgp
semelhantes de pesos moleculares correspondentes aos pesos moleculares das bandas
Kgp de lisados bacterianos de P. gingivalis estirpes W83, ATCC33277 e FDC381 (Fig.
3A). A cepa HG66, que contém uma mutação que afeta a retenção de gengivas em sua
superfície celular ( 39), demonstrou apenas uma única banda Kgp no peso molecular do
domínio catalítico Kgp (Fig. 3A). O domínio catalítico Kgp foi identificado no peso
molecular adequado ( 40) em todas as amostras de cérebro com DA (Fig. 3B). Além disso,
cinco dos seis cérebros de controle não dementados demonstraram padrões de bandas
Kgp semelhantes aos cérebros de AD (Fig. 3B), consistentes com nossos dados de IHC
demonstrando um continuum de gingipaina e a patologia de AD apresenta cérebros de
controle de não dementados (Fig. 1, D, F , eH). Na sexta amostra de cérebro de controle
não dementado (C6), as bandas de Kgp eram muito fracas, indicando quase ausência de
Kgp (Fig. 3B).
Identificação do RRNA de P. gingivalis 16S e hmuY genes no córtex cerebral
da DA
Para validar ainda mais os dados de detecção da proteína Kgp, realizamos a análise
quantitativa da reação em cadeia da polimerase (qPCR) no DNA isolado do mesmo
tecido cerebral usado para a análise Kgp IP e WB. análise qPCR usando RRNA de P.
gingivalis 16S primers revelaram a presença do RRNA de P. gingivalis 16S gene nos
cérebros com DA e cinco dos seis cérebros de controle não-demen- sados (Fig. 3C).
Cérebro de controle C6, que exibiu quase ausência de bandas Kgp na Fig. 3B acima, foi
negativo por qPCR para o RRNA de P. gingivalis 16S
gene (Fig. 3C). Para validar ainda mais o 16S rRNA resultados qPCR, realizamos análise de
PCR usando primers para o hmuY gene, um gene altamente específico para P. gingivalis (41). Todos
os três cérebros AD e os cinco cérebros de controle não-elementares que foram positivos para
o 16S rRNA
gene também foram positivos para o hmuY gene, e sequenciamento do
hmuY Os produtos de PCR confirmaram a presença de P. gingivalis no DNA do cérebro (fig. S3).
Porque estávamos usando um método de PCR altamente sensível
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UMA C E

le
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co
Ao
B D F

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Eu G H

Fig. 1. Gingipain IR no cérebro se correlaciona com o diagnóstico e patologia de DA. (UMA e B) TMA NVD005 representativo contendo núcleos de tecido cerebral do MTG de pacientes com DA e controles sondados para RgpB (A) e Kgp (B)

com anticorpos CAB101 e CAB102, respectivamente. Maior ampliação de núcleos de tecido representativos revela maior RgpB-IR e Kgp-IR neuronal em núcleos de tecido AD do que em núcleos de controle. ( C) RgpB-IR e ( D) Os dados Kgp-IR

dos TMAs NVD005 e NVD003 mostram uma carga significativamente maior no cérebro DA em comparação com os controles. Teste de Mann-Whitney, *** P < 0,0001; apresentado como média geométrica ± intervalo de confiança de 95%, n = 99

(C) e n = 104 (D). ( E e F) A carga Tau se correlaciona com a carga RgpB (Spearman r = 0,674, P < 0,0001, n = 84) (E) e carga Kgp (Spearman r = 0,563, P < 0,0001, n = 89) (F). Azul, controle; vermelho, AD. ( G e H) A carga de ubiquitina, um

marcador da patologia da DA, se correlaciona com a carga RgpB (azul, controle; vermelho, DA; Spearman r = 0,786, P < 0,0001, n = 99) (G) e carga Kgp (Spearman r = 0,572, P < 0,0001,

n = 104) (H). ( EU) A carga RgpB se correlaciona com a carga Kgp (Spearman r = 0,610, P < 0,0001, n = 99).

para detectar baixo número de cópias de P. gingivalis DNA (consulte Materiais e
Métodos), estávamos preocupados com a amplificação aninhada de uma bactéria
Gram-negativa comum, como P. gingivalis na presença de DNA cerebral pode estar
criando um sinal falso-positivo. Portanto, como um controle negativo adicional, usamos o
mesmo método de primer aninhado para tentar detectar outra bactéria Gram-negativa
ubíqua,
Helicobacter pylori ( consulte Materiais e Métodos) ( 42). Testamos as três amostras de DNA do
cérebro com DA e três das P. gingivalis –Amostras de DNA de cérebro não dementadas positivas
para H. pylori. Todas as seis amostras de cérebro foram negativas para H. pylori usando primers
qPCR validados e
sonda (fig. S3D) ( 43), indicando que nosso P. gingivalis Os resultados de PCR não são
provavelmente devido a um artefato de PCR. Em resumo, a identificação de P. gingivalis O DNA em
cérebros com DA e em cérebros de controle não-demen- sados Kgp-positivos valida ainda mais a
identificação de Kgp nas mesmas amostras de tecido cerebral por IP e WB.
P. gingivalis O DNA está presente no LCR de pacientes clínicos com DA
O LCR é considerado uma "janela" para infecção cerebral, fornecendo informações sobre
a neuropatogênese de agentes infecciosos ( 44). Portanto, conduzimos um estudo piloto
prospectivo usando CSF coletado de

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UMA C

D E

Fig. 2. RgpB colocaliza com neurônios e patologia no hipocampo da DA. (UMA) IHC usando anticorpo monoclonal específico de RgpB 18E6 (imagens representativas de um paciente com DA de 63 anos). O hipocampo mostra

abundante RgpB intracelular no hilo (1), camada piramidal CA3 (2), camada de células granulares (3) e camada molecular (4). Imagens de alta ampliação das áreas indicadas (1 a 4) exibem um padrão de coloração granular consistente com P.

gingivalis infecção intracelular. Barras de escala, 200 • m (visão geral), 50 • m (1) e 10 • m (2 a 4). ( B) O hipocampo AD foi corado com 18E6 (AD) em comparação com o tecido gengival (gengiva) de um paciente com doença periodontal, bem
como um controle não AD e um controle IgG1 de camundongo (IgG1) em uma seção adjacente do hipocampo. Barras de escala, 50 • m. ( C) A colmarcação imunofluorescente com CAB101 revela coloração intraneuronal granular para RgpB

(setas) em neurônios positivos para MAP2 na camada de células granulares (GCL) e na camada de células piramidais (CA1). Barras de escala, 10 • m. ( D) Agregados extracelulares densos positivos para RgpB (pontas de seta) foram

intimamente associados com astrócitos [proteína glial fibrilar ácida (GFAP)]. Não houve associação observada de RgpB com microglia (IBA1). Barras de escala, 10 • m. ( E) RgpB foi associado ao filamento helicoidal emparelhado Tau

(PHF-Tau; setas). Neurônios RgpB-positivos negativos para PHF-Tau (pontas de seta) também foram vistos. Intracelular A • estava frequentemente co-localizado com RgpB (setas). Em alguns A •• células positivas, RgpB não pôde ser

detectado (pontas de seta). Barras de escala, 10 • m.

UMA B C

Fig. 3. Identificação de P. gingivalis –Proteína e DNA específicos no córtex de pacientes controle e com DA. (UMA) WB com quatro cepas diferentes de P. gingivalis e CAB102
detecção de bandas de peso molecular típicas para Kgp em lisados bacterianos. ( B) IP usando lisados cerebrais de controles não-demenciados (C1 a C6; idades 75, 54, 63, 45, 37 e 102 anos,

respectivamente) e pacientes com DA (AD1 a AD3; idades 83, 90 e 80 anos, respectivamente) usando CAB102 com WB subsequente revela a subunidade catalítica de ~ 50-kDa Kgp (Kgp gato),

junto com espécies Kgp de peso molecular alto e baixo vistas em (A). ( C) qPCR de DNA isolado dos mesmos lisados cerebrais que as amostras de proteínas analisadas em (B)
mostra um sinal positivo em amostras de controle não-demenciado (C1 a C5) e AD (AD1 a AD3). A amostra C6 do paciente de controle não-demenciado de 102 anos não tinha sinal qPCR detectável em (C) e bandas muito fracas indicando

quase ausência de Kgp (B) (média com barras de erro SEM de execuções de qPCR repetidas).

10 pacientes com diagnóstico de provável DA que apresentavam comprometimento cognitivo O sequenciamento dos produtos de PCR de ponto final de CSF confirmou a presença do hmuY gene
leve a moderado (fig. 4D). CSF e amostras de saliva combinadas foram coletadas e analisadas (fig. S4). Em seguida, quantificamos o P. gingivalis
para P. gingivalis DNA por detecção qPCR do hmuY gene ( 41). Controles positivo e negativo, carga nas amostras de saliva correspondentes de todos os 10 pacientes. Todas as 10 amostras de saliva

semelhantes ao padrão de tratamento para detecção de outras infecções cerebrais no LCR, correspondentes foram positivas para P. gingivalis por ensaio qPCR do hmuY gene (Fig. 4B). Tal como

foram usados ( 45, 46). Fomos capazes de detectar e quantificar cópias do acontece com as amostras de cérebro observadas acima, para um controle negativo de PCR, analisamos

as amostras de CSF para a presença de

hmuY gene por qPCR no LCR em 7 dos 10 pacientes com DA diagnosticados clinicamente, H. pylori usando métodos com a mesma sensibilidade que para P. gingivalis.
com P. gingivalis carga variando de 10 a 50 cópias / • l de CSF (Fig. 4A), e a intensidade de Todas as amostras de CSF foram negativas para H. pylori ( Fig. 4C). Os dados do CSF
fluorescência relativa dos produtos qPCR em gel de agarose foi consistente com os dados fornecem evidências adicionais para P. gingivalis infecção no cérebro de pacientes com DA.
de qPCR (Fig. 4C).

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UMA B

C D
()

Fig. 4. Detecção de P. gingivalis em CSF e biofluidos orais de indivíduos clínicos DA. (UMA) Detecção e quantificação de P. gingivalis DNA por qPCR em CSF de sujeitos
com provável AD. ( B) Detecção e quantificação de P. gingivalis DNA por qPCR de amostras de saliva correspondentes. ( C) Acima: produtos de PCR detectando P. gingivalis de CSF em (A) de todos os indivíduos executados em gel de agarose

incluindo controles negativos e positivos contendo um molde de DNA sintético. Produtos de PCR fracos ou indetectáveis dos sujeitos AD1, AD3 e AD5 estavam abaixo do limite de quantificação para o número de cópias e não eram de quantidade

suficiente para a análise de sequência. Embaixo: produtos qPCR doCSF dos mesmos assuntos para H. pylori. ( D) A tabela de dados inclui idade e pontuação do Mini Mental Status Exam (MMSE) em indivíduos e identidade de sequência de

produtos de PCR para P. gingivalis hmuY Sequência de DNA. Os dados de sequência estão incluídos na fig. S4. NS, não sequenciado.

Tau é fragmentado por gingipains
Como identificamos a co-localização de gingipaina com emaranhados de tau no ADbrain (Fig.
2E), estávamos interessados em ver se tau era um alvo para a proteólise de gingipain. Foi
proposto que o truncamento e a fragmentação da tau desempenham um papel fundamental
na indução da formação de tau insolúvel e hiperfosforilada na DA ( 47–49). Para determinar se
as gingipains clivam tau em um sistema baseado em células, usamos células SH-SY5Y que
expressam formas de tau de alto peso molecular ( 50).
Usando o anticorpo Tau-5 como uma sonda, as células SH-SY5Y infectaram com três
concentrações diferentes de P. gingivalis foram examinados em três momentos diferentes. Os
resultados mostraram uma perda dependente da dose de tau total solúvel dentro de 1 hora após a
infecção em comparação com células não infectadas, enquanto células infectadas com P. gingivalis Os
mutantes com defeito de gingipaina mostraram níveis de tau solúvel semelhantes às células não
infectadas, indicando que os gingipains foram responsáveis pela perda do epítopo Tau-5 (Fig. 5, A e
B).
Para caracterizar os locais de clivagem de gingipaina dentro de tau, incubamos
tau-441 recombinante com proteína purificada contendo os domínios catalíticos de
Kgp e RgpB em combinação e identificamos fragmentos de clivagem de tau por
espectrometria de massa (MS). Após a exposição a gingipains purificadas 1 nM,
identificamos fragmentos de tau cobrindo 23% da sequência de aminoácidos
tau-441; a 10 nM de gingipains, fragmentos de tau foram gerados cobrindo 85% da
sequência de tau (Fig. 5D e tabela S3). A partir dos fragmentos de tau identificados,
fomos capazes de deduzir 14 locais de clivagem RgpB e 30 locais de clivagem Kgp
na proteína tau-441 (Fig. 5D). A maioria dos locais de clivagem Kgp (21 de 30)
estavam localizados no terminal C na posição 222 na proteína tau. Para RgpB, a
maioria dos locais de clivagem (9 de 14) estavam localizados no terminal N na
posição 222. Dentro do epítopo do anticorpo Tau-5,
e dois locais de clivagem Kgp (Fig. 5D, b). Assim, clivagens de gengiva
dentro do epítopo do anticorpo Tau-5 foram a causa provável da perda do sinal do anticorpo
Tau-5 e, portanto, a detecção da proteína tau após as células SH-SY5Y serem infectadas
com P. gingivalis.
Identificamos domínio amid, fragmento de peptídeo de tau gerado por RgpB,
TPSLPTPPTR (resíduos 212 a 221), que faz parte do epítopo Tau-5 (Fig. 5D, g). Este
peptídeo tau é comum a todas as isoformas de tau e tem sido usado como analito para
medir os níveis de tau no LCR ( 51) e determinar a taxa de renovação de tau no sistema
nervoso central (SNC) humano ( 52). Foi relatado que o fragmento TPSLPTPPTR
aumentou 1,7 vezes no AD CSF em comparação com o não AD CSF ( 51).
Kgp gerou quatro fragmentos de peptídeo de tau exclusivos contendo a sequência
hexapeptídica VQIVYK (Fig. 5D, e) e dois fragmentos de peptídeo de tau exclusivos contendo a
sequência de VQIINK (Fig. 5D, f). Os fragmentos de tau contendo esses motivos hexapeptídicos
mostraram estar envolvidos na formação do emaranhado de tau por nucleação de filamentos
helicoidais emparelhados (PHFs) de tau de comprimento total ( 53, 54).
Os inibidores da gingipaina de pequenas moléculas são neuroprotetores
Para determinar se as gengivas são tóxicas para os neurônios in vitro, expusemos células
SH-SY5Y diferenciadas a RgpB ou Kgp por 24 horas. A aplicação combinada de RgpB e
Kgp aumentou significativamente a agregação celular (Fig. 6A). O pré-tratamento de
gengiva com iodoacetamida, um inibidor irreversível da cisteína protease, evitou a
agregação induzida pela gengiva, indicando que a atividade proteolítica das gengivas foi
responsável pelas alterações morfológicas (Fig. 6A).
Com base na atividade citotóxica de gingipains de P. gingivalis,
sua presença no cérebro com DA e seu papel crítico na sobrevivência e virulência bacteriana,
desenvolvemos uma biblioteca de inibidores potentes e seletivos, reversíveis e irreversíveis da
gingipaina de pequenas moléculas. COR286 e

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UMA B C

Fig. 5. P. gingivalis e fragmento tau de gingipains. (UMA) Análise de WB de tau solúvel total em células SH-SY5Y infectadas com concentrações crescentes de tipo selvagem (WT)
P. gingivalis cepa W83 ( Pg) e P. gingivalis mutantes deficientes em gingipaina ou sem atividade Kgp (Kgp • Ig-B) ou sem atividade Kgp e Rgp ( • K / • RAB-A). Células SH-SY5Y não infectadas (Não Pg) foram usados como um
controle negativo. Gliceraldeído-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usado como um controle de carregamento. A tau total foi monitorada com o anticorpo monoclonal Tau-5 1, 4 e 8 horas após a infecção. ( B) Análise
densitométrica das imagens tauWB totais. ( C) Análise de WB de rtau-441 incubado com domínios catalíticos Kgp e RgpB combinados (Gp) em várias concentrações durante 1 hora a 37 ° C. O blot foi sondado com anticorpo
monoclonal tau T46. ( D) Sítios de clivagem de gengipaina em rtau-441 deduzidos de fragmentos de peptídeo identificados por MS para rtau-441 incubado com 1 ou 10 nM de gingipaina. (a) Epítopo de anticorpo T46
(vermelho). (b) Epítopo de anticorpo Tau-5 (vermelho). (c) fragmento de tau N-terminal. (d) fragmento de tau C-terminal. (e) fragmentos de tau gerados por Kgp contendo a sequência VQIVYK. (f) fragmentos gerados por Kgp
contendo a sequência VQIINK. (g) Um fragmento de tau gerado por RgpB. * Locais de clivagem identificados em gingipains 1 nM.

COR271 são inibidores irreversíveis de gingipains específicas de arginina (RgpA e RgpB) e Marcador AD A • 1-42. Camundongos BALB / c com 44 semanas de idade foram infectados por via oral em

específicas de lisina (Kgp), respectivamente, ambos com dias alternados durante 6 semanas com P. gingivalis W83, Kgp knock-

uma concentração inibitória mediana (IC 50) de <50 pM. COR119 é um
inibidor Kgp covalente reversível com um IC 50 de 10 nM.
Para quantificar os efeitos protetores dos inibidores de gingipain, nós infectamos
Células SH-SY5Y com a cepa W83 de P. gingivalis a uma multiplicidade de infecção (MOI) de
400 por 48 horas, produzindo aproximadamente 50% de morte celular (Fig. 6B). COR286 e
COR271 foram ambos eficazes no bloqueio P. gingivalis –Morte celular induzida de maneira
dependente da concentração (Fig. 6B). Amplo espectro humano-antibióticos, moxifloxacina e
doxiciclina, mesmo em concentrações que reduzem a sobrevivência bacteriana in vitro ( 55), não
protegeu as células. Nós também testamos o •• inibidor de secretase
Fora ( • Kgp) [ • kgp ( 602-1732) Em r] ( 57), ou RgpA RgpB duplo nocaute ( • Rgp) ( • rgpA
rgpB • 495-B Cm r, Em r) ( 58) P. gingivalis.
O braço infectado com OneW83 foi administrado com o inibidor Kgp COR119 três vezes por dia por
via subcutânea durante os dias 21 a 42. Análise de PCR de ponto final de cérebros de camundongos
para P. gingivalis revelou que a bactéria invadiu o cérebro de todos os oito camundongos após a
infecção oral por 6 semanas, e a colonização foi diminuída por cepas de gingipainknockout ou
tratamento-
com COR119 (Fig. 7A). Cérebro de rato A • 1-42 aumentou significativamente após infecção oral
com P. gingivalis Comparado com o Tomock infectado
ou ratinhos tratados com COR119 (Fig. 7B). Camundongos infectados com • Rgp ou • Kgp

semagacestat (LY450139), que bloqueia a formação de A • 1-42 ( 56),
para determinar se a toxicidade bacteriana foi mediada por P. gingivalis -
induziu A • produção, mas não teve efeito protetor (Fig. 6B).
Em seguida, avaliamos se as gingipains são neurotóxicas in vivo e se os inibidores podem
penetrar no cérebro e prevenir a neurotoxicidade da gingipain. Camundongos BALB / c de oito
semanas de idade receberam uma única administração de inibidores da gengipaina por meio de uma
combinação de COR271 por gavagem oral e COR286 por via subcutânea, ou ambos os veículos. A
injeção estereotáxica de uma combinação de Kgp e RgpB no hipocampo foi realizada 1,5 horas
depois. Sete dias depois, os cérebros foram analisados quanto à neurodegeneração. Camundongos
injetados com gingipaina tinham um número significativamente maior de neurônios em degeneração
do que camundongos injetados com solução salina, mas a neurodegeneração poderia ser bloqueada
por pré-tratamento com uma combinação de inibidores de gingipainaCOR286 eCOR271 (Fig. 6,
CandD).
Infecção oral de camundongos com P. gingivalis resulta no cérebro
infecção e indução de A • 1-42
Em seguida, queríamos entender se a exposição oral a P. gingivalis
resultaria em infiltração cerebral e indução do estereótipo
cepas de P. gingivalis tinha cérebro A • 1-42 níveis não diferentes de infectados com pulgas, indicando
que ambas as gengivas eram necessárias, seja diretamente
ou indiretamente, para induzir um A • 1-42 resposta in vivo (Fig. 7B).
UMA • 1-42 tem efeitos antibacterianos contra P. gingivalis
O significativo A • 1-42 resposta no cérebro do rato para P. gingivalis
infecção é consistente com relatórios que demonstram que A • 1-42 é um
peptídeo antimicrobiano ( 4, 6). Portanto, analisamos se A • 1-42
interage com P. gingivalis e diminui sua viabilidade in vitro. Depois de
incubação de A • 1-42 com P. gingivalis, UMA • 1-42 colocalizado com RgpB na superfície
da bactéria (Fig. 7C). Porque A • 1-42 é conhecido
para romper as membranas celulares, formulamos a hipótese de que A • 1-42 pode perturbar a
integridade do P. gingivalis membrana para causar morte celular.
Em um experimento separado, usamos um ensaio que pode detectar membranas bacterianas
danificadas e quantificar a quantidade de células bacterianas mortas ou morrendo como resultado
do dano à membrana. Descobrimos que a proporção de mortos e moribundos P. gingivalis bactéria
significativamente
aumentou após incubação com A • 1-42 quando comparado com A • 1-40,
UMA • 1-42 solução salina tamponada com fosfato e embaralhada (PBS; Fig. 7D).

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UMA

C D

Fig. 6. Os inibidores da gingipaina de molécula pequena protegem as células neuronais contra P. gingivalis– e toxicidade induzida por gingipaina in vitro e in vivo. (UMA) SH- Diferenciado

As células do neuroblastoma SY5Y demonstram agregação celular após a exposição a RgpB (10 • g / ml), Kgp (10 • g / ml), ou ambos por 24 horas. O inibidor de protease de cisteína não seletivo iodoacetamida (IAM) bloqueia a agregação

celular induzida por gingipaina. ( B) O ensaio de viabilidade AlamarBlue mostra que P. gingivalis (Pg) é tóxico para as células SH-SY5Y (MOI de

400) e que o inibidor Kgp de molécula pequena COR271 e o inibidor RgpB COR286 fornecem proteção dependente da dose. Os antibióticos de amplo espectro moxifloxacina e doxiciclina e os •• O inibidor da secretase
semagacestat não inibiu o efeito citotóxico de P. gingivalis. ( C) A coloração com Fluoro-Jade C (FJC) (verde) em neurônios piramidais da região CA1 do hipocampo de rato indica neurodegeneração após injeção
estereotáxica de gengiva. Contracoloração com 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (azul). Barras de escala, 50 • m. ( D) O número total de células FJC-positivas foi determinado a partir de cortes seriados por todo o
hipocampo. Os resultados demonstram um efeito neuroprotetor significativo dos inibidores de gingipaina COR271 + COR286 após a exposição aguda de gingipain no hipocampo (* P < 0,05, n = 14). Todos os gráficos
mostram a média com barras de erro SEM.

A administração oral de um inibidor de Kgp trata efetivamente
P. gingivalis infecção cerebral e evita a perda de interneurônios
Gad67 + do hipocampo in vivo
Em seguida, queríamos medir os efeitos dos inibidores da gengipaina sobre
P. gingivalis carga no cérebro após infecção oral de BALB / cmice. Camundongos com oito semanas de
idade foram infectados por via oral em dias alternados por 42 dias com
P. gingivalis W83 [10 9 unidades formadoras de colônia (UFC)] e receberam 28 dias de descanso
antes da conclusão do estudo. O tratamento, começando após o estabelecimento da infecção
cerebral, foi administrado durante os dias 36 a 70 (Fig. 7E). P. gingivalis O DNA foi identificado por
qPCR no cérebro de todos os camundongos infectados no dia 35, e as cópias do P. gingivalis o
genoma aumentou significativamente no dia 70 (Fig. 7F). O inibidor Kgp COR271, que tem
biodisponibilidade oral e penetração significativa no SNC, administrado por via oral duas vezes ao
dia reduziu significativamente a carga bacteriana no cérebro em comparação com o braço de
infecção de controle positivo e em comparação aos níveis basais em 5 semanas (Fig. 7F) . O
inibidor RgpB
COR286, administrado por via subcutânea, foi eficaz na redução da carga bacteriana cerebral em
10 semanas, mas não foi tão eficaz quanto COR271 na redução da carga bacteriana abaixo da
linha de base em 5 semanas (Fig. 7F). o
O antibiótico de amplo espectro moxifloxacina também foi benéfico na prevenção do aumento
da colonização cerebral entre o dia 35 e o dia 70, mas não foi eficaz na redução da P. gingivalis carga
abaixo da linha de base de 5 semanas (Fig. 7F). As combinações de COR271 com
moxifloxacina ou COR286 não melhoraram a eficácia em relação ao COR271 sozinho (Fig. 7F).
A análise histológica dos cérebros após a conclusão do estudo de 10 semanas
revelou uma perda significativa de interneurônios Gad67 + GABAérgicos no giro dentado
do hipocampo no P. gingivalis grupo de infecção em comparação com infecção simulada
(Fig. 7G). Na DA, estudos de neuroimagem cerebral e pós-morte mostraram perturbação
variável do sistema GABAérgico do hipocampo ( 59). Tratamento com o inibidor Kgp
COR271 sozinho, o inibidor RgpB COR286 sozinho, uma combinação de COR271 e
COR286, COR271 mais moxifloxacina emoxifloxacina

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UMA B

)
(
C D

D
- -

-
E ×

F G ,

Fig. 7. P. gingivalis invasão do cérebro induz um A • 1-42 resposta que é bloqueada pela inibição da gingipaina em camundongos. (UMA) P. gingivalis Produto de PCR em cérebros de camundongos

após infecção oral com P. gingivalis W83, com ou sem tratamento com o inibidor Kgp COR119, ou infecção com cepa de gingipain knockout • RgpB ou • Kgp. As pistas 1 a 8 representam animais experimentais individuais. Na
primeira faixa ( Pg), P. gingivalis W83 foi usado como um controle positivo. ( B) P. gingivalis Ratinhos infectados com W83, mas não COR119-
camundongos tratados ou camundongos infectados com nocaute de gingipain, tiveram A significativamente maior • 1-42 níveis em comparação com camundongos com infecção simulada (*** P < 0,001, n = 40). ( C) RgpB-IR (vermelho)

colocalizado com A • 1-42- IR (verde) na superfície de P. gingivalis ( D) UMA • 1-42, mas não A • 1-40 ou A • 1-42 embaralhado, diminuição da viabilidade de P. gingivalis (*** P < 0,001, n = 12). ( E) Desenho do estudo para quantificar o efeito dos inibidores da

gengipaina no cérebro P. gingivalis carga. ( F) Os resultados qPCR mostraram um substancial P. gingivalis número de cópia no cérebro em

5 semanas, aumentando 10 vezes em 10 semanas (Inf. 10 semanas). Todos os grupos de tratamento mostraram uma diminuição significativa em P. gingivalis carga em comparação com o Inf. tratado com veículo. Camundongos de 10 semanas

(*** P < 0,0001, n = 63). O tratamento com o inibidor Kgp COR271 resultou em uma redução de 90% de P. gingivalis número da cópia. A comparação dos grupos de tratamento com a infecção de linha de base no início do tratamento (Inf. 5

semanas) mostrou uma redução significativa com COR271 e COR286 (## P < 0,01, # P < 0,05) mas não com moxifloxacina. ( G) O número de interneurônios Gad67 + no giro denteado do hipocampo foi significativamente diminuído no Inf. Grupo

de 10 semanas (* P < 0,05, n = 120). Esta diminuição foi reduzida em todos os grupos de tratamento, com COR271 e COR286 tendendo a melhor proteção do que a moxifloxacina. (F) Média geométrica com intervalo de confiança de 95%. (B),

(D) e (G) mostram a média com barras de erro SEM.

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por si só, tudo começando no dia 36, reduziu a perda dos interneu- rons Gad67 +, com os
braços tratados com moxifloxacina tendendo a diminuir a proteção (Fig. 7G).
O tratamento com COR388 mostra efeitos dependentes da dose no cérebro
P. gingivalis infecção, A • 1-42, e fator de necrose tumoral - •
níveis no rato
Com base no desempenho superior do inibidor Kgp altamente potente e específico
COR271 no estudo de camundongo in vivo acima na limpeza P. gingivalis infecção
cerebral e proteção dos neurônios Gad67 + no hipocampo em comparação com um
inibidor Rgp e um antibiótico de amplo espectro, desenvolvemos o análogo COR271
COR388. Semelhante ao COR271, o COR388 é um inibidor de pequenas moléculas
irreversíveis altamente potente (constante de inibição picomolar em Kgp) e seletivo de
Kgp, com farmacocinética oral superior e propriedades apropriadas ao fármaco, incluindo
penetração significativa no SNC.
Em paralelo, também desenvolvemos sondas baseadas em atividade de Kgp para caracterizar
o engajamento do alvo de COR388 Kgp intacto P. gingivalis
bactérias e amostras de tecido biológico. Desenvolvemos a sonda de atividade fluorescente
COR553 combinando uma pequena molécula potente
inibidor Kgp irreversível com Cy5 (Fig. 8A) e validou sua especificidade e potência em
Kgp in vitro (Fig. 8, B a D). COR553 ligado Kgp presente em culturas bacterianas de P.
gingivalis mas não se ligou a uma cepa deficiente em Kgp (Fig. 8B). A pré-incubação do
lisado bacteriano com o anticorpo Kgp CAB102 empobreceu a proteína Kgp e a ligação
COR553 do lisado, enquanto os complexos CAB102 ligados ao anticorpo contêm a
ligação Kgp e COR553, confirmando a identidade do alvo COR553 (Fig. 8C).
Pré-incubação de P. gingivalis com COR388 100 nM antes da ligação de COR553
resultou no envolvimento de COR388 com o sítio ativo Kgp e um bloco de ligação da
sonda de atividade COR553 (Fig. 8D). Usando a sonda COR553, demonstramos
engajamento do alvo COR388 Kgp ex vivo em amostras de placa subgengival oral
humana obtidas de pacientes com doença periodontal (tabela S4). COR553 etiquetado
Kgp presente na placa em quatro dos cinco indivíduos. A pré-incubação com COR388
bloqueou a ligação da sonda ao sítio ativo, enquanto a proteína Kgp total ainda foi
detectada por CAB102 (Fig. 8E). Altos níveis de Kgp nessas amostras de placa
refletiram a detecção de P. gingivalis DNA nas amostras de placa (Fig. 8F). Esses
mesmos quatro assuntos também tinham níveis detectáveis de P. gingivalis na saliva
(Fig. 8G).

UMA B C D

E F G

H Eu J K eu

Fig. 8. envolvimento do alvo COR388 e efeitos dependentes da dose no cérebro P. gingivalis, UMA • 1-42, e TNF • Em ratos. (UMA) Sonda de atividade fluorescente COR553 para Kgp.

( B) Rotulagem COR553 de Kgp em P. gingivalis Cepa W83 e sem marcação em mutante deficiente em Kgp ( • Kgp). ( C) W83 lisados marcados com COR553. Pista da esquerda, antes da imunodepleção; faixa do meio, após imunodepleção com

esferas conjugadas a anti-Kgp; pista da direita, após eluição de esferas conjugadas com anti-Kgp. ( D) A cepa W83 foi titulada e marcada com COR553 para determinar o limite de detecção bacteriana. Consulte os resultados para obter detalhes. ( E)

Amostras de placa oral de sujeitos humanos (CB1-5) com doença periodontal foram incubadas ex vivo com sonda COR553 com ou sem pré-incubação com COR388. A sonda COR553 e CAB102 detectaram Kgp fortemente em três sujeitos (CB1,

CB4 e CB5) e fracamente em um sujeito (CB3). A pré-incubação de COR388 bloqueou a ligação da sonda COR553 a Kgp. ( F) análise qPCR de amostras de placa usando hmuY primers específicos do gene identificados P. gingivalis DNA em

amostras. ( G) Análise qPCR de amostras de saliva. Os gráficos de barras em (F) e (G) mostram os médios e SEMs de três repetições. ( H) O tratamento de COR388 da cultura W83 em meio de crescimento definido reduziu o crescimento de forma

semelhante a uma cepa deficiente em Kgp ( • Kgp) ao longo de 43 horas. ( EU) A resistência desenvolveu-se rapidamente à moxifloxacina, mas não ao COR388 com a repetição da passagem da cultura bacteriana. ( J para EU) Eficácia de COR388

em três doses orais de 3, 10 e 30 mg / kg duas vezes ao dia no tratamento de um estab-

amado P. gingivalis infecção cerebral em camundongos. Redução dos níveis de tecido cerebral de P. gingivalis ( J), A • 1-42 ( K), e TNF • ( EU). Os gráficos de barras mostram as médias com barras de erro SEM.

*** P < 0,001, ** P < 0,01, * P < 0,05, t teste com correção de comparação múltipla de Dunn; n = 39

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Usando um meio de crescimento definido, mostramos que COR388 inibiu o
crescimento de P. gingivalis, demonstrando que um inibidor do fator de virulência Kgp
envolvido na geração de aminoácidos nutrientes para energia atua como um antibiótico de
espectro estreito (Fig. 8H). Para testar o potencial de resistência a COR388, P. gingivalis foi
passado na presença de COR388 ou do antibiótico de amplo espectro moxifloxacina.
Conforme mostrado na Fig. 8I, P. gingivalis desenvolveram resistência completa à
moxifloxacina, com a concentração inibitória mínima (CIM) aumentando mais de 1000
vezes em 12 passagens. A resistência a COR388 em dois ensaios independentes não se
desenvolveu neste estudo. A eficácia do COR388 foi testada in vivo para tratar uma P.
gingivalis
infecção cerebral no modelo de camundongo descrito acima para o teste de eficácia de
COR271 (Fig. 7E). Semelhante ao COR271, a dosagem oral de COR388 duas vezes ao dia
resultou em eficácia dependente da dose quando administrado a um P. gingivalis infecção
cerebral. Doses de 10 e 30mg / kg
reduzido P. gingivalis carregar, A • 1-42, e fator de necrose tumoral - • ( TNF •)
níveis no tecido cerebral em comparação com os animais infectados tratados
com veículo (Fig. 8, J a L). A menor dose de COR388 a 3 mg / kg mostrou alguma
redução do cérebro P. gingivalis carregar, mas não reduziu
níveis do cérebro A • 1-42 ou TNF • ( Fig. 8, J a L). Estudos de habilitação de aplicação de novos
medicamentos de investigação foram concluídos com COR388,
e o composto está atualmente em estudos clínicos (ClinicalTrials.gov NCT03331900).
DISCUSSÃO
Os resultados deste estudo oferecem evidências de que P. gingivalis e gipinas no cérebro
desempenham um papel central na patogênese da DA, fornecendo uma nova estrutura
conceitual para o tratamento da doença. Conseqüentemente, demonstramos a presença de P.
gingivalis DNA e antígenos de gingipaina em cérebros de DA e mostram in vivo que a
administração oral de inibidores de gingipaina de molécula pequena bloqueia a
neurodegeneração induzida por gingipain, reduz significativamente P. gingivalis carga
no cérebro do rato, e diminui significativamente o hospedeiro A • 1-42 resposta a P.
gingivalis infecção cerebral.
Nossa identificação de antígenos de gingipain no cérebro de indivíduos com DA e também
com patologia da DA, mas nenhum diagnóstico de demência argumenta que a infecção cerebral
com P. gingivalis não é resultado de cuidados odontológicos inadequados após o início da
demência ou uma consequência de doença em estágio avançado, mas é um evento precoce
que pode explicar a patologia encontrada em indivíduos de meia-idade antes do declínio
cognitivo ( 60). Também demonstramos que P. gingivalis carga bacteriana pode ser detectada no
LCR de pacientes clínicos com DA, fornecendo mais evidências de P. gingivalis infecção do
SNC.
A análise PCR de P. gingivalis no cérebro e CSF relatado aqui não diferencia
entre P. gingivalis cepas, e estudos futuros são necessários para determinar o que P.
gingivalis cepas estão presentes no cérebro e no LCR e se algumas cepas podem
ser mais virulentas do que outras em causar doenças. Além disso, existe uma outra
espécie de Porfiromonas que é conhecido por produzir gingipains,
Porphyromonas gulae (61). P. gulae é um habitante natural da cavidade oral de animais de
companhia, como cães, e um estudo recente demonstrou que os cães podem transmitir P.
gulae para a cavidade oral de seus proprietários ( 62). A pesquisa está em andamento para
determinar se P. gulae
pode estar contribuindo para a carga de gengiva em cérebros de DA.
Evidências de nosso trabalho relatadas aqui dão suporte ao conceito emergente de
que A • é um peptídeo antimicrobiano ( 4-6), andmutations ( 63, 64) contribuir para a perda
desta função pode permitir uma infecção mais robusta com P. gingivalis e maior risco de
doenças. Além disso
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ção, sustentado altos níveis de antimicrobiano A • conduzido por crônica
P. gingivalis infecção do cérebro pode ser tóxica para as células hospedeiras e, portanto, a
redução de A • níveis após o tratamento do P. gingivalis
a infecção deve ser benéfica. Além disso, a síndrome de Down (SD), a causa genética
mais comum de deficiência mental, tem sido usada para apoiar A • como um alvo
terapêutico devido à prevalência notavelmente alta de demência com patologia do tipo
Alzheimer em pacientes com SD (mais de 50% após os 60 anos de idade) e ao fato de
que o gene da proteína precursora de amilóide, que dá origem a A •• está presente no
cromossomo 21, que é triplicado emDS ( 65). No entanto, em apoio à nossa hipótese, uma
forma agressiva de periodontite com rápida progressão e início tão cedo quanto 6 anos de
idade está associada com SD, mas não controles normais da mesma idade ou outros
pacientes com deficiência mental de um semelhante distribuição de idade ( 66). A
ocorrência de
P. gingivalis foi considerado significativo na placa subgengival de pacientes com SD
começando por volta dos 5 anos de idade, quando comparados com controles da mesma
idade, indicando que P. gingivalis coloniza anormalmente pacientes com SD na primeira
infância ( 67). A razão por trás dos pacientes com SD serem suscetíveis a P. gingivalis infecção
em uma idade tão precoce não é clara, mas pode ser devido à imunodeficiência que está
associada à SD ( 68). É necessária pesquisa para determinar se
P. gingivalis e gingipains estão presentes no DS LCR e no cérebro.
Embora não seja especificamente abordado neste relatório, uma vez que a cavidade oral é
infectada, P. gingivalis pode acessar o cérebro e se espalhar através de uma série de vias,
incluindo (i) infecção de monócitos seguida de recrutamento do cérebro ( 69, 70), ( ii) infecção
direta e dano às células endoteliais protegendo a barreira hematoencefálica ( 28), e / ou (iii)
infecção e disseminação através dos nervos cranianos [por exemplo, olfatório ( 71)
ou trigêmeo] para o cérebro. Depois de entrar no cérebro, sugerimos que
P. gingivalis pode se espalhar lentamente ao longo de muitos anos de neurônio a neurônio ao longo
de vias conectadas anatomicamente, semelhante ao que foi demonstrado para a transmissão de
célula a célula vascular de P. gingivalis (72).
A patologia Tau também foi sugerida para se espalhar de neurônio para neurônio ( 73), com
um padrão semelhante a um processo infeccioso. Nossos dados indicam que a tau é um alvo
da proteólise da gengipaina, e propomos que a patologia da tau observada no cérebro AD pode
ser devido à disseminação transneuronal de P. gingivalis, com dano direto da tau pela proteólise
da gengiva, bem como ativação da gingipaina de proteases humanas que agem sobre a tau.
Demonstrou-se que as gengipinas clivam diretamente a procaspase-3 para ativar a caspase-3 ( 74),
uma caspase que foi implicada na fosforilação de tau ( 75) e clivagem tau ( 76). Prevê-se que a
proteólise de tau por gingipains aumentaria a taxa de renovação de tau e desencadearia um
aumento compensatório na taxa de produção de tau para manter a homeostase em neurônios
infectados por P. gingivalis. Uma pesquisa recente sobre a cinética de tau no SNC humano
usando o fragmento TPSLPTPPTR de domínio médio de tau como um repórter descobriu que a
taxa de produção de tau foi aumentada no LCR de indivíduos com AD pré-clínica e clínica ( 52). Nossos
dados demonstrando que Kgp e RgpB se correlacionam independentemente com a carga de
tau em cérebros com DA reforçam a hipótese de que os gingipains podem ser um
impulsionador de um aumento compensatório na produção de tau. Por último, mais pesquisas
são necessárias para determinar se os fragmentos de tau C-terminal gerados por gingipain
contendo os domínios de ligação de microtúbulos de hexapeptídeo que identificamos in vitro
podem conduzir a formação de filamentos de tau in vivo.
Aqui, não abordamos como P. gingivalis infecção pode estar relacionada à
apolipoproteína E4 ( APOE4), o maior fator de risco genético para DA esporádica ( 77). Estudos
em camundongos deficientes em proteínas APOE demonstraram uma resposta imune inata
prejudicada ao patógeno bacteriano Listeria monocytogenes (78), implicando APOE em
normal
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função imune inata in vivo. Foi relatado recentemente que a APOE humana é um alvo
da proteólise da gingipaina, e os autores sugeriram que esse mecanismo poderia gerar
fragmentos de APOE neurotóxicos no cérebro AD ( 79). Propomos que APOE4 pode ser
mais suscetível à clivagem da gengiva do que APOE3 ou APOE2 devido à presença de
mais resíduos de arginina, resultando na diminuição da função imune inata e na geração
de fragmentos neurotóxicos ( 80). O papel distinto da APOE em relação a P. gingivalis infecção
a ativação neuronal de NLRP1, resultando em piroptose de neurônios e ativação da
e direcionamento por gingipains continua a ser o foco de estudos futuros.
Nossa identificação de P. gingivalis no SNC ressalta a importância dos achados
genéticos que ligam os genes da resposta imune inata à suscetibilidade à DA,
incluindo TREM2 (81), TLR4 (82), CR1
( 83), e NLRP3 (84). Por exemplo, estudos recentes destacaram a associação entre
variantes do receptor desencadeador expresso nas células mieloides 2 ( TREM2) e AD ( 81).cérebro. Foi recentemente demonstrado que um inibidor de molécula pequena de um
TREM2 codifica um receptor expresso em células imunes, como macrófagos e microglia,
com heterozigotos TREM2 variantes que conferem um risco de desenvolver AD
semelhante a uma cópia do APOE4 (81). Foi demonstrado que TREM2 regula as
respostas inflamatórias ( 85) e servir como um receptor fagocítico para bactérias ( 86). TREM1,
bacteriana ( 99). Em contraste, relatamos aqui que a inibição de pequenas moléculas da protease de
que compartilha homologia com TREM2, também foi associado à patologia de amiloide
AD e declínio cognitivo ( 87). O risco associado TREM1 alelo mostrou diminuir a
expressão de superfície TREM1 em monócitos ( 87). P. gingivalis foi mostrado para
induzir TREM1 expressão genetica ( 88), e, portanto, é possível que os portadores do TREM1
bacteriana no cérebro por inibidores de Kgp é provavelmente devido à redução de nutrientes
O alelo associado a AD tem uma capacidade reduzida de responder à infecção por P.
gingivalis. Além disso, TREM1 é um alvo para a proteólise e degradação da gingipaina,
com dados mostrando que Rgp pode clivar TREM1 solúvel da superfície celular e que
Kgp pode degradar TREM1, ações que podem induzir inflamação crônica ( 88). Pesquisas
adicionais são necessárias para determinar se TREM2 está envolvido na resposta
imune inata a P. gingivalis
e se P. gingivalis e as gingipains têm efeitos semelhantes na expressão e
degradação de TREM2 como para TREM1. Em resumo, propomos que
polimorfismos genéticos de genes do sistema imune inato em vias imunes
essenciais podem resultar em depuração defeituosa de P. gingivalis e gingipains
do cérebro, resultando em infecção crônica de baixo nível e neuroinflamação em
indivíduos suscetíveis.
No que diz respeito à neuroinflamação induzida por infecção, inflamassomas,
complexos multiproteicos que atuam como sistemas de defesa imune inatos
intracelulares ( 89), foi mostrado para ser ativado em cérebros AD ( 90). P. gingivalis foi
mostrado para modular a atividade do inflamassoma ( 91). Pesquisas recentes indicam
que • a formação da placa na DA está ligada à resposta imune inata por meio da
ativação do inflamassoma NLRP3 na microglia e liberação de partículas ASC que
conduzem A • montagem e deposição ( 92). Notavelmente,
P. gingivalis foi o primeiro patógeno microbiano a induzir manchas de agregação ASC em P. pré-clínicos para permitir o desenvolvimento de um composto terapêutico contra P.
gingivalis - monócitos humanos primários infectados por meio da ativação do inflamassoma
NLRP3 ( 93). Inflamassomas atuam na defesa imune inata intracelular contra patógenos
intracelulares, ativando a interleucina-1 • ( IL-1 •) e IL-18, causando morte celular por
piroptose e, assim, eliminando o nicho intracelular para replicação de patógenos ( 94). Além
disso, relatórios recentes mostraram que P. gingivalis OMVs, proteolipossomas em
nanoescala que são enriquecidos em gingipains e liberados nos tecidos circundantes, são
rapidamente internalizados nas células de mamíferos ( 95), onde eles conduzem a
ativação do inflamassoma NLRP3 e a formação de partículas ASC e causam a morte
celular por meio da piroptose ( 96, 97). Esta pesquisa sugere que P. gingivalis no cérebro
humano, através da liberação de OMVs enriquecidos
Dominy et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaau3333 23 de janeiro de 2019
em gingipains, pode conduzir a ativação do inflamassoma NLRP3, agregação de
partículas ASC e A subsequente • formação de placa. Além disso, evidências recentes
mostraram que o inflamassoma de NLRP1 em neurônios pode detectar fatores de
virulência bacterianos, como proteases, servindo como substrato para as enzimas
patogênicas ( 98). Sugerimos que as gingipains intraneuronais podem, portanto, conduzir
caspase-1, levando à liberação das interleucinas neuroinflamatórias IL-1 • e IL-18.
Por último, mostramos que antibióticos de amplo espectro não protegem contra P.
gingivalis –Morte celular induzida in vitro, enquanto os inibidores da gingipaina o fazem.
Também demonstramos in vivo que um inibidor de Kgp administrado por via oral é mais eficaz
do que um antibiótico de amplo espectro subcutâneo de alta dose na eliminação P. gingivalis do
Clostridium difficile fator de virulência de protease de cisteína, TcdB, redução da patologia da
doença em um modelo de camundongo de C. difficile– colite induzida, mas não reduz o C. difficile carga
cisteína Kgp reduziu não apenas a patologia da doença no cérebro de camundongos, mas também
P. gingivalis carga bacteriana. Os mecanismos subjacentes à diminuição em P. gingivalis carga
peptídicos gerados por Kgp essenciais para o crescimento desta bactéria assacarolítica ( 100)
e o bloqueio da aquisição de heme dependente de Kgp que é crítica para P. gingivalis produção
de energia ( 101, 102). Nós demonstramos que P. gingivalis
desenvolve resistência rápida a um antibiótico de amplo espectro, a moxifloxacina, mas não
ao inibidor Kgp COR388. Portanto, com a crescente preocupação com a resistência
generalizada a antibióticos ( 103), e efeitos colaterais graves, como C. difficile colite devido
ao uso de antibióticos de amplo espectro ( 104), uma abordagem de inibição do fator
antivirulência para o tratamento de P. gingivalis é o caminho mais promissor, reduzindo as
pressões de resistência.
Em conclusão, projetamos um inibidor Kgp de penetração cerebral por via oral,
biodisponível, atualmente sendo testado em estudos clínicos em humanos para DA. Os
presentes dados indicam que o tratamento com um potente e seletivo inibidor de Kgp irá
reduzir P. gingivalis infecção no cérebro e retardar ou prevenir neurodegeneração
adicional e acúmulo de patologia em pacientes com DA.
MATERIAIS E MÉTODOS
Design de estudo
Este estudo foi realizado para investigar a prevalência de P. gingivalis
no cérebro DA e para elucidar possível P. gingivalis –Mecanismos de ação dependentes
para neurodegeneração e patologia da DA. Além disso, realizamos uma série de estudos
gingivalis –Induzida AD. Para demonstrar a presença de antígenos de gingipaina no cérebro
com DA, TMAs contendo controle não-demenciado e tecido cerebral com DA foram usados
para IHC. Para evitar viés potencial e elementos subjetivos na avaliação dos resultados,
os TMAs corados foram digitalizados e as imagens foram analisadas para a IR de gengiva
usando o programa de análise de imagem MetaMorph. Provas da presença de P. gingivalis no
cérebro com DA foi ainda verificado por IP, WB e PCR. Para demonstrar a presença de P.
gingivalis no SNC de pacientes vivos com diagnóstico prospectivo de AD provável, o LCR
foi analisado para P. gingivalis por PCR. Os experimentos in vitro para demonstrar P.
gingivalis fragmentação de tau analisada por WB e MS foram projetadas após a detecção
da correlação
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de aumento da carga de tau com gingipainas nos TMAs e a colocalização de gingipain com
emaranhados de tau no cérebro humano com DA. Para estudar a eficácia dos inibidores da
gengipaina e os efeitos neurodegenerativos da doença crônica P. gingivalis infecção in vivo,
desenvolvemos um modelo de camundongo para infecção crônica com P. gingivalis. O
tamanho da amostra para o modelo de rato para infecção cerebral com P. gingivalis foi
empiricamente determinado com base no tamanho do efeito e DP. Um observador cego
realizou a quantificação da perda de neurônios GABAérgicos do hipocampo após P. gingivalis
infecção cerebral e o número de neurônios em degeneração após injeção intra-hipocampal
de gengiva. A eficácia do composto principal principal, COR388, foi determinada no cérebro
por qPCR para P. gingivalis –Genes específicos e por imunoenzimático
ensaio de sorvente (ELISA) para A • 1-42 e TNF •. Os animais foram atribuídos a cada
grupo experimental com igual probabilidade de receber
veículo ou tratamento.
Amostras de tecido humano
O tecido humano pós-mortembraina obtido da Fundação Neurológica do Banco de Cérebro
Humano de NewZealand na Universidade de Auckland foi doado ao Banco de Cérebro com
consentimento da família, e seu uso para este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de
Participantes Humanos da Universidade de Auckland. Os casos de controle não tinham
história de anormalidades neurológicas e a causa da morte não estava relacionada a
nenhuma condição neurológica. A análise patológica independente confirmou que qualquer
patologia amilóide foi considerada normal para a idade nos casos de controle selecionados
para este estudo. A análise patológica foi realizada em todos os casos de DA utilizados
neste estudo para determinar o diagnóstico patológico e atribuir graus patológicos, que,
juntamente com um histórico de demência, confirmaram o diagnóstico (tabelas S1 e S2).
As amostras de tecido pós-morte coletadas sob os protocolos aprovados pelo comitê
de revisão institucional (IRB) foram obtidas do Centro de Doença de Alzheimer da
Universidade da Califórnia Davis, Banco de Tecidos de Neurocirurgia da Universidade da
Califórnia em San Francisco (UCSF), Proteo-Genex (Culver City, CA) e PrecisionMed
(Solana Beach, CA). Amostras de tecido gengival foram coletadas de voluntários humanos
com doença periodontal crônica que forneceram consentimento informado assinado após a
natureza e as possíveis consequências dos estudos terem sido explicadas sob um
protocolo aprovado pelo IRB da Universidade da Califórnia em São Francisco (aprovação
nº 11-05608) . Amostras de CSF e saliva foram coletadas de voluntários humanos com
diagnóstico de provável DA que forneceram consentimento informado assinado após a
natureza e as possíveis consequências dos estudos serem explicadas sob um protocolo
aprovado pelo IRB obtido da PrecisionMed (Solana Beach, CA). Amostras de placa oral e
saliva foram coletadas de voluntários humanos com doença periodontal crônica que
forneceram consentimento informado assinado após a natureza e as possíveis
consequências dos estudos terem sido explicadas sob um protocolo aprovado pelo IRB
obtido do Forsyth Institute (Cambridge, MA).
Animais
Camundongos BALB / c fêmeas livres de patógenos específicos (SPF) foram adquiridos da Envigo (Reino
Unido) para os experimentos de infecção oral com P. gingivalis.
Os camundongos foram mantidos em gaiolas ventiladas individualmente e alimentados com uma dieta
padrão de laboratório e água ad libitum sob condições SPF dentro da instalação de cuidados com
animais da Faculdade de Bioquímica, Biofísica e Biotecnologia, a Universidade Jagiellonian, Cracóvia,
Polônia. Os camundongos foram mantidos em um ciclo claro / escuro de 12 horas a 22 ° ± 2 ° C e 60 ±
5 de umidade relativa. Camundongos controle e infectados com bactérias foram alojados
Dominy et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaau3333 23 de janeiro de 2019
em gaiolas separadas. Para estudar A • 1-42 níveis nos cérebros de camundongos infectados por via
oral e a eficácia dos inibidores da gengipaina para diminuir
P. gingivalis infecção do cérebro, 40 ( n = 8 por braço) camundongos BALB / c fêmeas de 43 a 44
semanas de idade ou 100 ( n = 10 por braço) foram usados camundongos BALB / c fêmeas de 8
semanas de idade, respectivamente. Todos os experimentos foram revisados e aprovados pelo I
Comitê Regional de Ética em Experimentação Animal, Cracóvia, Polônia (aprovação nos. 164/2013
e 116/2016).
Para estudar a neurodegeneração após injeção estereotáxica de gipainas no hipocampo
de rato, foram adquiridos 15 BALB / cmice de 8 semanas de idade do sexo masculino na
Envigo (EUA). Os animais foram alojados em grupo ( n = 2 a 4 por gaiola) em gaiolas de
plástico. Os animais foram mantidos em um ciclo claro / escuro de 12/12 horas com a
temperatura ambiente (RT) mantida em 22 ° ± 2 ° C e aproximadamente 50% de umidade e
receberam ração padrão para roedores e água da torneira ad libitum no Brains On -Line, LLC
Animal Facility (South San Francisco, CA). Os experimentos foram conduzidos de acordo com
os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais de Brains
On-Line, LLC (número de aprovação US16003).
Produção de anticorpos
Os anticorpos policlonais CAB101 e CAB102 foram produzidos pela GenScript USA Inc. (New
Jersey) de acordo com seu protocolo de imunização expresso. Resumidamente, os
imunógenos foram expressos em um sistema de expressão bacteriana e usados para quatro
imunizações consecutivas de quatro coelhos cada. As sequências imunogênicas expressas
são de 401 a 736 resíduos para CAB101 (RgpB; GenBank: BAG33985.1) e 22 a 400 resíduos
para CAB102 (Kgp; GenBank: BAG34247.1). Após a última imunização, os soros foram
agrupados e purificados por afinidade com o antígeno. A ligação específica foi testada em
WBs, e a ligação não específica em seções de histologia humana foi controlada por
coincubação de anticorpos policlonais com seus respectivos imunógenos antes da coloração
de IHC.
TMAs humanos
Os TMAs do cérebro humano compreenderam um total de 58 amostras de núcleo de 2 mm de
diâmetro, 29 de indivíduos controle sem demência e 29 de casos de AD, cada um em duas matrizes
(NVD003 e NVD005). Os tamanhos finais das amostras refletem a perda de várias amostras da
lâmina durante o processamento (consulte as tabelas S1 e S2).
IHC para detectar gingipains, tau e ubiquitina em TMAs humanos
Os TMAs foram construídos a partir de blocos MTG embutidos em parafino, conforme descrito em
detalhes por Narayan et al. (105). As seções de TMA foram cortadas com uma espessura de 7 • me
foram recozidos em lâminas por aquecimento a 60 ° C durante 1 hora. As seções foram então
desparafinadas usando xileno imersão em xileno duas vezes (1 hora e 10 min, respectivamente) e
reidratadas usando um procedimento de série de etanol graduado padrão. Para IHC, as lâminas foram
imersas em tampão de recuperação de antígeno de citrato de sódio (pH 6), aquecido a 121 ° C por 2
horas em 2100 Antigen Retriever (Aptum, Pick Cell Laboratories),
e, em seguida, enxágue três vezes por 5 minutos em milliQH 2 O. Para tau (1: 20.000; coelho A0024,
DAKO), as lâminas de IHC foram imersas em ácido fórmico a 99%
por 5 min, enxaguado três vezes em milliQH 2 O, e então tratado como por outros slides. As
lâminas foram então incubadas com um peróxido endógeno
solução de bloqueio dase (50% metanol, 1% H 2 O 2, diluído em mQH 2 O) por 20 min à temperatura
ambiente. Isso foi seguido por três lavagens em PBS e, em seguida,
as lâminas foram incubadas com tampão de bloqueio (soro de cabra normal a 10% em PBS) durante 1
hora à temperatura ambiente. Os anticorpos primários anti-ubiquitina de camundongo (1: 2000; MAB1510,
Chemicon), CAB101 (1: 500) e CAB102 (1: 500) foram aplicados para incubação durante a noite a 4 ° C.
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Para detectar a ligação do anticorpo, as lâminas foram lavadas em PBSwithTriton X-100 por
5min e depois duas vezes em PBS por 5min cada e incubadas com anticorpos biotinilados de cabra
anti-camundongo ou anti-coelho (Sigma-Aldrich) por 3 horas em temperatura ambiente. Após nova
lavagem, eles foram incubados por 1 hora à temperatura ambiente com Sigma Extravidin
peroxidase na diluição de 1: 1000 e, em seguida, lavados e incubados com o sub-peroxidase
estratégia [3,3 ′ - diaminobenzidina com 0,04% de Ni (NH 4) 2 ( TÃO 4) 2] para de-
Velop a mudança de cor. Seguindo PBS-milliQH 2 Owashes (3 × 5 min cada), as lâminas foram
desidratadas em uma série de etanol graduado seguido por
xileno e montado sob lamínulas com meio de montagem DPX.
Os anticorpos da gengipaina foram otimizados inicialmente em seções fixadas em
formalina e embebidas em parafina de tecido gengival coletadas de pacientes com doença
periodontal na Faculdade de Odontologia da UCSF sob um protocolo aprovado pelo IRB. O
teste foi então realizado em TMT (de ambos os cérebros de controle post mortem e humano
com DA) e cerebelo (controle negativo). A especificidade da coloração de anticorpos foi
demonstrada usando controles positivos e negativos, apenas anticorpos secundários,
controles de isotipos e pré-absorção do antígeno. Os controles de anticorpos “sem primários”
foram negativos para coloração. As lâminas coradas foram escaneadas com objetiva de 10 ×
usando um scanner de slides MetaSystems VSlide, e as imagens de campo claro foram
analisadas para gingipain (e outros marcadores) IR usando o programa de análise de imagem
MetaMorph. Para cada marcador, as imagens foram limitadas. Dois limiares para cada núcleo
foram determinados: um para determinar a área total do núcleo e o outro para determinar a
área total da região limite. Para determinar a carga de coloração por núcleo, a área limite de
coloração foi dividida pela área total do núcleo. Esta análise controlada para vários tamanhos
de núcleo.
IHC de seções cerebrais humanas com DA para neurônios, astrócitos e RgpB-IR
Para a análise 18E6, que reconhece um epítopo único dentro do domínio semelhante a
imunoglobulina (Ig) de Arg-gingipaina (RgpB) ( 58), A IHC foi realizada usando o sistema
automatizado Ventana Benchmark XT de preparação de lâminas no núcleo de tecido do
UCSF Brain Tumor Research Center. Para coloração de imunoperoxidase, após seções
de tecido (5 • m) foram desparafinizados (a 75 ° C; EZ-Prep, Ventana Medical Systems), a
recuperação do antígeno foi realizada por 30 min [Cell Condi-
ção 1 (pH 8,5), VentanaMedical Systems] a 95 ° a 100 ° C. H 2 O 2
(3%) (Thermo Fisher Scientific) foi aplicado por 8 min para reduzir
coloração de fundo. O anticorpo 18E6 (University of Georgia Monoclon Antibody Facility) foi
incubado à temperatura ambiente por 32 min em uma diluição de 1:10. A coloração foi
desenvolvida usando o Sistema de detecção DAB Universal UltraView (Ventana Medical
Systems), e as lâminas foram contrastadas com hematoxilina.
Para imunofluorescência, as seções foram desparafinizadas em xileno e reidratadas em
uma série de álcool graduado. A recuperação do antígeno mediada por calor foi realizada
com tampão cítrico (pH 6,0) (H-3300, Vector Laboratories). Após as lavagens com PBS, as
seções foram incubadas em solução de bloqueio, 5% de soro de burro e 0,3% de Triton
X-100 em PBS por 1 hora em temperatura ambiente. As seções foram incubadas durante a
noite a 4 ° C em anticorpos primários anti-MAP2 (1: 500; ab5392, Abcam), CAB101 (1: 500),
anti-IBA1 (1: 1000; ab97120, Abcam), anti- •• amilóide, 17-24 (1: 500; SIG-39200; 4G8,
BioLegend) e anti-AT8 (1: 2000; MN1020B, Thermo Fisher Scientific) em 3% de soro de
burro e 0,3% de Triton X-100 em PBS. Após as lavagens com PBS, as lâminas foram
incubadas com solução de anticorpo secundário, anti-galinha de cabra Alexa Fluor 647 (1:
200; A21449, Life Technologies) e anti-coelho de burro Alexa Fluor 488 (1: 200; Jackson
ImmunoResearch) misturado com anti – GFAP-
Dominy et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaau3333 23 de janeiro de 2019
Cy3 (1: 250; MAB3402C3, Millipore) ou Cy3-burro anti-coelho (1: 200; Jackson
ImmunoResearch), Alexa Fluor 488 burro anti-rato (1: 200; Jackson
ImmunoResearch) e Alexa Fluor 647 burro anti-cabra (1: 200; Jackson
ImmunoResearch) em PBS com
0,3% Triton X-100 por 2 horas à temperatura ambiente. As seções foram lavadas em PBS
e contrastadas com 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Invitrogen; D1306). A
autofluorescência foi extinta com TrueBlack Lipofuscina Autofluorescence Quencher 1:20
em 70% de etanol (catálogo no. 23007, Biotium), e as lâminas foram montadas com
ProLong Gold Antifade (P36930, Thermo Fisher Scientific). Coimunofluorescência em P.
gingivalis foi realizada secando bactérias em lâminas de microscópio SuperFrost Plus. As
bactérias foram imersas em paraformaldeído a 4% por 10 min, lavadas três vezes em PBS
e incubadas em ácido fórmico por 7 min, seguidas de outras três lavagens com PBS. As
células foram expostas a anti - •• amilóide, 17-24 (1: 500; SIG-39200; 4G8, BioLegend) e
CAB101 (1: 500) em 3% de sorvete de burro e 0,3% de Triton X-100 em PBS por 30 min à
temperatura ambiente, seguido por 30 min de incubação em Cy3-burro anti-coelho (1: 200;
Jackson ImmunoResearch) e Alexa Fluor 488 burro anti-camundongo (1: 200; Jackson
ImmunoResearch) em PBS, contrastado com DAPI e coberto com uma lamínula com
ProLongGold Antifade (Thermo Fisher Scientific; P36930).
A análise histológica foi realizada em microscópio motorizado Olympus BX61. Imagens de
fluorescência foram tiradas com uma câmera sCMOS (Zyla-5.5-USB3, Andor), e as imagens
de campo claro foram tiradas em uma câmera colorida de dispositivo de carga acoplada
(DP27, Olympus). As imagens foram processadas para correção de brilho e contraste, recorte
e adição de barras de escala com o softwareCellSens 1.14Dimension (Olympus).
Cérebro humano Kgp IP e WB
Tecido cerebral de cada amostra de sujeito (córtex, 100 mg) foi homogeneizado em gelo em
1 ml de tampão de lise B-PER (Thermo Fisher Scientific) com coquetel inibidor de
proteinase (Millipore) e então mantido em gelo por 10 min. O controle de bactérias foi
preparado por peletização de 10 9
bactérias por centrifugação a 5000 g por 10 min. Em seguida, o sedimento foi lisado em 1 ml
do mesmo tampão de lise em gelo durante 10 min. Todas as amostras foram centrifugadas a
16.000 g por 20 min a 4 ° C, e o sobrenadante foi coletado. A concentração de proteína foi
medida usando um kit de ensaio Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Um miligrama de
proteína total de cada amostra foi desnaturado a 95 ° C durante 5 min e, em seguida, foi
adicionado um volume igual de tampão de ligação e lavagem de anticorpo do Dynabeads
Protein G Immunoprecipitation Kit (Thermo Fisher Scientific). Para o controle de bactérias, 10 7 bactérias
foram usadas. Para a amostra de cérebro enriquecida com bactérias, 1 mg de proteína
cerebral total foi misturado com lisado bacteriano de 10 7 bactérias. As amostras foram
incubadas com 10 • g de anticorpo policlonal CAB102 de coelho com rotação durante a noite a
4 ° C. No dia seguinte, esferas de Proteína G Dynabeads pré-lavadas foram incubadas com 1
mg de serumalbumina bovina (BSA) em tampão de ligação por 30 min e depois lavadas três
vezes com tampão de lavagem. Em seguida, as amostras foram incubadas com Dynabeads
com rotação por 30 min em temperatura ambiente. As amostras foram lavadas quatro vezes
com 200 • l de tampão de lavagem usando rack magnético. As contas foram então dissolvidas
com 20 • 1 de tampão de eluição e 10 • 1 de tampão de amostra NuPAGE LDS e ditiotreitol
(DTT) 50 mM e aquecido a 70 ° C durante 10 min. Em seguida, as proteínas IP foram eluídas
das esferas magnéticas usando uma cremalheira magnética. Cada amostra (15 • l) foi então
submetido a eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE). O gel SDS-PAGE foi
submetido a análise de WB usando o sistema de transferência Trans-blot Turbo (Bio-Rad)
para transferir proteínas para a membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF). A membrana
foi então enxaguada com
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solução salina tamponada com tris (TBS) e então bloqueada com tampão de bloqueio do
Clean-Blot IPDetectionKit (Thermo Fisher Scientific) por 1 hora. O blot foi então incubado com
1: 1000 anticorpo primário CAB102 durante a noite com agitação em tampão de bloqueio a 4 °
C. O blot foi então lavado três vezes com tampão TBST, 5min cada, e então incubado com
diluição 1: 250 de reagente de detecção Clean-Blot [peroxidase de rábano (HRP)] em tampão
de bloqueio por 1 hora em temperatura ambiente. O blot foi então lavado quatro vezes com
TBST e então submetido ao reagente de detecção Pierce ECL e ao sistema de imagem
ChemiDoc.
análise qPCR de P. gingivalis no tecido cerebral humano
O DNA foi extraído e purificado de tecidos cerebrais do córtex pós-morte seguindo o
protocolo descrito no Blood and Tissue Kit (Qiagen). Número da cópia do P. gingivalis genoma
calcular o número de cópia inicial.
em amostras de DNA do cérebro foi determinado por qPCR com P. gingivalis -específico
16S
iniciadores [(ACCCTTTAAACCCAATAAATC (direto) e ACGAG-
TATTGCATTGAATG (reverso)] e sonda marcada com fluorescência
(CGCTCGCATCCTCCGTATTAC). A mistura de reação qPCR continha 100 ng de
DNA cerebral, 0,5 • Mprimers / 0,15 • Mprobe e Kapa Fast qPCR Mix (Kapa
Biosystems). A amplificação por PCR foi realizada usando os seguintes parâmetros
de ciclo: 3 min a 95 ° C, 50 ciclos de 3 s a 95 ° C e 30 s a 60 ° C. O número de
cópias foi determinado a partir da curva padrão gerada usando um modelo sintético.
Análise de sequência de P. gingivalis DNA amplificado de tecido cerebral
humano
Para sequenciamento, uma região de aproximadamente 1 kb do P. gingivalis
genoma englobando o hmuY (exceto as sequências correspondentes aos seis primeiros
aminoácidos) foi amplificado a partir de 50 ng de DNA cerebral por PCR. A amplificação
por PCR (95 ° C / 5 min; 95 ° C / 20 s, 60 ° C / 15 s e 72 ° C / 1 min por 35 ciclos; 72 ° C /
2 min) foi realizada usando o PCR KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kit (Kapa Biosystems) e
primers [TTCTCCGCACTCTGTGCATT (para a frente) andAGCACTTC-
GATTCGCTCGAT (reverso)] projetado para amplificar o hmuY gene do P. gingivalis genoma.cepas foram centrifugadas a 1000 g por 10 min à temperatura ambiente em meio de Eagle
Os produtos de PCR foram executados em gel de agarose a 2% e bandas de DNA
próximas do tamanho esperado (com base no produto de PCR obtido da amplificação de P. / ml), seguido de incubação por 1, 4 e 8 horas, re-
gingivalis DNA) foram excisados do gel (Fig. 2F). O DNA foi extraído dos pedaços de
gel seguindo o protocolo descrito no Gel Extraction Kit (Qiagen). Aproximadamente 5%
do DNA eluído foi reamplificado usando o mesmo hmuY Primers de PCR. O
sequenciamento de produtos de PCR reamplificados foi realizado usando primers
internos (fig. S3).
análise qPCR de P. gingivalis no LCR e saliva humana
As amostras de LCR e saliva combinada foram obtidas na PrecisionMed (Solana Beach, CA). Dez
sujeitos voluntários, que foram diagnosticados com provável AD e atenderam aos critérios de ter
uma pontuação de Exame de Status MiniMental (MMSE) de 20 ou menos, foram inscritos em série
no protocolo aprovado pelo IRB do PrecisionMed para coleta de CSF em novembro de 2017 e
amostras de CSF doadas e amostras de saliva correspondentes para P. gingivalis
Análise PCR.
Método de PCR de CSF
DNA foi extraído de 50 • l de CSF usando Puregene Core Kit A (Qiagen). O pellet de
DNA final foi dissolvido em 50 • l de tampão de hidratação de DNA. Um ensaio de PCR
de pré-amplificação (20 ciclos) foi realizado com 5 • l de DNA de CSF e P. gingivalis
hmuY iniciadores H1.2 específicos do gene [GGTGAAGTCGTAAATGTTAC (H1.2
direto) e TTGACTGTAATACGGCCGAG (H1.2 reverso)]. Uma diluição em série de
DNA modelo sintético também foi pré-amplificada para o cálculo
Dominy et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaau3333 23 de janeiro de 2019
do número da cópia. Os produtos de PCR pré-amplificados foram diluídos e um
ensaio de qPCR foi realizado com hmuY iniciadores [GAAC- GATTTGAACTGGGACA
(H1.1 direto) e AACGGTAGTAG- CCTGATCCA (H1.1 reverso)] e uma sonda (/
56-FAM / TTCTGTCTT / ZEN / GCCGGAGAATACGGC / 3IABkFQ /). Uma diluição
em série do mesmo DNA modelo sintético foi incluída no ensaio qPCR para gerar
uma curva padrão e calcular o número de cópias iniciais no LCR.
Método de PCR de saliva
DNA foi extraído de 50 • l de saliva usando Puregene Core Kit A (Qiagen). O pellet de
DNA final foi dissolvido em 50 • l de tampão de hidratação de DNA. Um ensaio de qPCR
foi realizado com 2 • l de DNA de saliva e hmuY iniciadores (H1.1) e a sonda mencionada
acima. Uma diluição em série de DNA modelo sintético foi incluída no ensaio qPCR para
análise qPCR de H. pylori no cérebro humano e no LCR
A pré-amplificação e o protocolo qPCR usado para detecção de
H. pylori número de cópias no cérebro, CSF e amostras de saliva foram os mesmos que aqueles usados
para detectar o P. gingivalis hmuY número da cópia do gene mencionado acima. Os qPCRprimers e a
sonda usados para detecção de H. pylori
o número da cópia foi descrito anteriormente ( 43). Projetamos dois primers
[GATTAGTGCCCATATTATGGA (Hpy_outer_For) e CTCACCAGGAACTAATTTAC
(Hpy_outer_Rev)] para a etapa de pré-amplificação. Esses primers amplificaram um
fragmento de 217 pb englobando a região amplificada pelos primers qPCR. Um DNA
sintético de 240 bases englobando a região amplificada por primers externos foi
utilizado como controle para a etapa de pré-amplificação.
Efeitos de P. gingivalis infecção em tau em células SH-SY5Y
Células SH-SY5Y (~ 2,4 × 10 6) foram inoculados por rotação com MOIs de 10,
50 e 100 com cada um dos seguintes: P. gingivalis [ American Type Culture Collection
(ATCC) BAA-308] [tipo selvagem (WT)], P. gingivalis KgP • Ig-B, e P. gingivalis • K / • RAB-A. Células
SH-SY5Y não infectadas foram usadas como controle. Células SH-SY5Y e P. gingivalis as
modificado por Dulbecco (DMEM) / F12 suplementado com 2 mM eu- glutamina e BSA (200 • g
espectivamente, em um CO 2 incubadora. Após os tempos de incubação indicados, as células foram
coletadas e os sedimentos celulares foram lisados com 250 • l de rádio-
tampão de ensaio de imunoprecipitação suplementado com coquetel de inibidor de
protease por 10 a 15min. Proteína total (16 • g) foi usado para WB. WBs foram sondados
com anticorpo monoclonal tau TAU-5 (Thermo-MA5-12808). Gliceraldeído-fosfato
desidrogenase (GAPDH) foi usado como uma referência interna.
Incubação Tau-441 com gingipains e WB
Tau-441 (2N4R) (rPeptídeo, T-1001-1; peso molecular, 45,9 kDa)
(2 • g) foi reconstituído em 1% NH 4 OH e digerido por 100, 10, 1 e 0,1 nMKgp / RgpB
em tampão de trabalho [20 nM de fosfato de sódio
e DTT 1 mM (pH 7,5)]. As reações de digestão foram realizadas durante 1 hora a 37 ° C;
as reações foram interrompidas com inibidor de protease (P8340, Sigma-Aldrich). As
proteínas foram separadas por eletroforese a 70 V por 15 min e depois a 85 V por 1,5
horas em um gel pré-moldado Criterion TGX a 10% (Bio-Rad, 5671033) (Bio-Rad, célula
de eletroforese vertical Criterion) e eletrotransferidas durante a noite em um PVDF
membrana a 10 V (Bio-Rad, Criterion Blotter). O blot foi bloqueado com BLOTTO
(87530, Thermo Fisher Scientific) por 1 hora e sondado com anticorpo primário
anti-Tau46 (13-6400, Thermo Fisher Scientific) na diluição de 1: 1000 em BSA a 3% em
TBS por 2 horas. Blot era
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em seguida, lavado três vezes por 10 min cada com TBST (28630, Thermo Fisher
Scientific) e, em seguida, incubado com anticorpo secundário HRP anti-camundongo de
cabra (1: 50.000; 31439, Thermo Fisher Scientific) em 3% BSA em TBS por 30 min. Após
lavagem adicional, o blot foi lavado três vezes por 10 min com TBST e a coloração do blot
foi visualizada usando detecção de quimioluminescência (34096; SuperSignalWest Femto,
Thermo Fisher Scientific).
Análise de cromatografia líquida - MS / MS de produtos de
clivagem de tau gerados por gingipaina
Amostras de Tau tratadas com 1 nMKgp / RgpB ou 10 nMKgp / RgpB foram analisadas por
1DNano LC-MS / MS (JadeBio, SanDiego, CA). A invertida-
coluna de fase (200 • m × 20 cm C 18 2,5 • m 130 Å) foi gerado internamente e acoplado
online a um espectrômetro de massa QExactive (Thermo
Fisher Scientific, Bremen, Alemanha). Os peptídeos foram separados por um gradiente linear de
95% de tampão A [0,1% de ácido fórmico (FA) em água] / 5% de tampão B [0,1% de FA em
acetonitrila (ACN)] para 60% de tampão A / 40% de tampão B em 150 min a 500 nl / min. O
espectrômetro de massa foi operado em um modo TOP20 dependente de dados com as seguintes
configurações: faixa de massa, 400 a 2000 relação massa / carga ( m / z); resolução para MS 1
digitalização, largura total de 70.000 na metade máxima (FWHM); resolução para MS 2
varredura, 17.500 FWHM; largura de isolamento, 3 m / z; NCE, 27; proporção de subpreenchimento, 1%;
exclusão dinâmica, 15 s. Espectros MS / MS brutos foram pesquisados contra UniProt Human + P.
gingivalis + bancos de dados de sequência de engodo. A taxa de descoberta falsa foi <0,1% ao nível do
péptido.
Caracterização de inibidor de gingipaina de molécula pequena
O projeto baseado na estrutura foi usado para desenvolver uma biblioteca de inibidores
de gingipaina, que foram testados em Kgp e RgpB purificados para avaliar a potência e
determinar constantes de inibição. A síntese química detalhada e a estrutura dos
compostos na série relevante de inibidores da gengipaina arginina, incluindo COR286,
podem ser encontradas no Pedido de Patente Internacional PCT / US2015 / 054050 e
PCT / US2016 / 061197. A síntese química detalhada e a estrutura de compostos na
série estrutural para inibidores de lisina gingipaina incluindo COR119, COR271 e
COR388 podem ser encontradas em PCT / US2016 / 061197. A capacidade dos
compostos para inibir a atividade da lisina ou arginina gingipaina foi medida em um
ensaio fluorogênico. O ensaio foi realizado em tampão [100mM tris-HCl, 75mMNaCl,
2,5mMCaCl 2, 10 mM de cisteína e 1% de dimetilsulfóxido (DMSO) (pH 7,5)] durante
90 min a 37 ° C. Kgp, RgpB e RgpA foram isolados
da cultura de P. gingivalis, conforme descrito por Potempa e Nguyen ( 39).
O substrato fluorogênico para Kgp foi de 10 • M Z-His-Glu-Lys-MCA e para RgpA e
RgpBwas 10 • MBoc-Phe-Ser-Arg-MCA. Tripsina
tampão era tris 10 mM e 10 mMCaCl 2 ( pH 8,0), e o substrato era Z-Gly-Gly-Arg-AMC.
COR286 tem um IC 50 de ≤20 pM em RgpB purificado e um IC 50 de 300 pM em RgpA
estruturalmente relacionado, mas nenhuma inibição significativa de Kgp. COR119 tem
um IC 50 de 10 nM em
Kgp, com COR271 e COR388 tendo IC 50 valores de ≤50 pM em Kgp. Todos não têm
atividade significativa em RgpB. Todos os compostos mostram
inibição insignificante de tripsina com IC 50 valores de ≥10 • M. COR271 e COR388 foram
traçados mais extensivamente em uma série de celulares
proteases, e nenhuma atividade biologicamente significativa (IC 50> 10 • M) foi detectado
nessas enzimas, incluindo catepsina S, calpaína, triptase,
trombina, plasmina, FXa, FVIIa, BACE1, DPP4, proteassoma, desabiquitinante
peptidases e enzimas da família das caspases.
Constante de inibição AMorrison ( K Eu) foi determinado para COR271
e COR388, e ambos exibem um K Eu de <0,01 nM. Estudos cinéticos enzimáticos foram
realizados para determinar o modo de inibição do
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compostos monitorando a recuperação da atividade enzimática após a diluição dos
complexos enzima / inibidor existentes. COR119 é um inibidor reversível, e COR271 e
COR388 exibem cinética de ligação irreversível. COR286 contém um mecanismo de
sítio de ligação catalítica idêntico ao COR271. As curvas de progresso da enzima a
partir deste
estudo foram usados para estimar K fora e T 1/2 ( meia-vida) do complexo enzimático reversível
com COR119. Ajustar a curva de progresso permite um
estimativa de K off / obs ( min -1) de 0,032 e T 1/2 de 22 min para COR119.
UMA K fora o valor para COR271 e COR388 não pode ser calculado, pois sua ligação é
irreversível.
A sonda de atividade COR553 foi preparada pela reação de cicloadição de
azida-alcino catalisada por cobre ( 106) entre um derivado azida do inibidor Kgp
irreversível COR553 e um derivado alquinoamida do fluoróforo Cy5. A sonda
COR553 forma uma ligação covalente irreversível com um resíduo de cisteína
catalítica no sítio ativo de Kgp por deslocamento de um grupo de saída fenol.
Efeito dos inibidores de gingipaina sobre P. gingivalis toxicidade em células
SH-SY5Y
Células de neuroblastoma humano SH-SY5Y em 13 passagens foram cultivadas em
meio completo [DMEM / F12 (Invitrogen) suplementado com 2 mM eu- glutamina
(Invitrogen), 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (10099141, Invitrogen) e 1%
de penicilina-estreptomicina
(Invitrogen)] em 5% de CO 2 incubadora (Thermo Fisher Scientific). As células foram semeadas a uma
densidade de 2 × 10 4 para 4 × 10 4 células por poço (200 • eu de
1 × 10 5 para 2 × 10 5 células / ml) em placas de fundo plano / preto de 96 poços (Greiner) revestidas
manualmente com colágeno tipo I e, em seguida, incubadas
em um CO 2 incubadora em 37 ° C.
Quando as células atingiram 70 a 80% de confluência (~ 6 × 10 4 células por
bem), eles foram desafiados com P. gingivalis com ou sem COR271, COR286,
moxifloxacina (32477, Fluka), doxiciclina (D9891-5G, Sigma-Aldrich) ou semagacestat
(S1594, SELLECK) em várias concentrações.
No dia do teste, a solução estoque foi diluída por oito séries de diluição dupla
em DMSO (Sigma-Aldrich) em uma placa de fundo V estéril de 96 poços
(WIPP0280, Axygen) do poço 2 ao poço 10. O poço 11 continha apenas DMSO. Do
poço 2 ao poço 11, as concentrações foram 12,8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2, 0,1,
0,05 e 0 mg / ml. Esta foi a placa-mãe do composto, com cada poço contendo 200 ×
concentrações de teste do composto em DMSO. Então, 6 • l da placa-mãe foi
transferido para uma placa de 96 poços profundos preenchida com 594 • l de meio
completo - penicilina / estreptomicina (diluição 1: 100) a 2 × concentração de teste
(128, 64, 32, 16, 8, 4, 2,
1, 0,5 e 0 • g / ml). Esta foi a solução de trabalho.
P. gingivalis ( ATCC BAA-308) foi inoculado a partir de estoque de −80 ° C em um ágar de
infusão de cérebro e coração (BD-211065). A placa foi incubada por 72 horas a 37 ° C em uma
estação de trabalho anaeróbica (YQX-II,
Xangai Yuejin). A atmosfera foi mantida a 80% N 2, 10% CO 2,
e 10% H 2
No dia do teste, as placas foram processadas em atmosfera ambiente
esfera. As bactérias foram colhidas e suspensas em meio completo - penicilina /
estreptomicina (sem penicilina / estreptomicina). A suspensão foi ajustada usando um
medidor de turbidez Siemens MicroScan (Siemens) para 0,5 turbidez, o que é equivalente a
~ 6 × 10 8 CFU / ml. A suspensão bacteriana foi diluída em meio completo - penicilina /
estreptomicina para uma densidade bacteriana final de 6 × 10 8 CFU / ml (para MOI de 1:
1000) incluindo um poço sem bactérias como controle negativo.
As células na placa de teste foram lavadas uma vez com 200 • l de
completemio-penicilina / estreptomicina. Então, 100 • l de solução de trabalho e 100 • 1 de
suspensão bacteriana foram adicionados. O teste final
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as concentrações foram 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, 0,025 e 0 • g / ml com
1% DMSO. As placas de teste foram incubadas a 37 ° C em um CO a 5% 2
incubadora por 24 horas.
A viabilidade celular foi determinada usando AlamarBlue (Invitrogen). As células nas
placas de teste foram lavadas duas vezes usando um meio completo - penicilina /
estreptomicina para remover as bactérias da suspensão. Então, 220 • l de AlamarBlue /
mediummix (consistindo em 200 • l de meio completo - penicilina / estreptomicina e 20 • 1 de
AlamarBlue) foi adicionado a cada poço das placas de teste. As placas de teste foram então
incu
batido em 37 ° CCO 2 incubadora para fluorescente reduzidaAlamarBlue para
desenvolver. O sinal fluorescente do AlamarBlue reduzido (exci-
530 nm / emissão, 590 nm) foi lida após 6 horas, antes da saturação, em um leitor
de placas SpectraMax M2e (Molecular Devices).
Injeção estereotáxica de gingipains no hipocampo de rato
Um estudo de 7 dias foi projetado para detectar a neurodegeneração hipocameral induzida por
gingipaina com Fluoro-Jade C (FJC), uma coloração fluorescente que demonstrou exibir
coloração máxima de neurônios em degeneração 1 semana após um insulto neurotóxico ( 107). Quinze
Para estudar A • 1-42 níveis no cérebro de camundongos infectados por via oral, 40 ( n = 8 por braço)
camundongos BALB / c machos de 8 semanas de idade (Envigo) foram usados no estudo. Os
animais foram alojados em grupo ( n = 2 a 4 por gaiola) em gaiolas de plástico. Os animais foram
mantidos em ciclo claro / escuro de 12/12 horas, com o TR mantido em 22 ° + 2 ° C e
aproximadamente 50% de umidade, e receberam ração padrão para roedores e água da torneira
ad libitum.
Os camundongos foram anestesiados com isoflurano (2%, 800 ml / min O 2).
Bupivacaína / epinefrina foi usada para analgesia local, e carpro-
fen foi usado para analgesia perioperatória / pós-operatória. Uma solução de RgpB (5 • g / ml)
+ Kgp (5 • g / ml) + 5mM eu- a cisteína foi preparada em solução salina estéril. Injeções
bilaterais de 0,5 • Eu fui feito em coordenadas a partir do bregma: ântero-posterior -2,0, lateral
± 1,5 e ventral -1,4 mm da dura-máter a uma taxa de 0,1 • l / min com um período de
descanso de 5 min usando uma seringa Hamilton (10- • l seringa com agulha de ponta romba
calibre 30 correspondente; modelo nº 80308) e o micromanipulador estereotáxico (Ultra Micro
Pump III com Micro4 Controller, World Precision Instruments). Quando a administração do
composto foi concluída, a agulha foi deixada no local por 5 min e, em seguida, retirada de
forma que levou aproximadamente 1 min para retirar totalmente a agulha.
Os camundongos receberam uma única administração de veículo ou droga 1,5 horas antes da
injeção estereotáxica de gengiva. Os camundongos tratados com inibidor receberam COR271 (100 mg /
kg) em PBS por gavagem oral e COR286 (20 mg / kg) em 25% de pluronic F127 por via subcutânea em
um volume de dose de 5 e 10 ml / kg, respectivamente. Os camundongos tratados com veículo
receberam PBS ou pluronic.
Sete dias depois, os camundongos foram anestesiados com isoflurano (2%,
800 ml / min O 2) e perfundido com PBS. Os cérebros foram colhidos, fixados em formalina
a 10%, incluídos em parafina e seccionados em 5 • m.
Seções seriais 200 • m separados por todo o hipocampo foram corados com o
kit de coloração pronto para diluir FJC (Biosensis) de acordo com o protocolo do
fabricante, e as células FJC-positivas na área CA1 foram contadas em um
microscópio motorizado Olympus BX61.
Crescimento de P. gingivalis W83
P. gingivalis [ W83 (ATCC, Rockville, MD), • Kgp ( • kgp), e • Rgp ( • rgpArgpB • 495-B Cm r, Em r] ( 57,
58) foi semeado em placas de ágar com caldo de soja tríptica (TSB) [5% de sangue de
ovelha, suplementado com eu- cisteína (0,5 mg / ml), hemina (5 • g / ml) e vitamina K (0,5 • g /
ml)] e cultivado sob condições anaeróbicas a 37 ° C durante 5 a 7 dias. As amostras foram
então inoculadas em TSB com hemina, vitamina K e eu- cisteína (TSB-HKC)
Dominy et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaau3333 23 de janeiro de 2019
até meio da fase de log OD 600 ( densidade óptica a 600 nm) de 0,5 a 0,7. As bactérias foram
lavadas em PBS e preparadas em uma concentração final
de 1 × 10 10 células / ml em PBS + 2% de metilcelulose.
P. gingivalis infecção oral em ratos
A periodontite experimental foi induzida pela colocação de ligadura. Durante o
procedimento, os camundongos foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal de
cetamina (200 mg / kg; VetaKetam, Polônia) e xilazina (10 mg / kg; Sedasin, Biowet,
Polônia), e os olhos foram lubrificados com pomada ( Puralube Vet; PharmaDerm, Melville,
NY). Em seguida, uma ligadura de seda 5-0 (Roboz Surgical Instrument Co., MD, EUA) foi
amarrada ao redor dos segundos molares superiores esquerdo e direito. A sutura foi
aplicada e amarrada delicadamente para evitar danos ao tecido periodontal. A ligadura foi
deixada em posição durante todo o período experimental para que a inflamação pudesse
ser constantemente induzida pela colonização de bactérias dentro dela.
Experimento 1
camundongos BALB / c fêmeas de 43 a 44 semanas de idade foram infectados por
6 semanas em dias alternados. Para infecção, 100 • L da solução bacteriana foi aplicada
topicamente na superfície vestibular da maxila. COR119 em 2% DMSO / PBS foi
administrado três vezes ao dia por injeção subcutânea começando no dia 21 e
continuando até o dia 42. Os animais tratados com veículo receberam apenas DMSO.
Para promover
definir o papel dos gengibres na indução do cérebro A • 1-42, ratos foram infectados com
P. gingivalis W83 (WT) ou P. gingivalis em falta
Kgp ( • kgp) ou o Rgp-null P. gingivalis cepa mutante ( • Rgp) ( 58).
Após 6 semanas, os ratos foram sacrificados e perfundidos com PBS, e os cérebros foram
colhidos e congelados em nitrogênio líquido.
Experimento 2
Para estudar a eficácia dos inibidores de gingipaina para diminuir P. gingivalis
infecção do cérebro, 100 ( n = 10 por braço) Camundongos BALB / c fêmeas de 8 semanas de idade
foram infectados por 6 semanas em dias alternados, conforme descrito acima. Os ratos receberam
inibidores de gingipaina ou moxifloxacina por 5 semanas (dias 36 a 70). COR271 foi administrado por
via oral duas vezes ao dia em PBS a 10 mg / kg; COR286 foi administrado por via subcutânea duas
vezes ao dia em 25% de pluronic F127 (10 mg / kg; Sigma-Aldrich, EUA). A moxifloxacina
(Sigma-Aldrich, EUA) foi administrada por via subcutânea duas vezes ao dia em PBS a 10mg / kg.
Os animais tratados com veículo receberam PBS ou pluronic apenas. Um grupo de falsos infectados
e P. gingivalis Camundongos infectados com W83 (WT) foram sacrificados no dia 35 para reunir
medições de linha de base antes do início do tratamento. Após 10 semanas, P. gingivalis W83 (WT) -
camundongos infectados e camundongos infectados com bactérias ± inibidores de gingipaina ou
moxifloxacina foram sacrificados, e o cérebro e o soro foram
colhido e congelado em nitrogênio líquido.
Experimento 3
Para estudar a eficácia dos inibidores de gingipaina para diminuir P. gingivalis
infecção do cérebro, 70 ( n = 10 por braço) Camundongos BALB / c fêmeas de 8 semanas de idade
foram infectados por 6 semanas em dias alternados, conforme descrito acima. Os ratos receberam
COR388 (3, 10 ou 30mg / kg) ouCOR271 (10mg / kg) duas vezes ao dia em PBS por 5 semanas
(dias 36 a 70) por administração oral. Os animais tratados com veículo receberam apenas PBS. Os
camundongos foram sacrificados no dia 35 ou 70, e um hemisfério cerebral e o soro foram
congelados em nitrogênio líquido, enquanto um hemisfério cerebral foi fixado em formalina a 10%.
UMA • ELISA
Amostras do cérebro (metade posterior do hemisfério esquerdo) eram homogêneos
nizado em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (VWR), e A • 1-42
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foi quantificado com um NovexMouse Beta Amyloid 1-42 (A • 42) Kit ELISA (Thermo
Fisher Scientific, EUA) de acordo com as especificações do fabricante.
Ensaios ELISA para TNF •
O lisado cerebral foi quantificado para TNF • com ProcartaPlex Chemokine Convenience
Panel 1 (Thermo Fisher Scientific) em uma plataforma Luminex seguindo o protocolo
do fabricante e com kit de mouse aV-PLEXProinflammatory Panel 1 (Meso Scale
Diagnostics, Rockville,
MD). Os resultados de ambos os ensaios foram corrigidos para o conteúdo de proteína e normalizados
para o grupo simulado, e as médias de ambos os ensaios foram analisadas como um conjunto de dados
combinado.
Análise de endpoint PCR de P. gingivalis tecido cerebral de ratos
O DNA bacteriano foi extraído de cérebros de camundongos usando os kits DNeasy
Blood & Tissue (Qiagen, Alemanha) de acordo com os protocolos do fabricante. A
concentração de DNA foi medida usando um NanoDrop 2000 (Thermo Fisher
Scientific, EUA). O DNA bacteriano foi amplificado com 16 S primers de RNA
ribossômico (rRNA) para a cepa W83 de P. gingivalis [ AGGCAGCTTGCCATACTGCG
(para a frente) e ACTGTTAGCAACTACCGATGT (reverso)]. A amplificação de PCR foi
conduzida em um 12- • l volume de reação incluindo 3 • l de DNA cerebral (80 ng de
DNA), 6 • l de EconoTaq PLUS Green 2 × MasterMix (Lucigen, EUA), 0,6 • l (10 • M) de
cada iniciador (GenoMed,
Polônia) e 1.8 • l de H 2 O (Thermo Fisher Scientific, EUA). Quarenta ciclos de
amplificação foram realizados em um termociclador de DNA
(TProfessional TRIO, Biometra, Alemanha) consistindo em 3 min para 95 ° C, 20 s para
95 ° C, 30 s para 57 ° C, 30 s para 72 ° C e 5 min para 72 ° C. O produto amplificado foi
identificado por eletroforese em um
Gel de agarose a 1,5% (BioShop, Canadá). O DNA foi corado com brometo de etídio,
visualizado em transiluminador de comprimento de onda curto e fotografado em
imager runVIEW (BIOCOMdirect, UK).
UMA • 1-42 liga-se à superfície de P. gingivalis
Recombinante A • ( 1-42) Ultra-Pure, AmmoniumHydroxide (rProtein)
foi preparado como soluções estoque (1 mg / ml) em 1% NaNH 4 - P. gingivalis
foi lavado em PBS e incubado a 10 8 CFU / ml em A • ( 10, 30,
e 100 • g / ml) por 1 hora à temperatura ambiente e oxigênio ambiente. Para IHC, um 10- • A
solução foi seca em lâmina de vidro SuperFrost Plus (VWR) fixada em paraformaldeído a 4%
por 10 min. A lâmina foi então enxaguada
com PBS e dH 2 O, exposto ao ácido fórmico e, após lavagem com PBS, incubado por
2 horas em PBS, 0,3% TritonX-100 e anti-primário
corpos CAB102 (1: 1000) e 4G8 (1: 1000; BioLegend). A marcação por fluorescência foi
realizada com anti-coelho de burro Alexa Fluor 488 (1: 200; Jackson ImmunoResearch)
e anti-cabra de burro Cy3 (1: 200; Jackson ImmunoResearch) em PBS. As lâminas
foram montadas com ProLong Gold Antifade (Thermo Fisher Scientific). As imagens
foram tiradas em um microscópio Olympus BX61 com uma câmera Zyla 5.5 sCMOS
(Andor).
Efeitos antimicrobianos de A • em P. gingivalis
Recombinante A • ( 1-40, 1-42, 1-42 embaralhado) Ultra-Pure, AmmoniumHydroxide
(rProtein) foi preparado como 0,2 mM soluções estoque
em 1% NaNH 4 - UMA • peptídeos foram adicionados a P. gingivalis culturas a uma concentração final
de 20 mM e mantidas a 37 ° C sob condições anaeróbicas
dições por 24 horas. As células foram lavadas em PBS e coradas com o LIVE /
DEADBacLight BacterialViabilityKit (ThermoFisher Scientific) de acordo com o protocolo do
fabricante. A intensidade da fluorescência foi quantificada em um leitor de placas
PerkinElmer Envision.
Dominy et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaau3333 23 de janeiro de 2019
análise qPCR de P. gingivalis tecido cerebral interno
O DNA foi extraído do tecido cerebral usando o DNeasy Blood & Tissue Kit
(Qiagen, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. TaqMan qPCR foi
realizado com Kapa Probe fast qPCR Mix (Rox Low) em um Bio-Rad CFX96
Real-Time System C1000 Touch ThermalCycler com o forward (5 ′ - AGCAACCAGCTAC-
CGTTTAT-3 ′) e reverso (5 ′ - GTACCTGTCGGTTTACCATCTT-3 ′)
primers e 6-FAM-TACCATGTTTCGCAGAAGCCCTGA-TAMRA
como a sonda de detecção. Os primers foram baseados em uma única cópia de
P. gingivalis gene específico da arginina cisteína-proteinase ( 108). Amostras
duplicadas foram analisadas em um volume total de 10 • l, contendo 100 ng de solução
de DNA genômico de cérebro modelo, TaqMan Universal PCR Master Mix (2 ×) (Kapa
Biosystems, EUA) e o conjunto específico de primers (concentração final, 5 • M) e
sonda (concentração final, 4 • M) (GenoMed, Polônia), correspondendo a 562,5 nM de
primers direto e reverso e 100 nM da sonda. Após uma etapa inicial de incubação de 2
min a 50 ° C e desnaturação a 95 ° C por 20 s, foram realizados 40 ciclos de PCR (95
° C por 20 se 60 ° C por 30 s). O número de cópias do P. gingivalis genoma foi
calculado por
Coincidindo C q valores com uma curva padrão preparada a partir de diluições em série de
culturas P. gingivalis W83 (WT).
Quantificação de interneurônios Gad67 + hipocampal
O anticorpo anti-GAD67, clone 1G10.2 (MAB5406, MilliporeSigma), foi usado a uma
diluição de 1: 2000 para IHC. A quantificação dos interneurônios Gad67 + foi
realizada com o software CellSens 1.5. A área do hilo foi definida como a área entre
as lâminas do giro denteado conectadas por uma linha reta no lado aberto. O
número de células a cada 40 seções do hipocampo foi contado. Os resultados são
apresentados como o número de células por volume de tecido.
Preparação de P. gingivalis lisados para eletroforese em gel
Bactérias (10 8) foram coletados e centrifugados a 5000 g por 10 min a 4 ° C. O sobrenadante
foi descartado. O sedimento de células bacterianas foi lisado com 1 ml de tampão de lise
B-PER (Thermo Fisher Scientific) em gelo por 10 min e depois centrifugado por 10 min a
14.000 g a 4 ° C. O sobrenadante contendo lisado de proteína foi coletado.
Rotulagem de sonda de atividade COR553 de Kgp
P. gingivalis lisado, Kgp purificado ou amostras de placa subgengival humana foram
incubadas com 1 • M de Cy5 sonda COR553 durante 1 hora a 37 ° C com agitação. Para
amostras tratadas com COR388, 1 • M COR388 foi adicionado durante 30 min a 37 ° C antes
da adição de COR553. Em seguida, as amostras foram desnaturadas com tampão de
amostra NuPAGE LDS (Thermo Fisher Scientific) contendo DTT 50 mM a 95 ° C por 10 min
e submetidas a SDS-PAGE com o critério 4 a 15% de gel pré-moldado (Bio-Rad) e tris /
glicina / Tampão de corrida SDS (Bio-Rad). O gel foi executado a 75 V por 10 min e depois a
125 V por 1,5 horas, seguido por visualização Cy5 com sistema de imagem ChemiDoc
(Bio-Rad).
IP do Kgp rotulado com COR553
Para IP de Kgp marcado com Cy5, as amostras foram incubadas com 10 • g de anticorpo policlonal
CAB102 de coelho com rotação durante a noite a 4 ° C, incubado com esferas de proteína G
Dynabeads pré-lavadas com rotação por 20 min à temperatura ambiente, lavado e
magneticamente separado. As contas foram então dissolvidas com 20 • l de elutionbuffer e 10 • 1 de
tampão de amostra NuPAGELDS e 50 mMDTT e aquecido a 70 ° C por 10 min, eluindo as
proteínas IP. As amostras foram então submetidas a SDS-PAGE e os sinais da sonda Cy5 foram
visualizados com um sistema de imagem ChemiDoc (Bio-Rad).
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SC I ENCE ADVANCE S | ARTIGO DE PESQUISA
Análise WB de amostras marcadas com COR553
Após a obtenção de imagens com detecção de Cy5, os mesmos géis foram transferidos para
membranas de PVDF e imunotransferidos com anticorpo anti-Kgp CAB102. As membranas
foram bloqueadas com tampão BSA TBST a 3% por pelo menos 1 hora, incubadas com 1: 1000
CAB102 por 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C em tampão de bloqueio
e visualizadas com anticorpo IgG anti-coelho de cabra conjugado a HRP (# 31462, Thermo
Fisher Scientific) e detecção quimioluminescente usando SuperSignal West Femto (Thermo
Fisher Scientific) e um sistema de imagem ChemiDoc.
Coleta e processamento de amostras de saliva humana e placa
subgengival
As amostras de placa subgengival oral e saliva foram obtidas de cinco indivíduos
humanos com doença periodontal sob um protocolo clínico aprovado pelo IRB. Uma
amostra de saliva não estimulada (cerca de 1 ml) foi obtida por coleta em um tubo falcon
estéril de 15 ml após uma lavagem com água de 2 minutos. As amostras foram coletadas
em um horário consistente do dia para evitar efeitos diurnos e foram mantidas resfriadas
durante e após a coleta. Após o término da coleta, a tampa do tubo foi bem parafusada e
transferida para −80 ° C.
Duas amostras de placa subgengival por local foram coletadas de locais periodontais de
quatro dentes periodontais com ≥6 mm de profundidade de bolsa usando pontas de papel
absorvente endodôntico (tamanho, 40). Os locais de amostragem foram suavemente secos ao ar
e isolados com pelotas de algodão para evitar contaminação com saliva. As pontas de papel
foram inseridas nos bolsos por 30 s até sentir resistência. As pontas de papel foram seguradas
com um alicate, removidas do local e colocadas em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml
pré-etiquetados. As amostras foram eluídas das pontas de papel, colocando-as em 100 • l de
tampão de lise B-PER em um tubo de 1,5 ml de ligação baixa, sacudindo o tubo a uma batida
por segundo por 30 s, descartando a ponta de papel e congelando rapidamente as amostras em
nitrogênio líquido. Cada amostra de placa foi processada desta maneira separadamente, mas
combinada para análise. Vinte microlitros do eluato foram usados para marcação de sonda
COR553, 5 • l foi usado para a determinação da proteína BCA, e 2 • l foi usado para qPCR.
detecção qPCR de P. gingivalis número de cópias na saliva e placa
subgengival de seres humanos
DNA foi extraído de 50 • l de Saliva usando Puregene Core Kit A (Qiagen). O pellet
de DNA final foi dissolvido em 50 • l de tampão de hidratação de DNA. Um ensaio de
qPCR foi realizado com 2 • l de DNA de saliva e hmuY iniciadores
[GAACGATTTGAACTGGGACA (H1.1 direto) e AACGGTAGTAGCCTGATCCA
(H1.1 reverso)] e uma sonda (/ 56-FAM / TTCTGTCTT / ZEN /
GCCGGAGAATACGGC /
3IABkFQ /). Uma diluição em série de DNA modelo sintético foi incluída no ensaio
qPCR para calcular o número de cópias de P. gingivalis
na saliva. qPCR foi realizado em 2 • l de eluato puro da placa subgengival (sem
extração de DNA). Os primers e métodos foram os mesmos usados para a saliva
acima.
Determinação do crescimento dependente de Kgp de P. gingivalis
P. gingivalis [ WT (ATCCBAA-308) e KgP • Ig-B] foi inoculado a partir de estoques em
20 ml de meio TSB modificado pré-reduzido [TSB + extrato de levedura (5 mg / ml), eu- cisteína
correlação de Spearman.
(0,5 mg / ml), hemina (5 • g / ml) e vitamina K1 (1 • g / ml)] e incubado a 37 ° C por 48
horas anaerobicamente em uma câmara de vinil Coy tipo C. A pré-redução de todas
as soluções usadas foi feita transferindo os líquidos para uma câmara anaeróbica por>
16 horas imediatamente após a autoclavagem. No dia do experimento, a cultura
primária foi diluída para obter OD
Dominy et al., Sei. Adv. 2019; 5: eaau3333 23 de janeiro de 2019
de 0,2 a 0,25 usando um medidor de turbidez Siemens MicroScan no
meio TSB modificado pré-reduzido e incubado por 6 horas para atingir a fase log (DO de
aproximadamente 0,5 a 0,6) a 37 ° C. Em seguida, as bactérias foram coletadas por
centrifugação a 4000 rpm por 10 min e lavadas. Pelotas foram diluídas para 3 × 10 8 para
5 × 10 8 UFC / ml e 10ml dessas culturas diluídas foram transferidos para tubos cônicos e
centrifugados. O sedimento resultante foi ressuspenso usando 10 ml de meio definido
para avaliar o crescimento. O meio definido consiste em
seguinte: suplemento à base de sal [10,0 mMNaH 2 PO 4, 10,0 mMKCI, 2mM de ácido
cítrico, 1,25mMMgCl 2, 20,0 • MCaCl 2, 0,1 • MNa 2 MoO 4,
25,0 • MZnCl 2, 50,0 • MMnCl 2, 5.0 • MCuCl 2, 10,0 • MCoCl 2, e
5.0 • MH 3 BO 3 ( pH 7,0)] com 20 mM •• cetoglutarato, 3% BSA, hem (5 • g / ml) e
vitamina K (1 • g / ml). Cinqüenta microlitros de 100 ×
Estoque COR388 preparado em DMSO foi adicionado à suspensão bacteriana (3 × 10 8 para
5 × 10 8 CFU / ml) para cada cepa com uma concentração final de 500 nM. As culturas de
veículos foram tratadas com DMSO a 0,1%. As bactérias foram incubadas a 37 ° C na
câmara anaeróbia e a DO foi medida em 0, 21 e 43 horas para gerar um curso de tempo
de crescimento da cultura.
Avaliação da resistência in vitro de P. gingivalis
P. gingivalis ( ATCC BAA-308) e P. gingivalis Kgp nocaute foram
descongelado e uma cultura de OD 600 = 1,2 (igual a 3 × 10 9 para 5 × 10 9 CFU / ml) foi preparado
como descrito acima. A resistência foi avaliada por incu
bação de 16 passagens em série de P. gingivalis no meio definido listado
anteriormente, e a resistência a COR388 foi realizada simultaneamente com culturas
incubadas com o antibiótico de amplo espectro moxifloxacina. Porque COR388 não
inibe completamente P. gingivalis
crescimento in vitro, definimos MIC como a concentração mínima de COR388 que produziu
um corte de inibição parcial, especificamente> 50% de inibição em comparação com culturas
não tratadas. A resistência foi avaliada em dois métodos padrão, com os dados finais
relatados como uma média de ambos os métodos. As culturas foram preparadas primeiro com
droga e moxifloxacina em uma faixa de doses, passando cada vez por 17 passagens e
monitorando a CIM em cada passagem. Em um estudo separado, as concentrações de drogas
aumentaram gradualmente entre as passagens. A menor concentração de droga que inibiu>
50% do crescimento foi registrada como o MIC, inóculo desta passagem usado para a próxima
passagem, e avaliada em uma nova concentração de droga usando a maior concentração de
droga que era subletal e aumentando as concentrações ao longo do o teste conforme
necessário.
Análise estatística
Os dados foram analisados com GraphPad Prism versão 7.02 para Windows (GraphPadSoftware,
La Jolla, CA, EUA; www.graphpad.com). Outliers foram detectados com o método ROUT ( Q = 0,2%)
e removido de análise posterior. Os valores discrepantes não foram removidos dos dados
apresentados na Fig. 1. Para determinar se os dados estavam normalmente distribuídos,
realizamos um teste de Shapiro-Wilk. E se P os valores estavam abaixo de 0,05, então os dados
foram considerados não paramétricos e analisados pelo teste de Mann-Whitney ou análise de
variância (ANOVA) univariada de Kruskal-Wallis seguida pelo teste post hoc de Dunn. Os dados
paramétricos foram analisados por desemparelhados t teste ou por ANOVA unilateral seguida pelo
teste de comparações múltiplas de Dunnett. As correlações foram analisadas com o coeficiente de
MATERIAIS COMPLEMENTARES
O material suplementar para este artigo está disponível em http://advances.sciencemag.org/cgi/ content / full / 5/1 /
eaau3333 / DC1
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Fig. S1. Análise CAB101 de microarranjos cerebrais com doenças neurológicas não relacionadas à DA.
Fig. S2. RgpB IHC em amostras de hipocampo de pacientes não demenciados e com DA. Fig. S3. Sequenciamento
de P. gingivalis hmuY Produtos de PCR de cérebros AD. Fig. S4. Sequenciamento de P. gingivalis hmuY Produtos de
PCR de AD CSF clínico. Tabela S1. NVD003 AD e controle de dados do paciente TMA.
Tabela S2. NVD005 AD e controle de dados do paciente TMA.
Tabela S3. Fragmentos de tau identificados por MS após exposição à gengiva.
Tabela S4. Informações demográficas de pacientes com PC que doaram amostras de saliva e placa subgengival.
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Agradecimentos: Somos imensamente gratos aos doadores de tecido cerebral e suas famílias. Também somos muito gratos a
N. Mehrabi, M. Singh-Bains e S. Feng (Centro para Pesquisa do Cérebro, Universidade de Auckland) por sua assistência
especializada com a construção de TMA, IHC e análises de MetaMorph e a M. Eszes, a Gerente do Banco de Cérebro Humano. Financiamento:
PM foi apoiado pelo National Science Center 2016/23 / B / NZ5 / 011469, Polônia. JP foi apoiado pela concessão R01DE022597
do NIH / NIDCR. Este trabalho foi financiado pela Cortexyme Inc. Contribuições do autor: SSD e CL desenvolveram e
coordenaram o projeto, planejaram experimentos, avaliaram os dados e redigiram o manuscrito. FE projetou, realizou e analisou
experimentos de IHC e imunofluorescência em tecidos cerebrais humanos; projetou, realizou e analisou experimentos em
injeção estereotáxica de gingipains no cérebro de camundongo; projetou, realizou e analisou experimentos sobre os efeitos
antibacterianos de A • em P. gingivalis; e analisou amostras de cérebro de todos os experimentos com animais. MB e AM
projetaram, realizaram e analisaram experimentos usando um modelo de mouse de P. gingivalis –Doença periodontal induzida
e infecção cerebral. AK projetou e supervisionou o desenvolvimento de inibidores de gingipaina de pequenas moléculas.
MN realizou IP e WB de Kgp de tecidos cerebrais humanos. UH analisou amostras de cérebro de todos os experimentos
com animais. DR projetou, realizou e analisou experimentos de PCR de P. gingivalis Carga de DNA no LCR humano. CG
realizou a digestão in vitro de tau-441 recombinante por gingipains e desenvolveu o WB de fragmentos proteolíticos de tau.
LJH e SA-K. projetou e avaliou experimentos e editou o manuscrito. SK avaliou experimentos e editou o manuscrito. AL
auxiliou nos aspectos bioquímicos dos experimentos. MIR avaliou experimentos e editou o manuscrito. BP forneceu
gengivas purificadas. PM, AH e KA ajudaram na realização de experimentos em ratos e na análise de espécimes animais.
HH forneceu amostras de saliva e placa subgengival de indivíduos periodontais no The Forsyth Institute. GDW e ECR
analisaram a gingipaina-IR em tecido cerebral com DA na Universidade de Melbourne e forneceram anticorpos contra a
gingipaina. RLMF, MAC e MD coordenou experimentos e analisou os TMAs cerebrais usando anticorpos anti-gingipaina na
NeuroValida, da Universidade de Auckland. JP desenvolveu e coordenou o projeto, planejou experimentos, avaliou os
dados e ajudou a redigir o manuscrito. Interesses competitivos:
SSD e CL são co-fundadores da Cortexyme, são funcionários da empresa e possuem ações da Cortexyme. FE, MN, UH, DR,
CG, LJH, SA-K., SK e AL são funcionários da Cortexyme com opções de ações. AK é um consultor pago da Cortexyme e
possui ações da Cortexyme. MIR e JP são consultores científicos da Cortexyme e têm opções de compra de ações da
Cortexyme. AK, SSD e CL são inventores de duas patentes emitidas, ambas intituladas "Inibidores de gingipaina de lisina" (US
/ 9.975.473 e US / 9.988.375), bem como dois pedidos de patentes pendentes intitulados "Inibidores de gingipaina de arginina"
(PCT / US2016 / 061197, depositado em 9 de novembro de 2016) e “Inibidores de cetona de lisina gingipaina” (PCT / US2017 /
051912, apresentado em 15 de setembro de 2017). SSD e CL são inventores de um pedido de patente intitulado "Métodos de
uso para terapêutica visando o patógeno P. gingivalis ”(US2017 / 0014468, arquivado em
29 de abril de 2015). AK e LJH são inventores de um pedido de patente intitulado "Sondas de atividade de Gingipain" (62 /
459.456; arquivado em 15 de fevereiro de 2017). A Cortexyme é a cessionária dessas patentes e pedidos. Os outros autores
declaram não ter interesses conflitantes. Disponibilidade de dados e materiais: Todos os dados necessários para avaliar as
conclusões do artigo estão presentes no artigo e / ou nos Materiais Suplementares. Dados adicionais relacionados a este artigo
podem ser solicitados aos autores.
Enviado em 30 de maio de 2018 Aceito em 11
de dezembro de 2018 Publicado em 23 de
janeiro de 2019
10.1126 / sciadv.aau3333
Citação: SS Dominy, C. Lynch, F. Ermini, M. Benedyk, A. Marczyk, A. Konradi, M. Nguyen,
U. Haditsch, D. Raha, C. Griffin, LJ Holsinger, S. Arastu-Kapur, S. Kaba, A. Lee, MI Ryder,
B. Potempa, P. Mydel, A. Hellvard, K. Adamowicz, H. Hasturk, GD Walker, EC Reynolds,
RLM Faull, MA Curtis, M. Dragunow, J. Potempa, Porphyromonas gingivalis em cérebros com doença de Alzheimer: evidências
para a causa da doença e tratamento com inibidores de moléculas pequenas.
Sci. Adv. 5, eaau3333 (2019).
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