Cromatografia

Prof. Valmir F.
Juliano
QUI624
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS
Classificação dos métodos analíticos
CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS
Chamados de métodos Baseados em propriedades

de via úmida físicas (químicas em alguns casos )
Gravimetria Volumetria Eletroanalítico Cromatográfico
Espectrométrico
Propriedades Propriedades Propriedades

elétricas ópticas mistas*
*Separação: interações físico-químicas.
Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou elétricas.
Cromatografia
Histórico
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903),
botânico russo: Separação de misturas de pigmentos
vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e
éter de solventes variados.
petróleo
mistura de
pigmentos
CaCO3 pigmentos
separados
1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)

Cromatografia
Definição - Princípio Básico
Cromatografia é um método físico-químico de

separação de misturas, identificação e
quantificação de seus componentes.
• A separação depende da interação dos componentes da
mistura com a fase móvel e com a fase estacionária.
• A interação dos componentes da mistura com estas duas fases
é influenciada por diferentes forças intermoleculares,
incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de
afinidade e solubilidade.
• A identificação se dá mediante a comparação da
interação de padrões com as fases estacionárias.
• A quantificação é feita também pela comparação com
padrões de concentrações conhecidas, através de
curvas analíticas.
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas
• De acordo com o sistema cromatográfico
• Em Coluna
• Cromatografia Líquida
• Cromatografia Gasosa
• Cromatografia Supercrítica
• Planar
• Centrífuga (Chromatotron®)
• Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
• Cromatografia em Papel (CP)
Cromatografia
• De acordo com a fase móvel
• Utilização de Gás
• Cromatografia Gasosa (CG)
• Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)
• Utilização de Líquido
• Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
• Utilização de Gás Pressurizado

• Cromatografia Supercrítica (CSC)
Cromatografia
• De acordo com a Fase Estacionária
• Líquida
• Sólida
• Quimicamente Ligadas
• De acordo com o modo de separação
• Por Adsorção
• Por Partição
• Por Troca Iônica
• Por Afinidade
Cromatografia
Técnica Planar Coluna
FM Líquido Gás Líquido
FE Líq Sól Líq Sól Líq Sól Troca Afinidade Fase Exclusão
Iônica Ligada
Tipo de
cromato- CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE
grafia
Cromatografia
Analogia
O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo
de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região.
Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as
moscas e abelhas.
Fase estacionária Analitos

Cromatografia
Analogia
Para uma mesma mistura, a simples troca da fase

estacionária pode ser suficiente para alterar completamente
a ordem de eluição de componentes da mistura.
Fase estacionária Analitos

Cromatografia
Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Fase estacionária líquida suportada na celulose.
Separação
Fase móvel
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos

(líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom
exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível
verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.
Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem

simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na
separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser
largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está
fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases
estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica.
Cromatografia
Termos e parâmetros técnicos
ΔSmancha
Rf 
ΔSsolvente
a
Rfa 
s s
c
b
Rfb 
s
b
c
a Rfc 
s
Cromatografia
FASES ESTACIONÁRIAS
Sílica (SiO2)
Ativação de 30 a 60 min
de 105 a 110 oC
Alumina (Al2O3)
Celulose Ativação de 10 min

a 105 oC
Poliamida
Cromatografia
ANÁLISE QUALITATIVA
- Comparação com valores de Rf tabelados
- Comparação com padrão eluído em conjunto
- Extração e aplicação de métodos instrumentais

Cromatografia
Conclusões:
Amostra não contém a espécie B
Amostra pode conter a espécie A
Para se certificar da presença,

eluir em outros solventes
A B Após
Amostra Eluição
Cromatografia
Cromatografia
Bi-dimensional
Solvente 1 Solvente 2
Cromatografia
Cromatografia planar
Chromatotron é uma
cromatografia de camada
fina preparativa acelerada
centrifugamente. Pode
substituir pequenas colunas e
HPLC.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Cromatografia
PROCESSOS DE SEPARAÇÃO
Exclusão Partição
Adsorção Troca Iônica
Afinidade
Cromatografia
ADSORÇÃO
- Fase Móvel Líq. ou Gás
- Fase Estacionária Sólida
Processos de
Adsorção/Dessorção
Ligações de hidrogênio;
Forças de Van der Waals
Cromatografia
Diferença entre Absorção e Adsorção

Cromatografia
ADSORÇÃO
Fase Estacionária Sólida:

Polar
Aumento da Atividade
-CO2H > -OH > -NH2 >
-SH > -CHO > -C=O >
-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-

Cromatografia
A função das fases móveis na cromatografia por adsorção
tem sentido amplo:
a) Função solvente
• Solubilizar os componentes
• Ter baixo ponto de ebulição
b) Função eluente
• Conduzir os componentes da mistura pela coluna
• Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)
SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente

Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano <
Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno <
Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico <
Acetato de Etila < Acetona < Etanol <
Metanol < Ácido Acético
Cromatografia
ADSORÇÃO
Usos:
a) Laboratórios de química orgânica  separar e purificar
reagentes e materiais obtidos em síntese.
b) Laboratórios de produtos naturais  escala preparativa
e analítica.
c) Laboratórios de análises clínicas  separação de
esteróides de urina ou de sangue, etc.
Cromatografia
PARTIÇÃO
Fase Móvel Gasosa
Fase Estacionária Líquida
Processos de Solubilidade
O processo de partição é
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel
depende da sua volatilidade.
volatilidade
Cromatografia
PARTIÇÃO
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária Líquida
Processos de Solubilidade
O processo de partição é
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel
depende da sua solubilidade.
solubilidade
Cromatografia
TROCA IÔNICA
Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica
orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de
extraordinário valor em processos analíticos.
Fase Estacionária Sólida
Processos de Troca Iônica

Adsorção reversível e
diferencial dos íons da fase
móvel pelo grupo trocador
da matriz
Cromatografia
TROCA IÔNICA
Resinas Catiônicas
e Aniônicas
Fluxo da FM
FE altamente carregada
Maior Interação
• Íons de alta carga
• Íons de menor tamanho
A diferença de afinidade entre

os íons da FM pode ser
controlada por pH e força iônica
Cromatografia
O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas

Cromatografia
EXCLUSÃO
Fase Estacionária em Gel
Enquanto as partículas menores penetram nas

cavidades, as maiores vão sendo eluídas
contornando as estruturas moleculares da FE.
Cromatografia
EXCLUSÃO
A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão,
introduzida por volta de 1960, de outros tipos de
cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado
constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas,
com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis.
- Separação de tamanhos específicos
- Separação de polímeros e proteínas
- Determinação de Massa Molar
Cromatografia
EXCLUSÃO
Características
desejáveis para os Géis
-Inércia Química:
Não pode haver uma interação
química entre a matriz e o soluto.
-Estabilidade:
O gel deve suportar uso contínuo
quanto mantido em condições
brandas de temperatura e pH.
-Baixo teor de íons:

Grupos carregados interferem no
processo de separação.
Cromatografia
EXCLUSÃO
Fluxo da FM
Tipos de Géis
Dextrano (Sephadex)
Poliacrilamida
Ágar e Agarose
Cromatografia
AFINIDADE
Fase Estacionária Sólida
Propriedades
Biológicas e
Funcionais
Cromatografia
Teoria Básica
Sem
importância
SOLUTO na CG, mas
com grande
importância
na CLAE
⇌
⇌
FASE
MÓVEL
⇌ FASE
ESTACIONÁRIA
Cromatografia
Teoria Básica
Coluna cromatográfica:
cromatográfica série de estágios independentes onde acontece o
equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase
móvel:
Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito

sorvido na FE e dissolvido na FM.
KC 
 A FE Afinidade pela FE [A]FE
 A FM MENOR RETENÇÃO !!!
KC = Constante de Distribuição
Volatilidade [A]FM
[A]FE = concentração do analito na FE
[A]FM = concentração do analito na FM
Cromatografia
Quantificação da eficiência
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados
onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM:
Cada “estágio” de equilíbrio é

chamado de PRATO TEÓRICO
O número de pratos teóricos
de uma coluna (N) pode ser
calculado por:
tR Coluna mais
N eficiente
wb
Cromatografia
Quantificação da eficiência
ALTURA EQUIVALENTE A UM
PRATO TEÓRICO (H)
Valores típicos de H e N:
“Tamanho” de cada estágio de dC df H N
equilíbrio 0,10 0,25 0,081 370370
0,25 0,25 0,156 192308
(L = comprimento da coluna) 0,32 0,32 0,200 150000
0,32 0,50 0,228 131579
Capilares, L = 30 m 0,32 1,00 0,294 102041
0,32 5,00 0,435 68966
dc = diâmetro da coluna em mm
df = espessura da fase estacionária em m 0,53 1,00 0,426 70423
0,53 5,00 0,683 43924
2,16 10% 0,549 3643
Empacotadas, L = 2 m
2,16 5% 0,500 4000
Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas

como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais
eficientes
Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa
Fase estacionária
Detecção
Fase móvel
Separação
Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa
Injetor: submetido
à temperatura
controlada
Detector:
submetido à
Fase móvel: temperatura
gás inerte controlada
Coluna: contendo a
fase estacionária
está submetida à
temperaturas
controladas
Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser

separadas por CG ?
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de
um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás.
Misturas cujos constituintes sejam

VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)
DE FORMA GERAL:
CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos
constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que
sejam termicamente estáveis.
Requisitos - Gás de arraste (FM)
INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem

com a fase estacionária ou superfícies do
instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que
possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em
gases e seus efeitos:
oxida / hidrolisa algumas FE
H2O, O2
incompatíveis com DCE
hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC

Requisitos - Gás de arraste (FM)
CUSTO: Gases de A = 99,995 % (4.5)
CUSTO
altíssima pureza C B = 99,999 % (5.0)
podem ser muito B
A C = 99,9999 % (6.0)
caros. PUREZA
COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda

um gás de arraste específico para melhor funcionamento.
DCT He , H2
Seleção de Gases de
Arraste em Função DIC N 2 , H2
do Detector: N2 (SS), Ar + 5% CH4
DCE
Injetor
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou

VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução
INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica
t = 0
Injeção instantânea:
t = x
t = 0
Injeção lenta:
t = x
Injetor “on column”
1
2
1 - Septo (silicone)
3 2 - Alimentação de gás de
arraste)
4
3 - Bloco metálico aquecido
4 - Ponta da coluna
cromatográfica
Injetor “on column”
1 - Ponta da agulha
1 2 3 da microsseringa é
introduzida no início
da coluna.
2 - Amostra injetada
e vaporizada
instantaneamente no
início da coluna.
3 - “Plug” de vapor
de amostra forçado
pelo gás de arraste a
fluir pela coluna.
Parâmetros de injeção
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem
decomposição.
Regra Geral:
Geral Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do
componente menos volátil.
VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado
físico da amostra.
Amostras Amostras
COLUNA Líquidas Gasosas
Sólidos:
Sólidos
convencionalmente se empacotada
dissolve em um solvente  = 3,2 mm (1/4”) 0,2 L ... 20 L 0,1 mL ... 50 mL
adequado e injeta-se a
solução capilar
 = 0,25 mm 0,01 L ... 3 L 1 L ... 100 L
Microsseringas para injeção
LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
êmbolo agulha (inox 316)
Microsseringa de
10  L:
corpo (pirex)
corpo agulha
Microsseringa de 1  L
(seção ampliada):
guia
êmbolo (fio de aço
soldado ao guia)
Colunas
EMPACOTADA
 = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido pulverizado
(FE sólida ou FE líquida
depositada sobre as partículas do
recheio)
CAPILAR
 = 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com
um filme fino (fração de m) de
FE líquida ou sólida
Temperatura da coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora
para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE
VAPOR (p0).
Estrutura química do analito
p0 = f
Temperatura Pressão Velocidade

da de de
coluna vapor migração
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE

(MENOR RETENÇÃO)
RETENÇÃO
TEMPERATURA DA COLUNA
CONTROLE CONFIÁVEL
AUMENTO DA
DA TEMPERATURA DA
COLUNA É ESSENCIAL
PARA OBTER BOA
SEPARAÇÃO EM CG
Programação linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito
diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAIXA: TCOL ALTA:
- Componentes mais voláteis são - Componentes mais voláteis não

separados são separados
- Componentes menos voláteis - Componentes menos voláteis
demoram a eluir, saindo como eluem mais rapidamente
picos mal definidos
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:
TFIM
TEMPERATURA
R
TINI
tINI tFIM
TEMPO
TINI - Temperatura Inicial

Consegue-se boa
separação dos TFIM - Temperatura Final
componentes da tINI - Tempo Isotérmico Inicial

amostra em menor tFIM - Tempo Final do Programa
tempo R - Velocidade de Aquecimento
Programação linear de
temperatura
a) Isotérmico a 45 ºC;
b) isotérmico a 145 °C;
c) programado de 30 ºC a 180 ºC
Possíveis problemas associados à PLT:
VARIAÇÕES DE VAZÃO
DO GÁS DE ARRASTE: A
viscosidade vazão
viscosidade de um gás
aumenta com a temperatura.
DERIVA (“DRIFT”) NA
LINHA DE BASE: Devido ao
aumento de volatilização de
FE líquida
Fase Estacionária
REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível
próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os
componentes da amostra.
FE Seletiva:
separação adequada dos constituintes
da amostra
FE pouco Seletiva:
má resolução mesmo com coluna de
boa eficiência
Fase estacionária sólida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação
analito + FE sólida é a ADSORÇÃO
A adsorção ocorre na
interface entre o gás de
arraste e a FE sólida
• Sólidos com grandes áreas superficiais

(partículas finas, poros)
ADSORÇÃO • Solutos polares
• Sólidos com grande número de sítios

ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)
Fase estacionária líquida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação
analito + FE líquida é a ABSORÇÃO
A absorção ocorre no interior

do filme de FE líquida
(fenômeno INTRAfacial)
• Filmes espessos de FE líquida
• Grande superfície líquida exposta ao gás

ABSORÇÃO de arraste
• Interação forte entre a FE líquida e o

analito (grande solubilidade)
Fase estacionária quirais
• As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são
MUITO SIMILARES  FE convencionais não interagem
diferencialmente com os isômeros óticos.
óticos
PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de

origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias
oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).
FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos

têm atividade farmacológica.
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal
quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste.
Características ideais:
ideais
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias
ordens de grandeza.
4.Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos
400 ºC.
5.Tempo de resposta curto e independente da vazão.
6.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
7.Similaridade de resposta para todos os solutos.
8.Não destrutivo.
Detectores
REGISTRO
DE
SINAL
ANALÓGICO
Registradores XY
DIGITAL
Integradores
Computadores
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA

Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.
Detectores
DCT DCE DNP
UNIVERSAIS: SELETIVOS: ESPECÍFICOS:

Geram sinal para Detectam apenas Detectam
qualquer substâncias substâncias que
substância eluída. com determinada possuam
propriedade determinado
físico-química. elemento
ou grupo funcional
em suas
estruturas
Detectores - Funcionamento
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU
TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste.
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):

Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de
H2 + ar.
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):

Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por
eluatos altamente eletrofílicos.
DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação

do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por
uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de
moléculas com N e P.
Detectores – Limites de detecção
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU
TCD): Universal.
Universal Observa-se para qualquer substância eluída.
Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de g (104).
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):
Quase-universal.
Quase-universal Detecta qualquer substância que contenha
ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4
(X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3.
Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 – 108).
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):
Seletivo.
Seletivo Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos
conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01
a 1 pg com linearidade até ng. (104)
DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico. Específico
Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg
(P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105)
Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
Específico Um dos
detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o
espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância
eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa.
É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de
determinada razão m/z.
Detecção
TIC
Universal
Similar a DCT
SIM
Seletivo
Maior Sensibilidade
Específico
Cromatograma de íons totais:

TIM ou TIC
CONTAGENS
Em cada posição do
cromatograma tem-se
um espectro de massa.
MASSA / CARGA
CONTAGENS
TEMPO
Específico
Cromatograma de íons
selecionados: SIM
CONTAGENS
Em cada posição do
cromatograma tem-se
o sinal somente da m/z
selecionada. MASSA / CARGA
Oferece a vantagem
CONTAGENS
de registrar
somente o sinal do
constituinte de
interesse, sendo
“cego” para os
demais.
demais TEMPO
CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.
CG-EM
Câmara
de Ionização
Coluna
CG EM
Capilar
Vácuo
Separador Molecular
O gás de arraste leve Interface Capilar Direta
(He) difunde mais Com colunas capilares a
rapidamente que o analito vazão baixa de gás de
e tende a ser drenado arraste pode ser drenada
para o vácuo. pelo sistema de vácuo.
Análise qualitativa
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:
tR = Tempo de Retenção (tempo

tR decorrido entre a injeção e o ápice
do pico cromatográfico)
t R’ = t R - t M
tM = Tempo de Retenção do
Composto Não-Retido (tempo
SINAL
mínimo para um composto que não

tM interaja com a FE atravesse a
coluna)
tR’ = Tempo de Retenção Ajustado
TEMPO
(tempo médio que as moléculas do
analito passam sorvidas na FE)
Análise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 m
Detector FID: 250 ºC
Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC
Volume injetado: 1 L
Como se explica esta
Mistura de benzeno, n-propanona,
n-propanol, n-butanol, isobutanol e
ordem de eluição?
n-pentanol.
1. A n-propanona elui primeiro
devido à sua maior volatilidade.
2. O benzeno em segundo devido
sua natureza apolar (menor ).
3. Para os demais compostos,
cujas diferenças de polaridade
não são elevadas, a volatilidade
se torna o principal parâmetro
que define a ordem de eluição.
Análise quantitativa
O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é:
• Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois

a banda necessita ser perfeitamente simétrica.
• Área da banda cromatográfica.
SINAL
Área Altura
TEMPO
Área
amostra
Concentração
tempo
A partir de certo
ponto o sinal não
ÁREA
aumenta mais
linearmente
MASSA
1,05 S
O fim da zona de linearidade pode ÁREA / MASSA

ser detectado quando a razão
(Área / Massa) diverge em mais de
5 % da inclinação da reta na 0,95 S
região linear:
MASSA
concentração
na amostra
Área
amostra
Concentração Adicionada
tempo
Cromatografia Líquida
Cromatografia em fase líquida
Cromatografia Líquida - CLAE
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser

separadas por CLAE ?
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido
ela deve dissolver-se nesse líquido.
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar

de 32 até 4000000.
DE FORMA GERAL:
CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos
constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de
volatilidade ou de estabilidade térmica.
Aumento de polaridade
Insolúvel em água Solúvel em água

Apolar Iônico
Polar não iônico
Tipos e Partição
102
Aplicações da Partição Partição
Adsorção em fase
Troca
em fase
Cromatografia 103 reversa normal
iônica
Massa molecular
Líquida
104
Permeação Filtração
em gel Exclusão em gel
105
106
Componentes típicos - CLAE
Esquema de um equipamento para CLAE
Requisitos dos sistemas de bombeamento
1 – Geração de pressões até 6.000 psi
2 – Saída com ausência de pulsos
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min
4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de
0,5% ou melhor
5 – Componentes resistentes à corrosão
Bomba recíproca (também são chamadas de

bombas de pistão ou de diafragma)
Sistemas de injeção de amostras
Suportam pressões de até 7.000 psi

Volumes típicos: 5 a 500 L
Microamostragem: 0,5 a 5 L
Fase móvel para CLAE
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a
polaridade requerida na separação.
• Eluição isocrática:
• Quando a separação é feita utilizando um único solvente de
composição constante.
• Eluição com gradiente:

gradiente
• São utilizados dois ou três sistemas de solventes que
diferem bastante entre si em polaridade.
• Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é
variada de modo programado, de forma contínua ou em
passos.
A eluição com gradiente produz efeitos similares aos
produzidos pela programação de temperatura na CG.
Eluição com gradiente Coluna C18, 5 m, fase reversa
Detector fluorescência:
excit. 334 nm – emis. 425 nm
Colunas para CLAE
As colunas geralmente são
construídas de aço inox, embora
tubos de vidro com paredes
resistentes sejam encontrados
ocasionalmente. No entanto, estes
últimos são restritos a pressões
mais baixas do que 600 psi.
Existem comercialmente centenas de colunas

empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase
estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
Colunas para CLAE
•Remoção de material particulado
•Contaminantes do solvente
Pré-coluna
•Contaminantes da amostra
•Saturar a FM com a FE
Aumenta a vida útil da coluna

COLUNAS TÍPICAS
•Material:
Material aço inox
•Comprimento:
Comprimento 10 a 30 cm
•Diâmetro:
Diâmetro 4 a 10 mm
•FE:
FE Partículas de 5 a 10 m
•Eficiência:
Eficiência 40 mil a 60 mil
pratos/metro
Separação isocrática de alta velocidade
Coluna de alta - 4 cm de comprimento
velocidade e - 0,4 cm d.i.
100.000 pratos/metro
alta eficiência - FE: spherisorb 3 m
FM: 4,1% EtAc em n-Hexano
1– p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato
Fase estacionária para CLAE
Basicamente são dois tipos de FE:
• Pelicular:
• Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso,
esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 m,
recoberto com uma camada fina e porosa de:
• Sílica
• Alumina
• Resina de poliestireno-divinil-benzeno
• Resina trocadora de íons
• Partícula porosa:
porosa
• Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3
a 10 m. As partículas são constituídas dos mesmos
materiais do recobrimento pelicular.
pelicular
Detectores
As características desejáveis para os detectores
para CLAE não são diferentes daquelas para CG.
Existem dois tipos de detectores:
• Propriedades universais (índice de refração, densidade ou
constante dielétrica).
• Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).
Características ideais:
ideais
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de
grandeza.
4.Tempo de resposta curto e independente da vazão.
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
6.Similaridade de resposta para todos os solutos.
7.Não destrutivo.
8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.
Detectores
• Absorbância
• UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105
• IV
• Fluorescência – S: 10-9 a 10-12 g/mL – FL: 103

• Índice de refração (universal) –
S: 10-7 g/mL – FL: 104
Detectores
• Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente.
Embora não sejam tão explorados quanto os detectores
ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta
sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
• Amperométricos
• Coulométricos
• Condutométricos – S: 10-8 g/mL – FL: 104
• Polarográficos – S: 10-12 g/mL – FL: 106
Detectores
• Espectrometria de massa - universal
• Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa
potencializa a técnica de separação e quantificação
• Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente
grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.
Interface CL-EM
Detectores
• Espectrometria de massa
TIC
SIM
CONTAGENS
CONTAGENS
MASSA / CARGA
CONTAGENS
CONTAGENS MASSA / CARGA
TEMPO
TEMPO
Tipos de CLAE
Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como

um gás ideal e não contribui para o processo de
separação, a FM líquida da CLAE interage tanto
quanto a FE com os componentes da amostra.
Isto torna o desenvolvimento dos métodos em

CLAE um tanto mais complexo que na CG.
Tipos de CLAE
• PARTIÇÃO:
PARTIÇÃO líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre
elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do
suporte do empacotamento  Adsorção e ligação química.
química
Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase
reversa.
reversa
Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água)
FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico)
O componente menos polar é eluído primeiro por ser o
mais solúvel na fase móvel.
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos)
FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila)
O componente mais polar aparece primeiro e o aumento
da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.
Tipos de CLAE
• É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase
reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses
recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)
Tipos de CLAE
Campo Misturas típicas
Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides,
analgésicos
Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios
Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes,

aflatoxinas, aditivos
Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes,
propelentes, corantes industriais
Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas
policloradas)
Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue,
narcóticos
Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas,
extratos de urina, estrógenos
Tipos de CLAE
• ADSORÇÃO:
ADSORÇÃO líquido-sólido. FE sílica ou alumina.
alumina É a forma
clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu
adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de
HPLC.
• TROCA IÔNICA:
IÔNICA líquido-sólido. FE resina com capacidade
de troca iônica.
iônica
• EXCLUSÃO:
EXCLUSÃO líquido-gel. FE gel.gel Um material polimérico,
hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas,
são capazes de promover a separação de acordo com os
tamanhos das moléculas  EXCLUSÃO DE TAMANHO.
TAMANHO Se o
material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a
cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS. ÍONS
Cromatografia
Para refletir e responder:

Duas substâncias diferentes com a mesma concentração
apresentarão a mesma área sob suas bandas cromatográficas?
Para um mesmo analito, a área ou altura aumentam
com o aumento da concentração. A área sob a banda
cromatográfica de duas substâncias diferentes
dependerá da resposta do detector para aquele tipo
de substância, independentemente do tipo de
detector utilizado.
Cromatografia
Para refletir e responder:

A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de
analito?
A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os

casos em que isto ocorre?
FIM

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Prof. Valmir F.

Chamados de métodos Baseados em propriedades

Gravimetria Volumetria Eletroanalítico Cromatográfico

Propriedades Propriedades Propriedades

1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)

Cromatografia é um método físico-químico de

• De acordo com o sistema cromatográfico

• De acordo com a fase móvel

• Utilização de Gás Pressurizado

• De acordo com a Fase Estacionária

• De acordo com o modo de separação

Técnica Planar Coluna

FM Líquido Gás Líquido

Fase estacionária Analitos

Para uma mesma mistura, a simples troca da fase

Fase estacionária Analitos

A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos

Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem

Celulose Ativação de 10 min

- Comparação com valores de Rf tabelados

- Comparação com padrão eluído em conjunto

- Extração e aplicação de métodos instrumentais

Amostra não contém a espécie B

Amostra pode conter a espécie A

Para se certificar da presença,

Adsorção Troca Iônica

- Fase Móvel Líq. ou Gás

- Fase Estacionária Sólida

Diferença entre Absorção e Adsorção

Fase Estacionária Sólida:

-CO2H > -OH > -NH2 >

-SH > -CHO > -C=O >

-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-

SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente

Fase Estacionária Líquida

Fase Estacionária Líquida

Fase Móvel Líquida

Fase Estacionária Sólida

Processos de Troca Iônica

• Íons de alta carga

• Íons de menor tamanho

A diferença de afinidade entre

O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas

Enquanto as partículas menores penetram nas

-Baixo teor de íons:

Fase Móvel Líquida

Fase Estacionária Sólida

Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito

Cada “estágio” de equilíbrio é

Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas

Quais misturas podem ser

Misturas cujos constituintes sejam

INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem

hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC

CUSTO: Gases de A = 99,995 % (4.5)

COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda

Os dispositivos para injeção (INJETORES ou

êmbolo agulha (inox 316)

Temperatura Pressão Velocidade

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE

TCOL BAIXA: TCOL ALTA:

- Componentes mais voláteis são - Componentes mais voláteis não

TINI - Temperatura Inicial

componentes da tINI - Tempo Isotérmico Inicial