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Imuno-Hematologia e Imunologia Clínica

Brasília-DF.
Atualização

Eliseu Frank de Araújo

Elaboração

Eliseu Frank de Araújo


Julio Cesar Pissuti Damalio

Produção

Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração


Sumário

APRESENTAÇÃO.................................................................................................................................. 4

ORGANIZAÇÃO DO CADERNO DE ESTUDOS E PESQUISA..................................................................... 5

INTRODUÇÃO.................................................................................................................................... 7

UNIDADE I
IMUNO-HEMATOLOGIA........................................................................................................................... 9

CAPÍTULO 1
SISTEMA ABO............................................................................................................................ 9

CAPÍTULO 2
SISTEMA RH............................................................................................................................. 18

UNIDADE II
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I........................................................................................................... 36

CAPÍTULO 1
ANTICORPOS.......................................................................................................................... 36

CAPÍTULO 2
REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO E AGLUTINAÇÃO.......................................................................... 52

UNIDADE III
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II.......................................................................................................... 57

CAPÍTULO 1
QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO ANTIGÊNICA OU DE ANTICORPOS.............................. 57

CAPÍTULO 2
IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS EM CÉLULAS E ANTÍGENOS..................................................... 70

UNIDADE IV
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III.......................................................................................................... 81

CAPÍTULO 1
METODOLOGIAS COM USO DE BIOLOGIA MOLECULAR........................................................... 81

CAPÍTULO 2
DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS (MINISTÉRIO DA SAÚDE).......................................................... 89

PARA (NÃO) FINALIZAR.................................................................................................................... 107

REFERÊNCIAS................................................................................................................................. 108
Apresentação

Caro aluno

A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se


entendem necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade.
Caracteriza-se pela atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela
interatividade e modernidade de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da
Educação a Distância – EaD.

Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade


dos conhecimentos a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos
específicos da área e atuar de forma competente e conscienciosa, como convém
ao profissional que busca a formação continuada para vencer os desafios que a
evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo.

Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo


a facilitar sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na
profissional. Utilize-a como instrumento para seu sucesso na carreira.

Conselho Editorial

4
Organização do Caderno
de Estudos e Pesquisa

Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em


capítulos, de forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos
básicos, com questões para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam tornar
sua leitura mais agradável. Ao final, serão indicadas, também, fontes de consulta para
aprofundar seus estudos com leituras e pesquisas complementares.

A seguir, apresentamos uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos
Cadernos de Estudos e Pesquisa.

Provocação

Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes
mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor
conteudista.

Para refletir

Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e reflita
sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio. É importante
que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. As
reflexões são o ponto de partida para a construção de suas conclusões.

Sugestão de estudo complementar

Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo,


discussões em fóruns ou encontros presenciais quando for o caso.

Atenção

Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a


síntese/conclusão do assunto abordado.

5
Saiba mais

Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões


sobre o assunto abordado.

Sintetizando

Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o


entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos.

Para (não) finalizar

Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem


ou estimula ponderações complementares sobre o módulo estudado.

6
Introdução

De acordo com Araujo e Damalio (2013, p. 7),

Historicamente a Imunologia surgiu como um ramo da microbiologia


e conquistou seu espaço com os estudos das doenças infecciosas e
suas respectivas respostas. A nossa capacidade de coexistir com
diversos micro-organismos de nosso ambiente depende de um
conjunto de fatores, e um destes fatores é o Sistema Imune.

O Sistema Imune, por sua vez, é como um conjunto de células


de defesa e/ou ataque eficaz que tem a capacidade de distinguir
os sinais de perigo para o organismo e protegê-lo contra estes
patógenos oportunistas. Esta distinção ocorre por comunicação
por meio de sinais mediados por citocinas e receptores. As células
do Sistema Imune estão distribuídas por todo organismo, alojadas
nos tecidos, e desempenham o papel de sentinelas e circulando
por vasos sanguíneos e linfáticos esperando o sinal de que o
organismo foi invadido.

A Imunologia Clínica tem o objetivo de investigar e orientar o


clínico na apuração de diagnósticos das patogenicidades por meio
de resultados de exames laboratoriais. Para tanto é necessário
conhecer as estratégias traçadas pelo Sistema Imune, no que tange
ao controle e/ou eliminação dos diferentes patógenos, além de saber
as estratégias de evasão utilizadas pelos patógenos para driblar a
defesa e o ataque do Sistema Imune.

“Obviamente, sob o ponto de vista imunológico, um determinado agente infeccioso


não precisa se restringir a uma única estratégia patogênica, de modo que a resposta
imune eficiente contra o determinado micro-organismo pode incluir diversos
mecanismos” (ARAUJO; DAMALIO, 2013, p. 7).

Objetivos
» Reconhecer o sistema ABO e seus componentes: antígenos e
anticorpos.

» Entender a importância do sistema ABO na prática transfusional.

7
» Reconhecer o sistema Rh e seus componentes: antígenos e
anticorpos.

» Entender o teste de Coombs direto e indireto.

» Conhecer a caracterização da doença hemolítica do recém-nascido


(DHRN) e suas implicações em gestações de risco. Antígeno D fraco e
parcial.

» Reconhecer os anticorpos: classes e funções das Igs.

» Reconhecer as aplicações dos testes imunológicos mais utilizados em


Análises Clínicas.

» Caracterizar diagnósticos laboratoriais de várias doenças, de acordo


com o Ministério da Saúde.

8
IMUNO-HEMATOLOGIA UNIDADE I

CAPÍTULO 1
Sistema ABO

Para o especialista em Análises Clínicas, é extremamente relevante compreender


como as células sanguíneas funcionam nos sistemas antigênicos. Além das
aplicações práticas da genética da célula sanguínea, como transfusões de sangue,
transplantes e estudos com fins antropológicos, a investigação dos antígenos das
hemácias oferece visão ampla de outros aspectos mais básicos da biologia humana.

O conhecimento de antígenos e anticorpos plaquetários e granulocíticos ainda


apresenta certas deficiências e, portanto, não é completo. Foram descritos
antígenos específicos de plaquetas e granulócitos e, ao mesmo tempo, nos
deparamos com a condição de muitos antígenos descritos na tipagem ainda não
terem sido incorporados na rotina dos laboratórios. Em contraste, os antígenos
de superfície dos linfócitos foram estudados mais detalhadamente durante as
últimas três décadas. Os antígenos do complexo de histocompatibilidade maior
são importantes na moderna prática transfusional, mas o estudo desse sistema
tem significado mais amplo e levou a uma visão mais elaborada dos mecanismos
genéticos de imunorregulação, transplante e doença.

O sistema do grupo sanguíneo ABO

Histórico

A separação dos indivíduos em grupos de acordo com os antígenos presentes em


suas hemácias, historicamente, foi demonstrada pela primeira vez entre 1900 e
1901, pelo médico austríaco Karl Landsteiner. Ao reagir amostras de sangue de
diversas pessoas, isolou eritrócitos fazendo diferentes combinações entre plasma
e hemácias. Encontrou como resultado a presença de aglutinação das hemácias em

9
UNIDADE I │ IMUNO-HEMATOLOGIA

alguns casos e sua ausência em outros. “Dessa forma, Karl Landsteiner classificou
os seres humanos em três grupos sanguíneos distintos, a saber, A, B e O, e ainda
explicou o fato de algumas pessoas morrerem depois de transfusões de sangue e
outras não” (ARAUJO; DAMALIO, 2013, p. 9). Já em em 1902, o grupo sanguíneo
AB foi descrito por von Decastello e Sturli.

Segundo Araujo e Damalio (2013, pp. 9-10),

Destaca-se como importante no Sistema ABO, na prática


transfusional, o fato de ser esse o sistema que possui maior capacidade
de provocar a produção de anticorpos, ou seja, é o mais antigênico.
Como os eritrócitos humanos não expressam moléculas HLA de
classe I e II, essas moléculas de superfície altamente polimórficas
têm pouca consequência na transfusão sanguínea. A maior barreira
imunogenética se constitui, então, nos polimorfismos estruturais
nos carboidratos dos glicolipídios de superfície das hemácias, cujas
diferenças antigênicas são a base do sistema ABO.

Para mais conhecimento sobre os assuntos tratados, recomendamos assistir


a videoaula sobre o sistema ABO, disponível em: https://www.youtube.com/
watch?v=WBrIhmLmdI8.

Antígenos de hemácias
A composição antigênica das hemácias é importante na terapia transfusional.

Fazendo referência ao trabalho original de Araujo e Damalio (2013, p. 10),

Na prática transfusional rotineira, os testes determinam a


compatibilidade entre o doador e o receptor dos antígenos de grupos
sanguíneos de significado clínico. Os anticorpos que reagem com
antígenos de hemácias podem provocar graves problemas clínicos,
entre eles as reações transfusionais hemolíticas, a doença hemolítica
do recém-nascido e as anemias hemolíticas autoimunes.

“Alguns antígenos já são bem definidos bioquimicamente e dividem-se em


dois grupos: carboidratos (em que um gene codifica a formação de enzimas
+ açúcares a substratos específicos – ABO) ou proteicos (decorrentes de ação
direta de um gene – Rh)” (ARAUJO; DAMALIO, 2013, p. 10).

10
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Constituição dos anticorpos


Como sabemos, existem quatro grupos sanguíneos comuns no sistema ABO: O,
A, B e AB. Os grupos sanguíneos são classificados pela presença de açúcares
específicos de carboidratos na superfície das hemácias, N-acetilgalactosamina
para o antígeno A e D-galactose para o antígeno B. Ambos os açúcares são
construídos sobre o antígeno H – se o antígeno H não for modificado, o grupo
sanguíneo resultante será O, porque nem o antígeno A nem o B podem se ligar
aos glóbulos vermelhos (DEAN, 2012).

Cada indivíduo desenvolverá anticorpos contra os antígenos ABO que ele não
possui. Por exemplo, os indivíduos de sangue tipo A terão anticorpos anti-B
e indivíduos com grupo sanguíneo tipo O terão anti-A e anti-B. Antes de uma
transfusão de sangue, o teste sorológico de rotina verifica a compatibilidade dos
grupos sanguíneos ABO (e Rh). Uma transfusão de sangue incompatível com ABO
pode ser fatal, devido à natureza altamente imunogênica dos antígenos A e B e aos
correspondentes anticorpos fortemente hemolíticos (DEAN, 2012).

“Os anticorpos do Sistema ABO – usualmente chamados de aglutininas – estão


presentes no plasma de indivíduos, contra os antígenos que eles não possuem em
suas hemácias, classificados assim de anti-A e anti-B” (ARAUJO; DAMALIO, 2013,
p. 10).

Esses anticorpos são naturalmente formados contra antígenos que não estão
presentes nas hemácias. Os estímulos são passivos, gerados por bactérias que
colonizam o trato intestinal a partir do nascimento. Geralmente, os anticorpos do
Sistema ABO são misturas de IgM e IgG (Unidade II). Anticorpos ABO das classes
IgM ou IgG, têm a capacidade de desativar o sistema complemento, provocando
assim hemólise intravascular em transfusões incompatíveis.

Indivíduos que fazem parte do a grupo sanguíneo do tipo AB não têm anticorpos
anti-A ou anti-B. “Já os indivíduos portadores de sangue tipo A possuem anticorpos
anti-B, os pertencentes ao grupo B possuem anticorpos anti-A e os indivíduos do
grupo O, finalmente, possuem as aglutininas anti-A e aglutininas anti-B” (ARAUJO;
DAMALIO, 2013, p. 10).

Comparados a outros grupos sanguíneos, indivíduos com grupo sanguíneo


O podem ter menor risco de câncer de pâncreas e doença tromboembólica
(Amundadottir et al., 2009; Tregouet et al., 2009). Além disso, em certas
populações africanas, indivíduos com o grupo sanguíneo O podem ser protegidos
da malária com risco de vida (Fry et al., 2008). No entanto, esse grupo sanguíneo

11
UNIDADE I │ IMUNO-HEMATOLOGIA

não é mais comum em algumas regiões onde a malária é endêmica. Isso pode
ocorrer porque indivíduos com grupo sanguíneo O apresentam maior risco de
cólera e diarreia grave devido ao Vibrio cholerae 01, sendo os indivíduos com o
grupo sanguíneo AB os mais protegidos (FARUQUE et al., 1994; ROWE et al.,
2007).

Mais de 80 alelos ABO foram relatados. Os alelos comuns incluem A1, A2, B1,
O1, O1v e O2 (SELTSAM et al., 2003). Enquanto os alelos A e B codificam uma
enzima específica para a transferência de glicosil, o alelo O parece não ter função.
Uma deleção de base única no alelo O significa que indivíduos do tipo O não
produzem os antígenos A ou B. As frequências do tipo sanguíneo variam em
diferentes grupos raciais/étnicos. Nos EUA, nos caucasianos, a proporção dos
grupos sanguíneos O, A, B e AB é de 45%, 40%, 11% e 4%, respectivamente. Nos
hispânicos, a distribuição é de 57%, 31%, 10% e 3%; e nos negros, 50%, 26%, 20%
e 4% (GARRATTY et al., 2003).

Determinação do grupo sanguíneo ABO


A determinação do grupo sanguíneo é realizada pela identificação de antígenos
nas hemácias, utilizando anticorpos anti-A e anti-B. Essa técnica, denominada de
tipagem direta, permite que os anticorpos sejam reconhecidos na superfície das
hemácias, classificando as pessoas em quatro grupos: sangue A, B, O e AB (Figura 1).

Figura 1. Determinação do sistema ABO.

Tipo Anticorpos Reação a anticorpos


sanguíneo Genótipo produzidos adicionados
pelo corpo
Anti-A Anti-B

A A A A O Anti-B
I I ou I I

B B B B O Anti-A
I I ou I I

Nem anti-A
AB A B
I I
Nem anti-B

O O O
I i Anti-A
e
anti-B

Fonte: adaptado de Quinley, 2011.

12
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Transfusões sanguíneas no sistema ABO


Em seu trabalho original, Araujo e Damalio (2013, p. 11) afirmam que,

A divisão das transfusões sanguíneas no Sistema ABO pode ser feita


em dois grandes conjuntos:

1) isogrupo, quando doador e receptor são do mesmo grupo de


acordo com o sistema ABO; e

2) heterogrupo, quando o doador e receptor são de grupos


sanguíneos diferentes. A escolha do sangue deve levar em conta
que o indivíduo não pode ser transfundido com um sangue que
possua um antígeno que ele não tem, justamente porque o
anticorpo presente no seu plasma irá reagir contra as hemácias
transfundidas.

O esquema abaixo mostra as transfusões possíveis quanto ao sistema ABO


(Figura 2):

Figura 2. Transfusões do sistema ABO.

Quem doa
para quem?
Recebe de: Recebe de:
A+, A-, O+ e A- e O-
A+ O- A-
Doa para:
Doa para: A+, A-, AB+
A+ e AB+ e AB-

Recebe de: Recebe de: Recebe de:


B+, B-, O+ B-e O- O+ e O-
B+ e O-
B- O+
Doa para: Doa para:
Doa para: B+, B-, AB+ A+, B+,
B+ e AB+ e AB- AB+ e O+

Recebe de: Recebe de: Recebe de:


A+, A-, B+, B-, A-, B-, AB-e O- O-
AB+, AB-, O+ e
AB+ O- Doa para: Doa para:
AB- AB+ e AB- O- A+, A-, B+, B-,
Doa para: AB+ e AB-. O+
AB+ e O-

Fonte: adaptado de https://www.diariodolitoral.com.br/cotidiano/dia-nacional-do-doador-de-sangue-bancos-homenageiam-


voluntarios/106068/.

13
UNIDADE I │ IMUNO-HEMATOLOGIA

É interessante mostrar para vocês que o grupo sanguíneo O pode ser doado ou
transferido para todos os outros grupos existentes; sendo denominados, portanto,
de doadores universais. Por outro lado, quando falamos em receber sangue de
outros grupos, indivíduos portadores do sangue tipo O não podem receber sangue
de nenhum outro grupo – limitado apenas ao seu próprio grupo. O grupo AB, já
pode receber sangue de qualquer outro tipo sanguíneo, recebendo a nomenclatura
de receptores universais.

Genética

Os antígenos A e B são herdados segundo a Lei de Mendel. O grupo ABO de


um indivíduo é determinado pela presença de um (homozigótico) ou dois
(heterozigótico) dos três alelos: A, B e H, cujo gene está localizado no cromossomo
9 (Quadro 1) (ARAUJO; DAMALIO, 2013, p. 13).

Quadro 1. Genética do sistema ABO.

Fenótipo Genótipo Antígenos de hemácias Anticorpos


O OO (H) Anti-A + Anti-B
A AO ou AA A Anti-B
B BO ou BB B Anti-A
AB AB A+B nenhum
Fonte: adaptado de Lima, 2001.

Bioquímica

É importante destacar que os produtos dos genes A e B não são os antígenos A e B


por assim dizer; as glicosiltransferases têm como função modificar a membrana
celular e levar à síntese dos antígenos A e B. Ao longo do processo, destaca-se
uma substância precursora na forma de cadeia lateral oligossacarídica associada
com glicoesfingolipídeos e glicoproteínas de membrana. Após conversão dessa
substância precursora na substância H, o precursor imediato dos antígenos A e
B está sob influência dos alelos H e h, que são herdados independentemente do
gene determinando o tipo ABO. O H é comum; o h é raro. Em dose simples ou
dupla, o gene H apresenta uma enzima, a H-transferase, que converte a substância
precursora em substância H. A presença de um alelo A ou B determina a atividade
da A ou B-transferase correspondente, que, subsequentemente, converterá a
substância H em antígeno A ou B.

Assim, de acordo com Araujo e Damalio (2013, p. 13),

14
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Quando o antígeno A ou B está ausente das hemácias, o anticorpo


correspondente está presente no plasma. Ao nascimento, essas
iso-hemaglutininas estão ausentes, mas desenvolvem-se durante
os 6 primeiros meses de vida. Elas surgem como produto da
exposição dos polissacarídeos semelhantes a ABO que são vistas
em micro-organismos, sementes, plantas e outras fontes exógenas.
Substâncias com atividade antigênica de A, B e H estão amplamente
distribuídas nas hemácias, bem como em secreções e glândulas
mucosas dos tratos gastrointestinal, respiratório e genital.

Enzimas

A especificidade A, B ou H de uma hemácia é determinada pela atividade de


enzimas geneticamente determinadas durante o desenvolvimento celular (ARAUJO;
DAMALIO, 2013, p. 13).

Assim, o alelo H determina a expressão de uma H-transferase (α2-L-fucosiltransferase)


a qual adiciona um resíduo de fucose à galactose terminal da substância precursora
produzindo substância H.

O alelo A, por sua vez, determina a expressão de A-transferase (α3-N-acetilgalact


osaminiltransferase), adicionando N-acetilgalactosamina à galactose terminal da
substância H.

Por fim, o alelo B determina a B-transferase (α3-D-galactosiltransferase), que


transfere uma molécula de galactose na mesma posição.

A principal diferença entre as hemácias do grupo A e do grupo B é o resultado de


diferenças estruturais entre essas duas moléculas de açúcar.

As hemácias do grupo O não expressam atividade de A-transferase nem de


B-transferase. Nos indivíduos do grupo sanguíneo AB, estão presentes ambos os
alelos A e B, com as duas transferases ativas e os dois sítios antigênicos com as
especificidades A e B presentes na mesma molécula (ARAUJO; DAMALIO, 2013,
p. 14).

Antígenos ABO

Os antígenos A e B estão localizados na superfície externa da membrana da hemácia.

15
UNIDADE I │ IMUNO-HEMATOLOGIA

Vários antígenos têm especificidade A. A mais frequente é A1; 80% dos indivíduos
do grupo A são A1 e 20% são A2. A2 e outras variantes reagem mais fracamente com
soros de tipagem anti-A que as hemácias A1. São conhecidas também variantes
mais fracas do grupo A, entre elas A3, Ax, Am, Aend, Ae1 e outras variantes desse
grupo, e elas constituem menos de 1% do fenótipo do grupo A.

Existem também variantes fracamente reativas do antígeno B, como B3, Bx e Bm1,


mas elas ocorrem com menor frequência que as variantes do grupo A.

Anticorpos ABO (Iso-hemaglutininas)

Em adultos, anticorpos IgM anti-A e/ou anti-B, de ocorrência natural e com


especificidade complementar ao seu próprio grupo ABO, estão presentes, devido a
estímulos oriundos de antígenos vegetais e também bacterianos. Já em neonatos, os
anticorpos IgM estão ausentes nos três a seis primeiros meses de vida.

O soro do grupo O contém anti-A, anti-A1 e anti-B.

Testes laboratoriais para tipagem ABO

Testes pré-transfusionais

Testes pré-transfusionais realizados com o sangue do


doador

De acordo com Araujo e Damalio (2013, p. 15),

É obrigatória, em todas as unidades coletadas, a determinação


estrita do grupo ABO, do tipo Rho (D), do antígeno D fraco
(Du) nas Rho (D) negativo e dos testes para a exclusão das
hepatites tipos B e C, doença de Chagas, sífilis, AIDS, anticorpos
anti-HTLV-I/II e anti-HBc. Testes para a pesquisa de anticorpos
irregulares e dosagem de ALT/TOP devem ser realizados de forma
complementar. Recomenda-se também a realização de testes para
exclusão de malária, anemia falciforme e detecção de hemoglobinas
anormais.

O sangue total e seus componentes não podem ser transfundidos antes da


obtenção de resultados finais não reagentes, nos testes de detecção para hepatites B
e C, HIV-1 e HIV-2, doença de Chagas, sífilis, HTLV-I e HTLV-II.

16
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Testes pré-transfusionais realizados com o sangue do


receptor

O tratamento com o sangue do receptor deve ser igualmente considerado e


classificado pensando, enfim, em atestar a compatibilidade imunológica entre o
doador e o receptor. Realizam-se os testes para verificação do grupo ABO e Rh.

Verifica-se ainda a presença de anticorpos do receptor que potencialmente


inviabilizariam a transfusão. Além disso, realizam-se os testes de Coombs direto e
indireto (ver a seguir) e o teste da prova cruzada (ARAUJO; DAMALIO, 2013, p. 16).

Incompatibilidade do Sistema ABO


Ainda de acordo com Araujo e Damalio (2013, p. 16),

As provas de compatibilidade fazem parte dos testes pré-transfusionais,


isto é, fazem parte do procedimento que tem por finalidade verificar in
vitro a compatibilidade eritrocitária entre o doador e o receptor. São
executadas em meio de antiglobulina humana (AGH), entre o soro/
plasma do doente e os eritrócitos do doador.

Essas provas identificam incompatibilidades causadas por anticorpos clinicamente


significativos, em especial do sistema ABO, exatamente pela gravidade das reações
transfusionais que, por fim, provocam.

17
CAPÍTULO 2
Sistema Rh

Na prática transfusional, o sistema do grupo Rh só perde em importância para o


ABO. O sistema Rh foi descrito pela primeira vez por Levine e Stetson, em 1941.

Rh é o sistema de grupo sanguíneo mais reconhecido após o ABO, provavelmente


devido à apresentação dramática de um feto que sofre de doença hemolítica do
recém-nascido (HDN) após aloimunização materna ao antígeno D. Mesmo as
pessoas não associadas à medicina já ouviram falar do “fator Rh” e sabem que
ele tem alguma importância na gravidez. A descrição mais antiga registrada da
síndrome data dos anos 1600, de uma parteira francesa que assistiu ao parto
de um casal de gêmeos, um dos quais hidrópico e o outro icterícia e morreu de
kernicterus (RACE; SANGER, 1975). O agente responsável pela ampla gama de
casos fetais e os sintomas, desde icterícia leve até morte fetal, permaneceram
obscuros até 1941. Levine e colegas observaram que o parto de um feto natimorto e
a reação adversa na mãe a uma transfusão de sangue do pai estavam relacionados
e foram o resultado de uma reação imune à um antígeno paterno (LEVINE et al.,
1941).

O relacionamento dos sorologistas com o sistema de grupos sanguíneos ofensivos


começou quando foi confundida com uma proteína de glóbulos vermelhos de
macaco Rhesus (RBC), agora denominada LW, e muitos argumentos e debates se
seguiram sobre quem deveria receber crédito por sua descoberta (ROSENFELD,
1989). Tomar consciência do antígeno, no entanto, foi apenas o começo da história.
Esse sistema de grupos sanguíneos se tornaria notório pela complexidade, com
vários antígenos e múltiplas nomenclaturas definindo-o (WESTHOFF, 2004).

Vários eventos seminais caracterizaram a história do sistema Rh. Uma das mais
importantes foi a observação de que a incompatibilidade ABO entre mãe e feto
teve um efeito protetor parcial contra a imunização contra D. Isso sugeriu a
justificativa para o desenvolvimento da imunoglobulina Rh (RhIG) (MOLLISON
et al., 1969). Embora os anticorpos da imunoglobulina M (IgM) não forneceram
proteção, a imunoglobulina G (IgG) anti‐D foi eficaz. No início dos anos 1960,
apenas 20 anos após a descoberta da incompatibilidade de Rh, um tratamento
eficaz estava disponível (WESTHOFF, 2004).

18
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Apesar de sua importância clínica, a natureza extremamente hidrofóbica das


proteínas Rh dificultou os estudos bioquímicos, e as proteínas não foram isoladas
com sucesso até o final da década de 1980 (AGRE et al., 1987). Isso levou à clonagem
dos genes na década de 1990 (CHERIF-ZAHAR et al., 1990) e a grandes avanços em
nossa compreensão do sistema Rh. As bases moleculares da maioria dos antígenos
Rh foram determinadas, e a estrutura do gene RH explica por que esse sistema é
tão polimórfico. Especificamente, os antígenos Rh convencionais são codificados
por dois genes, RHD e RHCE (conceito de Fisher-Race), mas numerosos eventos
de conversão de genes entre eles criam genes híbridos. As novas proteínas híbridas
resultantes contendo regiões de RhD unidas a RhCE, ou o inverso, geram uma
infinidade de antígenos Rh diferentes disponível (WESTHOFF, 2004).

A terminologia Rh atual tenta distingui-los dos antígenos, referidos pelas


designações das letras D, C, c, E, e etc. Letras maiúsculas e itálico são usadas
para se referir aos genes RH, que incluem RHD, RHCE e RHAG, além dos RHBG
e RHCG não tireoide. Os diferentes alelos do gene RHCE são designados RHce,
RHCe e RHcE, de acordo com os antígenos que eles codificam. As proteínas
são indicadas como RhD, RhCE (ou de acordo com os antígenos específicos que
transportam Rhce, RhCe ou RhcE) e RhAG, RhBG e RhCG. Os haplótipos Rh são
designados Dce, DCe, DcE, etc. ou ce, Ce, cE quando se refere a um haplótipo CE
específico disponível (WESTHOFF, 2004).

RBC RhCE, RhD e RhAG


Dois genes (RHD, RHCE) próximos do cromossomo 1 codificam as proteínas
Rh, RhD e RhCE; um carrega o antígeno D e o outro carrega antígenos CE em
várias combinações (ce, Ce, cE ou CE) U (CHERIF-ZAHAR et al.; 1991; ARCE
et al., 1993) Os genes são 97% idênticos, cada um possui 10 éxons e codifica
proteínas que diferem em 32 a 35 aminoácidos. Isso contrasta com a maioria
dos antígenos de grupos sanguíneos que são codificados por genes únicos com
alelos que diferem em apenas um ou alguns aminoácidos. O grande número de
diferenças de aminoácidos explica por que a exposição à RhD pode resultar em
uma potente resposta imune em um indivíduo RhD (WESTHOFF, 2004).

Os RBCs expressam ainda outra proteína Rh denominada RhAG, para glicoproteína


associada a Rh, que transporta uma cadeia N-glicano (RIDGWELL et al., 1992).
RhAG compartilha 38% de identidade com RhCE e RhD, tem a mesma topologia
prevista na membrana e é codificado por um único gene no cromossomo 6. RhAG
não é polimórfico, por isso não carrega antígenos de grupos sanguíneos, mas é

19
UNIDADE I │ IMUNO-HEMATOLOGIA

importante para direcionar RhCE e RhD para a membrana. Duas moléculas de


RhAG associam-se a duas moléculas de mutações RhCE e/ou RhD (EYERS et al.,
1994). RHAG são responsáveis pela
​​ perda de expressão de antígenos Rh (Rhnull),
porque sem RhAG, nem RhCE nem RhD atingem a membrana RBC (HUANG, 1997)
RhAG é expresso precocemente durante a diferenciação eritroide, sendo detectável
nos progenitores do CD34 +, enquanto o RhCE aparece mais tarde, seguido pelo
RhD (Southcott et al., 1999). O momento da expressão pode refletir a montagem
dessas proteínas na membrana das hemácias (WESTHOFF, 2004).

Indivíduos homozigotos para os genes RHce que codificam os tipos de antígenos e


variantes como e +, mas geralmente produzem aloanticorpos com especificidades
do tipo e. Os anticorpos, designados anti-hrS, -hrB, -RH18 e -RH34, são difíceis de
identificar sorologicamente e, o mais importante, são clinicamente significativos e
causaram fatalidades na transfusão (WESTHOFF, 2004).

Anticorpos relacionados com esse antígeno são importantes na prática transfusional,


pois o D é altamente imunogênico; o anti-D pode resultar em graves reações
hemolíticas, constituindo importante causa de DHRN grave.

Os anticorpos contra os vários antígenos Rh geralmente se desenvolvem após


exposição a hemácias estranhas, como em transfusões ou gestações, mas
ocasionalmente podem ocorrer de forma natural. Esses anticorpos geralmente são
da classe IgG (Unidade II), não fixam complemento, mas podem causar severa
hemólise extravascular.

Determinação do fator Rh
O teste mais comum para se determinar o fator Rh é o Teste de Coombs, efetuado
com o soro de mesmo nome. Pode ser direto ou indireto.

Teste de Coombs direto

O teste antiglobulina, também conhecido como teste de Coombs, é um procedimento


laboratorial de imunologia usado para detectar a presença de anticorpos contra os
glóbulos vermelhos circulantes (RBCs) no corpo, que depois induzem a hemólise.
A destruição desses glóbulos vermelhos (RBCs) por anticorpos direcionados contra
eles é descrita como diagnóstico de anemia hemolítica autoimune (AIHA). Muitas
etiologias se enquadram nessa classificação (THEIS; HASHMI, 2020).

20
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

O teste de antiglobulina pode ser um teste direto de antiglobulina (TAD) ou um


teste indireto de antiglobulina (TIA). O princípio do DAT é detectar a presença
de anticorpos conectados diretamente às hemácias, o que ocorre lavando uma
amostra de sangue coletada em soro fisiológico para isolar as hemácias do
paciente; esse procedimento remove anticorpos não ligados que, de outra forma,
podem confundir o resultado. O TIA, por outro lado, é usado para detectar
anticorpos não ligados a hemácias, que podem estar presentes no soro do paciente
(THEIS; HASHMI, 2020). Com o teste direto de antiglobulina, um reagente
monoespecífico ou poliespecífico é então adicionado às hemácias lavadas para
detectar IgG ligada e/ou complementar C3. Na prática, muitos laboratórios
usarão primeiro o reagente poliespecífico que pode detectar IgG e C3; um
resultado positivo será seguido com testes monoespecíficos para caracterizar
ainda mais o anticorpo (PARKER; TORMEY , 2017). Para testes indiretos de
antiglobulina, o soro de uma amostra de sangue é isolado e as hemácias nativas
removidas. A amostra de soro isolada é então incubada com hemácias estranhas
de antigenicidade conhecida. O reagente antiglobulina é então adicionado e a
presença de aglutinação indica um resultado positivo (THEIS; HASHMI , 2020).

A coleta de uma amostra de sangue para teste de antiglobulina requer tubo


anticoagulado com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA); na prática padrão,
esse tubo de coleta tradicionalmente tem um tom de lavanda, vermelho ou rosa. O
EDTA é usado para quelar o cálcio sérico para impedir a fixação in vitro do fator
C3 do complemento que, de outra forma, levaria a um resultado falso-negativo
(PARKER; TORMEY, 2017).

Várias modificações foram relatadas para a melhoria do teste de Coombs, incluindo


o uso de polietilenoglicol (PEG) e o teste de gel de antiglobulina (TGA) (WENZ;
APUZZO, 1989; REISNER et al., 1996). Algumas vantagens do TGA em comparação
ao teste padrão de Coombs incluem melhor reprodutibilidade e testes fáceis. O
TGA é o teste mais sensível para a detecção de anticorpos anti-RBC no soro. É
essencial nos testes pré-transfusionais e no diagnóstico de doença hemolítica do
recém-nascido (LAPIERRE et al., 1990). O TGA foi lançado na Europa em 1988.
Tornou-se disponível nos EUA em 1995. Lapierre e colaboradores desenvolveram
essa tecnologia (THEIS; HASHMI, 2020).

O teste de Coombs é necessário quando a autoimunidade às hemácias é considerada


no diagnóstico diferencial, incluindo anemia hemolítica quente e fria (THEIS;
HASHMI, 2020).

21
UNIDADE I │ IMUNO-HEMATOLOGIA

O diagnóstico potencial do teste de Coombs inclui desde testes pré-transfusionais, o


caso de reação transfusional hemolítica e ainda as anemias hemolíticas autoimunes
ou induzidas por medicamentos (THEIS; HASHMI, 2020).

O teste de antiglobulina, particularmente o teste qualitativo direto de


antiglobulina, é clinicamente útil nos casos em que há suspeita clínica de hemólise
de hemácias induzida por autoanticorpo. O teste TDA normalmente envolve
o uso de um reagente poliespecífico que consiste em IgG e complemento C3. O
teste indireto de antiglobulina é clinicamente útil para a detecção de anticorpos
circulantes com potencial para induzir hemólise de hemácias; esse teste é mais
comumente utilizado para fenotipagem de hemácias e na triagem cruzada para
transfusão de sangue. Um resultado positivo de antiglobulina requer análise no
contexto clínico para fazer um diagnóstico preciso. Os custos com assistência
médica e a carga de tempo de laboratório podem ser minimizados pela primeira
triagem com um reagente poliespecífico antes de confirmar o anticorpo com
análise monoespecífica ou quantitativa. Raramente, pode-se suspeitar de
hemólise autoimune, mesmo na ausência de testes TDA positivos; nesse caso,
o teste quantitativo de TDA pode ajudar a identificar subtipos de anticorpos
menos comuns, exceto IgG ou C3. Na ausência de outras variáveis de confusão,
o teste positivo de antiglobulina indica a presença de hemólise por anticorpos
direcionados contra hemácias nativas (THEIS; HASHMI, 2020).

Anemia hemolítica autoimune (AHAI): A AHAI é tradicionalmente a causa mais


reconhecida de testes positivos de antiglobulina e tem sido objeto de amplo estudo.
A classificação “AHAI” serve como descritor abrangente que unifica grande grupo
de diagnósticos com diferentes etiologias que causam hemólise por meio de
anticorpos contra hemácias (GEHRS; FRIEDBERG , 2002). A classificação pode ser
dicotomizada ainda mais considerando fatores como aglutinação quente versus frio
e causa primária versus secundária. A AHAI também pode ser induzida por drogas
ou sindrômica (consulte síndrome de Evans). A caracterização adicional de doenças
que se enquadram nessa classificação está além do escopo desta entrada (THEIS;
HASHMI, 2020).

Reação de transfusão hemolítica mediada por aloimune (RTHA): RTHA ocorre


quando uma amostra pós-transfusão desenvolve um aloanticorpo recém-encontrado.
A formação de um aloanticorpo pode ocorrer tão rapidamente quanto em 2 a 3
dias (DOLATKHAH et al., 2013). O desenvolvimento de aloanticorpos resulta em
um teste TDA positivo, mas pode ou não estar associado à hemólise (PARKER;
TORMEY, 2017).

22
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Tipagem de grupos sanguíneos ABO: em transfusões de sangue e transplantes de


células-tronco hematopoiéticas, o teste indireto de antiglobulina pode ser usado para
identificar o fenótipo de hemácias e minimizar as chances de incompatibilidade do
doador (THEIS; HASHMI, 2020).

Caso o resultado seja negativo, devem-se acrescentar ao tubo de reação duas gotas
de hemácias humanas sensibilizadas com IgG e verificar se houve aglutinação. A
positividade na prova de Coombs direto indica que a hemácia está sensibilizada e
é recomendada a identificação da classe e do anticorpo. Para identificação de que o
anticorpo é contra algum antígeno do sistema eritrocitário, este deve ser eluído dos
antígenos do paciente e do eluato analisado (Figura 3).

Figura 3. Teste de Coombs direto.

Hemácias com IgG Incubação com Aglutinação


ou C3 ligadas à anticorpos anti-Ig (prova de Coombs
membrana humana e anti-C3 direta positiva)

IgG C3 anti-Ig anti-C3

Fonte: adaptado de https://www.msdmanuals.com/pt-br/profissional/multimedia/figure/hem_direct_coombs_test_pt.

Teste direto da antiglobulina (TDA) ou Coombs


direto

O TDA tem por finalidade a detecção de anticorpos ou componentes do


complemento fixados às hemácias in vivo ou in vitro.

Descrição da técnica:

» Lavar as hemácias teste de três a quatro vezes em salina e preparar


uma suspensão de 3 a 5% em salina.

» Identificar dois tubos (IgG, Poli) e acrescentar uma gota de


suspensão de hemácias em cada tubo.

23
UNIDADE I │ IMUNO-HEMATOLOGIA

» Adicionar de uma a duas gotas do soro antiglobulina correspondente


a cada tubo.

» Misturar e centrifugar de 3.000 a 3.600rpm por 15-20 segundos.

» Ressuspender gentilmente e examinar a aglutinação. Registrar os


resultados.

Quando o Coombs direto for negativo com a leitura imediata, deixar 15 minutos em
temperatura ambiente, centrifugar e ler novamente.

Os resultados negativos deverão ser confirmados adicionando o controle de


Coombs, centrifugando e observando a aglutinação:

» Controle de Coombs positivo valida o resultado negativo do Coombs


direto.

» Controle de Coombs negativo invalida a reação e indica que o resultado


do Coombs direto é falso-negativo. Nesse caso, é necessário repetir a
técnica.

Os testes positivos devem ser encaminhados para laboratório especializado para


realização de estudos. A presença de aglutinação indica que as hemácias podem
estar sensibilizadas por anticorpos ou por componentes do complemento. Para se
definir a especificidade do anticorpo, devem ser aplicados testes de eluição.

Teste de Coombs indireto

A prova de Coombs indireto é chamada de Pesquisa de Anticorpos Irregulares


(PAI) e avalia a presença de anticorpos irregulares circulantes no soro de
doadores de sangue, receptores, gestantes, pacientes com suspeita de anemias
hemolíticas por presença de anticorpos, entre outros (Figura 4).

Figura 4. Teste de Coombs indireto.

Teste de Coombs indireto


Teste positivo

Amostra de soro Amostra de sangue Ig’s se fixam nas


Soro de Coombs é Aglutinação ocorre,
contendo de um doador é hemácias do doador
adicionado pois as Ig’s estão
anticorpos adicionado ao tubo formando o complexo
(Anti-Ig-humana). fixadas nas hemácias.
(Ig’s). com soro (O+). antígeno-anticorpo.

Fonte: adaptado de https://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/02/teste-de-coombs-indireto.html.

24
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

A pesquisa é realizada rotineiramente no soro de doadores de sangue e receptores,


utilizando para isso hemácias comerciais fenotipadas do grupo O que apresentam
os antígenos para os anticorpos irregulares mais frequentes. Esse teste é
obrigatório nos serviços de hemoterapia porque, quando o doador apresenta
anticorpos irregulares, esses estariam presentes na bolsa de hemocomponente,
podendo reagir com as hemácias do receptor caso encontrassem antígenos
correspondentes.

No caso do receptor, é importante o teste, pois, caso esse tenha algum anticorpo
irregular, é aconselhável a identificação por duas razões:

» É possível direcionar a prova de compatibilidade para bolsas que


sejam negativas para o antígeno, equacionando tempo e custos.

» Caso o paciente seja um candidato a cirurgia, possibilita que o serviço


de hemoterapia providencie com antecedência e tempo hábil as bolsas
de sangue compatível.

Sempre que a PAI é positiva, deve-se proceder à identificação da especificidade


do(s) anticorpo(s) irregulares encontrado(s) no soro/plasma. A identificação de
anticorpos irregulares deve incluir, obrigatoriamente, o meio no qual a PAI foi
reativa.

A identificação de anticorpos irregulares (IAI) é realizada com o soro do


paciente utilizando um painel de hemácias. Geralmente, esse painel apresenta
11 hemácias, em suspensão de 3-5%, numeradas de 1 a 11. As hemácias do painel
são do tipo O e possuem os antígenos contra os anticorpos mais frequentes
em bancos de sangue. Acompanhando o painel vem um diagrama contendo o
perfil fenotípico de cada uma das hemácias. A presença de aglutinação diante
dos diferentes eritrócitos permite a identificação do anticorpo. Como exemplo:
houve aglutinação nos tubos 1, 2, 3, 8, 10 e 11. Basta procurar, em cada uma das
colunas do diagrama, o perfil de aglutinação obtido.

25
UNIDADE I │ IMUNO-HEMATOLOGIA

Figura 5. Painel de hemácias.

DiaMEd-ID Set ID-DiaPanel 516.xx


Micro Typing System Tabela de Antígenos

Rh-hr
Rh-hr Doador
D C E c e
w
1 w W
M600422 C
+ + 0 0 + +
C CD.ee R1 R1
2 CCD.ee R1R1 M600273 + + 0 0 + 0
3 ccD.EE M700437 + 0 + + 0 0
R2R2
4 Ccddee M200441 0 + 0 + + 0
r’r
5 ccddEe r’’r M200385 0 0 + + + 0
6 ccddee rr M100433 0 0 0 + + 0
7 ccddee M100440 0 0 0 + + 0
rr
8 ccD.ee 9970670 + 0 0 + + 0
Ror
9 ccddee rr M100448 0 0 0 + + 0
10 ccD.EE M700420 + 0 + + 0 0
R2R2
11 CcD.ee M400425 + + 0 + + 0
R1r

Fonte: adaptado de http://www.ciencianews.com.br/arquivos/ACET/IMAGENS/biblioteca-digital/imunohematologia/30-


Frequencia-de-anticorpos-eritrocitarios-em-amostras-de-doadores-de-sangue-do-estado-do-Amapa.pdf.

O site Biomedicina Padrão traz a técnica e os testes de Coombs direto e


indireto, acesse em:

» http://www.biomedicinapadrao.com/2011/02/teste-de-coombs-
indireto.html;

» http://www.biomedicinapadrao.com/2010/11/teste-de-coombs-
direto.html.

Doença hemolítica do recém-nascido (HDFN)

A doença hemolítica do feto e do recém-nascido (HDFN) ocorre quando a IgG


materna se forma contra antígenos fetais, notadamente o antígeno Rh ou Kell.
O tipo mais comum de HDFN é devido à incompatibilidade ABO, que ocorre em
aproximadamente 15 a 25% das gestações e tende a ser menos grave (NASSAR;
WEHBE , 2020). A incidência de testes DAT positivos no ABO HDFN é muito
baixa – em torno de 1% –, e desse grupo apenas aproximadamente 23% dos
recém-nascidos desenvolverão icterícia clinicamente significativa; portanto,
o DAT é um mau-preditor positivo de recém-nascidos que exigirá tratamento
(NASSAR; WEHBE, 2020).

26
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

A HDFN, também conhecida como HDFN aloimune ou eritroblastose fetal, é


causada pela destruição de glóbulos vermelhos (RBCs) do neonato ou do feto
por anticorpos maternos da imunoglobulina G (IgG). A formação de anticorpos
maternos em resposta a um antígeno fetal é chamada isoimunização. Esses
anticorpos se formam quando os eritrócitos fetais que expressam certos
antígenos RBC que não são expressos na mãe atravessam a placenta e obtêm
acesso ao sangue materno. Essa resposta de anticorpos pode ser suficiente para
destruir os eritrócitos fetais, levando à hemólise, à liberação de bilirrubina e à
anemia. A gravidade da doença no feto depende de vários fatores, incluindo a
quantidade e a força do anticorpo produzido pela mãe, a idade gestacional do
feto e a capacidade do feto de repor os glóbulos vermelhos destruídos e limpar a
bilirrubina (NASSAR; WEHBE, 2020).

Etiologia

Numerosos sistemas de grupos sanguíneos foram implicados no HDFN, incluindo


ABO, Rhesus (Rh), Kell, Duffy, Kidd, MNS, Diego.P, Lutheran e Xg (MOISE,
2008). Rhesus e ABO são de longe os mais comuns. A incompatibilidade ABO
geralmente ocorre em uma mãe do grupo O com um bebê do grupo A ou B, mas
a incompatibilidade ABO causa doença hemolítica menos grave do recém-nascido
do que a incompatibilidade Rh (D). (GANDHI et al., 2018) Os bebês afetados
são geralmente assintomáticos no nascimento, com anemia ausente ou leve, e
desenvolvem icterícia neonatal, que, geralmente, é tratada com sucesso com
fototerapia. Como a incompatibilidade do fator Rhesus é mais grave, será o foco do
restante desta discussão (NASSAR; WEHBE, 2020).

Epidemiologia

A introdução da imunoprofilaxia pós-natal em 1970 reduziu a incidência de


aloimunização da RhD materna de 14% para 1% ou 2%. Posteriormente, também
foi iniciada a imunoprofilaxia pré-natal, que reduziu ainda mais a aloimunização
da RhD para 0,1%. (LIUMBRUNO et al., 2010). No mundo ocidental, a
incompatibilidade ABO é agora a maior causa de HDFN (NASSAR; WEHBE,
2020).

A incidência de incompatibilidade de Rh varia de acordo com raça e etnia.


Aproximadamente 15% dos brancos são Rh negativos, em comparação com
apenas 5% a 8% dos afro-americanos e 1% a 2% dos asiáticos e americanos

27
UNIDADE I │ IMUNO-HEMATOLOGIA

nativos. Entre os brancos, uma mulher Rh-negativa tem aproximadamente


85% de chance de acasalar-se com um homem Rh-positivo, 60% dos quais
são heterozigotos e 40% dos quais são homozigotos no locus D (PRACTICE
BULLETIN, 2017)

Fisiopatologia

Após a exposição materna ao sangue RhD-positivo, são estabelecidos os clones de


linfócitos B que reconhecem o antígeno RBC. A resposta imune materna primária
é a produção do isotipo IgM. É importante notar que essa resposta imune materna
primária depende da dose. Ocorre em cerca de 15% das gestações com 1mL de
células Rh-positivas e 70% após 250mL de exposição a células Rh-positivas. A
resposta IgG materna ocorre mais tarde nas gestações subsequentes. A resposta
imune secundária segue a exposição repetida a apenas 0,03mL de células
Rh-positivas (HARTWELL, 1998). Os anticorpos anti-D (IgG) maternos atravessam
a placenta e se ligam aos antígenos Rh nas hemácias fetais. A destruição de hemácias
ocorre por lise de hemácias revestidas de anticorpos por enzimas lisossômicas
de macrófagos. O feto responde inicialmente à anemia subsequente e à hipóxia
tecidual por meio da reticulocitose, e um aumento no lactato da artéria umbilical
indica anemia fetal grave. A eritroblastose fetal ocorre quando a destruição das
hemácias excede a produção (NASSAR; WEHBE , 2020).

História e física

Doença leve a moderada: Os bebês menos afetados geralmente apresentam a


doença hemolítica autolimitada que se manifesta como hiperbilirrubinemia nas
primeiras 24 horas de vida (NASSAR; WEHBE, 2020).

Hydrops Fetalis: bebês com anemia grave e com risco de vida (por exemplo,
hydrops fetalis) apresentam edema cutâneo, derrame pleural ou pericárdico ou
ascite. Lactentes com RhD e algumas pequenas incompatibilidades de grupos
sanguíneos, como Kell, estão em risco de hidropsia fetal, principalmente
gestações sem atendimento pré-natal (NASSAR; WEHBE, 2020).

Avaliação

Para pacientes que são Rh-negativas e também têm uma tela de anticorpos negativa,
é importante tentar impedir que elas se sensibilizem durante o curso da gravidez.
As possíveis razões pelas quais um paciente pode ficar exposto ao sangue fetal e,
portanto, sensibilizado incluem aborto espontâneo, amniocentese, sangramento

28
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

vaginal, descolamento de placenta e trauma abdominal. Se qualquer um desses


casos ocorrer, RhoGAM (imunoglobulina anti-D ou fator Rhesus IgG) deve ser
administrado (NASSAR; WEHBE, 2020).

Se a triagem de anticorpos para Rh voltar positiva durante a visita pré-natal inicial,


o título também será verificado. Títulos de anticorpos de 1:16 e maiores foram
associados a hidropisia fetal. Se a paternidade não estiver em questão, o tipo de
sangue pode ser realizado no pai do bebê para determinar se o feto está em risco.
No entanto como aproximadamente 5% de todas as gestações têm paternidade
desconhecida ou incorreta, o caminho mais seguro é tratar todas as gestações
como se o feto estivesse em risco (CLAUSEN, 2018).

Durante a gravidez, o título de anticorpos é seguido aproximadamente a cada


quatro semanas. Enquanto permanecer abaixo de 1:16, a gravidez pode ser
gerenciada com expectativa (NASSAR; WEHBE, 2020).

No entanto, se exceder 1:16, a amniocentese em série deve ser iniciada em 16 a


20 semanas. Na primeira amniocentese, as células fetais podem ser coletadas e
analisadas para o antígeno Rh para determinar o status Rh fetal. Se negativo, a
gravidez pode ser seguida com expectativa. No entanto, se o feto for Rh positivo, é
rastreada a anemia fetal, usando medidas de Doppler da artéria cerebral média
(ACM) fetal. (LEE, 2010). Foi demonstrado mais de uma década atrás que em
fetos anêmicos há maior fluxo sanguíneo para o cérebro, portanto o Doppler MCA
mede a velocidade sistólica de pico (PSV). Em fetos com maiores medições de
PSV, a preocupação com anemia fetal merece testes mais invasivos e tratamento
potencial (ANDREI; VLADAREANU, 2012).

Historicamente, antes do uso do MCA Doppler, a avaliação do feto Rh-positivo


em uma mulher Rh-negativa com títulos positivos 1:16 ou superior era feita com
amniocenteses seriadas para avaliar o líquido amniótico por um espectrofotômetro
(NASSAR; WEHBE, 2020).

Tratamento/Gerenciamento

A imunoglobulina Rho (D) é uma preparação de anticorpos contendo IgG humana


contra o antígeno Rho (D) da célula vermelha. A imunoglobulina Rho (D) é usada
na prevenção da doença hemolítica Rh do recém-nascido. A administração de
imunoglobulina Rho (D) a mães negativas para Rho (D) no momento da exposição
ao antígeno, como o nascimento de uma criança positiva para Rho (D), bloqueia a
resposta imune primária às células estranhas. Portanto, anticorpos maternos para

29
UNIDADE I │ IMUNO-HEMATOLOGIA

células Rh-positivas não são produzidos em gestações subsequentes e a doença


hemolítica do recém-nascido é evitada (NASSAR, WEHBE, 2020).

O RhoGAM deve ser administrado às 28 semanas, pois tem meia-vida de cerca


de 12 semanas e cobre a mãe até o termo ou 40 semanas e pós-parto, se o
recém-nascido for Rh positivo. Uma dose padrão de RhoGAM (0,3 mg) irá erradicar
15 mL de hemácias fetais (NASSAR; WEHBE, 2020). Esta dose é adequada para
uma gravidez de rotina. Nos casos de sangramento pré-parto, trauma abdominal,
amniocentese ou descolamento de placenta, onde mais sangue é transferido do
feto para a mãe do que o normal, a dose padrão de 0,3 mg de RhoGAM pode
não ser suficiente. Um teste de Kleihauer-Betke que determina a quantidade de
hemácias fetais na circulação materna deve ser realizado. Se a quantidade de
hemácias fetais for maior do que a que pode ser eliminada pela dose única de
RhoGAM, devem ser administradas doses adicionais (NASSAR; WEHBE, 2020).

A cordocentese e a medida da hemoglobina fetal são largamente utilizadas para


avaliar a gravidade da anemia quando os dopplers de MCA estão elevados. A
hemoglobina fetal é, por padrão, dois desvios padrão abaixo do valor médio para
a idade gestacional. Um nível de hemoglobina superior a 7g/dL abaixo da média
normal para idade gestacional ou hidropisia (nível real de hemoglobina inferior a
5g/dL). Um hematócrito inferior a 30% também pode ser usado como limiar para
transfusão fetal (NASSAR, WEHBE, 2020).

Diagnóstico diferencial

As causas de bilirrubina não conjugada elevada são vastas. A causa mais comum
é icterícia fisiológica. A icterícia fisiológica apresenta-se por volta do dia 2 ou 3
com uma bilirrubina sérica inferior a 12mg/dL, principalmente não conjugada.
Geralmente desaparece no final da primeira semana e ocorre em 60% dos bebês
a termo e em 80% dos prematuros devido à capacidade limitada de conjugar
bilirrubina (KIRK, 2008). Os fatores de risco incluem diabetes materno,
policitemia, cefaloematoma, prematuridade, sexo masculino, asiático, síndrome
de Down, retardo do movimento intestinal ou obstrução gastrointestinal superior,
hipotireoidismo e um irmão com icterícia fisiológica (NASSAR; WEHBE, 2020).

A icterícia nas primeiras 24 horas após o nascimento não é icterícia fisiológica e


necessita de avaliação adicional. A icterícia para amamentação de início precoce
é a causa mais comum de hiperbilirrubinemia não conjugada patológica. A
amamentação pode potencializar icterícia fisiológica na primeira semana de vida
devido à privação calórica, levando a um aumento na circulação entero-hepática

30
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

e, portanto, a uma diminuição da reabsorção de bilirrubina pelo intestino. A


amamentação bem-sucedida a cada duas a três horas, enquanto monitora a produção
de fezes e urina para determinar se a criança está se alimentando adequadamente,
diminui significativamente o risco de hiperbilirrubinemia (LAUER; SPECTO,
2011).

A icterícia do leite materno ocorre após a primeira semana de vida e é secundária à


capacidade do leite materno de inibir a 2,3 UDP glucuroniltransferase, a enzima
responsável pela conjugação da bilirrubina (NASSAR, WEHBE, 2020).

As causas genéticas da hiperbilirrubinemia não conjugada incluem a síndrome


de Gilbert, que se apresenta com icterícia mais tarde na vida após doenças leves,
jejum ou estresse físico. A síndrome de Gilbert é causada por um defeito da UDP
glucuronosiltransferase. Crigler-Najjar é devido a uma ausência ou diminuição da
UDP glucuronosiltransferase (NASSAR, WEHBE, 2020).

Outras causas devido a um aumento na produção de bilirrubina, semelhante


à incompatibilidade Rh/ABO, incluem defeitos enzimáticos (deficiência de
glicose-6-fosfato e deficiência de piruvato-quinase), defeitos estruturais (esferocitose
e eliptocitose), trauma de nascimento (cefaloematoma e hematomas excessivos) e
policitemia (NASSAR; WEHBE, 2020).

A investigação da hiperbilirrubinemia indireta inclui hemograma completo,


contagem de reticulócitos, esfregaço de sangue, haptoglobina sérica, teste direto
e indireto de Coombs, eletroforese de hemoglobina, teste enzimático de glóbulos
vermelhos e teste de esferocitose (LAUER; SPECTO, 2015). (Figura 6).

Figura 6. Doença hemolítica do recém-nascido.

Eritroblastose fetal
(doença hemolítica do recém-nascido)

Mulher
Rh- (rr) Mulher sensibilizada produz
grande quantidade de
anticorpos anti-Rh
PAI MÃE
Organismo materno
Rh+ Rh- produz anticorpos anti-Rh

Passagem de
Passagem de
anticorpos anti-Rh
hemácias fetais (Rh+)
para a circulação
Rh+ FILHO para o sangue da
mãe
fetal
Criança
Criança
Rh+ Rh+

1ª Gravidez Parto 2ª Gravidez

Anticorpos anti-Rh passam pela placenta destruindo


hemácias/eritroblastos fetais.
Fonte: adaptado de https://www.slideshare.net/AndreLuizdoNasciment1/grupos-sanguineos-99645385.

31
UNIDADE I │ IMUNO-HEMATOLOGIA

Há certos procedimentos que a mãe de Rh negativo pode realizar a fim de evitar a


doença hemolítica do neonato. Pode-se destacar o cuidado no contato com sangue
de Rh positivo, o diagnóstico do fator Rh do feto por meio da técnica denominada
Reação em Cadeia de Polimerase, a realização do teste de Coombs para saber se
a mãe já está imunizada e ainda o uso de medicamentos como o MATERGAM e
RHOGAM, que são imunoglobulinas (IgG) Anti-D usadas profilaticamente na
prevenção de anticorpos contra eritrócitos Rh positivos em pessoas Rh negativas
que estão sob risco de serem sensibilizadas por esses eritrócitos.

Antígeno D fraco (fraca expressão de D)

De acordo com Araujo e Damalio (2013, p. 23),

É sabido que um número muito reduzido de pessoas possui


hemácias que não são aglutinadas diretamente com soro anti-D,
contudo reagem positivamente ao teste da anti-globulina. Durante
a incubação com soro anti-D, ocorre sensibilização das hemácias
portadoras do fator D fraco. Acrescentando-se a antiglobulina, esta
reagirá com os anticorpos sensibilizando as hemácias (anti-D), e
assim promovendo a aglutinação. O fator D fraco é um alelo do gene
D tão imunogênico quanto o próprio antígeno D.

Normalmente hemácias RhD positivas possuem densidade antigênica variando


entre 15.000 a 30.000 antígenos/célula, dependendo do haplótipo. Isto não é
regra, pois alguns fenótipos foram identificados com densidade variando entre
70 e 5.200 antígenos RhD e foram denominados de D fracos. Estes são causados
pela substituição de aminoácidos nas porções transmembranosas e intracelulares
da proteína RhD devido à mutação no gene RHD. Hemácias com fenótipo D fraco
expressam um antígeno RhD intacto ocorrendo em 0,2% a 1% dos caucasianos.

Hoje em dia, temos mais de 40 tipos de D fracos identificados em nível molecular,


nos quais o D fraco tipo 1 e 2 são os mais frequentes. Somado a isso, o fenótipo
D fraco carrega o antígeno RhD intacto, o que diminui a probabilidade de formar
aloanticorpo anti-D.

A distinção entre D fraco e D parcial não deve ser feita pela produção de anti-D.
Foi proposto o índex Rhesus para a predição do risco de imunização em indivíduos
D fraco. Esse índex foi baseado na densidade antigênica de diferentes anticorpos
monoclonais dependendo da:

» quantidade de sítios antigênicos;

32
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

» afinidade do anticorpo e pode teoricamente variar de 1 (risco baixo,


exemplo: RhD normal) a 0 (alto risco exemplo: parcial RhD faltando
epítopos).

Definições de D fraco e D parcial

Os termos D fraco e D parcial têm sido frequentemente usados para determinar


como um paciente é transfundido ou se a profilaxia da imunoglobulina anti-D deve
ser administrada. Esses termos, no entanto, não são definidos adequadamente
e, portanto, não são adequados para esse fim. Três tipos de definições de
diferenciação foram usados, mas nenhum é satisfatório (DANIELS, 2013).

Antígenos D fracos têm todos os epítopos D; antígenos D parciais não possuem


um ou mais epítopos D. É difícil definir sorologicamente, porque uma reação
negativa com um anticorpo monoclonal específico ou por um método específico
pode resultar da expressão fraca do epítopo, e não da sua ausência. O antígeno
D-IIa parece ter todos os epítopos, mas os indivíduos com glóbulos vermelhos
do D-IIa produzem anti-D e, portanto, seus glóbulos vermelhos devem estar com
pelo menos um epítopo D (DANIELS, 2013).

Indivíduos com antígenos D parciais podem produzir anti ‐ D; aqueles com


antígenos D fracos não podem. Essa é a interpretação usual da dicotomia, mas
depende de uma resposta imune. Se anti-D não foi encontrado em qualquer
pessoa com uma variante D específica, isso não significa que outro paciente
com a mesma variante não fará anti-D após a imunização com eritrócitos D+.
Por exemplo, os tipos D fracos 4 · 2 e 15 foram classificados como D fracos, mas
todos foram posteriormente encontrados em numerosos pacientes que fizeram
aloanti-D (WAGNER et al., 2000).

No D parcial, as proteínas RhD apresentam alterações de aminoácidos fora da


membrana, enquanto no D fraco as proteínas RhD têm uma ou mais substituições
de aminoácidos nos domínios de abrangência da membrana ou nas alças
citoplasmáticas da proteína, mas não expostas externamente (WAGNER et al.,
1999; FLEGEL et al., 2007). Uma falha importante dessa definição é que não
são conhecidas as localizações precisas dos resíduos de aminoácidos da proteína
RhD na membrana; modelos diferentes preveem locais diferentes para alguns
aminoácidos. Além disso, essa definição não é funcional do ponto de vista da
prática transfusional, pois a genotipagem de RHD geralmente não é realizada
rotineiramente em muitos hospitais ou mesmo laboratórios de referência. Além
disso, as palavras “fraco” e “parcial” têm significados bem definidos no idioma
inglês e usá-las como código para diferença estrutural em uma proteína de
membrana é enganosa (DANIELS, 2013).

33
UNIDADE I │ IMUNO-HEMATOLOGIA

Em alguns casos, símbolos sugestivos de atividade do antígeno D variante podem


ter sido atribuídos quando uma mutação RHD foi detectada, apesar da falta de
evidência de expressão D anormal. Por exemplo, o DMA (Leu207Phe) é codificado
por um gene RHD que só foi encontrado em trans com RHD normal; portanto, não
há informações sobre o efeito na expressão D (WAGNER et al., 2003) e os tipos D
fracos 19 (Ile204Thr) e 20 (Phe417Ser) possuem antígenos D normais, conforme
determinado por testes sorológicos, embora haja um número reduzido de sítios de
antígenos D (YU et al., 2006). Sem evidência de expressão D anormal, os termos D
fraco, D parcial e D são inapropriados (DANIELS, 2013).

As variantes D DAR e D fraco tipo 4 · 2 foram encontradas em indivíduos com


aloanti-D e têm as mesmas três substituições de aminoácidos, diferindo apenas
por uma única mutação sinônima (HEMKER et al., 1999; WAGNER et al., 2000).
Consequentemente, os termos DAR e D fraco tipo 4 · 2 representam variantes D
com fenótipos idênticos e genótipos quase idênticos, mas o primeiro é considerado
D parcial e o segundo possui uma notação D fraca (DANIELS, 2013).

A dicotomia D/D parcial é artificial e a terminologia usada para descrever essas


variantes é enganosa. Os termos D fraco e D parcial devem agora ser substituídos
por um único nome coletivo, como a variante D (DANIELS et al., 2007).

Antígeno D parcial

O antígeno D é composto de numerosos epítopos e sua expressão parcial foi


originalmente definida por indivíduos D apresentando formação de anti-D. Estudos
com anticorpos monoclonais resultaram em mais de 30 epítopos altamente
conformacionais, envolvendo várias alças extracelulares.

Hemácias D parciais são definidas pela ausência de um ou mais epítopos


causados pelos rearranjos dos genes RHD e RHCE. Essa configuração genética
possibilita microconversões e trocas unidirecionais de fragmentos de gene RHD
e RHCE, ou parte deles, levando a formação de alelos RHD-CE-D ou RHCE-D-CE
respectivamente. Esses novos alelos aberrantes de Rh não produzem proteínas
híbridas, regiões de RhD unidas com RhCE levando à perda de epítopos de D,
gerando novos antígenos.

Poucos fenótipos D parciais resultam de trocas de um aminoácido apenas. De


forma contrária ao D fraco, o polimorfismo ocorre nos segmentos extracelulares
da proteína RhD. Indivíduos D parciais podem frequentemente produzir anti-D
contra aqueles epítopos ausentes quando expostos à proteína RhD completa.

34
IMUNO-HEMATOLOGIA │ UNIDADE I

Quais seriam os outros sistemas sanguíneos e as suas funções? Que tal fazer
uma busca e incorporar este conhecimento?

Recomendamos dois vídeos sobre o sistema ABO e Rh, disponíveis em:

» http://www.youtube.com/watch?v=1LG5lTkgP0g;

» http://www.youtube.com/watch?v=mPOIZKCorCI.

35
IMUNOLOGIA UNIDADE II
CLÍNICA – PARTE I

CAPÍTULO 1
Anticorpos

Classes de anticorpos
Anticorpo é caracterizado por uma GLOBULINA sintetizada de linfócitos B e
principalmente por plasmócitos, após receber estímulo de um imunógeno, e
que possui propriedade de interagir com este de maneira específica (ARAUJO;
DAMALIO, 2013, p. 26).

As imunoglobulinas (Igs) pertencem à superfamília de imunoglobulinas


homônimas (IgSF). (WILLIAMS; BARCLAY, 1988; HARPAZ; CHOTHIA, 1996;
TORRES et al., 2008) Elas consistem em duas cadeias pesadas (H) e duas
leves (L), onde a cadeia L pode consistir em uma cadeia κ ou λ. Cada cadeia
de componentes contém um domínio IgSF “variável (V) Ig2-terminal e um ou
mais domínios IgSF” terminal “(C)” constante “(C), cada um dos quais consiste
em duas folhas plissadas β prensadas ‘presas’ juntas por uma ponte dissulfeto
entre dois resíduos de cisteína conservados (WILLIAMS; BARCLAY, 1988).
Cada domínio V ou C consiste em aproximadamente 110-130 aminoácidos, com
média de 12.000 a 13.000 kDa. Ambas as cadeias de Ig L contêm apenas um
domínio C, enquanto as cadeias de Ig H contêm três ou quatro desses domínios.
As cadeias H com três domínios C tendem a incluir uma região de articulação
espaçadora entre o primeiro (CH1) e o segundo (CH2) domínios. Assim, uma
cadeia L típica massa aproximadamente 25 kDa e uma cadeia Cγ H de três
domínios C com sua dobradiça massa aproximadamente 55 kDa. É permitida
uma considerável variabilidade aos aminoácidos que povoam a superfície
externa do domínio IgSF e às alças que ligam as cadeias p. Essas superfícies
expostas a solventes oferecem vários alvos para atracar com outras moléculas
(SCHROEDER; CAVACINI, 2010).

36
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I │ UNIDADE II

Reconhecimento de antígeno e o Fab


Os primeiros estudos da estrutura de Ig foram facilitados pelo uso de enzimas
para fragmentar moléculas de IgG. A papaína digere IgG em dois fragmentos
Fab, cada um dos quais pode se ligar ao antígeno, e um único fragmento Fc. A
pepsina divide a IgG em um fragmento Fc e em um único F (ab) 2 dimérico que
pode reticular e também ligar antígenos. O Fab contém uma cadeia L completa
em sua totalidade e a porção V e CH1 de uma cadeia H. O Fab pode ainda ser
dividido em um fragmento variável (Fv) composto pelos domínios VH e VL e um
fragmento constante (Fb) composto pelos domínios CL e CH1. Fragmentos de Fv
único podem ser geneticamente modificados para recapitular as características
de ligação ao antígeno monovalente do anticorpo original. (SMITH et al., 2004).

Paratopos, epítopos, idiotipos e isotipos

As interações imunoglobulina-antígeno geralmente ocorrem entre o paratopo,


o local na Ig na qual o antígeno se liga, e o epítopo, que é o local no antígeno
que está ligado. In vivo, as imunoglobulinas tendem a ser produzidas contra
antígenos intactos na forma solúvel e, assim, identificam preferencialmente
epítopos de superfície que podem representar estruturas conformacionais
que não são contíguas na sequência primária do antígeno. Essa capacidade
de identificar partes componentes do antígeno independentemente do resto
torna possível para a célula B discriminar entre dois antígenos intimamente
relacionados, cada um dos quais pode ser visto como uma coleção de epítopos.
Também permite que o mesmo anticorpo se ligue a antígenos divergentes que
compartilham epítopos equivalentes ou semelhantes, um fenômeno conhecido
como reatividade cruzada (SCHROEDER; CAVACINI , 2010).

A imunização de espécies heterólogas com anticorpos monoclonais (ou um


conjunto restrito de imunoglobulinas) permitiu a identificação de determinantes
antigênicos comuns e individuais da imunoglobulina. Determinantes individuais,
denominados idiotipos, estão contidos nos domínios V. Determinantes comuns,
denominados isotipos, são específicos para a porção constante do anticorpo e
permitem o agrupamento de imunoglobulinas em classes reconhecidas, com
cada classe definindo um tipo individual de domínio C. Determinantes comuns
a subconjuntos de indivíduos dentro de uma espécie, mas diferindo entre outros
membros dessa espécie, são denominados alotipos e definem polimorfismos
herdados que resultam de alelos genéticos (JAZWINSKA et al., 1988).

37
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I

Imunógenos versus Antígenos

No trabalho original de Araujo e Damalio (2013, p. 26),

Imunógenos são moléculas capazes de desencadear uma


resposta imune adaptativa após sua introdução em humanos
ou animais, ou seja, é qualquer substância que possa gerar
uma resposta imune específica. Antígenos são substâncias
que podem se ligar a um determinado anticorpo. Logo, todos
os antígenos têm o potencial de induzir anticorpos específicos,
no entanto, alguns precisam ligar-se a algum imunógeno para
poder fazer isso. Isso quer dizer que todos os imunógenos
são antígenos, mas nem todos os antígenos são imunógenos.
Às vezes o que pode fazer com que um antígeno não seja um
imunógeno é a reação cruzada, definida como a ligação de
um anticorpo com outro anticorpo que não o imunógeno que
desencadeou a resposta imune.

No início dos estudos em Imunologia, o anticorpo era reconhecido apenas por


suas propriedades, tais como a de neutralizar a toxina correspondente ou provocar
aglutinação de hemácias e a de promover lise de bactérias e, por fim, provocar
choque anafilático em pessoas ou animais sensibilizados.

O conhecimento nos dias de hoje nos mostra que as moléculas de anticorpos são
constituídas basicamente de duas subunidades proteicas denominadas cadeias
leves (L) e duas subunidades designadas cadeias pesadas (H) do inglês heavy.

A Organização Mundial da Saúde (OMS) adotou a designação genérica de


imunoglobulinas para todas as classes ou isotipos (tipos moleculares presentes
em todos os indivíduos de uma mesma espécie) de globulinas com a estrutura
básica da molécula de anticorpo, usando a sigla Ig seguida das maiúsculas A, G,
M, D e E para as cinco classes até agora conhecidas.

As cinco classes (ou isotipos) diferem entre si (sequência primária de aminoácidos)


das cadeias pesadas, sendo as cadeias leves iguais para todas as classes
imunoglobulinas. Há, no entanto, dois tipos de cadeias leves com diferentes
sequências de aminoácidos. As cadeias pesadas, específicas para cada classe, são
também designadas por letras gregas que simbolizam a sua estrutura.

38
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I │ UNIDADE II

Estrutura básica da molécula de anticorpo


Os primeiros estudos de imunoglobulinas tiveram foco na IgG. Essa é a que apresenta
maior concentração no soro, portanto, sua estrutura pôde ser mais facilmente
caracterizada (SCHROEDER; CAVACINI, 2010).

As cadeias pesada e leve de Ig são codificadas por uma família multigênica


separada (TONEGAWA, 1983) e os domínios V e C individuais são codificados
por elementos independentes: segmentos do gene V (D) J para o domínio V
e exons individuais para o C domínios. A sequência primária do domínio V é
funcionalmente dividida em três intervalos hipervariáveis, denominados regiões
determinantes de complementaridade (CDRs) que estão situadas entre quatro
regiões de sequências estáveis denominadas estruturas (FRs) (SCHROEDER;
CAVACINI, 2010).

Reorganização da imunoglobulina

Cada segmento do gene V contém tipicamente seu próprio promotor, um exon


líder, um intron interveniente, um exon que codifica as três primeiras regiões
estruturais (FR 1, 2 e 3), CDRs 1 e 2 em sua totalidade, a porção amino terminal
de CDR 3 e uma sequência de sinal de recombinação (RSS). Cada segmento gênico
J (para união) começa com seu próprio sinal de recombinação, a porção terminal
carboxi da CDR 3 e a FR 4 completa (SCHROEDER; CAVACINI, 2010).

Isotipos de cadeia pesada

No início do desenvolvimento das células B, os domínios variáveis rearranjados


produtivamente (VH e VL) são expressos em associação com a cadeia pesada µ para
produzir IgM e, em seguida, IgD por meio de splicing alternativo. Posteriormente
durante o desenvolvimento, e em resposta à estimulação antigênica e à regulação
de citocinas, esses domínios variáveis podem se associar a outros isotipos (IgG, IgA
e IgE) em um processo controlado. Ou seja, a troca de isotipo não ocorre apenas
por acaso. Os genes CH para cada isotipo estão alinhados na mesma orientação
transcricional, no cromossomo 14. Os isotipos diferem em várias propriedades,
incluindo tamanho, fixação do complemento, ligação ao FcR e resposta do
isotipo ao antígeno. A escolha do isotipo depende do próprio antígeno e das vias
de sinalização ativadas, bem como dos microambientes locais (SCHROEDER;
CAVACINI, 2010). (Figura 7).

39
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I

Figura 7. Estrutura de uma imunoglobulina.

Sítio de ligação Antígeno


Determinante antigênico
Região variável
Cadeia leve
Região constante Cadeia pesada

Fonte: adaptado de https://danimelofisio.blogspot.com/2011/04/imunoglobulinas-e-anticorpos-na.html.

Veja mais, no artigo sobre imunidade do feto e do recém-nascido, disponível


em: http://www.pediatriasaopaulo.usp.br/index.php?p=html&id=253.

Propriedades gerais das imunoglobulinas

Ligação ao antígeno (Ag)

As imunoglobulinas são ligadas de forma específica a um ou mais antígenos


proximamente relacionados. Segundo Araujo e Damalio (2013, p. 28),

Cada imunoglobulina liga-se a um determinante antigênico


específico. Ligação a antígeno pelos anticorpos é a função primária
dos anticorpos e pode resultar em proteção do hospedeiro. A
valência do anticorpo refere-se ao número de determinantes
antigênicos que uma molécula individual de anticorpo pode se
ligar, sendo que é pelo menos duas e em alguns casos mais (IgM –
na forma pentâmera).

Resposta imune adaptativa primária e secundária

Nas respostas imunes de primeiro contato com Antígeno (Ag), encontramos


imunoglobulinas predominantes como IgM e IgD (na superfície da célula B),
que apresenta como principal característica principal ser mais lenta e menos
intensa. Por sua vez, as respostas imunes de segundo contato com o antígeno
(Ag), encontramos predominância de IgA, IgE e IgG, e respostas mais rápidas,
intensas e especifica.

40
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I │ UNIDADE II

Estrutura

Todos os anticorpos são Imunoglobulinas (Igs), mas nem todas as Imunoglobulinas


são classificadas como anticorpos: Em tese, anticorpo constitui uma ação e um
evento que é característico do funcionamento de uma molécula denominada
Imunoglobulina. Contudo, também produzimos imunoglobulinas que não tem
nenhuma atividade de anticorpo. Assim, as Igs fazem parte das proteínas do sangue
(são proteínas solúveis no sangue), embora possamos encontrar Igs em muitos
fluidos e líquidos corporais também.

As Igs foram descobertas por meio da análise da mobilidade eletroforética das


proteínas do sangue levando em conta o peso molecular de cada uma delas. Foi
verificado nas proteínas a presença de um grupo de proteínas que correspondem
às albuminas e um grupo que corresponde às globulinas. Dentro das globulinas, de
morfologia globosa, existem outros subtipos como as globulinas alfa, beta e gama.
Assim, as imunoglobulinas fazem parte do grupo das gama globulinas e, na sua
formação, é glicoproteica (proteína + polissacarídeo).

Produzidas pelas células plasmáticas (linfócito B maduro, únicas células a produzir


Igs), esse processo normalmente é de resposta a um imunógeno. Existem eventos
casuais e patológicos em que há produção de Ig sem a presença de um imunógeno
(processos neoplásicos de células B, por exemplo) e a formação de grupos de
células produtoras de Ig sem nenhum estímulo, ou seja, não são moléculas de
anticorpos, são apenas Ig.

As imunoglobulinas estão alocadas em cinco classes diferentes, com base nas


diferenças em sequências de aminoácidos na região constante das suas cadeias
pesadas. Na prática, todas as imunoglobulinas de uma mesma classe têm regiões
constantes de cadeia pesada muito similares. Essas diferenças podem ser detectadas
por estudos de sequências ou por meios sorológicos por exemplo, pelo uso de
anticorpos dirigidos a essas diferenças) (Figura 8).

IgG

Estrutura: na maioria das respostas de anticorpos humorais, seja a proteção


contra patógenos celulares ou virais, estão envolvidas funções efetoras mediadas
por IgG. Isso inclui respostas humorais em doenças alo- ou autoimunes. IgG1 é
o anticorpo mais abundante no soro humano, seguido por IgG2, IgG3 e IgG4,
respectivamente (VIDARSSON et al., 2014). Embora as subclasses de IgG sejam
mais de 90% idênticas no nível de aminoácidos, cada subclasse de IgG possui um

41
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I

perfil exclusivo em relação à estrutura, ligação ao antígeno, formação do complexo


imune, ativação do complemento, ativação de FcγR, meia-vida e transporte
placentário (VIDARSSON et al., 2014). IgG1, IgG3 e, em certa medida, IgG4 são
geralmente formados contra antígenos protéicos, enquanto IgG2 é a principal
subclasse formada contra estruturas repetidas de polissacarídeos independentes
de células T encontradas em bactérias encapsuladas (FERRANTE et al., 1990).
A IgG3 é frequentemente a primeira subclasse a ser formada, seguida pelas
respostas de IgG1 que mais tarde dominam. O desenvolvimento de respostas de
IgG4 geralmente é o resultado de exposição repetida ou prolongada a antígenos,
embora seja possível a troca de classe de células B naive que expressam IgM para
IgG4 (LIGHAAM; RISPENS, 2016). As interações CH3-CH3 incomumente fracas
no domínio Fc da IgG4 e as ligações dissulfeto sensíveis à redox na dobradiça
da IgG4 facilitam a troca de duas meias-moléculas (cada uma consistindo em
uma cadeia pesada e uma leve de uma única molécula de IgG4), o que permite a
formação de moléculas biespecíficas de IgG4 (LIGHAAM; RISPENS, 2016; VAN
DER NEUT KOLFSCHOTEN et al., 2007; RISPENS et al., 2014). Para IgG2, duas
isoformas (IgG2 A/B) existem como resultado de diferentes ligações dissulfeto
no domínio Fab e dobradiça, o que determina a rigidez dos domínios Fab ao se
envolver o antígeno (WYPYCH et al., 2008). Funcionalmente, IgG1 e IgG3 são fortes
indutores de mecanismos efetores mediados por Fc, como citotoxicidade celular
dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento
(CDC) e fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP). IgG2 e IgG4, por
outro lado, geralmente induzem respostas mais sutis, embora a IgG2 tenha
demonstrado ser bastante capaz de induzir um bom complemento e respostas
mediadas pelo receptor Fc contra epítopos de alta densidade, como polissacarídeos
(BARRETT; AYOUB, 1986; SAELAND et al., 2003). Essa capacidade de IgG2
pode estar relacionada também à rigidez peculiar da dobradiça, que resulta em
anticorpos super-agonísticos e desencadeia uma sinalização forte ao direcionar-se
a receptores co-estimuladores imunes, como o CD40 (WHITE et al., 2015).

Todas IgGs são categorizadas como monômeros (imunoglobulina 7S). As subclasses


diferem no número de pontes dissulfeto e comprimento da região da dobradiça.

Propriedades: é a mais versátil imunoglobulina porque é capaz de realizar todas as


funções das moléculas de imunoglobulinas.

» IgG é a principal Ig no soro – 75% das Ig do soro são IgG.

» IgG é a principal Ig em espaços extra vasculares.

42
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I │ UNIDADE II

» Transferência placentária – IgG é a única classe de Ig que atravessa


a placenta. A transferência é mediada pelo receptor da região Fc do
IgG nas células placentárias. Nem todas as subclasses atravessam a
placenta com a mesma eficiência; IgG2 não atravessa bem.

» Fixação do complemento – nem todas as subclasses fixam com a


mesma eficiência; IgG4 não fixa complemento.

» Ligação a células – macrófagos, monócitos, PMNs (células da


imunidade inata) e alguns linfócitos (imunidade adquirida) têm
receptores para a região Fc da IgG. Nem todas as subclasses se ligam
com a mesma eficiência; IgG2 e IgG4 não se ligam a receptores de
Fc. Uma consequência direta da ligação a receptores de Fc em PMNs,
monócitos e macrófagos é que a célula pode internalizar melhor o
antígeno processado. O anticorpo cria um microambiente propício
para que o antígeno seja reconhecido e fagocitado pelas células
do sistema imune inato. O termo opsonina é usado para descrever
substâncias que aumentam essa fagocitose. IgG é uma boa opsonina.
Ligação de IgG a receptores de Fc em outros tipos de células resulta
na ativação de outras funções.

IgM

Estrutura: IgM é a primeira imunoglobulina expressa durante o desenvolvimento


de células B. As células B naïve expressam IgM monomérica em sua superfície e
associam-se a CD79a e CD79b, cadeias polipeptídicas que participam da sinalização
de células IgM. Após a maturação e estimulação antigênica, a IgM multimérica
(geralmente pentamérica, raramente hexamérica), na qual unidades IgM únicas
se ligam entre si por ligações dissulfeto na região CH4, é secretada. O pentâmero
também contém uma cadeia polipeptídica, a cadeia J, que é ligada a dois dos
monômeros por meio de uma ligação dissulfeto. A cadeia J facilita a secreção nas
superfícies mucosas. Geralmente, enquanto as moléculas de IgM monoméricas têm
baixa afinidade devido a sua imaturidade; alta avidez pode ser alcançada por meio
de interações multiméricas entre o anticorpo secretado pentamérico e o antígeno,
especialmente se esse antígeno contiver vários epítopos de repetição em si. A
IgM funciona opsonizando (revestindo) o antígeno para destruição e fixação do
complemento. A natureza pentamérica do anticorpo o torna muito eficiente nesse
processo (SCHROEDER; CAVACINI, 2010).

43
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I

Os anticorpos IgM estão associados a uma resposta imune primária e são


frequentemente usados para diagnosticar a exposição aguda a um imunógeno ou
patógeno. Dado que a IgM é expressa no início do desenvolvimento de células B,
a cadeia pesada μ associa-se a VH e VL que não sofreram muita mutação somática
em resposta ao antígeno. Como resultado, os anticorpos IgM tendem a ser mais
polirreativos do que outros isotipos, o que permite que as células B portadoras de
IgM respondam rapidamente a uma variedade de antígenos. Esses anticorpos IgM
de afinidade relativamente baixa também são chamados de anticorpos naturais.
Alguns desses anticorpos naturais não apenas participam como primeira linha
de defesa, mas também desempenham um papel na imunorregulação (BOES,
2000). Os anticorpos naturais podem reagir com autoantígenos, mas raramente
são responsáveis por doenças autoimunes ou patogênese. Os autoanticorpos
patogênicos tendem a ser extraídos da população IgG de alta afinidade, somática e
mutada (SCHROEDER; CAVACINI, 2010).

Propriedades:

» IgM é a terceira Ig mais facilmente encontrada no soro.

» IgM é a primeira Ig produzida e liberada pelo feto e a primeira Ig


produzida e liberada por uma célula B naive assim que estimulada
pelo antígeno.

» Devido às características da estrutura pentâmera, a IgM é


considerada uma excelente Ig fixadora do sistema complemento,
permitindo, assim, ganho de eficiência dos anticorpos IgM na lise
de microrganismos.

» IgM também é uma boa Ig aglutinadora, o que permite agregar


microrganismos e eliminá-los eventualmente de forma extracorpórea.

» IgM utiliza receptores Fc para se conectar a algumas células no


organismo.

» Ig de superfície de célula do tipo B (linfócito B): IgM de superfície se


apresenta como um monômero sem a presença da cadeia J, com 20
aminoácidos extras na região C-terminal, que permitem a ancoragem
na membrana. Dentre as funções mais importantes, podemos citar a
capacidade de funcionar como receptor para antígeno ou células B e
a importante ligação não covalente com duas proteínas na membrana
da célula B, as denominadas Ig-alfa e Ig-beta. Estas proteínas,

44
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I │ UNIDADE II

por sua vez, funcionam como moléculas de transdução de sinal,


desempenhando um papel que seria da curta cauda citoplasmática.
Especificamente, os antígenos T-independentes têm capacidade
de contato entre o antígeno e a superfície da imunoglobulina,
ativando as células B na diferenciação em plasmócitos secretores
de anticorpos. Já para os antígenos T-dependentes, um segundo
sinal fornecido pelas células T auxiliares é requerido na ativação
das células B.

IgA

Estrutura: Os níveis séricos de IgA tendem a ser mais altos que os de IgM, mas
níveis consideravelmente mais baixos que os de IgG. Por outro lado, os níveis
de IgA são muito mais altos que a IgG nas superfícies mucosas e nas secreções,
incluindo saliva e leite materno (mucosa, como o trato genital, enquanto mais
de 90% da IgA sérica está na forma de IgA1 (SCHROEDER; CAVACINI, 2010).
Em particular, a IgA pode contribuir com até 50% da proteína no colostro,
o ‘primeiro leite’ dado ao recém-nascido pela mãe. Embora geralmente um
monômero no soro, a IgA na mucosa, denominada IgA secretora (sIgA), seja
um dímero (às vezes, trímero e tetrâmero) associado a uma cadeia J e outra
cadeia polipeptídica, o componente secretor. Semelhante à IgM, os domínios
CH3 da IgA têm peças curtas às quais a cadeia J se liga por meio de ligações
dissulfeto, enquanto o componente secretor é dissulfeto ligado a um dos
domínios CH2 do dímero. Existem duas subclasses de IgA, IgA1 e IgA2, cujas
estruturas diferem principalmente em suas regiões de charneira. A IgA1 tem
uma região de dobradiça mais longa com um trecho duplicado de aminoácidos
que falta na IgA2. Essa região dobradiça alongada aumenta a sensibilidade da
IgA1 às proteases bacterianas, apesar da proteção parcial dos glicanos. Essa
proteção aumentada contra a digestão da protease pode explicar por que a IgA2
predomina nas muitas secreções da mucosa, como o trato genital, enquanto
mais de 90% da IgA sérica está na forma de IgA1 (SCHROEDER; CAVACINI,
2010).

Em forma de dímero, uma cadeia J se associa a ela. Por outro lado, se IgA for
encontrada em secreções identificamos outra proteína associada a ela chamada de
peça secretora T; IgA é, às vezes, referida como imunoglobulina 11S. Ao contrário
do resto da IgA que é feito no plasmócito, a peça secretora é feita nas células
epiteliais e é adicionada à IgA à medida que esta passa pelas secreções. A peça
secretora ajuda a IgA a ser transportada por meio da mucosa e também a protege
da degradação nas secreções.

45
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I

Propriedades:

» IgA é comum no soro (só perde para IgG).

» IgA é a principal classe de Ig em secreções – lágrimas, saliva, colostro,


muco. Uma vez que é encontrada em secreções, IgA secretora é
importante na imunidade local (de mucosa).

» Normalmente IgA não fixa complemento, a menos que esteja agregada.

» IgA pode se ligar a algumas células – PMNs e alguns linfócitos.

IgD

Estrutura: a IgD circulante é encontrada em níveis muito baixos no soro


com uma meia-vida curta no soro que pode ser atribuída à sensibilidade da
molécula, com a região de articulação em particular, à proteólise. A função da
IgD circulante não é clara, pois não se sabe que ela participa dos principais
mecanismos efetores de anticorpos. A IgD circulante pode reagir com proteínas
bacterianas específicas, como a proteína de ligação IgD de Moraxella catarrhalis,
independente das regiões variáveis do anticorpo (RIESBECK; NORDSTROM,
2006). A ligação dessas proteínas bacterianas à região constante da IgD resulta
em estimulação e ativação de células B (SCHROEDER; CAVACINI, 2010).

Enquanto a forma de IgD ligada à membrana foi estudada mais extensivamente;


mesmo aqui sua função permanece pouco compreendida. Semelhante à IgM, a
IgD ligada à membrana está associada a CD79a e CD79b para sinalização. A IgD
é expressa nas membranas das células B quando elas saem da medula óssea e
povoam os órgãos linfoides secundários. A maioria das células B IgD + também
coexpressa IgM e ambas participam na sinalização do receptor de células B por
meio de CD79a e CD79b. A IgD pode substituir a IgM e vice-versa nas células B
IgD + IgM +. Foi proposto que a IgD ligada à membrana regula o destino das
células B em estágios específicos de desenvolvimento por meio de alterações no
status de ativação. (GEISBERGER et al., 2006).

Propriedades:

» IgD é encontrada em baixos níveis no soro; seu papel no soro não está
totalmente estabelecido.

46
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I │ UNIDADE II

» IgD encontrada em superfícies de célula B, onde funciona como


receptor para antígeno. IgD na superfície de células B tem aminoácidos
extras na região C-terminal para ancoramento à membrana. Ela
também se associa com as cadeias beta de Ig-alfa e Ig-beta.

» IgD liga complemento.

IgE

Estrutura: embora esteja presente na menor concentração sérica com a


menor meia-vida, a IgE é uma imunoglobulina muito potente. Está associada
a hipersensibilidade e reações alérgicas, bem como a resposta a infecções por
vermes parasitas. A IgE se liga com uma afinidade extremamente alta ao FCER1,
que é expresso em mastócitos, basófilos, células de Langerhans e eosinófilos.
A IgE circulante regula positivamente a expressão de FCER1 nessas células. A
combinação de forte ligação e regulação positiva da expressão de FCER1 contribui
para a notável potência dessa imunoglobulina (SCHROEDER; CAVACINI, 2010).

Recentemente, tem havido o desenvolvimento de anticorpos anti-IgE como


terapia para alergias e asma (SCHROEDER; CAVACINI, 2010). Os anticorpos são
projetados para atingir IgE livre, bem como células B com IgE ligada à membrana,
mas não ligada ao FcεR, pois esta estimula a degranulação e a liberação de
mediadores inflamatórios. A IgE tem uma afinidade muito menor por FcεRII ou
CD23, que é expressa tanto nas mesmas células que FcεRI quanto em células B,
células NK e plaquetas (SCHROEDER; CAVACINI, 2010).

IgE existe como um monômero e tem um domínio extra na região constante.

Propriedades:

» IgE é a Ig sérica menos comum, uma vez que se liga fortemente com
receptores de Fc em basófilos e mastócitos mesmo antes da interação
com o antígeno.

» Envolvida em reações alérgicas – como consequência da sua ligação


a basófilos e mastócitos, IgE é envolvida em reações alérgicas.
Ligação do alérgeno à IgE nas células resulta na liberação de vários
mediadores farmacológicos que resulta em sintomas alérgicos.

47
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I

» IgE também participa em doenças parasitárias por helmintos. Uma vez


que os níveis sorológicos de IgE aumentam em doenças parasitárias,
a quantificação dos níveis de IgE auxilia no diagnóstico de infecções
parasitárias. Eosinófilos têm receptores de Fc para IgE e a ligação de
eosinófilos a helmintos cobertos por IgE resulta na morte do parasita.

» IgE não fixa complemento.

Figura 8. Classes de imunoglobulinas.

IgG IgE IgD

IgM IgA

Fonte: adaptado de https://www.todamateria.com.br/anticorpos/.

Funções das imunoglobulinas

Neutralização de toxinas

O reconhecimento do antígeno é realizado pela interação do determinante


antigênico com o sítio do anticorpo específico. Em geral, os sítios combinatórios
dos anticorpos são direcionados contra bactérias, fungos, vírus e seus produtos.
Reconhecem também epítopos presentes em parasitas protozoários e metazoários.
A interação entre um antígeno (por exemplo: presente na superfície de uma
bactéria) com o anticorpo por si só não leva necessariamente a sua destruição.
Como exceção, temos a interação entre certas toxinas bacterianas (como a diftérica
ou tetânica) e anticorpo, em que ocorre completa neutralização do produto
microbiano. A neutralização da toxina, nesses casos, é suficiente para impedir os
sintomas das doenças que são mediados pela toxina. A ligação antígeno-anticorpo,
em geral, prepara para a etapa efetora que é mediada por outros agentes.

Aglutinação

Os produtos do sistema complemento também alteram a superfície dos organismos


invasores, induzindo-os a aderir uns aos outros, promovendo assim a aglutinação
(prendem vários antígenos ao mesmo tempo).

48
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I │ UNIDADE II

Citotoxicidade celular dependente de anticorpo

Anticorpos específicos ao interagirem com epítopos de membrana de uma


célula-alvo podem dar origem a um fenômeno denominado ADCC (do inglês
antibody dependent cell mediated cytotoxicity), que pode ser mediado por
granulócitos. Há experimentos in vitro que descrevem a morte de esquistossomos
após opsonização por anticorpo IgE e atividade ADCC mediada por eosinófilos.

Opsonização por IgG

Na fagocitose é necessário o envolvimento entre componentes da partícula a ser


interiorizada e receptores de membrana da célula fagocitária.

Assim, um microrganismo pode ser reconhecido por células


fagocitárias através de receptor para manose, que reconhece resíduos
deste açúcar na superfície da partícula a ser ingerida, quando a
partícula estranha estiver opsonizada por anticorpos específicos do
isotipo IgG (ARAUJO; DAMALIO, 2013, p. 33).

O processo se torna muito mais eficiente em virtude da existência de receptores


de membrana dos fagócitos que reconhecem a região Fc da IgG. A opsonização
por anticorpos IgG não somente aumenta expressivamente a taxa de fagocitose
(número de partículas ingeridas por fagócito) como também pode levar a um
aumento da digestão da partícula ingerida (no fagossomo) por ativação do
metabolismo da célula fagocitária.

Lise

Um dos mais importantes produtos da cascata do complemento é o complexo


lítico, que por definição é a combinação de múltiplos fatores do complemento
sendo designado C5b6789. Seu efeito é direto na ruptura das membranas
celulares de bactérias e outros organismos invasores. Enzimas e outros produtos
do complemento atacam as estruturas de alguns vírus tornando-os não virulentos.

Quimiotaxia

O fragmento C5a induz a quimiotaxia pelos neutrófilos e macrófagos, promovendo a


migração de grandes quantidades desses fagócitos para o local do agente antigênico.

49
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I

Ativação de mastócitos e basófilos e eosinófilos

Os fragmentos C3a, C4a e C5a têm uma função efetora de ativar os mastócitos e
basófilos, induzindo-os a liberar histamina, heparina e várias outras substâncias
para os fluidos locais. Como consequência, há um aumento no fluxo sanguíneo
local, extravasamento de líquido e proteína plasmática para os tecidos e, de
reações teciduais locais que ajudam a inativar e imobilizar o agente antigênico.
Os mesmos fatores desempenham papel importante na inflamação e na alergia.

Efeitos inflamatórios

Além dos efeitos inflamatórios causados pela inflamação dos mastócitos e basófilos,
a ação de vários outros produtos do complemento contribue para a inflamação local,
induzindo o aumento do fluxo sanguíneo que já estava aumentado, aumentando o
extravasamento de proteínas a partir dos capilares e a favorecendo a coagulação
de proteínas nos espaços teciduais, evitando assim a movimentação do organismo
invasor por meio dos tecidos.

Anticorpos monoclonais
Por definição anticorpos monoclonais (mAbs, na sigla em inglês) são anticorpos
produzidos por um único clone de um linfócito B parental, sendo idênticos em
relação às propriedades físicas, químicas e biológicas. Foi descrito, pela primeira
vez, em 1975, em artigo na revista Nature por César Milstein e Georges Köhler,
que dividiram o Prêmio Nobel de medicina no ano de 1984 com o dinamarquês
Niels Kaj Jerne.

Os mAbs são produzidos em ambiente controlado laboratorial com linfócitos


B gerados por camundongos com sistemas imunológicos estimulados pelos
antígenos de interesse. São chamados de anticorpos murinos que usados de forma
continuada durante uma terapia, estimulam uma reação imune ao anticorpo
próprio. Dessa forma, o uso dos mAbs ficou limitado durante duas décadas à
produção de kits para diagnósticos ou à pesquisa científica (Figura 9).

Esse problema foi resolvido com a humanização dos anticorpos murinos por
modernas técnicas de engenharia genética. Na técnica, os genes responsáveis
pela produção dessas proteínas são modificados de forma a eliminar essa reação
imunológica do organismo humano. O processo de humanização não deve alterar
a afinidade do anticorpo com o respectivo antígeno e possibilita assim a sua
aplicação continuada em procedimentos terapêuticos.

50
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I │ UNIDADE II

Os mais significativos avanços no uso de mAbs se encontram na área de oncologia,


uma vez que uma nova geração de medicamentos em desenvolvimento está baseada
na capacidade dos mAbs em reconhecer antígenos específicos de tumores e induzir
uma resposta imune contra as células cancerosas. Mais ainda, os mAbs podem ser
modificados e atuarem como portadores de radioisótopos ou toxinas às células
tumorais ampliando, assim, seu espectro de aplicação terapêutica.

Figura 9. Técnica para produção de anticorpos monoclonais a partir de hibridomas.

Antígeno

Cultura de células
de mieloma

Células de mieloma

Células do baço

Seleção e crescimento Seleção de células que


de células híbridas produzem o anticorpo correto

Propagação de
clones Congelar

Crescimento em cultura Descongelar

Indução de tumores

Anticorpo

Fonte: adaptado de https://wikiciencias.casadasciencias.org/wiki/index.php/Anticorpo_Monoclonal.

51
CAPÍTULO 2
Reação de precipitação e aglutinação

Título do anticorpo
A produção de anticorpos contra um determinado antígeno pode ser correlacionada
às diluições dos soros utilizadas para a realização do teste, já que os ensaios não
são quantitativos. Nesses ensaios, as partículas antigênicas são misturadas com
seriadas diluições do soro do paciente e, como resultado de produção de anticorpos,
considera-se a maior diluição em que ocorre a visualização (precipitação ou
aglutinação) da reação antígeno-anticorpo. Essa diluição é chamada de título do
anticorpo.

De acordo com Araujo e Damalio (2013, p. 35),

Por exemplo, se estudarmos a produção de anticorpos contra


espécies de Leishmania, que causam calazar, em uma população
de área endêmica do Brasil é comum ser observada aglutinação de
formas promastigotas de Leishmania até a diluição de 1:600 (título)
na maioria das pessoas. Este resultado é justificado pela infecção
com diversos parasitas (Trypanosoma, Schistosoma, Plasmodium,
Leishmania que causa a forma mucocutânea) induz a produção
de anticorpos que apresentam reação cruzada com Leishmania
donovani. De forma contrastante, o soro de pacientes infectados,
que apresentam calazar, aglutina as formas promastigotas até a
diluição de 1:6400 (título). Como pode ser observado, o título de
anticorpos contra Leishmania nas pessoas da região endêmica é de
1:600 enquanto nas pessoas infectadas este aumenta mais de dez
vezes.

Imunoprecipitação

As técnicas de imunoprecipitação permitem identificar e, até mesmo, quantificar


precipitações resultantes da interação antígeno-anticorpo, ambos inicialmente
solúveis. Nessa técnica, é necessário que a molécula antigênica seja multivalente
52
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I │ UNIDADE II

quanto ao número de epítopos e, preferencialmente, os anticorpos sejam policlonais.


Para anticorpos monoclonais, a especificidade única exige que o epítopo esteja
acessível e presente em grande quantidade na molécula.

Os anticorpos policlonais derivam de diferentes linhagens de linfócitos


B, isto é, são imunoglobulinas com estruturas diferentes, produzidas em
resposta a um antígeno específico, cada uma com especificidade para um
epítopo diferente desse antígeno. Dado que a maioria dos antígenos é
muito complexa e possui numerosos epítopos que são reconhecidos por
diferentes linfócitos, cada linfócito é ativado para proliferar e se diferenciar
em plasmócitos resultando em anticorpos com resposta policlonal.

Ainda segundo Araujo e Damalio (2013, p. 35),

Entre os vários fatores físico-químicos e imunológicos que


interferem na quantidade de precipitado formado, os principais
são as concentrações de relativas de antígeno e de anticorpo. O
máximo de precipitação é observado quando as quantidades de
antígeno e de anticorpo são equivalentes, diminuindo na presença
de excesso de um ou outro componente.

A curva de precipitação clássica pode ser obtida quando ao anticorpo e


concentração constante adicionamos o antígeno em diferentes concentrações
apresentando aspecto parabólico (Figura 10). A precipitação assim será máxima
na zona de equivalência ou de proporções ideais de antígeno e anticorpo, e, à
medida que se adiciona mais antígeno, o imunocomplexo se dissolve. A zona de
excesso de anticorpo (ou falta de antígeno) é chamada de pró-zona e proporciona
resultado falso-negativo para a pesquisa de anticorpo. Esse tipo de resultado se
torna inaceitável, porque justamente quando há mais anticorpos o resultado se
apresenta como negativo. Para solucionar esse grave problema, devem ser utilizadas
diferentes diluições do anticorpo diante da concentração fixa do antígeno.

53
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I

Figura 10. Curva de precipitação: quantidade de precipitação formada na interação antígeno-anticorpo com
concentração fixa de anticorpo (azul) e quantidade crescente de antígeno (vermelho). Na zona de equivalência
se observa o imunocomplexo na sua máxima estrutura de malha, permitindo que o imunoprecipitado seja visível,
especialmente em meio gelidificado. Nas zonas de excesso de anticorpo (pró-zona) ou de excesso de antígeno
(pós-zona), o tamanho molecular dos imunocomplexo não permite visualização, gerando resultados falso-
negativos.

Excesso de Excesso de
anticorpo Equivalência antígeno
Quantidade de anticorpo precipitado adicionado

Quantidade de antígeno adicionado

Fonte: adaptado de https://bioquimicaimunologica.blogspot.com/2014/10/tecnicas-de-imunoprecipitacao.html.

A visualização de precipitados em meio líquido é difícil, pois tanto as amostras de


soros com anticorpos quanto às soluções antigênicas apresentam turvação e coloração
próprias e variáveis.

As técnicas manuais de precipitação atualmente e uso são realizadas em meio


gelidificado, o que facilita a leitura e reduz os volumes necessários para a interação.
No entanto requerem períodos de horas a dias para a migração molecular e a
formação do imunocomplexo.

Imunoaglutinação

Fundamento básico das técnicas de aglutinação é similar ao princípio das técnicas de


precipitação, diferindo na adsorção do antígeno ou do anticorpo a micropartículas
insolúveis ou células e permitindo leitura visual e rápida. A técnica não permite

54
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I │ UNIDADE II

discriminar frações dos componentes antigênicos como a imunoprecipitação, mas


permite a utilização de antígenos purificados e complexos fixados a micropartículas
ou células. Além disso, pode ser mais sensível que a imunoprecipitação e permite a
detecção de pequenas quantidades de anticorpos, especialmente nas técnicas de
microaglutinação.

A característica mais marcante da imunoaglutinação é a apresentação, seja o


anticorpo ou antígeno, na forma insolúvel em suspensão, de forma natural em
células, ou adsorvido artificialmente a micropartículas ou células. Pode ser direta
ou indireta (Figuras 11 e 12).

O teste de aglutinação ocorre quando há a formação de agregados suficientemente


grandes de micropartículas ou células com múltiplos determinantes antigênicos
(ou anticorpos), interligados por pontes moleculares de anticorpos (ou antígenos).
Ocorrem várias interações entre os sítios combinatórios idênticos (dos anticorpos)
simultaneamente com determinantes antigênicos iguais. Esses agregados facilitam
a visualização do imunocomplexo, que pode acontecer em minutos ou levar algumas
horas, e a leitura pode ser a olho nu ou com lupa.

A execução da técnica pode ser determinada em tubo, lâmina ou placa de


microcavidades, sempre com o envolvimento de diferentes fatores na formação
dos agregados, tais como:

» Classe do anticorpo envolvido.

» Concentração iônica e pH do meio.

» Presença de macromoléculas, íons, enzimas e conservantes.

» Tempo e temperatura.

» Padronização adequada da suspensão de micropartículas ou células.

» Concentração ótima do antígeno ou anticorpo a ser fixado nas


micropartículas ou células.

» Estabilidade da ligação do antígeno/anticorpo e acessibilidade dessa


molécula nas micropartículas ou células.

Como vantagens da reação de imunoaglutinação temos:

» elevada sensibilidade;

» baixo custo;

55
UNIDADE II │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE I

» leitura visual;

» facilidade de execução;

Podemos ainda listar algumas desvantagens:

» reprodutibilidade dos lotes de reagentes;

» acessibilidade molecular para interação antígeno-anticorpo;

» estabilidade da ligação do antígeno-anticorpo no suporte.

Figura 11. Imunoaglutinação direta.

Anticorpo Antígeno Complexo precipitado


Fonte: adaptado de https://image.slidesharecdn.com/aglutinacao-100324121138-phpapp02/95/aglutinacao-7-728.
jpg?cb=1269433092.

Figura 12. Imunoaglutinação indireta (passiva).

Aglutinação
Indireta
Látex

Antígeno

Anticorpo
Soro/
Plasma

Fonte: adaptado de https://www.biomedicinapadrao.com.br/2012/10/aglutinacao-indireta.html.

56
IMUNOLOGIA UNIDADE III
CLÍNICA – PARTE II

CAPÍTULO 1
Quantificação da concentração
antigênica ou de anticorpos

Historicamente, os ensaios imunológicos foram – e têm sido – os principais


responsáveis pelo conhecimento que se tem do sistema imune. Além desse aspecto
relacionado ao conhecimento científico básico, esses ensaios são importantes
na clínica para a detecção de infecções, de doenças autoimunes e de estados de
imunodeficiência. Podem ainda ser utilizados para detectar a presença de antígenos
(além de anticorpos), na diferenciação do estágio de uma doença de acordo com
a classe de Ig produzida, na seleção de doadores e receptores de órgãos para
transplantes, na avaliação do prognóstico da doença, no sucesso de um tipo de
terapia etc.

A amplitude da realização de ensaios imunológicos permite a utilização de técnicas


não quantitativas que são visualizadas por meio de reações de precipitação e
aglutinação. Podem, ainda, utilizar técnicas quantitativas, com o uso de marcadores
enzimáticos (ELISA, imunoperoxidase, citometria de fluxo) ou radioisótopos
(radioimunoensaio).

Os testes de precipitação e aglutinação são menos sensíveis que os ensaios


imunoenzimáticos, porque os complexos antígeno-anticorpo para serem
visualizados precisam apresentar tamanho adequado. Na prática, os testes de
precipitação são utilizados para a detecção de antígenos solúveis (proteínas,
glicoproteínas) enquanto os de aglutinação para a detecção de antígenos
particulados (hemácias, bactérias, células diversas).

57
UNIDADE III │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II

Radioimunoensaio (RIA)
O radioimunoensaio é considerado um método de alta sensibilidade na análise
quantitativa das reações antígeno-anticorpo. Ele permite medidas rápidas e precisas
mesmo em preparações não purificadas. Também apresenta limiar de detecção na
ordem de nanogramas ou picogramas. Dentre as limitações do ensaio, destacam-se o
custo do teste, a vida média dos reagentes e o risco operacional.

Na rotina, pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores


tumorais, alérgenos e anticorpos e antígenos em doenças parasitárias. Encontramos
inúmeras variações desse ensaio, contudo o princípio utilizado é o mesmo, ou seja,
a quantidade de reagente marcado (antígeno ou anticorpo) quantifica o antígeno ou
anticorpo não marcado na amostra (Figura 13).

Radioimunoensaio direto
No radioimunoensaio direto, coloca-se quantidade fixa e limitada de anticorpo
que é ligada a um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena
de antígeno marcado, misturada com uma amostra em teste ou com as soluções
padrão que contêm concentrações conhecidas do antígeno não marcado. O
antígeno não ligado é removido após um período de incubação e faz-se a medida
da radioatividade da fase sólida. A partir da resposta obtida, a concentração do
antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.

Radioimunoensaio de competição
No radioimunoensaio de competição, coloca-se quantidade fixa do antígeno
em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado
específico, misturada com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão
com concentrações variadas do antígeno solúvel. O anticorpo marcado que não
se ligou à fase sólida e o antígeno solúvel é removido por lavagem, após período
de incubação, e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida. De acordo com a
resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação
na curva.

Radioimunoensaio de captura
No radioimunoensaio de captura, coloca-se uma quantidade fixa de anticorpo
imobilizada em um suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de
antígeno, ou as soluções padrão, com concentrações conhecidas do antígeno,
58
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II │ UNIDADE III

são adicionadas. Após período de incubação, remove-se o antígeno não ligado


e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o antígeno, com sítio de
ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado
não ligado é removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase
sólida. De acordo com a resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é
estimada por interpolação na curva.

No radioimunoensaio clássico os reagentes são:

» o anticorpo;

» o antígeno marcado;

» o antígeno frio contido nas amostras e padrões.

Figura 13. Radioimunoensaio.

Método de competição com


antígeno marcado

Anticorpo Antígeno marcado + Medir


não marcado (amostra) radioatividade

Fonte: adaptado de https://image.slidesharecdn.com/imunodiagnsticodedoenasinfecciosas-160507022432/95/


imunodiagnstico-de-doenas-infecciosas-33-638.jpg?cb=1462587998.

Aplicações:

» Testes que necessitem de alta sensibilidade.

» Triagem do vírus da hepatite B em doadores de sangue.

» Pesquisa.

» Pesquisa de drogas na urina ou soro de atletas.

59
UNIDADE III │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II

ELISA (Enzyme-Linked Immunoassay)


De acordo com Araujo e Damalio (2013, p. 41),

O ensaio de ELISA é um dos tipos de testes mais empregados


nos laboratórios hoje em dia, visto que oferece simplicidade,
sensibilidade e dependendo do kit a especificidade superior
a de vários testes. A metodologia deste ensaio se mostrou tão
eficaz, a ponto de substituir os testes de Radioimunoensaio
(RIA), justamente por ser um teste mais estável e permitir o
armazenamento do kit por um período bem maior sem que seus
reagentes sofram degradação.

Os testes de ELISA podem ser classificados em testes Homogêneos


e Heterogêneos. Nos testes homogêneos, a atividade enzimática
é alterada como parte de uma reação imunológica. Neste tipo de
ensaio não há necessidade de separar o imunocomplexo formado dos
imunorreagentes livres. As técnicas homogêneas são especialmente
elaboradas para a dosagem de drogas e haptenos, mas não tiveram
seu uso difundido nos laboratórios de análises clínicas, já que este
apresenta problemas na dosagem de proteínas. Por outro lado, os
ensaios heterogêneos são amplamente empregados na imunologia.
Neste tipo de ensaio, a atividade enzimática do imunorreagente
marcado não está diretamente envolvida na reação propriamente
dita; no entanto, os reagentes ligados e os reagentes livres devem
ser separados uns dos outros.

Ensaios de ELISA heterogêneos


O princípio básico do ELISA heterogêneo se baseia no uso de um antígeno ou
anticorpo conjugado com uma enzima que, ao reagir com seu substrato, dá
origem a um produto colorido, quimioluminescente ou fluorescente. Se for usado
o método colorimétrico, a mudança de cor é monitorada a olho nu ou com o uso
de um espectrofotômetro para determinar a proporção entre a quantidade de
cor produzida e a quantidade de analito presente. Existe quantidade enorme de
materiais que podem ser usados como suporte para a colocação do antígeno ou
do anticorpo. O mais comum é se fazer uso de microplacas de poliestireno, pois
estas, além de serem pequenas, evitando desperdício de material, permitem que
se faça a análise de grande quantidade de amostras (Figura 14).

60
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II │ UNIDADE III

A técnica de ELISA heterogênea é feita com algumas etapas de lavagem, como


forma de separar os imunorreagentes ligados dos que não estão ligados.

Essa técnica permite ainda se fazer uso de ensaios competitivos e não competitivos,
podendo ainda dosar antígenos ou anticorpos, nesse último caso, todos os isotipos
de anticorpos podem ser dosados, tudo depende da especificidade do anticorpo
usado.

Figura 14. Ensaio de ELISA heterogêneo.

antígeno
anticorpo

ETAPA 1
Fase sólida ETAPA 2
cor
Substrato
Cromoógeno
Conjugado

ETAPA 3 ETAPA 4 ETAPA 5

Fonte: adaptado de http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/cd08_08.pdf.

Ensaios competitivos
Esse tipo de ensaio é usado para se dosar antígenos. Nesse caso, eles são fixados
ao suporte sólido de anticorpos ou antígenos específicos. Tais procedimentos
também são chamados de métodos de reagentes limitados, pois o antígeno e o
anticorpo são usados em quantidades limitadas (ARAUJO; DAMALIO, 2013,
p. 42).

Quando o ensaio usa um anticorpo específico fixado na fase sólida, adiciona-se


a amostra do paciente contendo o antígeno + o antígeno marcado, fazendo com
que concorram pelo anticorpo fixado na fase sólida. Com a dosagem da amostra
do paciente, procede-se ao controle do reagente, em que se adiciona apenas o
antígeno marcado com um tampão na fase sólida; com isso, tem-se o parâmetro
negativo, podendo compará-lo com o resultado obtido da amostra do paciente.
Isso é necessário, pois o sinal detectado na amostra do paciente é inversamente
proporcional à quantidade de analito presente na amostra, ou seja, quanto mais

61
UNIDADE III │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II

analito na amostra, menor o sinal. Existem variações do ensaio competitivo em que


o antígeno é fixado na fase sólida e o ensaio pode ser realizado em duas etapas.
Nesse caso, numa primeira fase, adiciona-se o soro do paciente no suporte,
incuba-se; posteriormente procede-se à lavagem para a remoção de tudo que não
ficou ligado ao suporte sólido e, então, adiciona-se o conjugado e procede-se à nova
incubação. Nessa etapa, o conjugado irá se ligar ao antígeno livre do suporte sólido.
Posteriormente, procede-se a uma nova lavagem e executa-se a fase de revelação e
leitura (Figura 15).

Os ensaios competitivos são ideais para dosagem de moléculas relativamente


pequenas que podem ser obtidas com relativa pureza em grandes quantidades, a
fim de serem marcadas com uma enzima. Como os ensaios competitivos requerem
pequenas quantidades de anticorpo, eles são ideais para o uso em sistemas nos
quais há pequenas quantidades de anticorpo.

Figura 15. ELISA competitivo.

Amostra

Conjugado enzima-
derivado da
substância

Substrato Amostra
cromogênico

Fonte: adaptado de https://www.researchgate.net/profile/Raquel_De_Boni/publication/334000853/figure/fig2/AS:773729550356


480@1561482908366/Figura-1-Principio-do-metodo-de-ELISA-competitivo-Creditos-da-Figura-Eloisa-Comiran.png.

Ensaios não competitivos indiretos


É um dos tipos de ensaio mais empregados nas rotinas laboratoriais de análises
clínicas. Assim como os ensaios competitivos, eles podem usar antígenos ou
anticorpos fixados a fase sólida. Quando se faz uso de um antígeno fixado a fase
sólida, o anticorpo específico presente na amostra se ligará a este. Posteriormente
o anticorpo será detectado com a adição de uma imunoglobulina marcada
específica para o anticorpo em questão. Se compararmos os testes competitivos
com os não competitivos, veremos que estes oferecem maior especificidade e

62
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II │ UNIDADE III

menor sensibilidade; no entanto, isto é, dependente da afinidade e pureza dos


reagentes imunológicos. Para detectar diferentes isotipos de imunoglobulina,
são utilizadas imunoglobulinas marcadas específicas para determinado isotipo.
Esse tipo de ensaio é muito empregado quando se deseja detectar anticorpos
para determinado agente infeccioso ou autoanticorpos (Figura 16).

Para esse tipo de teste, pode-se usar suporte de microplacas de poliestireno,


nitrocelulose, esferas e microesferas.

Quando um anticorpo é ligado à fase sólida, esses ensaios são classificados


como ensaios de captura ou sanduíche, pois o antígeno presente na amostra,
que pode ser um anticorpo também, será capturado pelo anticorpo fixado ao
suporte sólido. Posteriormente adiciona-se um anticorpo marcado para um
epítopo diferente do antígeno em questão, que completará o sanduíche. Existem
inúmeras variações desse tipo de ensaio. O antígeno capturado pode ser uma
imunoglobulina qualquer, uma proteína viral ou um antígeno qualquer que
tenha, no mínimo, dois epítopos diferentes. Esse tipo de ensaio requer que uma
grande quantidade de anticorpo esteja fixada na fase sólida, no entanto oferece
grande sensibilidade.

Os ensaios de ELISA não competitivos podem ser modificados para incorporar


camadas adicionais de reagentes imunes, com isso se obtém o aumento na
sensibilidade do ensaio. No entanto isso acaba influenciando no custo e no tempo
de execução do teste. A aplicação mais comum é o complexo avidina-biotina, que
proporciona um aumento significativo na sensibilidade do teste. O anticorpo
biotinilado é normalmente usado como o segundo anticorpo do sanduíche. Ele
então é posto para reagir com uma mistura previamente preparada de avidina
e peroxidase biotinilada. Essa peroxidase pode ser desenvolvida com agentes
quimioluminescentes como forma de aumentar a sensibilidade.

Figura 16. ELISA não competitivo.

+ substrato

Fonte: adaptado de https://www.researchgate.net/profile/Thiago_Motta3/publication/305775152/figure/fig3/AS:3907167957032


98@1470165551798/Figura-03-ELISA-nao-competitivo-indireto.png.

63
UNIDADE III │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II

Outras variações do ELISA


Uma das variantes do ELISA é a que usa a membrana de nitrocelulose como
suporte sólido, chamada de ensaio Dot Blot. Nesse tipo de ensaio, o antígeno
ou anticorpo é fixado à membrana. Normalmente, essa reação é observada
pela produção de um produto colorido na membrana, esse é apenas um ensaio
qualitativo. Os ensaios de Dot Blot podem ser modificados de forma a apresentar
maior sensibilidade e podem se tornar semiquantitativos desde que se use um
densitômetro para ler a cor da reação.

Western Blot
Atualmente, a técnica de Western Blot (WB) tem sido utilizada para estudos
detalhados de uma série de microrganismos incluindo bactérias, vírus e
protozoários.

Para cada microrganismo há pequenas variações no tocante ao preparo dos


reagentes, mas o fundamento da reação é o mesmo. Encontramos muita semelhança
com o ELISA, mudando apenas o suporte antigênico que é feito em papel de
nitrocelulose.

Como padrão, daremos o exemplo da obtenção dos reagentes, montagem e utilização


do teste para Vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV). Com esse exemplo, a
compreensão do teste ficará bem clara.

A técnica de Western Blot teve sua origem na metodologia desenvolvida em 1975


por E.M. Southern, que, ao utilizar eletroforese em gel de poliacrilamida, realizou
a separação de proteínas por peso molecular em um estudo de hibridização
DNA-RNA. Esse trabalho foi acompanhado, em 1977, pela demonstração, por Van
Raamsdork, de uma técnica para a detecção de determinantes antigênicos, em
moléculas separadas por peso molecular, em gel de poliacrilamida, por meio de
um teste imunoenzimático utilizando a enzima peroxidase. Finalmente, Harry
Towbin, em 1979, demonstrou a possibilidade de se transferir as moléculas
separadas em gel de poliacrilamida para folhas de nitrocelulose, facilitando a
manipulação das proteínas em uma matriz mais resistente. A união dessas três
metodologias formam a técnica de Enzyme-Linked Immunoelectrotransfer Blot
Assay ou técnica de Western Blot.

A técnica de Western Blot é composta de quatro estágios (HIV-1) (Figura 17):

» Primeiro estágio – Eletroforese em gel de poliacrilamida.


64
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II │ UNIDADE III

A preparação purificada de HIV-1 é submetida à eletroforese em gel de


poliacrilamida, havendo a separação por peso molecular dos componentes
antigênicos virais que formam bandas de proteínas na matriz do gel.

» Segundo estágio – Transferência das bandas.

O material antigênico viral separado é transferido do gel de poliacrilamida para


folha de nitrocelulose que é, então, cortada em tiras, contendo os componentes
do vírus separados em bandas.

» Terceiro estágio – Reação antígeno-anticorpo.

As tiras de nitrocelulose, contendo os antígenos virais, são colocadas em contato


com os soros dos pacientes e soros controles. Os anticorpos séricos específicos
para os componentes virais irão reagir com as respectivas bandas, formando
complexos antígeno-anticorpo macromoleculares, que ficam retidos nas tiras de
nitrocelulose.

» Quarto estágio – Revelação dos complexos antígeno-anticorpo.

A revelação dos complexos antígeno-anticorpo é realizada por meio da utilização


de um conjugado constituído de anti-imunoglobulina humana marcada com uma
enzima e o substrato enzimático.

Figura 17. Western Blot HIV.


Amostra de
Transferência para
antígenos
membrana de
nitrocelulose

Proteínas
separadas

Gel de separação
Anticorpo
marcado

Imunocoloração
do blot
Desenvolvimento e
fixação da
autorradiografia

Autorradiografia

Fonte: adaptado de http://bioquimicaimunologica.blogspot.com/2014/11/exames-de-diagnostico-de-hiv.html.

65
UNIDADE III │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II

Imunoeletroforese
Esse ensaio é a combinação da eletroforese de dupla difusão em gel de ágar, que
se realiza em duas etapas. Nesse particular, aplica-se corrente elétrica no sistema
(Figura 18).

Na primeira etapa, separam-se os componentes de determinado antígeno,


graças às diferenças de suas cargas elétricas. Numa segunda etapa, faz-se reagir
essas frações já separadas com um antissoro específico. Esse método permite
caracterização de uma substância, simultaneamente, para três parâmetros:

» conhecimento sobre características eletroforéticas;

» difusibilidade;

» especificidade imunoquímica.

Esse é um método que foi utilizado em larga escala em todos os ramos da Biologia,
por seu alto poder de resolução, bastando mencionar que a eletroforese do soro
do indivíduo nos permite evidenciar 30 componentes. Há uma combinação de
sensibilidade e de poder de identificação dos diferentes componentes.

Por outro lado, a quantidade de soro é mínima, com apenas 5μl, pode-se fazer
uma análise ampla do material a ser identificado. No soro humano, encontramos,
pela eletroforese, cinco componentes: albumina, alfa um, alfa dois, beta e
gamaglobulina. Essas frações se separam de acordo com as cargas elétricas.

Em uma segunda fase, aplicando soro imune específico paralelo a cada uma das
frações e fazendo atuar a corrente elétrica, teremos combinação de cada fração
antigênica com o soro. Ocorre uma combinação de cada fração antigênica com o
anticorpo correspondente e, por sua vez, dá-se a separação de outros componentes
antigênicos e sua a respectiva combinação com os anticorpos específicos de cada
subfração.

Nessa nova fase, podemos proceder à análise de grande quantidade de subfrações


combinadas com anticorpos específicos.

Em Análises Clínicas, a imunoeletroforese foi substituída por uma série de testes


modernos, mais eficientes e de fácil realização, como os testes de imunoenzimático,
fluorimétricos e outros que permitem separação dos componentes como a
cromatografia em gel de acrilamida.

66
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II │ UNIDADE III

Figura 18. Imunoeletroforese.

+ Ag
- Ag

Anticorpo

Ag

Anticorpo

Fonte: adaptado de https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/aula-pratica-6--


imunoeletroforese.pdf.

Imunodifusão
A metodologia de imunodifusão é realizada em meio semissólido, geralmente o
ágar ou agarose, permitindo difusão mais homogênea que em meio líquido, mas
com o inconveniente de demorar entre 18 e 24 horas para que seja observada
a precipitação. A difusão dos imunoprecipitados no gel depende do tamanho
deles. Quando são grandes ficam maiores que o diâmetro dos poros, o que impede
a difusão. A imunodifusão pode ser simples ou dupla. É simples quando ou o
antígeno ou o anticorpo é fixado a um suporte e o outro componente se difunde
no meio, até ocorrer precipitação; é dupla quando os dois componentes migram
um em direção ao outro.

A imunodifusão dupla é realizada numa lâmina de microscópio revestida de


ágar, contendo orifícios onde são colocadas concentrações de Ag e Ac. Quando
o antígeno e os anticorpos específicos encontram-se, em concentrações
correspondentes à zona de equivalência, são formados complexos precipitantes
(Figura 19).

Figura 19. Imunodifusão dupla.


Anticorpo Antígeno

Matrix do Ágar Precipitado


Fonte: adaptado de http://www.profbio.com.br/aulas/ac3_11.pdf.

67
UNIDADE III │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II

Imunodifusão radial simples


O ensaio de imunodifusão radial simples, introduzido por Mancini, em 1965,
além de ser uma técnica de fácil realização e de baixo custo, é quantitativa
(Figura 20). É realizada em placas ou lâminas revestidas de ágar, no qual é
incorporado um antissoro específico para a molécula a ser quantificada. No gel
de ágar são feitos orifícios onde são depositadas pelo menos três concentrações
conhecidas da molécula estudada (solução padrão) e as amostras de concentração
desconhecida. Essas moléculas se difundem no ágar e, quando reagem com o
anticorpo, na concentração correspondente à zona de equivalência, forma-se a
linha de precipitação, o que ocorre entre 48 e72 horas. O diâmetro do halo que
se forma ao redor do orifício onde foram depositadas as amostras corresponde à
concentração da molécula, de acordo com a curva padrão obtida. Para a obtenção
da curva-padrão, são utilizadas concentrações conhecidas da solução padrão e,
após reação com os anticorpos presentes no ágar, os halos são medidos.

Por exemplo, ao dosar as concentrações de IgM do soro de pacientes para a


obtenção da curva padrão deve-se ter uma solução contendo IgM purificada de
concentração conhecida.

Essa técnica é utilizada para quantificar as imunoglobulinas IgG, IgM e IgA e


moléculas do sistema complemento.

Figura 20. Imunodifusão radial simples.

Imunodifusão radial simples


Gel contendo Ac
Anel de precipitação

Ag Ag
Ag colocado no orifício

Teste
Concentrações conhecidas

Gráfico padrão
2
Diâmetro
do anel

0 10 25 50 100
Concentração do antígeno

Fonte: adaptado de https://image.slidesharecdn.com/ap6-reao-de-precipitao-1221052772556104-8/95/ap6-reao-de-


precipitao-9-728.jpg?cb=1221027633.

68
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II │ UNIDADE III

Reação de microaglutinação passiva –


reação de VDRL (Venereal Diseases Research
Laboratory)
A reação de microaglutinação passiva é rotineiramente utilizada para o diagnóstico
sorológico da sífilis, por meio de técnica de microaglutinação passiva feita em
placa escavada (Figura 21).

Pacientes com sífilis desenvolvem resposta de anticorpos contra hapteno ubiquitário


existente nos tecidos dos mamíferos. Trata-se de um fosfolipídio, que pode ser
extraído em alto grau de pureza do coração de bovino e é denominado cardiolipina.

Anticorpos para antígenos cardiolipínicos são conhecidos como anticorpos de


Wasserman ou reagínicos.

Infecções pelo Treponema pallidum (sífilis) levam à liberação nos fluídos orgânicos
de cardiolipina, a qual faz parte normalmente da membrana mitocondrial, e
à produção de anticorpos. Cardiolipina sozinha, entretanto, somente se liga
a anticorpos, mas não estimula a produção, isto é, atua como um hapteno. Para
tornar-se imunogênica, a cardiolipina deve se ligar a uma proteína carreadora.

A cardiolipina, somada a doses adequadas de colesterol e de lecitina, constitui


excelente antígeno para a detecção da reagina sifilítica, seja em testes de
aglutinação passiva, nos quais o hapteno é adsorvido a superfície de cristais de
colesterol (reação de floculação de Kline, VDRL etc.), seja em testes de fixação do
complemento (reação de Wasserman).

Figura 21. Reação de microaglutinação passiva – reação de VDRL.

Reativo VDRL Não reativo VDRL

Fonte: adaptado de https://unifenasresumida.blogspot.com/2012/08/pl1-patologia-puberdade.html.

69
CAPÍTULO 2
Identificação de antígenos em células
e antígenos

Imunofluorescência
Antes de falar sobre a técnica em si, é importante relembrar o conceito de
anticorpos e como podemos utilizar essa ferramenta para diagnóstico. Assim,
um anticorpo é um complexo proteico produzido pelas células B que inicia
resposta imune contra um antígeno alvo. A organização básica de um anticorpo
inclui dois domínios funcionais que, juntos, se assemelham à letra Y. O domínio
Fab (fragmento com o local de ligação ao antígeno) forma os braços do Y e, no
final de cada braço, é uma região variável responsável pela ligação ao antígeno,
denominada local de ligação ao antígeno. O domínio Fc (fragmento que
cristaliza) compreende a cauda do Y, que células efetoras, proteínas imunes e
outros anticorpos reconhecem principalmente. Essa estrutura exclusiva permite
a detecção direta de antígenos na pele usando um único anticorpo marcado
com fluoróforo (fluorocromo) ou a detecção indireta por meio da ligação de um
anticorpo secundário marcado com fluoróforo gerado contra o domínio Fc de
um anticorpo primário não marcado. Como o domínio Fc é conservado dentro
de uma espécie, o anticorpo secundário marcado pode ser usado para detectar
qualquer anticorpo primário gerado a partir de uma única espécie. Esse sistema
é versátil e econômico, porque poucos anticorpos marcados são necessários
para detectar muitos possíveis anticorpos primários (ODELL; COOK, 2013).

A imunofluorescência é uma técnica poderosa que utiliza anticorpos marcados com


fluorescência para detectar antígenos alvo específicos. É amplamente utilizado em
pesquisas científicas e em laboratórios clínicos (ODELL; COOK, 2013). O ensaio de
imunofluorescência nos permite detectar e localizar antígenos em células e tecidos
utilizando anticorpos específicos, marcados com fluorocromos ou fluoróforos,
facilitando a localização dos antígenos por esses estarem visíveis ao microscópio de
fluorescência (Figuras 22 e 23).

Em suma, o método é baseado na capacidade de as moléculas de anticorpo


ligarem-se covalentemente a fluorocromos sem perder a reatividade específica
com o antígeno.

70
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II │ UNIDADE III

De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e localizar anticorpos em


fluidos biológicos usando seu antígeno correspondente.

A imunofluorescência é considerada:

» teste qualitativo/semi-quantitativo;

» método de alta sensibilidade e alta especificidade.

Fluorocromos ou fluoróforos

Fluorocromos ou fluoróforos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e


emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes. Em 1941, foi a primeira vez que
anticorpos foram conjugados com fluorocromos.

Fluorocromos mais utilizados

Isotionato de fluoresceína (FITC) e compostos da rodamina são os fluorocromos


mais usados para conjugação com anticorpos para torná-los fluorescentes sob
condições adequadas de iluminação.

Isotionato de fluoresceína (FITC): se excita com luz azul a 490nm e emite a


514nm. Seu rendimento quântico é de 0,5. Produz quenching.

Observação: quenching refere-se a qualquer processo que diminui a intensidade


de fluorescência de uma dada substância. Uma variedade de processos pode
resultar em extinção, tais como reações de estado animado, a transferência de
energia, formação de complexos e extinção de colisão.

Compostos da rodamina: rodamina é um nome genérico para uma família


de compostos orgânicos, corantes chamados fluoronas. Por exemplo, temos
a Rodamina 6G e Rodamina B. Elas são usadas como corantes e como corantes
que podem ser estimulados por laser como meio amplificador. São oferecidas
como corantes traçantes para determinação de vazão e direção de fluxos d’água.
Os corantes de rodamina fluorescem e sua medição é por meio de fluorímetros.
Como rotina, usamos em aplicações biotecnológicas tais como a microscopia de
fluorescência, citometria de fluxo e os testes do tipo ELISA.

71
UNIDADE III │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II

Figura 22. Ensaio de imunofluorescência.

Antígeno
Anticorpo primário
Anticorpo secundário
Fluoróforo
Direto Indireto
Fonte: adaptado de https://www.epigentek.com/catalog/images/newsdesk/IF-diagram.jpg.

Figura 23. Visualização de ensaio de imunofluorescência.

Fonte: adaptado de http://www.scielo.br/img/revistas/rbr/v44n3/07f01.jpg.

Microscópio de epifluorescência

A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência


ocorre por meio da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de
curto comprimento de onda (UV).

A epifluorescência é um conjunto de óptica para um microscópio fluorescente


no qual a objetiva é usada tanto para focalizar a luz ultravioleta sobre o
espécime, como para captar a luz fluorescente do espécime. Ela é mais eficiente
do que a fluorescência transmitida, em que uma lente ou um condensador
é empregado para focalizar a luz ultravioleta no espécime. A epifluorescência
também possibilita que a microscopia fluorescente seja combinada com outro
tipo no mesmo microscópio (Figura 24).

72
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II │ UNIDADE III

Figura 24. Epifluorescência.

Lente ocular

Filtro de barreira verde

Filtro de barreira azul

Espelho dicroico

Fonte de luz

Lente objetiva

Amostra (fluorescência verde, excitada com azul)

Fonte: adaptado de https://iie.fing.edu.uy/investigacion/grupos/gti/timag/trabajos/2007/proteus/imagenes/micepiesquema.jpg.

Imunofluorescência direta (IFD)

O IFD usa anticorpos marcados com fluorescência para se ligar diretamente ao


antígeno-alvo na pele. Nas doenças bolhosas autoimunes, o antígeno alvo é o
autoanticorpo ou complemento que causa a bolha. Depois que o tecido é recebido
no laboratório, ele é lavado, congelado rapidamente e cortado em seções de 5
a 6μm, que são colocadas em lâminas de vidro. As lâminas são incubadas com
os anticorpos marcados com fluorescência direcionados contra o antígeno-alvo.
Tipicamente, é utilizado um painel de anticorpos direcionados contra diferentes
isotipos de anticorpos (IgA, IgG, IgM), bem como o complemento. Uma gota de
cada anticorpo marcado com fluorescência é colocada em uma seção de tecido
separada, bem como controles positivos e negativos apropriados. A concentração
de trabalho de cada anticorpo é previamente titulada para obter a maior relação
sinal-fundo. As lâminas são incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente
em uma câmara escura e umidificada. O anticorpo é então drenado, as lâminas
são lavadas e as seções de tecido marcadas são montadas e visualizadas com
um microscópio de fluorescência. O diagnóstico é baseado no padrão de ligação
(por exemplo, intercelular, linear na junção dérmico-epidérmica), bem como no
isotipo (por exemplo, IgG, IgA) do anticorpo detectado (ODELL; COOK, 2013).

As técnicas de IFD também podem ser usadas para detectar alvos que não são
anticorpos na pele, como organismos infecciosos. Nesse caso, um anticorpo
primário marcado com fluoróforo direcionado contra o antígeno suspeito é usado

73
UNIDADE III │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II

para detectar a presença ou ausência do organismo. Essa técnica é rápida e bastante


específica, mas, devido ao número limitado de anticorpos que podem se ligar ao
alvo específico, pode ser menos sensível do que outras técnicas microbiológicas
(ODELL; COOK, 2013).

» O anticorpo específico marcado com Fluorocromo (conjugado) é


adicionado e se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo
estável.

» O anticorpo não ligado é removido por lavagens.

» O preparado é observado em microscópio de fluorescência.

Vantagens:

» Alta especificidade e sensibilidade.

» Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua


localização.

Desvantagens:

» Alto custo do microscópio de fluorescência.

» Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja


identificar ou localizar.

» Subjetividade da leitura.

Aplicações: detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes,


em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.

Imunofluorescência indireta (IFI)

A imunofluorescência indireta utiliza técnica de duas etapas (duas camadas),


em que um anticorpo primário não marcado se liga ao alvo, após o qual um
segundo anticorpo marcado com fluoróforo (direcionado contra a porção Fc do
anticorpo primário) é usado para detectar o primeiro anticorpo. Essa técnica é
mais complicada e demorada que a imunofluorescência direta (porque requer
um segundo período de incubação). No entanto é mais sensível porque mais de
um anticorpo secundário pode se ligar a cada anticorpo primário, o que amplifica

74
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II │ UNIDADE III

o sinal de fluorescência. Uma variação do teste de imunofluorescência indireta


é usada para detectar autoanticorpos circulantes em doenças imunobolhosas.
Nessa situação, o anticorpo primário é o autoanticorpo suspeito no soro do
paciente. O soro é incubado com seções finas da pele humana normal ou de
outros tecidos animais, que se sabe que se ligam de maneira consistente e
sensível ao anticorpo de interesse. O esôfago de macaco, por exemplo, é um
excelente substrato para a detecção de anticorpos antidesmogleína. Quando o
teste é positivo, os autoanticorpos no soro se ligam ao antígeno alvo na amostra
de tecido; o segundo anticorpo marcado com fluoróforo se liga à porção Fc
do autoanticorpo, permitindo que seja visualizado com o microscópio de
fluorescência. O padrão de fluorescência criado pelos autoanticorpos circulantes
demonstra o mesmo padrão que uma biópsia de pele perilesional com IFD
(ODELL; COOK , 2013).

Assim, a reação da imunofluorescência indireta (IFI), ou técnica de dupla camada


(Figura 25), é realizada por antígenos fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro
um anticorpo específico não fluorescente e, por último, coloca-se um anticorpo
fluorescente com especificidade marcada contra determinantes antigênicos do
primeiro anticorpo utilizado para reagir com o antígeno. Essa técnica apresenta
como vantagem a possibilidade de se ter uma fluorescência mais evidente, pelo fato
do anticorpo fluorescente se ligar apenas aos anticorpos primários.

Outra vantagem é que, por essa técnica, pode-se trabalhar com vários anticorpos
primários específicos para diferentes tipos de antígenos e pode-se identificar qual a
classe que o anticorpo pertence.

Figura 25. Ensaio de imunofluorescência direta, indireta e sanduíche.

substrato
Substrato
Anticorpo
secundário
Substrato
Anticorpo
secundário
Anticorpo
primário
Anticorpo
Anticorpo primário Ag
primário
Anticorpo
Ag Ag
de captura
Sanduíche
Direto Indireto

Fonte: adaptado de https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/1e/ElisasFormat.png/1024px-ElisasFormat.png.

75
UNIDADE III │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II

Citometria de fluxo

História

O nível atual da citometria de fluxo (CF) resultou:

» Da evolução tecnológica que se seguiu à primeira descrição feita por


Coulter, em 1956, de um aparelho que contava e media o tamanho de
células que passavam em corrente por meio de um feixe de luz.

» Da produção e marcação de anticorpos monoclonais com fluorocromos,


que começou na década de 1970.

» Dos progressos feitos na tecnologia dos computadores, os quais


permitem a análise e manipulação de toda a informação eletrônica
que o método fornece.

Princípio

A amostra observada em CF é constituída por suspensão de células ou de


partículas, as quais, incluídas na corrente em fluxo laminar de um líquido
condutor, serão forçadas a passar uma a uma por meio da câmara de fluxo. Essa
câmara é atravessada por um feixe de raios laser com comprimento de onda
preestabelecido. Sempre que o raio laser choca com uma célula, a radiação vai
sofrer desvios que, depois de convertidos pelo citômetro em sinais eletrônicos,
vão ser reconhecidos pelos sensores.

Um dos sensores é designado por Forward Angle Light Scatter (FS ou FSC), porque
se encontra colocado no sentido da direção do feixe luminoso. Outro situa-se
sensivelmente a 90° dessa direção, designando-se por isso Ortogonal ou Side Scatter
(SS ou SSC). Simplificadamente, poder-se-á dizer que o sensor FS dá informação
sobre o tamanho da célula, baseado na difração e refração da luz, enquanto o sensor
SS, que mede a luz dispersada, avalia a granulosidade intracelular, constituída pelo
núcleo, cromossomos, mitocôndrias e outras organelas ou partículas.

Os citômetros de fluxo possuem ainda um número variável de sensores especializados


em medir fluorescência, nomeadamente a que provém de fluorocromos como
o FITC, PE, PERCP, PACIFIC BLUE e outros que vão ser acoplados a anticorpos
monoclonais. Filtros ópticos colocados previamente a esses sensores permitem
separar os diversos componentes do espectro de emissão (Figura 26).

76
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II │ UNIDADE III

Com as informações provenientes dos variados sensores, a parte informática do


citômetro, de acordo com as características das próprias células, agrupa-as em
histogramas virtuais semelhantes ao representado na Figura 27.

Figura 26. Representação de um citômetro de fluxo (esquema).

Vibrador
Suspensão de células

Líquido

Laser
Detector

Células não fluorescentes


Colocação de carga

Células fluorescentes

- 2000V + 2000V

Coletor com células Coletor com células


marcadas não marcadas

Fonte: adaptado de https://canal.cecierj.edu.br/anexos/recurso_interno/7140/download/


a547e1c3dce20fcc3e2d819a1b1560f5.

Circunscrevendo-se no histograma uma determinada população celular (gating)


podemos realizar a imunofenotipagem (Figura 27)

A citometria de fluxo é um método multiparamétrico (número de parâmetros


analisados) utilizado na fenotipagem de células provenientes de variadíssimos
tecidos, incluso de tumores sólidos. Contudo o seu grande campo de aplicação
em clínica é o sangue periférico, cujas células apresentam na membrana
exterior antigênicos específicos habitualmente classificados com um número
correspondente ao seu Cluster of Differentiation (CD).

77
UNIDADE III │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II

Figura 27. Histograma de células do sangue periférico.

Granulócitos

FS
C

Monócitos

Linfócitos

SSC
Fonte: adaptado de http://www.gbcflux.com.br/files/20120925/curso-pre-congresso-fundamentos-da-citometria-de-fluxo-dra-
elizabeth-xisto-souto.pdf.

Exemplos de algumas aplicações da


citometria de fluxo

Imunodeficiência adquirida (AIDS)

O vírus causador da imunodeficiência humana (HIV) que tenha entrado na


circulação mostra especial predileção em infectar as células que exibem na sua
membrana uma glicoproteína que funciona como antígeno CD 4. Embora esse
antígeno se encontre em células de variados tecidos hematopoieticos ou não,
existe fundamentalmente na membrana dos linfócitos T. Estes, por sua vez,
constituem o principal alvo do HIV e o seu local privilegiado de replicação. Após
fusão com o receptor CD 4 da membrana, o HIV entra no linfócito T onde, por
ação de uma transcriptase reversa, o seu RNA é convertido em DNA, que vai
integrar-se no DNA nuclear. Esta célula ficará infectada durante o seu período
de vida e será a fornecedora da energia gasta com a reprodução do HIV. O DNA
viral passa de novo a partículas de RNA, que se agrupam para originar novos
vírus. Esses vão reentrar em circulação aptos a infectar mais linfócitos T, e a
célula de onde saíram ou morreu ou morrerá mais tarde ou mais cedo.

Sugestão de vídeos sobre a transmissão do HIV, disponível em: https://www.


youtube.com/watch?v=ZeyEYymuacg.

78
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II │ UNIDADE III

Fenotipagem da população linfocitária por


citometria de fluxo

Antes de proceder a essa fenotipagem, é preciso separar a população linfocitária dos


restantes leucócitos do sangue circulante.

Como todos os leucócitos apresentam nas suas membranas o antígeno CD45, começa
por se incubar o sangue total com um anticorpo marcado específico para esse
antígeno, que, de maneira geral existe, em maior quantidade nas membranas dos
linfócitos. Após passagem do sangue pelo citômetro, os variados tipos de leucócitos
vão ser agrupados virtualmente.

Os linfócitos assim agrupados (gated) vão ser agora separados nas suas variadas
subpopulações, após incubação com um painel adequado de anticorpos marcados.

Embora para o estadiamento da infecção por HIV, como veremos, tenha interesse
quantificar, sobretudo, os linfócitos T CD4+ e CD8+, é prática frequente em muitos
laboratórios utilizar também anticorpos contra os antígenos CD3, CD5, CD14, CD16,
CD19 e CD56.

Com esta prática, além de se excluírem monócitos que porventura se encontrem


entre as células estudadas, podem-se separar e quantificar especialmente os
linfócitos T, os linfócitos B e as células Natural Killer (NK). Se a soma T+B+NK
(no seu conjunto designada por imunossoma) for aproximadamente igual a
95%, temos a garantia de que não se perderam durante a separação quantidades
significativas de células linfocitárias.

Monitorização laboratorial da infecção por HIV

Antígeno p24 (Figura 28) – poucos dias após o contágio, detecta-se no sangue
circulante, por exemplo, por quimiluminescência, o antígeno p24 específico do HIV.
Esse marcador virológico, que já pode ser positivo uma semana antes da resposta
sorológica, atinge um pico por volta dos 20 dias e costuma negativar ao fim de um
mês. Um subsequente aumento dos seus níveis séricos é sinal de mau prognóstico.

Resposta Sorológica – consiste na produção, pelo organismo infectado, de


imunoglobulinas M e G específicas para o HIV. A IgM desaparece da circulação a
breve trecho, enquanto que a IgG sobe progressivamente e mantém-se com níveis
séricos elevados até muito tarde na progressão da doença.

79
UNIDADE III │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE II

Quantificação das populações linfocitárias – após a soroconversão, os linfócitos


T CD8+ aumentam quantitativamente para, juntamente com os CD3+ diminuírem
numa fase tardia da doença.

Pelo contrário, o número de linfócitos T CD4+, fundamentais na reação imunológica


contra agentes infecciosos, desce progressivamente, por razões já referidas, após
a entrada do HIV no organismo. Quando atingem as 400-500 células por µL ou
menos, o doente, que se manteve durante meses ou anos assintomático, tem maior
probabilidade de adquirir uma ou mais doenças oportunistas que definem a AIDS

Figura 28. Comportamento laboratorial da infecção pelo HIV.


A progressão do HIV
Contagem de células CD4 Carga viral
3
(células por mm ) (cópias por ml)
1,200 Contagem de células CD4 7
10
Carga viral
1,000 6
10
800
5
10
600
4
10
400
A AIDS ocorre
200 quando a contagem 3
10
de CD4 chega a 200
0
0 6 12 == 1 - 15+ =➔ == 2-3+=➔ 102
Semanas Anos

Fonte: adaptado de https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/0e/Hiv-timecourse_copy.svg/300px-Hiv-


timecourse_copy.svg.png.

80
IMUNOLOGIA UNIDADE IV
CLÍNICA – PARTE III

CAPÍTULO 1
Metodologias com uso de biologia
molecular

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)


A técnica de PCR utiliza os princípios de hibridização específica, orientação
definida, desnaturação e restauração ao estado nativo para aumentar
sequência específica de um gene. Na técnica de PCR, para amplificação de um
segmento específico de DNA, primers (oligonucleotídeos sintéticos) ou sondas
alelo-específicas são utilizados na reação de cadeia. Cada ciclo de amplificação
consiste de:

» Desnaturação da dupla fita de DNA por aquecimento.

» Hibridização dos primers com a utilização de uma sequência específica


de nucleotídeos da fita de DNA complementar (anelamento).

» Extensão dos primers pela ação da Taq DNA polimerase por meio da
adição de nucleotídeos livres complementares à fita de DNA original.
A seguir, a nova dupla fita de DNA formada serve como fita original
para os subsequentes ciclos, gerando assim uma escala geométrica de
amplificação.

Análises moleculares

A genotipagem molecular pode ser realizada sempre que a sequência de um gene for
conhecida e que as mutações responsáveis por um antígeno ou fenótipo de grupo
sanguíneo tenham sido determinadas.

81
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

Os protocolos de PCRs comumente utilizados na determinação de antígenos de


grupos sanguíneos são: primers alelo-específicos (AS-PCR) e PCR seguido por
análises dos fragmentos com enzimas de restrição (PCR-RFLP).

Atualmente tem merecido destaque também a técnica de microarray ou tecnologia


chip, por possuir plataforma rápida de genotipagem (diversas amostras ao mesmo
tempo) com excelente descriminação alélica, redução no número de procedimentos
isolados (execução de um único PCR multiplex) e resultado altamente automatizado.

Técnica de PCR alelo-específica

Nessa técnica de PCR alelo-específica, são utilizados dois diferentes primers, o


que nos leva a ter duas amplificações independentes (Figura 30). Dessa forma,
torna-se importante monitorar a eficiência da amplificação, realizando-se como
um controle interno uma sequência não relacionada. A amplificação de um
controle interno mostra a ausência de substância inibidora no tubo da reação
(não mostrado no exemplo a seguir.)

Eles podem não ser eficientes quando dois alelos diferem em apenas um nucleotídeo.
Esse método tem grande aplicação na tecnologia chip.

Figura 29. Produto de PCR alelo específico após eletroforese em gel agarose.

458 pb
histidina
363 pb
arginina

Fonte: adaptado de https://www.researchgate.net/publication/11294069_Clinical_and_molecular_study_of_Chilean_patients_


with_McCune-Albright_Syndrome/figures?lo=1.

Técnica de microarray

A técnica de microarray utiliza um PCR multiplex que possibilita a análise de


vários polimorfismos simultaneamente e sondas de oligonucleotídeos depositadas
em uma placa (vidro, sílica ou outros suportes) marcadas com fluorescência e

82
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III │ UNIDADE IV

hibridizadas com DNAs alvo (amplificados por meio do PCR multiplex), gerando
espectro de cor (caso haja a hibridização) que é detectado e interpretado por um
sistema automatizado capaz de avaliar a intensidade das hibridizações e fornecer
resultados que podem ser visualizados na forma de gráficos ou tabelas de genótipos
(Figura 31).

A rapidez e a confiabilidade de resultados proporcionados por esta tecnologia


aumentarão a exatidão da compatibilidade entre doador e receptor, bem como a
segurança das transfusões.

Figura 30. Esquema do microarray.

Teste Referência Excitação


Clones de DNA Laser 1 2 Laser 2 2

Transcrição
reversa

Marcar com
corantes
Emissão
fluorescentes

Amplificação por PCR


purificação

Análise
computacional
Hibridização

Fonte: adaptado de Duggan et al., 1999.

Aplicações clínicas da genotipagem molecular

Identificação de risco na doença hemolítica perinatal (DHPN) – testes


de hemaglutinação, incluindo a titulação de anticorpos anti-eritrocitários, dão
apenas uma indicação indireta da possibilidade de ocorrência da DHPN. Esse fato
ocorre particularmente nos casos de mães com anticorpos dirigidos a antígenos
do sistema Kell. Apesar de o genótipo fornecer informações diretas, os critérios
para obtenção dos amniócitos devem ser bem estabelecidos. A genotipagem é
indicada nos casos em que a mãe possui um anticorpo da classe IgG clinicamente
significante e o pai heterozigoto para o antígeno em questão ou desconhecido.
Atualmente, é possível realizar a genotipagem fetal por meio da amostra de

83
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

plasma materno (método não invasivo para o feto), pois foi demonstrado que o
DNA fetal livre encontrado na circulação materna, cuja concentração aumenta
durante a gestação, pode ser utilizado para realização da genotipagem de grupos
sanguíneos.

A possibilidade de realizar genotipagem RHD fetal por meio do plasma materno


terá um grande impacto na identificação das gestantes RhD-negativo que
necessitam de imunoglobulina Rh e também no monitoramento da gestação de
mães sensibilizadas pelo antígeno RhD que estão gerando um feto RhD positivo.

Teste direto da antiglobulina positivo – nas situações em que as


hemácias estão revestidas com anticorpos da classe IgG, a genotipagem tem
papel importante na determinação dos antígenos de grupos sanguíneos, pois
a maioria dos antissoros utilizados para a fenotipagem são reativos pelo teste
da antiglobulina. A utilização da genotipagem nesses casos pode auxiliar na
determinação do perfil antigênico do paciente e possibilitar a realização de
transfusão fenótipo compatível.

Pacientes com transfusão recente – estudos mostram que a presença de


leucócitos nos produtos de sangue transfundidos não interfere na genotipagem de
grupos sanguíneos. Assim, pacientes politransfundidos com transfusão recente
podem ser genotipados para determinação do seu perfil antigênico, possibilitando
transfusões fenótipo compatível.

Processo de identificação de anticorpos – a genotipagem pode ser um


método de auxílio na identificação de anticorpos de pacientes politransfundidos,
pois, por meio dela, é possível deduzir o fenótipo e confirmar a suspeita do
aloanticorpo presente.

Confirmação de discrepâncias ABO e Rh – algumas situações clínicas e a


utilização de diferentes antissoros nas rotinas de Imunohematologia podem levar
a discrepâncias nos fenótipos ABO e Rh. Estas discrepâncias podem atualmente
ser facilmente solucionadas por meio dos testes moleculares que independem da
disponibilidade de soros para a confirmação do fenótipo presente.

Determinação da zigozidade do antígeno RhD – a zigozidade do antígeno


RhD, impossível de ser determinada sorologicamente, pode ser realizada
por técnicas moleculares. Essa genotipagem tem sido de grande auxílio na
identificação da zigozidade RhD em pais de fetos gerados por mães RhD-negativo
e na constituição dos painéis de hemácias.

84
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III │ UNIDADE IV

Determinação de antígenos fracos – antígenos fracamente expressos


na membrana eritrocitária como Fyx, evar e outros podem ser seguramente
determinados pela genotipagem.

Confirmação dos antígenos D fraco e D parcial – a genotipagem tem sido


de grande auxílio na confirmação dos antígenos D fraco e D parcial, bem como na
determinação dos tipos de D fraco e tipos e categorias de D parcial, muitas vezes
impossível de identificar sorologicamente.

Determinação de microquimerismo em pacientes transplantados –


é possível selecionar um marcador genético de grupos sanguíneos por meio da
genotipagem eritrocitária em doadores e receptores de transplante de medula óssea e
avaliar o quimerismo após o transplante.

Testes em medicina legal – paternidade e testes forenses podem ser realizados


mediante genotipagem molecular com maior chance de resolução.

Disponibilidade de sangue para pacientes dependentes de transfusão


– a genotipagem molecular tem sido utilizada para identificar pacientes com
fenótipo Fy(b–) que podem ser transfundidos com hemácias Fy(b+) sem o
risco de desenvolverem anticorpos anti-Fyb. Dois terços da população Africana
com fenótipo Fy(a–b–) possuem o gene FYB com uma mutação no promotor
eritroide (GATA-1) que leva a ausência de expressão da proteína Duffy e,
consequentemente, do antígeno Fyb na superfície das hemácias. No entanto,
a proteína é expressa em outros tecidos, como por exemplo, nas células do
endotélio de vasos sanguíneos.

RT-qPCR

Introdução. A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real


(qPCR) ( Higuchi et al., 1993), desenvolvida a partir do método revolucionário
de reação em cadeia da polimerase (PCR), pioneira em Kary Mullis nos anos
1980 (MULLIS, 1990; MULLIS, 1987; SAIKI, et al., 1985), emergiu como um
método amplamente utilizado para investigação biológica porque pode detectar e
quantificar com precisão quantidades muito pequenas de sequências específicas
de ácidos nucleicos. Isso está associado a uma simplicidade inerente que
torna os ensaios qPCR fáceis de projetar e executar (SANDERS et al., 2014).
A caracterização dos padrões de expressão gênica por meio da quantificação
do RNA mensageiro (mRNA), acoplando a transcrição reversa à PCR, como
substituto do metabolismo celular, é uma das principais aplicações dessa

85
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

tecnologia. A transcrição reversa qPCR (RT-qPCR) possibilita avaliação rápida


e precisa das alterações na expressão gênica como resultado da fisiologia,
fisiopatologia ou desenvolvimento (VALASEK; REPA, 2005). No entanto, para
que as análises de RNA sejam clinicamente informativas, são essenciais medições
confiáveis reproduzíveis entre laboratórios. Até 30% dos custos dos orçamentos
de assistência médica estão em medições e testes relacionados ao diagnóstico
(QUINN; KOVALEVSKY , 2005). Isso requer esforços contínuos para melhorar
a confiabilidade de tais medições e testes, que desempenham papel fundamental
no desenvolvimento contínuo de sistemas de saúde eficazes (SANDERS et al.,
2014).

Em estudos de pesquisa, o RT-qPCR tem sido usado para medir a expressão


de genes bacterianos ou cargas virais de RNA (MANNONEN et al., 2011;
SHAHZAMANI et al., 2010), para avaliar o status do câncer ou para rastrear a
progressão da doença e a resposta ao tratamento (BENNOUR et al., 2012). Como
consequência, esse método está sendo aplicado à descoberta e desenvolvimento
de supostos biomarcadores (SANDERS et al., 2014). Um exemplo de tradução
bem-sucedida de um método RT-qPCR para o paciente é o ensaio Oncotype
Dx, que prevê os benefícios potenciais da quimioterapia e a probabilidade de
recorrência do câncer (KNEZEVIC et al., 2013) e, portanto, pode ser usado para
estratificar os pacientes para diferentes regimes de tratamento (Ru et al., 2011).
Além disso, o monitoramento da carga viral usando RT-qPCR agora é rotina
para vários vírus de RNA (GLAUBITZ et al., 2011).

O RT-qPCR é amplamente utilizado em pesquisas clínicas que investigam


biomarcadores putativos para diagnóstico de doenças, bem como para
monitoramento preditivo e prognóstico. No entanto na revisão da literatura, os
artigos publicados relatando dados de RT-qPCR frequentemente não relatam
todos os detalhes experimentais relacionados a experimentos com RT-qPCR.
Detalhes experimentais fundamentais são frequentemente omitidos ao relatar
medições de expressão gênica, incluindo informações relativas à qualidade do
RNA, a justificativa para a escolha da estratégia de normalização, a localização
do amplicão ou descrições detalhadas das condições da transcriptase reversa e do
ensaio de PCR (BUSTIN, 2010; HUGGETT; BUSTIN, 2011) .

Para facilitar a boa repetibilidade (medições feitas pelo mesmo operador


ou instrumento e nas mesmas condições por um curto período de tempo) e
reprodutibilidade (medições feitas por diferentes operadores ou instrumentos
e/ou sob diferentes condições) [24], aspectos principais dos processos experimentais
de RT-qPCR precisam ser relatados, conforme descrito nas diretrizes do MIQE (de

86
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III │ UNIDADE IV

“informações mínimas para publicação de experimentos quantitativos de PCR em


tempo real”), que propõem um padrão mínimo para o fornecimento de informações
para publicações que relatam experimentos de qPCR. [25] Eles abrangem
aspectos-chave, incluindo aquisição de amostras, projeto e validação de ensaios,
além de detalhes sobre a análise de dados, permitindo que outros cientistas avaliem
facilmente e, se necessário, repitam o experimento [25, 26]. Isso é fundamental
para que os achados sejam corroborados, o que, por sua vez, é crucial para que a
observação seja traduzida em uma ferramenta clinicamente útil (SANDERS et al.,
2014).

A medição de RNA em uma amostra biológica complexa (como uma amostra de


biópsia de tecido) requer uma série de etapas, cada uma das quais contribui com
erro muitas vezes maior que a diferença no mRNA a ser medido. Consequentemente,
determinar diferenças na expressão gênica em cenários reais requer consideração
das fontes de erro e mecanismos de normalização apropriados para controlá-los
(SANDERS et al., 2014).

No entanto, reivindicações de medição de diferenças de expressão gênica


biologicamente significativas são feitas rotineiramente sem consideração aparente
(ou relato) de tais fatores técnicos (BUSTIN et al., 2011). Consequentemente,
embora com frequência estatística significativa, esses resultados podem não ser
devidos ao fenômeno biológico sob investigação e/ou podem não ser reproduzíveis.
Sem avaliação e consideração da variabilidade técnica introduzida em cada estágio
do processo experimental, os resultados podem ser de uso prático limitado na
clínica, pois são difíceis de reproduzir (SANDERS et al., 2014).

Medição clínica

O RT-qPCR é uma ferramenta importante que pode auxiliar na compreensão


dos eventos moleculares subjacentes às doenças humanas, mas também oferece
um método para medir biomarcadores para a identificação e estratificação de
uma série de doenças (BUSTIN, 2002; RIZZI et al., 2008). Estudos relataram
a aplicação de RT-qPCR para a identificação de micrometástases ou doença
residual mínima no câncer colorretal, neuroblastoma, câncer de próstata e
leucemia (SANDERS et al., 2014). Foi utilizado para distinguir diferentes tipos
de linfoma (Gomes et al., 2010), para a análise das respostas imunes celulares
no sangue periférico, para a detecção de assinaturas de RNA bacteriano
e viral em amostras clínicas e para monitorar a resposta do câncer humano
ao tratamento (SANDERS et al., 2014; TAKAHASH et al., 2010). Outras
aplicações clinicamente relevantes incluem seu uso para a análise da expressão

87
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

gênica específica de tecido, identificando a expressão gênica de citocinas na


estimulação ex vivo de células mononucleares do sangue periférico e para o
perfil de mRNA de citocinas. Novas abordagens de expressão gênica estão
sendo constantemente avaliadas para fins de diagnóstico de inúmeras doenças
humanas (SANDERS et al., 2014).

A análise precisa do RT-qPCR pode melhorar o diagnóstico clínico, bem como o


monitoramento preditivo e prognóstico. Além disso, a sensibilidade aprimorada
da medição analítica pode oferecer ferramentas para detectar e quantificar
marcadores de doença em estágios iniciais de progressão, facilitando o tratamento
mais oportuno e melhorando os resultados. Além disso, testes de diagnóstico
que conferem precisão superior e confiança analítica podem alterar os regimes de
tratamento oferecidos aos pacientes (SANDERS et al., 2014).

88
CAPÍTULO 2
Diagnósticos laboratoriais (Ministério da
Saúde)

Doença de chagas

Aspectos clínicos

O diagnóstico da doença de Chagas humana pode ser realizado em qualquer estágio


da doença e envolve a análise de dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais
(UMEZAWA et al., 1996). Na fase aguda, é possível determinar a presença de
parasitas circulantes no sangue periférico por meio de exames parasitológicos,
que podem ser diretos como esfregaço de sangue ou esfregaço espesso de sangue,
ou por multiplicação como hemocultura, xenodiagnose e reação em cadeia da
polimerase (PCR) (LUQUETTI; SCHMUÑIS, 2017) Na fase crônica, pelo menos
dois testes sorológicos baseados em princípios diferentes devem ser realizados
para detectar anti-T. anticorpos IgG cruzi, como imunofluorescência indireta,
hemaglutinação e ensaio imunoabsorvente enzimático (ELISA). No caso de um
teste de sangue em bancos de sangue, um único teste ELISA é suficiente para
decidir sobre a exclusão de sangue (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2013).

Destacam-se por sua importância epidemiológica as formas agudas (indício


de transmissão ativa), indeterminadas (mais frequentes), cardíacas e digestiva
(gravidade clínica). Estima-se que as formas agudas aparentes se manifestam em
3% dos casos em área endêmica; as formas indeterminadas em 50%; as formas
cardíacas em 30%; e as digestivas em 7 a 8%.

Diagnóstico laboratorial

Parasitológico:

» exame a fresco;

» gota espessa;

» ssfregaço corado;

» creme leucocitário;

89
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

» xenodiagnóstico;

» Métodos imunológicos:

› hemaglutinação indireta;

› imunofluorescência;

› ELISA.

Todos os métodos parasitológicos acima destacados, na prática, são utilizados


para diagnóstico da fase aguda, quando a parasitemia é intensa. As sorologias
que detectam IgM (imunofluorescência e hemaglutinação) também são utilizadas
para diagnóstico da fase aguda, entretanto só deve firmar diagnóstico de forma
aguda com o encontro de parasitas no sangue periférico. Já na fase crônica,
utilizam-se mais com mais frequência os métodos de detecção de anticorpos
circulantes (IgG) e os métodos imunológicos (ELISA, a imunofluorescência e a
hemaglutinação indireta).

HIV/AIDS

Diagnóstico laboratorial

O diagnóstico laboratorial do HIV é realizado por meio da utilização de métodos


que permitam investigar anticorpos anti-HIV, antígenos, material genético ou que
possam isolar o vírus em cultura.

Para os infectados menores de 18 meses de idade, investiga-se o DNA ou RNA


viral, uma vez que poderia haver reação cruzada com os anticorpos maternos nas
crianças. Dessa forma, as técnicas utilizadas são o PCR para DNA viral e RT-PCR
para RNA viral.

Os indivíduos com mais de 18 meses de idade, utilizam testes que pesquisam os


anticorpos como os métodos de ELISA, Western Blotting, Imunofluorescência
Indireta.

No entanto deve ser levado em consideração que os anticorpos anti-HIV


somente serão detectáveis em torno de 30 dias após a infecção em indivíduos
imunologicamente competentes.

90
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III │ UNIDADE IV

Esse intervalo entre a infecção pelo patógeno e a detecção dos anticorpos


por metodologias laboratoriais é denominado janela imunológica. Nesse
período, podemos encontrar provas sorológicas falso-negativas e, por isso, há a
necessidade de realizar testes em tempos diferentes.

Na rotina, o método de ELISA é usado amplamente como teste inicial para a


detecção de anticorpos anti-HIV no sangue dos pacientes. Se o resultado for
positivo, o indivíduo deverá realizar outros testes adicionais confirmatórios como a
Imunofluorescência Indireta e Western Blot.

Febre amarela

Diagnóstico sorológico

Existem vários testes empregados no diagnóstico sorológico de febre amarela; os


mais frequentemente utilizados são:

» reação imunoenzimática de captura de IgM (MAC-ELISA);

» inibição da hemaglutinação (IH);

» teste de neutralização (N);

» fixação de complemento (FC);

» O MAC-ELISA é um dos métodos mais úteis para o diagnóstico


de infecção recente e para diagnóstico dos casos nos quais existem
reações cruzadas para flavivírus nos outros testes. É uma prova
simples e rápida, baseada na detecção de anticorpos da classe IgM
específicos de febre amarela. Pode fornecer um resultado presuntivo
utilizando apenas uma amostra de soro. Essa deve ser coletada a
partir do quinto dia de doença, quando o organismo já começa a
responder com a produção de anticorpos. A duração dos anticorpos
IgM é desconhecida e parece ser bastante variável. Em pessoas
vacinadas com a cepa 17D, os anticorpos IgM neutralizantes estão
presentes até 18 meses após a imunização.

Na infecção primária, anticorpos IgG específicos são encontrados regularmente e


anticorpos IgM são altamente específicos e usualmente presentes.

» A inibição da hemaglutinação (IH) é um teste sensível, de


fácil execução e requer equipamentos simples, porém é o menos

91
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

específica. É ideal para inquéritos sorológicos, uma vez que os


anticorpos IH persistem por um longo período de tempo, talvez
pela vida inteira e são usualmente detectados em casos de resposta
primária, a partir da primeira semana da doença. Em casos de
resposta secundária, altos títulos de anticorpos IH podem ser
precocemente detectados (dois a três dias após o início da febre).
Às vezes, podem ocorrer reações cruzadas com outros flavivírus,
dificultando a interpretação. A IH não é boa para avaliar resposta
à vacina e é frequentemente negativa em pessoas que demonstram
soro conversão pelo teste de neutralização. A limitação desse teste
deve-se à necessidade de coletar duas amostras com intervalo de 15
dias. Considera-se positivo quando há soro conversão, representada
pelo aumento de pelo menos quatro vezes os títulos de anticorpos
em relação à primeira amostra.

» O teste de neutralização é o mais específico. Detecta anticorpos


neutralizantes que aparecem tão precocemente quanto os anticorpos
IH, durante a primeira semana da doença e permanecem por muitos
anos, provavelmente por toda a vida. Os anticorpos neutralizantes
são protetores e se caracterizam pela capacidade de reduzir ou
eliminar a infectividade do vírus. As técnicas usadas para detecção
dos anticorpos neutralizantes incluem a redução em placa em
cultura celular e o teste de proteção de camundongos. Atualmente,
a redução em placa é a técnica padrão para avaliar resposta à vacina
antiamarílica.

» A fixação de complemento é um teste mais específico que a


IH. A presença de anticorpos é indicativo de infecção recente. Os
anticorpos detectados aparecem durante a quinta semana após o
início dos sintomas e declinam rapidamente a baixos níveis, 6 a 12
meses após a infecção. No entanto, em alguns estudos os anticorpos
podem persistir em títulos moderados ou elevados por períodos mais
prolongados (até dois anos).

As provas sorológicas produzem resultados bem definidos quando realizados em


um paciente exposto pela primeira vez a um flavivírus. Os anticorpos específicos
surgem nos primeiros dias, alcançando níveis elevados em comparação aos
anticorpos heterólogos. No entanto, quando a pessoa foi exposta anteriormente

92
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III │ UNIDADE IV

a outro flavivírus, a reação é rápida e intensa em função da memória imunológica


prévia. Sendo assim, os anticorpos heterólogos são iguais ou mais elevados que
os específicos. Essas interpretações nos permitem entender a dificuldade no
entendimento das reações sorológicas em casos de exposição anterior a outros
flavivírus.

Definição de caso

Caso suspeito

Paciente com quadro febril agudo (há menos de sete dias), de início súbito,
acompanhado de icterícia e que apresente pelo menos um dos seguintes
achados clínicos e/ou laboratoriais ou paciente com quadro (há menos de
sete dias), de início súbito, procedente de área endêmica para febre amarela
silvestre e/ou de ocorrência de casos de febre amarela:

» sinal de Faget;

» manifestações hemorrágicas (epistaxe, gengivorragia, hematúria,


hematêmese e melena);

» dor abdominal alta;

» albuminúria;

» oligúria.

Caso confirmado por critério clínico-laboratorial

Todo caso é suspeito quando há pelo menos uma das seguintes condições:

» detecção de anticorpos do tipo igm pela técnica de mac elisa.

» isolamento do vírus amarílico.

» laudo histopatológico compatível, com vínculo epidemiológico


(procedência de área endêmica e/ou de transição para febre
amarela silvestre);

» detecção do genoma viral;

» demonstração de um aumento de 4 vezes ou mais nos títulos de


anticorpos IgG por meio da técnica de IH.

93
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

Caso confirmado por critério clínico-epidemiológico

É o caso suspeito de febre amarela que evoluiu para óbito em menos de 10


dias, sem confirmação laboratorial, no curso de surto ou epidemia em que
outros casos já tenham sido comprovados laboratorialmente.

Caso descartado

Caso suspeito com diagnóstico laboratorial negativo, desde que se comprove


que as amostras foram coletadas e transportadas adequadamente, ou caso
suspeito com diagnóstico laboratorial de outra doença.

Leptospirose

A leptospirose humana é considerada uma antropozoonose (em que a participação


humana no ciclo do parasito é apenas acidental) de distribuição mundial, com
maior incidência em áreas pobres ou regiões afetadas por catástrofes naturais.

As leptospiras são mantidas em animais vertebrados e invertebrados que se tornam


portadores e excretam a bactéria na urina. O contato da pele ou da mucosa íntegra
ou lesada com a bactéria viável inicia a infecção. No meio urbano, os ratos são o
principal foco de disseminação da leptospirose para o homem, por contato com
esgotos contendo urina de ratos. A mordedura de ratos também pode transmitir a
infecção.

Os sintomas da leptospirose humana são pleomórficos, muitas vezes brandos,


parecendo uma gripe. A Leptospira produz toxinas e enzimas responsáveis pelos
quadros mais graves, depois à icterícia. Dores musculares geralmente estão presentes.

O diagnóstico tem importância para que a terapêutica antimicrobiana seja


instituída, reduzindo a morbidade e a letalidade da doença.

Os critérios laboratoriais preconizados de diagnóstico indicativo são:

» Isolamento da Leptospira (de sangue, urina ou liquido cefalorraquiano)


em cultivo.

» Aumento de duas a quatro vezes do título de anticorpos aglutinantes


observado em amostras coletadas na fase aguda (início dos sintomas) e
convalescença (duas a três semanas depois).

94
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III │ UNIDADE IV

Além de requererem laboratório especializado para o cultivo e a manutenção de


cepas de leptospiras, são desvantagens desses critérios:

» O isolamento microbiológico é muito demorado.

» A necessidade de segunda coleta de sangue e demora para confirmar o


diagnóstico.

A pesquisa de anticorpos específicos utilizando testes mais sensíveis pode


contornar essas dificuldades. Vale lembrar que o período curto de incubação da
infecção aos sintomas mantém a maioria dos pacientes na janela imunológica por
até uma semana já apresentando sintomas. Testes de detecção de anticorpos IgM
por ELISA ajudam a reduzir esse período de janela.

Malária

Até agora, foi observada uma melhora notável no diagnóstico da malária. Vários
métodos de diagnóstico da malária estão disponíveis para os formuladores de
políticas escolherem: diagnóstico presuntivo, microscopia de esfregaço de
sangue, reação em cadeia da polimerase (PCR) e teste rápido de diagnóstico (RDT)
(BRITTON et al., 2016). O diagnóstico presuntivo de malária é uma abordagem
convencional que diagnostica pacientes com base em seus sintomas e sinais
clínicos e ainda é amplamente adotado (TANGPUKDEE et al., 2009). No entanto
foi reconhecido que o método pode aumentar a dificuldade em diagnosticar a
doença com eficácia e precisão e levar a uma alta proporção de erros de diagnóstico
e uso excessivo de drogas. A microscopia de esfregaço de sangue tem vantagens
tanto na precisão quanto na capacidade de quantificar parasitas, se puder ser
usada adequadamente (MURPHY et al., 2013). Mas tem altos requisitos de
habilidades e experiência dos técnicos, o que é difícil de garantir, especialmente
em locais de baixa transmissão (DING et al., 2018). Também leva mais tempo
para operar, longe das expectativas atuais de uma técnica precisa e oportuna
para a detecção de rotina da malária (MURRAY et al., 2003. A PCR é atraente por
sua alta precisão diagnóstica. Por outro lado, é mais caro e tem altos requisitos
em dispositivos, materiais e técnicos, tornando-o inadequado para países com
recursos limitados (DOCTOR et al., 2017).

Diagnóstico laboratorial da malária

O diagnóstico da malária é realizado por meio da identificação do parasita no


sangue do paciente principalmente pelo método de gota espessa ou esfregaço com
coloração de Giemsa.

95
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

Entre as metodologias para a detecção de anticorpos consideradas válidas na rotina


laboratorial estão os métodos de ELISA e de imunofluorescência indireta.

Raiva

Diagnóstico laboratorial da raiva

De acordo com dados clínicos e epidemiológicos, a suspeita da doença se instala e,


assim, faz-se necessária a confirmação laboratorial.

As principais metodologias utilizadas para a identificação de antígenos ou


anticorpos específicos da doença são as imunofluorescências direta e indireta
das amostras de saliva, sangue e impressão da córnea (extremamente doloroso
para o paciente).

No caso da raiva, por ser uma doença de período de incubação curto, ou seja,
apresenta um intervalo de tempo curto entre a infecção e o aparecimento da
doença, também é realizado o diagnóstico pós-morte por meio da análise de
fragmentos do cérebro pela técnica de imunofluorescência direta.

Hepatites A-E

No Brasil, as hepatites virais mais comuns são as causadas pelos vírus A, B, C e


D. Existe, ainda, o vírus E, contudo, é mais frequente na África e na Ásia. Milhões
de pessoas no Brasil são portadoras dos vírus B ou C e não sabem, portanto,
correm o risco de as doenças evoluírem (tornarem-se crônicas) e causarem danos
mais graves ao fígado como cirrose e câncer. Por isso, é importante ir ao médico
regularmente e fazer os exames de rotina que detectam a hepatite.

A progressão das hepatites varia conforme o tipo de vírus. Os vírus A e E


apresentam apenas formas agudas de hepatite (não possuindo potencial
para formas crônicas). Isso nos leva a apontar que, após uma hepatite A ou
E, o indivíduo pode recuperar-se completamente, eliminando o vírus de seu
organismo. Já as hepatites causadas pelos vírus B, C e D podem apresentar
formas agudas e crônicas de infecção, que é o quadro de a doença persistir no
organismo por mais de seis meses.

96
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III │ UNIDADE IV

Hepatite A

Diagnóstico laboratorial (Quadro 2)

Exames:

» Anti-HAV IgM – anticorpos IgM contra o vírus da hepatite A,


presente na fase aguda e ausente em condição de imunidade.

» Anti-HAV IgG – anticorpos IgG contra o vírus da hepatite A, ausente


ou presente na fase aguda e presente na imunidade.

Quadro 2. Hepatite A – interpretação dos resultados sorológicos.

Anti-HAV total Anti-HAV IgM Interpretação


+ + Infecção pela
hepatite A recente.
+ - Infecção passada pela
hepatite A.
- - Ausência de contato/imunidade à hepatite A.
Fonte: adaptado de http://www.medicinanet.com.br/imagens/20140129144338.jpg.

Hepatite B

Diagnóstico laboratorial (Quadro 3)

Exames:

» Anti-HBcT (anticorpos totais contra o corion do vírus da hepatite B).

» Anti-HBcM (anticorpos IgM contra o corion do vírus da hepatite B).

» Anti-HBcG (anticorpos IgG contra o corion do vírus da hepatite B).

» HBsAg (antígeno de superfície do vírus da hepatite B).

» Anti-HBs (anticorpo contra o antígeno de superfície do vírus da


hepatite B).

» HBeAg (antígeno “e” do vírus da Hepatite B).

» Anti-HBe (anticorpo contra o antígeno “e” do vírus da hepatite B).

» HBV DNA (DNA do vírus da hepatite B).

97
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

Quadro 3. Hepatite B – interpretação dos resultados sorológicos.

Interpretação HBsAg HBeAg Anti-HBc Anti-HBc Anti-HBe Anti-HBs


IgM IgG
Incubação + - - + - +
Fase aguda + + + + - +
Fase aguda final ou hepatite + + - + - -
crônica + - - + + -
+ - - + - -
Início da fase convalescente - - + + - -
Imunidade - - - + + +

Infecção passada recente


Imunidade. - - - + - - ou +

Infecção passada
Imunidade - - - - - +

Resposta vacinal
Fonte: adaptado de https://www.biomedicinapadrao.com.br/2013/11/marcadores-sorologicos-da-hepatite-b.html.

Hepatite C

Diagnóstico laboratorial (Quadro 4)

Exames:

» Anti-HCV (anticorpos contra o vírus da hepatite C).

» PCR HCV (RNA do vírus da hepatite C).

Quadro 4. Hepatite C – interpretação dos resultados sorológicos.

Hepatite C aguda Hepatite C crônica Hepatite C curada


Anti-HCV - Anti-HCV + Anti-HCV +/- (com o tempo diminui)
PCR HCV + PCR HCV + PCR HCV-
Fonte: http://www.medicinanet.com.br/imagens/20140129144151.jpg.

Hepatite D

Diagnóstico laboratorial (Quadro 5)

Exames:

» Anti-HDV (anticorpos contra o vírus da Hepatite D).

98
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III │ UNIDADE IV

Quadro 5. Hepatite D – interpretação dos resultados sorológicos.

Formas HBsAg Anti-HBc total Anti-HBc IgM Anti-HDV total Anti-HBs


Coinfecção + - + + (a) -
Superinfecção + + - + (a) -
Cura - + - + (b) -

A – Anti-HDV IgM e IgG em altos títulos.

B – Anti-HDV-IgG positivo em baixo títulos.

Fonte: adaptado de http://medicinanet.com.br/conteudos/revisoes/1774/hepatite_d.htm.

Hepatite E

Diagnóstico laboratorial (Quadro 6)

Exames:

» Anti-HEV IgM (anticorpos IgM contra o vírus da hepatite E).

» Anti-HEV IgG (anticorpos IgG contra o vírus da hepatite E).

Quadro 6. Hepatite E – interpretação dos resultados sorológicos.

Anti-HEV total Anti-HEV IgM Interpretação


+ ou - + Infecção recente pelo vírus da hepatite E.
+ - Exposição prévia ao vírus
hepatite E.
- - Nunca teve contato com o vírus da hepatite A.
Fonte: adaptado de http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/hepatites_virais_brasil_atento.pdf.

Sífilis

Diagnóstico laboratorial

Devido à ausência de manifestações clínicas evidentes, ou mesmo quando


presentes, mas proteiformes (muda de forma com frequência), o diagnóstico
da sífilis baseia-se na evidenciação do Treponema pallidum nas lesões, quando
cancro primário, ou mais frequentemente, na detecção de anticorpos produzidos
após a infecção.

Pesquisa de treponema

Existem alguns meios de pesquisar o treponema tanto para casos de sífilis congênita
como em situações recentes e tardias da doença.

99
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

Pesquisa em campo escuro

Faz-se a coleta adequada, retirando-se a camada de material que recobre a lesão


com cuidado para que não sangre e, em seguida, coloca-se uma lâmina em contato
com a superfície de ulceração para coletar a gota de exsudato (líquido com alto
teor de proteína resultante de processo inflamatório) que aí se forma. Então, a
lâmina é observada por microscopia logo após a coleta do material.

À observação direta, a fresco, o Treponema pallidum é delgado, com 6 a 8 espiras


regulares, movimentando-se continuamente para frente e para trás por rotação
contínua.

Pesquisa após a coloração

Seco e fixado ao calor brando, o material pode ser corado pela prata. Para material
de lesões mucosas da boca é preferível uma coloração por imunofluorescência,
pois podem existir neste material treponemas que não são patogênicos, mas que
possuem uma morfologia semelhante àqueles que provocam a doença.

Pela técnica direta, a lâmina é incubada com anticorpo conjugado à fluorescência


e específico para T. pallidum. Na falta deste anticorpo, pode-se proceder à técnica
indireta utilizando-se um soro reagente bem concentrado de um paciente com
sífilis. Este soro reagente servirá para provocar, mais tarde, uma reação no
material que se deseja analisar, sendo o resultado dessa reação uma confirmação
ou não da presença do treponema.

A coloração por imunofluorescência, ou por técnica imuno-histoquímica com


anticorpo marcado por enzima, também pode evidenciar o treponema em cortes de
tecidos.

Pesquisa de DNA e Teste de Infectividade em coelhos

A partir do soro ou do líquido cefalorraquidiano (LCR), o T. pallidum pode ser


isolado por inoculação em testículo de coelho. Além disso, ele pode ser evidenciado
por meio da identificação de seu segmento de DNA em tecidos, soros ou líquido
cefalorraquidiano.

Testes sorológicos

São divididos em dois tipos, de acordo com os reagentes antigênicos empregados:


testes de cardiolipina e testes treponêmicos.

100
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III │ UNIDADE IV

Testes de cardiolipina

Utilizam como antígeno o fosfolipídeo cardiolipina, princípio ativo dos extratos


de coração de boi, para a pesquisa das reaginas, anticorpos que em infecções por
sífilis atingem altos níveis no organismo. Apesar de possuir especificidade limitada,
a cardiolipina é bastante utilizada na sorologia da sífilis, pois os testes lipídicos
possuem alta sensibilidade, resposta rápida, custo reduzido e simplicidade de
execução.

Estes testes consistem basicamente em suspensões de cristais de colesterol,


em meio aquoso contendo lecitina, que são aglutinados em presença de soro
reagente. De alta sensibilidade, mas sujeitos a resultados falso-positivos, assim
como a resultados falso-negativos especialmente na sífilis tardia, os testes de
cardiolipina devem ter seus resultados confirmados pelos testes treponêmicos.

Observação: Para maior entendimento dos testes de cardiolipina, veja o tópico


avançado sobre testes sorológicos na página inicial ou clique em sorologia.

Testes treponêmicos

Os testes sorológicos são realizados com Treponema pallidum ou com seus


antígenos, obtido a partir de testículos de coelhos infectados.

Toxoplasmose

Diagnóstico laboratorial

Classicamente, tem-se baseado na pesquisa de anticorpos contra o parasito (IgG,


IgM, IgA, IgE)

» Pesquisa do parasito ou de seus componentes.

» Isolamento do Toxoplasma.

Os materiais suspeitos são semeados em culturas de células, como fibroblastos


humanos. O desenvolvimento dos toxoplasmas no interior das células pode ser
evidenciado com facilidade por imunofluorescência em prazos curtos.

» Pesquisa de antígenos;

» Reação em cadeia da polimerase (PCR).

101
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

O toxoplasma pode ser identificado pela detecção de segmentos caraterísticos de


seus ácidos nucleicos, depois de ampliados pela reação em cadeia da polimerase
(PCR).

Dispendiosos e exigidos controles rigorosos para evitar resultados falsos, este


vem se tornando mais prático, atualmente podendo ser completados em menos
de 48 horas.

A pesquisa pode ser realizada no líquido amniótico ou no sangue de cordocentese


de recém-nascidos, em sangue venoso, em material de biópsia cerebral ou no
líquido cefalorraquiano, em material de lavagem brônquio-alveolar.

Testes sorológicos

» Teste imunoenzimáticos - ELISA.

Extratos ou frações antigênicas do toxoplasma fixados sobre suportes inertes,


como cavidades de placas ou microesferas, são incubados com diluições dos
soros a serem testados e, em seguida, com conjugado enzimático antiglobulina.
Posteriormente é feita a incubação com produto capaz de, sob a ação da enzima,
desenvolver cor (ou fluorescência) cuja intensidade é diretamente proporcional a
quantidade de anticorpos antitoxoplasma no soro.

» Testes de ELISA de captura.

Usados para eliminar os resultados falsos por interferência de fatores reumatoides


e fator antinuclear (FAN).

» Testes de hemaglutinação.

» Outros testes: a reatividade de anticorpos para diferentes componentes


antigênicos do Toxoplasma pode ser evidenciada pelos testes de
IMMUNOBLOT.

Perfis e marcadores sorológicos

O aparecimento de anticorpos para o toxoplasma, assinalado pela soroconversão


dos testes sorológicos, de negativos para positivos, traduz a resposta humoral à
infecção recém-adquirida.

Na vigência da parasitemia, observada nas primeiras semanas da primo-infecção,


surgem anticorpos específicos representados por isotipos IgM, IgA, IgG e IgE.
Numa primeira fase (perfil I – fase aguda) observa-se a presença de IgM, IgG de

102
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III │ UNIDADE IV

baixa avidez, IgA e IgE. Posteriormente, evidencia-se o declínio da IgM, a IgA e


da IgE e o aparecimento da IgG de alta avidez (perfil II – fase intermediária). A
terceira fase, caracteriza-se pela presença de IgG de alta avidez em concentração
constante (perfil III – fase crônica).

Dengue/Zika/Chikungunya

Diagnóstico laboratorial

Os métodos de diagnóstico laboratoriais empregados hoje em dia para diagnóstico


de dengue, zica e chikungunya são o isolamento viral em culturas celulares
(C6/36), o MAC-ELISA, o ELISA de inibição e a inibição da hemaglutinação. Seja
qual for o método, o isolamento viral deverá ser feito até o quinto dia de doença
e a sorologia (testes rápidos para IgM, IgG) após este período, sempre com
acompanhamento dos órgãos de Saúde. Os testes moleculares como o RT-PCR
para detecção direta do vírus são indicados para aferir precisa aos diagnósticos
(NOORBAKHSH et al., 2019).

Tuberculose

É uma doença bacteriana, causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis que,


ao se instalar no organismo (por meio da inalação de gotículas de saliva expelidas
pela tosse ou espirro de um indivíduo com a doença), aloja-se nos alvéolos
pulmonares iniciando sua multiplicação no interior dos macrófagos alveolares,
que são as células com função fagocítica.

A doença é caracterizada pelo desenvolvimento de granulomas (formação celular


envolvendo a bactéria) e lesões teciduais graves, normalmente nos pulmões
(cerca de 85% dos casos), embora a doença possa se desenvolver em outros
órgãos, como rins, ossos e meninges, dentre outros.

Diagnóstico clínico e laboratorial

O diagnóstico da tuberculose é inicialmente feito com a pesquisa dos bacilos


álcool-ácido-resistentes (BAAR) em materiais biológicos (principalmente o
escarro). Como esse teste de BAAR não é suficiente, pois outras bactérias podem
dar o mesmo resultado, configurando um falso positivo, temos que recorrer à
cultura celular permite definir o agente etiológico.

103
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

Métodos sorológicos

Em geral apresentam problema de baixa sensibilidade e especificidade. Pessoas


não infectadas que foram vacinadas ou que já ficaram doentes uma vez podem ser
confundidas com aquelas realmente infectadas pela presença de anticorpos no seu
sangue.

O método ELISA tem-se mostrado promissor para o diagnóstico da tuberculose


em líquidos cefalorraquidianos e secreções, com altos índices de sensibilidade e
especificidade, porém, ainda não é o método mais utilizado por ser um dos mais
novos. Cabe lembrar também que se devem levar em consideração as informações
sobre a população estudada, como incidência da doença, vacinação etc.

Avanços no diagnóstico

Não vimos alterações significantes nas últimas décadas no que tange ao


diagnóstico exclusivo da tuberculose, já que os sintomas e os exames clássicos
eram suficientes para o tratamento dos pacientes. Contudo, surgiu a necessidade
de técnicas mais avançadas com o crescimento da associação HIV-tuberculose, e
a tuberculose multi-resistente (TBMR). Isso se deve por encontrar em pacientes
portadores do HIV espécies outras de Mycobacterium sp como aquelas do
complexo Mycobacterium avium que também podem ser responsáveis pela
manifestação da doença. O uso de técnicas como o PCR permite que sequências de
DNA presentes em poucas cópias possam ser amplificadas in vitro e quantidades
amplificadas de material genético possam ser visualizadas e identificadas.

Doenças associadas ao ASLO (Anticorpo


antiestreptolisina O)
A bactéria mais importante desse grupo é o Streptococcus pyogenes. Estas
bactérias estreptococos beta hemolítico do grupo A são responsáveis pelo
aparecimento de diversas doenças como amigdalite, escarlatina (infecção de
garganta associada a uma erupção de pele), septicemia (infecções do sangue),
erisipela (infecção do tecido abaixo da pele, geralmente nas pernas), febre
reumática e glomerunefrite (inflamação renal) aguda; podendo inclusive levar
ao óbito em aproximadamente um mês.

A presença de estreptolisina é característica neste grupo de bactérias. A


estreptolisina contém hemolisinas capazes de causar hemólise total, ou seja,
promover ruptura total dos eritrócitos do hospedeiro.

104
IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III │ UNIDADE IV

Tal fenômeno ocorre por meio da interação dessas hemolisinas com seus anticorpos,
ou seja, anticorpos antiestreptolisina O (ASLO) presentes no organismo do
hospedeiro, no caso, no homem.

A elevação de anticorpos antiestreptolisina séricos, na faixa de 166UI/mL a


200Ul/mL, é indicador de um contato prévio com a bactéria estreptococo beta
hemolítico do grupo A, atingindo os seus valores máximos entre quatro a seis
semanas. Embora na tuberculose o ASLO também possa se elevar, neste caso,
não está associado à bactéria estreptococo beta hemolítico do grupo A.

Para um correto diagnóstico o ASLO deve ser dosado logo após o jejum de oito
horas e a sua detecção se faz indiretamente por meio de provas que mostram a
elevação de anticorpos contra a enzima estreptolisina O.

A amostra sérica do ASLO é diluída em uma preparação comercial de estreptolisina


O e incubada. É adicionada hemácias de coelho ou humanas e, após isso, o tubo é
reincubado e examinado visualmente.

A dosagem deste anticorpo pode ser realizada por nefelometria cujo princípio
está baseado na leitura da intensidade da luz dispersa (espalhada) pela amostra
em ângulo de 90° usando como referência a direção da luz incidente. Em suma,
em reações de precipitação entre antígeno e anticorpo em soluções diluídas
verificamos aumento da reflexão da luz, que pode ser medida de forma direta
pela dispersão da luz incidente.

A quantidade e a natureza da dispersão dependem tanto da forma como tamanho


das partículas, e mais ainda da concentração, comprimento de onda da luz e do
índice de refração do meio.

As substâncias são medidas pela adição de quantidades constantes de anticorpos


puros e opticamente claros a concentrações crescentes da substância em análise.
O feixe de luz incide sobre os complexos formados na solução do tubo ou cubeta
e a intensidade de luz dispersada é medida por uma célula fotométrica como
densidade óptica.

Podemos apontar vantagens da nefelometria como:

» É totalmente automatizada.

» De fácil realização, rápida e precisa.

105
UNIDADE IV │ IMUNOLOGIA CLÍNICA – PARTE III

» Tem a capacidade de utilizar pequenos volumes de amostra.

» tem uma sensibilidade adequada para a medida de proteínas de


significado clínico.

No entanto como essa técnica tem sido realizada hoje em dia, mais manualmente,
a dosagem do ASLO tem sido realizada também por ELISA, turbidimetria,
neutralização da toxina entre outros.

106
Para (não) finalizar

O estudo da disciplina Imuno-Hematologia e Imunologia Clínica apresentado


neste caderno é de grande importância não só para o aluno, mas também
para os professores que estiveram empenhados neste trabalho. A elaboração
de conteúdos que estimulem a busca de conhecimento que invariavelmente
se tornarão aplicados na rotina daqueles que trabalham na área de saúde são
cruciais no modelo educacional. Nesse momento de formação, a capacidade
autônoma é de grande relevância, considerando as habilidades crítica e
criativa, desenvolvidas durante esse período de aprendizado. O fator que se
torna mais motivante nesse processo é saber que este caderno dá subsídios para
uma busca mais aprofundada de informações, atualização de conhecimento
e principalmente o compartilhar desse universo todo da ciência que tanto
amamos.

O entendimento dos sistemas sanguíneos apresentados neste caderno (ABO


e Rh) é importante por serem os mais conhecidos na prática de transfusão de
sangue. Assim, bancos de sangue, que lidam rotineiramente com esses processos,
necessitam de profissionais habilitados e conhecedores da prática e, sobretudo,
do fundamento teórico embutido nas análises. Lembramos de que existe uma
infinidade de outros sistemas sanguíneos, cada qual com a sua importância, o que
nos leva a motivá-lo a não estreitar seu centro de conhecimento do assunto. Da
mesma forma, entender as implicações de doenças associadas a reconhecimento
de antígenos como a DHRN é importante na análise e orientação de gestações
de risco e se constitui uma ferramenta poderosa, que pode ajudar nos exames de
rotina laboratorial, bem como na correlação com outros exames laboratoriais.

O conhecimento da Imunologia Clínica no que tange à relação antígeno-anticorpo


se torna essencial na rotina das Análises Clínicas, principalmente pelo considerável
tipo de ensaios propostos e sua cada vez mais rápida precisão tecnológica de
equipamentos e reagentes. Esse fato no permite aumentar a investigação de
doenças consideradas graves, sejam de cunho agudo sejam de cunho crônico, que
afetam a população que depende de eficiente diagnóstico laboratorial para um
tratamento preventivo e até mesmo curativo.

Portanto, fica claro o objetivo deste caderno de estudos para aprimorar e


consolidar os conhecimentos em Imuno-hematologia e Imunologia Clínica e
auxiliar também nas boas práticas de rotina laboratorial.

107
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