da quantidade de DNA específico utilizando a enzima Taq DNA polimerase, sequências iniciadoras específicas (primers) e variações de temperatura controladas. ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes DNA ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes DNA dATP dCTP dGTP dTTP (nucleotideos) ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes DNA Taq polimerase dATP Primers dCTP Tampão dGTP Água dTTP (nucleotideos) Taq DNA polimerase
O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a
qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park. Taq DNA polimerase
Termoestabilidade limitada
Temperatura T 1/2 (minuto)
92,5oC 130 95,0oC 40 97,5oC 5 Taq DNA polimerase Trata-se de uma enzima cuja atividade é mantida durante 45 minutos a 95°C.
• Sua quantificação é dada em Unidades (U), sendo que
cada U é definida como a quantidade de enzima capaz de incorporar 10 nM de dNTP em cerca de 30 min a 72°C.
• Na maioria dos protocolos são utilizadas 2,0 a 2,5 U
(0,5 l) de enzima em volume final de 100 l.
• É importante deixar claro que o excesso de enzima
também pode prejudicar a eficiência da reação, podendo inclusive inibi-la. Seqüências dos primers
• Os primers (forward e reverse) devem ser
construídos de acordo com a conveniência do investigador, de modo que esses possuam seqüências complementares a determinadas regiões do DNA que limitam os segmentos a serem amplificados. Problemas comuns no Desenho de Primers
• Auto-complementariedade
• Complementariedade entre primers
Auto Complementariedade
• Formação de alça
GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT
HOTGACTTC Tm = 71oC ACTGAA Complementariedade entre Primers
3‟OHTGACTTCCTCAAGAACTGGACTTC GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH3‟ Desoxinucleotídios trifosfatados (dNTP) • São as bases nitrogenadas que constituirão as novas cadeias de DNA.
• Sua concentração numa reação pode variar de
20 a 200 uM sendo importante que as quatro devam variar em concentrações equivalentes.
• Quando estão em excesso (um nucleotídeo ou
todos) podem ocorrer erros de incorporação de bases, gerando cópias alteradas Íon magnésio • O íon magnésio (Mg++) é um co-fator enzimático que desempenha um papel de extrema importância na atividade da enzima Taq DNA polimerase.
• Sua concentração em torno de 1,5 mM é aplicável a
maioria das necessidades.
- Se a concentração de Mg2+ é muito baixa, temos
pouco ou nenhum produto
- Se a concentração de Mg2+ é muito elevada, a
PCR tem baixa especificidade. Observa-se muitas bandas ou “smear”. Smear PCR “Requerimentos”
• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM
• Tampão: pH 8.3-8.8 • dNTPs: 20-200µM • Primers: 0.1-0.5µM • DNA Polimerase: 1-2.5 units • DNA Alvo: 1 µg ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes DNA Taq polimerase dATP Primers dCTP Tampão dGTP Água dTTP (nucleotideos) ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes DNA Taq polimerase dATP Primers dCTP Tampão dGTP Água dTTP (nucleotideos)
94ºC
DENATURAÇÃO
2. Alternância de temperaturas (Termociclador) ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes DNA Taq polimerase dATP Primers dCTP Tampão dGTP Água dTTP (nucleotideos)
94ºC 57ºC
DENATURAÇÃO ANELAMENTO
2. Alternância de temperaturas (Termociclador) ETAPAS 1. Adição de reagentes DO PCR DNA Taq polimerase dATP Primers dCTP Tampão dGTP Água dTTP (nucleotideos)
94ºC 57ºC 72ºC
DENATURAÇÃO ANELAMENTO EXTENSÃO
2. Alternância de temperaturas (Termociclador) 25-40 (35) CICLOS
EXTENSÃO Temperatura média (Tm) de Anelamento Essa temperatura está relacionada, por exemplo, com a quantidade das bases C Ponte e G, de modo que de Hidrogênio quanto maior for o número dessas bases, fosfato a temperatura de hibridização tende apentose aumentar. Citosina
Guanina
Timidina
• Normalmente primers de 18 a 25 nucleotídios
Adenina contendo 50 a 60% de G + C são adequados.
• Para se calcular a TM (temperatura média de
hibridização) de primers com até 20 nucleotídios aplica-se a seguinte formula:
4 x (C + G) +2 x (A + T) = TM Tempo de extensão dos primers
• Esse fator depende do comprimento do
segmento a ser amplificado e da concentração do DNA molde utilizado na reação.
• A temperatura ótima de extensão dos primers é
de 72°C (temperatura ótima de atividade da polimerase) e o tempo de extensão de 1 minuto é considerado suficiente para estender produtos de aproximadamente 1.250 pb (em condições ideais). Tempo e temperatura de desnaturação
• As condições de desnaturação utilizadas
normalmente são de 95°C por 5 minutos (desnaturação inicial) e por 30 segundos (desnaturação na ciclagem), sendo que temperaturas mais altas podem ser utilizadas quando se trabalha com seqüências moldes ricas em G+C.
• Temperaturas muito altas e tempos longos de
desnaturação levam a perda de atividade da enzima Amplificação de DNA (exponencial)
Plateau Linear Gel EtBr
Log [DNA]
Geométrica
X ciclos y = 2X Amplificação de DNA (Platô) Número de cópias de 1 molécula de DNA após 34 ciclos: 1.580.000.000 CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1,024 11 2,048 12 4,096 13 8,192 14 16,384 15 32,768 16 65,536 17 131,072 18 262,144 19 524,288 20 1,048,576 21 2,097,152 22 4,194,304 23 8,388,608 24 16,777,216 25 33,554,432 26 67,108,864 27 134,217,728 28 268,435,456 29 536,870,912 30 1,073,741,824 31 1,400,000,000 32 1,500,000,000 33 1,550,000,000 34 1,580,000,000 Reação: DNA Enzima Taq Primer Nucleotídeos Análise Tampão Água dos dados Luz Ultravioleta
Fotodocumentação
Termociclador
Eletroforese em gel de agarose Reação + de PCR Brometo de Etídeo + Tampão Corado (Loading Buffer) ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 2% REVELAÇÃO DO BROMETO DE ETÍDEO COM LUZ ULTRAVIOLETA FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2% UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb
1400 1300
600 500 400 300
200
100
Marcador de pares de base (pb) FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2% UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb
1400 1300
600 600 600
500 400 400 400 400 300
200
100 100 100 100 100
Marcador de pares TAMANHO ESTIMADO DOS FRAGMENTOS DE de base (pb) DNA AMPLIFICADOS Variações da técnica de PCR
- Real Time-PCR: PCR quantitativo utilizado para determinação
de carga viral.
- Nested-PCR: amplifica seqüências de DNA de baixa
frequência (exemplo: diagnóstico de parasitoses). Aplicações do PCR
• A alta sensibilidade do método de PCR, bem como
a sua especificidade, nos permite amplificar uma seqüência-alvo mesmo a partir de amostras com baixo grau de pureza e de quantidades mínimas de DNA, o que torna o método viável não só para a pesquisa básica mas também para a pesquisa aplicada. Aplicações do PCR
Os produtos amplificados por PCR podem ter as seguintes
utilidades/ aplicações:
1. Detecção de deleções / inserções determinadas pela
geração de produtos amplificados que apresentam alterações em seu tamanho.
2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de
bases), conhecidas ou não, que geram polimorfismos genéticos podem ser determinadas pela ação das enzimas de restrição ou através do seqüenciamento. Aplicações do PCR 3. No diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional (particularmente para doenças herdadas). 4. Na tipagem para transplantes de órgãos e susceptibilidade para doenças auto-imunes específicas (detecção de polimorfismo para HLA). 5. No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem genética, como o câncer, através do estudo dos genes relacionados a essas doenças. 6. Na medicina forense (DNA fingerprint). 7. No diagnóstico de doenças infecciosas por agentes patogênicos diversos
