Marcilio Nichi

Criopreservação de espermatozoides

Disciplina VRA 414 / 2201 - Biotecnologia da Reprodução

São Paulo
2018
 Criopreservação
“Manutenção da viabilidade de órgãos, tecidos e

células através da estocagem a temperaturas

extremamente baixas por período indefinido.”

(modificado do Dicionário Médico Dorland)

 Histórico
- Primeiras células a serem estudadas;

- Demanda da produção animal com o surgimento da

seleção genética sistemática (especialmente em

bovinos) : IA

- Evidência clara de viabilidade (móvel vs. não

móvel???);

- Facilidade de obtenção de amostras.

 Histórico
- Spallanzani (1776): Primeiras observações;

- Prévost (1840), De Quatrefages (1853), Mantegazza

(1866), Schenk (1870), Davenport, Ivanov (1907),
Jahnel (1938), Luyet and Hodapp (1938), Schafner et
al. (1941), Maximov (1908), Bernstein and
Petropavlovsky (1937), Hoagland and Pincus (1942)
 Histórico
- Polge, Smith e Parkes (1949): Descoberta acidental do
glicerol como crioprotetor em galos;

- Sherman (1953-55) – Curva de congelamento com

glicerol;

- Lovelock, 1953a; Lovelock & Polge, 1954; Menz &

Luyet, 1965; Luyet, 1966; MacKenzie & Luyet, 1967a;
1967b; Luyet & Rapatz, 1970; Luyet, 1971;
Rasmussen & Luyet,1972; Rapatz & Luyet, 1973
 Vantagens
• Logística da aplicação de biotecnologias da reprodução;
• Ganho genético;
• Redução de custos e riscos para importação e exportação
de material genético (transporte, quarentena, premunição);
• Utilização por tempo indefinido;
• Maior controle das doenças sexualmente transmissíveis;
 Problema
- Formação de cristais de gelo;
- Aumento da osmolaridade (efeito solução);
 Problema
- Formação de cristais de gelo;
- Aumento da osmolaridade (efeito solução);

TEMPERATURA

Molécula de água Bogdan, 2010

 Solução
- Crioprotetores;
- Velocidade de resfriamento e congelação.
 Solução
- Crioprotetores;
- Velocidade de resfriamento e congelação.

TEMPERATURA

Crioprotetores

Bogdan, 2010
 CRIOPROTETOR

➢ Substancias que protegem a célula durante o

congelamento e descongelamento;
➢ Mecanismos não completamente elucidados;
➢ Reduzem o ponto de congelação H2O:
➢ Evitam formação gelo intracelular;
➢ Desidratação celular controlada;
➢ Características desejáveis:
➢ Baixo peso molecular
➢ Alta solubilidade em H2O
➢ Baixa toxicidade
Classificação dos Crioprotetores
➢ Habilidade em atravessar a Membrana
➢ Penetrantes ou Intracelulares

➢ Não Penetrantes ou Extracelulares

➢ Ambos → desidratação célula por efeito osmótico

DOEBLER, 1966; MERYMANN, 1971;

MCGANN, 1978; SEIDEL, 1986
 Crioprotetores intracelulares
- Moléculas pequenas que penetram pela membrana
celular;
- Formam ligações de hidrogênio com as moléculas de
água prevenindo a formação de cristais de água;
- Em baixas concentrações, diminuem o ponto de
congelação;
- Em altas concentrações, inibem a formação de critais
de gelo;
- Ex: GLICEROL, PROPILENO GLICOL, DIMETIL
SULFOXIDO, 1-2 ISOPROPANODIOL, ETILENO
GLICOL, METANOL, ETANOL, POLIETILENOGLICOL,
ACETAMIDA, FORMAMIDA, LACTAMIDA
 Crioprotetores Penetrantes
Glicerol - Mecanismo Ação
➢ Glicerol
➢ mais utilizado e mais estudado
➢ Efeito na Solução
➢ Se liga á Molécula de H2O
➢ Altera as propriedades coligativas da solução
➢  ponto de congelamento
 Crioprotetores Penetrantes
Glicerol – Efeito negativo
➢ Efeito direto na permeabilidade da
membrana
➢ Grupos fosfatos dos fosfolipídios
➢ Fluidez da membrana;
➢ Interage com proteínas de ligação e
Glicoproteinas
➢Agrupamento de partículas intramembranares
➢  Capacidade elétrica da membrana
(bombas de íons):
➢ Interfere na capacitação espermática.
 Crioprotetores Penetrantes
Glicerol – Efeito negativo
▪ Efeito no Balanço Energético
Metabolismo Glicerol

demanda ATP

Deficit ATP
 Crioprotetores extracelulares
- Não penetram pela membrana celular das células,

- Ação estabilizadora e reparadora de membrana

plasmática;

- Durante a descongelação, previnem o choque osmótico

impedindo um influxo excessivo de água e a
rehidratação celular muito rápida;

- Ex: Gema de ovo, Açúcares, lipídios, proteínas,

aminoácidos e polímeros sintéticos de alto peso
molecular;
Crioprotetores não Penetrantes
▪ Efeito osmótico (glicose, frutose, lactose,
sacarose, rafinose, trealose)

Meio Perde  Gelo

hipertônico H 2O intracelular

▪Associação entre si e com penetrantes

 Crioprotetores não
Penetrantes
• Gema de Ovo
– Comum nos diluentes de sêmen
– Protege o sptz contra choque térmico
– Confere proteção á membrana durante
congelação e descongelação
– permite  níveis de glicerol
– Questões sanitárias.
 Crioprotetores não
Penetrantes : mecanismo de
ação
• Gema de Ovo
Lipoproteinas de Baixa Densidade

Fosfolipídios Componente
ativo

Previne a Perda de Fosfolipídios da

Membrana
 Solução
- Crioprotetores;
- Velocidade de resfriamento e congelação.
Sobrevivência celular
(%)

Velocidade de congelação (ºC/min.)

Fonte: Biotécnicas Aplicadas à Reprodução Animal, Varela Editora, São Paulo, 2002.
 Solução
- Crioprotetores;
- Velocidade de resfriamento e congelação.
 Solução
- Crioprotetores;
- Velocidade de resfriamento e congelação.

➢ Velocidade de resfriamento: Temperatura ambiente a 5°C

(-0,50 a -0,03°C/minuto) → Fase crítica entre 19 e 8°C

- Caixa de isopor: 8cm de gelo/palhetas a 3cm

do gelo (90 minutos)

- Geladeira: 1,5 a 2 horas

- Máquina: 1hora a 1hora e 20 minutos

 Solução
- Crioprotetores;
- Velocidade de resfriamento e congelação.

➢ Velocidade de congelação:

- Caixa de isopor: palhetas a 3cm do N2

5 a -153°C (-19,1°C/minuto)
15 a 20 minutos

- Máquina de congelação
de 5 a -80°C (-15°C/minuto – 15 minutos),
de -80 a -120°C (-10°C/minuto – 3 minutos)
 Problema
- Formação de cristais de gelo;
- Aumento da osmolaridade (efeito solução);
- Durante resfriamento, congelação, descongelação →
Lesão;
- Efeito tóxico das substâncias necessárias ao processo
(Crioprotetores);
 Problema
- Formação de cristais de gelo;
- Aumento da osmolaridade (efeito solução);
- Durante resfriamento, congelação, descongelação →
Lesão;
- Efeito tóxico das substâncias necessárias ao processo
(Crioprotetores);
 Solução
- Velocidade de descongelação;

- Palhetas de 0,5 mL: 35-37ºC/30`` vs. 50ºC/20`` vs. 70ºC/10``

- Palheta de 0,25 mL: 35-37ºC/20`` vs. 50ºC/15`` vs. 70ºC/7``

- One step vs. Two steps;

- Efeito tóxico do glicerol??? vs. Condições laboratoriais
 Diluidor
- Aumentar o volume para facilitar o fracionamento do
ejaculado mantendo as características do sêmen
- Crioprotetores (Glicerol, gema de ovo, glicose);
- Osmolaridade (sais);
- pH (tampões);
- Nutrientes (frutose, glicose, gema de ovo);
- Antibióticos;
Congelação de Sêmen
 Congelação de Sêmen

Sequência:

1) Preparo do material (checklist);

2) Colheita;

3) Avaliação e pré-diluição;

4) Diluição;

5) Envase e estabilização;

6) Congelação;

7) Descongelação e reavaliação.
 Congelação de Sêmen
Dados obtidos da avaliação do sêmen

• Volume do
ejaculado
• Motilidade / Vigor
•Concentração
espermática
• % de Defeitos
Maiores e Menores?
 Congelação de Sêmen

Valores mínimos de qualidade:

• 60-70% de motilidade

• 3 de vigor

• patologias :

até 30% defeitos totais

até 10% defeitos maiores

até 20% defeitos menores

 Congelação de Sêmen

Fatores a serem considerados para o cálculo de doses:

• Volume do ejaculado

• Motilidade

• Concentração espermática

• Perda na congelação

• Dose inseminante

•Volume da palheta
 Congelação de Sêmen

Exemplo:

Volume do ejaculado = 9ml

Motilidade = 80%

Concentração espermática = 600 x 106sptz/mL

Perda na congelação = 50%

Dose inseminante = 15x 106sptz

 Congelação de Sêmen

1o passo) Saber quantos sptz o ejaculado apresenta

→ multiplicar a concentração pelo volume
 Congelação de Sêmen

1o passo) Saber quantos sptz o ejaculado apresenta

→ multiplicar a concentração pelo volume

Volume do ejaculado= 9ml

Concentração espermática= 600 x 106ptz/mL

Assim, temos: 9 x 600 x 106 = 5400 x 106 sptz/ ejaculado

 Congelação de Sêmen

2o passo) Saber quantos sptz estão viáveis neste

ejaculado

→ multiplicar o no de sptz no ejaculado pela motilidade

Sptz no ejaculado = 5400 x 106

Motilidade = 80%

Portanto, temos : 5400 x 106 X 0,8 = 4320 x 106 sptz

viáveis no ejaculado
 Congelação de Sêmen

3o passo) Saber quantos sptz estarão viáveis após a

descongelação

→ multiplicar o no de sptz viáveis no ejaculado pela

porcentagem de células sobreviventes à congelação.

Sptz viáveis no ejaculado = 4320 x 106

Perda na congelação = 50% (50% sobrevivem)

4320 x 106 X 0,5 = 2160 x 106 sptz viáveis pós-

congelação
 Congelação de Sêmen

4o passo) Saber quantas doses inseminantes o ejaculado pode

originar

→ dividir o no de sptz viáveis após a congelação pelo no sptz na

dose inseminante.

Sptz viáveis pós-congelação = 2160 x 106

Dose inseminante = 15x 106

2160 x 106 ÷ 15 x 106 = 144 doses

 Congelação de Sêmen

5o Passo) Calcular o volume de sêmen + meio → depende do

volume da dose inseminante (palhetas de 0,5ml ou 0,25ml)

no doses = 144

Se o volume da dose inseminante = 0,5ml

→ 144 x 0,5 = 72ml de sêmen diluído

Se o volume da dose inseminante = 0,25ml

→ 144 x 0,25 = 36ml de sêmen diluído

Congelação de Sêmen
Tipos de Diluidores (1 ou 2
frações)
 Congelação de Sêmen
Diluidor com DUAS frações

6o Passo) Preparar as frações A e B

Fração A = Sêmen + diluidor

Fração B = Diluidor + 14% de crioprotetor (glicerol)

Ambas devem ter o mesmo volume

Portanto → 72ml : 2 = 36ml

Fração A = 9ml de sêmen + 27 ml de diluidor

Fração B = 36ml de diluidor com crioprotetor

 Congelação de Sêmen
Diluidor com DUAS frações

7o Passo) Resfriamento, mistura das frações

• Ejaculado e diluidores no banho-maria (37oC)

• Mistura da Fração A ao sêmen lentamente

• Resfriamento (1,5 a 2 horas a 5oC)

• Mistura da Fração B lentamente

 Congelação de Sêmen
Diluidor com DUAS frações

7o Passo) Resfriamento, mistura das frações

Tempo de Glicerolização (1 hora)

 Congelação de Sêmen

8o Passo) Envase e estabilização

• Envase (palheta de 0,5 ou 0,25 ml)

• Identificação das palhetas

• Previamente resfriadas
 Congelação de Sêmen - Envase

http://www.minitube.com.br/BR_por/Produtos-e-
 Congelação de Sêmen - Envase

http://www.minitube.com.br/BR_por/Produtos-e-
Congelação de Sêmen - Envase
 Congelação de Sêmen

9o Passo) Congelação final e armazenamento.

Manter sobre o vapor

de nitrogênio líquido
por 15 a 20 minutos.
 Congelação de Sêmen

http://www.minitube.com.br/BR_por/Produtos-e-
Servicos/Bovinos/Rampas-de-congelamento/Rampa-de-
Congelação de Sêmen
 Congelação de Sêmen

https://www2.cead.ufv.br/espacoProdutor/scripts/verArtigo.php?co
 Congelação de Sêmen

9o Passo) Congelação final e armazenamento

 Congelação de Sêmen

9o Passo) Congelação final e armazenamento.

 Avaliação após a congelação

http://veja.abril.com.br/saladeaula/220306/p
 Avaliação após a congelação

Após 24 horas → descongelar uma palheta e avaliar a motilidade

▪ Palhetas de 0,5ml – 30 segundos em água a 35-37oC

▪ Palhetas de 0,25ml – 20 segundos em água a 35-37oC

 Avaliação após a congelação

Controle de qualidade (mínimo 20% motilidade e vigor 2):

- TT lento (370C/4h)
- TT rápido (460C/30minutos)
mnichi@usp.br