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Núcleo de Aprimoramento Científico

APOSTILA BIOLOGIA
MOLECULAR

2017
Integração entre os conceitos práticos e
teóricos para um trabalho em bancada
Resumo

Essa apostila foi elaborada com informações que serão úteis durante os seguintes
cursos do NAC: Fundamentos da Biologia Molecular e Técnicas em Biologia
Molecular I, II e III. Nela estão informações fundamentais da biologia molecular
para aplicação da prática do dia a dia laboratorial. Utilize-a sem moderação!
Bons estudos!

Prof. Dr. Lauro Thiago Turaça

Ibstruç
Técnicas em Biologia Molecular – Nível 1

INFORMAÇÕES
Para mais informações clique sobre as palavras GRIFADAS OU DESTACADAS em azul.
Através delas o NAC indica alguns links externos, em que você encontrará artigos científicos,
informações adicionais, aulas, curiosidades, entre outros. Além disso, faça a leitura e assista
as videoaulas da plataforma do NAC

Módulo 1
Introdução a Biologia Molecular

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

O Dogma Central da Biologia Molecular foi postulado por Francis


Crick em 1958. Esse modelo mostra que uma proteína pode ser formada
a partir de um fragmento de DNA (que veremos mais para frente, os
denominados genes). Dessa forma, Crick mostrou com o ocorre o fluxo de
informações do código genético. Segundo esse dogma, o fluxo da
informação genética segue o seguinte sentido: DNA → RNA →
PROTEÍNAS. Além disso, sabemos também que o contrário, ou seja, o
fluxo da informação proteína → DNA não é possível.

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A REPLICAÇÃO - DUPLICAÇÃO

A molécula de DNA passa por um processo de duplicação. Esse


processo é semi-conservativo, pois a dupla fita de DNA precisa se
separar para ser duplicada, mas as novas moléculas criadas conterão
uma das fitas do DNA inicial, ou seja: cada DNA criado terá uma fita
nova e outra antiga (do DNA original), sendo, portanto, um processo
semi-conservativo (o DNA novo conserva uma das duas fitas do DNA
original).
A replicação do DNA se inicia com a quebra das ligações de
hidrogênio que une as bases nitrogenadas do DNA. Nesse momento,
outros nucleotídeos aproximam-se de cada fita-molde e inicia o
pareamento entre A-T e G-C, resultando em duas novas moléculas de
DNA, que são idênticas à molécula inicial. É desse modo que o DNA é
duplicado (replicado).
Há inúmeras enzimas que participam do processo, como a DNA
polimerase (que promove a ligação dos nucleotídeos), a
topoisomerase (que tem função de quebrar ligações do DNA e também
restaurá-las) e a DNA ligase, que liga certos fragmentos de DNA

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(chamados fragmentos de Okasaki) ao longo da replicação (Para mais


informações veja o conceito teórico em Fundamentos da Biologia
Molecular I).

A TRANSCRIÇÃO

A transcrição ocorre quando um RNA se forma a partir do DNA.


A enzima responsável pela transcrição chama-se RNA Polimerase, que a
partir de uma das fitas de DNA consegue elaborar a fita de RNA.
Diferentemente do DNA (que é uma estrutura em forma de fita dupla), o
RNA tem apenas uma única fita.

A TRADUÇÃO (SÍNTESE DE PROTEÍNAS)

Para entendermos a tradução, nós precisamos saber primeiro


quais são os tipos de RNA:

1. RNA de transferência ou Trna


2. RNA mensageiro ou mRNA
3. RNA ribossômico ou rRNA

O RNA TRANSPORTADOR

É a menor molécula das três e sua função é a de carrear e


combinar os aminoácidos que constituirão as novas proteínas. Eles se
combinam com os aminoácidos e reconhecem as bases presentes no RNA
mensageiro, que deverão ser pareadas com estes. As sequências
reconhecidas pelo tRNA são chamadas códons, e são grupos de três

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bases nitrogenadas. As sequências que pareiam com os códons são


chamadas anticódons. Cada trinca ou códon corresponde a um
aminoácido, como vimos na vídeo aula anterior.

O RNA mensageiro
Tem a função de transcrever a informação contida em um
segmento de DNA. Seu tamanho e peso variam de acordo com o tamanho
da molécula proteica final. O mRNA é composto por duas extremidades:
a cauda Poli A e a cauda cap. Seu percurso é sair do núcleo já
portando as informações necessárias à síntese e dirigir-se ao citoplasma.

By MRNA_structure_fr.svg: *MRNA_structure.svg: Daylite derivative work: Fdardel (talk) derivative work: Nossedotti
(MRNA_structure_fr.svg) [Public domain], via Wikimedia Commons

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O RNA ribossômico

Este tipo corresponde a cerca de 80% dos tipos de RNA e ele se


encontra unido a proteínas, formando os ribossomos. Estes últimos,
quando ligados ao RNA mensageiro são chamados
de polirribossomos, onde ocorrerá a síntese proteica.

O processo de fabricação de proteínas ("tradução", ou "síntese


de proteínas", ou então "síntese proteica") ocorre no citoplasma após
a saída do mRNA do núcleo, que se dirige aos rRNAs. Os ribossomos do
rRNA terão a função de traduzir em proteínas a mensagem do DNA
carreada pelo tRNA e transcrita pelo mRNA inicialmente.

Por LadyofHats Translation: Nossedotti (Anderson Brito)


(File:Ribosome_mRNA_translation_en.svg) [Public domain], undefined

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Passos da tradução:

1) Saída do mRNA do núcleo portando determinado número de


códons (aminoácidos) e dirigindo-se ao citoplasma;

2) Já no citoplasma, um ribossomo se liga ao mRNA, num códon


inicial (há um códon específico que indica o início da leitura).
Logo chegam tRNAs portando determinados anticódons
(aminoácidos), que se ligam também ao ribossomo e pareiam
suas trincas de bases com o mRNA;

3) Ocorre, então, a primeira ligação entre os aminoácidos


presentes no tRNA e no mRNA (é a chamada ligação
peptídica). Assim que ela ocorre, o ribossomo se desloca ao
longo do mRNA e outro tRNA liga-se ao mRNA. Assim segue a
tradução, com o ribossomo se deslocando a medida em que
chegam outros aminoácidos e até que surja um códon de
parada, que indica o fim da tradução;

4) Quando o códon de parada aparece, o tRNA e o ribossomo se


desligam do primeiro peptídeo formado, que ficará livre no
citoplasma. Esse peptídeo será usado para inúmeras funções
da célula e nada impede, também, que outros ribossomos
surjam recomeçando a síntese de um peptídeo maior, até
formar uma proteína.

Obs.: Costuma-se chamar peptídeo as moléculas formadas por até 100

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aminoácidos e apenas quando ultrapassa esse número, é que chamam a molécula de


proteína. Alguns autores, porém, podem denominar proteínas algumas moléculas com
menos de 100 aminoácidos.

Moreira, C. (2010), WikiCiências, 1(9):0093

Módulo 2
Noções básicas de gene

No módulo 2 você verá os seguintes conceitos que são


fundamentais para o entendimento das denominações que envolvem as
propriedades dos genes.

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• Exons
• Introns
• Splicing Alternativo
• Promotores, Enhancers e Silenciadores
• Direções das transcrições
• Conservação

Orientação de gene e transcrição

Por convenção, a orientação do gene é determinada pela cadeia


de codificação. Assim, o início de um gene é chamado de
extremidade 5' e o fim de um gene é chamado de 3'. Note na figura a
seguir que na mesma região existem dois genes que são transcritos
em sentidos opostos: o gene WRAP53 para a direita e o gene P53 para
a esquerda.

O que são exons?

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Os exons são partes do DNA que são convertidas em RNA


mensageiro maduro (mRNA). O processo pelo qual o DNA é usado como
um modelo para criar mRNA é chamado de transcrição. Este mRNA então
sofre um processo adicional chamado tradução em que o mRNA é usado
para sintetizar proteínas, através de outro tipo de molécula chamada
RNA de transferência (tRNA).

O que são introns?

Introns são partes de genes que não codificam diretamente para


proteínas.

Onde estão encontrados introns?

Introns são comumente encontrados em eucariotas multicelulares,


como os seres humanos. Eles são menos comuns em eucariotas unicelulares,
como leveduras, e ainda mais raras em bactérias.

Como os íntrons são removidos?

Os introns estão presentes na transcrição inicial do RNA, conhecida


como pré-mRNA. Eles precisam ser removidos para que o mRNA possa
direcionar a produção de proteínas. O pré-mRNA, portanto, sofre um
processo, conhecido como splicing, para criar mRNA maduro. É necessário
que os introns sejam removidos precisamente, caso contrário, pode
resultar em uma proteína defeituosa.

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Uma ótima maneira de lembrar isso é fazer uma regra de prefixo


das palavras:

- INtron – INtervenientes (ou seja, sequência que intervém ou deve


ser retirada da sequência do RNA mensageiro).
- EXon - sequências EXpressas (codificam e permitem a Expressão
de proteinas).

Splicing de RNA

O processamento de RNA ocorre em locais de emenda especiais.


Estes tendem a começar com o dinucleotideo GU na extremidade 5'
e AG na extremidade final 3'. O processo é realizado por pequenas
ribonucleoproteínas nucleares (snRNPs). Eles se ligam às extremidades 5
'e 3' do intron e fazem com que ele forme um loop. O intron é então
removido da sequência e os dois exons restantes estão ligados entre si.

By Qef [Public domain], via Wikimedia Commons

Splicing alternativo

O splicing alternativo refere-se à forma como diferentes


combinações de exons podem ser unidas. Essa ideia foi apresentada

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pela primeira vez por Walter Gilbert. Ele propôs que as diferentes
permutações de exons pudessem produzir diferentes isoformas de
proteínas. Essas, por sua vez, teriam diferentes atividades químicas e
biológicas. Observe na imagem a seguir três proteinas diferentes sendo
formadas pelo mesmo gene.

National Human Genome Research Institute

Curiosidades:
Estudos indicam uma média de 9 exons e 8 introns por gene em
seres humanos.
Estudos indicam que o número de introns que os genes de um
organismo contém é positivamente relacionado à sua complexidade.
De 30 a 60% dos genes humanos são submetidos a splicing
alternativo. Isso indica que muitas doenças genéticas estão ligadas a
alterações genéticas que causam erros de splicing que por sua vez
causam proteínas defeituosas.

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Um exemplo de um gene humano que sofre de splicing


alternativo é o da fibronectina. Mais de 20 diferentes isoformas de
fibronectina foram descobertas. Todos estes foram produzidos a partir
de diferentes combinações de exons do gene da fibronectina.

Promotores

Um promotor é uma região reguladora do DNA localizado


geralmente na região 5' de um gene, fornecendo um ponto de controle
para transcrição de genes reguladora. O promotor contém sequências
de DNA específicas que são reconhecidas por proteínas conhecidas como
fatores de transcrição. Estes fatores se ligam às sequências do promotor,
recrutando a RNA polimerase para realizar a transcrição.

Promotores procarióticos

Nos procariotos, o promotor consiste em duas sequências curtas a


-10 e a -35, ou seja, localizadas a 10 e 35 bases de distância do início
da transcrição de um gene.
A sequência em -10 é chamada de caixa Pribnow, ou o elemento
-10, e geralmente consiste nos seis nucleotídeos TATAAT. A caixa Pribnow
é absolutamente essencial para começar a transcrição em procariotos.
A outra sequência em -35 pares de base antes do início da
transcrição geralmente consiste nos seis nucleotídeos TTGACA. Sua
presença permite uma taxa de transcrição muito alta.

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Promotores eucarióticos

Os promotores eucarióticos são muito diversos e são difíceis de se


caracterizar. Eles geralmente se encontram antes de um gene e podem
ter elementos regulatórios de várias kilobases (kilo = mil) antes do local
de início da transcrição.
Muitos promotores eucarióticos, contêm uma caixa TATA
(sequência TATAAA), que se liga a uma proteína de ligação TATA e que
por sua vez auxilia na formação do complexo transcricional da RNA
polimerase.

Enhancers

Em alguns genes eucarióticos, existem regiões que ajudam a


aumentar a taxa de transcrição. Essas regiões, chamadas
deintensificadores ou enhancers, não estão necessariamente próximos de
um gene. Eles podem estar localizados dentro da região de codificação,
a montante (antes) ou a jusante (depois) de um gene, ou ou até mesmo
estar a milhares de nucleótidos de distância.
Veja um exemplo na imagem a seguir que o enhancer, constituído
por pequenas sequências de DNA chamadas elementos de controle
distal, interage com proteínas mediadoras e fatores de transcrição.
Quando uma proteína de aderência de DNA se liga ao Enhancers,
a forma do DNA muda, o que permite interações entre
osativadores e Fatores de transcrição.

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Na figura ao lado observe como o enhancer permite o


dobramento da fita de DNA e agrupa a maquinaria de transcrição,
acentuando a transcrição:

Clique no link e veja ao estudo de alguns enhancers neste artigo


da revista Nature: Transcriptional enhancers: from properties to genome-
wide predictions. Aqui você pode visualizar alguns enhancers e suas
disposições na fita de DNA.

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Silenciadores

Os silenciadores são sequências de DNA podem ser encontrados


a montante (no inicio), a jusante (no fim), ou dentro do gene de interesse.
Quando os repressores se ligam a silenciadores (ver a seguir), eles atuam
de forma semelhante aos potenciadores e se inclinam para evitar a
interação da RNA polimerase com os promotores. Isso silencia o gene e,
portanto, o gene não será expresso na célula.

Repressores

Na genética molecular, um repressor é uma proteína que ao se


ligar a silenciadores associados a determinado gene inibe sua
expressão. Um repressor de ligação ao DNA bloqueia a ligação da RNA
polimerase ao promotor, evitando assim a transcrição dos genes . Um
repressor ainda pode se ligar a um RNA evitando a tradução do mRNA
para a proteína. Esse bloqueio de expressão é chamado de repressão.

Veja na figura a seguir a disposição desses elementos em um


gene. Note que em ambas as regiões 5' ou 3' observamos a presença de
alguns elementos como os Enhancer e silenciadores.

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Veja abaixo uma Distribuição de algumas regiões importantes


dentro ou próximas de um gene (uma perspectiva)

Curiosidades

Em um estudo recente utilizou um novo oligonucleótido anti-


sense (pequena sequência de DNA que está no sentido contrário de
uma transcrição) com funções sobre um silenciador. Ela por sua vez
inibiu a produção uma de proteína mutante que causa uma doença
conhecida como Huntington e provou ser eficaz e seguro ao tratar
animais. O primeiro teste da droga em pessoas com a doença está em
andamento. Os estudos estão sendo coordenados pelo cientista Blair
R. Leavitt, MD , da Universidade da Colúmbia Britânica.

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Módulo 3
Rastreando genes (plataforma Ensembl)

Na videoaula a seguir veremos uma introdução a uma das


plataformas de biologia molecular disponíveis na internet. Utilizaremos
o banco de dados do site ensembl. Com base no que vimos nos módulos
anteriores vamos rastrear alguns genes nesta plataforma e identificar
algumas características apresentadas em cada um. Existem muitas
plataformas online disponíveis atualmente, sendo algumas mais
específicas e outras mais gerais. A plataforma ensembl é de grande
utilidade quando precisamos realizar algumas tarefas básicas in silico,
isto é, de forma computacional, como:
a. Descobrir a sequência de um gene
b. Identificar as anotações realizadas por pesquisadores
em determinado gene
c. Desenhar um primer
d. Localizar alterações já descritas em determinado gene

Assista a seguir uma prévia da plataforma na videoaula. Todas


as ferramentas computacionais são abordadas no curso de Manipulação
Molecular em Softwares - nível avançado

Após assistir acesse o link a seguir e realize os mesmos


procedimentos para alguns genes diferentes. Observe e explore todas
as características de cada gene. Note que para cada um observamos
regiões e características diferentes. Utilize códigos de genes que você já
está familiarizado. Como opção disponibilizamos alguns códigos de

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genes humanos para você utilizar em seus estudos caso não possua:

Módulo 4
O que são primers

No módulo 4 veremos um elemento, conhecido como primer, que é


fundamental para algumas técnicas em biologia molecular como a PCR
e o sequenciamento de DNA.
Para isso a videoaula foi divida com as duas informações básicas
de:

a. Funções dos primers


b. Primers e suas características

Como vimos na videoaula, primers ou iniciadores são segmentos

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ou oligonucleotídeos de ácidos nucléicos necessários à iniciação da


replicação do DNA. Um iniciador é uma cadeia curta de RNA ou DNA
(geralmente cerca de 18-22 bases) que serve como ponto de partida
para a síntese de DNA. É necessário para a replicação do DNA porque
as enzimas que catalisam este processo, as polimerases de DNA, só
podem adicionar novos nucleótidos a uma cadeia de DNA existente, que
no caso, são os primers. A polimerase realiza a replicação no sentido 5'
--> 3'.
Muitas técnicas de laboratório in vitro utilizam primers de DNA
como iniciadores de reações como sequenciamento de DNA e a reação
em cadeia da polimerase -PCR). Em experimentos, muitas vezes é
importante usar o primer Sense e antisense com uma temperaturas de
melting (ou seja, temperatura quando o primer se liga ao DNA) próximas.
Veja a seguir que os primers possuem assim como o DNA uma
orientação 5' -> 3' que indica o sentido da transcrição:

By Zephyris (Own work) [CC BY-SA 3.0

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Em PCR , os iniciadores são utilizados para determinar o fragmento de


DNA a ser amplificado pelo processo. A extensão de um iniciador pela
polimerase leva a um aumento exponencial no segmento alvo.
Vale ressaltar que os primers nem sempre são para síntese de DNA,
mas podem também serem usados por polimerases virais, por exemplo,
influenza, para síntese de RNA.

Módulo 5
PCR convencional e PCR em tempo Real

Após revermos alguns conceitos teóricos vamos abordar algumas


técnicas que fazem parte da rotina laboratorial no campo da Biologia
Molecular. Para isso iniciaremos através da videoaula os tópicos a seguir
que se basearão na Reação em Cadeia da Polimerase -PCR:

PCR convencional

• Fundamentos da PCR convencional


• Componentes da reação
• Fundamentos da amplificação
• Temperaturas ótimas
• Platô

PCR real time

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(tópico abordado de maneira aprofundada no curso nível 2)

• Fundamentos do PCR real time


• Exemplos de amplificação
• Controles negativos
• Aplicação do PCR real time na descoberta do sexo fetal

Módulo 6
Transcrição reversa in vitro

A transcrição reversa in vitro é uma reação que envolve uma


ampla família de enzimas chamadas transcriptases reversas que
desempenham um papel único no fluxo de informações genéticas. Desde
a sua descoberta, os pesquisadores usaram essas enzimas como
ferramentas fundamentais em uma ampla gama de aplicações de
biologia molecular.
O dogma central original da biologia molecular sustentou que o
DNA foi transcrito para o RNA, que por sua vez foi traduzido em
proteína. No entanto, este conceito foi desafiado na década de 1970,
quando duas equipes científicas, uma liderada por Howard Temin na
Universidade de Wisconsin e outra liderada por David Baltimore no MIT,
identificaram de forma independente novas enzimas associadas à
replicação de vírus de RNA chamados retrovírus. Essas enzimas convertem
o genoma de RNA viral em uma molécula de DNA complementar (cDNA),
que então é capaz de se integrar no genoma do hospedeiro. Estas são
polimerases de DNA dependentes de RNA e são chamadas de

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transcriptase reversa porque, em contraste com o fluxo de DNA-RNA do


dogma central, eles transcrevem modelos de RNA para moléculas de
cDNA. Para um melhor entendimento de como a transcrição reversa
ocorre assista a vídeo aula a seguir e acesse os links desse módulo para
estudos complementares. Na vídeo aula a seguir você verá os seguintes
tópicos:

Fundamentos da transcrição reversa


Aplicações
Primers oligo dT e Random primer

No vídeo a seguir observe uma estrutura em 3D da transcriptase


reversa e seus subdomínios:
link

No vídeo a seguir observe como age a enzima transcriptase


reversa. É utilizado como modelo a ação do AZT que é similar a uma
Timina porém quando é adicionado a reação da transcrição reversa a
reação pára e a propagação do HIV pára no organismo. AZT é um dos
tratamentos para portadores do vírus da AIDS porém note que se o
portador possuir um vírus com a transcriptase reversa resistente ao AZT
a transcrição reversa não é interrompida e a propagação do HVI
continua:
Link

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Exemplo de Protocolo

Veja a seguir um exemplo de protocolo padrão para realizar uma


transcrição reversa. Note que o template nesse caso é o RNA ao invés de
DNA como na PCR. No caso, M-MuLV RT é a transcriptase reversa usada
nesse caso e os Inhibidor de RNase auxilia na não degradação do RNA
ao inibir RNAses.

Protocolo

1. Descongele os componentes no gelo e misture, invertendo várias vezes.


2. Misture os seguintes componentes e incube a 42 ° C ** durante 1 hora.

COMPONENTE VOLUME

Template RNA Até 1 μg *

Random primer ou oligo dT


2 μl
(60uM)

Tampão 10X 2 μl

M-MuLV RT (200 U / μl) 1 μl

DNTP 10 mM 1 μl

Inhibidor de RNase (40


0,2 μl
U/μl)

H2O livre de nucleases Para um


volume total de 20 μl

* 1 ng-1 μg de RNA total


** A Transcriptase reversa M-MuLV pode ser utilizada de 37 ° a 42 ° C.

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3 - Inative a enzima a 65 ° C durante 20 minutos. Para aplicação de PCR


após a transcrição reversa, o volume de produto de cDNA não deve
exceder 1/10 do volume de reação de PCR.

Veja uma lista de protocolos diferentes que podem ser


realizados através do link a seguir:
Link

VISÃO GERAL DAS APLICAÇÕES

Após a descoberta da ação da Transcriptase reversa diversas


aplicações começaram a ser utilizadas nos laboratórios de biologia
molecular. Veja a seguir as diversas aplicações que podem ser usadas a
transcrição reversa:

Reação em cadeia da polimerase após a transcrição reversa (RT-PCR)

Na RT-PCR, uma população de RNA é convertida em cDNA por


transcrição reversa (RT) e, em seguida, o cDNA é amplificado pela
reação em cadeia da polimerase (PCR). O passo de amplificação de
cDNA oferece oportunidades para estudar mais as espécies originais de
RNA, mesmo quando elas são limitadas ou expressas em baixa
abundância. As aplicações comuns de RT-PCR incluem a detecção de
genes expressos, o exame de variantes de transcrição e a geração de
modelos de cDNA para clonagem e sequenciamento.

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RT-PCR quantitativa (RT-qPCR)

Uma das aplicações mais comuns da RT-PCR quantitativa (RT-qPCR) é


a análise quantitativa dos níveis de mRNA ao longo do tempo, através de
células e tecidos, ou após um evento (por exemplo, tratamento
medicamentoso). Devido a uma maior sensibilidade do que RT-PCR, RT-qPCR
também é amplamente utilizado para examinar a presença de retrovírus
(vírus RNA) em amostras de pesquisa. Semelhante ao fluxo de trabalho de
RT-PCR, o RNA é primeiro convertido em cDNA, que é amplificado pela PCR.
A principal diferença, no entanto, é que os níveis de cDNA amplificado são
medidos por fluorescência em tempo real durante a fase exponencial da
amplificação (assunto aprofundado no curso Técnicas em Biologia Molecular
II). O nível de amplificação é usado como base para quantificar os alvos
originais dentro da população de RNA.

Clonagem de cDNA e construção de biblioteca

Uma das primeiras aplicações da transcriptase reversa em biologia


molecular foi a construção de bibliotecas de cDNA. Uma biblioteca de cDNA
consiste em clones de cDNA que representam as sequências transcritas dentro
de uma amostra específica. Portanto, uma biblioteca fornece informações
sobre a expressão temporal e espacial de genes para um determinado tipo
de célula, órgão ou estágio de desenvolvimento, por exemplo.

Ampliação rápida de extremidades de cDNA (RACE)

A amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE) é um método

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baseado em PCR para determinar sequências desconhecidas nas


extremidades 5 'e 3' de um determinado cDNA. Estes métodos são comumente
conhecidos como 5 'RACE e 3' RACE, respectivamente. Os objetivos
experimentais da RACE incluem identificação de regiões não traduzidas de 5
'e 3', pesquisa de locais de início de transcrição, caracterização de regiões
promotoras e determinação de sequências completas de cDNA.

Microarrays de expressão de genes

Os microarrays consistem em milhares de câmaras, conhecidas como


"características" ou "manchas", em bolachas de vidro ou de silício. Cada
característica contém, imobilizado na sua superfície, cópias idênticas de uma
seqüência de DNA de cadeia simples chamada "sonda", que representa um
gene. As sondas se hibridam com alvos de cDNA marcados com fluorescência
e que são aplicados ao microarray, permitindo uma comparação simultânea
da expressão gênica entre duas amostras.

As sondas de microarray são geradas a partir de sequências conhecidas do


genoma ou cDNA de um organismo. Por exemplo, a PCR pode ser utilizada
para fazer cópias de cada gene conhecido, cujos produtos são então
desnaturados em DNA de cadeia simples e marcados em um chip como
sondas. Alternativamente, os oligonucleótidos de 20-60 nucleotídeos podem
ser sintetizados diretamente em um chip como sondas de microarray.

Seqüenciamento de RNA (RNA-Seq)

O seqüenciamento de RNA, ou RNA-Seq, é comumente realizado para

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obter informações sobre RNAs transcritos do genoma e sua regulamentação.


Com o advento da sequenciação da próxima geração (NGS), o RNA-Seq
tornou-se uma abordagem de alto rendimento para a análise de:
Transcriptoma inteiro (todas as fitas que foram transcritas de
determinado organismo.

Determinação da expressão gênica.

Descoberta de Variantes de junção e transcrições de fusão e detecção


de genes de baixa abundância.

Módulo 7
Sequenciamento de DNA
O sequenciamento de DNA é o processo de leitura dos nucleótidos
presentes nas moléculas de DNA ou RNA. Existem dois tipos de
tecnologias de sequenciamento que são usadas atualmente:
sequenciamento de Sanger e sequenciamento de próxima geração .
Cada uma dessas tecnologias possui utilidades diferentes no ambiente
de análise genética de hoje.
Sanger é o método desenvolvido pelo bioquímico britânico Dr.
Frederick Sanger na década de 1970. Este método envolve a cópia de
DNA de cadeia simples com bases quimicamente alteradas chamadas
didesoxinucleótidos que, quando incorporadas na extremidade 3 'da
cadeia de crescimento, terminam a cadeia de forma seletiva em A, C, G
ou T. As cadeias terminadas são então resolvidas por capilar
Eletroforese.

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A sequenciação de próxima geração (NGS) utiliza sequenciações


massivamente paralelas para gerar milhares de megabases de
informações de sequência por dia. As técnicas de próxima geração são
baseadas em um princípio de "sequenciamento por síntese", onde os
nucleotídeos incorporados a uma cadeia de DNA fornecem um sinal único.
Na maioria das tecnologias NGS, o sinal exclusivo é uma molécula
fluorescente. No entanto, com a tecnologia de sequenciação Ion Torrent
™ de próxima geração , o sinal está na forma de uma mudança de pH,
eliminando a necessidade de detecção baseada na luz.
Nesse módulo vamos nos focar na metodologia de Sanger, para
isso assista a video aula a seguir:

A reação de sequenciamento é um método simples em que


rodadas sucessivas de desnaturação, anelamento e extensão em um
termociclador (assim como em um PCR) resultam em uma amplificação
linear (já que não possui somente um primer por well) de produtos de
extensão de DNA. Os produtos são então injetados em um capilar para
separação eletroforética.

Sequenciamento com nucleotídeos marcados

A sequenciamento de DNA fluorescente é realizado com uma


marcação diferente a cada um dos quatro ddNTPs. Os reagentes
necessários para uma reação de sequenciamento são: DNA, primer,
tampão, os quatro dNTPs, os quatro ddNTPs marcados fluorescentemente
e a Polimerase. Os fragmentos marcados com fluorescência são gerados
pela incorporação dos ddNTP marcados com corante na sequência.

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Todos os fragmentos terminados (aqueles que terminam com um ddNTP),


portanto, contêm um corante na extremidade 3'. Os fragmentos são
então separados por eletroforese capilar.

Eletroforese capilar

Durante a eletroforese capilar, os produtos da reação de


sequenciamento do ciclo são injetados eletroquimicamente em capilares
cheios de polímero. A alta tensão é aplicada para que os fragmentos de
DNA carregados negativamente se movam através do polímero nos
capilares em direção ao eletrodo positivo. A eletroforese celular pode
separar as moléculas de DNA que diferem em peso molecular por
apenas um nucleotídeo.
Pouco antes de alcançar o eletrodo positivo, os fragmentos de
DNA marcados de forma fluorescente, separados por tamanho, se
movem através do caminho de um raio laser. O raio laser faz com que
os corantes dos fragmentos fluoresçam. Um dispositivo de detecção
óptica em um analisador genético detecta o sinal de fluorescência.

Software

O software de coleta de dados do sequenciador converte o sinal


de fluorescência em dados digitais e registra os dados em um arquivo
de extensão *.ab1. Como cada corante emite luz em um comprimento de
onda diferente quando excitado pelo laser, todas as quatro cores e,
portanto, todas as quatro bases, podem ser detectadas e distinguidas
em uma injeção capilar.

Prof. Dr. Lauro Thiago Turaça

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