ANÁLISES TOXICOLÓGICAS

Wanderley Pinheiro de Holanda Júnior

Perito Legista Classe Especial
Farmacêutico Bioquímico
NUTOF/CALF/PEFOCE
 Declaração de conflito de interesse e outras
providências
Eu, Wanderley Pinheiro de Holanda Júnior, responsável por
esta apresentação, declaro que não tenho conflito de
interesse ordem pessoal, comercial, acadêmico pela
utilização de slides, imagens ou vídeos produzidos pela
empresas Agilent, Thermo, Randox dentre outras
empresas por venturas não declaradas aqui. E que as
mesmas não são responsáveis por quaisquer danos
resultantes de ou em conexão com o seu uso, cópia ou
divulgação dos materiais contidos nestes e que a utilização
aqui é exclusivamente para fins de ensino. documento
 ANÁLISE TOXICOLÓGICA

• A Toxicologia forense está intimamente ligada

às Análises Toxicológicas

– análises químicas capazes de quantificar e/ou

identificar substâncias que causem efeitos tóxicos
no organismo (CASARETT, 2007).
 ANÁLISE TOXICOLÓGICA

• A Toxicologia forense está intimamente ligada

às Análises Toxicológicas
– objetivo de detectar e identificar agentes tóxicos
em material biológico ou em materiais diversos
como água, alimentos, medicamentos e “drogas”
que estejam envolvidos em ocorrências
policiais/legais (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO,
2008)
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
 Finalidade das Análises Toxicológicas
• ANÁLISES TOXICOLÓGICAS:
• Forenses
• de Urgências
• de Alimentos
• Controle da Dopagem
• de Monitorização do Grau de Exposição
– Monitorização Biológica da Exposição Ocupacional
– Monitorização Ambiental
– Monitorização Terapêutica
– Monitorização Fármacodependência
 Toxicologia Forense

• Iniciam-se por um teste geral “screening”

– detecta um grande número de substâncias,
permitindo fazer uma triagem de casos negativos

E os positivos?
• Métodos de confirmação
– permitem confirmar a presença de substância
suspeita, bem como identificá-la e/ou quantificá-
la
 Análises Toxicológicas
AMOSTRA
• selecionar amostra que melhor represente a
biodisponibilidade, a excreção ou o efeito do toxicante
no organismo.
• esclarecimento de intoxicação letal —vísceras, sangue, urina,
etc.
• análise toxicológica de urgência —sangue, urina, líquido de
diálise, líquido de lavado gástrico, vômito, restos alimentares
e de medicamentos
 As três principais etapas da análise toxicológica
sistemática
Preparação das Diferenciação Identificação
amostras /Detecção •Comparar os resultados
com diretamente com
•Homogeneização, digestão, •Testes colorimétricos
hidrólise material de referência
•Espectroscopia derivado ou a partir de dados de /
•Microdifusão
•Imunoensaios “impressão digital”
•Headspace
•TLC com reações UV / cor composto autêntica
•Extração líquido-líquido
•Extração em fase sólida •GC com um ou mais:
•Extração com fluido •FID, NPD, MS, etc
supercrítico •HPLC com uma ou mais:
•Cromatografia de •UV, DAD, MS, etc
imunoafinidade
•Derivatização
 Marcha Toxicológica
AMOSTRA
Analitos, metabolitos (se houver) e
compostos endógenos

DETECÇÃO
(Seletividade Variável)
quantificação

A análise direta
(Imunoensaio)
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
“Clean-up” (Seletividade e
concentração)

Cromatografia (seletividade)
 Toxicologia Forense
IMUNOCROMATOGRAFIA

• QUAL TIPO DE AMOSTRA

• URINA
 Toxicologia Forense
RESULTADO

AMP NEG
COC +
THC +
MET NEG
OPI NEG
PCP NEG AUSÊNCIA DA LINHA
CORRESPONDE AO
BZO NEG POSITIVO
TCA NEG
BAR NEG
MDMA NEG
MTD NEG
MOP NEG
 Exame Toxicológico de Triagem
(Screening)

 Metodologia: (Cocaína)
 Imunoensaio
enzimático;
 Competitivo;
 Quimioluminescente;
 Semi-quantitativo.
Exame toxicológico de Triagem (Screening)
 Drogas de abuso que podem ser identificadas:

Anfetaminas;
No caso em análise, a triagem
Metanfetaminas; apresentou os seguintes resultados:
Barbitúricos;
 Cocaína = > 176 ng/mL
Benzodiazepínicos;
Cocaína;  Metanfetamina = 233 ng/mL**
THC;  Anfetamina = 276 ng/mL**
Opiáceos;
Ecstasy (MDMA);
Fenciclidina ;
Buprenorfina;
Metadona;
Antidepressivos Tricíclicos.
 Exame toxicológico de Triagem -
Screening

 Metodologia: (Cocaína)
 Imunoensaio enzimático;
 Competitivo;
 Quimioluminescente;
 Semi-quantitativo.
 Análises Toxicológicas

• Cromatografia:
– Técnica de separação, identificação e
quantificação das espécies químicas

– Podem ser acoplado a espectrofotometria por

absorção no visível e ultravioleta ou a
espectrometria de massas.
 Cromatografia

• As diferentes formas de cromatografia podem ser

classificadas considerando- se diversos critérios:
1. Classificação pela forma física do sistema
cromatográfico
2. Classificação pela fase móvel empregada
3. Classificação pela fase estacionária utilizada
4. Classificação pelo modo de separação
 Toxicologia Forense

• Tipos de cromatografia como:

– Cromatografia em papel
– Cromatografia em Camada Delgada (CCD ou TLC)
– Cromatografia em Coluna
– Cromatografia gasosa (CG)
– Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
MÉTODOS DE SEPARAÇÃO
CROMATOGRÁFICOS
 Cromatografia

• A cromatografia envolve uma série de processos de separação

de misturas, acontece pela passagem de uma mistura através de
duas fases: uma estacionária (fixa) e outra móvel.
• A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é
influenciado por diferentes forças intermoleculares, incluindo
iônica, bipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e
solubilidade.
 Cromatografia

• A cromatografia pode ser utilizada para a identificação

de compostos, por comparação com padrões
previamente existentes, para a purificação de
compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e
para a separação dos componentes de uma mistura.
 Cromatografia em camada delgada
(CCD)
Pó suspeito (25mg)

Metanol

Aplicação de ‘spots’
na placa de sílica

Eluição
(Metanol:Amônia)

Revelação da placa
com Dragendorff e/ou
Iodo Platinado
 Cromatografia gasosa
• Em cromatografia gasosa, a fase em movimento (ou "fase móvel") é
um gás transportador, normalmente um gás ´inerte tal como o hélio ou um
gás não reativo tal como o nitrogênio.
• A fase estacionária é uma camada microscópica de líquido ou polímero sobre
um sólido inerte, dentro de uma peça tubular
de vidro ou metal chamada coluna.
• O instrumento usado para realizar a cromatografia gasosa é
chamado cromatógrafo a gás
• Os compostos gasosos sendo analisados interagem com as paredes da coluna, a
qual é revestida com diferentes fases estacionárias. Isto causa que cada
composto "elui" a um tempo diferente, conhecido como tempo de retenção do
composto. A comparação de tempos de retenção é que dá o CG sua eficiência
analítica.
 Cromatografia gasosa

• Cromatografia gasosa é em princípio similar à cromatografia em

coluna, HPLC, TLC.
• O processo de separação dos compostos em uma mistura é carregada
entre uma fase líquida estacionária e uma fase de gás em movimento,
enquanto na cromatografia em coluna a fase estacionária é um sólido
e a fase móvel é um líquido.
• A coluna através da qual a fase gasosa passa é localizada em
um forno onde a temperatura do gás pode ser controlada, enquanto a
cromatografia em coluna (tipicamente) não possui qualquer controle
de temperatura. Em terceiro lugar, a concentração de um composto na
fase gás é unicamente uma função da pressão de vapor do gás.
 HPLC
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência' (CLAE,
em inglês: High Performance/Pressure Liquide
Chromatography, HPLC) é uma técnica cromatográfica.
– O uso de pressões elevadas permite uma redução no
diâmetro das partículas da fase estacionária, localizada no
interior da coluna cromatográfica.

• O uso de partículas menores (na ordem de 5,0 µm) no

recheio da coluna resulta em uma área superficial, o
sítio de adsorção maior, o que promove uma separação
mais eficiente dos componentes da amostra.
– Essa "miniaturização" das partículas da coluna permite o uso
de colunas menores, volumes menores de amostras e um
gasto menor de fase móvel. Assim sendo, em cromatografia
líquida de alta eficiência trabalha-se na faixa dos microlitros
(µL).
 HPLC
• O advento dessa técnica analítica só foi possível
graças à produção de cromatógrafos líquidos
totalmente automatizados (embora mesmo hoje
ainda exista cromatógrafos que não oferecem opção
de injeção automática de amostragem).
• As bombas de fase móvel permitem o trabalho
geralmente na faixa média de 2.500 psi.
• Hoje em dia são oferecidos, também as máquinas da
chamada CLUE - Cromatografia Líquida de Ultra
Eficiência (Em inglês, UPLC)
– trabalham com partículas de colunas ainda menores (até
0,01 µm) e pressões ultra-elevadas (da ordem de 15.000
psi).
 Conceitos básicos de
cromatografia gasosa:
Teoria

DESENVOLVENDO
UMA CIÊNCIA MELHOR
AGILENT E VOCÊ

Apenas para finalidades de ensino

01 April 2021
© Agilent Technologies, Inc. 2016
28
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Apenas para finalidades de ensino

01 April 2021
© Agilent Technologies, Inc. 2016
29
Introdução Academic - Agilent Technologies
Separação de compostos Número da publicação: 5991-5422EN

Tempo t

Fluxo de gás de arraste

Separação tr2-tr1
Largura de pico Wb1,2

Os compostos são separados por suas afinidades diferentes com a coluna

durante a fase estacionária. Os compostos com menos afinidade eluirão
da coluna mais rapidamente; os componentes com maior afinidade
eluirão depois.
ToC
 Principais parâmetros Academic - Agilent Technologies
Número da publicação: 5991-5422EN

Seletividade ou fator de separação (α)

a Seletividade
k2
a k1 Fator de retenção de primeiro pico
k1 k2 Fator de retenção de segundo pico

Seletividade é uma medida do tempo ou da distância entre dois picos.

Se a = 1, os dois picos têm o mesmo tempo de retenção e coeluição.
A seletividade é definida como a razão em fatores de capacidade.
Parâmetros que influenciam o fator de retenção:
• Fase estacionária
• Fase móvel
• Temperatura

ToC
Introdução Academic - Agilent Technologies
O que acontece dentro da coluna? Número da publicação: 5991-5422EN

tr2-tr1 tr2-tr1

Separação superior vs Separação inferior

Wb1 Wb2 Wb1 Wb2

Separação superior vs Separação inferior

ToC
Principais parâmetros Academic - Agilent Technologies
Tempo de retenção e largura de pico Número da publicação: 5991-5422EN

h
tr2 tri Tempo de retenção do
composto i
tr1 W1/2 Largura de pico na
meia altura
Wbi Largura de pico na
linha de base

W 1/2

W b1 W b2
t

O tempo de retenção de um composto não retido (tM ou t0) também é conhecido

como tempo de espera. Moléculas de soluto não retidas percorrem a coluna na
ToC mesma taxa que o gás de arraste.
 Principais parâmetros Academic - Agilent Technologies
Número da publicação: 5991-5422EN

Eficiência ou número de pratos teóricos (N)

2 2
 tr   tr 
N  16    N  5.54   
 Wb   W1/ 2 
A eficácia da coluna é utilizada para comparar o desempenho de colunas
diferentes. Ela é expressa como o número de pratos teóricos, N.
As colunas com números altos de pratos são mais eficientes. Uma coluna com
um valor N alto terá um pico mais estreito em um determinado tempo de
retenção do que uma coluna com um número N mais baixo.
Parâmetros que influenciam a eficiência da coluna:
• Comprimento da coluna (aumentar o comprimento da coluna aumenta a eficiência)
• Tamanho da partícula (diminuir o tamanho da partícula aumenta a eficiência)

ToC
Principais parâmetros Academic - Agilent Technologies
Altura equivalente a um prato teórico (H)
Número da publicação: 5991-5422EN

L L Comprimento da coluna (mm)

H
N N Número de pratos teóricos

Outra forma de medir a eficiência da coluna é a altura

equivalente a um prato teórico, designada como H, que
geralmente é expressa em milímetros.
Quanto mais curto for o prato teórico, mais pratos "cabem" em
qualquer comprimento de coluna. Isso significa mais pratos por
metro e maior eficiência da coluna.

ToC
 HPLC

• Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência' (CLAE, em inglês: High Performance/
Pressure Liquide Chromatography, HPLC)
• fase estacionária – coluna (partículas
sólidas empacotadas
• Fase móvel - líquida
HPLC
 Toxicologia Forense
• Espectrometria de Massas:
– A espectrometria de massa é uma técnica analítica
muito usada para:
• identificar
• quantificar
• elucidar as propriedades químicas e estruturais de
moléculas e biomoléculas.
– A detecção de compostos: 10-15ng ; massa de
1000 Dalton.
• Tipos: ionização por electrospray
ANÁLISE TOXICOLÓGICA
MODOS DE PREPARAÇÃO EXTRAÇÃO DE
AMOSTRAS
 Extração de Amostras

(b) Líquidos
• Extração líquido-líquido
(LLE)
• Extração em fase sólida
(SPE)
• Microextração em fase
sólida (SPME) de líquido ou
de headspace
• Microextração em fase
líquida (LPME)
• Extração com fluido
supercrítico (SFE) da matriz
sólida
 VALORES APROXIMADOS DE pKa DE ALGUNS ÁCIDOS E BASES

Fortes ÁCIDOS pKa BASES Fracos

0
Cafeína*
1 Dapsona
2 Oxazepan*
Nitrazepan*
Penicilinas 3
Diazepan
Ácido salicílico 4 Quinina
Ácido acetilsalicílico
5 Quinidina
Warfarina
Clordiazepóxido
Tolbutamida 6 Profoxifeno
Sulfadimetoxina
7 Reserpina
Fenobarbital
8 Kanamicina
Tiopental
Lidocaína
Fenitoína 9 Quinina
Teofilina
10 Quinidina
Glutetimida
Meperidina
*Nitrazepan 11
Procainamida
*Oxazepan 12 Efedrina
13 Anfetamina
Tolazolina
14
Mecamilamina
Cafeína
Guanetidina
Fracos Fortes
 GRAU DE IONIZAÇÃO DO TOXICANTE

pKa do toxicante pH do meio

EQUAÇÃO DE HANDERSON-HASSELBACH

para ácidos fracos: RCOOH  RCOO-  H+

log NI Onde:
pKa - pH =
[I] I = forma
ionizada
para bases fracas: R NH3+  RNH2  H+ NI = forma não
ionizada
log  I 
pKa - pH =
NI
 Composto ácido: AAS (pKa = 3,4)

Plasma Suco gástrico

(pH = 7,4) (pH = 1,4)

R-COOH E R-COOH
M
B
R R-COO- + H+
A
R-COO- + H+
N
A NI
NI 10-4 102
I
I
 ELL

Extração básica:

1 mL de sangue

tampão fosfato
Separar fase Evaporar até
Homogeneização Centrifugação orgânica secura

sol. Sat. de NaCl

PI

Solvente extrator
 Exame toxicológico confirmatório

Ressuspender
com n- Acrescentar Descartar n- Análise
hexano ACN hexano
por
Usar fase ACN
(“clean up”) CG/MS
Precipitação de Proteínas
SPE – Extraction Solid Phase
CG – HEADSPACE
CG – HEADSPACE
SPME – Micro- Extraction Solide Phase
SPME – Micro- Extraction Solide Phase
SPME – Micro- Extraction Solide Phase
Espectro de massa
Perfil Cromatográfico – Terbufós
 Estrutura Temik

Apresentação única: granular

Gesso

Princíopiativo
Aldicarb (150 g/kg)
15% de material ativo ou Outro Pesticida

Agente ligante

Grafite
 REFERÊNCIAS
1. Analytical Sciencess, 2001, v.17 supplement [1], Basic Education in
Analytical Chemistry
2. Talanta Volume 51, Issue 5, p921-933 [2], Review of analytical next term
measurements facilitated by drop formation technology
3. TrAC Trends in Analytical Chemistry Volume 21, Issues 9-10, Pages 547-
557 [3], History of gas chromatography
4. Talanta, Volume 36, Issues 1-2, January–February 1989, Pages 1-9 [4] History
of analytical chemistry in the U.S.A.
5. Principles of Instrumental Analysis, D. A. Skoog, J. J. Leary., Saunders College
Publishing, 1992
6. Introdução à Semimicroanálise Qualitativa, N.
Baccan.,L.M.Aleixo.,E.Stein,O.E.S.Godinho, Editora da Unicamp, 1988.
7. Chemical Analysis: an advanced text and reference, H.A.Laitinen, W. Edgard,
Mc Graw-Hill,1975
 Obrigado!
wphjunior@hotmail.com