UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

INSTITUTO DE QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA- IQB

Prática 01: Introdução a Espectrofotometria e Lei de Lambert-Beer

Daiane Soares dos Santos

Relatório da disciplina prática de Bioquímica do

curso de Química Tecnológica e Industrial, sob a
orientação da professora Dr. Sonia Salgueiro.

Maceió - Al
Junho de 2019
Introdução.
A espectrofotometria é um termo muito empregado para as técnicas de obtenção de
dados físico-químicos de uma determinada amostra, dados de absorção ou reflexão
da transmissão de uma energia radiante que incide sobre esse material. A energia
que é incidente pode ser refletida, transmitida ou absorvida, como resultado temos
um gráfico representando uma função de comprimento de onda ou uma frequência,
ao qual chamamos de espectro. A lei de Lambert-Beer relaciona essa absorção da
luz com as propriedades do material pela qual a luz esta passando, ou seja, de
acordo com Lambert, “A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à
medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente ". Ao incidir
sobre a amostra, parte da intensidade do feixe de luz pode ser absorvida devido a
excitação de elétrons das ligações em moléculas e íons orgânicos, ou alguns ânions
inorgânicos. Assim, podemos medir a Transmissão (T) de luz pela amostra pela
equação:
𝑇 = 𝐼 / Io
Onde, I = Intensidade da luz transmitida e Io = Intensidade da luz incidente.
Um espectro de UV-Vis, por outro lado, pode trazer informações de absorção (Abs)
ou transmissão (T) em função do comprimento de onda (λ em nm). A correlação
entre Abs e T é descrita de acordo com a equação:
𝐴𝑏𝑠 = log (1 𝑇 ) = 𝑙𝑜𝑔 ( 𝐼0 𝐼 )

Nesse relatório, utilizamos das técnicas de espectrofotometria para a determinação

de açúcares redutores, ou seja, determinar a concentração de espécies químicas
absorvedoras em solução, empregando o método de DNS. Os açúcares redutores
são carboidratos que possuem grupo carbonílicos livres e que são capazes de se
oxidarem na presença de agentes oxidantes. Porém essa oxidação ocorre apenas
com os monossacarídeos que possuem uma forma linear e estão em equilíbrio com
suas estruturas cíclicas, assim o carbono carbonílico (anomérico), da estrutura
cíclica é oxidado a um grupo carboxílico, como exemplo temos a glicose. Por outro
lado, os açúcares não redutores são aqueles que cujos carbonos anoméricos estão
envolvidos em reações glicosídicas e são incapazes de assumir sua forma linear,
um exemplo desses açúcares é a sacarose. Para esse método de determinação de
açúcares redutores é muito empregado o uso do DNS, ácido 3,5-dinitrosalicílico, um
agente oxidante que em condições alcalinas, reage com o carbono carbonílico de
açúcares redutores e se reduz a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, um composto cuja
absorção máxima de luz se dá a 540 nm.
Por esses motivos, as técnicas de espectrofotometria possui largo emprego nas
indústrias de fermentação, a detecção desses carboidratos nos mostos mostra-se
importante para se saber por exemplo, o percentual teórico de etanol que pode ser
obtido, ou avaliar a velocidade de consumo dessas fontes de carbono e o quanto de
açúcar deixou de ser fermentado. Além disso, no caso dos vinhos, a detecção
desses açúcares redutores no produto final pode ser necessária para a classificação
da bebida em seca, semi-seca ou suave.
Objetivo.
O objetivo deste relatório é a construção de uma curva padrão para determinar a
quantidade de açucares redutores em uma amostra, utilizando a glicose como
padrão e empregando o método de DNS.
Materiais utilizados:
-Balão volumétrico 250mL
-Béquer de 10, 50 e 100mL
-Tubos de ensaio com tampas de rosca
-Bastão de vidro
-Pipetas automáticas
-Ponteiras
-Cuvetas
-Termômetro
-Banho Maria
-Glicose
-Espectrofotômetro UV-VIS
Procedimento experimental.
Foram separados 9 tubos de ensaio e enumerados de 1 a 8 e o ultimo tubo
identificado como “Branco” com a finalidade de zerar o espectrofotômetro. Em
seguida através da solução padrão de glicose com concentração de 5 μmols/mL
preparada anteriormente, e utilizando uma pipeta automática, foram retiradas 8
alíquotas e distribuídas em 8 tubos de ensaio, as quantidades de glicose
apresentadas foram: 0.05, 0.2, 0.4, 0.5, 0.6, 0.8, 0.9 0.95. Após a adição da glicose,
acrescentamos água destilada até que a quantidade de glicose mais água destilada
somassem 1mL em cada tubo de ensaio. No tubo “Branco” foi adicionado apenas
1,0mL de água destilada. Com os tubos de ensaio preenchidos, foram adicionados
1mL de DNS em cada tubo (exceto o branco), os tubos foram agitados e deixados
na bancada em repouso por alguns minutos. Em seguida os tubos foram levados
para o banho maria onde permaneceu por 5 minutos a 100ºC. Após o banho maria,
os tubos foram resfriados e acrescentado mais 13mL de água destilada, tornando o
volume final nos tubos de 15mL. Os tubos foram homogeneizados e levados para a
leitura da absorbância com espectrofotômetro em λ = 540nm.
Resultados e Discussões.
A tabela abaixo mostra os valores utilizados para a construção da Curva Padrão,
que é a relação gráfica entre os valores de absorbância (A) e os de concentração.
Água destilada Solução Solução
Tubos (mL) Padrão de Padrão de Absorbância
Glicose (mL) Glicose [μM]
1º 0,95 0,05 1 0,012
2º 0,8 0,2 4 0,256
3º 0,6 0,4 8 0,311
4º 0,5 0,5 10 0,353
5º 0,4 0,6 12 0,365
6º 0,2 0,8 16 0,389
7º 0,1 0,9 18 0,379
8º 0,05 0,95 19 0,377
Branco 1,0 - 0 0
Após a obtenção dos valores de absorbância no espectrofotômetro e calculada a
concentração de glicose em cada amostra, os dados obtidos foram inseridos em um
software afim de montar um gráfico de linearidade.

Conclusão.
Apesar de alguns erros durante o preparo, foi possível obter uma equação da reta
através dos valores mais bem definidos conforme proposto a prática.
Referências Bibliográficas. Gonçalves et al., 2010. Negrulesco et al., 2012
F. F, Caniato , João C. Galvão et al., Quantificação de áçucares sólúves totais,
açúcares redutores e amido nos grãos verdes. Ciênc. agrotec., Lavras, v. 31, n. 6, p.
1893-1896, nov./dez., 2007
Thalita A. C., Anna L. Allan V. Ribeiro- Utilização da lei de Lambert-Beer para
determinação da concentração de soluções- JETI- UFMS, IFSP-2018