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SUMÁRIO

SUMÁRIO........................................................................................................3
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................4
2 MÉTODOS FOTOMÉTRICOS..........................................................................5
2.1 Luz........................................................................................................5
2.2 Interação da luz com a matéria ............................................................7
3 FOTOMETRIA............................................................................................... 9
3.1 Transmitância ....................................................................................10
CONCEITO IMPORTANTE PARA A LEI DE LAMBERT-BEER..............................10
CROMÓFORO................................................................................................10
4 LEI DE LAMBERT-BEER...............................................................................11
4.1 Determinações simultâneas................................................................13
4.3 Fluorescência .....................................................................................14
4.4 Métodos fotométricos na análise qualitativa ......................................15
4.5 Métodos fotométricos na análise quantitativa....................................15
5 ESPECTROFOTOMETRIA.............................................................................15
5.1 Tipos de Espectrofotometria...............................................................18
5.2 Espectrofotometria astronômica.........................................................18
5.3 Espectrofotometria de absorção atômica............................................19
5.4 Espectrofotometria no Infra-vermelho................................................19
5.5 Equipamento.......................................................................................20
5.5.1 Espectrofotômetro........................................................................20
5.5.2 Fonte.............................................................................................21
5.5.3 Seleção do Comprimento de Onda (l)...........................................21
5.5.4 Fendas e lentes ............................................................................22
5.5.5 Cubeta..........................................................................................22
5.5.6 Detectores ...................................................................................22
5.5.7 Fluorímetro...................................................................................24
CONCLUSÃO.................................................................................................24
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................26

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1 INTRODUÇÃO

A espectrofotometria é o método de análises óptico mais usado nas investigações


biológicas e fisico-químicas. O espectrofotômetro é um instrumento que permite
comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma
quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância.
Todas as substâncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parece
completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro
visível. A água absorve fortemente na região do infravermelho. A absorção das
radiações ultravioletas, visíveis e infravermelhas dependem das estruturas das
moléculas, e é característica para cada substância química.
Quando a luz atravessa uma substância, parte da energia é absorvida (absorbância): a
energia radiante não pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida. A cor das
substâncias se deve a absorção (transmitância) de certos comprimentos de ondas da luz
branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles
comprimentos de ondas não absorvidos.

A fotometria é o ramo da óptica que se preocupa em medir a luz, em termos de como


seu brilho é percebido pelo olho humano. Aquela se diferencia da radiometria, que é a
ciência que mede a luz em termos de sua potência absoluta, por descrever a potência
radiante associada a um dado comprimento de onda usando a função de luminosidade
modeladora da sensibilidade do olho humano ao brilho. A fotometria também é
utilizada na astronomia, na observação de estrelas, pela percepção da diminuição da luz
por elas emitida. Através de estudos e cálculos, é possível descobrir novos planetas e
saber informações como rotação, translação, distância da estrela e satélites.

Neste trabalho, trataremos dos métodos analíticos baseados na absorção de radiação


eletromagnética. A luz tem radiações para as quais a vista humana é sensível, e as ondas
com comprimento de onda diversos provocam sensações de cores diferentes; uma
mistura apropriada da luz, com estes comprimentos de onda, constitui a luz branca.

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2 MÉTODOS FOTOMÉTRICOS

De acordo com o senso comum, quanto mais cromóforo (substância que absorve luz)
uma solução tiver, mais escura ela será. Todo dia inferimos a quantidade de café pela
aparência do cafezinho! No início, a fotometria utilizou exatamente este instrumento, ou
seja, o olho humano, para determinar a concentração de substâncias cromóforas. Para
facilitar esta tarefa, uma vez que o nosso olho não é um equipamento absoluto, usou-se
cores ou concentrações padrões com os quais a solução em análise poderia ser
comparada. A precisão deste método, porém, não era adequada devido às propriedades
da visão e também do componente subjetivo, que sempre que possível deve ser
eliminado na quantificação. O advento de equipamentos capazes de quantificar a luz
permitiu que a quantidade de fótons pudesse ser medida, permitindo uma
quantificação muito mais precisa.
Antes de abordar os aparelhos responsáveis pelas medidas fotométricas, é importante
discutir um pouco as bases teóricas que permitem a aplicação da absorção da luz como
método quantitativo.

2.1 Luz

A luz é uma onda eletromagnética, isto é, possui dois componentes, um componente elétrico
e outro magnético, posicionados a um ângulo de 90º um em relação ao outro.
Todo movimento oscilatório possui um comprimento de onda, que é a distância entre dois
máximos de onda. Na Figura 1 podemos ver uma onda com um comprimento de 360 e outro de
200 nm. A amplitude da onda ( neste exemplo de 1,0 e 0,6) representa a intensidade da mesma.

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Outra propriedade muito importante das ondas é que elas podem interagir umas com as
outras. No exemplo da figura 1, as duas ondas na realidade se somam para produzir a
onda marcado com SOMA. Este efeito de soma das ondas é particularmente importante
no que se refere à interferência entre ondas, que, quando defasadas em p se anulam
completamente (interferência destrutiva) e quando não possuírem defasagem (ou
obviamente defasagem de 360, 720º) se soma (interferência construtiva). Basta lembrar
que a diferença entre uma luz normal e um laser é a interferência, que é construtiva
neste e tanto construtiva como destrutiva naquele.
O comprimento de onda (l) se relaciona com as outras propriedades das ondas através
das seguintes equações:

λ c
E = h
ν

“c” é a velocidade da luz no vácuo (~ 3 x 108 m s-1), n é a frequência em s-1, E a energia


em Joules e h a constante de Plank (6,6 x 10-34 J s).
Estas duas equações indicam que tanto a frequência como a energia é inversamente
proporcional ao comprimento de onda. Desta forma, ondas mais energéticas tem um λ
menor e uma frequência maior. As ondas eletromagnéticas, dependendo da sua energia,
possuem características diferentes, principalmente no que se refere a sua interação com
a matéria, sendo utilizados para os mais diversos fins. É importante salientar que as
propriedades de ondas eletromagnéticas (i. e. velocidade, interferência) permanecem
inalteradas por todo o espectro de energia. A Figura 2 mostra o espectro de ondas
eletromagnéticas, que vão desde l de quilômetro até fentometros (10-15).
As ondas eletromagnéticas que podem ser detectadas por nossos olhos, isto é, o visível,
ocupa uma pequena faixa de todo o espectro. Dentro do visível, como bem sabemos,
existem várias cores, que nada mais são do que ondas com diferentes λs. As energias, as
frequências e os comprimentos de onda das cores são mostrados na Tabela 1.

Figura 2. Ondas eletromagnéticas de diferentes energias.

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Cor Cor Complementar λ /nm ν /(1014 Hz)
Ultravioleta (UV) <380 7,89
Violeta Verde-amarelado 380-435 7,89-6,90
Azul Amarelo 435-480 6,90-6,25
Azul-esverdeado Alaranjado 480-490 6,25-6,12
Verde-Azulado Vermelho 490-500 6,12-6,00
Verde Púrpura 500-560 6,00- 5,36
Verde-amarelado Violeta 560-580 5,36-5,17
Amarelo Azul 580-595 5,17-5,04
Alarajado Azul-esverdeado 595-650 5,04-4,62
Vermelho Verde-azulado 650-780 4,62-3,85
Infravermelho (IV) > 780 3,85

2.2 Interação da luz com a matéria

Radiações eletromagnéticas interagem com a matéria de muitas formas. Como


trataremos somente das radiações no visível e das radiações com energias próximas a
este, como o UV e o IV, serão analisadas somente as interações que as radiações
eletromagnéticas desta faixa de energia produzem.
Para podermos compreender a interação da luz com a matéria é necessário fazer uma
rápida revisão sobre a constituição da matéria. Como todos sabem os átomos e, portanto
as moléculas são constituídas por um núcleo (prótons + nêutrons) e por elétrons. As
energias das radiações eletromagnéticas na faixa do visível não possuem energia
suficiente para alterar os núcleos λ, podendo alterar somente as distribuições eletrônicas
dos átomos e das moléculas. É interessante lembrar que os elétrons são distribuídos em
orbitais preenchidos segundo as regras de distribuição eletrônica de Pauling.
Um átomo ou molécula possuem orbitais ocupados e orbitais não ocupados. No estado
fundamental os elétrons se distribuem de forma a minimizar a energia. Existe, porém, a
possibilidade de ocupação de orbitais mais energéticos, se for proporcionada certa
quantidade de energia.
Isto pode acontecer quando um fóton de luz atingir um átomo ou molécula como visto
na Figura 3.

Figura 3. Orbitais eletrônicos e a absorção e emissão de luz

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Este elétron no estado excitado tenderá a voltar para o estado fundamental, o que
geralmente ocorre por um caminho tortuoso, na qual o elétron passa para um estado
metaestável, emitindo com isso energia térmica, e deste estado volta ao estado
fundamental, emitindo luz.
Esta emissão de luz é classificada como fluorescência quando a emissão cessa logo após
a extinção da excitação e fosforescência quando a emissão espontânea continua por
períodos de tempo mais elevados (até mesmo horas, mas caracteristicamente segundos
ou frações de segundos).
Uma característica muito importante a que deve ser considerada quando se leva em
consideração estas transições energéticas entre orbitais é a quantização.
As transições só ocorrem quando a energia fornecida pela radiação é igual à energia de
transição entre os dois orbitais, sendo que tanto energias inferiores como superiores são
incapazes de produzir a transição eletrônica.

Figura 4. Espectro de absorção de vários pigmentos fotossintéticos.


(Absorbância x Comprimento de onda)

As transições energéticas que ocorrem em um átomo ou molécula podem ser


determinadas através de um espectro de absorbância, que é a medição da
quantidade de luz absorvida em vários λs, como visto na Figura 4.

É interessante ressaltar que é justamente nestas transições eletrônicas que está o motivo
do mundo colorido que vivenciamos. Vejamos o caso da clorofila, que como todos
sabemos é responsável pelo maravilhoso verde das matas, possui uma forte absorção na
região do azul e do vermelho. Isto significa dizer que quando olhamos para uma folha,
estamos recebendo em nossos olhos a luz filtrada, isto é, a luz branca (que possui todos
os λs) subtraídos do azul e do vermelho (Figura 4), fazendo com que somente o que não
for absorvido seja captado pelos nossos olhos, isto é, o verde (λ = 530). Da mesma
forma, todas as colorações que vemos são resultado da absorção seletiva de algum l,
restando a cor. Neste ponto é interessante filosofar que pode ter havido uma pressão
seletiva durante a evolução dos órgãos responsáveis pela detecção da luz (leia-se olhos)
para que fossem detectados justamente os s entre 400 e 700nm, pois esta região é
riquíssima em transições observadas na natureza, trazendo desta forma uma quantidade

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de informações imensa (muito provavelmente o mundo em λ diferentes do visível seja
bastante “cinza” ou monótono - isto é, contém muito menos informação).

3 FOTOMETRIA

Fotometria é a medida da luz proveniente de um objeto. Até o fim da Idade Média, o


meio mais importante de observação astronômica era o olho humano, ajudado por
vários aparatos mecânicos para medir a posição dos corpos celestes. Depois veio a
invenção do telescópio, no começo do século XVII, e as observações astronômicas de
Galileo. A fotografia astronômica iniciou no fim do século XIX e durante as últimas
décadas muitos tipos de detectores eletrônicos são usados para estudar a radiação
electromagnética do espaço. Todo o espectro electromagnético, desde a radiação gama
até as ondas de rádio são atualmente usadas para observações astronômicas.

Apesar de que observações com satélites, balões e espaçonaves podem ser feitas fora da
atmosfera, a grande maioria das observações é obtida da superfície da Terra.

Como a maioria das observações utiliza radiação electromagnética, e podemos obter


informações sobre a natureza física da fonte estudando a distribuição de energia desta
radiação, introduziremos alguns conceitos para a caracterização desta radiação.

• comprimento de onda
• freqüência
• c 300 000 km/s velocidade da luz

Localização no espectro:

A radiação visível vai aproximadamente de 3900 Å (violeta) até cerca 7800 Å


(vermelho).

Cor Comprimento de onda (Å) Freqüência (1012 Hz)


Violeta 3900 - 4550 659 - 769
Azul 4550 - 4920 610 - 659
Verde 4920 - 5770 520 - 610
Amarelo 5770 - 5970 503 - 520
Laranja 5970 - 6220 482 - 503

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Vermelho 6220 - 7800 384 - 482
Freqüências e comprimentos de onda para várias cores, no vácuo. Como as cores são subjetivas,
pois dependem da sensibilidade de cada olho humano, a definição é um pouco arbitrária.

3.1 Transmitância

Se passarmos um feixe de luz de intensidade conhecida (Io) através de uma amostra e


medirmos a intensidade da luz que emergiu (I), podemos calcular a transmitância (T)
desta amostra da seguinte forma: T = I / Io , isto é, a razão de luz que atravessa a
amostra.

Figura 5. Transmitância

CONCEITO IMPORTANTE PARA A LEI DE LAMBERT-BEER

CROMÓFORO

Um cromóforo ou grupo cromóforo é a parte ou conjunto de átomos de uma molécula


responsável por sua cor. Também se pode definir como uma substância que tem
muitos elétrons capazes de absorver energia ou luz visível, e excitar-se para assim

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emitir diversas cores, dependendo dos comprimentos de onda da energia emitida pelo
câmbio de nível energético dos elétrons, de estado excitado a estado basal.
Quando uma molécula absorve certas longitudes de onda de luz visível e transmite ou
reflete outras, a molécula tem uma cor. Um cromóforo é uma região molecular onde a
diferença de energia entre dois orbitais atômicos cai dentro do intervalo do espectro
visível. A luz visível que incide no cromóforo pode também ser absorvida excitando um
elétron a partir de seu estado de repouso.
Nas moléculas biológicas úteis para capturar ou detectar energia luminosa, o cromóforo
é a semimolécula que causa uma alteração na conformação do conjunto ao receber luz.
Tipos de cromóforos
Os cromóforos se apresentam quase sempre em uma de duas formas: sistemas
conjugados pi ou complexos metálicos.
Na primeira forma, os níveis de energia que alcançam os elétrons são orbitais pi gerados
a partir de séries de ligações simples e duplas alternadas, como acontece nos sistemas
aromáticos. Entre os exemplos mais comuns podemos encontrar os corantes retinianos,
(usados no olho para detectar a luz), vários corantes de alimentos, colorantes azóicos
para têxteis, licopeno, β-caroteno, e antocianinas.
Os cromóforos de complexos metálicos surgem da divisão de orbitais "d" ao vincular
metais de transição com ligantes. Alguns exemplos destes cromóforos se encontram na
clorofila, usada pelos vegetais para a fotossíntese, a hemoglobina, a hemocianina, e em
minerais coloridos como malaquita e ametista.

4 LEI DE LAMBERT-BEER

Para que esta diminuição na intensidade da radiação (T) possa ser utilizada para a
determinação da concentração de um cromóforo, é necessário relacionar estas duas
grandezas, o que é realizado pela lei de Lambert-Beer.
Primeiramente é necessário esclarecer que a luz atravessa um caminho óptico no
qual se encontram certa quantidade de moléculas do cromóforo, sendo que
somente uma parte destas pode interagir de forma adequada com a luz para que
esta possa ser absorvida. Importante mencionar aqui é que a quantidade de
cromóforos que interagem com a luz neste caminho óptico é proporcional à
concentração do cromóforo na cubeta (recipiente no qual passa a luz). Uma teoria
que pretende relacionar a concentração de um cromóforo com a quantidade de luz
absorvida deve levar em consideração que cada interação adequada da luz com o
cromóforo diminui a intensidade do feixe de luz 4 numa quantidade infinitesimal
dP, no qual P é a intensidade radiante e d é uma quantidade infinitesimal. Esta
redução na intensidade radiante é proporcional à concentração do cromóforo e à
intensidade do feixe de luz (quanto mais concentrado e quanto mais fótons tiver,
maior a probabilidade de haver um choque fóton - cromóforo).

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Podemos então escrever a equação como sendo:

dP ∞ C P db (1) dP = -k C P db (2)

no qual db representa uma quantidade infinitesimal do caminho óptico percorrido (o


necessário para encontrar um cromóforo pronto para absorver um fóton), k é a constante
de proporcionalidade e o sinal negativo significa que a intensidade da luz está
diminuindo.
Bem, mas o que interessa é a quantidade de luz absorvida ao longo de certo caminho
Óptico de, por exemplo, 1 cm e não infinitesimal. Para chegarmos à equação que
descreve isto, devemos somar as d Ps em todos os d bs, o que matematicamente é
conseguido com a integração, o que fornece: ln P/P0 = - k b C
considerando que, ln = log2,303
-log P = k b C
P0 2,303

e finalmente considerando que P/P0 = T e k/2,303 = ε . temos:


A = ε b C sendo que A=
-log T

Nesta equação, que é denominada de Lambert-Beer, o e (epsilon) é a absortividade


molar, uma constante dependente do λ, do cromóforo, do solvente e da temperatura. Um
e elevado significa uma grande capacidade de um cromóforo absorver luz de certo λ em
determinadas condições. Por exemplo, o e da clorofila em 480nm é um dos mais
elevados da natureza, o que condiz com a sua utilização como captadora de luz para a
fotossíntese.

Como mostrado na Figura 6, A lei de Lambert-Beer fornece um traçado gráfico de A x [C] em


forma de reta enquanto que a transmitância fornece uma curva descendente, quando a

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abscissas é a concentração do cromóforo ([C]). Neste gráfico a inclinação da reta fornece o
valor de “e b”, ou seja, um gráfico de A x [C] pode ser utilizado para o cálculo da absortividade
molar.

É importante mencionar que a lei de Lambert-Beer somente se aplica quando as


seguintes considerações forem obedecidas:

a) A radiação incidente deve ser monocromática, isto é, possuir somente um λ;

b) Os centros absorventes devem atuar independentemente uns dos outros no


processo de absorção. Também é necessário destacar que quanto maior o e mais
precisa será a determinação, o que significa dizer que o l mais adequado para a
determinação da concentração de um cromóforo através da lei de Lambert-Beer
é o λ de absorbância mais intensa, ou seja, o pico de absorbância.

4.1 Determinações simultâneas

Dois ou mais cromóforos podem ser quantificados independentemente quando presentes


em uma mistura. Para que isto seja possível é necessário que algumas condições sejam
satisfeitas: o cromóforo A deve possuir pelo menos um pico de absorbância no qual a
absorbância do cromóforo B seja negligenciável e vice-versa. A Figura 7 mostra a
absorbância de dois compostos separadamente e somados5. Neste caso o pico de 670nm
seria melhor para a detecção do composto A e o pico de 530nm para o composto B.
Embora seja aconselhável escolher o pico de maior e para a determinação da
concentração de um composto, neste caso o pico de 670nm é indicado pois ele não sofre
a interferência do espectro de absorção do composto B.
É importante mencionar que, como a absorção total é a soma da absorção dos diversos
componentes, é possível até fazer uma determinação simultânea quando os dois
espectros se sobrepõem completamente, contanto que se conheça os espectros isolados e
os ε s de cada pico.

Figura 7. Determinação simultânea em uma mistura de dois cromóforos

4.2 Desvios na lei de Lambert-Beer

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Como abordado anteriormente, a Lei de Lambert-Beer somente se aplica quanto os
centros absorventes não interagem uns com os outros. Isto obviamente só é conseguido
em concentrações muito pequenas. Em termos práticos, as concentrações limites até as
quais esta lei é obedecida situam-se na faixa de 10-2 M para a maioria dos compostos.
Até estas concentrações as moléculas (centros absorventes) interagem
predominantemente com o solvente. Em concentrações superiores, iniciam-se interações
também entre as moléculas do soluto (cromóforo), fazendo com que o ε e o λ de
certos picos de absorbância sejam alterados (“blue ou red shift” - deslocamento para o
azul ou vermelho). Lembrem-se de que certo espectro com os seus respectivos ε s é
característico daquela substância em um determinado solvente. Em concentrações muito
altas, as interações entre as moléculas do soluto se tornam tão elevadas que predominam
sobre as interações solvente-soluto, fazendo com que o próprio soluto aja como
solvente, produzindo alterações na absorbância.
Outra fonte de erro pode ser o índice de refração, que pode aumentar significativamente
em soluções concentradas, desviando parte da luz e diminuindo a intensidade detectada.
Na Figura 6 pode-se ver o desvio da lei de Lambert-Beer na curva A*.
O equipamento de detecção também pode representar uma fonte de erro, principalmente
em concentrações muito baixas ou muito elevadas, nas quais a intensidade de luz
transmitida é muito próxima ou muito distante, respectivamente, da intensidade do feixe
que não passa pela amostra, fazendo com que as comparações se tornem muito menos
precisas.

4.3 Fluorescência

A fluorescência é devido à emissão de luz após uma excitação, sendo que aquela sempre
acontece em λ s maiores do que esta. A fluorescência possui várias vantagens em

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relação à absorbância, entre as quais pode-se destacar a maior sensibilidade, a maior
seletividade e a maior dependência do meio circundante.
A sensibilidade da fluorescência é aproximadamente 2 ordens logarítmicas maior do
que a absorbância. Quanto à seletividade é interessante mencionar que um composto
fluorescente geralmente possui mais de um espectro de emissão, cada qual para um
certo λ de excitação, fazendo com que este método também seja melhor do que a
absorbância para a determinação qualitativa do composto.
Além destas vantagens, a fluorescência é extremamente sensível ao meio em que se
encontra o composto. Existem várias substâncias que suprimem a emissão de
fluorescência (“quencher”) dentre os quais se pode citar o O2. Isto pode ser utilizado
para detectar, por exemplo, se um grupo fluorescente está em contato com o meio ou
está protegido dele (na parte interna de uma proteína, por exemplo). Esta técnica é
bastante utilizada no auxílio da determinação de estruturas de proteínas usando o
aminoácido triptofano como grupo fluorescente.

4.4 Métodos fotométricos na análise qualitativa

Como discutido anteriormente, o espectro é uma característica de certa substância


em um certo solvente. Obviamente isto pode ser utilizado para a análise qualitativa, o
que geralmente acontece por comparação, isto é, se compara o espectro de um composto
desconhecido com espectros de padrões. O espectro de absorção fornece algumas
informações sobre a natureza do composto. A absorção na faixa do visível e do IV
geralmente indica ligações duplas conjugadas para compostos orgânicos e complexos de
metais de transição no caso de compostos inorgânicos.
Um exemplo interessante de utilização da absorbância é a determinação se o DNA está
na forma de simples ou dupla fita. As bases do DNA absorvem na faixa do UV, em
torno de 260 nm, sendo que esta absorção é aumentada quando a dupla hélice é
separada, fazendo com que a absorbância neste λ seja um bom método para a
determinação da conformação do DNA.

4.5 Métodos fotométricos na análise quantitativa

O principal uso dos métodos fotométricos é na quantificação de substâncias. Em anexo


se encontra um protocolo que mostra como que estes métodos podem ser utilizados para
a determinação da concentração de um cromóforo, a partir de soluções com
concentrações conhecidas ou então com a utilização da constante e para as condições
nas quais se está fazendo a determinação. Na construção de uma curva de calibração é
importante utilizar todas as condições nas quais se encontra a amostra cuja concentração
se deseja determinar, pois pequenas alterações no solvente, pH ou força iônica podem
produzir alterações nas propriedades dos cromóforos.

5 ESPECTROFOTOMETRIA

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Este é, indubitavelmente, o método mais exato para a determinação da concentração de
substâncias em solução. Mas os instrumentos são mais dispendiosos do que os que
foram descritos anteriormente. Um espectrofotômetro pode ser considerado como
um fotômetro fotoelétrico de filtro refinado que permite o uso de faixas de luz
aproximadamente monocromáticas continuamente variáveis. As partes essenciais
de um espectrofotômetro são uma fonte de energia radiante (luz), um monocromador,
um dispositivo para o isolamento de luz monocromática, mais exatamente, faixas
estreitas de energia radiante da fonte de luz, células de vidro ou de sílica feixes de
energia radiante que passam através do solvente ou da solução.

A variação da cor de um sistema, com a modificação da concentração de certo


componente, constitui a base do que os químicos denominam análise colorimétrica. A
cor é provocada pela formação de um composto corado, resultante da adição de um
reagente apropriado, ou pode ser intrínseca ao constituinte analisado. A intensidade da
cor pode ser comparada com a que se obtém pelo tratamento idêntico de uma
quantidade conhecida da substância.

A colorimetria visa a determinar a concentração de uma substância pela medida da


absorção relativa de luz, tomando como referência à absorção da substância numa
concentração conhecida. Na colorimetria visual usa-se, em geral, como fonte de luz,
uma fonte natural ou artificial de luz branca. As determinações são feitas num
instrumento simples, denominado colorímetro, ou comparador de cores. Quando a vista
for substituída por uma fotoelétrica (o que elimina em grande parte os erros devidos às
características pessoais de cada observador), o instrumento é um colorímetro
fotoelétrico. Neste instrumento emprega-se a luz que está numa banda estreita de
comprimentos de onda, que se consegue pela passagem da luz através de filtros, isto é,
de materiais coloridos na forma de placas de vidro, ou de gelatina, etc., que só
transmitem a luz numa região espectral limitada. O instrumento é chamado, às vezes,
"fotômetro de filtro".

Na análise espectrofotométrica a fonte de radiação emite até a região ultravioleta do


espectro. Desta radiação selecionam-se comprimentos de onda definidos que constituem
bandas, com largura menor que 1nm. Este procedimento necessita de um instrumento
mais complicado, e por isso mais caro. O instrumento é um espectrofotômetro.

Um espectrômetro ótico é um instrumento que dispõe de um sistema ótico que pode


provocar a dispersão da radiação eletromagnética incidente, e com o qual se podem
fazer medidas da radiação transmitida num certo comprimento de onda da faixa
espectral. Um fotômetro destina-se a medir a intensidade da radiação transmitida ou
uma função desta intensidade. Um espectrômetro e um fotômetro, combinados num
espectrofotômetro, podem gerar um sinal que corresponde à diferença entre a radiação
transmitida por um material tomado como referência e a radiação transmitida pela
amostra analisada, num certo comprimento de onda.

A principal vantagem dos métodos colorimétricos e espectrofotométricos é a de


proporcionarem um meio simples para determinar quantidades diminutas de
substâncias. O limite superior dos métodos colorimétricos é, em geral, a determinação
dos constituintes que estão presentes em quantidades relativas inferiores a 1 ou 2%. A
sensibilidade pode ser, no entanto, aumentada mediante a técnica da espectrofotometria

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derivada. O desenvolvimento de colorímetros fotoelétricos de baixo custo colocou ao
alcance de qualquer instituição de ensino pequena este ramo da análise química
instrumental.

Comprimento de onda aproximado das cores

Cor Comprimento de Cor Comprimento de


onda (nm) onda (nm)
Ultravioleta <400 Amarelo 570-590
Violeta 400-450 Alaranjado 590-620
Azul 450-500 Vermelho 620-760
Verde 500-570 Infravermelho >760

Na tabela estão as faixas de comprimento de onda aproximados que correspondem às


diferentes cores. A percepção visual das cores é provocada pela absorção seletiva, por
um objeto corado, de certos comprimentos de onda da luz incidente. Os outros
comprimentos de onda ou são refletidos ou são transmitidos, de acordo com a natureza
do objeto, e são percebidos pela vista como a luz do objeto. Se um corpo sólido opaco
tem a aparência de branco, todos os comprimentos de onda são igualmente refletidos; se
o corpo parece negro, a reflexão de luz de qualquer comprimento de onda é muito
pequena. Se um corpo parece azul, são refletidos os comprimentos de onda que
correspondem ao estímulo do azul, e assim sucessivamente.

Deve-se acentuar que a faixa de radiação eletromagnética estende-se muito além da


região visível.

Na figura abaixo aparecem os limites aproximados do comprimento de onda e o


conjunto de radiações pode ser considerado o espectro eletromagnético (excluindo-se,
como é claro, as ondas acústicas). Percebe-se, no espectro, que os raios y e os raios X
têm comprimentos de onda muito curtos, enquanto a radiação ultravioleta, a radiação
visível, a radiação infravermelha, e as ondas de rádio têm comprimentos de onda
sucessivamente maiores. Na colorimetria e na espectrofotometria, a região visível e a
região ultravioleta que lhe é adjacente são da maior importância.

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Espectro eletromagnético

As ondas eletromagnéticas são usualmente descritas em termos (a) do comprimento de


onda (distância entre os picos sucessivos em cm, a menos de explicitação de outra
unidade), (b) do número de onda v (número de ondas por cm) e (c) da freqüência v
(número de ondas por segundo). As três grandezas estão relacionadas como segue:
Para a adoção integral das unidades SI estas funções deveriam ser calculadas com o
metro como umidade básica. É, no entanto, ainda a prática comum usar o centímetro.

5.1 Tipos de Espectrofotometria

5.2 Espectrofotometria astronômica

Os astrônomos utilizam redes de difração para estudar o espectro de energia da radiação


eletromagnética dos astros coletada nos telescópios. A rede de difração é o artefato que
substitui o antigo prisma óptico na pesquisa científica. Sua qualidade se mede pelo
poder de separação de duas linhas de absorção ou de emissão do espectro
eletromagnético de uma estrela, isto é, pela sua resolução espectral.

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5.3 Espectrofotometria de absorção atômica

É o método de análise usado para determinar qualitativamente e quantitativamente a


presença de metais. O método consiste em determinar a presença e quantidade de um
determinado metal em uma solução qualquer, usando como princípio a absorção de
radiação ultravioleta por parte dos elétrons que, ao sofrerem um salto quântico depois
de devidamente excitados por uma chama de gás acetileno a 3000 graus celsius, esses
devolvem a energia recebida para o meio, voltando assim para a sua camada orbital de
orígem. A energia devolvida na forma de um fóton de luz, por sua vez, absorve a
radiação ultravioleta emitida pela fonte específica (cátodo ôco) do elemento químico em
questão. Dessa forma, elétrons que estão contidos na solução, e que sofrem também um
salto quântico e que não pertencem ao mesmo elemento que constitui o cátodo ôco que
está sendo usado no momento, não serão capazes de causar uma interferência, isso
porque eles absorverão apenas radiação com comprimento de onda referente ao
elemento químico do qual fazem parte.

5.4 Espectrofotometria no Infra-vermelho

Os compostos orgânicos também absorvem radiações na região do infravermelho (IV)


do espectro . A radiação infravermelha não tem energia suficiente para excitar os
elétrons e provocar transições eletrônicas, mas ela faz com que os átomos ou grupos de
átomos vibrem com maior rapidez e com maior amplitude em torno das ligações
covalentes que os unem. Estas vibrações são quantizadas e, quando ocorrem, os
compostos absorvem energia IV em certas regiões do espectro. Nas vibrações, as
ligações covalentes comportam-se como se fossem pequenas molas unindo os átomos.
Quando os átomos vibram, só podem oscilar com certas frequências, e as ligações
sofrem várias deformações. Quando a ligação absorve energia, ela sofre alterações e, ao
retornar ao estado original, libera essa energia, que então é detectada pelo
espectrômetro. As moléculas podem vibrar de muitos modos. Dois átomos unidos por
uma ligação covalente podem efetuar vibrações de estiramento dessa ligação, como se
fosse uma mola que estica e retorna ao tamanho original. Três átomos também podem
efetuar diferentes vibrações de estiramento e alteração dos ângulos de ligação, em
vários planos do espaço. No entanto, as vibrações de estiramento são as mais
importantes.

A radiação infravermelha é outra espécie de radiação eletromagnética cujo espectro


começa num dos limites do espectro da luz (o vermelho) e se estende até à zona das
ondas hertzianas (radar, televisão, rádio). É caracterizada por um comprimento de onda
compreendido entre cerca de 800 e 105 nm. Nas moléculas, os átomos e os grupos
atômicos estão em contínuo movimento, uns em relação aos outros (vibrações
moleculares). Quando elas são sujeitas a radiação com energia semelhante à
correspondente a essas vibrações (radiação infravermelha), as moléculas podem alterar
o seu estado de vibração (excitação), absorvendo a radiação correspondente à diferença
de energia entre o estado inicial e o estado excitado. Como não é possível a uma
molécula vibrar de qualquer modo, mas apenas de alguns modos, a absorção da radiação
ocorre apenas para determinados valores da energia, valores estes que são
característicos das moléculas. Assim, através da comparação dos valores de energia da
radiação infravermelha para os quais há absorção, é possível identificar as moléculas ou
os tipos de moléculas presentes nas amostras. A espectrofotometria infravermelho

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próximo oferece um método rápido de análise química que fornece, em segundos,
resultados de múltiplas propriedades em amostras não preparadas.

• Usos e aplicações A espectroscopia no infravermelho é largamente usada tanto na


indústria quanto na pesquisa científica pois ela é uma técnica rápida e confiável para
medidas, controle de qualidade e análises dinâmicas. Os instrumentos agora são
pequenos, e podem ser transportados, mesmo para medidas de campo. Com a crescente
tecnologia em filtragem computacional e manipulação de resultados, agora as amostras
em solução podem ser medidas com precisão (a água produz uma banda larga de
absorbância na faixa de interesse, o que daria um espectro ilegível sem esse tratamento
computacional). Algumas máquinas até mesmo dirão automaticamente que substância
está sendo analisada a partir de milhares de espectros de referência armazenados na
memória. Medindo-se a uma freqüência específica ao longo do tempo, mudanças no
caráter ou na quantidade de uma ligação em particular podem ser medidas, isso é
especialmente útil na medida do grau de polimerização na manufatura de polímeros. As
máquinas modernas podem tirar medidas na faixa de interesse freqüentemente, como 32
vezes por segundo. Isso pode ser feito enquanto se fazem medidas simultâneas com
outras técnicas. Isso faz com que as observações de reações químicas sejam processadas
mais rapidamente, de forma mais precisa e mais exata.

5.5 Equipamento

Os equipamentos mais utilizados nos métodos fotométricos.

5.5.1 Espectrofotômetro

A Figura 9 mostra um esquema de um espectrofotômetro, com os seus principais


componentes numerados de 1 a 5, sendo 1 - fonte, 2 - prisma para seleção do l, 3 -
fenda, 4 – cubeta com a amostra e 5 - detector produzindo o resultado final.

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Os espectrofotômetros modernos geralmente utilizam feixes duplos produzidos através
de espelhos semitransparentes, sendo que um feixe passa através da amostra enquanto o
outro feixe não, e a comparação entre a intensidade destes dois feixes produz a leitura
final do equipamento. Isto elimina problemas como flutuações na fonte, diferente
detecção para diferentes ls, etc.

5.5.2 Fonte

A fonte de energia eletromagnética precisa fornecer radiação estável e com intensidade


razoavelmente constante por toda a faixa de l na qual se pretende usar. Devido a essas
exigências, geralmente utiliza-se um lâmpada para a região do visível e do IV e outra
lâmpada para o UV.
A fonte de radiação visível e IV mais utilizada é a lâmpada incandescente de tungstênio,
que devido a sua alta temperatura (2600-3000ºC) fornece uma radiação razoavelmente
constante entre 350 a 2500 nm. No caso da radiação UV, as fontes mais utilizadas são
as lâmpadas fluorescentes de hidrogênio e hélio, que fornecem radiações com l de 180 a
350 nm.

5.5.3 Seleção do Comprimento de Onda (l)

Uma das premissas da lei de Lambert-Beer é a luz monocromática, isto é, que tenha
somente um determinado λ, que precisa ser selecionado do vasto espectro geralmente
fornecido pela fonte.
A seleção do λ pode ser realizado de várias formas. Nos fotocolorímetros, esta seleção
se dá através do uso de filtros, que nada mais são do que vidros coloridos. Obviamente
as cores destes vidros foram cuidadosamente escolhidas para que estes permitam a
passagem de um λ específico. Na realidade a seleção do λ usando-se filtros geralmente
consegue uma precisão de somente alguns nm, ou seja, consegue selecionar uma faixa
de λs em vez de um λ específico.
Nos espectrofotômetros utilizam-se geralmente prismas ou grades de difração para uma
seleção mais precisa do λ. Diferentes λs viajam com velocidades diferentes através da
matéria, sendo que λs menores sofrem mais difração do que λs maiores.

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Usando-se um prisma móvel juntamente com lentes adequadas e uma fenda se consegue
selecionar λs com a precisão de até λ nm.
Outra forma de seleção do l é o uso de uma grade de difração, que nada mais é do que
uma superfície irregular que consegue refletir a luz. A interferência desta luz refletida
fornece um espectro, do qual se pode selecionar os λs de forma semelhante ao descrito
para o prisma.

Figura 10. Prisma. (la > lb)

5.5.4 Fendas e lentes

Existem nos espectrofotômetros várias lentes e fendas, que tem como objetivo colimar e
selecionar os feixes de luz apropriados.

5.5.5 Cubeta

A característica fundamental da cubeta é que ela seja transparente à radiação. No caso


da radiação UV utiliza-se quartzo ou sílica fundida enquanto que na região do visível
podem ser utilizados materiais mais baratos como o vidro ou plásticos. Geralmente as
cubetas possuem um caminho óptico (espessura) de um centímetro, tamanho
padronizado na lei de Lambert-Beer.
Sempre é bom lembrar que estas cubas devem ser rigorosamente limpadas para que
sujeiras ou mesmo a gordura dos dedos não interfira na leitura. É conveniente que as
cubetas sejam regularmente limpas com agentes oxidantes como, por exemplo, solução
sulfocrômica para retirar qualquer traço de sujeira.

5.5.6 Detectores

Existem várias formas de se detectar ondas eletromagnéticas, sendo que todas estão
baseadas na conversão da energia radiante em energia elétrica, que podem então ser
detectados por um equipamento convencional. Os três tipos diferentes de detectores
mais utilizados.
As células fotovoltaicas baseiam-se na geração de força eletromotriz quando se ilumina
uma placa metálica recoberta com uma camada de material semicondutor como o
selênio e o óxido de cobre. As células fotovoltaicas são utilizadas principalmente no

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caso de uma iluminação alta, pois a amplificação deste tipo de célula é difícil de ser
conseguida. As células fotoelétricas tem como princípio o efeito fotoelétrico, que
consiste na liberação de um elétron de uma superfície (geralmente constituída de óxidos
alcalinos) quando um fóton de luz visível ou UV atingir a placa. Estes elétrons liberados
podem ser captados por um ânodo, o que produzirá uma corrente elétrica detectável.
Uma modificação das células fotoelétricas, denominados fotomultiplicadores, (Figura
11) utilizam a emissão induzida por fótons e elétrons para amplificar o sinal. O fóton
bate na primeira placa e 2 a 5 elétrons secundários são emitidos, que são atraídos pela
placa seguinte (díodo) através de uma voltagem de aproximadamente + 90V. Cada qual
destes elétrons podem por sua vez produzir 2 a 5 outros 12 elétrons e assim
sucessivamente. Com a utilização de 9 a 16 díodos, cada qual com uma voltagem de
+90 V em relação ao anterior, pode se conseguir uma amplificação de até 108,
considerando- se que cada passo tenha um fator multiplicador de 4,5. Desta forma é
possível detectar uma quantidade ínfima de luz. Devido a sua alta sensibilidade, os
tubos fotomultiplicadores não podem ser utilizados para intensidades de luz muito
elevadas.

Figura 11. Fotomultiplicador

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5.5.7 Fluorímetro

A diferença básica no fluorímetro é a geometria da detecção da luz, que se localiza a um


ângulo de 90º em relação à fonte. Este desenho geométrico é utilizado no intuito de
maximizar a detecção da fluorescência e minimizar a detecção da luz referente à
transmitância. Outra diferença fundamental é a presença de um segundo sistema de
seleção de l após a passagem da luz pela amostra, possibilitando desta forma a escolha
do l de emissão, além obviamente, do l da excitação.

CONCLUSÃO
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Ondas eletromagnéticas, como a luz, fornecem inúmeras informações sobre a fonte que a
produziu e também sobre o caminho percorrido, isto é, as interações sofridas com a matéria ao
longo do caminho. Para ilustrar isto é interessante mencionar que a fonte de informação mais
poderosa sobre a constituição do universo vem da luz, que vem ao nosso encontro das estrelas
mais distantes. Esta luz possui as bandas características dos componentes dos quais as estrelas
são formadas e desta forma é possível determinar a concentração dos componentes presentes
nas estrelas. Se voltarmos um telescópio para uma estrela distante alguns bilhões de anos luz,
estaremos vendo a luz primordial, provavelmente emitida por ela a alguns bilhões de anos,
permitindo o conhecimento da constituição da matéria naqueles primórdios.
Este trabalho foi uma forma de enriquecer mais meus conhecimentos no campo da
análise química quantitativa pode observar e entender melhor a quantidade de
informações que a luz é capaz de carregar fazendo com que ela pode ser uma
informante poderosa da constituição qualitativa e quantitativa da matéria.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALCANTARA, Petrus Jr. Espectroscopia Molecular. Disponível em


www.universidadefederaldopara.com.br . Acesso em 29/10/2006.
SKOOG, Douglas A; HOLLER, James F; NIEMAN, Timonthy. Princípios de analise
instrumental. 5ed. Porto Alegre: Bookman, 2002. P. 115-137; 275-297.
Atvars, T. D. Z. e Martelli C. ''Espectroscopia eletrônica de emissão''.
Atvars, T. D. Z. e Martelli C. ''Espectroscopia de luminescência''.
Bassi, A. B. M. S. ''Conceitos fundamentais em espectroscopia''.
Manual de operação do espectrofotômetro Cary 5G - Varian - 1995, A-1, B-3
HARRIS, C Daniel. Análise Química Quantitativa. Fundamentos da
Espectrofotometria. 6ed. Rio de Jabeiro: LTC, 2005. P. 398-423.

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