Arthur Luiz Corrêa Tese Doutorado

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO Stricto sensu EM CIÊNCIAS APLICADAS A
PRODUTOS PARA SAÚDE (PPG-CAPS)
ARTHUR LUIZ CORRÊA
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE NEUTRALIZANTE

DE Myrsine parvifolia SOBRE ATIVIDADES BIOLÓGICAS PROVOCADAS PELA
PEÇONHA DE Bothrops sp
Niterói
2017
ARTHUR LUIZ CORRÊA
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE

NEUTRALIZANTE DE Myrsine parvifolia SOBRE ATIVIDADES BIOLÓGICAS
PROVOCADAS PELA PEÇONHA DE Bothrops sp
Tese de doutorado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em
Ciências Aplicadas a Produtos para
Saúde (PPG-CAPS) da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal
Fluminense, como requisito parcial
para obtenção do título de Doutor
em Ciências Aplicadas a Produtos
para Saúde. Área de Concentração:
Desenvolvimento de Produtos para
Saúde.
Orientadores: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha

Prof. Dr. André Lopes Fuly
Niterói
2017
2
C824 Corrêa, Arthur Luiz
Estudo fitoquímico e avaliação da capacidade neutralizante de Myrsine

parvifolia sobre atividades biológicas provocadas pela peçonha de Bothrops
sp . / Arthur Luiz Corrêa. - Niterói, 2017.
111 f.
Orientador(a): Leandro Machado Rocha
Tese (Doutorado) – Universidade Federal Fluminense, Faculdade de

Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos
para Saúde, 2017.
1. Myrsine parvifolia. 2. Planta Medicinal. 3. Produção Intelectual. I.

Rocha, Leandro Machado, orient. II. Título. III. Universidade Federal
Fluminense.
CDD: 615.321
AGRADECIMENTOS
 A Deus, por estar sempre presente em minha vida, guiando-me e iluminando

meus caminhos;
 Aos professores e funcionários da Faculdade de Farmácia da UFF e do PPG-
CAPS pela contribuição à minha formação acadêmica e pela oportunidade de
realizar o doutorado;
 Ao Prof. Dr. Leandro Rocha, pela confiança, conselhos, incentivo, ensinamentos
e, sobretudo à amizade;
 À Prof. Dra. Bettina Ruppelt, pelo apoio, confiança, paciência, ensinamentos e
amizade, que foram fundamentais para a realização deste trabalho;
 Aos meus pais e familiares pelo incentivo e paciência, em especial à minha tia-
mãe Dolores pelo carinho e conselhos;
 Aos colegas do LTPN, pela ajuda e momentos de descontração, em especial ao
meu aluno de IC Gabriel e também ao Sr. Iraí, Ricardo Diego, Ricardo Esteves,
Diogo, Francisco, Luis Armando, Leonor, Érica Ribeiro, Henrique e demais
alunos que tive o prazer de conviver no laboratório;
 Ao Prof. Dr. Marcelo Guerra pela identificação do material botânio;
 Ao Sr. Jorge, pela receptividade e valiosos ensinamentos sobre a Restinga de
Jurubatiba;
 À prof. Dra. Adriana Passos pela amizade e ajuda;
 Á equipe do Laboratório Multiusuário do PPG-CAPS, em especial à Camila e
Nelise;
 Ao IVB pelo fornecimento da peçonha de Bothrops jararaca e animais para
experimentação;
 Ao biotério do IVB por todo apoio e ajuda e aos funcionários Diego, Samira,
Valéria, Maura e José Dacasa;
 Ao Laboratório de Aracnário do IVB pela receptividade e ajuda em especial às
funcionárias Glauciane e Laila, e ajuda da aluna Brena.
 Ao Prof. Cláudio Maurício pelo apoio, disponibilização do espaço físico para
realização do trabalho e receptividade;
iv
 Ao Laboratório de Farmacologia do INCQS/FIOCRUZ pelo apoio na realização
dos ensaios de pleurisia, em especial à Flávia, Dr. Fausto e Dr. Fábio pela
confiança, paciência e aprendizado;
 Ao LAREN-UFF pelos espectros de RMN;
 À Plataforma de Métodos Analíticos/PDTIS da Fiocruz, pela realização dos
ensaios cromatográficos;
 Ao Prof. Dr. André Fuly pela coorientação e ao seu laboratório, em especial ao
Eduardo, pela realização dos ensaios in vitro;
 Aos amigos Camila Marques, Carolina Catta Preta, Renata Corrêa, Eliza Chazin,
Pedro Batalha, Débora Eiriz, Paula Duarte, Paula Arantes, Ana Carolina,
Mariane Rocha, Livia Rubatino e aos irmãos do coração Acácio Silva e Lílian
Balut pela ajuda e carinho sempre dispensado;
 Aos professores Dr. Fábio Amendoeira, Dr. Jairo Bastos e Dr. José Carlos
Tavares por aceitarem o convite para participar da banca de avaliação deste
trabalho;
 À prof. Dra. Sorele Fiaux pela disponibilidade de revisar este trabalho;
 À Faperj, pelo apoio financeiro e concessão da bolsa;
 A todos que contribuíram de alguma forma para realização deste trabalho, e para
meu desenvolvimento pessoal e profissional, meu muito obrigado.
v
E nunca considerem seu estudo como uma
obrigação, mas sim como uma oportunidade
invejável de aprender, sobre a influência
libertadora da beleza no domínio do espírito,
para seu prazer pessoal e para o proveito da
comunidade à qual pertencerá o seu trabalho
futuro
Albert Einstein
vi
RESUMO
Acidentes envolvendo serpentes do gênero Bothrops são uma das principais causas de
envenenamento no Brasil, e constituem importante problema de saúde pública devido as
elevadas taxas de mortalidade e morbidade. A peçonha de Bothrops provoca danos
teciduais locais e o processo inflamatório é uma das suas principais complicações. O
tratamento preconizado pela Organização Mundial de Saúde para os acidentes ofídicos
constitui na administração de soro hiperimune que neutraliza efeitos sistêmicos, mas
não inibe o desenvolvimento de efeitos locais. Desta forma, a busca de tratamentos
alternativos/complementares torna-se necessário. Este estudo tem como objetivo
caracterizar os constituintes químicos dos extratos de Myrsine parvifolia e avaliar sua
ação inibitória sobre os efeitos locais induzidos pela peçonha de B. jararaca e B.
jararacussu. No presente estudo, foi determinada a composição química do óleo
essencial de frutos e folhas de M. parvifolia e o perfil químico dos extratos bruto
hidroetanólico, fração em hexano, fração em diclorometano, fração em acetato de etila,
fração em butanol e extrato bruto aquoso de suas folhas. O teor de polifenóis, taninos e
de flavonoides totais foi determinado por técnicas espectrofotométricas. As substâncias
foram identificadas por técnicas cromatográficas e espectrométricas. A atividade
antioxidante foi determinada usando os ensaios de sequestro do radical 1-difenil-2-
picrilhidrazila (DPPH). Avaliou-se a capacidade dos extratos em inibir atividade
proteolítica e coagulante induzida pela peçonha de B. jararacussu em modelo in vitro e
a capacidade de proteção contra letalidade e redução do processo inflamatório (aumento
da permeabilidade vascular, edema de pata e migração de leucócitos) induzido pela
peçonha de B. jararaca em modelo in vivo. Inibição da proteólise e coagulação induzida
pela peçonha de B. jararacussu foi verificada após pré-incubação da peçonha com os
extratos (10:1). Camundongos suíços foram pré-tratados com extrato (100 mg/kg) uma
hora antes da administração da peçonha de B. jararaca e submetidos ao ensaio de
indução de letalidade, edema de pata, aumento da permeabilidade vascular
intraperitoneal e pleurisia. Os principais constituintes químicos identificados no óleo
essencial de folhas de M. parvifolia foram óxido de cariofileno (14,4%), β-cariofileno
(12,6%) e γ-muuroleno (7,9%) e nos frutos β-cariofileno (11,7%) e δ-cadineno (7,1%).
Os flavonoides miricetina, miricetina-3-O-β-arabinopiranosideo, quercetina e
kaempferol foram isolados da fração acetato de etila. Terpenos, vitaminas liposolúveis e
ácidos graxos foram identificados na fração em hexano e diclorometano. Todos os
extratos inibiram atividade proteolítica (81-100%) enquanto que a coagulação induzida
por B. jararacussu foi prolongada pelo extrato bruto hidroetanólico e fração em butanol.
Verificou-se aumento da taxa de sobrevida entre os animais tratados com fração em
acetato de etila (40%). Nos animais tratados com extrato bruto hidroetanólico e fração
em diclorometano observaram-se redução do edema total (40 e 52%, respectivamente),
redução do aumento da permeabilidade vascular (32,2 e 32,4%, respectivamente) e
redução do influxo de leucócitos na cavidade pleural (42 e 39%, respectivamente). No
grupo tratado com a fração em hexano observou-se apenas redução do edema (37%). A
inibição de enzimas proteoliticas e prócoagulantes da peçonha de B. jararacussu e
redução da inflamação induzida pelo envenenamento por B. jararaca, demonstram o
potencial antiofidico de folhas de M. parvifolia, principalmente no controle da
morbidade observada dos acidentes por serpentes do gênero Bothrops.
Palavras-chave: Myrsine parvifolia. Bothrops jararaca. Bothrops jararacussu. Planta

medicinal
vii
ABSTRACT
Accidents involving snakes of the genus Bothrops are one of the main causes of
poisoning in Brazil, and represent a significant problem of public health due to its high
rates of mortality and morbidity. The Bothrops venom causes local tissue damage and
the inflammatory process is one of its major complications. The recommended
treatment for snakebites by the World Health Organization is the administration of
hyperimmune serum which neutralizes systemic effects, but does not inhibit the
development of local effects. Therefore, the search for alternative/complementary
treatments becomes necessary. This study aims to characterize the chemical constituents
and evaluate the inhibitory effects of Myrsine parvifolia extracts against local effects
induced by the Bothrops jararaca and B. jararcussu venom. In the present study, it has
been estabilished the chemical composition of the essential oil from the M. parvifolia
leaves and fruits and the chemical profile of the hydroethanolic crude, hexane,
dichloromethane, ethyl acetate, butanol and aqueous crude extracts. The concentration
of total phenols, tannins and flavonoids was established using spectrophotometric
techniques. Compounds were identified by chromatographic and spectrometric
techniques. The antioxidant activity was determined by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
radicals (DPPH) radical scavenging assay. The extracts ability to inhibit proteolytic and
coagulant activity induced by the B. jararacussu venom was determined in vitro and
their ability of protection against lethality and reduction of the inflammatory process
(increase in vascular permeability, paw edema and leukocyte migration) induced by the
B. jararaca venom was determined in vivo. Inhibition of proteolysis and coagulation
induced by the B. jararacussu venom was verified after preincubation of the venom
with extracts (10: 1). Swiss mice were pretreated with extract (100 mg/kg) one hour
before the administration of the B. jararaca venom and then submitted to the assays of
lethality, paw edema, increased intraperitoneal vascular permeability and pleurisy. The
main substances identified in the essential oil of leaf of M. parvifolia were
caryophyllene (14.4%), β-caryophyllene (12.6%) and γ-muurolene (7.9%) and in the
fruits β-caryophyllene (11.7%) and δ-cadinene (7.1 %) were identified. The flavonoids
myricetin, myricetin-3-O-β-arabinopyranoside, quercetin and kaempferol were isolated
from the ethyl acetate extract. Terpenes, fat-soluble vitamins and fatty acids were
identified in the hexane and dichloromethane extracts. All extracts inhibited proteolytic
activity (81-100%), while coagulant activity induced by the B. jararacussu was
inhibited only by hydroethanolic crude and buthanol extracts. There was an increase in
survival rates in the animals treated with ethyl acetate extract (40%). In the animals
treated with the hydroethanolic crude and dichloromethane extract it was noted total
edema reduction (40 and 52 %, respectively), reduction in vascular permeability
increase (32.2 and 32.4 %, respectively) and reduction of leukocytes in the pleural
cavity (42 and 39 %, respectively). Inhibition of proteolytic and procoagulant enzymes
from B. jararacussu venom and the reduction of inflammation induced by B. jararaca
poisoning demonstrate the antiofidic potential of M. parvifolia leaves, mainly in the
control of morbidity observed in accidents coused by Bothrops snakes.
viii
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................... vii

ABSTRACT .............................................................................................................. viii
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. xii
LISTA DE TABELAS .............................................................................................. xvii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ............................................................... xviii
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 1
1.1 Acidentes ofídicos ............................................................................................... 1
1.2 Bothrops (Bothropoides) jararacussu .................................................................. 4
1.3 Bothrops (Bothropoides) jararaca ....................................................................... 4
1.4 Composição da peçonha de Bothrops sp. ............................................................. 5
1.5 Aspectos clínicos e fisiopatológicos do acidente por Bothrops sp......................... 7
1.6 Tratamento de acidentes ofídicos ......................................................................... 9
1.7 Espécies vegetais com atividade antiofídica ....................................................... 10
1.8 Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba ........................................................ 12
1.9 Gênero Myrsine ................................................................................................. 14
1.9.1 Myrsine parvifolia ....................................................................................... 15
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................ 18
3 OBJETIVOS ........................................................................................................ 19
3.1 Objetivo geral .................................................................................................... 19
3.2 Objetivos específicos ......................................................................................... 19
4. METODOLOGIA .................................................................................................. 20
4.1 Fitoquímica ....................................................................................................... 20
4.1.1 Material vegetal .......................................................................................... 20
4.1.2 Extração do óleo essencial........................................................................... 20
4.1.2.1 Determinação da composição química do óleo essencial por CG/EM ....... 20
4.1.3 Preparo dos extratos .................................................................................... 21
4.1.4 Determinação do teor de polifenol total ....................................................... 22
4.1.5 Determinação do teor de flavonoides totais ................................................. 23
4.1.6 Determinação do teor de tanino total ........................................................... 23
4.1.7 Análise dos extratos por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) .......... 24
ix
4.1.8 Perfil químico da fração em acetato de etila por CLUE................................ 25
4.1.9 Isolamento e identificação de flavonoides ................................................... 25
4.1.9.1 Reações de deslocamento químico para identificação de flavonoides por
espctrofotometria UV........................................................................................... 26
4.1.9.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear .................................. 26
4.1.10 Perfil químico do extrato bruto hidroetanólico e fração em diclorometano
por CLAE ............................................................................................................ 27
4.1.11 Perfil químico da fração em hexano e diclorometano por CG/EM.............. 27
4.1.12 Avaliação da atividade antioxidante .......................................................... 28
4.2 Ensaios biológicos in vitro ................................................................................. 29
4.2.1 Peçonha de Bothrops jararacussu................................................................ 29
4.2.2 Protocolo de Neutralização da Peçonha ....................................................... 29
4.2.3 Atividade proteolítica .................................................................................. 29
4.2.4 Atividade anticoagulante ............................................................................. 30
4.3 Ensaios biológicos in vivo.................................................................................. 31
4.3.1 Peçonha de Bothrops jararaca .................................................................... 31
4.3.2 Animais....................................................................................................... 31
4.3.3 Protocolo de tratamento............................................................................... 31
4.3.4 Letalidade ................................................................................................... 32
4.3.5 Permeabilidade vascular .............................................................................. 32
4.3.6 Edema de pata ............................................................................................. 33
4.3.7 Pleurisia ...................................................................................................... 33
4.4 Análise estatística .............................................................................................. 34
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 35
5.1 Análise química do óleo essencial...................................................................... 35
5.2 Teor de polifenol, flavonoides e taninos totais e avaliação da atividade
antioxidante de extratos de folhas de M. parvifolia .................................................. 37
5.3 Análise dos extratos por cromatografia em camada fina ..................................... 40
5.4 Isolamento e identificação de flavonoides .......................................................... 42
5.4.1 Identificação estrutural substância 1 ............................................................ 43
5.5 Perfil químico do extrato bruto hidroetanólico por CLAE-DAD ........................ 72
x
5.6 Perfil químico da fração em hexano e diclorometano por CG-EM ...................... 74
5.7 Ensaio biológico in vitro .................................................................................... 82
5.7.1 Atividade proteolítica .................................................................................. 82
5.7.2 Atividade coagulante ................................................................................... 83
5.8 Ensaios biológicos in vivo.................................................................................. 85
5.8.1 Letalidade ................................................................................................... 85
5.8.2 Permeabilidade vascular .............................................................................. 87
5.8.3 Edema de pata ............................................................................................. 89
5.8.4 Pleurisia ...................................................................................................... 91
5.8.5 Correlação da composição química dos extratos de M. parvifolia e atividades
biológicas in vivo ................................................................................................. 93
6 CONCLUSÃO ......................................................................................................... 97
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 99
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estimativa de morbidade e mortalidade anual decorrentes de acidentes

ofídicos. ................................................................................................................. 2
Figura 2: Proporção relativa de serpentes envolvidas em acidentes ofídicos no Brasil no
período de 2010 a 2015. ......................................................................................... 3
Figura 3: Proporção relativa de serpentes envolvidas em acidentes ofídicos por região
do território brasileiro no período de 2010 a 2015. ................................................. 3
Figura 4: Serpente Bothrops jararacussu (A) e sua distribuição geográfica em território
brasileiro (B).......................................................................................................... 4
Figura 5: Serpente Bothrops jararaca (A) e sua distribuição geográfica em território
brasileiro (B).......................................................................................................... 5
Figura 6: Efeitos biológicos da peçonha de Bothrops sp. ............................................... 8
Figura 7: Myrsine parvifolia.. ...................................................................................... 15
Figura 8: Distribuição geográfica de Myrsine parvifolia.. ............................................ 16
Figura 9: Ilustração retratando partes de Myrsine parvifoia. (A) ramo com frutos, (B)
fruto, (C) flor estaminada em botão, (D) flor pistilada com fruto em formação.. ... 17
Figura 10: Esquema de partição de extrato bruto hidroetanólico de folhas de Myrsine
parvifolia. ............................................................................................................ 22
Figura 11: Esquema de purificação da fração acetato de etila de Myrsine parvifolia e
isolamento das substâncias 1, 2, 3 e 4................................................................... 26
Figura 12: Fórmula estrutural das substâncias majoritárias identificadas no óleo
essencial de M. parvifolia: (a) β-cariofileno, (b) Óxido de cariofileno, (c) γ-
muuroleno e (d) δ-cadineno. ................................................................................ 37
Figura 13: Curva calibração ácido gálico em 765 nm empregada na determinação do
teor de polifenol total. .......................................................................................... 38
Figura 14: Curva calibração ácido piragolol em 715 nm empregada na determinação do
teor de tanino total. .............................................................................................. 39
Figura 15: Curva de calibração da quercetina a 430 nm empregada na determinação do
teor de flavonoides totais. .................................................................................... 39
Figura 16: Cromatografia em camada fina com o extrato bruto hidroetanólico. (1),
fração em hexano (2), fração em diclorometano (3), fração em acetato de etila (4) e
fração em butanol (5) de folha de Myrsine parvifolia. Fase móvel: hexano e acetato
de etila (7:3)......................................................................................................... 41
Figura 17: Cromatografia em camada fina com o extrato bruto hidroetanólico (1), fração
em hexano (2), fração em diclorometano (3) da folha de Myrsine parvifolia e
xii
padrão lupeol (4). Fase móvel: hexano e acetato de etila (9:1). Revelador:
Anisaldeído sulfúrico e aquecimento. ................................................................... 41
Figura 18: Cromatograma em camada fina com o extrato bruto hidroetanólico. (1),
fração em diclorometano (2), fração em acetato de etila (3) de folhas de Myrsine
parvifolia, padrão de miricetina (4), padrão de quercetina (5) e padrão de
kaempferol (6). Fase móvel: acetato de etila/diclorometano/água (7:3:1).
Revelador: NP/PEG e UV-365 nm. ...................................................................... 42
Figura 19: Cromatograma em 365 nm da fração em acetato de etila de folhas de Myrsine
parvifolia. ............................................................................................................ 43
Figura 20: Espectro de RMN 1H (500MHz, CD3OD) da substância 1. ......................... 45
Figura 21: Espectro expandido de RMN 1H (6,15 –7,35 ppm) da substância 1. ........... 46
Figura 22: Espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C – HSQC da
substância 1. ........................................................................................................ 47
Figura 23: Estrutura química de miricetina .................................................................. 48
Figura 24: Cromatograma do sinal base (modo positivo) em 365 nm (A) e espectro de
massa (B) da substância 1, obtido por CLUE-DAD-EM. ...................................... 49
Figura 26: Espectro expandido de RMN 1H (4,9 – 7,5ppm) (500MHz, CD3OD) da
substância 2. ........................................................................................................ 52
Figura 27: Espectro expandido de RMN 1H (3,3 – 4,0ppm) (500MHz, CD3OD) da
substância 2. ........................................................................................................ 53
substância 2. ........................................................................................................ 54
Figura 29: Espectro bidimensional de correlação homonuclear 1H x 1H – COSY da
substância 2. ........................................................................................................ 55
Figura 30: Espectro RMN 13C (125MHz, CD3OD) da substância 2. ............................ 56
Figura 31: Estrutura química de miricetina 3-O-β-arabinopiranosídeo. ........................ 57
massa (B) da substância 2, obtido por CLUE-DAD-EM. ...................................... 58
Figura 34: Espectro expandido de RMN 1H (6,2 – 6,9ppm) da substância 3. ............... 61
Figura 35: Espectro expandido de RMN 1H (7,54 – 7,76 ppm) da substância 3 ........... 62
substância 3. ........................................................................................................ 63
Figura 37: Espectro de RMN 13C-APT (500MHz, CD3OD) da substância 3. ............... 64
Figura 38: Estrutura química de quercetina. ................................................................ 65
xiii
massas (B) da substância 3, obtido por CLUE-DAD-EM. .................................... 66
Figura 40: Espectro de RMN 1H (500MHz, CD3OD) da substância 4. ........................ 68
Figura 41: Espectro expandido de RMN 1H (6,2 – 8,1 ppm) da substância 4. .............. 69
substância 4. ........................................................................................................ 70
Figura 43: Estrutura química do kaempferol................................................................ 71
massas (B) da substância 4, obtido por CLUE-DAD-EM. .................................... 72
Figura 45: Cromatograma em 365 nm do extrato bruto hidroetanólico de folhas de
Myrsine parvifolia (A), cromatograma flavonoides referência (B), cromatograma
do extrato bruto hidroetanólico fortificado (C). Miricetina (1) e miricetina-3-O-β-
arabinopyranoside (2). CLAE utilizando coluna fase inversa (C-18, 4.0 mm × 250
mm, 5 μm), fase móvel: (A) ácido trifluoracético 0,1% e (B) metanol com ácido
trifluoracético 0,1%; gradiente: (i) 0-30 min, 40-65% B, (ii) 30-32 min, 65-40% B e
(iii) 32-35 min, 40% B.; fluxo: 0.8 mL/min. ......................................................... 73
Figura 46: Cromatograma da fração em hexano de folhas de M. parvifolia, obtido por
CG-EM. ............................................................................................................... 74
Figura 47: Espectros de massas do éster metílico do ácido hexadecanóico (5), éster
etílico do ácido hexadecanóico (6) e éster etílico do ácido octadecanóico (7)
identificados na fração em hexano de folhas de M. parvifolia, obtido através de
ionização eletrônica por impacto de elétron a 70 ev. ............................................. 75
Figura 48: Rearranjo de McLafferty em ésteres de ácido carboxílicos. ........................ 75
Figura 49: Espectro de massas do α-tocoferol (vitamina E) (8) e γ-tocoferol (9)
identificados na fração em hexano de folhas de M. parvifolia, obtido através de
ionização eletrônica por impacto de elétrons 70 eV. ............................................. 76
Figura 50: Proposta de fragmentação para os ésteres de α-tocoferol. ........................... 77
Figura 51: Espectro de massas da lupeona (10) e lupeol (11) identificados na fração em
hexano de folhas de M. parvifolia, obtido através de ionização eletrônica por
impacto de elétrons 70 eV. ................................................................................... 77
Figura 52: Esquema geral de fragmentação de triterpenos pentacíclicos da série lupan
............................................................................................................................ 78
Figura 53: Espectro de massas dos triterpenos lupeona (10) e lupeol (11) identificados
na fração em hexano de folhas de M. parvifolia, obtido através de ionização
eletrônica por impacto de elétrons 70 eV.............................................................. 78
Figura 54: Formação dos íons em m/z 189 e 207 característicos do lupeol ................... 79
Figura 55: Cromatograma da fração em diclorometano de folhas de M. parvifolia,
obtido por CG-EM. .............................................................................................. 80
xiv
Figura 56: Substâncias identificadas por CG-MS na fração em hexano e fração em
diclorometano de folhas e M. parvifolia: éster metílico do ácido hexadecanóico (5),
éster etílico do ácido hexadecanóico (6), éster etílico do ácido octadecanóico (7), α-
tocoferol (vitamina E) (8), γ-tocoferol (9), lupeona (10), lupeol (11) e éster etílico
do ácido linoleico (12). ........................................................................................ 81
Figura 57: Inibição da proteólise induzida por peçonha de Bothrops. jararacussu após
incubação por 30 min à 37ºC com extrato bruto hidroetanólico (EBH), fração em
hexano (HEX), fração em diclorometano (DCM), fração em acetato de etila (EA) e
fração em butanol (BUT) de folhas de Myrsine parvifolia. Dados expressos como
Média ± Desvio padrão de três experimentos independentes (n=3). ...................... 83
Figura 58: Tempo de coagulação induzida por peçonha de Bothrops. jararacussu após
incubação por 30 min à 37ºC com solução salina (NaCl), dimetisufóxido (DMSO),
extrato bruto hidroetanólico (EBH), fração em hexano (HEX), fração em
diclorometano (DCM), fração em acetato de etila (AE) e fração em butanol (BUT)
de folhas de M. parvifolia. Dados expressos como média ±desvio padrão de três
experimentos independentes (n=3), *: nível significância (p<0,05) quando
comparado com os controles (NaCl e DMSO). #: não coagulável em 600s. .......... 84
Figura 59: Curva padrão de Azul de Evans em 590nm (n = 4). ................................... 87
Figura 60: Efeito dos extratos de Myrsine parvifolia sobre aumento da permeabilidade
vascular induzido por peçonha de Bothrops jararaca. Os animais foram tratados
com DEXA (dexametasona 1,0 mg/kg, vo), DICLOF (diclofenaco de sódio 15,0
mg/kg, vo) EBH (extrato bruto hidroetanólico), HEX (fração em hexano), DCM
(fração em diclorometano), AE (fração em acetato de etila), BUT (fração em
butanol) ou EBA (extrato bruto aquoso) (100 mg/kg, vo) sessenta minutos antes da
administração de 1 mg/kg de Peçonha de B. jararaca por via intraperitoneal. Grupo
controle foi tratado com veículo (dispersão de 5% de polissorbato 80 em água, 10
mL/kg). Valores da concentração do corante Azul de Evans são expresos como
média ± desvio padrão (n=8). Tratamento estatístico dos dados foi realizado por
ANOVA seguido de pós teste Newman-Keul. *p<0.05 e **p<0.01 quando
comparado ao grupo controle. .............................................................................. 88
Figura 61: Efeito de extratos de Myrsine parvifolia sobre edema induzido por peçonha
de Bothrops jararaca. (A) Curva de edema tempo-dependente, (B) Edema total
calculado como AUC durante período de 5 h. Os animais foram tratados com
DEXA (dexametasona 1,0 mg/kg, vo), DICLOF (diclofenaco de sódio 15,0 mg/kg,
vo) EBH (extrato bruto hidroetanólico), HEX (fração em hexano), DCM (fração em
diclorometano), AE (fração em acetato de etila), BUT (fração em butanol) ou EBA
(extrato bruto aquoso) (100 mg/kg, vo) sessenta minutos antes da administração
intraplantar de 5 μg of de peçonha de B. jararaca (50 μL de solução a 100 μg/mL).
Grupo controle foi tratado com veículo (dispersão de 5% de polissorbato 80 em
água, 10 mL/kg). Os valores são expressos como média ± desvio padrão (n=8).
Tratamento estatístico dos dados foi realizado por ANOVA seguido de pós teste
Newman-Keul. *p<0.05 e **p<0.01 quando comparado ao grupo controle. ......... 90
xv
Figura 62: Efeito dos extratos de Myrsine parvifolia sobre o número de leucócitos totais
(A), neutrófilos (B) e monócitos (C) em modelo de pleurisia induzido por peçonha
de Bothrops jararaca. Os animais foram tratados com Dexa (dexametasona 1,0
mg/kg, vo), EBH (extrato bruto hidroetanólico), HEX (fração em hexano), DCM
(fração em diclorometano), AE (fração em acetato de etila), BUT (fração em
butanol) ou EBA (extrato bruto aquoso) (100 mg/kg, vo) sessenta minutos antes da
administração intratorácica de 5 μg of de peçonha de B. jararaca (50 μL de solução
a 100 μg/mL). Grupo controle foi tratado com veículo (dispersão de 5% de
polissorbato 80 em água, 10 mL/kg). Valores são expressos como média ± desvio
padrão (n=6). Tratamento estatístico dos dados foi realizado por ANOVA seguido
de pós teste Newman-Keul. *p<0.05, **p<0.01 e ***p<0.001 quando comparado
ao grupo controle. ................................................................................................ 92
xvi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Abundância relativa (%) dos constituintes do óleo essencial de folhas e frutos
de Myrsine parvifolia. .......................................................................................... 35
Tabela 2: Teor de polifenol total, flavonoide e tanino, atividade antioxidante e índice de
atividade antioxidante de extratos de folhas de M. parvifolia................................ 38
Tabela 3: Tempo de retenção, relação massa carga e valores de aborções máximas das
substâncias isoladas a partir da fração em acetato de etila de folhas de M.
parvifolia. ............................................................................................................ 43
Tabela 4: Deslocamento químico na região do ultravioleta da substância 1 em metanol,
acetato de sódio, metóxido de sódio, cloreto de alumínio e ácido bórico............... 44
Tabela 5: Deslocamento químico de RMN de 1H e 13C constantes de acoplamento da
substância 1 comparado com dados de miricetina obtidos da literatura. ................ 48
Tabela 7: Deslocamento químico de RMN de 1H e 13C da substância 2 comparado com
dados de miricetina 3-O-β-arabinopiranosídeo obtidos da literatura. .................... 57
Tabela 9: Deslocamento químico de RMN de 1H e 13C e constantes de acoplamento da
substância 3 comparado com dados de quercetina obtidos da literatura. ............... 65
Tabela 11: Deslocamento químico de RMN de 1H e 13C da substância 4 comparado com
dados de Kaempferol obtidos da literatura............................................................ 71
Tabela 12: Substância e classes químicas de substância identificadas nas folhas de M.
parvifolia. ............................................................................................................ 82
Tabela 13: Efeito dos extratos de folhas de Myrsine parvifolia (100mg/kg, vo, 1h) sobre
a letalidade induzida pela peçonha de Bothrops. jararaca (9,6 mg/kg). ................ 86
xvii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
1D: unidimensional
2D: bidimensional
AA: Atividade Antioxidante
Abs: absorvância
AlCl3: cloreto de alumínio
ANOVA: análise de variância
APT: Attached Proton Test
ara: arabinose
AUC: área sob a curva, do inglês Area Under Curve
BaP1: metaloprotease da classe P-I isolada do veneno de Bothrops asper
BUT: fração em butanol
Calc: calculado
CCD: Cromatografia em Camada Delgada
CD3OD: metanol deuterado
CE: Concentração Efetiva
cels: células
CEUA: Comissão de Ética no Uso de Animais
CG: Cromatografia em fase Gasosa
CLAE: Cromatografia em fase Líquida de Alta Eficiência
CLUE: Cromatografia em fase Líquida de Ultra Eficiência
CONCEA: Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal
COSY: Espectroscopia de correlação homonuclear (1H-1H)
COX: cicloxigenase
d: dupleto
DAD: Detector de Arranjo de Diodo
xviii
DCM: fração em diclorometano
dd: duplo dupleto
DEXA: dexametasona
DIC: Detector de Ionização em Chama
DICLOF: Diclofenaco de sódio
DL: Dose Letal
DMSO: dimetilsufóxido
DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
EAG: Equivalente de Ácido Gálico
EBA: Extrato Bruto Aquoso
EBH: Extrato Bruto Hidroetanólico
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético
EM: Espectrometria de Massas
EQ: Equivalente de Quercetina
eV: elétron volt
Fiocruz: Fundação Oswaldo Cruz
FUNED: Fundação Ezequiel Dias
HEX: fração em hexano
HSQC: espectroscopia de correlação heteronuclear quantum simples
HT: toxina hemorrágica (do inglês: Hemorragic Toxin)
Hz: hertz
IAA: Índice de Atividade Antioxidante
IBAMA: Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis
IC50: concentração inibitória de 50% do efeito
IES: ionização por eletrospray
IFN-Ƴ: interferon gama
IL: interleucina
xix
INCQS: Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
iNOS: óxido nítrico sintase
ip: intraperitoneal
ipl: intraplantar
IR: Índice de Retenção
it: intratorácica
iv: intravenosa
IVB: Instituto Vital Brazil
J: Constantes de acoplamento
Lit: literatura
LOX: lipoxigenase
LTB4: leucotrieno B4
m/z : relação massa carga
m: multipleto
MM: Massa Molecular
mM: milimolar
Mo: molibdênio
N: normal
NIST: National Institute of Standard and Technology
NP/PEG: éster de difenil boriloxietilamina- polietilenoglicol, (do inglês: Natural

Products-Polyethylene Glycol)
OMS: Organização Mundial de Saúde
p: peso
PA: Pureza Analítica
PBJ: peçonha de B. jararaca
PBS: tampão fosfato de sódio salino (do inglês Phosphate Buffered Saline)
PG: prostaglandina
xx
pH: potencial hidrogeniônico
PLA2: fosfolipase A2
ppm: partes por milhão
q: quarteto
QP: quadrupolo
R2: coeficiente de correlação
RDA: retro Diels-Alder
Rf: fator de retenção (do inglês: Retention factor)
rH: rearranjo de Hidrogênio
RMN: Ressonância Magnética Nuclear
s: singleto
sc: subcutânea
SINAN: Sistema de Informação de Agravos de Notificações
SISBIO: Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade
SVMPs: metaloprotease de peçonha de serpente (do inglês: Snake venom

metalloproteinases)
SVSP: serinoprotease de peçonha de serpente (do inglês: Snake venom serine

proteinases)
TCA: ácido tricloroacético
TMS: tetrametilsilano
TNF- α: fator de necrose tumoral (do inglês: Tumor Necrosis Factor)
Tris: tris-hidroximetil aminometano
UV: ultravioleta
v: volume
vo: via oral
δ: deslocamento químico
xxi
xxii
xxiii
1. INTRODUÇÃO
1.1 Acidentes ofídicos

Os envenenamentos provocados por acidentes envolvendo animais peçonhentos
constituem importante problema de saúde pública, pela frequência com que ocorrem e pela
morbi-mortalidade que ocasionam. Os acidentes ofídicos ocorrem com maior frequência em
países tropicais, desencadeando problemas físicos e psicológicos nos indivíduos acidentados.
As serpentes, escorpiões e aranhas são os principais agentes causadores de envenenamentos
no Brasil (FUNASA, 2001; PINHO & PEREIRA, 2001). No ano de 2009 os acidentes
ofídicos foram reconhecidos pela primeira vez pela Organização Mundial de Saúde (OMS)
como doença tropical negligenciada. Os dados epidemiológicos de acidentes ofídicos ainda
são muito escassos, visto que ocorrem principalmente em regiões rurais e países em
desenvolvimento, onde muitos casos são subnotificados (WARRELL, 2010).
Existem aproximadamente 2.900 espécies de serpentes no mundo, distribuídas em 465
gêneros e 20 famílias, sendo que 410 espécies são consideradas peçonhentas. As serpentes
peçonhentas possuem presas anteriores, com orifício central ou sulco conectado à glândula de
peçonha, que é responsável pela inoculação da peçonha em suas vítimas; fosseta loreal
presente (exceto no gênero Micrurus); pupilas em fenda; cabeça destacada do corpo; a cauda
afina abruptamente, possuem hábitos noturnos e costumam ser vagarosas. As serpentes não
peçonhentas não possuem presas anteriores e fosseta loreal; possuem pupilas circulares;
cabeça não destacada do corpo; a cauda afina progressivamente; hábitos diurnos e costumam
ser ágeis (FUNASA, 2001; PINHO & PEREIRA, 2001).
As serpentes são classificadas de acordo com suas características morfológicas em
quatro famílias: Viperidae, Elapidae, Hydrophiidae e Colubridae (CARDOSO et al, 2003).
No Brasil são encontrados representantes da família Viperidae onde se incluem os gêneros
Bothrops com 32 espécies (conhecidas popularmente como jararaca, jararacuçu, urutu,
caiçaca), Crotalus com 6 espécies (conhecidas popularmente como cascavel) e Lachesis com
apenas uma espécie (conhecida popularmente como: surucucu, pico-de-jaca). A família
Elapidae está representada por 29 espécies pertencentes ao gênero Micrurus (coral-
verdadeira) (BRASIL, 2005).
1
Outras espécies de serpentes, que apresentam menor importância médica por não
serem peçonhentas, também são encontradas no país e são causa comum de acidentes:
Phylodrias (cobra-verde, cobra-cipó), Oxyrhopus (falsa-coral), Waglerophis (boipeva),
Helicops (cobra-d’água), Eunectes (sucuri) e Boa (jibóia), dentre outras (FUNASA, 2001;
BRASIL, 2005).
O maior número de acidentes ofídicos ocorre na Ásia, África e Américas, em especial
América do Sul, conforme apresentado na Figura 1 (GUTIERREZ et al, 2010). Estima-se que
ocorra anualmente no mundo cerca de 5.400.000 acidentes ofídicos, dos quais cerca de
421.000 a 1.841.000 envolvem espécies peçonhentas, resultando em 20.000 a 94.000 óbitos
(KASTURIRATNE et al., 2008).
Figura 1: Estimativa de morbidade e mortalidade anual decorrentes de acidentes ofídicos (GUTIERREZ et al.,
2010).
No Brasil, os acidentes por animais peçonhentos são de notificação compulsória e as

informações epidemiológicas são disponibilizadas no Sistema de Informação de Agravos de
Notificações (SINAN). Apesar da existência de sistemas de registro de acidentes, acredita-se
que o número de acidentes ofídicos seja muito maior do que o registrado, devido às falhas de
coletas de dados e subnotificações.
2
Entre os anos de 2010 e 2015 foram registradas 188.310 notificações de acidentes
ofídicos no Brasil sendo que 86% dos acidentes envolviam serpentes do gênero Bothrops,
conforme apresentado na Figura 2 (SINAN, s.d.).
Figura 2: Proporção relativa de serpentes envolvidas em acidentes ofídicos no Brasil no período de 2010 a 2015
(SINAN, s.d.).
A região sudeste (331.458 notificações), nordeste (269.842 notificações) e sul

(154.474 notoficações) registraram maior número de notificações de acidentes ofídicos, com
predomínio de acidentes envolvendo serpentes do gênero Bothrops, conforme apresentado na
Figura 3 (SINAN, s.d.).
Figura 3: Proporção relativa de serpentes envolvidas em acidentes ofídicos por região do território brasileiro no
período de 2010 a 2015 (SINAN, s.d.).
3
O gênero Bothrops é representado por aproximadamente 45 espécies das quais 32 são
encontradas no território brasileiro. As serpentes do gênero Bothrops possuem uma vasta
nomenclatura popular, sendo suas principais denominações: jararaca, jararacussu, caiçara,
urutu, entre outros. Entre as principais espécies do gênero, pode-se citar a B. atrox, encontrada
na região amazônica; B. erythromelas, encontrada na região nordeste; B. jararaca endêmica
de áreas agrícolas e periurbanas de todo território nacional; B. jararacussu, encontrada na
região sul e sudeste e B. alternatus, encontrada na região centro-oeste (BRASIL, 2010a).
1.2 Bothrops (Bothropoides) jararacussu

Dentre as serpentes do gênero Bothrops, a Bothrops jararacussu apresenta maior
tamanho, podendo atingir até 2,2 m de comprimento e injeta uma grande quantidade de
peçonha bruta (4 mL) que corresponde a 1,0 g de peçonha em peso seco. Esta espécie é
encontrada nas regiões sul e sudeste do Brasil (Figura 4), no sudeste da Bolívia e Paraguai e
nordeste da Argentina (MILANI et al., 1997).
O envenenamento por B. jararacussu produz sinais e sintomas semelhantes a outras
espécies botrópicas, com hemorragia, edema e necrose marcantes (mionecrose) (MILANI et
al., 1997).
A B
Figura 4: Serpente Bothrops jararacussu (A) e sua distribuição geográfica em território brasileiro (B). (Adaptado
de FUNASA, 2001)
1.3 Bothrops (Bothropoides) jararaca

Bothrops jararaca é uma serpente terrestre de tamanho médio. Apresenta padrão de
coloração que varia do castanho claro até quase completamente negro. Possuem grande
capacidade adaptativa, ocupando tanto áreas silvestres quanto áreas agrícolas, suburbanas e
4
urbanas. É encontrada desde o sul do Bahia até o Rio Grande do Sul, sendo a espécie mais
comum na região sudeste conforme apresentado na Figura 5 (FUNASA, 2001).
A B
Figura 5: Serpente Bothrops jararaca (A) e sua distribuição geográfica em território brasileiro (B). (Adaptado de
FUNASA, 2001)
1.4 Composição da peçonha de Bothrops sp.
As peçonhas de serpentes são constituídas de uma mistura complexa de substâncias de

natureza enzimática e não enzimática como carboidratos, lipídeos, aminoácidos e proteínas e
substâncias inorgânicas como cálcio, ferro, sódio, fósforo e zinco, que são armazenados nas
glândulas produtoras de peçonha e utilizados pela serpente para imobilizar suas presas
(GOMES et al., 2010). A peçonha botrópico caracteriza-se principalmente pela presença de
enzimas proteolíticas como metaloproteases (SVMPs), serinoproteinases (SVSPs),
fosfolipases A2 (PLA2) e hialuronidases (GUTIERREZ & LOMONTE, 1989;
ALBUQUERQUE et al., 2013).
As metaloproteases são enzimas envolvidas no desenvolvimento da hemorragia,
edema, hipotensão, inflamação e necrose. São proteinases que compartilham um domínio
proteásico que contêm um átomo de zinco no seu sítio ativo. Podem ser classificadas, de
acordo com seus dominios estruturais, em quatro classes básicas: P-I, P-II, P-III e P-IV. As
metaloproteases da classe P-III, também denominadas hemorraginas, representadas pela
jararragina, atrolisina-A, HF3 e bothropasina, apresentam domínio não catalítico adicional
tipo desintegrina rico em cisteina que lhe conferem propriedade hemorrágica. Estas enzimas
induzem hemorragia através da hidrólise dos componentes da membrana basal dos vasos
5
sanguíneos, como colágeno tipo IV, laminina e proteoglicanas, que conferem estabilidade ao
endotélio vascular (BALDO et al., 2010).
As metaloproteases da classe P-III também apresentam ação fibrinogenolítica, inibem
a agregação plaquetária e exercem ação pró-inflamatória. (MOURA DA SILVA et al., 2007).
Em resposta à redução da coagulação e hemorragia, decorrente de quadro de trombocitopenia
desenvolvido pelo acidente botrópico, o sistema de coagulação é ativado e um quadro inicial
de trombose venosa pode ser instalado. Ao longo do tempo, no entanto, a ativação da cascata
de coagulação resulta no consumo de fatores de coagulação, tornando o sangue incoagulável e
aumentando o tempo de sangramento (KAMIGUTI et al., 1991).
A ação pró-inflamatória das metaloproteases da classe P-III pode ser consequência da
degradação de componentes da membrana basal de vasos sanguíneos e consequente
extravasamento de leucócitos e migração para a matriz extracelular ou, da ativação direta de
macrófagos e consequente liberação de mediadores inflamatórios. (MOURA DA SILVA et
al., 2007).
A jararragina, principal metaloprotease presente no veneno botrópico, induz a
ocorrência de alterações morfológicas nas células endoteliais que resultam na ativação de
processo apoptótico e consequente liberação de citocinas pró-inflamatória responsáveis pela
quimiotaxia de neutrófilos. Esta metaloprotease também estimula a expressão de RNAm de
citocinas como TNF-α, IL-1 e IL-6 por macrófagos (MOURA DA SILVA et al., 2007;
TEIXEIRA et al., 2005). Já as metaloproteases da classe P-I, representadas pela atrolisina-C,
HT-2, acutolisina-A e BaP1, possuem apenas o domínio catalítico, são desprovidas de ação
hemorrágica e participam do complexo quadro inflamatório característico do envenenamento
botrópico (FOX & SERRANO, 2009). Gutierrez e colaboradores (2009) demonstraram que a
metaloprotease da classe P-I isolada do veneno de Bothrops asper (BaP1) induz edema de
pata em camundongos e que, quando administrada por via intramuscular induz à infiltração de
leucócitos. Lesão muscular decorrente da atividade proteolítica de BaPI estimulam
macrófagos a sintetizar os mediadores inflamatórios IL-1β e IL-6, e ativar o sistema
complemento gerando o fator quimiotático C5a.
As serinoproteases são caracterizadas como enzimas com atividade do tipo trombina
pois atuam catalisando a conversão direta do fibrinogênio plasmático em fibrina, sem a
necessidade da participação da trombina endógena. Atuam na cascata de coagulação pela
ativação dos fatores II, V e VIII, induzem a fibrinólise e agregação plaquetária e atuam na
degradação proteolítica das células, causando um desequilíbrio no sistema hemostático
(CUNHA et al., 2012). Em ensaios in vivo, as serinoproteases promovem ação anticoagulante
6
visto que, diferentemente da trombina endógena, não ativam o fator XIII da coagulação,
responsável pela estabilização do coágulo (KOH et al., 2006).
As fosfolipases A2 (PLA2) são pequenas proteínas, que catalisam a hidrólise da ligação
2-acil-éster na posição sn-2 dos fosfolipídeos de membrana, liberando ácido aracdônico e
lisofosfolipídeos (FERNANDES et al., 2011). Com a liberação de ácido aracdônico, os níveis
de ácido graxo insaturados aumentam e seu metabolismo resulta na formação de espécies
reativas de oxigênio que são responsáveis por causar dano tecidual (VENKATESAN et al.,
2014). Já os lisofosfolipideos são precursosres do fator de agregação plaquetária
(FERNANDES et al., 2011).
O ácido aracdônico quando metabolizado pelas enzimas cicloxigenases (COX) e
lipoxigenases (LOX) origina os prostanoides (prostaglandinas e tromboxanos) e os
leucotrienos. A prostaciclina exerce ação vasodilatadora e potencializa os efeitos
quimiotáticos de outras prostaglandinas. Por sua vez, as prostaglandinas PGE2, PGD2 e
PGF2α, estão envolvidas na patogenia da dor e da febre durante a inflamação (COUTINHO et
al., 2009)
As prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos são substâncias envolvidos em várias
etapas do processo inflamatório, como aumento da permeabilidade vascular, formação do
edema, recrutamento de leucócitos, dor e liberação de mediadores inflamatórios
(CARVALHO et al., 2013). Os leucotrienos, em especial o LTB4, é um potente agente
quimiotático de leucócitos, eosinófilos e monócitos. No sítio da infecção os leucotrienos
ativam os leucócitos, induzindo a degranulação e a produção de superóxidos, que contribuem
para os danos teciduais característicos da inflamação. Os leucotrienos C4, D4 e E4 (LC4, LD4
e LE4) estão envolvidos no aumento da permeabilidade vascular (COUTINHO et al., 2009).
As desordens patofisiológicas provocadas pela ação das fosfolipases A2 incluem ainda
neurotoxicidade, miotoxicidade, cardiotoxicidade, ação sobre plaquetas, hemólise,
hemorragia, hipotensão, edema e lesão tecidual (KINI et al., 2003).
1.5 Aspectos clínicos e fisiopatológicos do acidente por Bothrops sp

O acidente botrópico desencadeia um complexo quadro patofisiológico que incluem
manifestações locais e sistêmicas variadas (ARAUJO et al., 2000). A sintomatologia depende
diretamente da composição da peçonha que varia com o tamanho, idade e hábito alimentar da
serpente (CUNHA et al., 2012). Complicações do acidente ofídico também dependem da
quantidade de peçonha inoculada, da localização da picada, da idade do indivíduo e de suas
condições gerais de saúde (FUNASA, 2001; FERNANDES et al, 2011).
7
A peçonha botrópica apresenta atividade proteolítica, coagulante e hemorrágica, que
induzem um quadro fisiopatológico caracterizado por rápido desenvolvimento do edema e
intensa reação inflamatória no local da picada (NOGUEIRA & ANDRADE, 2011). As
diversas ações do envenenamento botrópico são descritos na Figura 6.
Figura 6: Efeitos biológicos da peçonha de Bothrops sp. (Adaptado de NOGUEIRA & ANDRADE, 2011)
As coagulopatias provocadas por acidentes botrópicos resultam da depleção de fatores

da coagulação, enquanto os sangramentos espontâneos são atribuídos à hemorraginas
causadoras de danos ao endotélio vascular (PAINE et al., 1992).
A reação inflamatória é um fenômeno de natureza complexa que envolve interações
entre células inflamatórias (neutrófilos, linfócitos e monócitos/macrófagos) e sistema vascular
(ALBANO et al., 2013). Os eventos relacionados à inflamação, como o aumento da
permeabilidade vascular e dor, têm sido atribuídos à liberação local de mediadores químicos
como a histamina, bradicinina e anafilotoxinas (C3a e C5a).
Após lesão tecidual vários mediadores inflamatórios são produzidos por células
endoteliais e células residentes (mastócitos, macrófagos e células dendríticas)
(WANDERLAY et al., 2014). PETRICEVICH (2000) observou TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10 e
IFN-Ƴ são as principais citocinas produzidas após envenenamento por B. jararaca.
O edema resulta da ação de hemorraginas (atuam sobre o endotélio capilar e pequenas
vênulas, aumentando a permeabilidade), citocinas (induzem a liberação de histamina, PLA2 e
ácido aracdônico que liberam fosfolipideos da membrana precursores da síntese de
prostaglandinas as quais aumentam a permeabilidade vascular), proteases (favorecem a
produção de oxido nítrico e prostaglandinas), peptídeos vasoativos (inibem a ação da enzima
8
conversora de angiotensina e aumentam a liberação de bradicinina) e fatores do sistema
complemento (LUNA et al., 2011)
O aumento da permeabilidade vascular após estímulo inflamatório é o mecanismo
primário de formação do edema. A resposta inflamatória pode-se iniciar rapidamente com a
ativação de mastócitos e secreção de histamina. Simultaneamente, as fibras sensoriais
aferentes, como a fibra C, promovem a liberação de substância P, que interagem com os
mastócitos estimulando a libertação de histamina adicional. A bradicinina presente na
peçonha botrópica, e a substância P, histamina e serotonina liberadas após indução do
processo inflamatório atuam sobre as células endoteliais induzindo a síntese de óxido nítrico.
Este radical promove relaxamento vascular, necessária para a formação do edema e a
manutenção da resposta inflamatória (DUSSE 2003).
Os derivados do metabolismo do ácido aracdônico são os principais mediadores
envolvido no processo de formação de edema induzido pelo veneno de B. jararaca.
Participam também em menor extensão, o fator de agregação plaquetária, serotonina e
histamina (TREBIEN & CALIXTO, 1989).
Os efeitos sistêmicos do acidente botrópico são caracterizados principalmente por
alterações no sistema de coagulação sanguínea que podem induzir alterações
cardiovasculares, choque hipovolêmico, insuficiência renal, hemorragia em regiões distantes
do local da picada e morte (JORGE & RIBEIRO, 1997).
1.6 Tratamentos de acidentes ofídicos

O quadro clínico desenvolvido pela vítima de acidente ofídico é muito variado e depende
principalmente da quantidade de peçonha inoculada, localização da picada, idade da vítima e
principalmente do tempo decorrido entre o acidente e o atendimento médico. Na região norte
do Brasil, este problema é agravado em consequência das longas distâncias entre os locais de
acidentes e os centros de atendimento médico, dessa forma, os pacientes demoram a receber o
tratamento soroterápico específico (BORGES et al., 1996). Neste contexto, diversas práticas
populares têm sido empregadas nos casos de envenenamentos por serpentes e ausência de
soro específico, dentre as quais se destaca o uso de plantas medicinais (MORS et al., 2000).
O tratamento preconizado pelo Ministério da Saúde para os acidentes ofídicos é a
administração endovenosa de soro antiofídico de acordo com a gravidade do envenenamento
(GOMES et al., 2010). No entanto, apesar de reverter com eficácia os efeitos sistêmicos
provocados pela peçonha, a soroterapia se mostra pouco eficaz no controle de efeitos locais
como edema, hemorragia e necrose que, na maioria das vezes, são responsáveis pela
9
morbidade observada na região da picada. Torna-se, portanto, necessária a busca por
antivenenos de origem sintético ou natural que possam complementar a soroterapia tradicional
(SAMY et al., 2008). Outro fator limitante relacionado à utilização da soroterapia tradicional
é a possibilidade da manifestação de reações adversas, já que os soros são constituídos de
proteínas de origem heterólogas que podem desencadear respostas de hipersensibilidade
(OTERO et al., 2000).
Plantas medicinais representam uma importante fonte de substâncias que apresentam
atividade biológica capaz de auxiliar diretamente no tratamento de envenenamento por
peçonhas de serpentes ou indiretamente como complemento da soroterapia (SOARES et al.,
2005). A utilização de extratos vegetais como antídoto ao envenenamento por picada de
serpentes é uma antiga prática de comunidades indígenas e uma promissora alternativa como
complementação da soroterapia utilizada normalmente, uma vez que dependendo do período
compreendido entre o acidente ofídico e a administração do soro antiofídico, a capacidade
deste neutralizar os efeitos locais é apenas parcial (SOARES et al., 2005). Assim sendo, os
extratos vegetais apresentam-se como terapia adicional no combate aos danos teciduais locais
provocados por peçonhas de serpentes, uma vez que são uma importante fonte de substâncias
farmacologicamente ativas (FERNANDES et al., 2011).
A inibição das enzimas fosfolipases A2, serinoproteinases e metaloproteinases
presentes nas peçonhas é uma estratégia de reduzir significativamente os danos teciduais
locais provocados pelo envenenamento. Logo a busca por inibidores dessas enzimas, como os
provenientes de metabólitos secundários de espécies vegetais, tem se tornado um importante
alvo de pesquisa (MENDES et al., 2013).
1.7 Espécies vegetais com atividade antiofídica

Levantamento bibliográfico de dados fitoquímico e etnobotânico realizado entre 1985
e 2005 identificou 850 espécies vegetais pertencentes a 138 famílias com propriedades
antiofídicas. Aproximadamente 82% dos estudos foram realizados no continente americano, e
64% destes estudos foram relacionados com acidentes provocados pelo gênero Bothrops. As
folhas (24%), raízes (22%) e cascas (17%) foram as partes vegetais mais citadas com
atividade anti-PLA2 (16%), anti-hemorrágica (11%), antiletalidade (8%), antiedema (4%),
anticoagulante (4%) e antiproteolítica (4%), enquanto o levantamento etnofarmacológico foi
responsável por 47% dos trabalhos que relataram espécies vegetais com propriedades
antiofídicas (SOARES et al., 2005).
10
Exemplos de espécies vegetais capazes de inibir atividades biológicas induzidas por
peçonhas de serpentes do gênero Bothrops incluem a Baccharis trimera com atividade anti-
hemorrágica e anti-proteolítica, Bauhinia forficata com atividade anti-coagulante e anti-
fibrinolítica, Blutaparon portulacoides com atividade anti-inflamatória, Brongniartia
podalyrioides, Cissampelos pareira com atividade anti-hemorrágica e anti-proteolítica,
Cordia verbenaceae com atividade inibidora de PLA2, Dipteryx alata com atividade
neutralizante de miotoxinas e neurotoxinas, Eclipta alba com atividade inibidora de PLA2 e
Hypericum brasiliense com propriedade anti-inflamatória, analgésica e de reduzir a letalidade,
edema, hemorragia e hemólise (DEY & DE, 2012).
No Brasil, Nicarágua, China, Nepal e África do Sul, onde é encontrado o maior
número de relatos de plantas com propriedades antiofídicas, destacam-se as famílias vegetais
Acanthaceae (39 relatos), Apocynaceae (67 relatos), Araceae (41 relatos), Asteraceae (102
relatos), Euphorbiaceae (78 relatos) Fabaceae (147 relatos), Lamiaceae (61 relatos),
Malvaceae (37 relatos), Menispermaceae (29 relatos) e Rubiaceae (56 relatos) (MOLANDER
et al., 2012).
A maioria das substâncias farmacologicamente ativas identificadas em extratos
vegetais são caracterizadas por apresentar baixo peso molecular e são consideradas como
substâncias “multifuncionais”, uma vez que apresentam uma grande variedade de
propriedades bioquímicas e farmacológicas. As peçonhas de serpentes que são constituídas
por várias proteínas e enzimas tornam-se, portanto, potenciais alvos de ação de substâncias de
origem natural que neutralizam a peçonha de serpentes ao se complexar com as proteínas,
inibindo ou potencializando suas funções biológicas. Diversas classes de substâncias de
origem natural encontradas em plantas apresentam atividade antiofídica como os esteróis,
triterpenos, compostos fenólicos e polissacarídeos (MORS et al., 2000).
Esteróides que apresentam a capacidade de se ligar a moléculas
orgânicas, como o sitosterol, tigogenina, hecogenina e wedelactona, apresentaram
propriedades antiofídicas e anti-inflamatórias (MORS et al., 2000; GOMES et al., 2010). Os
derivados de ácido cinâmico com atividade antiofídica incluem o ácido caféico e o ácido
ferúlico que também inibem a enzima lipoxigenase e apresentam propriedade anti-
hepatotóxica (MORS et al., 2000).
A propriedade antiofídica em derivados de ácido benzóico como o ácido 2-hidroxi-4-
metoxi- benzóico, pode ser explicada pela presença de grupamento funcional hidroxila e
metoxila, que são descritos pela capacidade de interagir com as metaloproteinases presentes
na peçonha e neutralizar sua ação hemorrágica (GOMES et al., 2010). Já os taninos podem
11
atuar diretamente sobre os constituintes da peçonha ligando-se de forma inespecífica a
proteínas e impedindo que estas se liguem a seus receptores ou através de bloqueio
competitivo (SAMY et al., 2008).
Os polifenois são abundantemente encontrados na natureza e conhecidos
principalmente por sua propriedade antioxidante que protege o organismo da ação do estresse
oxidativo (BIESALSKI, 2007). Os flavonóides são conhecidos por suas propriedades anti-
inflamatórias, anti-hepatotóxica, anti-hipertensiva, antiarrítmica, antialérgica e antitumoral.
Apresentam potencialidade em inibir enzimas e proteínas de peçonhas de serpentes uma vez
que apresentam afinidade por proteínas e metais. A capacidade dos flavonóides inibirem a
ação da metaloproteinases pode ser parcialmente explicada por sua estrutura química que
apresenta grupamentos hidroxilas que interagem com a enzima alvo através de ligações de
hidrogênio e de grupos hidrofóbicos representados pelo anel aromático (PATINO et al.,
2013). A interação dos flavonoides com a enzima fosfolipase A2 depende fundamentalmente
da presença do grupamento hidroxila na posição C5, da carbonila e da ligação dupla no anel
oxano da molécula. As hidroxilas na posição C3’ e C4’ estão relacionadas com a inibição
seletiva da enzima fosfolipase A2 (COTRIM et al., 2012).
Alguns exemplos de flavonóides com propriedade antiofídica incluem a quercetina,
hesperidina, apigenina, kaempferol, luteolina, diosmetina, miricetina e seus respectivos
glicosídeos. Os polissacarídeos, que são reconhecidos por apresentar atividade anti-
inflamatória e imunomoduladora, também podem apresentar propriedade antiofídica (MORS
et al., 2000).
Algumas substâncias isoladas de vegetais apresentam menor proteção a
envenenamento por mordeduras de serpentes quando comparados com misturas complexas de
substâncias encontradas nos extratos vegetais brutos. O extrato de folhas de Perilla
frutescens, por exemplo, caracterizado quimicamente pela presença de peril aldeido,
sitosterol, estigmasterol e campesterol, inibiu a peçonha de serpentes apenas quando a mistura
de peril aldeido e estigmasterol estavam presentes nas preparações utilizadas, a remoção de
uma dessas duas substâncias anulou a propriedade antiofídica observada no extrato bruto
(MORS et al., 2000).
1.8 Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba

O Brasil é composto por diversos biomas e representa a maior biodiversidade do
mundo que ainda é pouco explorada. O Estado do Rio de Janeiro é caracterizado por uma
grande diversidade de ecossistemas que inclui costões rochosos, lagoas, manguezais e
12
restingas (bancos de areia), localizados no litoral e uma vasta planície que se estende desde as
regiões serranas (Serras dos Órgãos, das Araras e da Mantiqueira) até os estados de Minas
Gerais e São Paulo (KELECOM et al., 2002).
Restingas são ecossistemas complexos, formados, ao longo da costa brasileira, como
resultado de transgressões e regressões consecutivas do mar. Elas são caracterizadas por
grandes planícies de sedimentos arenosos, marinhos quaternários que são ondulados por
fileiras de dunas isolando lagoas, lagos, lagunas, pântanos e brejos. A diversidade de
condições físicas origina diferentes ambientes que são colonizados por uma grande variedade
de comunidades vegetais que incluem desde plantas herbáceas, passando por formações
arbustivas e chegando até florestas cujo dossel não ultrapassa 20 m de altura. As restingas
possuem uma vegetação muito característica devido a uma combinação de fatores físico-
químicos, tais como elevada temperatura, salinidade, alta exposição à luminosidade, baixa
disponibilidade de água e pequena oferta de nutrientes que podem coordenar ou alterar a taxa
de produção de metabólitos secundários dos vegetais (COGLIATTI-CARVALHO, 2001). A
redução da temperatura ambiental pode favorecer o aumento da produção de ácido
clorogênico e antocianinas, enquanto a produção de óleos voláteis costuma ser favorecida
pelo aumento da temperatura. O aumento da irradiação solar favorece a produção de
compostos fenólicos os quais exercem importante papel fisiológico ao dificultar a danificação
do tecido vegetal através da absorção/dissipação da energia solar, e também favorece a
biossíntese de terpenoides. O estresse hídrico frequentemente interfere favoravelmente nas
concentrações de glicosídeos cianogênicos, glucosinolatos, terpenóides, antocianinas e
alcaloides (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).
O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba está localizado na região norte
fluminense e compreende os municípios de Macaé (1,4% da área), Carapebus (36% da área) e
Quissamã (63% da área). Com aproximadamente 15.000 hectares, 44 km de extensão de
litoral oceânico e abrigando 18 lagoas, o Parque Nacional de Reserva da Restinga de
Jurubatiba, criado em 29 de abril de 1998, é o primeiro Parque Nacional no Brasil a
compreender exclusivamente o ecossistema de restinga (SANTOS et al., 2009). A vegetação
de restinga, por estar localizada em áreas privilegiadas do litoral, está constantemente
ameaçada pela especulação imobiliária e industrial (ARAÚJO & LACERDA, 1987;
KELECOM et al., 2002).
Levantamento etnobotânico das espécies utilizadas pela população local registrou a
utilização de 117 espécies pertencentes a 47 famílias e 99 gêneros vegetais. Entre as 618
espécies vasculares registradas no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, 19,4% são
13
utilizadas no município de Carapebus para diversas finalidades como alimentar, medicinal,
ornamental, tecnologia, higiênica, aromatizante, construção e combustível (ARAUJO, 2001).
O uso medicinal é o predominante, com 45 espécies, sendo 29 delas utilizadas exclusivamente
como medicinais (SANTOS et al., 2009).
1.9 Gênero Myrsine

A família Primulaceae apresenta ampla distribuição geográfica e é representada por
69 gêneros e 2.580 espécies (THE PLANT LIST, s.d.) dos quais 11 gêneros e 138 espécies
são encontradas no Brasil (FREITAS, s.d.). O gênero Myrsine é caracterizado por plantas
herbáceas que apresentam estruturas de secreção que podem fornecer importante contribuição
taxonômica. A esses tecidos é atribuída a síntese de uma variedade de derivados de
hidroxibenzoquinonas cuja composição pode variar de acordo com a espécie. Apesar de
espécies do gênero apresentarem tecidos de secreção, poucos estudos de caracterização
química do óleo essencial de folhas da família Primulaceae incluindo o gênero Myrsine são
descritos na literatura. O estudo químico do óleo essencial de folhas de M. venosa, M.
coriacea e M. africana mostrou predomínio de β-cariofileno, β-elemeno e naftaleno,
respectivamente (LUNA et al., 2014). Os dados sobre as características químicas do gênero
Myrsine estão relacionados a uma quantidade de espécies relativamente baixa, porém com
grande utilização na medicina popular.
A espécie Myrsine africana L. é utilizada na medicina tradicionalmente para o
tratamento de diarréia, reumatismo, dor de dente, tuberculose pulmonar e hemorragia (ZOU et
al., 2009). Sua propriedade antibacteriana frente a Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli e
moderada atividade hemo-aglutinante em eritrócitos humanos também já foram descritas
(AHMAD et al., 2011). Estudo fitoquímico demonstrou a presença de saponinas
(primulagenina A), esteróides (estigmasterol e sitosterol), mirsinosídeos A e B, ácido gálico,
triterpenos (taraxerona, taraxerol e miricadiol), derivado do ácido oleanólico, lignanas
glicosiladas, derivados de benzoquinonas (embelina, rapanona, mirsinona, 5-O-metil-
embelina e muketanina) e flavonóides (miricetina, quercetina e kaempferol), sendo esta
última, a classe química mais comumente descrita no gênero (ZOU et al., 2009).
A atividade antiviral frente ao vírus Polio tipo 1 e Herpes simplex tipo 1 do extrato
bruto de M. australis e atividade inibidora da enzima fosfolipase D é atribuída a saponinas
triterpênicas como a Primulagenina A (BLOOR & QI, 1994; HEGDE et al.,1995) A espécie
M. seguinii é caracterizada quimicamente pela presença de derivados de ácido benzoico e
ácido mirsinóico que lhe conferem atividade anti-inflamatória (DONG et al., 1999;
14
MIZUSHINA et al., 2000). Derivados glicosilados de hidroquinonas e flavonoides também
foram isolados dessa espécie (ZHONG et al., 1997).
Estudos fitoquímicos de M. rubra demonstraram a presença de miricetina-3-O-α-L-
ramnopiranosideo, quercetina-3-O-α-L-ramnopiranosideo (quercitrina), kaempferol-3-O-β-D-
(6''-galoil)-glicopiranosideo, luteolina-3'-α-L-ramnopiranosideo e epicatequina (FRANÇA et
al., 2011).
Lectinas, glicoproteínas de alto peso molecular que inibem a proliferação celular,
foram isoladas de folhas de M. coriacea e apresentaram atividade antiproliferativa frente a
várias linhagens de célula cancerígena como HT-29, HeLa, PC-3, MDA-MB-231, MCF-7 e
IMR-32 (MEDEIROS et al., 2013). Esta espécie também é utilizada no tratamento de
acidentes ofídicos pela população da província de Antioquia na Colombia (VASQUES et al.,
2015).
1.9.1 Myrsine parvifolia

Myrsine parvifolia A. DC. (Figura 7) é uma espécie arbustiva, nativa não endêmica do
Brasil encontrada nas regiõe Nordeste (Bahia), Sudeste (Espírito Santo, Minas Gerais, São
Paulo e Rio de Janeiro) e Sul (Paraná, Rio Grande do Sul e Santa Catarina) do Brasil (Figura
8) e é conhecida popularmente como capororoca (SANTOS et al, 2009), capororoquinha
(CONAMA, 1999) e pororoca (QUEIROZ et al., 2012). Apresenta como sinonímia botânica
Rapanea parvifolia (A.DC.) Mez, Myrsine bahiensis Casar e Myrsine flocculosa (FREITAS,
s.d.).
Figura 7: Myrsine parvifolia. (Fonte: Marcelo Guerra Santos)
15
Figura 8: Distribuição geográfica de Myrsine parvifolia. (Fonte: FREITAS, s.d.).
M. parvifolia consistem em arbustos com altura de 1,5 – 3,0 m com folhas pequenas,
obovadas e coriáceas. As folhas apresentam 3,5 – 5,0 cm de comprimento e 1,5- 1,8 cm de
largura. São glabras, lisas, obovadas, de base aguda, margem inteira, levemente revoluta,
nervura mediana proeminente em ambas as faces e nervuras secundárias não evidentes. O
pecíolo é alvo-esverdeado com 23 mm de comprimento. As inflorescências apresentam
pedúnculo curto com 1-2 mm de comprimento e 5 a 7 flores pentâmeras. O fruto globoso
possui 5–6 mm comprimento e 3–5 mm de largura com pericarpo imaturo verde, cavidades
secretoras com conteúdo escuros pouco evidentes (Figura 9) (FREITAS & KINOSHITA,
2015).
16
Figura 9: Ilustração retratando partes de Myrsine parvifoia. (A) ramo com frutos, (B) fruto, (C) flor estaminada
em botão, (D) flor pistilada com fruto em formação. (Fonte: FREITAS & KINOSHITA, 2015).
Na Restinga de Jurubatiba, o chá das folhas ecascas da espécie vegetal M. parvifolia é

utilizado para combater a diarreia, e seus frutos são consumidos ao natural (SANTOS et al.,
2009). Esta espécie vegetal, até o presente momento, não possui estudos que avaliam seu
potencial químico e biológico.
17
2. JUSTIFICATIVA
Os envenenamentos provocados por picadas de animais peçonhentos em humanos

constituem importante problema de saúde pública, especialmente em países tropicais e em
desenvolvimento. No Brasil, acidentes com espécies do gênero Bothrops representam cerca de
de 90% dos envenenamentos por serpentes. A soroterapia, tratamento preconizado pela
Organização Mundial de Saúde (OMS), apesar de reverter com eficácia os efeitos sistêmicos
do envenenamento, são pouco eficazes no controle de manifestações locais.
Considerando a complexa composição química da peçonha de serpentes, os extratos
vegetais representam uma importante fonte de substâncias biologicamente ativas com
capacidade de inibir simultaneamente diferentes toxinas. A descrição da atividade anti-
inflamatória da espécie M. australis e M. seguini e do uso popular da espécie M. coriacea
como antiofídica, associada a inexistência de estudos farmacológicos e da composição
química de Myrsine parvifolia, estimulou a realizar o estudo fitoquímico desta última espécie
e avaliar a capacidade dos extratos em neutralizar a letalidade, ação proteolítica, coagulante e
inflamatória induzida pela peçonha de Bothrops sp.
18
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral

Caracterizar a fitoquímica e avaliar a capacidade neutralizante do extrato e frações de
folhas da espécie vegetal Myrsine parvifolia sobre atividades biológicas provocadas pela
peçonha botrópica.
3.2 Objetivos específicos

 Determinar a composição química do óleo essencial das folhas e frutos de M.
parvifolia;
 Determinar o teor de flavonoides, taninos e polifenos total nos extratos de folhas de M.
parvifolia;
 Avaliar a atividade antioxidante dos extratos de folhas de M. parvifolia;
 Identificar, isolar, purificar e identificar a estrutura química das substâncias
majoritárias dos extratos de M. parvifolia;
 Avaliar os efeitos in vitro dos extratos de folhas de M. parvifolia na neutralização da
atividade proteolítica induzida pela peçonha de Bothrops jararacussu;
 Avaliar os efeitos in vivo dos extratos de folhas de M. parvifolia na neutralização da
atividade coagulante induzida pela peçonha de Bothrops jararacussu;
 Avaliar atividade antiofídica dos extratos de folhas de M. parvifolia frente à peçonha
de B. jararaca;
 Avaliar a capacidade dos extratos de folhas de M. parvifolia em inibir o aumento da
permeabilidade vascular induzida pela peçonha de B. jararaca;
 Avaliar a capacidade dos extratos de folhas de M. parvifolia em reduzir o edema
induzido pela peçonha de B. jararaca;
 Avaliar o efeito dos extratos de folhas de M. parvifolia sobre a migração de leucócitos
induzida pela peçonha de B. jararaca.
19
4. METODOLOGIA
4.1 Fitoquímica
4.1.1 Material vegetal

Partes aéreas (folhas e frutos) da espécie vegetal Myrsine parvifolia foram coletados
no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, Carapebus-RJ, em maio de 2013. A coleta do
material vegetal foi realizada com autorização para atividades com finalidade científica
(13659-2) concedida pelo IBAMA/SISBIO. A espécie vegetal foi identificada pelo botânico
Dr. Marcelo Guerra Santos e um exemplar do espécime depositado no Herbário da Faculdade
de Formação de Professores da Universidade Estadual do Rio de Janeiro sob o registro RFFP
17.338 (M.G.Santos 2253).
4.1.2 Extração do óleo essencial

Folhas frescas (500 g) e frutos (200 g) de M. parvifolia foram fragmentados,
separadamente, em liquidificador industrial contendo água destilada, e submetidos ao
processo de hidrodestilação em aparato tipo Clevenger durante 4 horas (EUROPEAN
PHARMACOPOEIA, 2005). O óleo essencial obtido foi desidratado com sulfato de sódio
anidro e armazenado sob refrigeração para posterior análise em Cromatografia em fase
Gasosa acoplada a Detector Ionização de Chama (CG-DIC) e detector de Espectrometria de
Massas (CG-EM). O rendimento da extração foi expresso em gramas de óleo por 100 g de
material vegetal fresco (BRASIL, 2010b).
4.1.2.1 Determinação da composição química do óleo essencial por CG/EM

O óleo essencial de folhas e frutos de M. parvifolia foi analisado em cromatógrafo em
fase gasosa acoplada a espectrometrômetro de massas - GC/EM-QP5000 (SHIMADZU),
utilizando detector de massas com ionização por impacto de elétrons (70 eV). Um miligrama
de cada amostra, dissolvido em CH2Cl2 (1:100 mg/μL), foi injetado (1 µL) separadamente em
coluna RTX-5 (0,25 mm; 30 m; 0,25 μm) (OLIVEIRA et al., 2010).
As amostras foram submetidas às seguintes condições cromatográficas: temperatura de
injeção de 260ºC, temperatura do detector 290ºC, gás de arraste: hélio com fluxo de 1
mL/min, modo de injeção split com razão de 1:40. A temperatura do forno foi mantida
20
inicialmente em 60ºC e posteriormente elevada gradualmente até 290ºC utilizando rampa de
aquecimento de 5ºC/min (TIETBOHL et al., 2012; SENATORE et al., 2013).
O Índice de Retenção (IR) das substâncias foi calculado através de interpolação do
tempo de retenção de uma mistura de padrão de carbonos alifáticos (C9-C30) (Sigma®)
analisados nas mesmas condições que as amostras. As substâncias foram identificadas por
comparação do índice de retenção (IR) e espectro de massas (EM) descritos na literatura
(ADAMS, 2007).
A análise quantitativa relativa das substâncias presentes no óleo essencial foi
realizada pelo método de normalização das áreas dos sinais do cromatograma, obtido após
análise por cromatografia em fase gasosa acoplada detector de ionização de chama (CG/DIC),
empregando as mesmas condições descritas anteriormente para CG/EM.
4.1.3 Preparo dos extratos

As folhas de Myrsine parvifolia (2.700 g) foram secas em estufa com ventilação
forçada, pulverizadas em moinho de facas e submetidas ao processo de extração exaustiva
com etanol 96% pelo método de maceração estática. O material vegetal foi filtrado e o
solvente removido em evaporador rotatório sob pressão reduzida, obtendo assim o extrato
bruto etanólico (690 g) que em seguida foi liofilizado. O extrato bruto hidroetanólico foi
ressuspenso em 2 L de etanol 90% (v/v) e posteriormente particionado com hexano (4 x 1,0
L). A fração orgânica foi evaporada até a secura para obtenção da fração em hexano (12,0 g)
(30,0% de rendimento). O resíduo alcoólico remanescente foi evaporado, resuspenso em 3 L
de água destilada e em seguida submetido a sucessivos processos de partição com
diclorometano (3 x 500 mL), acetato de etila (3 x 500 mL) e butanol (2 x 500 mL), para
obtenção das frações em diclorometano (2,0 g) (0,8% de rendimento), acetato de etila (6,0 g)
(2,4% de rendimento) e butanol (15,0 g) (6,0% de rendimento), respectivamente, conforme
esquema apresentado na Figura 10.
Folhas secas e pulverizadas de M. parvifolia (200 g) foram submetidas a extração por
decocção (20%, p/v) com água à aproximadamente 100ºC por 15 minutos. O extrato foi
filtrado a quente e em seguida liofilizado, fornecendo 4,6 g de extrato bruto aquoso (2,3% de
rendimento) (FELIX-SILVA et al., 2014).
21
Figura 10: Esquema de partição de extrato bruto hidroetanólico de folhas de Myrsine parvifolia.
4.1.4 Determinação do teor de polifenol total

O teor de polifenol total foi determinado no extrato bruto hidroetanólico, fração em
diclorometano, fração em acetato de etila, fração em butanol e extrato bruto aquoso de folhas
de M. parvifolia empregando reagente de Folin-Ciocalteau, conforme descrito pela ISO
14502-1 (2005) e adaptado por ANESINI et al. (2008).
Alíquota de 1,0 mL dos extratos diluídos em metanol (200 µg/mL) foram transferidos
para tubo de ensaio contendo 5 mL de solução aquosa de Folin-Ciocalteu 10% (v/v). Em
seguida adicionou-se 4 mL de solução aquosa de carbonato de sódio 7,5% (p/v). Após
incubação dos tubos por 60 minutos ao abrigo da luz e em temperatura ambiente, os valores
da absorvância foram medidos em espectrofotômetro a 765nm. Utilizou-se água como
solução de compensação (branco). O teor de polfenóis totais foi determinado através da
interpolação dos valores de absorvância em uma curva de calibração empregando ácido gálico
(Sigma ®) na faixa de 10 a 50 µg/mL como padrão. O teor de polifenol total foi expresso em
gramas de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas de amostra (g EAG/100g). As análises
foram realizadas em triplicata.
O reagente de Folin-Ciocalteu consiste em uma mistura dos ácidos fosfomolibídico e
fosfotungstico, na qual o molibdênio encontra-se no estado de oxidação (VI). Na presença de
agentes redutores ocorre reação de oxirredução com formação de complexos de molibdênio-
tungstênio, no qual o molibdênio encontra-se no estado de oxidação (V). Na presença de
compostos fenólicos em meio básico, o ânion fenolato reduz o molibdênio (VI) de coloração
22
amarela à molibdênio (V) de coloração azul, possibilitando assim a quantificação de
polifenóis totais por espectrofotometria (ISO 14502-1, 2005; OLIVEIRA et al., 2009).
4.1.5 Determinação do teor de flavonoides totais

O teor de flavonoides totais foi determinado no extrato bruto hidroetanólico, fração em
de M. parvifolia por método espectrofotométrico conforme preconizado pela Farmacopeia
Brasileira para monografia de Calendula officinalis L. (BRASIL, 2010b) e adaptado por
Marques e colaboradores (2012).
Vinte miligramas dos extratos foram transferidos, separamente, para balão fundo
redondo e submetidos a hidrólise em solução ácida de acetona (1 mL de solução aquosa de
metenamina a 0,5% (p/v), 20 mL de acetona e 2 mL de ácido clorídrico P.A.), e mantidos por
30 minutos sob refluxo. Após resfriamento, o material foi filtrado e transferido de forma
quantitativa para funil de separação, onde foram adicionados 20 mL de água destilada. A
fase aquosa foi lavada com acetato de etila (3 x 15 mL), e as fases orgânicas reservadas e
volume completado para 100 mL.
O método de complexação de flavonóides com cloreto de alumínio 2% (p/v) foi
utilizado na determinação do teor de flavonoides totais. Alíquotas de 2,0 mL de solução do
extrato hidrolisado (200 µg/mL) foram incubados com 2,0 mL de solução metanólica de
AlCl3 2% (p/v) por 10 minutos ao abrigo da luz e em temperatura ambiente. Os valores de
absorvância foram medidos em espectrofotômetro a 430 nm, utilizando metanol como solução
de compensação (branco). O teor de flavonoides totais foi determinado através da
interpolação dos valores de absorvância em uma curva de calibração empregando quercetina
(Sigma®) na faixa de 0,5 a 16 µg/mL como padrão.
O teor de flavonóides totais foram expressos em gramas de equivalentes de quercetina
por 100 gramas de amostra (g EQ/100g). As análises foram realizadas em triplicata.
4.1.6 Determinação do teor de tanino total

O teor de tanino total foi determinado no extrato bruto hidroetanólico, fração em
de M. parvifolia por espectrofotometria utilizando o método de precipitação de taninos com
pó de pele conforme descrito pela Farmacopeia Brasileira para monografia de Eugenia
uniflora (BRASIL, 2010b).
23
Inicialmente procedeu-se a determinação de polifenóis não adsorvidos em pó-de-pele
utilizando-se 10,0 mL de solução metanólica dos extratos (200 µg/mL) e 0,1g de pó de pele
(Sigma®) que foram mantidos sob agitação mecânica por 60 minutos. O material foi filtrado e
o teor de polifenol não adsorvido em pó de pele foi determinado por espectrofotometria a 715
nm utilizando o reagente de Folin-Ciocalteau conforme descrito anteriormente para
determinação do teor de polifenol total (BRASIL, 2010b; ISO 14502-1, 2005). O teor de
polifenol adsorvido em pó de pele (tanino), calculado pela diferença entre polifenol total e
polifenol não adsorvido, foi determinado através da interpolação dos valores de absorvância
em uma curva de calibração empregando piragolol (Sigma®) na faixa de 3,0 a 100 µg/mL
como padrão.
O teor de tanino total (%) foi determinado pela razão entre a concentração de polifenol
adsorvido no pó de pele e a concentração inicial da amostra (MACEDO et al. 2013; SOUSA,
2009). As análises foram realizadas em triplicata.
4.1.7 Análise dos extratos por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

A técnica de Cromatografia em Camada Fina (CCD) foi utilizada para identificar a
classe de substâncias químicas presente nos extratos, e acompanhar o processo de purificação
das amostras por cromatografia em coluna. Para os ensaios cromatográficos utilizou-se como
fase estacionária cromatofolhas de alumínio revestidas com gel de Sílica 60 F254
(ALUGRAM® SIL G/UV254 20 x 20 cm; 0,22 μm; Merck). Como fase móvel foram
utilizados hexano, acetato de etila, ácido fórmico, ácido acético, clorofórmio, metanol e água
em diferentes gradientes de concentração.
O sistema de eluição contendo clorofórmio/metanol/água (7:3:1) e acetato de
etila/ácido acético/ácido fórmico/água (100:11:11:26) foram utilizados como fase móvel para
identificação de agliconas de flavonoides e flavonoides glicosilados, respectivamente. A
detecção de flavonoides foi realizada sob incidência de luz visível e radiação ultravioleta
(UV) em comprimento de onda 254 nm e 365 nm e após emprego de revelador colorimétrico
natural products-polyethylene glycol (NP/PEG) (solução metanólica 1% (p/v) de éster de
difenilboriloxietilamina e solução etanólica 5% (p/v) de polietilenoglicol-4000) (WAGNER &
BLADT, 1995).
O sistema de eluição contendo hexano/acetato de etila (7:3) foi utilizado como fase
móvel para identificação de terpenos após revelação com reagente colorimétrico vanilina
sulfúrica (solução etanólica 1% (p/v) de vanilina e solução etanólica 10% (v/v) de ácido
sulfúrico) ou anisaldeído sulfúrico (solução metanólica 0,5% (v/v) de p-anisaldeído, contendo
24
10% (v/v) ácido acético e 5% (v/v) de ácido sulfúrico) e aquecimento. (WAGNER &
BLADT, 1995).
Bandas cromatográficas observadas na CCD foram caracterizadas pelo valor do fator
de retenção (Rf) e coloração adquirida sob incidência de luz UV e visível antes e depois da
revelação química. Para identificação das bandas cromatográficas, estas foram comparadas
com substâncias referência (quercetina, miricetina, kaempferol e lupeol), isoladas por nosso
grupo de pesquisa e caracterizadas por técnicas de RMN (OLIVEIRA, 2011).
4.1.8 Perfil químico da fração em acetato de etila por CLUE

A fração em acetato de etila de folhas de M. parvifolia, foi analisada por
Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acopladas a detector de Espectrometria de Massas
(CLUE/EM). Foi utilizado cromatógrafo (CLUE, Shimadzu, modelo Nexera) equipado com
detector de massas simples quadrupolo (ZQ 4000, Micromass/Waters) com ionização por
eletrospray (IES-EM) e coluna cromatográfica em fase inversa (C-18, 75 mm x 2 mm x 2,2
μm; Shim-Pack, Shimadzu).
Foram utilizados os seguintes eluentes: água acidificada com 0,1% de ácido
trifluoracético (A) e metanol grau espectroscópico com 0,1% de ácido trifluoracético (B).
Empregou-se o seguinte gradiente de eluição: (i) 07,8 min, 0-50% B, (ii) 7,88,2 min, 50-
100% B; (iii) 8,29,7 min, 100% B e (iv) 9,711,5 min, 100-0% B. A taxa de fluxo
empregada foi de 0,5 mL/min com detecção em modo positivo de ionização.
4.1.9 Isolamento e identificação de flavonoides

A fração em acetato de etila de folhas de M. parvifolia (2,0 g) foi submetida a
cromatografia em coluna de filtração em gel contendo o polímero Sephadex TM LH-20 (GE
HEALTHCARE) como fase estacionária (0,2 x 40 cm) e metanol como fase móvel. Foram
obtidas 40 frações que após serem agrupadas de acordo com a semelhança do perfil
cromatográfico apresentado na análise por CCD originaram 3 sub-frações (SP1, SP2 e SP3).
A sub-fração SP2 (200,0 mg) foi recromatografada em uma nova coluna Sephadex
TM LH-20 (0,1 x 60 cm), fornecendo a susbtância 1 (12,0 mg) e substância 2 (11,0 mg). A
sub-fração SP3 (100,0 mg) foi purificada por cromatografia de adsorção utilizando como fase
estacionária Sílica gel 60 (0,063-0,2mm, Vetec®) (0,2 x 40 cm) e como fase móvel
hexano/acetato de etila (1:1), em sistema isocrático de eluição, fornecendo a substância 3 (4,0
mg) e substância 4 (5,0 mg).
A Figura 11 ilustra o processo de purificação e isolamentos das substâncias 1, 2, 3 e 4.
25
Figura 11: Esquema de purificação da fração acetato de etila de Myrsine parvifolia e isolamento das substâncias
1, 2, 3 e 4.
4.1.9.1 Reações de deslocamento químico para identificação de flavonoides por

espctrofotometria UV
As reações de deslocamento químico na região Ultravioleta (UV) foram utilizadas
para identificar as classes de flavonoides e seus possíveis padrões de substituições. Os
espectros de UV dos flavonoides isolados foram obtidos de acordo com método descrito por
MABRY et al., 1970.
O espectro na região UV (200 a 500 nm) dos flavonoides foi inicialmente obtido em
metanol e após reação com metóxido de sódio (NaOMe 2,5% p/v), cloreto de alumínio (AlCl3
2% p/v), ácido clorídrico (HCl 50%, v/v), acetato de sódio sólido (NaOAc) e ácido bórico
sólido (H3BO3) ou em solução saturada. Os espectros obtidos foram interpretados e
comparados com dados da literatura.
4.1.9.2 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1D e 2D foram obtidos no
espectrômetro Varian VNMRS no Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear
multiusuário da Universidade Federal Fluminense.
Os espectros foram obtidos em frequência de 500 MHz para RMN de 1H e 125 MHz
para RMN de 13C. Os valores de deslocamento químico (δ) foram expressos em partes por
milhão (ppm) e as constantes de acoplamento (J) expressas em hertz (Hz). As amostras foram
solubilizadas em metanol deuterado (CD3OD) (Cambridge Isotope Laboratories). O
26
tetrametilsilano (TMS) foi usado como padrão interno. Os experimentos de RMN de 2D
utilizados foram análises de correlação homonuclear (COSY) e heteronuclear (HSQC). A
edição dos espectros foi realizada utilizando-se o programa MestReNova 6.0.2.
4.1.10 Perfil químico do extrato bruto hidroetanólico e fração em diclorometano por

CLAE
O perfil cromatográfico do extrato bruto hidroetanólico e fração em diclorometano de
folhas de M. parvifolia, foi avaliado por cromatografia em fase líquida acoplada a detector de
arranjo de diodo (CLAE/DAD). Foi utilizado equipamento LC-A20, equipado com bomba
LC-20AT, detector UV / Vis DAD-20A (Shimadzu); coluna cromatográfica de fase inversa
(C-18, 4,6 x 250mm, 5.0 μm, Macherey-Nagel Nucleodur®) e pré-coluna (3 x 10 mm). Os
dados foram adquiridos e processados pelo programa Shimadzu LC Solution 1.25.
Foram utilizados os seguintes eluentes: água acidificada com 0,1% de ácido
trifluoracético (A) e metanol grau espectroscópico com 0,1% de ácido trifluoracético (B).
Empregou-se o seguinte gradiente de eluição: (i) 030 min, 40-65% B, (ii) 3032 min, 65-
40% B and (iii) 3235 min, 40% B. A taxa de fluxo empregada foi de 0,8 mL/min com
detecção de UV em um intervalo de 200 a 450 nm.
A identificação dos flavonoides foi realizada através da comparação do espectro UV e
tempo de retenção dos seguintes cromatogramas: (i) substâncias referência (miricetina,
quercetina, kaempferol e miricetina-3-O-β-arabinopiranosideo), previamente isoladas da
fração em acetato de etila e estrutura química identificada por RMN, (ii) extrato bruto
hidroetanólico, (iii) fração em diclorometano e (iv) extrato/fração fortificado com as
substâncias referência.
Os extratos e substâncias referência foram solubilizadas em metanol na concentração
aproximada de 5 mg/mL (extratos) ou 1 mg/mL (substância referência).
4.1.11 Perfil químico da fração em hexano e diclorometano por CG/EM

A fração em hexano e fração em diclorometano de folhas de M. parvifolia foram
analisadas em cromatógrafo em fase gasosa acoplada a espectrometrômetro de massas -
CG/EM-QP5000 (SHIMADZU), utilizando detector de massas com ionização por impacto de
elétrons (70 eV). Um miligrama de cada amostra, dissolvido em CH2Cl2 (1:100 mg/μL), foi
injetado separadamente em coluna RTX-5 (0,25 mm; 30 m; 0,25 μm) (OLIVEIRA et al.,
2010). A fração em diclorometano foi submetida a um processo de pré-purificação
27
cromatográfica em coluna a media pressão utilizando sílica gel 60 como fase estacionária e
hexano/acetato de etila (9:1) como fase móvel.
As amostras foram analisadas sobre as seguintes condições cromatográficas:
temperatura de injeção de 270ºC, temperatura do detector 290ºC, gás de arraste: hélio, fluxo
de 1 mL/min, modo de injeção split com razão de 1:50. A temperatura do forno foi mantida
inicialmente em 60 ºC e posteriormente elevada gradualmente até 290ºC, de acordo com a
seguinte rampa de aquecimento: 60ºC a 160ºC com rampa de aquecimento de 15ºC/min (0--
>6 min); 160ºC a 290º C com rampa de aquecimento de 3ºC/min (6-->49 min); isoterma a
290ºC por 20 min (49-->69 min).
As substâncias foram identificadas por comparação do espectro de massas com a
biblioteca de dados do aparelho National Institute of Standard and Technology (NIST) e
dados descritos na literatura.
4.1.12 Avaliação da atividade antioxidante

Avaliação da atividade antioxidante do extrato bruto etanólico, fração em
diclorometano, fração em acetate de etila, fração em butanol e extrato bruto aquoso de folhas
de M. parvifolia foi realizada pelo método de eliminação do radical livre estável
2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH, Sigma-Aldrich, USA) conforme descrito por TEIXEIRA
et al. (2016).
Alíquota de 1,0 mL de solução etanólica de DPPH (0,3mM) foi incubada com 2,5 ml
de solução metanólica dos extratos (250, 125, 50, 25, 12 e 6 μg/mL) por 30 minutos ao abrigo
da luz e em temperatura ambiente. Os valores de absorvância foram determinados em
espectrofotômetro a 518 nm, utilizando methanol como solução de compensação (branco).
Solução controle negativo foi preparada com 2,5 mL de metanol e 1,0 mL de DPPH (0,3mM).
Os experimentos foram realizados em triplicata e trolox utilizado como substância
antioxidante controle.
A percentagem da atividade antioxidante (AA) foi calculada através da equação:
AA% = 100- [(Abs amostra – Abs branco) x 100 / Abs controle negativo]. O valor de IC50
(concentração de amostra antioxidante necessária para reduzir a concentração inicial de DPPH
em 50%) foi determinado graficamente por regressão linear onde o eixo das abcissas
representa a concentração da amostra analisada e no eixo das ordenadas o percentual da
atividade antioxidante.
O procedimento padronizado por Scherer & Godoy (2009) foi utilizado na avaliação
da atividade antioxidante dos extratos, considerando que não existe uma avaliação da
28
capacidade antioxidante universal para o método DPPH, e que a variação na concentração
deste radical, concentração da amostra e tempo de reação são fatores experimentais críticos. A
capacidade antioxidante das amostras foi expressa como Índice de Atividade Antioxidante
(IAA), calculada através da fórmula: IAA = concentração final do DPPH (μg/mL) / IC50
(μg/mL). As amostras apresentaram atividade antioxidante fraca quando IAA < 0,5; atividade
antioxidante moderada quando 0,5 < IAA < 1,0; atividade antioxidante forte quando 1,0 <
IAA < 2,0, e atividade antioxidante muito forte quando IAA > 2,0.
4.2 Ensaios biológicos in vitro

Os ensaios in vitro de inibição da atividade proteolítica e coagulante induzida pela
peçonha de Bothrops jararacussu foram realizados em parceria com o Laboratório de
Venenos e Toxinas de Animais e Avaliação de Inibidores (LaVenoToxi) do Instituto de
Biologia da Universidade Federal Fluminense.
4.2.1 Peçonha de Bothrops jararacussu

A peçonha bruta de Bothrops jararacussu foi gentilmente cedido pelo Dr. Eladio
Flores Sanchez da Fundação Ezequiel Dias (FUNED), Belo Horizonte, MG.
4.2.2 Protocolo de Neutralização da Peçonha

O extrato bruto hidroetanólico, fração em hexano, fração em diclorometano, fração em
acetato de etila e fração em butanol de folhas de M. parvifolia, foram solubilizados em
dimetilsufóxido (DMSO) e incubados com a peçonha bruta de B. jararacussu, na proporção
1:10, por 30 minutos à temperatura ambiente (DE OLIVEIRA et al., 2014) Em seguida,
triplicatas de ensaios independentes (n=3) foram empregados para avaliar a capacidade
inibitória das atividades proteolítica e coagulante induzidas pela peçonha de B. jararacussu.
Os seguintes controles experimentais foram utilizados:
Controle da peçonha: peçonha bruta + solução salina
Controle do veículo: peçonha bruta + veículo (DMSO)
Controle negativo: amostra + solução salina
4.2.3 Atividade proteolítica

A atividade proteolítica foi determinada por método colorimétrico, descrito por Garcia
et al. (1978), utilizando azocaseína como substrato.
Alíquotas de peçonha de B. jararacussu foram pré-incubadas com os extratos a 37ºC.
Decorridos 30 minutos, alíquotas de 50 µL da solução contendo peçonha e extrato vegetal,
29
foram adicionados a uma mistura contendo: 400 µL de azocaseína (0,2% p/v), 350 µL de
NaCl (150 mM) e 400 µL de tampão 20 mM Tris-HCl, 8 mM CaCl2, pH 8,8. A solução
tampão NaCl (150 mM) foi utilizado para completar o volume final de 120 μL. A reação
enzimática foi mantida por 90 min a 37ºC e em seguida interrompida pela adição de 400 µL
ácido tricloroacético (TCA) 10% (v/v). O material foi centrifugado a 15000 g por 2 minutos e
ao sobrenadante recolhido foram adicionados 0,5 mL de NaOH 2 N. Os valores de
absorvância foram medidos 420 nm.
Concentração Efetiva (CE), foi definida como concentração de peçonha (g/mL)
capaz de produzir uma variação de 0,2 unidades de densidade ótica a 420 nm. Para realização
dos ensaios de inibição proteolítica, uma unidade de concentração efetiva da peçonha foi pré-
incubada por 30 min a 37ºC com os extratos e em seguida a atividade proteolítica determinada
conforme descrito acima. Peçonha pré-incubada com solução salina ou DMSO (100%
atividade proetolítica), foram utilizadas como controle. Mistura de extrato vegetal e demais
reagentes, na ausência de peçonha, também foram utilizados como controle do experimento.
A azocaseína é um derivado da caseína, contendo um grupo sulfonilamida, que
apresenta coloração alaranjada. A digestão de uma solução de azocaseína por enzimas
proteolíticas resulta na formação de componentes coloridos solúveis em ácido tricloroacético.
O aumento da intensidade da absorvância a 420 nm, desenvolvida após digestão enzimática
da azocaseína e tratamento com ácido tricloroacético e NaOH, é função da atividade
proteolítica da enzima na solução (SANTOS et al., 2005).
4.2.4 Atividade anticoagulante

A dose coagulante mínima de uma peçonha é definida como a dose capaz de coagular
0,2 mL de plasma humano em 60 segundos (GENE et al., 1989). O tempo de coagulação foi
medido em coagulômetro digital Amelung KC4A (Labcon, Germany).
Concentrado de plasma citratado obtido de indivíduos sadios e fornecidos pelo banco
de sangue do Hospital Universitário Antônio Pedro foi diluído em solução salina na
proporção 1:1 (MAGALHAES et al., 2011)
O efeito neutralizante dos extratos sobre a atividade coagulante da peçonha de B.
jararacussu foi avaliado após pré-incubação da peçonha, com solução dos extratos em DMSO
na proporção 1:10. Alíquota de 50 µL da mistura de peçonha e extrato foi adicionada a 200
µL de plasma diluído e o tempo de coagulação monitorado. Considerou-se incoagulável o
plasma que não coagulou em até 600 segundos (ASSAFIM et al., 2011).
30
4.3 Ensaios biológicos in vivo
Os ensaios in vivo de inibição da letalidade, do aumento da permeabilidade vascular e
do edema de pata induzida pela peçonha de Bothrops jararaca foram realizadas no Instituto
Vital Brazil enquanto os ensaios de pleurisia foram realizados no laboratório de farmacologia
do Instituto Nacional de Controle de Qualidade (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz
(FIOCRUZ). Os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso
de Animais (CEUA-VITAL BRAZIL) (protocolo número 003/2015) e pelo Comitê do Uso de
Animais de Laboratório da FIOCRUZ (protocolo número 17/13-5).
4.3.1 Peçonha de Bothrops jararaca

A peçonha bruta liofilizada obtida a partir de vários espécimes adultos de B. jararaca
lote Pool RF01/11 foi fornecido pelo Banco de Venenos do Instituto Vital Brazil (IVB). A
peçonha foi armazenada a -20ºC e sua solução preparada em água destilada estéril
imediatamente antes do uso.
4.3.2 Animais
Camundongos suíços albino (18-30 g) de ambos os sexos foram fornecidos pelo
Biotério Central do Instituto Vital Brazil e Instituto de Ciências e Tecnologia em Biomodelos
da Fiocruz.
Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno com tampa metálica
contendo ração e água ad libitum em sala de criação de animais de laboratório, sob controle
de temperatura (24±3°C) e luminosidade (ciclo 12 h claro/escuro). Ao final dos experimentos,
os animais foram eutanasiados por via inalatória em câmara de gás de dióxido de carbono
(CO2) ou com sobredosagem de tiopental (50 mg/kg, ip.). Todos os experimentos foram
realizados de acordo com as recomendações do Conselho Nacional de Controle da
Experimentação Animal do Brasil (CONCEA).
4.3.3 Protocolo de tratamento

Camundongos suíços albinos (18-30 g) foram divididos em grupos (n = 6-10) e
tratados por via oral (v.o.) com: (i) veículo (dispersão de 5% de polissorbato 80 em água, 10
mL/kg) ou (ii) extrato bruto hidroetanólico (100 mg/kg) ou (iii) fração em hexano (100
mg/kg) ou (iv) fração em diclorometano (100 mg/kg) ou (v) fração em acetate de etila (100
mg/kg) ou (vi) fração em butanol (100 mg/kg) ou (vii) extrato bruto aquoso (100 mg/kg) de
M. parvifolia. Dexametasona (1,0 mg/kg) (Sigma®) e/ou diclofenaco sódico (15,0 mg/kg)
(Hipolabor®) foram utilizados como contole farmacológico. Os extratos administrados nos
31
animais foram previamente dispersos em água contendo 5% (v/v) de polissorbato 80. Uma
hora após administração da amostra por via oral (v.o.), os animais receberam injeção de
peçonha de B. jararaca (PBJ) (RUPPELT et al., 1990; ALBANO et al., 2013). A
administração dos extratos por via oral foi escolhida com o intuito de simular o uso popular
das plantas medicinais (FÉLIX-SILVA et al., 2014).
4.3.4 Letalidade
Camundongos fêmeas (18-22 g) foram distribuídas aleatoriamente em oito grupos
(n=10) conforme descrito no item 4.3.3. A dose de peçonha de B. jararaca (PBJ)
correspondente a duas vezes a DL50 (DL50 = 4,8 mg/kg) foi empregada no ensaio de
letalidade. Dose de 9,6 mg/kg de PBJ (200 µL de solução aquosa a 960 µg/mL) foi
administrada por via subcutânea (s.c.) no dorso do animal 60 minutos após tratamento por via
oral.
Os animais foram acompanhados por um período de 48 h, e o número de óbitos
registrados no intervalo de tempo de 6, 24 e 48 h, após a administração do PBJ. Os animais
foram eutanasiados em câmara de CO2 ao final do experimento. A capacidade de proteção da
letalidade das amostras foi verificada através da percentagem de proteção ou sobrevida dos
animais tratados (RUPPELT et al., 1990).
4.3.5 Permeabilidade vascular

A capacidade dos extratos em reduzir o aumento da permeabilidade vascular induzida
pela peçonha de B. jararaca (PBJ) foi avaliada pela metodologia do extravasamento do
corante azul de Evans a partir do compartimento vascular para a cavidade intraperitoneal
(RUPPELT et al., 1990; ARAUJO et al., 2000). O azul de evans é um corante alcalino, não
tóxico, que quando administrado por via intravenosa, se liga à albumina sérica a qual
extravasa para o interstício quando a permeabilidade vascular é alterada (NIDAVANI et al.,
2014).
Camundongos machos (18-20 g) foram distribuídos aleatoriamente em oito grupos
(n=8) conforme descrito no item 4.3.3. Diclofenaco de sódio e dexametasona foram utilizados
como controle farmacológico. Decorridos 50 minutos do tratamento por via oral, 0,2 mL (0,1
mL/10g animal) de solução aquosa de Azul de Evans 1% (p/v) foi administrada nos animais
por via intravenosa (i.v.). Dez minutos após foi administrado 1 mg/kg de PBJ (200 µL de
solução aquosa a 100 µg/mL) por via intraperitoneal (ip.). Os animais foram sacrificados em
câmara de CO2 1 h após administração da PBJ e sua cavidade peritoneal lavada com água
destilada (10 mL). A absorvância do corante extravasado para a cavidade peritoneal foi
32
medida em espectofotômetro a 590 nm. A concentração do corante foi determinada após
interpolação dos valores de absorvância do lavado peritoneal em uma curva de calibração
empregando corante Azul de Evans (Sigma®) na faixa de 0,5 a 10,0 µg/mL (ESTEVES et al.,
2011).
Alteraçãos na permeabilidade vascular foram expressos pela diferença na concentração
de corante extravasado na cavidade peritoneal entre os animais tratados e não tratados. A ação
dos extratos sobre a redução da permeabilidade vascular induzida pela PBJ foi expressa como
redução percentual do valor controle (FERNADES, 1986).
4.3.6 Edema de pata

Atividade edematogênica da peçonha de B. jararaca (PBJ) foi avaliada pelo modelo in
vivo de edema de pata (ARAUJO et al., 2000; WANDERLEY et al., 2014).
(n=10) conforme descrito no item 4.3.3. Diclofenaco de sódio e dexametasona foram
utilizados como controle farmacológico. Cinco microgramas de PBJ (50 µL de solução
aquosa a 100 µg/mL) foram administrados por via intraplantar (ipl.) na pata direita traseira
dos animais 60 minutos após tratamento por via oral. A pata contralateral esquerda, utilizada
como controle, recebeu igual volume de solução salina (50 µL). O volume de cada pata foi
medido até a articulação tíbio-tarsal utilizando pletismômetro nos intervalos de tempo de 0,
60, 120, 210, 240 e 300 minutos após administração da peçonha. Os animais foram
eutanasiados em câmara de CO2 ao final do experimento.
O edema foi expresso como diferença de volume (mL) entre a pata direita (com
veneno) e a pata esquerda (sem veneno) e o efeito antiedematogênico dos extratos expresso
como redução percentual do valor controle (FERREIRA, 1979).
A resposta antiedematogênica total foi quantificada através do cálculo da área sob a
curva (AUC0-6 h) utilizando a regra trapezoidal. A taxa de inbição da atividade edematogênica
foi calculada pela relação: Inibição (%) = ((AUCcontrole –AUCtratamento) / AUCcontrole) x 100
(AINOOSON et al. 2012).
4.3.7 Pleurisia
A capacidade dos extratos em reduzir o processo inflamatório induzido pela peçonha
de B. jararaca (PBJ) foi avaliada pelo ensaio de pleurisia (BURIGO et al., 1996).
(n=6) conforme descrito no item 4.3.3. Dexametasona foi utilizado como controle
33
farmacológico. Sessenta minutos após tratamento por via oral, foram administrados nos
animais 5 µg de PBJ (100 µL de solução aquosa a 50 µg/mL) na cavidade pleural através de
injeção intratorácica (i.t.). (FURTADO et al., 2015). No grupo de animais que não recebeu
estímulo do veneno (controle) foi administrado igual volume (100 µl) de solução salina. Após
5 h, os animais foram eutanasiados com tiopental (50 mg/kg), a cavidade torácica foi aberta e
lavada com 1 mL de PBS contendo EDTA (10 mM). O lavado pleural foi coletado e diluído
em líquido de Turk (2% de ácido ácético) para contagem global de leucócitos em câmara de
Neubauer. Amostras do lavado pleural (100 µl de suspensão celular a 1,0 x105 cels/mL)
foram concentradas por centrifugação (Cytospin) em lâmina de vidro e em seguida coradas
pelo método de May–Grunwald–Giemsa para contagem diferencial de leucócitos (FARIAS et
al., 2012).
4.4 Análise estatística
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão dos experimentos envolvendo
6 a 10 animais. Os dados foram tratados por análise de variância (ANOVA) seguido do pós-
teste Student-Newman-Keuls, empregando-se o programa GraphPad Prism 5.01 (San Diego,
CA, USA). Os resultados foram considerados significantes para valores de p < 0,05.
34
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análise química do óleo essencial

O óleo essencial, de coloração verde claro, foi obtido á partir de uma única extração de
folhas e frutos de M. parvifolia com rendimento de 0,03% e 0,01%, respectivamente. Total de
dezoito e trinta e cinco substâncias foram identificadas nos óleos essenciais de folhas e frutos
de M. parvifolia respectivamente. Análise quantitativa e qualitativa da composição química
dos óleos essenciais é apresentada na Tabela 1.
Tabela 1: Abundância relativa (%) dos constituintes do óleo essencial de folhas e frutos de Myrsine parvifolia.
Abundância relativa
IR Calc. IR Lit. Substância (%)
Folhas Frutos
932 935 α -pineno - 0,4
974 979 β-pineno - 0,3
1373 1375 α-ylangeno 2,4 0,5
1374 1379 α-copaeno - 6,0
1407 1410 Longifoleno - 0,4
1417 1412 β-cariofileno 12,6 11,7
1440 1439 β-barbateno - 0,6
1442 1437 6,9-guaiadieno 1,6 1,1
1449 1443 α-himachaleno 2,5 6,1
1452 1448 α-humuleno 6,1 5,0
1452 1462 clovene<α-neo> 1,4 -
1478 1481 γ-muuroleno 7,9 3,7
1481 1483 γ -himachaleno - 5,1
1489 1491 β-selineno 6,7 2,7
1492 1495 γ-selineno - 1,2
1498 1499 α-selineno 5,9 4,0
1500 1505 β-himachaleno 4,5 5,9
1514 1512 β-bisabolene - 2,1
1513 1506 γ-cadieno 1,6 -
1522 1512 δ-cadieno 2,3 7,1
1528 1529 Zonareno 6,3 -
1530 1533 himachaleno<γ-deidro-ar - 1,6
1531 1542 γ-vetiveneno - 0,8
1544 1548 α-calacoreno - 3,7
1545 1540 selina-3,7(11)-dieno 3,9 1,4
1570 1575 álcool de cariofileno - 0,8
1582 1588 óxido de cariofileno 14,4 2,1
35
1608 1603 humuleno epóxido II 3,9 -
1622 1620 Naftalenometanol - 0,6
1629 1622 eremoligenol 3,0 -
- 1,4
1630 1634 muurola-4,10(14)-dien-1- β –ol
1638 1631 epi-cardinol - 0,9
1639 1642 cariofila-4(12),8(13)-dien-5-ol - 1,0
1645 1638 Cubenol - 0,9
1652 1647 α-cadinol - 1,1
1652 1649 Himachalol 2,9 1,3
1658 1663 Gimnomitrol - 1,1
1668 1672 14-hidroxi-iso-cariofileno - 0,7
1674 1676 α –santalol - 0,9
1675 1680 Cadaleno - 2,5
Total de Sesquiterpenos: 89,9 87
Total de Monoterpenos: 0 0,7
Total identificado 89,9 87,7
IRcalc: Índice de retenção calculado utilizando padrão de n-alcanos C7-C30.
IRLit: Índice de retenção da literatura (ADAMS, 2007).
Óxido de cariofileno (14,4%), β-cariofileno (12,6%) e γ-muuroleno (7,9%) são as

substâncias majoritárias no óleo essencial das folhas que é constituído basicamente por
sesquiterpenos (89,9%), enquanto que o óleo essencial dos frutos possui 86,0% de
sesquiterpenos em sua composição química e é composto majoritariamente por β-cariofileno
(11,7%) e δ-cadineno (7,1%), cujas estruturas são apresentadas na Figura 12. Óleo essencial
de folhas de de M. coriacea, M. venosa, M. lessertiana e M. sandwicensis também
apresentaram predomínio de sesquiterpenos em sua composição química (LUNA et al., 2014
e SARDANS et al., 2010). Por outro lado, os monoterpenos (α-pineno and β-pineno) foram
identificados apenas no óleo essencial dos frutos de M. parvifolia, conforme apresentado na
Tabela 1, enquanto outros monoterpenos como o limoneno e mirceno foram descritos como
substâncias minoritárias do óleo essencial de folhas de M. sandwicensis (SARDANS et al.,
2010).
36
Figura 12: Fórmula estrutural das substâncias majoritárias identificadas no óleo essencial de M. parvifolia: (a) β-
cariofileno, (b) Óxido de cariofileno, (c) γ-muuroleno e (d) δ-cadineno.
As substâncias α-humuleno (5,0-6,1%), γ-muuroleno (3,7-7,9%), β-selineno (2,7-

6,7%), δ-cadineno (2,3-7,1%) e β-cariofileno (11,7-12,6%) presentes nos óleos essenciais de
folhas e frutos de M. parvifolia também foram identificadas anteriormente no óleo essencial
de folhas de M. coriacea and M. venosa (LUNA et al., 2014) e M. lessertiana (SARDANS et
al., 2010). As substâncias α-himachaleno, γ-himachaleno, γ-selineno e himachalol são
descritas pela primeira vez no gênero Myrsine.
5.2 Teor de polifenol, flavonoides e taninos totais e avaliação da atividade antioxidante

de extratos de folhas de M. parvifolia
Os extratos de folhas de M. parvifolia foram analisados quantitativamente por técnicas
espectrofotométricas e os resultados do teor de polifenol total, flavonoide total, tanino e
avaliação da atividade antioxidante pelo método de DPPH são apresentados na Tabela 2.
O teor de polifenol total e taninos nos extratos analisados foram determinados através
da interpolação de valores de absorvância das amostras sobre a curva de calibração de padrão
de ácido gálico e padrão de piragolol, apresentadas nas Figuras 13 e 14, respectivamente.
O teor de polifenol determinado nos extratos de folhas de M. parvifolia (0,0809 a
0,3685 g EAG/g), foi maior na fração em acetato de etila (0,3685±0,0184 g EAG/ g) seguido
da fração em butanol (0,2433±0,0011 g EAG/g).
O extrato bruto hidroetanólico, fração em acetato de etila, fração em butanol e extrato
bruto aquoso de M. parvifolia apresenaram maior teor de polifenol total que outras espécies
do gênero Myrsine sp., como M. umbellata (0,108 g EAG/g), M. coriaceae (0,113 g EAG/g) e
M. melanophloeos (0,0012 g EAG/g) (MOSA et al., 2011). Os extratos de M. parvifolia
também apresentaram teor de taninos (7,58 a 11,43%), superior ao extrato em metanol de
frutos de M. africana (4%) (ABBHI et al., 2011).
37
Tabela 2: Teor de polifenol total, flavonoide e tanino, atividade antioxidante e índice de atividade antioxidante
de extratos de folhas de M. parvifolia.
Teor de Flavonoide Atividade

polifenol total total Tanino (%) antioxidante IAAi
Extrato
(g EAG/g)f (g EQ/100 g)g IC50 (μg/mL)h
Bruto hidroetanólico 0,1499±0,0051a 4,10±0,05a 7,58±0,71a 15,91±2,05d 2,38±0,31b
Diclorometano 0,0809±0,0010d 7,04±0,11e 0b 20,75±0,40d 1,81±0,23b
Acetato de etila 0,3685±0,0184b 11,15±0,12b 9,84±3,13a 6,99±1,83b 5,63±1,52a
Butanol 0,2433±0,0011c 2,14±0,02c 10,00±1,00a 11,10±0,40c 3,38±0,42b
Bruto aquoso 0,1742±0,0158a 2,59±0,02d 11,43±0,89a 14,98±2,50a 2,50±0,19b
Dados são apresentados como media ± desvio padrão de ensaios em triplicata
Valores médios de uma mesma coluna que apresentam diferentes sobre-escritos apresentam diferença
estatisticamente significativa (p<0.05)
f
Teor de polifenol total é expresso como equivalente grama de ácido gálico por grama de extrato (g EAG/g)
g
Flavonoide total é expresso como equivalente grama de quercetina por 100 gramas de extrato (g of EQ/100 g)
h
Atividade antioxidante avaliada pelo método DPPH é expressa como IC50 (concentração de amostra
antioxidante necessária para reduzir a concentração inicial de DPPH em 50%) em microgramas por mililitro
(μg/mL).
i
IAA: Índice de atividade antioxidante é calculado pela formula: IAA= concentração final de DPPH (µg/mL)/
IC50 (µg/mL).
Figura 13: Curva calibração ácido gálico em 765 nm empregada na determinação do teor de polifenol total.
38
Figura 14: Curva calibração ácido piragolol em 715 nm empregada na determinação do teor de tanino total.
A concentração de flavonoides totais foi determinada nos extratos através da

interpolação de valores de absorvância das amostras sobre a curva de calibração de padrão de
quercetina, apresentada na Figura 15.
O teor de flavonoides totais determinados nos extratos de folhas de M. parvifolia (2,14
a 11,15 g EQ/100 g extrato), foram maiores na fração em acetato de etila (11,15±0,12 g
EQ/100g extrato) e fração em diclorometano (7,04±0,11 g EQ/100g extrato). Esses valores
são maiores que o descrito para fração em acetato de etila de cascas de M. melanophloeos (7 g
EQ/100g) (MOSA et al., 2011).
Figura 15: Curva de calibração da quercetina a 430 nm empregada na determinação do teor de flavonoides totais.
39
Esses resultados podem ser parcialmente explicados pelas condições ambientais em
que essa espécie vegetal foi coletada. Em ambientes de restinga, as espécies vegetais
produzem maior quantidade de substâncias fenólicas, como os flavonoides, como mecanismo
de proteger seus tecidos da alta exposição a luminosidade (ZUANAZZI & MONTANHAN,
2004).
Na avaliação da atividade antioxidante empregando o método DPPH, o maior
potencial antioxidante foi verificado na fração em acetato de etila (IC50 = 6,99±1,83 µg/mL)
seguido da fração em butanol (IC50 = 11,10±0,40 µg/mL) conforme apresentado na Tabela 2.
Utilizando o critério de avaliação do Índice de Atividade Antioxidante (IAA) estabelecido por
Scherer and Godoy (2009), a fração em acetato de etila (IAA=5,63), fração em butanol
(IAA=3,38), extrato bruto aquoso (IAA=2,50) e extrato bruto hidroetanólico (IAA=2,38)
foram classificados como antioxidantes muito fortes (IAA>2,0), enquanto que a fração em
diclorometano (IAA=1,81) apresentou atividade antioxidante forte (1.0<AAI<2.0).
A fração em acetato de etila de M. parvifolia apresentou maior ação antioxidante que
outras frações em acetato de etila provenientes de espécies do gênero Myrsine sp, como M.
umbellata (IC50=33,09 μg/mL e AAI=0,93) e M. coriaceae (IC50=24,62 μg/mL e AAI=1,25).
No entanto, a capacidade antioxidante do extrato de M. parvifolia mostrou-se inferior a fração
em acetato de etila de cascas de M. melanophloeos (IC50=0.483 μg/mL) (MOSA et al., 2011).
Atividade antioxidante determinada pelo método DPPH, apresentou forte correlação
negativa com o teor de polifenol total (R2=0,9712) e não apresentou correlação com a
concentração de flavonoide total (R2=0,1038), indicando que o efeito antioxidante observado
está relacionado com a presença de substâncias fenólicas em geral.
5.3 Análise dos extratos por cromatografia em camada fina

Os extratos e frações de folhas de M. parvifolia foram analisados qualitativamente por
cromatografia em camada fina (CCD). A partir das análises cromatográfica por CFF e
emprego de revelador químico específico, o fator de retenção (Rf), análise da coloração e
comportamento das bandas cromatográficas foram comparadas com susbstâncias de
referência pertencentes a classe dos flavonoides (quercetina, miricetina e kaempferol) e
terpeno (lupeol), conforme apresentado nas Figuras 17 e 18.
Na placa cromatográfica apresentada na Figura 16, pode-se observar a presença de
bandas de coloração roxa, característica de terpenos, no extrato bruto hidroetanólico, fração
em hexano e fração em diclorometano de M. parvifolia.
40
Na análise cromatográfica em camada fina revelada com reagente colorimétrico
NP/PEG e visualizada sob incidência de luz UV-365nm, foi possível verificar a presença de
manchas de coloração azul, laranja e amarela. Bandas características de aglicona de
flavonoides, com provável esqueleto de quercetina, miricetina e kaempferol, foram
observadas predominantemente nas frações em diclorometano e acetato de etila conforme
mostrado na Figura 18.
1 2 3 4 5
Figura 16: Cromatografia em camada fina com o extrato bruto hidroetanólico. (1), fração em hexano (2), fração
em diclorometano (3), fração em acetato de etila (4) e fração em butanol (5) de folha de Myrsine parvifolia. Fase
móvel: hexano e acetato de etila (7:3).
1 2 3 4
Figura 17: Cromatografia em camada fina com o extrato bruto hidroetanólico (1), fração em hexano (2), fração
em diclorometano (3) da folha de Myrsine parvifolia e padrão lupeol (4). Fase móvel: hexano e acetato de etila
(9:1). Revelador: Anisaldeído sulfúrico e aquecimento.
41
1 2 3 4 5 6
Figura 18: Cromatograma em camada fina com o extrato bruto hidroetanólico. (1), fração em diclorometano (2),
fração em acetato de etila (3) de folhas de Myrsine parvifolia, padrão de miricetina (4), padrão de quercetina (5)
e padrão de kaempferol (6). Fase móvel: acetato de etila/diclorometano/água (7:3:1). Revelador: NP/PEG e UV-
365 nm.
5.4 Isolamento e identificação de flavonoides

A fração em acetato de etila apresentou maior teor de flavonoides totais e foi
submetida a purificação cromatográfica para isolamento e posterior identificação das
substâncias majoritárias. A partir de conjunto de técnicas cromatográficas, foram isoladas 4
substâncias: substância 1 (12,0 mg), substância 2 (11,0 mg), substância 3 (4,0 mg) e
substância 4 (5,0 mg).
A fração em acetato de etila foi analisada por Cromatografia em Fase Líquida de Ultra
Eficiência acoplado a Detector de Aranjo de Diodo e Espectrometria de Massas (CLUE-
DAD-EM) utilizando Ionização por Eletrospray (IES) em modo positivo. No cromatograma
em 365 nm (Figura 19) foram identificados os sinais correspondentes aos flavonoides isolados
baseados nas informações de suas relações massa carga (m/z) e valores de absorvância na
região do ultra violeta , conforme apresentado na Tabela 3.
42
Figura 19: Cromatograma em 365 nm da fração em acetato de etila de folhas de Myrsine parvifolia.
Tabela 3: Tempo de retenção, relação massa carga e valores de aborções máximas das substâncias isoladas a
partir da fração em acetato de etila de folhas de M. parvifolia.
Tempo de [M+H]+
Substância λmáx (nm)
retenção (min) (m/z)
Substância 1 4,326 319,035 252,9; 372,17
Substância 2 3,368 465,191 238,7; 281,6; 349,5
Substância 3 5,23 302,921 254,4; 371,16
Substância 4 8,682 283,976 268,7; 373,8
As estruturas químicas foram identificadas por um conjunto de metodologias: reação

de deslocamento químico na região UV, CLUE-DAD-EM e RMN.
5.4.1 Identificação estrutural substância 1

Os resultados do ensaio de deslocamento químico na região do ultravioleta da
substância 1 são apresentados na Tabela 4. A substância 1 solúvel em metanol, apresentou
bandas (λmax) em 374 nm, referente ao anel B e, em 253,5 nm, referente ao anel A
característico de flavonol não substituído em C-3. No espectro da substância 1 em NaOAc
ocorreu deslocamento batocrômico de 15,5 nm na banda II, indicando a presença de hidroxila
livre em C-7.
Após adição de ácido à solução de flavonoide em AlCl3 ocorreu deslocamento
hipsocrômico na banda I de 19,5 nm o que caracteriza a presença de três hidroxilas adjacentes
no anel B. Quando comparado o espectro de AlCl3/HCl e metanol, observou-se deslocamento
batocrômico de 56,5 nm na banda I, confirmando a presença dos grupos hidroxilas livres em
C-3 e C-5. Os dados de deslocamento químico na região do UV sugerem que a substância 1
seja a miricetina.
43
Tabela 4: Deslocamento químico na região do ultravioleta da substância 1 em metanol, acetato de sódio,
metóxido de sódio, cloreto de alumínio e ácido bórico.
λ (nm)
metanol NaOAc NaOMe AlCl3 AlCl3/HCl NaOAc+H3BO3
Banda I 374,0 334,5 415 450,0 430,5 392
Banda II 253,5 269 213 270,0 266,5 258
O espectro de RMN 1H da substância 1 apresentou sinais de deslocamentos químicos

(δ) desblindados entre 6,1 a 7,5 ppm região característica de anel aromático. Observa-se no
anel A os δ = 6,18 (1H; d) e 6,38 (1H; d) que corresponde a H-6 e H-8, respectivamente,
ambos com J = 2,1 Hz, característico de acoplando na posição meta de anel aromático. A
presença de um singleto com deslocamento químico δ = 7,35, correspondente a dois
hidrogênios quimicamente equivalentes localizados na posição H2’ e H6’, caracterizam uma
substituição 3,4, 5 no anel B. (Figura 20 e 21).
Análise do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C – HSQC
indicou que os prótons em δH 7,39; 6,39 e 6,19 se correlacionaram com os carbonos de δC
em 107,3; 92,89 e 97,77, respectivamente, conforme apresentado na Figura 22.
44
Figura 20: Espectro de RMN 1H (500MHz, CD3OD) da substância 1.
45
Figura 21: Espectro expandido de RMN 1H (6,15 –7,35 ppm) da substância 1.
46
Figura 22: Espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C – HSQC da substância 1.
47
Os valores de deslocamento químico apresentados na Tabela 5 foram
comparados com os descritos na literatura (EL-FISHAWY et al., 2011).
Tabela 5: Deslocamento químico de RMN de 1H e 13C constantes de acoplamento da substância 1

comparado com dados de miricetina obtidos da literatura.
δ Experimental (CD3OD) δ Literatura* (CD3OD)

13C δ 13C
Posição δ δ 1H δ 1H
2 148,30 - 147,1 -
3 137,21 - 136,1 -
4 177,46 - 176,1 -
5 162,75 - 161,0 -
6 99,49 6,18 d (J=2,1Hz) 98,5 6,17 d (J=2,0Hz)
7 165,82 - 164,2 -
8 94,65 6,38 d (J=2,1Hz) 93,5 6,37 d (J=2,0Hz)
9 158,47 - 156,4 -
10 104,77 - 103,3 -
1' 123,37 - 121,3 -
2' 108,80 7,35 s 107,7 7,34 s
3' 146,99 - 146,0 -
4' 137,21 - 136,1 -
5' 146,99 - 146,0 -
6' 108,822 7,35 s 107,7 7,34 s
*EL-FISHAWY et al., 2011
A partir dos resultados apresentados a substância 1 foi identificada como

miricetina (Figura 23).
Figura 23: Estrutura química de miricetina
O sinal 1 obtido no cromatograma apresentou no espectro de massas (IES) íon

pseudomolecular [M+H]+ de m/z 319,035, correspondente ao íon quase molecular da
aglicona miricetina (Figura 24), confirmando a estrutura proposta pelas análises de
48
deslocamento químico na região do UV e dados de RMN (PRASAIN e BARNES,
2007).
Figura 24: Cromatograma do sinal base (modo positivo) em 365 nm (A) e espectro de massa (B) da
substância 1, obtido por CLUE-DAD-EM.

substância 2 são apresentados na Tabela 6. A substância 2 solúvel em metanol,
apresentou bandas (λmax) em 361 nm, referente ao anel B e, 263 nm, referente ao anel A
característico de flavonol substituído em C-3. No espectro obtido com NaOAc
observou-se deslocamento batocrômico de 10,5 nm na banda II, indicando a presença de
hidroxila livre em C-7. Após adição de AlCl3/HCl ocorreu deslocamento batocrômico
de 39 nm na banda I, quando comparado ao espectro em metanol, indicando a presença
de hidroxila livre em C-5. Após adição de ácido à solução de flavonoide em AlCl3
ocorreu deslocamento hipsocrômico na banda I de 18 nm o que caracteriza a presença
de três hidroxilas adjacentes no anel B. Os dados de deslocamento químico na região do
UV sugerem que a substância 2 seja uma miricetina substituída na posição C-3.
49
λ (nm)
Banda I 361,0 390,5 320,5 418,0 400,0 378,5
Banda II 263,5 273,5 210 270,0 270,0 257,5
O espectro de RMN 1H da substância 2 apresentou sinais de deslocamentos

químicos (δ) desblindados entre 6,21 a 7,31 ppm região característica de anel aromático.
Observou-se os sinais de deslocamentos químicos em 6,21 ppm (1H; d) e 6,39 ppm
(1H; d) que correspondem a H-6 e H-8, respectivamente, ambos com J=2,1 Hz,
característico de acoplamento na posição meta de anel aromático do anel A (Figura 25).
O espectro de 1H apresentou um singleto em δH 7,30 (2H, s) correspondente a dois
prótons quimicamente equivalentes H-2’ e H-6’, indicando substituição 3, 4, 5 do anel
B, em conformidade com a estrutura de miricetina (Figura 26, 27 e 28). Através da
análise do espectro bidimensional de correlação homonuclear 1H x 1H – COSY (Figura
29) verificou-se correlação entre o hidrogênio em δ 5,18 com o hidrogênio em δ 3,53 e
δ 3,89, e correlação entre o hidrogênio em δ 3,89 com o hidrogênio em δ 3,43. Análise
do espectro bidimensional de correlação heteronuclear 1H x 13C – HSQC indicou que os
prótons em δH 3,9; 3,65; 3,86; 3,86 e 3,48 se correlacionaram com os carbonos de δC
em 108,3; 71,4; 72,6; 67,6; 65,7, respectivamente, indicando a presença de três CH e
um CH2 na região glicídica, conforme verificado também no espectro de APT
apresentado na Figura 30.
50
51
Figura 26: Espectro expandido de RMN 1H (4,9 – 7,5ppm) (500MHz, CD3OD) da substância 2.
52
Figura 27: Espectro expandido de RMN 1H (3,3 – 4,0ppm) (500MHz, CD3OD) da substância 2.
53
54
Figura 29: Espectro bidimensional de correlação homonuclear 1H x 1H – COSY da substância 2.
55
Figura 30: Espectro RMN 13C (125MHz, CD3OD) da substância 2.
56
comparados com os descritos na literatura (FURER et al., 2013).
Tabela 7: Deslocamento químico de RMN de 1H e 13C da substância 2 comparado com dados de

miricetina 3-O-β-arabinopiranosídeo obtidos da literatura.
δ Experimental (CD3OD) δ Literatura * (DMSD)

Posição 13C 1H 13C 1H
2 163,02 - 157,4 -
3 135,78 - 135 -
4 158,38 - Nd -
5 166,1 - 162 -
6 98,38 6,21 d (J=2,1Hz) 97,6 6,22
7 179,4 - 164,8 -
8 93,2 6,39 d (J=2,1Hz) 92,5 6,42
9 158,65 - 156,8 -
10 104,8 - 104,3 -
1' 121,74 - 119,9 -
2' 108,3 7,31 s 107,9 6,93
3' 146,48 - 146,5 -
4' 138,14 - 137,9 -
5' 146,43 - 146,5 -
6' 108,3 7,31 s 107,9 6,93
1'' 108,3 5,18 d (J=2,1Hz) 106,9 4,09
2'' 71,4 3,9 m 71,6 3,31
3'' 72,6 3,65 dd (J=2,1Hz) 73 3,29
4'' 67,7 3,86 q (J=2,1Hz) 68,1 3,55
5'' 65,67 3,86 m e 3,48 d (J=7,5Hz) 66,2 3,44 e 3,23
* FÜRER et al., 2013

miricetina 3-O-β-arabinopiranosídeo (Figura 31).
Figura 31: Estrutura química de miricetina 3-O-β-arabinopiranosídeo.
57
O sinal 2 obtido no cromatograma apresentou no espectro de massas (IES com
íon pseudomolecular [M+H]+ de m/z 465,191. A fragmentação do íon [M+H]+ de m/z
465,191 originou o íon 319 [(M+H)-146]+ e 146 [(M+H)-319]+ resultante de perda de
uma pentose. A clivagem do anel C pela fragmentação retro Diels-Alder, gerou o íon
194 [(M+H)-125]+ (PRASAIN e BARNES, 2007; SILVA et al., 2009). O íon em m/z
319 formado corresponde ao íon quase molecular da aglicona miricetina (MM=318
g/mol) (Figura 32) confirmando desta forma a estrutura química da substância 2,
proposta pelas análises de RMN.
Figura 32: Cromatograma do sinal base (modo positivo) em 365 nm (A) e espectro de massa (B) da

substância 3 são apresentados na Tabela 8. A substância 3, solúvel em metanol
apresentou bandas (λmax) em 371 nm, referente ao anel B e, em 255,5 nm referente ao
anel A característico de flavonol não substituído em C-3. No espectro na presença de
NaOAc, ocorreu deslocamento batocrômico de 19 nm na banda II, indicando a presença
de hidroxila livre em C-7. Na presença de NaOAc/H3BO3 ocorreu deslocamento
batocrômico de 16 nm na banda I, caracterizando a presença do grupamento orto-di-
hidroxila no anel B. Após adição de AlCl3/HCl ocorreu deslocamento batocrômico de
58 nm na banda I quando comparado ao espectro em MeOH, indicando a presença dos
58
grupos hidroxilas livres em C-3 e C-5. Os dados de deslocamento químico na região do
UV sugerem que a substância 3 seja a quercetina.

λ (nm)
Banda I 371,0 391,5 330,5 435,5 429,0 387,0
322,5 362,0
Banda II 255,5 274,5 244,0 269,5 265,5 259,5
No espectro de RMN 1H foram observados sinais de deslocamentos químicos (δ)

desblindados entre 6,18 a 7,74 ppm região característica de anel aromático. Observou-se
os sinais de deslocamentos químicos de 6,19 ppm (1H; d) e 6,39 ppm (1H; d) que
correspondem a H-6 e H-8, respectivamente, ambos com J=2,1 Hz, característico de
acoplamento na posição meta de anel aromático do anel A (Figura 33). Os sinais de
deslocamento químico δ = 7,74 ppm (1H; d; J=2,2 Hz), δ = 6,89 (1H; d; J= 8,5 Hz) e δ
= 7,64 (1H; dd; J= 2,2 Hz e 8,8Hz) correspondem aos hidrogênios aromáticos do anel B,
H-2’, H-5’ e H-6’, respectivamente (Figura 34 e 35). A constante de acoplamento J =2,2
Hz indica acoplamento meta entre H2’ e H6’, e a constante de acoplamento J=8,5 Hz
indica acoplamento orto entre H-5’ e H-6’, caracterizando a presença de oxigênio do
anel B em C3’ e C4’.
indicou que os prótons em δH 7,78; 7,70; 6,25; 6,44 e 6,26 se correlacionaram com os
carbonos de δC em 114,57; 120,08; 114,76; 92,92 e 92,78, respectivamente, indicando a
presença de cinco carbonos CH e dez carbonos quaternários, conforme verificado
também no espectro de APT apresentado na Figura 36 e 37.
59
60
Figura 34: Espectro expandido de RMN 1H (6,2 – 6,9ppm) da substância 3.
61
Figura 35: Espectro expandido de RMN 1H (7,54 – 7,76 ppm) da substância 3
62
63
Figura 37: Espectro de RMN 13C-APT (500MHz, CD3OD) da substância 3.
64
comparados com os descritos na literatura (KALEGARI, 2009).
Tabela 9: Deslocamento químico de RMN de 1H e 13C e constantes de acoplamento da substância 3

comparado com dados de quercetina obtidos da literatura.

Posição
RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN 1H
2 148,03 - 147,8 -
3 137,13 - 137,1 -
4 177,34 - 177,2 -
5 162,50 - 162,3 -
6 99,24 6,19 d (J=2,1Hz) 99,1 6,17 d (J=2,1Hz)
7 165,56 - 165,3 -
8 94,42 6,39 d (J= 2,1Hz) 94,4 6,36 d (J=2,1Hz)
9 158,23 - 158,1 -
10 104,53 - 104,1 -
1' 124,14 - 124,0 -
2' 116,01 7,74 d (J=2,2Hz) 115,9 7,72 d (J=2,1Hz)
3' 148,77 - 148,5 -
4' 146,22 - 146,0 -
5' 116,23 6,89 d (J=8,5Hz) 116,1 6,8 d (J=8,4Hz)
7,64 dd (J=8,5; 7,6 dd (J=8,7;
6' 121,68 2,2Hz) 121,6 2,1Hz)
* (KALEGARI, 2009)

quercetina (Figura 38).
Figura 38: Estrutura química de quercetina.
O sinal 3 obtido no cromatograma apresentou no espectro de massas (IES) com

íon pseudomolecular [M+H]+ de m/z 302,921 correspondente ao íon quase molecular
da aglicona quercetina e o fragmento 154,3 [(M+H)-148,8]+ é resultante da quebra da
65
ligação C-1 e C-3 do anel A (Figura 39) (PRASAIN et al., 2004; SILVA et al., 2009),
confirmando desta forma a estrutura química da substância 3 proposta pelas análises de
deslocamento químico na região do UV e análises de RMN.
Figura 39: Cromatograma do sinal base (modo positivo) em 365 nm (A) e espectro de massas (B) da

substância 1 são apresentados na Tabela 10. A substância 4 solúvel em metanol
apresentou bandas (λmax) em 365,5 nm, referente ao anel B e, em 266 nm, referente ao
anel A característico de flavonol não substituído em C-3. No espectro em NaOAc
ocorreu deslocamento batocrômico de 8,5 nm na banda II, indicando a presença de
hidroxila livre em C-7. Ausência de deslocamento na banda I e II entre os espectros
obtidos na presença de AlCl3 e AlCl3/HCl indicaram ausência de sistema di-hidroxilado
no anel B. Após adição de AlCl3/HCl ocorreu deslocamento batocrômico de 58,5 nm na
banda I quando comparado ao espectro em obtidos em metanol, indicando a presença de
hidroxilas livres em C-3 e C-5. No espectro obtido na presença de NaOMe, quando
comparado ao espectro em metanol, observou-se deslocamento batocrômico 46,5 nm na
banda I, indicando a presença de 4’-OH livre. Os dados de deslocamento químico na
região do UV sugerem que a substância 4 seja o kaempferol.
66
λ (nm)
Banda I 365,5 389,0 412,0 424,0 424,0 389,0
Banda II 266,0 274,5 318,0 269,0 269,0 274,5
O espectro de RMN 1H da substância 4 apresentou sinais de deslocamentos

químicos (δ) desblindados entre 6,19 a 8,10 ppm, região característica de anel
aromático. Observou-se os sinais de deslocamentos químicos em 6,19 ppm (1H; d) e
6,41 ppm (1H; d) que correspondem a H-6 e H-8, respectivamente, ambos com J=2,0
Hz, característico de acoplamento na posição meta de anel aromático do anel A (Figura
40). Os sinais de deslocamento químico em δ = 8,10 ppm (2H; d; J=9,0 Hz)
correspondem aos hidrogênios aromáticos do anel B, H-2’ e H-6’, e os sinais de
deslocamento químico em δ = 6,91 ppm (2H; d; J=9,0 Hz) correspondem aos
hidrogênios H-3’ e H-5’ (Figura 41).
indicou que os prótons em δH 6,19; 6,41; 8,1 e 6,91 se correlacionaram com os carbonos
de δC em 97,7; 92,9; 1299,1 e 114,7, respectivamente, conforme apresentado na Figura
42.
67
68
Figura 41: Espectro expandido de RMN 1H (6,2 – 8,1 ppm) da substância 4.
69
70
comparados com os descritos na literatura (SANTOS et al., 2015).
Tabela 11: Deslocamento químico de RMN de 1H e 13C da substância 4 comparado com dados de
Kaempferol obtidos da literatura.

Posição 13C 1H 13C 1H
2 - - 146,8 -
3 - - 135,6 -
4 - - 175,9 -
5 - - 160,7 -
6,19 d
6 97,70 (J=2,0Hz) 98,2 6,27 d (J=2,0Hz)
7 - - 163,9 -
6,41 d
8 92,90 (J=2,0Hz) 93,5 6,34 d (J=2,0Hz)
9 - - 156,2 -
10 - - 103,1 -
1' - - 121,7 -
2' 129,10 8,1 d (J=9,0) 129,5 7,98 d (J=9,0Hz)
3' 114,70 6,91 d (J=9,0) 115,4 6,96 d (J=9,0Hz)
4' - - 159,2 -
5' 114,70 6,91 (J=9,0) 115,4 6,96 d (J=9,0Hz)
6' 129,10 8,1 d (J=9,0) 129,5 7,98 d (J=z)
*SANTOS et al., 2015

kaempferol (Figura 43).
Figura 43: Estrutura química do kaempferol
71
O sinal 4 obtido no cromatograma apresentou no espectro de massas (IES) íon
pseudomolecular [M+H]+ de m/z 283,976. Apesar das análises de deslocamento químico
na região do UV e análises de RMN confirmarem a estrutura química da substância 4
como kaempferol, o íon [M+H]+ de m/z 287 corresponde ao íon quase molecular do
kaempferol (MM=286 g/mol) não foi observado nas análises por CLUE-EM (Figura
44).
A
Figura 44: Cromatograma do sinal base (modo positivo) em 365 nm (A) e espectro de massas (B) da
5.5 Perfil químico do extrato bruto hidroetanólico por CLAE-DAD

O cromatograma do extrato bruto hidroetanólico de folhas de M. parvifoia
apresentou sinais com espectros na região ultravioleta característicos de flavonoides.
No cromatograma do extrato bruto hidroetanólico foram observados dois sinais
majoritários com tempo de retenção (14,409 min correspondente a miricetina-3-O-β-
arabinopiranosideo e 19,859 min correspondente a miricetina) e espectros de UV
semelhantes a substância referência (Figura 45). A identificação dos flavonoides foi
confirmada através do aumento da intensidade do sinal correspondente aos padrões no
extrato fortificado.
72
A
Figura 45: Cromatograma em 365 nm do extrato bruto hidroetanólico de folhas de Myrsine parvifolia (A),
cromatograma flavonoides referência (B), cromatograma do extrato bruto hidroetanólico fortificado (C).
Miricetina (1) e miricetina-3-O-β-arabinopyranoside (2). CLAE utilizando coluna fase inversa (C-18, 4.0
mm × 250 mm, 5 μm), fase móvel: (A) ácido trifluoracético 0,1% e (B) metanol com ácido trifluoracético
0,1%; gradiente: (i) 0-30 min, 40-65% B, (ii) 30-32 min, 65-40% B e (iii) 32-35 min, 40% B.; fluxo: 0.8
mL/min.
73
Os flavonoides miricetina, miricetina-3-O-β-arabinopiranosideo isolados da
fração em acetato de etila e identificados no extrato bruto hidroetanólico de folhas de M.
parvifolia, foram identificados anteriormente no extrato metanólico de folhas de M.
africana (AROT et al., 1996). Já a quercetina e kaempferol, também isolados da fração
em acetato de etila, foram identificados nas folhas de M. seguinii (YANG et al., 2014) e
M. africana (AROT et al., 1996).
5.6 Perfil químico da fração em hexano e diclorometano por CG-EM

O cromatograma da fração em hexano obtido por análise em CG-EM apresentou
sete sinais com os seguintes tempos de retenção e íons moleculares: 18,05 min (m/z
270,3); 19,82 min (m/z 284,3); 25,21 min (m/z 312,3); 45,68 min (m/z 416,4); 47,33 min
(m/z 430,4); 52,00 min (m/z 424,4) e 52,68 min (m/z 426,4) (Figura 46).
Abundância
250000
230000
210000
190000
170000
150000
130000
110000
90000
70000
50000
30000
10000
Tempo 5,00 15,00 25,00 35,00 45,00 55,00 65,00
Figura 46: Cromatograma da fração em hexano de folhas de M. parvifolia, obtido por CG-EM.
A sequencia de fragmentação dos espectros de massas obtidos a partir do sinal

em 18,05; 19,92 e 25,11 min foi caracterizada por aglomerados de íons alquilas (m/z
101, 115, 129, 143, 157) em intervalos de 14 unidades de massa (CH2), correspondente
a sucessivas quebras das ligações C-C. Os espectros apresentaram sinal mais intenso em
m/z 88 correspondente à quebra da ligação β em relação ao grupo C=O de um éster
74
etílico de um ácido alifático não ramificado ou m/z 74 correpondente ao mesmo padrão
de quebra de um éster metílico, através do rearranjo de McLafferty (Figuras 47 e 48)
(OLIVEIRA, 2011). Através da análise do valor de massa, padrão de fragmentação e
comparação com os dados da biblioteca do aparelho, foram identificados os ésteres de
ácidos alifáticos: éster metílico do ácido hexadecanóico (5), éster etílico do ácido
hexadecanóico (6) e éster etílico do ácido octadecanóico (7).
Figura 47: Espectros de massas do éster metílico do ácido hexadecanóico (5), éster etílico do ácido
hexadecanóico (6) e éster etílico do ácido octadecanóico (7), identificados na fração em hexano de folhas
de M. parvifolia, obtido através de ionização eletrônica por impacto de elétron a 70 ev.
Figura 48: Rearranjo de McLafferty em ésteres de ácido carboxílicos.
O sinal em 47,33 minutos, apresentou espectro de massas com fragmentos em

m/z 165 e 430, característico de α-tocoferol (8) (Figura 49). PORTER & BALDAS
(1971) propõem uma rota de fragmentação à partir do acetato de tocoferila. A partir do
íon molecular 668 do palmitato de tocoferol, tem-se a formação do fragmento em m/z
430 através da perda de um ceteno do ácido esterificante. A formação do ceteno ocorre
75
através de um rearranjo de hidrogênio com a transferência do mesmo, do carbono α à
carbonila para o oxigênio do tocoferol. O fragmento em íon de m/z 430 formado sofre
um processo de fragmentação através de rearranjo de hidrogênio (rH) uma reação de
retro Diels-Alder (RDA) no anel pirânico do tocoferol, para dar origem ao íon m/z 165,
ou a perda da cadeia alquílica lateral para formar o fragmento m/z 205. Outra alternativa
na formação do íon m/z 165 é a fragmentação a partir do íon molecular por rearranjo de
hidrogênio (rH) e uma reação de retro Diels-Alder (RDA) para formar o íon m/z 403 de
baixa intensidade, e posterior perda do ceteno para dar origem ao íon m/z 165 (Figura
50). O sinal em 45,68 min apresentou fragmentos em m/z 151 e 416, característicos do
γ-tocoferol (9) (Figura 49) (SIQUEIRA et al., 2003).
Figura 49: Espectro de massas do α-tocoferol (vitamina E) (8) e γ-tocoferol (9) identificados na fração em
hexano de folhas de M. parvifolia, obtido através de ionização eletrônica por impacto de elétrons 70 eV.
76
Figura 50: Proposta de fragmentação para os ésteres de α-tocoferol. (Adaptado de SIQUIERA et al.,
2003)
O espectro de massas do sinal em 52,03 e 52,68 minutos apresentou íon base em

m/z 218 característico de derivados de lupeno (Figura 51), confirmando a estrutura
proposta para lupeona (tr=52,03 min) e lupeol (tr=52,68 min) (BUDZIKIEWICZ,
1963).
Figura 51: Espectro de massas da lupeona (10) e lupeol (11) identificados na fração em hexano de folhas
de M. parvifolia, obtido através de ionização eletrônica por impacto de elétrons 70 eV.
O espectro de massas referente ao sinal do CG em 52,03 min apresentou o íon

m/z 424,4 correspondente ao íon molecular [M]+ e os fragmentos em m/z 409 [M-15]+,
m/z 381 [M-43]+ correspondente ao fragmento e, m/z em 218 correspondente ao
fragmento a proveniente da fragmentação RDA (Retro-Diels-Alder) do anel C do
77
lupeno, m/z em 205 correspondente ao fragmento b +2H, e o sinal em m/z em 189
correspondente ao fragmento c (Figura 52) (NORONHA, 2001).
Figura 52: Esquema geral de fragmentação de triterpenos pentacíclicos da série lupano. (Adaptado de
NORONHA, 2001).
O espectro de massas referente ao sinal do CG em 52,68 min apresentou o íon

m/z 426,4 e fragmentos em m/z 218, 207 e 189 oriundos da fragmentação do tipo RDA
do anel C, típicos de triterpenos pentacíclicos (Figura 53). Os fragmentos mais intensos
observados em m/z 189 e 207, são característicos de triterpenos pentacícliocs com
esqueleto do tipo lupano contendo grupamento hidroxila na posição C-3 (Figura 54)
(PRAKASH e PRAKASH, 2012; ZANOM et al., 2008).
Figura 53: Espectro de massas dos triterpenos lupeona (10) e lupeol (11) identificados na fração em
hexano de folhas de M. parvifolia, obtido através de ionização eletrônica por impacto de elétrons 70 eV.
78
Figura 54: Formação dos íons em m/z 189 e 207 característicos do lupeol (CARVALHO et al., 2010)
Através da análise do padrão de fragmentação, comparação com os dados da

biblioteca do aparelho e análises comparativas por CCD do extrato em hexano com o
padrão de lupeol possibilitou a identificação dos terpenos lupeona (10) e lupeol (11).
A análise do cromatograma da fração em diclorometano (Figura 55) e padrão de
fragmentação permitiu a identificação do éster etílico do ácido linoléico (m/z 308,3)
(12) e das substâncias 6, 7, 8, 9, 10 e 11, também identificadas na fração em hexano.
79
Figura 55: Cromatograma da fração em diclorometano de folhas de M. parvifolia, obtido por CG-EM.
O espectro de massas do éster etílico do ácio linoleico caracteriza-se pela

presença do sinal de íon molecular da baixa intensidade e aglomerados de íons alquilas
separado em intervalos de 14 unidades de massa (CH2), correspondente a sucessivas
quebras das ligações C-C (PEREIRA et al., 2005).
Sinal intenso no cromatograma da fração em hexano (Figura 46) em 33,87 min e
no cromatograma da fração em diclorometano (Figura 55) em 33,84 minutos apresentou
espectro de massas característico de biftalato (m/z 279,2).
A análise do padrão de fragmentação de massas após separação cromatográfica
em fase gasosa das frações em hexano e diclorometano quando comparada com a
biblioteca NIST do equipamento e dados da literatura, permitiu a identificação de
vitaminas lipossolúveis, terpenos de derivados de ácido graxo cujas estruturas são
apresentadas na Figura 56.
Esta é a primeira vez que as substâncias γ.-tocoferol, α-tocopherol (vitamina E),
lupano, lupeol, éster metílico do ácido hexadecanoico, éster etílico do ácido
hexadecanoico, éster etílico do ácido octadecanoico e éster etílico do ácido linoleico,
são descritas no gênero Myrsine.
80
Figura 56: Substâncias identificadas por CG-MS na fração em hexano e fração em diclorometano de
folhas e M. parvifolia: éster metílico do ácido hexadecanóico (5), éster etílico do ácido hexadecanóico
(6), éster etílico do ácido octadecanóico (7), α-tocoferol (vitamina E) (8), γ-tocoferol (9), lupeona (10),
lupeol (11) e éster etílico do ácido linoleico (12).
Na literatra pesquisada não foram encontrados relatos da presença de vitaminas

lipossolúveis e ácidos graxos em espécies do gênero. Terpenos como o taraxerol e
taraxerona foram descritas em folhas de M. africana (MANGURO et al., 1997), e
derivados de ácido benzoico contendo unidades terpênicas como o ácido myrsinoico (B,
C, E, F) foram descritos em folhas de M. seguinii (HIROTA et al., 2002; MAKABE et
al., 2003).
As análises químicas dos extratos e frações de folhas de M. parvifolia
possibilitou a identificação de substâncias pertencentes a diferentes classes químicas,
conforme apresentado na Tabela 12. Observa-se que as frações de menor polaridade são
ricas em ácidos graxos, derivados de tocoferol e terpenos enquanto as frações de maior
polaridade apresentam taninos e são constituídas majoritariamente por flavonoides.
81
Tabela 12: Substâncias e classes químicas de substâncias identificadas nas folhas de M. parvifolia.
Amostras Classe química Substâncias identificadas

Extrato bruto hidroetanólico Polifenol, flavonoides e taninos Miricetina e miricetina-3-O-β-arabinopiranosideo
γ.-tocoferol, vitamina E, lupano, lupeol, éster

metílico do ácido hexadecanóico, éster etílico do
Ácidos graxo, derivados
Fração em hexano ácido hexadecanóico e éster etílico do ácido
tocoferol e terpenos
octadecanóico.
γ-tocoferol, vitamina E, lupano, lupeol, éster etílico

Polifenol, flavonoides, ácidos
do ácido hexadecanóico, éster etílico do ácido
Fração em diclorometano graxo, derivados tocoferol e
octadecanóico e éster etílico do ácido linoleico.
terpenos
Miricetina, quercetina, kaempferol e miricetina-3-O-
Fração em acetato de etila Polifenol, flavonoides, tanino
β-arabinopiranosideo
Fração em butanol Polifenol, flavonoides, tanino
Extrato bruto aquoso Polifenol, flavonoides, tanino
Óleo essencial Sesquiterpenos
5.7 Ensaio biológico in vitro

Avaliação da capacidade de inibição direta dos extratos de M. parvifolia sobre a
peçonha de B. jararacussu, foram realizadas após pré incubação com os extratos e os
resultados são apresentados a seguir.
5.7.1 Atividade proteolítica

As enzimas proteolíticas, abundantes nas peçonhas de serpentes, atuam sobre
uma grande variedade de substratos causando principalmente alterações hemodinâmicas
e necrose tecidual (CUNHA et al., 2012). Logo, a inibição de proteases mostra-se um
importante mecanismo de ação de substâncias antiofídicas. No presente trabalho, o
extrato bruto hidroetanólico e fração em acetato de etila de folhas de M. parvifolia (2,4
mg/mL) após incubação com peçonha de B. jararacussu (0,24 mg/mL), inibiram 100%
de sua ação proteolítica, conforme apresentado na Figura 57. As frações em butanol,
hexano e diclorometano neutralizaram a proteólise em 97,8±0,9%, 81,3±2,7% e
87,9±0,6%, respectivamente. Os controles, solução salina (NaCl 0,9%) e DMSO, não
interferiram na ação proteolítica da peçonha.
82
Figura 57: Inibição da proteólise induzida por peçonha de Bothrops jararacussu após incubação por 30
min à 37ºC com extrato bruto hidroetanólico (EBH), fração em hexano (HEX), fração em diclorometano
(DCM), fração em acetato de etila (EA) e fração em butanol (BUT) de folhas de Myrsine parvifolia.
Dados expressos como Média ± Desvio padrão de três experimentos independentes (n=3).
Os resultados apresentados são semelhantes a outros trabalhos descritos na

literatura que verificaram inibição da atividade proteolítica de peçonha de serpentes por
espécies vegetais. A inibição da atividade proteolítica da peçonha de B. jararacussu por
frações/extrato de folhas de M. parvifolia foi maior que o demosntrado pelo extrato
bruto hidroetanólico de Hypericum brasiliense caracterizado pela presença de
flavonoides como hiperosideo, isoquercetrina, quercetrina, quercetina e kaempferol, o
qual inibiu em 60% da atividade proteolítica de B. jararaca. Strauch et al. (2013)
demosntraram que o extrato bruto hidroetanólico de Humianthera ampla e o terpeno
lupeol inibiram a proteólise da peçonha de B. atrox, de forma dose dependente.
Resultados mais próximos ao nosso, inibição da proteólise de 81-100%, foram
observados no extrato bruto hidroetanólico e frações em acetato de etila de M.
subsericea, contendo taninos e flavonoides (quercetina, kaempferol e miricetina) os
quais inibiram atividade proteolítica de peçonha de B. jararaca em pelo menos 84%
(OLIVEIRA et al., 2014).
5.7.2 Atividade coagulante

A peçonha de B. jararacussu exerceu efeito pró-coagulante, coagulando o
plasma em 86,5±10,30 segundos. O extrato bruto hidroetanólico e a fração em butanol
de folhas de M. parvifolia, prolongaram o tempo de coagulação induzida pela peçonha
de B. jararacussu em pelo menos seis vezes (>600 segundos) quando comparado com o
grupo controle (85,3±16,5 segundos), conforme apresentado na Figura 58. Quando
alíquotas de peçonhas foram pré-incubadas com fração em hexano, fração em
83
diclorometano e fração em acetato de etila, o tempo de coagulação do plasma foi
prolongado para 138,4±6,1 seg, 112,9±3,3 seg e 145,1±17,7 seg, respectivamente. Os
extratos diluídos em DMSO, na ausência da peçonha, não exerceram ação pró-
coagulante.
Figura 58: Tempo de coagulação induzida por peçonha de Bothrops. jararacussu após incubação por 30
min à 37ºC com solução salina (NaCl), dimetisufóxido (DMSO), extrato bruto hidroetanólico (EBH),
fração em hexano (HEX), fração em diclorometano (DCM), fração em acetato de etila (AE) e fração em
butanol (BUT) de folhas de M. parvifolia. Dados expressos como média ±desvio padrão de três
experimentos independentes (n=3), *: nível significância (p<0,05) quando comparado com os controles
(NaCl e DMSO). #: não coagulável em 600s.
Resultados semelhantes aos obtidos com o extrato bruto hidroetanólico e fração

em acetato de etila que apresentaram melhor solubilidade no meio aquoso utilizado na
realização dos ensaios, foram encontrados em frações ricas em flavonoides e taninos
provenientes de fração metanólica de Serjania erecta, que também tornaram o plasma
incoagulável após incubação do material vegetal com peçonha de B. jararacussu. Os
flavonoides e taninos, podem inibir a ação de serinoproteases, reduzindo efeito pró-
coagulante da peçonha botrópica (FERNANDES et al., 2011).
Jedinák et al. (2006) demonstraram que os flavonoides, antraqinonas,
antracenos, substâncias fenólicas e alcaloides, inibem de forma eficiente as serino
proeases. Já o extrato bruto etanólico de Humirianthera ampla contendo terpenóides,
inibiu apenas 25% da atividade pró-coagulante da peçonha de B. jararacussu
(STRAUCH et al., 2013).
Nazato et al. (2010) observou que a neutralização da toxicidade da peçonha de
B. jararacussu e Crotalus durissus terrificus ocorreu majoritariamente por frações do
caule de Dipteryx alata contendo taninos. Os autores sugerem que a ação antiofídica de
plantas ricas em taninos pode ser atribuída a suas características físico químicas, que lhe
84
permitem complexar e precipitar proteínas. Observação semelhante foi realizada por
Melo et al. (2009) que demonstraram a formação do complexo tanino mais peçonha
durante o processo de pré-incubação e que a precipitação proteica é etapa fundamental
na perda da toxicidade da peçonha
Os taninos, no entanto, não são as únicas substâncias que neutralizam ou
reduzem a toxicidade das peçonhas. O mecanismo preciso pelo qual os extratos vegetais
inibem ou neutralizam sua ação tóxica é desconhecido, no entanto tomando como base a
composição química dos extratos de M. parvifolia e trabalhos da literatura, sugere-se
que a neutralização da ação proteolítica e coagulante após incubação do extrato vegetal
com a peçonha de B. jararacussu possa ocorrer por algum dos seguintes mecanismos:
(i) os taninos presentes no extrato bruto hidroetanólico, fração em acetato de etila e
butanol podem precipitar proteínas, (ii) substâncias fenólicas e flavonoides encontradas
no extrato bruto hidroetanólico, fração em diclorometano, acetato de etila e butanol,
podem complexar com íons metálicos que atuam como co-fatores enzimáticos ou até
mesmo complexar com sítios catalíticos enzimáticos através de ligações de hidrogênio,
(iii) terpenos encontrados na fração em hexano e diclorometano podem formar
complexos com proteínas através de ligações hidrofóbicas ou, (iv) combinação de um
ou mais desses mecanismos (GOMES et al., 2010; MORS et al., 2000).
5.8 Ensaios biológicos in vivo

Avaliação da capacidade dos extratos de M. parvifolia em reduzir a a letalidade
e o processo inflamatório induzido pela peçonha de B. jararaca, foram realizadas após
pré tratamento dos animais por via oral os resultados são apresentados a seguir.
5.8.1 Letalidade
A capacidade protetora ou do aumento de sobrevida observada pelos extratos de
folhas de M. parvifolia foram verificados 6, 24 e 48 h após a administração da peçonha
de B. jararaca (9,6 mg/kg) por via subcutânea. Todos os animais do grupo controle,
tratados com veículo (dispersão de 5% de polissorbato 80 em água), foram a óbito em
até 24h. A fração em butanol potencializou o efeito letal da PBJ nas primeiras 6 h,
enquanto que a fração em hexano exerceu proteção de 11% no mesmo período de
tempo. A fração em acetato de etila aumentou o tempo de sobrevida dos animais,
apresentando capacidade protetora de 33% nas primeiras 6h, e de 40% em 24h e 48h,
conforme apresentado na Tabela 13.
85
Tabela 13: Efeito dos extratos de folhas de Myrsine parvifolia (100 mg/kg, vo, 1h) sobre a letalidade
induzida pela peçonha de Bothrops. jararaca (9,6 mg/kg).
6h 24h 48h
Amostras Nº de Proteção Nº de Proteção Nº de Proteção
mortes (%) mortes (%) mortes (%)
Controle 9/10 0 10/10 0 10/10 0
Extrato bruto hidroetanólico 9/10 0 10/10 0 10/10 0
Fração em hexano 8/10 11 10/10 0 10/10 0
Fração em diclorometano 9/10 0 10/10 0 10/10 0
Fração em acetato de etila 6/10 33 6/10 40 6/10 40
Fração em butanol 10/10 -11 10/10 0 10/10 0
Extrato bruto aquoso 9/10 0 10/10 0 10/10 0
A letalidade induzida pela peçonha de B. jararaca é decorrente de distúrbios de

coagulação induzidos pela ação de enzimas metaloproteases. Inicialmente ocorre
ativação do fator X e protrombina da cascata de coagulação, seguida da ativação de
plaquetas e formação de microtrombos que podem desencadear trombose e/ou
insuficiência renal aguda. Em um segundo momento, observa-se quadro de
incoagulabilidade sanguínea resultante do consumo de fatores de coagulação do sangue
(KAMIGUTI et al., 1991; WHITE, 2005).
As metaloproteases podem ser inibidas por substâncias pertencentes a diversas
classes químicas como terpenos, saponinas, esteroides, alcaloides, polifenois e
flavonoides (SANTHOSH 2013). A capacidade de proteção à letalidade frente a
peçonha de B. jararaca (PBJ), observada na fração em acetato de etila de folhas de M.
parvifolia, pode estar relacionada à sua elevada concentração de flavonoides. Os
flavonoides quercetina, miricetina e kaempferol, isolados da fração em acetato de etila,
assim como a hesperidina, naringinina, apigenina, luteolina e morina são descritas por
apresentarem atividade antiofídica (MORS et al., 2000). A proteção contra letalidade
obtida pela administração da fração acetato de etila de M. parvifolia, antes da
inoculação da peçonha nos camundongos, foi inferior ao verificado por Mors et al
(2000) quando administraram quercetina (100 mg/kg, vo) 1h antes da administração da
peçonha de B. jararaca, verificando redução da letalidade em 40-80%. Já os extratos
vegetais de Phyllanthus klotzschianus e Alpinia speciosa caracterizados
majoritariamente pela presença de kaempferol, flavonóide este identificado em baixa
86
concentração na fração em acetato de etila de M. parvifolia, conferiram 100% de
proteção.
5.8.2 Permeabilidade vascular
O aumento da permeabilidade vascular provocada pela PBJ (100 μg/kg, ipl.) foi
quantificado pelo aumento da concentração do corante Azul de Evans na cavidade
peritoneal. A concentração do corante foi determinada após interpolação dos valores de
absorvância do lavado peritoneal em uma curva de calibração de azul de Evans (Figura
59).
Figura 59: Curva padrão de Azul de Evans em 590nm (n = 4).
Alterações da permeabilidade vascular foram verificadas através do aumento da

concentração do corante azul de evans nos animais pertencentes ao grupo controle
(3,9±0,2 µg/mL) após dministração intraperitoneal da peçonha de B. jararaca. A
concentração do corante no lavado peritoneal reduziu para 2,7±0,3 µg/mL (inibição de
32,4%) nos animais tratados com extrato bruto hidroetanólico e 2,7±0,2 µg/mL
(inibição de 32,2%) nos animais tratados com fração em diclorometano (32,2±7,3%)
conforme apresentado na Figura 60. O anti-inflamatório esteroidal dexametasona e o
AINE diclofenaco de sódio, reduziram o aumento da permeabilidade vascular em 36,2%
e 32,2%, respectivamente.
O aumento da permeabilidade vascular é uma característica importante da
inflamação aguda e resulta da contração e separação das células endoteliais, exposição
da membrana basal e consequente extravasamento de fluido rico em proteínas
plasmáticas, fatores de coagulação e células (OKOLI et al., 2008).
87
5
azul de Evans (µg/mL)

Concentração corante
4
** * * **
3
0
controle DEXA DICLOF EBH HEX DCM AE BUT EBA
Figura 60: Efeito dos extratos de Myrsine parvifolia sobre aumento da permeabilidade vascular induzido
por peçonha de Bothrops jararaca. Os animais foram tratados com DEXA (dexametasona 1,0 mg/kg, vo),
DICLOF (diclofenaco de sódio 15,0 mg/kg, vo) EBH (extrato bruto hidroetanólico), HEX (fração em
hexano), DCM (fração em diclorometano), AE (fração em acetato de etila), BUT (fração em butanol) ou
EBA (extrato bruto aquoso) (100 mg/kg, vo) sessenta minutos antes da administração de 1 mg/kg de
Peçonha de B. jararaca por via intraperitoneal. Grupo controle foi tratado com veículo (dispersão de 5%
de polissorbato 80 em água, 10 mL/kg). Valores da concentração do corante Azul de Evans são expresos
como média ± desvio padrão (n=8). Tratamento estatístico dos dados foi realizado por ANOVA seguido
de pós teste Newman-Keul. *p<0.05 e **p<0.01 quando comparado ao grupo controle.
Alterações da permeabilidade vascular são decorrentes da ação de metabólitos

do ácido aracdônico, histamina e serotonina (ESTEVES et al., 2011; ARAUJO et al.,
2000; DAHLEN et al., 1981). MAGALHÃES et al. (2011) após avaliar processo
inflamatório induzido pela peçonha de B. erytromelas, B. alternatus e B. moojeni,
sugeriram que os leucotrienos (produtos do metabolismo da lipoxigenase) sejam os
principais mediadores químicos envolvidos na alteração da permeabilidade vascular e
migração de leucócitos para a matriz extracelular.
É descrito na literatura que animais tratados com infusão de plantas ao receber
injeção de peçonha de B. jararaca, apresentam menor sensibilidade a dor e menor
alteração da permeabilidade vascular (RUPPELT et al., 1991). RUPPELT et al. (1991)
observaram a redução do aumento da permeabilidade vascular induzida pela PBJ, em
animais previamente tratados com extratos de Marsypianthes chamaedrys (34%),
Pothomorphe umbellata (22%), Dorstenia brasiliensis (38%), Casearia sylvestris (29
%), Mikania glomerata (24%), Elephantopus scaber (39%) e Brunfelsia uniflora (35%).
ESTEVES et al. (2011) verificou 71% de redução do aumento da permeabilidade
vascular, induzida pela peçonha de B. alternatus, em animais tratados com óleo
essencial de Casearia sylvestris.
88
5.8.3 Edema de pata
Administração intraplantar de PBJ (5μg) induziu o desenvolvimento do edema
de pata de forma tempo dependente, conforme apresentado na Figura 61.
A formação do edema foi observada imediatamente após a administração
intraplantar da peçonha. Quando comparado a valores basais (tempo 0 h), o volume
máximo da pata foi atingido na segunda hora (0,124±0,009 mL) após a administração
da peçonha, seguido de lenta redução durante 3 h. O edema foi revertido completamente
ao final de 24 h, sendo observado após esse período uma área hemorrágica no local da
administração da peçonha.
O tratamento dos animais, 1h antes da administração de PBJ, com o extrato
bruto hidroetanólico, fração em hexano e fração em diclorometano de M. parvifolia
(100 mg/kg, vo), reduziu para 0,070±0,005 mL (43% de inibição); 0,078±0,012 mL
(37% de inibição) e 0,070±0,016 mL (43% de inibição), respectivamente, o volume
máximo da pata, observado após 2 h da administração da PBJ. Após 3,5 h da
administração do agente flogístico, o extrato bruto aquoso reduziu o edema em 49% e
após 5 h, a fração em hexano reduziu o edema em 64%, conforme apresentado na
Figura 61A. O controle farmacológico dexametasona inibiu o edema nos tempos 2 h
(35,48%), 3,5 h (31,31%) e 5 h (42,86%) após a administração da PBJ. Já o controle
farmacológico diclofenaco de sódio inibiu o edema nos tempos 2 h (51,6%); 3,5 h
(45,4%) e 5 h (40,0%) após a administração da PBJ.
De acordo com os valores de área sobre a curva (AUC), o extrato bruto
hidroetanólico, fração em hexano e fração em diclorometano de M. parvifolia reduziram
em 40,3±2,5%, 43,8±7,8% e 52,3±13,1% o edema total, respectivamente (Figura 61 B).
O controle farmacológico dexametasona e diclofenaco de sódio também exerceram
efeito anti-edematogênico, inibindo o edema total em 40,3±5,1% e 50,9±3,3%,
respectivamente.
89
A
0.15
Variação volume
de pata (mL)
0.10
0.05
0.00
0 1 2 3 4 5
tempo (h)
controle DEXA DICLOF
EBH HEX DCM
AE BUT EBA
4
* **
AUC
* **
**
2
0
controle DEXA DICLOF EBH HEX DCM AE BUT EBA
Figura 61: Efeito de extratos de Myrsine parvifolia sobre edema induzido por peçonha de Bothrops
jararaca. (A) Curva de edema tempo-dependente, (B) Edema total calculado como AUC durante período
de 5 h. Os animais foram tratados com DEXA (dexametasona 1,0 mg/kg, vo), DICLOF (diclofenaco de
sódio 15,0 mg/kg, vo) EBH (extrato bruto hidroetanólico), HEX (fração em hexano), DCM (fração em
diclorometano), AE (fração em acetato de etila), BUT (fração em butanol) ou EBA (extrato bruto aquoso)
(100 mg/kg, vo) sessenta minutos antes da administração intraplantar de 5 μg of de peçonha de B.
jararaca (50 μL de solução a 100 μg/mL). Grupo controle foi tratado com veículo (dispersão de 5% de
polissorbato 80 em água, 10 mL/kg). Os valores são expressos como média ± desvio padrão (n=8).
Tratamento estatístico dos dados foi realizado por ANOVA seguido de pós teste Newman-Keul. *p<0.05
e **p<0.01 quando comparado ao grupo controle.
90
Atividade edematogênica da peçonha de B. jararaca é atribuida a ação de
diversas toxinas: PLA2, metaloproteases hemorrágicas e não hemorrágicas
(GUTIERREZ et al., 1989). Diversos trabalhos demonstram que extratos vegetais
reduzem o edema induzido por peçonha de Bothrops (NUNEZ et al., 2004; REIS et al.,
2014). Resultados semelhantes aos obtidos com extrato de M. parvifolia, foram
descritos por FELIX-SILVA et al. (2014), que verificou que a administração oral de
extrato aquosos de folhas de Jatropha gossypiifolia, reduziu em aproximadamente 40%
o edema induzido pela PBJ. Os autores atribuíram a atividade antiedematogênica a
presença de alcaloides, terpenos, esteroides, flavonoides, taninos e compostos fenólicos
(FELIX-SILVA et al., 2014).
A atividade antiedematogênica observada no extrato bruto hidroetanólico, fração
em hexano e fração em diclorometano pode ser atribuída à presença de terpenos e
flavonoides, que são conhecidos por apresentarem atividade anti-inflamatória e são
considerados potenciais adjuvantes para o tratamento de efeitos locais induzidos pela
peçonha de serpentes (FERNANDES et al., 2016).
5.8.4 Pleurisia
Administração de PBJ (5 μg) no espaço interpleural de animais do grupo
controle, induziu resposta inflamatória aguda, caracterizada pelo aumento do número
total de leucócitos (69,20±6,20 x105 leucócitos/mL) e neutrófilos (49,09±8,57 x105
leucócitos/mL) após 5 h da administração da PBJ (Figura 62). O tratamento dos
animais, 1 h antes da administração de PBJ, com extrato bruto hidroetanólico, fração em
diclorometano e extrato bruto aquoso de folhas de M. parvifolia (100 mg/kg, vo)
reduziu o número de leucócitos totais no exsudato pleural para 39,47±4,63 x105
leucócitos/mL (inibição de 42,9%), 41,89±8,82 x105 leucócitos/mL (inibição de 39,4%)
e 41,59±6,64 x105 leucócitos/mL (inibição de 39,9%), respectivamente. O controle
farmacológico dexametasona reduziu em 58,2% o número de leucócitos totais (Figura
62A). A diminuição do número total de leucócitos pode ser atribuída a redução do
influxo de neutrófilos para a cavidade pleural (Figura 62B), visto que não verificou-se
redução significativa no número de monócitos (Figura 62C).
91
A
100
Leucócitos totais 80
(x105 cel/mL)
60
** *
*
40 ***
20
0
controle salina DEXA EBH HEX DCM AE BUT EBA
80
60
(x105 cel/mL)
Neutrófilos
40
* * *
***
20
0
30
(x105 cel/mL)
Monócitos
20
10
0
Figura 62: Efeito dos extratos de Myrsine parvifolia sobre o número de leucócitos totais (A), neutrófilos
(B) e monócitos (C) em modelo de pleurisia induzido por peçonha de Bothrops jararaca. Os animais
foram tratados com Dexa (dexametasona 1,0 mg/kg, vo), EBH (extrato bruto hidroetanólico), HEX
(fração em hexano), DCM (fração em diclorometano), AE (fração em acetato de etila), BUT (fração em
butanol) ou EBA (extrato bruto aquoso) (100 mg/kg, vo) sessenta minutos antes da administração
intratorácica de 5 μg of de peçonha de B. jararaca (50 μL de solução a 100 μg/mL). Grupo controle foi
tratado com veículo (dispersão de 5% de polissorbato 80 em água, 10 mL/kg). Valores são expressos
como média ± desvio padrão (n=6). Tratamento estatístico dos dados foi realizado por ANOVA seguido
de pós teste Newman-Keul. *p<0.05, **p<0.01 e ***p<0.001 quando comparado ao grupo controle.
92
O modelo experimental de pleurisia é uma importante ferramente que permite
avaliar a potencial atividade anti-inflmatória de diversas substâncias. A peçonha de
Bothrops é constituida por uma variedade de enzimas, tais como as metaloproteases,
que digerem a membrana basal dos vasos sanguíneos, permitindo o extravasamento e
migração de leucócitos do leito vascular para matriz extracelular. As metaloproteases
também são conhecidas por ativar macrófagos que secretam mediadores pró-
inflamatórios (BURIGO et al., 1996).
Conforme apresentado por Burigo et al. (1996), a injeção intratorácica de PBJ
em ratos induz rápido influxo de neutrófilos em 3-8 h após administração do agente
flogístico, e envolve a participação de vários mediadores inflamatórios como, histamina,
serotonina e produtos do metabolismo do ácido aracdônico (TREBIEN & CALIXTO,
1989).
Pereira et al. (2009) demonstraram que a administração de extrato hidroetanólico
de Marsypianthes chamaedrys reduziu a migração de leucócitos para a cavidade pleural
em animais desafiados com peçonha de B. jararacussu. Outro estudo demosntrou que o
extrato de Marsypianthes chamaedrys inibiu a migração de leucócitos e a produção de
citocinas pró-inflamatórias, como IL-6 e TNF-α, após injeção de peçonha de B. atrox
(MAGALHÃES et al., 2011).
5.8.5 Correlação da composição química dos extratos de M. parvifolia e atividades

biológicas in vivo
Considerando que a resposta inflamatória induzida pela peçonha evolui
rapidamente e que a administração de soro hiperimune não ocorre imediatamente após o
acidente ofídico, os sinais locais de envenenamento (aumento permeabilidade vascular,
edema e influxo de células) não são inibidos pela soroterapia tradicional. ARAÚJO et
al. (2000) observaram que o edema induzido pela peçonha de B. jararaca é neutralizado
pelo soro heterólogo somente quando administrado em até 30 minutos após o acidente.
No Brasil, em 2015, o tempo médio entre o acidente botrópico e o atendimento médico
foi de 1-3 h (33% dos casos) (SINAN, s.d.). Após esse período, os efeitos locais do
envenenamento já foram instalados e não são revertidos pela soroterapia.
A peçonha botrópica induz um quadro fisiopatológico caracterizado pelo
aumento da permeabilidade vascular, rápido desenvolvimento do edema e intensa
reação inflamatória com migração de células para o local da picada. Essas alterações
fisiológicas, iniciadas por toxinas da peçonha, são mantidas e amplificadas por
93
mediadores químicos pró-inflamatórios de origem celular (OKOLI et al., 2008;
BURIGO et al., 1996).
Baseado nos resultados obtidos nos diferentes modelos experimentais in vivo,
observa-se que os extratos de folhas de M. parvifolia são capazes de inibir parcialmente
as principais complicações locais do envenenamento por B. jararaca, relacionadas com
a inflamação.
O extrato bruto hidroetanólico e a fração em diclorometano de folhas de M.
parvifolia reduziram o aumento da permeabilidade vascular, o edema e a infiltração de
leucócitos, quando os animais foram estimulados pela peçonha de Bothrops jararaca
(PBJ). Já a fração em hexano, caracterizada pela presença de terpenos, ácidos graxos e
vitaminas, reduziu apenas ação edematogênica. Acredita-se que a ação simultânea de
diferentes substâncias, presentes no extrato bruto hidroetanólico, fração em hexano e
fração em diclorometano, sobre do aumento da permeabilidade vascular e migração de
leucócitos pode reduzir o processo de formação do edema conforme sugerido por Okoli
et al. (2008).
A redução do edema, do aumento da permeabilidade vascular e da migração de
leucócitos observados nos animais tratados com extrato bruto hidroetanólico e fração
em diclorometano podem ser parcialmente explicadas pela presença de flavonoides,
como a quercetina, que inibem a a ação da enzima cicloxigenase (COX-2), fosfolipase
A2 e expressão da enzima lipoxigenase (CALIXTO et al., 2004; MORS et al., 2000).
Miricetina e kaempferol também demonstraram inibir eficientemente a enzima PLA2.
No entanto, outras classes de substâncias como terpenos e a vitamina E, identificadas na
fração em diclorometano, demonstram também ser fundamentais na inibição desses
sinais, visto que a fração com maior concentração de flavonoides (fração em acetato de
etila) não foi capaz de reduzir a inflamação induzida pela peçonha de B. jararaca. O
controle do edema, redução do aumento da permeabilidade vascular e infiltração de
leucócitos também não podem ser atribuídos unicamente aos terpenos e vitamina E, já
que a fração em hexano reduziu apenas a formação do edema, demonstrando-se ineficaz
no controle do aumento da permeabilidade vascular e infiltração de leucócitos.
Os flavonoides, são considerados uma das principais classes químicas com
atividade antiofídica, visto que são capazes de se ligar a sítios catalíticos de enzimas
através de ligações de hidrogênio (MORS et al., 2000). Mecanismos antioxidantes têm
sido propostos para essa classe de substâncias, como: (i) inibição do sistema enzimático
responsável pela geração de radicais livres (ciclooxigenase, lipoxigenase ou xantina
94
oxidase); (ii) quelação de íons metálicos que podem iniciar a produção de radicais
hidroxil; (iii) seqüestro de radicais livres; (iv) proteção das defesas antioxidantes por
induzir a fase II de enzimas como glutationa transferase que aumenta a excreção de
espécies oxidadas (v) indução de enzimas antioxidantes como a metalotioneína que é
uma proteína queladora de metais, com propriedades antioxidantes (BEHLING et al.,
2004).
A redução do edema em animais tratados com a fração em hexano e diminuição
do aumento da permeabilidade vascular e da infliltração de leucócitos nos animiais
tratados com a fração em diclorometano podem estar relacionados com a presença de
terpenos e vitamina E, que regulam a produção de eicosanoides.
O lupeol, triterpeno pentacíclico, identificado na fração em hexano e
diclorometano, é descrito por inibir a expressão de COX-2 e iNOS em macrófagos, e
também a síntese de prostaglandinas. O lupeol é descrito por inibir a produção de
prostaglandinas (PGE2) por macrófagos sem interferir na produção de leucotrienos
(CALIXTO et al., 2003). O acetato de lupeol, isolado de raízes de Hemisdemus indicus
neutralizou a ação letal, hemorrágica, formação de edema e inibição de PLA2, induzida
pela peçonha de Daboia russelli (GOMES et al., 2010). Já a vitamina E, substância
antioxidante identificada na fração em hexano e diclorometano, interfere na produção de
eicosanoides através da inibição das enzimas cicloxigenases (COX-2) e folfolipase A2.
(CALIXTO et al., 2003; CHANDRA et al., 2002; ABATE et al., 2000). O grupamento
hidroxila do alfa tocoferol interage com os aminoácidos His48 e Asp49 da enzima PLA2
através de ligação de hidrogênio, enquanto que o restante da molécula interage com o
resíduo hidrofóbico da enzima através de ligações hidrofóbicas que estabilizam o
complexo formado (CHANDRA et al, 2002).
Deve-se considerar que os ensaios foram realizados com peçonha bruta de B.
jararaca e que alteraçãoes da permeabilidade vascular também são influenciadas por
fatores hemorrágicos presentes na peçonha, mesmo que em pequenas concentrações.
Dessa forma, não se pode descartar a participação de fatores hemorrágicos na formação
do edema e alteração da permeabilidade vascular, visto que os fatores hemorrágicos não
foram removidos da peçonha bruta utilizada (ARAÚJO et al., 2000).
A lesão tecidual provocada pelo envenenamento ofídico é resultado de intenso
processo inflamatório e produção de espécies reativas de oxigênio, como radicais
superóxido, que atuam formando peróxidos lipídicos e desencadeando quadro de
necrose. Assim sendo, substâncias com propriedades antioxidantes como os terpenos,
95
vitamina E e flavonoides, identificados no extrato bruto hidroetanólico, fração em
hexano e fração em diclorometano, podem auxilar no controle da formação de espécies
reativas de oxigênio, reduzindo os efeitos tóxicos desencadeados pelo processo
inflamatório induzido pela peçonha de serpentes, (FELIX-SILVA et al., 2014).
Devido a complexidade química dos extratos de M. parvifolia, especialmente o
extrato bruto hidroetanólico e fração em diclorometano, a inibição das ações
farmacológicas relacionadas ao processo inflamatório, podem ser atribuídas a ação
sinérgica de flavonoides e terpenos encontrados nesses extratos, conforme já sugerido
por CHIBLI et al., 2014.
Os resultados biológicos observados apresentam correlação com as substâncias
químicas identificadas (terpenos, vitaminas, flavonoides e ácidos graxos) nos extratos
de folhas de M. parvifolia, visto que estas classes de substâncias são descritas na
literatura por apresentarem propriedades anti-inflamatórias (CALIXTO et al., 2003;
CALIXTO et al., 2004; MORS et al., 2000).
Estudos futuros podem ser realizados para identificar o mecanismo de ação dos
extratos na neutralização da toxicidade da peçonha de Bothrops sp, e sua capacidade em
reduzir a morbidade quando administrados na forma de pós tratamento à inoculação da
peçonha de serpentes.
96
6 CONCLUSÃO
O presente trabalho relata a primeira descrição da composição química e
atividade biológica de Myrsine parvifolia, espécie nativa e não endêmica do Brasil
encontrada no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba. No óleo essencial de folhas e
frutos foram identificados 18 e 35 substâncias, respectivamente, pertencentes
predominantemente à classe dos sesquiterpenos. As substâncias α-himachaleno, γ-
himachaleno, γ-selineno e himachalol são descritas pela primeira vez no gênero
Myrsine. O óxido de cariofileno (14,4%) foi o principal constituinte identificado no óleo
essencial das folhas enquanto o β-cariofileno (11,7%) foi o principal constituinte
identificado no óleo essencial dos frutos.
Ensaios espectrofotométricos indicaram maior teor de polifenol total, flavonoide
total e maior indice de atividade antioxidante na fração em acetato de etila. Os
flavonoides miricetina, miricetina-3-O-β-arabinopiranosideo, quercetina e kaempferol,
descritos anteriormente em outras espécies do gênero Myrsine, foram identificados após
isolamento a partir da fração em acetato de etila, e também identificados na fração em
diclorometano. No extrato bruto hidroetanólico foram identificados os flavonoides
miricetina e miricetina-3-O-β-arabinopiranosideo. Sete substâncias pertencentes às
classes dos terpenos, ácidos graxos e vitaminas lipossolúveis foram identificadas na
fração em hexano e fração em diclorometano, e descritos pela primeira vez no gênero.
O extrato bruto hidroetanólico e as frações em hexano, diclorometano, acetato de
etila e butanol inibiram a atividade proteolítica enquanto o extrato bruto hidroetanólico
e fração em butanol de folhas de M. parvifolia inibiram a atividade coagulante induzida
pela peçonha de B. jararacussu. A observação sugere que extratos mais complexos
(extrato bruto hidroetanólico) e de maior polaridade (fração em butanol), inibam com
maior eficácia enzimas proteolíticas e coagulantes da peçonha de B. jararacussu, em
modelo in vitro.
A fração em acetato de etila de folhas de M. parvifolia prolongou o tempo de
sobrevida dos animais inoculados com peçonha de B. jararaca. O extrato bruto
hidroetanólico e fração em diclorometano reduziram o aumento da permeabilidade
vascular, o edema e a infiltração de leucócitos induzido pela peçonha de B. jararaca. Já
a fração em hexano reduziu apenas a formação do edema. Os resultados sugerem2 que o
processo inflamatório é melhor controlado pela administração de extratos com
97
composição química mais complexa, como o extrato bruto hidroetanolico e fração em
diclorometano.
Os resultados do presente trabalho demonstram o potencial dos extratos de
folhas de M. parvifolia em inibir enzimas proteolíticas e prócoagulantes da peçonha de
B. jararacussu. Os resultados demonstram também que o extrato bruto hidroetanólico,
fração em hexano e fração em diclorometano de folhas de M. parvidolia apresentam
potencial anti-inflamatório quando utilizado como pré-tratamento ao envenenamento
por B. jararaca, especialmento no controle de manifestações locais, sugerindo assim
seu uso frente ao envenenamento botrópico.
98
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABATE, A.; YANG, G.; DENNERU, P.A.; OBERLE, S.; SCHODER, H. Synergistic
inhibition of cyclooxygenase-2 expression by Vitamin E and aspirin. Free Radical
Biology & Medicine, 29(11): 1135–1142, 2000.
ABBHI, V.; JOSEPH, L.; GEORGE, M. Phytochemical analysis of fruit extract of

Myrsine africana. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences,
3(4), 427-430: 2011.
ADAMS, R. P. Identification of essential oil components by gas

chromatography/mass spectrometry. 4º edição. Allured Publishing Corporation,
2007.
AHMAD, B.; AZAM,S.; BASHIR, S.; KHAN, I.; ALI, N.; IQBAL, M. Phytotoxic,
Antibacterial and Haemagglutination activities of the aerial parts of Myrsine africana L.
African Journal of Biotechnology, 10(1): 97-102, 2011.
AINOOSON, G.K.; OWUSU, G.; WOODE, E.; ANSAH, C.; ANNAN, K. Trichilia
monadelpha bark extracts inhibit carrageenan-induced foot-oedema in the 7-day old
chick and the oedema associated with adjuvant-induced arthritis in rats. Afr J Tradit
Complement Altern Med, 9(1): 8-16, 2012.
ALBANO, M.N.; SILVEIRA, M.R.; DANIELSKI, L.G.; FLORENTINO, D.;

PETRONILHO, F.; PIOVEZAN, A.P. Anti-inflammatory and antioxidante properties of
hydroalcoholic crude extract from Casearia sylvestris Sw. (Saliceae). Journal of
Ethnopharmacology, 147: 612–617, 2013.
ALBUQUERQUE, A. A. E.; LIMA, H.A.; ESTEVES, V.G.; BENEVIDES, C.R.;

RPDARTE, A.T.A. Myrsine parvifolia (Primulaceae) in sandy coastal plains marginal
to Atlantic rainforest: a case of pollination by wind or by both wind and insects?
Brazilian Journal of Botany, 36(1): 65-73, 2013.
ANESINI, C.; FERRARO, G.E.; FILIP, R. Total Polyphenol content and antioxidant
capacity of commercially avaliable tea (Camellia sinensis) in Argentina. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 56: 9225-9229, 2008.
ARAÚJO, D.; LACERDA, L. A natureza das restingas. Ciência Hoje, 6: 42-48, 1987.
ARAUJO, A.L.; SOUZA, A.O.; CRUZ, HOFLING, M.A.; FLORES, C.A.; BOM, C.
Bothrops lanceolatus (Fer de lance) venom induces oedema formation and increases
vascular permeability in the mouse hind paw. Toxicon, 38: 209-221, 2000.
ARAÚJO, D. S. S. et al. Florística e padrões fitogeográficos In: COSTA, A. F. e DIAS,

I. C. A. (Ed.). Flora do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba e arredores,
Rio de Janeiro, Brasil: listagem,florística e fitogeografia: angiospermas,
pteridófitas, algas continentais. . Rio de Janeiro: Museu Nacional do Rio de Janeiro,
155-165, 2001.
99
AROT, L.O.M.; MIDIWO, J.O.; KRAUST, W. A flavonol glycoside from Myrsine
afrina leaves. Phytochemistry, 43(5): 1107-1109,1996.
ASSAFIM, M.; CORIOLANO, E.C.; BENEDITO, S.E.; FERNANDES, C.P.; LOBO,

J.F.R.; SANCHEZ, E.F.; ROCHA, L.M.; FULY, A.L. Hypericum brasiliense plant
extract neutralizes some biological effects of Bothrops jararaca snake venom. Journal
of Venom Research, 11-16, 2011.
BALDO, C.; JAMORA, C.; YAMANOYE, N.; ZORN, T.M.; MOURA-DA-SIVA,

A.M. Mechanisms of Vascular Damage by Hemorrhagic Snake Venom
Metalloproteinases: Tissue Distribution and In Situ Hydrolysis. PLoS Negl Trop Dis
4(6): e727. doi:10.1371/journal.pntd.0000727, 2010.
BEHLING, E.B.; SENDÃO, M.C.; FRANCESCATO, H.D.C.; ANTUNES, L.M.G.;

BLANCHI, M.L.P. flavonóide quercetina: aspectos gerais e ações biológicas. Alim
Nutr, 15(3): 285-292, 2004.
BIESALSKI, H.K. Polyphenols and inflammation: basic interactions. Curr Opin Clin
Nutr Metab Care, 10: 724–728, 2007.
BLOOR, S. J.; QI, L. Cytotoxic saponins from new-zealand Myrsine species. Journal
of Natural Products, 57(10): 1354-1360, 1994.
BORGES, C.C.; CAVALCANTI-NETO, A. J; BOECHAT, A. L; FRANCISCO, C. H;

ARRUDA, M. R E SANTOS, M. C. Eficácia da espécie vegetal Peltodon radicans
(Labiatae, Lameaceae) na neutralização da atividade edematogênica e ineficácia do
extrato vegetal Específico Pessoa na neutralização das principais atividades do veneno
de Bothrops atrox. Revista da Universidade do Amazonas, 1: 97-113, 1996.
BRASIL. Boletim eletrônico epidemiológico. Brasília: Ministério da Saúde, 2010a.
BRASIL. Farmacopéia Brasileira. 5º edição. Brasília: Agência Nacional de Vigilância

Sanitária, 2010b.
BRASIL. Guia de vigilância epidemiológica / Ministério da Saúde, Secretaria de

Vigilância em Saúde. 6 ed. Brasília: Ministério da Saúde, 2005.
BURIGO, A.C.; CALIXTO, J.B.; MEDEIROS, Y.S. Pharmacological Profile of Rat

Pleurisy Induced by Bothrops jararaca Venom. J. Pharm. Pharmacol., 48: 106-111,
1996.
BUDZIKIEWICZ, H.; WILSON, J.M.; DJERASSI, C. Mass spectrometry in structural

and stereochemical problems. XXXII. Pentacyclic triterpenes. Journal of the
American Chemical Society, 85(22): 3688-3699, 1963.
CALIXTO, J.B.; CAMPOS, M.M.; OTUKI, M.F.; SANTOS, A.R. Anti-inflammatory

compounds of plant origin. Part II. modulation of pro-inflammatory cytokines,
chemokines and adhesion molecules. Planta Medica, 70(2): 93-103, 2004.
100
CALIXTO, J.B.; OTUKI, M.F.; SANTOS, A.R.S. Anti-inflammatory compounds of
plant origin. Part I. Action on arachidonic acid pathway, nitric oxide and nuclear factor
kappa B (NF-kappaB). Planta Medica, 69(11), 973-983: 2003.
CARDOSO, J.L.C.; FRANÇA, F.O.S.; WEN, F.H.; MÁLAQUE, C.M.S.; HADDAD

Jr., V. Venomous animals in Brazil: biology, clinic and therapeutics of envenomations.
Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 45(6): 338-338, 2003.
CARVALHO, T.C.;POLIZELI, A.M.; TURATTI, I.C.C.; SEVERIANO, M.E.;

CARVALHO, C.E.; AMBROSIO, S.R.; CROTTI, A.E.M.; FIGUEIREDO, U.S.;
VIEIRA, P.C.; FURTADO, N.A.J.C. Screening of filamentous fungi to identify
biocatalysts for lupeol biotransformation. Molecules, 15: 6140-6151, 2010.
CARVALHO, B.M.A.; SANTOS, J.D.L.; XAVIER, B.M.; ALMEIDA,

J.R.;RESENDE, L.M.; MARTINS, W.; MARCUSSI, S.; MARANGONI, S.;
STÁBELI, R.G.; CALDERON, L.A.; SOARES, A.M.; DA SILVA, S.L.; SALVADOR,
D.P.M. Snake Venom PLA2s Inhibitors Isolated from Brazilian Plants: Synthetic and
Natural Molecules. BioMed Research International, 153045 doi:
10.1155/2013/153045, 2013.
CHANDRA, V.; JASTI, J.; KAUR, P.; BETZEL, C.; SRINIVASAN, A.; SINGH, T.P.
First Structural Evidence of a Specific Inhibition of Phospholipase A2 by α-Tocopherol
(Vitamin E) and its Implications in Inflammation: Crystal Structure of the Complex
Formed Between Phospholipase A2 and α-Tocopherol at 1.8 A° Resolution. Journal of
Molecular Biology, 320: 215–222, 2002.
CHIBLI, L.A.; RODRIGUES, K.C.M.; GASPARETTO, C.M.; PINTO, N.C.C.;

FABRI, R.L.; SCIO, E.; ALVES, M.S.; VIEIRA, G.D.V.; SOUSA, O.V. Anti-
inflammatory effects of Bryophyllum pinnatum (Lam.) Oken ethanol extract in acute
and chronic cutaneous inflammation. Journal of Ethnopharmacology, 154: 330–338,
2014.
COGLIATTI-CARVALHO, L. Variação na estrutura e na composição de

Bromeliaceae em cinco zonas de restinga no Parque Nacional da Restinga de
Jurubatiba. Macaé, RJ. Revista Basileira de Botânica, 24(1): 1-9, 2001.
CONAMA. Resolução 261, de 30 de junho de 1999. Disponível

em:<http://www.mma.gov.br/port/conama/res/res99/res26199.html>. Acessado em 20
de outubro de 2014.
COTRIM, C.A.; OLIVEIRA, S.C.B.; FILHO, E.B.S.D; FONSECA, F.V.; ANTUNES,

E.; XIMENES, R.M.; MONTEIRO, H.S.A.; RABELLO, M.M.; HERNANDES, M.Z.;
TOYAMA, D.O.; TOYAMA, M.H. Quercetin as an inhibitor of snake venom secretory
phospholipase A2. Chemico-Biological Interactions, 189: 9–16, 2012.
COUTINHO, M.A.S.; MUZITANO, M.F.; COSTA, S.S. Flavonoides: Potenciais

Agentes Terapêuticos para o Processo Inflamatório. Revista Virtual Química, 1(3):
241-256, 2009.
101
CUNHA, E.M.; MARTINS, O.A. Principais compostos químicos presente nos venenos
de cobras dos gêneros Bothrops e Crotalus – uma revisão. Revista Eletrônica de
Educação e Ciência, 2 (2): 21-26, 2012.
DAHLEN, S.; BJORKT, J.; HEDQVIST, P.; ARFORST, K.; HAMMARSTROMS, S.;
LINDGRENS, J.; SAMUELSSONS, B. Leukotrienes promote plasma leakage and
leukocyte adhesion in post capillary venules: In vivo effects with relevance to the acute
inflammatory response. Proceedings of the National Academy of Sciences, 78(6): 3887-
3891, 1981.
DE OLIVEIRA, E.C.; FERNANDES, C.P.; SANCHEZ, E.F.; ROCHA, L.; FULY, A.L.
Inhibitory Effect of Plant Manilkara subsericea against Biological Activities of
Lachesis muta Snake Venom. Biomed Research International, 1-7, 2014.
DEY, A.; DE, J. N. Phytopharmacology of Antiophidian Botanicals: A Review.

International Journal of Pharmacology, 8(2): 62-79, 2012.
DONG, M.; NAGAOKA, M.; MIYAZAKI,S.; IRIYE,R.;HIROTA, M. .3-Geranyl-4-

hydroxy-5-(3 '-methyl-2 '-butenyl)benzoic acid as an anti-inflammatory compound from
Myrsine seguinii. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 63(9): 1650-
1653,1999.
DUSSE, L.M.S.; VIEIRA, L.M.; CARVALHO, M.G. Nitric oxide revision. Jornal
Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, 39(4): 343-350, 2003.
EL-FISHAWY, A.; ZAYED, R.; AFIFI, A. Phytochemical and pharmacological studies

of Ficus auriculata Lour. Journal of Natural Products, 4: 184-195, 2011.
ESTEVES, I.; LIMA, L.M.; SILVA, M.L.; SANTOS, L.S.; RODRIGUES, M.; DA
SILVA, J.M.S.; PERAZZO, F.H.; CARVALHO, J.C.T. Casearia sylvestris sw.
Essential oil activity in inflammation in rats induced by Bothrops alternatus venom.
International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 7(2): 28-
32, 2011.
European Pharmacopoeia. 5th ed. Strasbourg: EDQM, 2005.
FARIAS, J.A.C.; FERRO, J.N.S.; SILVA, J.P.; AGRA, I.K.R.; OLIVEIRA, F.M.;
CANDEA, A.L.P.; CONTE, F.P.; FERRARIS, F.K.; HENRIQUES, M.G.M.O.;
CONSERVA, L.M.; BARRETO, E. Modulation of inflammatory processes by leaves
Extract from Clusia nemorosa both in vitro and in vivo animal models. Inflammation,
35(2): 764-771, 2012.
FELIX-SILVA, J.; SOUZA, T.; MENEZES, Y.A.S.; CABRAL, B.; CAMARA,

R.B.G.SILAV-JUNIOR, A.A.; ROCHA, H.A.O.; REBECCHI, I.M.M.; ZUCOLOTTO,
S.M.; FERNANDES-PEDROSA, M.F. Aqueous Leaf Extract of Jatropha gossypiifolia
L. (Euphorbiaceae) Inhibits Enzymatic and Biological Actions of Bothrops jararaca
Snake Venom. PLoS ONE, 9(8): e104952. doi:10.1371/journal.pone.0104952, 2014.
FERNANDES, R.M. Contribuição para o conhecimento do efeito anti-inflamatório e

analgésico do Balsamo de Copaíba e alguns de seus constituintes. – Dissertação de
Mestrado. Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
1986.
102
FERNANDES, R.S.; COSTA T.R.; MARCUSSI, S.; BERNARDES, C.P.; MENALDO,
D.L.; RODRIGUÉZ, G.I.I.; PEREIRA, P.S.; SOARES, A.M.; FERNANDES, R.
Neutralization of pharmacological and toxic activities of Bothrops jararacussu snake
venom and isolated myotoxins by Serjania erecta methanolic extract and its fractions.
Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, 17(1): 85-
93, 2011.
FERNANDES, J.M.; FÉLIX-SILVA, J.; CUNHA, L.M.; GOMES, J.A.S.; SIQUEIRA,

E.M.S.; GIMENES, L.P.; LOPES, N.P.; SOARES, L.A.L.; PEDROSA, M.F.F.;
ZUCOLOTTO, S.M. Inhibitory effects of hydroethanolic leaf extracts of Kalanchoe
brasiliensis and Kalanchoe pinnata (Crassulaceae) against local effects induced by
Bothrops jararaca snake venom. PLoS ONE, 11(12): e0168658, doi:10.1371/journal.
pone.0168658, 2016.
FERREIRA, S.H. A New method for measuring variation of rat paw volume. Journal
of Pharmacology and Pharmacotherapeutics, 31: 648 1979.
FOX, J. W.; SERRANO, S. M. T. Timeline of key events in snake venom

metalloproteinase research. Journal of Proteomics, 72(2): 200-209, 2009
FRANÇA, H.; CORREA, A.L.; OLIVEIRA, A.P.; KUSTER, R.M.; SANTOS, R.P.;
ROCHA, L. Flavonoids from Myrsine rubra M. F. Freitas & Kinoshita (Myrsinaceae).
Biochemical Systematics and Ecology, 39(4-6): 885-887, 2011.
FREITAS, M. F. In: Myrsine in Lista de Espécies da Flora do Brasil., Disponível em:

http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/listaBrasil/FichaPublicaTaxonUC/FichaPublicaTax
onUC.do?id=FB10238. Sem data. Acesso em: 05 de abril de 2014.
FREITAS, M.F.; KINOSHITA L.S. Myrsine (Myrsinoideae- Primulaceae) in

Southeastern and Southern Brazil. Rodriguésia, 66(1): 167-189, 2015.
FUNASA. Manual de Diagnóstico e Tratamento de Acidentes por Animais

Peçonhentos Brasilia: Ministério da Saúde, 2001.
FÜRER, K.; RAITH, M.; BRENNEISEN, R.; MENNET, M.; SIMÕES-WÜST,

A.P.; VON MANDACH, U.; HAMBURGER, M.;, POTTERAT, O. Two new flavonol
glycosides and a metabolite profile of Bryophyllum pinnatum, a phytotherapeutic used
in obstetrics and gynaecology. Planta Medica, 79(16):1565-1571, 2013.
FURTADO, R.A.; BERNARDES, C.T.V.; SILVA, M.N.; ZOCCAL, K.F.; FACCIOLI,

L.H.; BASTOS, J.K. Antiedematogenic Evaluation of Copaifera langsdorffii leaves
hydroethanolic extract and its major compounds. BioMed Research International,
2015, 913152, 2015.
GARCIA, E. S. G., JORGE A.PRADO, JOSÉ L. Purification and characterization of a

sulfhydryl-dependent protease from Rhodnius prolixus midgut *. Archives of
Biochemistry and Biophysics, 188(2): 315-322, 1978.
GENE, J. A.; ROY, A.; ROJAS, G.; GUTIERREZ, J.M.; CERDAS, L. Comparative-
study on coagulant, defibrinating, fibrinolytic and fibrinogenolytic activities of costa-
rican crotaline snake-venoms and their neutralization by a polyvalent antivenom.
Toxicon, 27(8): 841-848, 1989.
103
GOBBO-NETO, L. & LOPES, N.P. Plantas medicinais: fatores de influência no
conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova, 30(2): 374-381, 2007.
GOMES, A.; SARKHEL, S.; MISHRA, R.; MUKHERJEE, S.; BHATTACHARYA, S.;
GOMES, A. Herbs and herbal constituents active against snake bite. Indian Journal of
experimental biology, 48(9): 865-878, 2010.
GUTÉRREZ, J.M.; ESCALANTE, T.; RUCAVADO, A. Experimental

pathophysiology of systemic alterations induced by Bothrops asper snake venom.
Toxicon, 54: 976-987, 2009.
GUTIÉRREZ, J.M.; LOMONTE, B. Local tissue damage induced by Bothrops snake

venoms - A review. Memórias do Instituto Butantan, 51 (4): 211-223, 1989.
GUTIÉRREZ, J. M.; WILLIANS, D.; FAN, H.W.; WARRELL, D.A. Snakebite

envenoming from a global perspective: Towards an integrated approach. Toxicon, 56
(7): 1223-1235, 2010.
HEGDE, V. R.; PATEL, S.M.G.; BRYANT, R.; PAI, J.; DAS, P.R.; PUAR, M.S.
Phospholipase D inhibitors from a Myrsine species. Journal of Natural Products,
58(10): 1492-1497, 1995
HIROTA, M.; MIYAZAKI, S.; MINAKUCHI, T.; TAKAGI, T.; SHIBAYA, H.

Myrsinoic Acids B, C and F, Anti-inflammatory compounds from Myrsine seguinii.
Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 66(3): 655-659, 2002.
HUANG, D.J.; OU, B.; PRIOR, R.L. The Chemistry behind Antioxidant Capacity
Assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 1841-1856, 2005.
ISO 14502-1. INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION

(ISO). ISO 14502. Determination of substances characteristic of green and blck tea. Part
1: Content of total polyphenols in tea. Colorimetric method using Folin-Ciocalteu
reagente, 2005. Disponível em:
http://www.iso.org/iso/catalogue_detail.htm?csnumber=31357. Acesso em
novembro/2015
JEDINÁK, A.; MALIAR, T.; GRANCAI, D.; NAGY, M. Inhibition activities of natural
products on serine proteases. Phytoterapy Research, 20(3): 214-217, 2006.
JORGE, M. T. E RIBEIRO, L. A. Infections in the bite site after envenoming by snakes

of the Bothrops genus. Journal of Venomous Animals and Toxins, 3(2): 264-272,
1997.
KALEGARI, M. Composição Fitoquímica e Atividades Biológicas de Rourea induta

Planch, Connaraceae. Curitiba: UFPR, Dissertação de mestrado em Ciências
Farmacêuticas- Universidade Federal do Paraná, 2009.
KAMIGUTI, A.S.; CARDOSO, J.L.C.; THEAKSTON, R.D.G.; SANO-MARTINS,

I.S.; HUTTON, R.A.; RUGMAN, F.P. Coagulopathy and hemorrhage in human victims
of Bothrops jararaca envenoming in Brazil. Toxicon, 29(8): 961-72, 1991.
104
KASTURIRATNE, A.; WICKREMASINGUE, R.; SILVA, N.; GUNAWARDENA,
K.; PATHMESWARAN, A.; PREMARATHA, R.; SAVIOLI, L.; LALLOO, D.G.;
SILVA, J. The Global Burden of Snakebite: A Literature Analysis and Modelling Based
on Regional Estimates of Envenoming and Deaths. Plos Medicine, 5(11): 1591-1604,
2008.
KELECOM, A.; REIS, G.L.; FEVEREIRO, P.C.A.; SILVA, J.G.; SANTOS, M.G.;
NETO, C.B.M.; GONZALES, M.S.; GOUVEA, R.C.S.; ALMEIDA, G.S.S. A
multidisciplinary approach to the study of the fluminense vegetation. Anais da
academia brasileira de Ciências, 74(1): 171-181, 2002.
KINI, R.M. Excitement ahead: structure, function and mechanism of snake venom
phospholipase A2 enzymes. Toxicon, 42: 827–840, 2003.
KOH, D. C. I.; ARMUGAM, A.; JEYASEELAN, K. Snake venom components and

their applications in biomedicine. Cellular and Molecular Life Sciences, 63(24):
3030-3041, 2006.
LUNA, B. N.; DEFAVERI, A.C.A.; SATO, A.; BIZZO, H.R.; FERITAS, M.F.;
BARROS, C.F. Leaf secretory tissues in Myrsine coriacea and Myrsine
venosa (Primulaceae): ontogeny, morphology, and chemical composition of essential
oils. Botany, 92(10): 757-766, 2014.
LUNA, K.P.O.; DA SILVA, M.B.; PEREIRA, V.R.A. Clinical and immunological

aspects of envenomations by Bothrops snakes. The Journal of Venomous Animals
and Toxins including Tropical Diseases, 17(2): 130-141, 2011.
MABRY, T. J.; MARKHAM, K. R.; THOMAS, M. B. The Systematic Identification

of Flavonoids. New York: Springer, 1970.
MACEDO, J.M.; SOUZA, L.G.P; VALENZUELA, V.C.T.; OLIVEIRA, A.B.;

CASTILHO, R.O.; JÁCOME, R.L.R.P. Variação sazonal nos teores de flavonoides,
taninos e atividade antioxidante de Davilla rugosa Poir. Journal of Basic and Applied
Pharmaceutical Sciences, 34(4): 585-590, 2013.
MAGALHAES, A.; MAGALHÃES, A.; SANTOS, G.B.; VERDAM,

M.C.; FRAPORTI, L.; MALHEIRO, A.; LIMA, E.S.; DOS-SANTOS, M.C. Inhibition
of the inflammatory and coagulant action of Bothrops atrox venom by the plant species
Marsypianthes chamaedrys. Journal of Ethnopharmacology, 134(1): 82-88, 2011.
MAKABE, H.; MIYAZAKI, S.; KAMO, T.; HIROTA, M. Myrsinoic acid E, an anti-
inflammatory compound from Myrsine seguinii. Bioscience, Biotechnology, and
Biochemistry, 67(9): 2038-2041, 2003.
MANGURO, L.O.A.; MIDIWO, J.O.; KRAUS, W. Triterpenoids and steroids of

Myrsine africana leaves. Planta médica, 63: 290, 1997.
MARQUES, G.S.; MONTEIRO, R.P.M.; LEÃO, W.F.; LYRA, M.A.M.; PEIXOTO,

M.S.; ROLIM-NETO, P.J.; XAVIER, H.S.; SOARES, L.A.L. Avaliação de
procedimentos para quantificação espectrofotométrica de flavonoides totais em folhas
de Bauhinia forficata. Química Nova, 35(3): 517-522, 2012.
105
MEDEIROS, A.; BEROIS, N.; INCERTI, M.; BAY, S.; FRAGUAS, L.F.; OSINAGA,
E. A Tn antigen binding lectin from Myrsine coriacea displays toxicity in human cancer
cell lines. Journal of Natural Medicines, 67(2): 247-254, 2013.
MELO, R.S.; FARRAPO, N.M.; ROCHA-JUNIOR, D.S.; SILVA, M.G.; COGO, J.C.;
DAL BELO, C.A.; RODRIGUES-SIMIONI, L.; GROPPO, F.C.; OSHIMA-FRANCO,
Y. Antiophidian mechanisms of medicinal plants. In Flavonoids: Biosynthesis,
Biological Effects and Dietary Sources; Keller, R.B., Ed.; Nova Science: New York,
NY, USA, 2009; pp. 249-262.
MENDES, M. M.; VIEIRA, S.A.; GOMES, M.S.; PAULA, V.F.; ALCANTARA, T.M.;
HOMSI-BRANDEBURGO, M.I.; SANTOS,J.I.; FONTES, M.R.; RODRIGUES, V.M.
Triacontyl p-coumarate: An inhibitor of snake venom metalloproteinases.
Phytochemistry, 86: 72-82, 2013.
MILANI, R. JORGE, M.T.; CAMPOS, F.P.; MARTINS, F.P.; BOUSSO, A.;

CARDOSO, J.L.; RIBEIRO, L.A. FAN, H.W.; FRANÇA, F.O.; SANO-MARTINS,
I.S.; CARDOSO, D.; FERNADEZ, C; FERNADES, J.C.; ALDRED, V.L.;
SANDOVAL, M.P.; PUORTO, G.; THEAKSTON, R.D.; WARRELL, D.A. Snake
bites by the jararacucu (Bothrops jararacussu): Clinicopathological studies of 29
proven cases in Sao Paulo State, Brazil. Qjm-Monthly Journal of the Association of
Physicians, 90(5): 323-334, 1997.
MIZUSHINA, Y.; MIYAZAKI, S.; OHTA, K.; SAKAQUCHI, K. Novel anti-

inflammatory compounds from Myrsine seguinii, terpeno-benzoic acids, are inhibitors
of mammalian DNA polymerases. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects,
1475(1): 1-4, 2000.
MOLANDER, M.; SASLIS-LAGOUDAKIS, C.H.; JAGER, A.K.; RONSTED, N.

Cross-cultural comparison of medicinal floras used against snakebites. Journal of
Ethnopharmacology, 139(3): 863-872, 2012.
MORS, W. B.; NASCIMENTO, M.C.; PEREIRA, B.M.; PEREIRA, N.A. Plant natural
products active against snake bite - the molecular approach. Phytochemistry, 55(6):
627-642, 2000.
MOSA, R.A.; LAZARUS, G.G.; GWALA, P.E.; OYEDEJI, A.O.; OPOKU, A.R. In
vitro anti-platelet aggregation, antioxidant and cytotoxic activity of extracts of some
zulu medicinal plants. Journal of Natural Products, 4: 136-146, 2011.
MOURA-DA-SILVA, A.M.; BUTERA, D.; TANJONI, I. Importance of snake venom

metalloproteinases in cell biology: effects on platelets, inflammatory and endothelial
cells. Current Pharmaceutical Design, 13: 2893-2905, 2007.
NAZATO, V.S.; MAURO, L.R.; VIEIRA, N.A.G.; JUNIOR, D.S.R.; SILVA, M.G.;
LOPES, S.P.; DAL-BELO, C.A.; COGO, J.C.; SANTOS, M.G.; HOFLING M.A.C.;
FRANCO, Y.O. In vitro antiophidian properties of Dipteryx alata vogel bark extracts.
Molecules, 15: 5956-5970, 2010.
NIDAVANI, R.B.; MAHALAKSHMI, A.M.; SHALAWADI, M. Vascular permeability

and Evans blue dye: a physiological and pharmacological approach. Journal of
Applied Pharmaceutical Science, 4 (11): 106-113, 2014.
106
NOGUEIRA, R.M.B.; ANDRADE, S.F. Manual de toxicologia veterinária. Rio de
Janeiro: Roca, 2011.
NORONHA, J.P.C. Metabólitos secundários do fruto de Arbutus unedo L. (Medronho).

– Tese de Doutorado. Instituto de Química, Universidade Nova de Lisboa, 2001.
NUNEZ, V.; OTERO, R.; BARONA, J.; SALDARRIAGA, M.; OSORIO, R.G.;
FONNEGRA, R.; JIMENEZ, S.L.; DIAZ, A.; QUINTANA, J.C. Neutralization of the
edema-forming, defibrinating and coagulant effects of Bothrops asper venom by
extracts of plants used by healers in Colombia. Brazilian Journal of Medical and
Biological Research, 37(7): 969-977, 2004.
OKOLI, C.O.; AKAH, P.A.; ONUOHA, N.J.; OKOYE, T.C.; NWORU, C.S. Acanthus
montanus: An experimental evaluation of the antimicrobial, anti-inflammatory and
immunological properties of a traditional remedy for furuncles. BMC Complementary
and Alternative Medicine, 8: 27, 2008
OLIVEIRA, A.C.; VALENTIM, I.B.; GOULART, M.O.F.; SILVA, C.A.; BECHARA,

E.J.H.; TREVISAN, M.T.S. Fontes vegetais naturais de antioxidantes. Química Nova,
32(3): 689-702, 2009.
OLIVEIRA, A.P. Metabólitos secundários e atividades antibacteriana e

anticolinesterásica de Sideroxylon obtusifolium (Roem. & Schult.) TD Penn
(SAPOTACEA). – Tese de Doutorado. Núcleo de Pesquisa de Produtos Naturais,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2011.
OLIVEIRA, A.P.; CRUZ, R.A.S.; BOTAS, G.S.; GONZALES, M.G.; SANTOS, M.G.;
TEIXEIRA, L.A.; ROCHA, L. Chemical and biological investigations of Pilocarpus
spicatus essential oils. Blacpma, 9(3): 206–211, 2010.
OLIVEIRA, E.C.; FERNANDES, C.P.; SANCHEZ, E.F.; ROCHA, L.; FULY, A.L.
Inhibitory effect of plant Manilkara subsericea against biological activities of Lachesis
muta snake venom. BioMed Research International, 2014, Article ID 408068, 2014.
OTERO, R.; NUNEZ, V.; JIMENEZ, S.L.; FONNEGRA, R.; OSORIO, R.G.;
GARCIA, M.E.; DIAZ. Snakebites and ethnobotany in the northwest region of
Colombia Part II: Neutralization of lethal and enzymatic effects of Bothrops atrox
venom. Journal of Ethnopharmacology, 71: 505–511, 2000.
PAINE, M.J.; DESMOND, H.P.; THEAKSTON, R.D.; CHAMPTON, J.M.

Purification, cloning, and molecular characterization of a high molecular weight
hemorrhagic metalloprotease, jararhagin, from Bothrops jararaca venom. Insights into
the disintegrin gene Family. The journal of biological chemistry, 267(32): 22869-22876,
1992.
PATINO, A. C.; BENJUMEA, D. M.; PEREANEZ, J. A. Inhibition of venom serine

proteinase and metalloproteinase activities by Renealmia alpinia (Zingiberaceae)
extracts: Comparison of wild and in vitro propagated plants. Journal of
Ethnopharmacology, 149(2): 590-596, 2013.
107
PEREIRA, N.P.; MIGUEL O.G.; MIGUEL, M.D. Composição química do óleo fixo
obtido dos frutos secos da [Chamomilla recutita (L.) Rauschert] produzida no
município de Mandirituba, PR. Revista Brasileira de Farmacognosia, 15(4): 334-337,
2005.
PEREIRA, I.C.; BARBOSA, A.M.; SALVADOR, M.J.; SOARES, A.M.; RIBEIRO,

W.; COGO, J.C.; ZAMUNER, S.R. Anti-inflammatory activity of Blutaparon
portulacoides ethanolic extract against the inflammatory reaction induced by Bothrops
jararacussu venom and isolated myotoxins BTHTX-I and II. Journal of Venomous
Animals and Toxins including Tropical Diseases, 15 (3): 527-545, 2009.
PETRICEVICH, V.L.; TEIXEIRA, C.F.P.; TAMBOURGI, D.V.; GUTIERREZ, J.M.

Increments in serum cytokine and nitric oxide levels in mice injected with Bothrops
asper and Bothrops jararaca snake venoms. Toxicon, 38: 1253-1266, 2000.
PINHO, F.M.O.; PEREIRA, I.D. Ofidismo. Revista da Associação Médica Brasileira,

47(1): 24-29, 2001.
PORTER, Q. N.; BALDAS, J. Mass Spectrometry of Heterocyclic Compounds.

Wiley-Interscience: Nova Iorque, 1971, p. 99.
PRAKASH, C.V.S.; PRAKASH, I. Isolation and structural characterization of lupane

triterpenes from Polypodium vulgare. Research Journal of Pharmaceutical Sciences,
1(1): 23-27, 2012.
PRASAIN, J.K.; BARNES, S. Metabolism and Bioavailability of Flavonoids in

Chemoprevention: Current Analytical Strategies and Future Prospectus. Molecular
pharmaceutics, 4(6): 846-64, 2007.
PRASAIN, J.K.;WANG, C.C.; BARNES, S. Mass spectrometric methods for the

determination of flavonoids in biological samples. Free Radical Biology & Medicine,
37(9): 1324-1350, 2004.
QUEIROZ, E. P.; CARDOSO, D. B. O. S.; FERREIRA, M. H. D. S. Composição

florística da vegetação de restinga da APA Rio Capivara, Litoral Norte da Bahia,
Brasil. Sitientibus série Ciências Biológicas, 12(1): 119-141, 2012.
REIS, F.P.; BONFA, I.M.S.; CAVALCANTE, R.B.; OKOBA, D.; VASCONCELOS,

S.B.S.; CANDELORO, L.; FILIU, W.F.O.; MONREAL, A.C.D.; SILVA, V.J.; RITA,
P.H.S.; CAROLLO, C.A.; KADRI, M.C.T. Tabebuiaaurea decreases inflammatory,
myotoxic and hemorrhagic activities induced by the venom of Bothrops neuwiedi.
Journal of Ethnopharmacology, 158: 352–357, 2014.
RUPPELT, B.M.; GONÇALVES, L.C; PEREIRA, N.A. Abordagem farmacológica de

plantas recomendadas pela medicina folclórica como antiofídicas. II Bloqueio da
atividade da permeabilidade capilar e na letalidade do veneno de jararaca (Bothrops
jararaca). Revista Brasileira de Farmácia, 71(3): 57-58, 1990.
RUPPELT, B.M.; PEREIRA, E.F.R.; GONÇALVES, L.C.; PEREIRA, N.A.

Pharmacological screening of plants recommended by folk medicine as anti-snake
108
venom: I. Analgesic and anti-inflammatory activities. Memórias do Instituto Oswaldo
Cruz, 86 (2): 203-205, 1991.
SAMY, R. P.; THWIN, M.M.; GOPALAKRISHNAKONE, P.; IGNACIMUTHU, S.

Ethnobotanical survey of folk plants for the treatment of snakebites in Southern part of
Tamilnadu, India. Journal of Ethnopharmacology, 115(2): 302-312, 2008.
SANTHOSH, M.S.; HEMSHEKHAR, M.; SUNITHA, K.; THUSHARA, R.M.;

JNANESHWARI, S.; KEMPARAJU, K.; GIRISH, K.S. Snake Venom Induced Local
Toxicities: Plant Secondary Metabolites as na Auxiliary Therapy. Mini-Reviews in
Medicinal Chemistry, 13: 106-123, 2013.
SANTOS, J.D.G.; VIEIRA, I.J.C.; BRAZ-FILHO, R.; BRANCO, A. Chemicals from

Agave sisalana Biomass: Isolation and Identification. International Journal of
Molecular Sciences, 16: 8761-8771, 2015.
SANTOS, M. G.; FEVEREIRO, P.C.A.; REIS, G.L.; BARCELOS, J.I. Recursos

vegetais da Restinga de Carapebus, Rio de Janeiro, Brasil. Revista Biologia
Neotropical, 6(1): 35-54, 2009.
SANTOS, P. M.; PROVAZI, M.; DE SOUZA, G. B. Determinação de atividade de

proteases em Panicum maximum cv. Tanzânia. Embrapa,. Comunicado técnico 62: 1-
5, 2005.
SARDANS, J.; LLUSIA, J.; NIINEMETS, U.; OWEN, S.; PENUELAS, J. Foliar
Mono- and Sesquiterpene Contents in Relation to Leaf Economic Spectrum in Native
and Alien Species in Oahu (Hawai’i). Journal of Chemical Ecology, 36: 210-226,
2010.
SCHERER, R.; GODOY, H.T. Antioxidant activity index (AAI) by the 2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl method. Food Chemistry, 112: 654–658, 2009.
SENATORE, F.; OLIVIEIRO, F.; SCANDOLERA, E.; TAGLIALATELA-SAFATI,

O.; ROSCIGNO, G.; ZACCARSELLI, M.; DE FALCO, E. Chemical composition,
antimicrobial and antioxidant activities of anethole-rich oil from leaves of selected
varieties of fennel [Foeniculum vulgare Mill. ssp. vulgare var. azoricum (Mill.)
Thell] Fitoterapia, 90: 214-219, 2013.
SILVA, T.M.S.; CARVALHO, M.G.; BRAZ-FILHO, R. Estudo espectroscópico em

elucidação estrutural de flavonoides de Solanum jabrense AGRA & NEE e S.
paludosum MORIC. Química Nova, 32(5): 1119-1128, 2009.
SINAN. Acidentes por animais peçonhentos-Notificações registradas no Sistema de

Informação de Agravos de Notificação-Sinan Net., sem data. Disponível em:
http://tabnet.datasus.gov.br/cgi/deftohtm.exe?sinannet/cnv/animaisbr.def. Acessado em: 15
de outubro de 2016.
SIQUEIRA, D.S.; PEREIRA, A.S.; NETO, F.R.A. Determinação de compostos de

massa molecular alta em folhas de plantas da amazônia. Química Nova, 26(5): 633-
640, 2003.
109
SOARES, A. M.; MARCUSSI, S. LOURENÇO, M.V.; JANUARIO, A.H.; SAMPAIO,
S.V.; GIGLIO, J.R.; LOMONTE, B.; PEREIRA, P.S. Medicinal plants with inhibitory
properties against snake venoms. Current Medicinal Chemistry, 12 (22): 2625-2641,
2005.
SOUSA, S.A. Desenvolvimento e validação de método analítico por cromatografia

líquida de alta eficiência e dissolução para avaliação da qualidade de fitoterápicos
contendo Paullina cupana Kunth. – Dissertação de Mestrado. Faculdade de Farmácia,
Universidade Federal de Goiás, 2009.
STRAUCH, M.A.; TOMAZ, M.A.; MACHADO, M.M.; RICARDO, H.D.; CONS,

B.L.; FERMAMDES, F.F.A.; EL-KIK, C.Z.; AZEVEDO, M.S.; MELO, P.A.
Antiophidic activity of the extract of the Amazon plant Humirianthera ampla and
constituents. Journal of Ethnopharmacology, 145: 50–58, 2013.
TEIXEIRA, C.C.C.; CABRAL, T.P.F.; SOUSA, J.P.B.; TEIXEIRA, S.P.; BASTOS,

J.K.; FREITAS, L.A.P. Study of quality assurance for Peumus boldus m products by
botanic profiling, extraction optimization, HPLC quantification and antioxidant assay.
Pharmacognosy Journal, 8(3): 264-272, 2016.
TEIXEIRA, C.F.P.; FERNANDES, C.M.; ZULIANI, J.P.; ZAMUNER, S.F.

Inflammatory effects of snake venom metalloproteinases. Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz, 100(1): 181-184, 2005.
THE PLANT LIST. Primulaceae. Sem data Disponível em:<

http://www.theplantlist.org/browse/A/Primulaceae/>. Acesso em: 7 de outubro de 2014.
TIETBOHL , L. A. C.; LIMA, B.G.; FERNANDES, C.P.; SANTOS, M.G.; SILVA,

F.E.B.; DENARDIN, E.L.G.; BACHINSKI, R.; ALVES, G.G.; SILVA, F.M.V.;
ROCHA, L. Comparative Study and Anticholinesterasic Evaluation of Essential Oils
from Leaves, Stems and Flowers of Myrciaria floribunda (H.West ex Willd.) O. Berg.
Latin American Journal of Pharmacy, 31(4): 637-641, 2012.
TREBIEN, H.A., CALIXTO, J.B. Pharmacological evaluation of rat paw edema

induced by Bothrops jararaca venom. Agents Actions, 26: 292-300, 1989.
VÁSQUES, J.; ALARCÓN, J.C.; JIMENEZ, S.L.; JARAMILLI, G.I.; GOMES-

BETANCUR, I.C.; REY-SUAREZ, J.P.; JARAMILLO, K.M.; MUNOZ, D.C.;
MARIN, D.M.; ROMERO, J.O. Main plants used in traditional medicine for the
treatment of snake bites in the regions of the department of Antioquia, Colombia.
Journal of Ethnopharmacology, 170, 158-166: 2015.
VENKATESAN, C.; SARATHI, M; BALASUBRAMANIAN, G.; THOMAS, J.;

BALACHANDER, V.; BABU, V.S.; BIALS, S.M.Y.; MAJEED, S.A.; MADAN, N.;
RAJI, N.S.; VIMAL, S.; NAMBI, K.S.N.; HAMEED, A.S.S. Antivenom activity of
triterpenoid (C34H68O2) from Leucas aspera Linn. against Naja naja naja venom
induced toxicity: Antioxidant and histological study in mice. Human & Experimental
Toxicology, 33(4): 336-59, 2014.
WAGNER, H.; BLADT, S. Plant Drug Analysis: a thin layer chromatography

Atlas. 2. New York: Springer, 1995.
110
WANDERLEY, C.W.S.; SILVA, C.M.S.; WONG, D.V.T.; XIMENES, R.M.;
MORELO, D.F.C.; COSKER, F.; ARAGAO, K.S.; FERNANDES, C.; PALHETA-
JUNIOR, R.C.; HAVT, A.; BRITO, G.A.C.; CUNHA, F.Q.; RIBEIRO, R.A.; LIMA-
JUNIOR, R.C.P. Bothrops jararacussu snake venom-induces a local inflammatory
response in a prostanoid- and neutrophil-dependent manner. Toxicon, 90: 134-147,
2014.
WARRELL, D. A. Snake bite. Lancet, 375(9): 640, 2010.
WEN, F. H.; FRANÇA, F. O. S.; CARDOSO, J. L. C. Animais peçonhentos no

Brasil: biologia clínica e terapêutica. São Paulo: Sarvier, 2009.
WHITE, J. Snake venoms and coagulopathy.Toxicon, 45(8): 951-67, 2005.
YANG, W.S.; JEONG, D.; YI, Y.; LEE, B.; KIM, T.W.; YOON, K.D.; HONG, S.;
LEE, W.; CHO, J.Y. Myrsine seguinii ethanolic extract and its active component
quercetin inhibit macrophage activation and peritonitis induced by LPS by targeting to
Syk/Src/IRAK-1. Journal of Ethnopharmacology, 151: 1165–1174, 2014.
ZANON, R.B.; PEREIRA, D.F.; BOSCHETTI, T.K.; SANTOS, M.; ATHAYDE, M.L.
Fitocosntituintes isolados da fração em diclorometano das folhas de Vernonia
tweediana Baker. Revista Brasileira de Farmacognosia, 18(2): 226-229, 2008.
ZHONG, X. N.; OTSUKA, H.; IDE, T.; HIRATA, E.; TAKUSHI, A.; TAKEDA, Y.
Three flavonol glycosides from leaves of Myrsine seguinii. Phytochemistry, 46(5):
943-946, 1997.
ZOU, Y. P.; TAN, C. H.; ZHU, D. Y. A New Acetylated Flavonoid Glycoside from
Myrsine africana L. Bulletin of Korean Chemical Society, 30(9): 2111-2113, 2009.
ZUANAZZI, J.A.S.; MONTANHA, J.A. Flavonoides In, SIMÕES, C.M.O.;

SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK,
P.R. Farmacologia: da planta ao medicamento. 5th ed. Porto Alegre: UFRGS; 2004.
p.577-614.
111

Arthur Luiz Corrêa Tese Doutorado

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

ARTHUR LUIZ CORRÊA

ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE NEUTRALIZANTE

ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE

Tese de doutorado apresentada ao

Orientadores: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha

Estudo fitoquímico e avaliação da capacidade neutralizante de Myrsine

Tese (Doutorado) – Universidade Federal Fluminense, Faculdade de

1. Myrsine parvifolia. 2. Planta Medicinal. 3. Produção Intelectual. I.

 A Deus, por estar sempre presente em minha vida, guiando-me e iluminando

Palavras-chave: Myrsine parvifolia. Bothrops jararaca. Bothrops jararacussu. Planta

RESUMO ................................................................................................................... vii

Figura 1: Estimativa de morbidade e mortalidade anual decorrentes de acidentes

AA: Atividade Antioxidante

AlCl3: cloreto de alumínio

ANOVA: análise de variância

APT: Attached Proton Test

AUC: área sob a curva, do inglês Area Under Curve

BaP1: metaloprotease da classe P-I isolada do veneno de Bothrops asper

BUT: fração em butanol

CCD: Cromatografia em Camada Delgada

CD3OD: metanol deuterado

CE: Concentração Efetiva

CEUA: Comissão de Ética no Uso de Animais

CG: Cromatografia em fase Gasosa

CLAE: Cromatografia em fase Líquida de Alta Eficiência

CLUE: Cromatografia em fase Líquida de Ultra Eficiência

CONCEA: Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal

COSY: Espectroscopia de correlação homonuclear (1H-1H)

DAD: Detector de Arranjo de Diodo

dd: duplo dupleto

DIC: Detector de Ionização em Chama

DICLOF: Diclofenaco de sódio

DL: Dose Letal

EAG: Equivalente de Ácido Gálico

EBA: Extrato Bruto Aquoso

EBH: Extrato Bruto Hidroetanólico

EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético

EM: Espectrometria de Massas

EQ: Equivalente de Quercetina

eV: elétron volt

Fiocruz: Fundação Oswaldo Cruz

FUNED: Fundação Ezequiel Dias

HEX: fração em hexano

HSQC: espectroscopia de correlação heteronuclear quantum simples

HT: toxina hemorrágica (do inglês: Hemorragic Toxin)

IAA: Índice de Atividade Antioxidante

IBAMA: Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis

IC50: concentração inibitória de 50% do efeito

IES: ionização por eletrospray

IFN-Ƴ: interferon gama

iNOS: óxido nítrico sintase

IR: Índice de Retenção

IVB: Instituto Vital Brazil

m/z : relação massa carga

MM: Massa Molecular

NIST: National Institute of Standard and Technology

NP/PEG: éster de difenil boriloxietilamina- polietilenoglicol, (do inglês: Natural

OMS: Organização Mundial de Saúde

PA: Pureza Analítica

PBJ: peçonha de B. jararaca

ppm: partes por milhão

R2: coeficiente de correlação

RDA: retro Diels-Alder