requisito à obtenção de nota parcial na disciplina de microbiologia ambiental do curso de engenharia ambiental, da coordenação de engenharia ambiental da universidade tecnologica federal do paraná - campus campo mourão Professora: Fernanda Peres Ramos
Campo mourão 2021
2 INTRODUÇÃO A microbiologia como conhecemos nos dias atuais só foi possível quando no ano de 1674 o alemão Antony Van Leeuwenhoek criou o primeiro microscópio. A partir disso ele usou esse equipamento
3 OBJETIVO As aulas práticas de microbiologia tem como o objetivo ensinar ao acadêmico os princípios gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia.
4 PRÁTICAS LABORATORIAIS
4.1 Prática 1- Normas de laboratório e identificação de vidrarias.
As aulas práticas de Microbiologia têm como objetivo ensinar ao acadêmico os princípios gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia, nas aulas são utilizadas bactérias, sendo algumas patogênicas para o homem, portanto nessa prática é apresentadas normas para evitar contaminação. Também são apresentadas instruções de uso de equipamentos, bem como a funcionalidade de cada um.
Vale ressaltar o conhecimento do nome e funcionalidade de cada instrumento, vidraria e
material do laboratório. Exemplo os materiais permanentes.
Autoclave, estufas de esterilização, refrigerador, estufa bacteriológica, cabine de fluxo laminar,
banho-maria. Também vale lembrar o nome e a função de cada vidraria, pois nelas são feitas medições, criadas as culturas de microrganismos, também são feitas as diluições, e outros tipos de manipulações.
Outro fator importante é as técnicas de assepsia dos materiais e equipamentos que tiveram algum tipo de contato com o meio de cultura. O bico de Bunsen é muito importante no laboratório bem como o conhecimento do uso, o ajuste do anel é um detalhe importantíssimo para evitar acidente no laboratório, importância saber também sobre as 3 faixas de chama que ele produz, e sua importância na esterilização.
4.2-Preparação de vidrarias: autoclavagem e acondicionamento
Muitos laboratórios não possuem condições de utilizar material descartável em seus
processos, portanto para o reuso das vidrarias é necessário ser feita a esterilização.
É importante que o material a ser utilizado no processo seja feito de boro silicato pra que não haja problema com o material quando for submetido a altas temperaturas. Os materiais placas de petri e tubos de rosca devem ser em embrulhados juntos em um papel kraft para ser colocado na autoclave, já as pipetas de vidro exigem mais cuidado, ela é embalada individualmente em uma folha kraft e posta um algodão dentro depois vai parar no autoclave.
Material contaminado->autoclavado->lavado->montado para autoclavação.
Um ponto importante é que depois que embrulhado o material deve ser identificado a lápis.
A autoclave é um aparelho usado em laboratório para a esterilização de materiais, meios de
cultura e microrganismos patogênicos. A esterilização é o processo que inativa todos os microrganismos presentes em um material ou ambiente, a melhor maneira de destruir é mediante ao calor, podemos usar equipamentos a seco ou úmido, sendo que o desempenho do calor úmido é melhor.
4.3 e 4.4- Microscópio ótico e Técnica de coloração de gram
A técnica de coloração de gram foi descrita em 1884 por Hans Christian Gram, a coloração gram facilita a visualização das baterias pelo microscópio de luz, auxiliando na identificação das bactérias em Gram positivo ou negativa. Isso ocorre, pois, a estrutura de parede celular desses dois grupos de bactérias é diferentes. Para a prática foram usados os itens:
Placa de pétri, bactérias não patogênicas, bico de Bunsen, piceta c/água, alça de platina, microscópio, corante violeta, solução de lugol, solução álcool/acetona, Safranina, lâmina, solução salina, solução de cloreto de sódio. A metodologia sobre o teste de gram é explicada no vídeo da disponibilizado pela UEL no youtube.
Metodologia: 1- Flambe a alça de platina no bico de Bunsen depois coloque uma gota de salina na superfície de uma lâmina de vidro, flambe novamente a alça de platina e espera esfriar. 2-Abra à placa de petri e retire a colônia separando, coloque na lâmina e deixe descansar em temperatura ambiente, depois passe a lâmina pelo fogo rapidamente. 3- Cubra com corante violeta 1min, escorra o corante, cubra a lâmina com lugol e deixe por 1 min, lave a lâmina com água, sem despejar diretamente, discorra com álcool/acetona, lave c água, cubra com Safranina 30s, lave a lâmina, retire o excesso, deixe secar. 4- Depois use o microscópio para visualizar. 5- Descarte adequado.
4.5- Preparação de meios de cultura
4.6- Técnicas de semeadura
Em laboratório conseguimos replicar meios de cultura como exemplo as bactérias e fungos, para eles se desenvolverem é preciso dar os nutrientes para esses microrganismos se replicarem, além de nutrientes ele precisa de umidade, temperatura adequada e outras condições. Hoje temos diversas substancias químicas para o cultivo no laboratório, os meios de cultura final podem ser sólidos ou líquidos A substancia importante para a solidificação do meio é o agar-agar, no processo de autoclavagem a 100 graus ele gelatiniza e no resfriamento ele solidifica o meio de cultura.
Os meios de cultura solido no qual usamos o agar agar, usamos a placa de petri, que garante um ambiente controlado, isolado do meio externo. Dificultando a contaminação. Para meios de cultura liquido, que não há adição de ágar, o cultivo é feito em tubos de vidro com rosca.
Detalhe importante é fechar a rosca da vidraria parcialmente, pois na autoclavagem pode dar problema de diferença de pressão e explodir. É apresentado diferentes solventes para o meio de cultura, mistura essa que pode favorecer um tipo de cultura, ou que não restringe nenhuma.
As bacterias se desenvolvem a ambientes com pH em torno de 7 e não suportam ambientes
com alta acidez, por exemplo pH abaixo de 4, elas não conseguem se desenvolver. Já os fungos e leveduras suportam altos graus de acidez.
Muitos meios de cultura têm diversos reagentes diferentes, como sacarose e extrato de malte.
Pesagem do meio de cultura, em gramas, adicione os meios de cultura em um Becker em cima
da balança. Use a colher e bata com o dedo para ter um ajuste fino. No vídeo ele dissolveu o meio em 500 ml de água destilada depois agitou a mistura com um aparelho magnético. Depois disso o vidro é levado para ser autoclavado, após o processo o agar vai fundir e depois que resfria abaixo de 50 graus ele solidifica (aspecto gelatinoso).
Depois disso o meio de cultura está pronto para ser inoculado os microrganismos, usando uma alça de platina ou um cotonete esterilizado para isso.
As técnicas de semeadura apresentadas são 5, dentro dessas técnicas há sub categorias, ou
seja, diferentes jeitos de se replicar a técnica. Esgotamento, Suabe, repicagem meio líquido usando alça, tubo inclinado, replicarem profunda em semi solido. 4.7- Diluição em serie Em microbiologia é usada para diminuir a população bacteriana, o objetivo é atingir uma concentração apropriada para a realização de testes quantitativas afim de possibilitar uma leitura adequada. Essa etapa faz parte da rotina dos laboratórios. As diluições são feitas de acordo com a demanda e necessidade para determinado experimento, porque a maioria dos laboratórios possuem as soluções armazenadas em uma concentração mais alta, seja por conveniência ou para evitar a contaminação. A técnica é util quando há escassez do volume do concentrado ou do diluente, havendo a necessidade de minimizar seu uso, ou quando há necessidade de diversas diluições, por exemplo, na contagem de microrganismos.
Para termos 1 ml de solução, adicionaremos 0,1ml do concentrado mais 0,9 ml do diluente,
assim criamos com precisão soluções extremamente diluídas, que exigem uma curva de concentração com uma escala exponencial ou logarítmica.
4.8- Averiguação de microrganismos no ambiente.
No vídeo foi coletado a amostra ambiental, e foi feito o espalhamento da cultura no meio solido de agar-agar, e foi feito a identificação de cada placa. O meio de cultura foi o agar, o PCA no qual privilegia o desenvolvimento de bactérias, mas os fungos também poderão se desenvolver no meio. Corrimão da porta do bar : diferença entre fungos e bactérias. Aspecto dos fungos: esponjoso bactérias: colônias menores de diferentes cores. As placas mais contaminadas foram:
dos bebedouros: muitas bactérias.
Mãos antes da assepsia da nelly. Orelhão público: alta contaminação de fungos.
4.9- Observação dos fungos
Visualização de bolor ao microscópio.
Materiais necessários: Berinjela em decomposição Uma lâmina, uma lamínula, espátula. Montagem:
Uma pequena fração da amostra do bolor, coloca em cima da lâmina, espalhar bem a amostra para que fique mais fina possível, adicionamos uma gota de água e homogeneizamos. Abaixamos a lamínulas devagar sobre a amostra para evitar bolhas. No aumento de 100x objetiva de 10 já notamos as hifas do bolor, no aumento de 40x podemos notar com detalhe as hifas do bolor, conjunto de hifas formando o micélio.
4.10- Agentes físicos e químicos
Os métodos físicos no controle do crescimento microbiano pode ser 3 tipos: 1)Temperatura: Seco (fornos e estufas, flambagem) e úmido (autoclave e água a 100 graus célsius) Frio (não extermina, apenas deixa o esporo adormecido)
2)Radiação Gama (empregado para materiais descartáveis e material cirúrgico termolábil) e o U.V(muito usado em salas de cirurgia)
3)Filtração (empregado para esterilizar materiais termolábeis como soro, enzimas, etc.
Método químico: usados para controlar o crescimento de microrganismos em tecidos e os
objetos inanimados(desinfetantes).
Fenóis e compostos fenóliticos, Iodo e Cloro, Alcoois, metais pesados, detergentes.
