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Produção de Antibióticos

 Produtos do metabolismo secundário


 Inibem processo de crescimento de
outros

 Importância Económica
 2000 toneladas/ano
 600 milhões de € (preço corrente a granel)
Apontamento Histórico
 1929 – descoberta da Penicilina
 1961 – 513 antibióticos
 Actualmente – cerca de 8000
 Líquenes, algas, animais, plantas
(+3000 substâncias com actividade antibiótica)
 123 são produzidos por fermentação
 + 50 são produzidos como compostos semi
sintéticos
 3 são completamente sintéticos (cloranfenicol)
Porque razão ocorre a
produção destas substâncias?
 Significado ecológico?

 Papel regulador durante a


diferenciação?

(funcionando como agentes inibidores temporários)


Grupos microbianos que
produzem antibióticos
Grupo taxonómico Nº de antibióticos

Bactérias diferentes 950


Ex: Bacillus sp. de Actinomicetas

Streptomyces Actinomicetas 4600

Fungos 1600
Classificação de antibióticos
 Segundo:
- espectro antimicrobiano
- mecanismos de acção
- estirpe produtora
- forma de biossintese
- estrutura química
Classificação de acordo com
estrutura química
Contém carbohidratos Estreptomicina
Lactonas macrocíclicas Eritromicina
Quinonas Tetraciclina
a.a. e peptidos Penicilina
Heterociclicos com azoto Polioxinas
Heterociclicos com oxigénio Monensina
Derivados aliciclícos Ciclohexamide
Aromáticos Cloranfenicol
Alifáticos Fosfomicina
Aplicações:
 Agentes terapêuticos
 Antitumorais (citoestáticos)
 Contra doenças das plantas
 Preservantes de alimentos (ex:nisina contra
os clostridios)
 Estimulantes do crescimento animal
 Ferramentas na bioquímica e biologia
molecular
Antibioticos β-lactâmicos
 Penicilina
 Descrita por Fleming 1929

 Estudos em 1940

 Aplicação clínica 1941

 Produzida por fungos (Penicillium, Aspergillus)


Antibioticos β-lactâmicos
 Lábeis em meio ácido

 Inactivados pela hidrólise do anel β-


lactâmico com penicilinase

 Baixa toxicidade

 Só 0,5 -2% dos pacientes desenvolve alergia

 Inibidores específicos da sintese de parede celular


bacteriana (peptidoglucano)
Estrutura Química

N
RCO 1 CH3
6 5 s
N
2
N CH3
O 4 3
COO-]Na+,K+

Anel Anel tiazolidinico


Radical β-lactamico
acile
Acido 6-aminopenicilânico (6-APA)
 Se na fermentação não se adicionar
precursores (os ácidos) da cadeia
lateral  Penicilinas naturais

 Destes só a benzilpenicilina é útil


terapeuticamente. As outras devem ser
removidas durante a etapa de
recuperação do produto
Processo comercial
 Penicilina G actua contra Gram +
Streptococcus pyogenes, Bacillus
anthracis, Treponema pallidum

 Penicilina V menos activa


Penicilinas semi sintéticas
 > estabilidade
 > resistência à β-lactamase
 > actividade antimicrobiana
Biossintese e regulação
 L- cisteína
β-lactamico-tiazolidinico
 L- valina

A sintese de Penicilina é afectada pela


[fosfato] e sofre repressão catabólica
por glucose
Biossintese e regulação
 L- cisteína Condensação
 L- valina num tripéptido
δ- (L- α- aminoadipil)cisteinilvalina
 Ácido α-aminoadípico

O tripéptido é ciclizado e forma-se a isopenicilina-N


primeiro composto com actividade microbiana
Desenvolvimento de Estirpes
Objectivos: rendimento
 Eficiência na recuperação do produto

 Original – P. notatum
 1943 – P. chrysogenum NRRL 1951
 Por mutagenese – estirpe WisQ176

Linha de culturas Wisconsin


(adoptada pela maior parte dos fabricantes)
 Screening de mutantes
Até anos 60
 Agentes mutagénicos Raios x
Radiações de λ curto

+ recentemente
Nitritos
Agentes alquilantes
 Utilização da tecnologia do DNA
recombinante
Método de Produção
 Método aeróbio com velocidade de absorção
volumétrica de Oxigénio de 0,4-0,8 mM/L.min

 Faixa de temperatura 25-27ºC

 Reactores agitados, com arejamento


operados em “Fed-batch”(alimentação
continua de várias substâncias a uma
fermentação descontinua)
Vantagens da operação “Fed-
Batch”
 Condições de fermentação em estado
quase estacionário

 Cultura em estado viável


 1) operar o fermentador evitando
repressão catabólica
 2) operar abaixo dos níveis de
inibição/toxicidade por substâncias
essenciais à biossintese (fonte de N e
precursor)
 3)  duração da fase de crescimento
 4) Prolongar a duração da fermentação
(manter biomassa viável + tempo)
 5) Operar a [biomassa] elevada e
constante
 6) Repor água evaporada com o
arejamento da cultura
Inóculo Fase de crescimento Fase real de produção
40h De Penicilina
Td=6 h

Esporos liofilizados Alimentando o meio


(óptimo 5x103/ml) com diferentes
Formação de agregados componentes
“pellets” A fase de produção
pode
Estender-se até
120-160h
Produção de Penicilina
Produção de Penicilina
 Meio de cultivo típico –
Melaço
Gorduras animais Fonte de azoto
Água de milho
Farinha de soja
Extracto de levedura Fonte de azoto adicional
Soro de leite
Lactose Fonte de carbono
 Vários tampões
 pH constante = 6,5
 Ác. fenil-acético é adicionado como
precursor (Penicilina G)
 Ác. fenoxi-acético e adicionado como
precursor (Penicilina V)
 Fermentação continua  problemas
devido à instabilidade das estirpes

 Enzimas imobilizadas  para produção


das penicilinas semi sintéticas.

 Método enzimático melhor que o


químico + barato, - poluente.
Isolamento da Penicilina do
caldo fermentado
Extracção

Caldo fermentado 1
Arrefecido abaixo de 10ºC

+ 0,5-1% de formol
2
Inactivação dos microrganismos
Prevenção da degradação por
β-lactamases

Obtenção de solvente rico


do qual se 3
Extrai o antibiótico
1 - Filtro rotativo
(extractor continuo)
 O caldo é filtrado, o filtrado é lavado,
 a extracção faz-se com solventes
imiscíveis (acetato de butilo)
 Extracção feita em contracorrente
 Extractores contínuos de vários andares
2- Extractor Decantador
 Extracção directa do caldo fermentado
para o solvente (acetato de butilo)

 Como há turvação é necessário um


clarificador (tipo separador liquido-
liquido)
3- Combinação sistema de
membranas com extractor
continuo
 É o mais usado
Cristalização
 O acetato de butilo é descorado com carvão
activado  (removido por filtração)
 Adiciona-se bicarbonato de potássio
 Formação de 2 fases (orgânica e aquosa)
 Adição de butanol à fase aquosa
 Destilação
 Os cristais de Penicilina potássica retidos no
evaporador-cristalizador seguem uma via de
filtração, lavagem e secagem.
Produção de Estreptomicina