Protocolo de Imunohistoquímica

A técnica trata-se da detecção de uma proteína especifica em um corte histológico

através de uma reação antígeno-anticorpo que resulta na marcação dessa proteína
pesquisada com um cromógeno. Na prática, a imunohistoquímica é usada para a
detecção de marcadores tumorais, dentre outros, de modo a identificar certos tipos
histológicos e, quando possível, direcionar o tratamento.

Na imunohistoquímica existem várias metodologias que podem ser aplicadas para a

detecção antigênica. A escolha do método depende basicamente do tipo de amostra
utilizada, da disponibilidade do anticorpo primário, do tempo de processamento
necessário e do custo dos reagentes.

Confecção das lâminas:

Os cortes histológicos devem ser colocados em lâminas carregadas iônicamente ou
gelatinizadas, deixadas em estufa 37ºc por no mínimo 1h para secagem.

Desparafinização:
30 min na estufa de 70ºc (opcional), após passar pela bateria de desparafinização
seguindo a ordem: 15 mim no xilol I e II; 3 min álcool abs I e II, 90, 80. Depois de
retirado do último álcool lavar 10 vezes em água destilada (trocando a água da cuba).

PBS: O tampão de lavagem PBS (Tampão fosfato-salino ou phosphate buffered saline)

é uma solução salina utilizada para lavagem entre os passos da reação de IHQ. Ajuda a
manter o pH constante entre 7,4 – 7,6 (pH próximo ao do corpo humano) durante a
reação, facilitando assim ligação antígeno-anticorpo.

 A solução concentrada deve ser diluída em água destilada na proporção de 10%

(ex: 100mL de PBS para 900mL de água destilada).

Recuperação antigênica: Poderá ser realizada em Banho Maria, vapor, panela

Pascal ou estufa; em Citrato pH6, EDTA pH9 ou enzimática de acordo com o
padronizado pelo LPC ou especificado no datasheet.

Citrato/EDTA: Diluir em água destilada na proporção de 10% (ex: 10mL de

Citrato/EDTA Dako® para 90mL de água destilada).

Enzimática: Dissolver 400mg de pepsina em 99mL de água destilada e adicionar e 1mL

de HCl.

Estufa: Colocar a solução Enzimática em uma cuba com as lâminas, deixar na estufa de
37ºC por 30 minutos. Após o tempo substituir a solução enzimática por PBS e deixar a
cuba por 3 minutos no congelador.

Banho Maria: Ligar o Banho com água até a marcação e aguardar o aquecimento até
atingir no mínimo 94ºC; quando atingir a temperatura colocar a cuba com
Citrato/EDTA por 5 minutos (para a solução também atingir a temperatura da reação),
colocar as lâminas na cuba e deixar imersa por 20 minutos. Retirar a cuba do Banho
Maria e deixar resfriando a temperatura ambiente por 20 minutos.
Panela Pascal: Colocar 500mL de água destilada na Pascal, por a cuba com as lâminas
contendo Citrato/EDTA no centro da panela, de modo que ela fique apoiada na
peneirinha. Fechar e ligar a panela, pressionar o botão “start”. Após o 1º apito apertar
novamente o “start” e aguardar, após o 2º apito apertar “start”, desligar e abrir a panela
para retirar a cuba, deixando resfriar por 20min a temperatura ambiente.

OBS1: Usar luva térmica para retirar a cuba do Banho Maria e Pascal.
OBS2: O tempo de resfriamento a temperatura ambiente é vital para a reação completa,
portanto respeitá-lo é fundamental.

Após o resfriamento lavar 3 vezes de 5 minutos em PBS (trocando o PBS da cuba).

 Retirar as lâminas da cuba, secar ao redor dos cortes com papel filtro/higiênico
e circular os cortes com caneta Dako, colocando-as na câmara úmida, sempre
colocando PBS sobre os cortes para não deixar a lâmina secar.

Bloqueio da Peroxidade e Proteína: Dependendo o tecido a ser analisado por

IHQ, pode ocorrer a interferência pela ação de enzimas endógenas e também pela
ligação inespecífica dos anticorpos (marcadores) com proteínas do tecido, sendo
necessário reações para bloqueio destas moléculas.

Bloqueio da peroxidase com solução de metanol e água oxigenada: Diluir 8% de água

oxigenada concentrada (30 volumes) em metanol (ex: 9,2 mL de metanol + 0,8 mL
água oxigenada). Pingar a solução na lâmina 3 vezes por 5 minutos (não lavar entre as
duas etapas, escorrer excesso e pingar novamente a peroxidase). Lavar com PBS 3 vezes
e pingar o Bloqueio de proteína DAKO® por 15 minutos, escorrer o excesso e pingar o
anticorpo.

OBS1: A concentração da água oxigenada pode variar de acordo com o tecido e o

anticorpo, podendo utilizar a água oxigenada diluída a 10 vol e 3%.
Obs2: Pode-se utilizar o Leite molico a 8% (100mL água destilada +8g de molico) ou
12% (100ml h2o deionizada para 12g leite) por 1 hora para bloqueio de proteína.

KIT NovoLink: pingar 1 gota (50µL) do “Bloqueio Peroxidase” no corte, 2 vezes de 5

minutos cada (não lavar entre as duas etapas, escorrer excesso e pingar novamente
peroxidase). Após lavar com PBS 3x e pingar o “Bloqueio Proteína” por 15 minutos.
Escorrer o excesso e pingar o anticorpo.

OBS: Caso o cromógeno seja à base de fosfatase alcanina não é necessário fazer o
bloqueio da peroxidase, apenas da proteína.

Incubação:
Pingar 50µL do anticorpo diluído sobre o corte. A depender do anticorpo, pode-se
incubar o anticorpo por 1h à temperatura ambiente ou overnight (geladeira por 18h).
Após incubação lavar 3 vezes em PBS.
OBS: A diluição do anticorpo deve ser feita de acordo com a padronização do LPC, se
não houver padronização deve-se seguir a diluição mínima indicada no datasheet para
teste e inicio da padronização.
Anticorpo Secundário, Polímero e Cromógeno: os anticorpos secundários
são sintetizados contra anticorpos primários, responsáveis por reconhecerem
imunoglobulinas de uma dada espécie e são conjugados à biotina ou a uma enzima
fosfatase alcalina ou uma peroxidase. Associado ao polímero a reação e amplificada e
melhor visualizada após a aplicação do cromógeno.

Kit Novo Link: pingar uma gota (50µL) sobre o corte do “Post Primary” por 30
minutos, lavar 3 vezes com PBS e pingar uma gota (50µL) do “Polymer” por 30 minutos
e lavar novamente 3 vezes com PBS e pingar o cromógeno.

HRP: pingar uma gota (50µL) sobre o corte do “Link” por 30 minutos, lavar 3 vezes
com PBS e pingar uma gota (50µL) do “Enzyme” por 30 minutos e lavar novamente 3
vezes com PBS e pingar o cromógeno.

Histofine: pingar uma gota (50µL) sobre o corte por 30 minutos, lavar 3 vezes com PBS
e pingar o cromógeno.

Fosfatase Alcalina: pingar uma gota (50µL) de Histofine AP sobre o corte por 30
minutos, lavar 3 vezes com PBS e pingar o cromógeno. Ou utilizar do Kit Dupla
Marcação Dako pingando 50µL do “Rabbit/Mouse Link” (frasco 6) por 30 minutos e
lavar 3 vezes com PBS. Após a lavagem pingar 50µL do “Polymer AP” (frasco 7) por 30
minutos, lavar 3 vezes com PBS e pingar o cromógeno.

Cromógeno:

 DAB Kit Novo Link: 1 mL de substrato para 1 gota do DAB (preparar 15 minutos
antes de pingar), por 1-5 minutos, lavar com água destilada e contracorar com
hematoxilina por 30 segundos e lavar em água corrente por 10 minutos.
 DAB Dako: 1mL de substrato para 1 gota do DAB (não necessita preparar antes),
por 1-5 minutos, lavar com água destilada e contracorar com hematoxilina por
30 segundos e lavar em água corrente por 10 minutos.
 Permanent Red: 3mL de substrato para 1 gota do Permanent Red (pingar
imediatamente após o preparo), por 5-10 minutos, lavar com água destilada.

Contracorar com hematoxilina por 30 segundos e lavar em água corrente por 10

minutos. Deixar secar por 24 horas e montar com entellan, não passar pela
bateria de montagem!!!!!

Montagem:
Passar pela bateria de montagem na seguinte ordem: álcool 80, 90, absoluto I e II, Xilol
I e II por 3 minutos em cada.
 Fluxograma Imunohistoquímica

Confecção Lâmina Anticorpo Lavagem PBS

Secundário

Desparafinização Lavagem PBS Polímero

Lavagem H2O Incubação Lavagem PBS

destilada

Recuperação Bloqueio Proteína Cromógeno

Antigênica

Resfriamento Lavagem PBS Contra coloração

Lavagem PBS Bloqueio Montagem

Peroxidase

OBS1: Caso o cromógeno utilizado seja à base de fosfatase alcalina a etapa do bloqueio
da peroxidase pode ser pulada.

OBS2: Caso seja utilizado o Histofine®, as etapas do anticorpo secundário e polímero

não são separadas, não havendo lavagem entre elas.

OBS3: Atenção quanto ao tipo cromógeno, alguns não passam pela bateria de
montagem!