Análisis de la ensaladilla rusa

Cuando la muestra de ensaladilla rusa nos llega al laboratorio tenemos que

efectuar primero unos pasos previos para prepararla a los análisis posteriores.

1) Primero homogenizamos la muestra y para ello vamos a utilizar el sistema

es el disruptor de paletas. Para ello pesaremos un poco de muestra para
meterla en una bolsa de Stomacher y asi poder romper el alimento.
2) Le añadiremos agua de peptona, que es un medio tamponado que permite
mantener estable la población bacteriana.
3) Despues de romper el alimento durante un tiempo concreto, depositamos la
muestra en una botella que sera la muestra madre a partir de la cual
realizaremos las siguientes disoluciones seriadas.

Después de esto tenemos que hacer los análisis pertinentes para saber con que
bacteria esta infectada la ensaladilla. Realizaremos análisis de:
a) Coliformes fecales
b) Salmonella
c) Microorganismos aerobios
d) Levaduras y mohos
e) Staphylococcus
f) Enterobacterias

Cada uno de estos microorganismos tiene un proceso analítico concreto y

específico, los cuales resumiré a continuación:

Coliformes fecales

Son un grupo dentro de las enterobacterias capaz de fermentar la lactosa y

producir ácido y gas a una temperatura de 37ºC y en un tiempo máximo de 48h.

1) Sembraremos en placas petri con medio FC, que es el específico para los
coliformes fecales.
2) La primera siembra la haremos a partir de la disolución madre para
continuar con las siguientes disoluciones.
3) Incubaremos a 44 ºC durante 24 h.
4) Luego contaremos las colonias de color azul de las placas que contengan
entre 15 y 300.
5) Obtener el número N de microorganismos por mililitro o por gramo
mediante la fórmula:
Σc
N =
(n1 + 0.1 ⋅ n 2) d
 Microorganismos aerobios

Son las bacterias, levaduras y mohos que se desarrollan en aerobiosis

1) Sembrar por duplicado a partir de la madre en dos placas petri estériles.
2) Repetir la operación con las siguientes disoluciones decimales.
3) Verter en cada placa PCA (agar de recuento) a 45ºC
4) Mezclar y esperar a que solidifique.
5) Si sospechamos que existen microorganismos en la muestra que invaden la
superficie del medio, después de la solidificación echar AB (Agar blanco) y
dejar reposar.
6) Incubar a 30ºC durante al menos 72 h
7) Contar las colonias de aquellas placas que contengan un máximo de 300
8) Expresión de los resultados y cálculo del número N de microorganismos por
mililitro o por gramo mediante la fórmula:
Σc
N =
(n1 + 0.1 ⋅ n 2) d

Levaduras y mohos

Levaduras: Microorganismos aerobios mesófilos que, en cinco dias, a 25ºC, se

desarrollan en la superficie del medio sólido, formando colonias mates o
brillantes, presentando frecuentemente contorno regular y una superficie más u
menos convexa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

Mohos: Microorganismos aerobios mesófilos, filamentosos, que en la superficie de

un medio sólido a 25ºC, desarrollan colonias cuando el ensayo se realiza según cl
siguiente método; este desarrollo puede proceder de la germinación de esporas o
del crecimiento de fragmentos micelares.

1) Sembrar a partir de la disolución madre en placas petri con medio

CGA( Agar glucosa y cloranfenitol ) .
2) Extender con asa de Drigalski .
3) Repetir la operación con las siguientes disoluciones seriadas .
4) Incubar a 25ºC durante 5 días .
5) Contar las colonias de cada placa a los 3, 4 y 5 días .
6) Quedarse solamente con las placas que contengan un máximo de 150
colonias .
7) Calcular el número N de levaduras y mohos que hay por mililitro o por
gramo mediante esta fórmula :
Σc
N =
0.11 ⋅ d
Enterobacterias

Las enterobacterias son bacterias que fermentan la glucosa .

1) Medios de cultivo para el crecimiento de las bacterias:

i) Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa (caldo EE) a doble
y simple concentración .
ii) Agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG).
iii) Agar glucosado (AGI ).
iv) Agar nutritivo (AN).

2) Sembrar en tres tubos con caldo EE a doble concentración la disolución madre.

3) Repetir la operacón las siguientes disoluciones seriadas.
4) Incubar a 37ºC durantes unas 24 h
5) Después procederemos al aislamiento:
a) Aislar en placas de VRBG a partir de cada tubo
b) Incubar a 37ºC durante 24 h
6) Para hacer las últimas pruebas haremos una selección de las colonias:
a) Resembar 5 colonias típicas y bien aisladas en placas de AN
b) Incubaremos a 37ºC durante 24 h
7) - Prueba de la oxidasa: Se realiza con cada una de las colonias aisladas. La
prueba es positiva si al cabo de 10 sg aparece una coloración violeta.
-Prueba de la fermentación de la glucosa:
Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias
aisladas oxidasa negativas.
Incubar a 37ºC durante 24 h . La prueba es positiva si en la totalidad del tubo
aparece una coloración amarilla.
8) Contar el número de tubos positivos para cada dilución. Si al menos una de las
colonias es
Oxidasa negativa y glucosa positiva, consideraremos positivo el tubo a partir de
cual se ha realizado el subcultivo.
Determinar el número más probable (NMP) con la ayuda de una tabla.

Salmonella

Es una enterobacteria no coliforme causante de muchas infecciones intestinales.

Su presencia en los alimentos es baja, por lo que requiere de un enriquecimiento
para poder detectar su presencia (análisis cualitativo, no de recuento). Según este
protocolo, serán positivas aquellas colonias de color rojo (debido al cambio de pH
por fermentación de la xilosa y descarboxilación de la lisina) y más aún si
presentan un color negro en el centro (por la produción de SH2).

1) Medios de cultivo.
- Agua de peptona tamponada.
- Caldo tetrationato-bilis-verde brillante: 250 μl de lugol + 150 μl novobiocin + 100
μl verde brillante + 2 ml BO
- Medio específico Salmonella- Shigella XLD (Agar-xilosa-lisina-desoxicolato).
3. Siembra.
a) Preenriquecimiento: Pesar asépticamente y en envase estéril, 25 g del producto
por analizar. Añadir 225 ml de agua de peptona tamponada para obtener una
solución al 1:10. Mezclar bien e incubar a 37ºC durante 16-20 horas.
b) Enriquecimiento: retirar 2 ml de la botella de preenriquecimiento y añadirlas al
caldo tetratonato-bilis-verde brillante e incubar a 42-43ºC durante 18-24 horas.
c) Aislamiento: Se sembrará por duplicado y sin recargar el asa de siembra en la
segunda placa a partir de la botella de enriquecimiento en medio específico XLD.
d) Confirmación bioquímica por galerías API: Los kits comerciales API son una
ayuda en la identificación rápida de Salmonella. Consisten en una serie de pocillos
donde el medio viene deshidratado. El proceso consiste en tomar biomasa de las
colonias con el asa de siembra y depositarla en la ampolla que acompaña al kit.
Dejamos esta ampolla en reposo a Tª ambiente 5 minutos y posteriormente, con
una pipeta Pasteur se echan 2-3 gotas en cada uno de los pocillos. En las reacciones
anaerobias se sella con parafina estéril.
Además existen 2 pruebas que necesitan de otros reactivos que la complementen:
 Preba deI indol: Se hace con 2 gotas del reactivo de Kovacs en el pocillo
correspondiente dejándola actuar 10 segundos. El positivo es un color rojo.

 Prueba de Voges- Proscahuer: con una gota de KOH 20% y 2 gotas de α-naftol
durante 20 minutos. Tiene que virar a rojo.

4. Recuento.

Observar si existe alguna colonia de color rojo en la placa.

5. Expresión de resultados.

Ver, según la legislación si el alimento es apto/no apto para el consumo.

Staphylococcus

Pertenecen a la familia Micrococaceae y son cocos Gram +, catalasa +, coagulasa +

y son capaces de fermentar el manitol. En este ensayo nos van a dar colonias de
color blanco y harán que el medio vire de rojo a crema por un cambio de pH.

Medios de cultivo:
Sal y manitol (Añadir cloruro sódico al 7,5% al Agar rojo de fenol y manitol).

Siembra:
- Sembrar por duplicado 1 ml de dilución madre en placas Petri con medio Sal y
manitol.
- Repetir la operación con las siguientes diluciones.
- Incubar a 37ºC durante 24 a 48 h.
Recuento:
Contar las colonias de color blanco de las placas que contengan entre 15 y 300.

Expresión de resultados:
Retener las placas cuyo número de colonias blancas se encuentre entre 15 y 300 y
utilizarlas para el cálculo.
Calcular el número N de microorganismos por mililitro o por gramo con la
expresión:
Σc
N =
(n1 + 0.1 ⋅ n 2) d