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Universidade de São Paulo

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

Departamento de Química

Bioquímica Experimental

Prática 6 – Cinética Enzimática: pH-ótimo e Determinação do KM: Efeito da


concentração do substrato sobre a velocidade da reação.

Renato Alexandre Polins Junior

Saira Vitória de Aquino Veneziani

Ribeirão Preto/SP

2019
1. OBJETIVOS

Observar o efeito do pH e da concentração de substrato sobre a velocidade das reações


enzimáticas, bem como determinar o pH-ótimo e o valor de KM para as reações realizadas.

2. RESULTADOS E DISCUSSÕES

2.1 Efeito do pH sobre a velocidade da reação

Preparou-se uma bateria de tubos de ensaio nos quais foram mantidas constantes as
concentrações de tampão, substrato e enzima, variando apenas o pH do tampão utilizado. Foram
calculados os volumes utilizados de tampão, substrato, água e enzima para que o volume final
fosse 1,0 mL, segundo o protocolo indicado na tabela 1. As soluções estoque utilizadas foram:
tampão de citrato de sódio de diferentes valores de pH (200 mmol/L), substrato pNFF (20
mmol/L) e a enzima fosfatase ácida (100 ng/mL).
Em intervalos de 1 minuto foi adicionada a quantidade de enzima calculada em cada tubo,
deixando reagir por 30 minutos e então interrompendo cada reação adicionando 1,0 mL de
NaOH 1 mol/L. A base foi adicionada pois desnatura a enzima e transforma o substrato p-
nitrofenilfosfato (pNFF) em p-nitrofenol (amarelo) e fosfato inorgânico. O p-nitrofenol pode ser
dosado espectrofotometricamente, obtendo-se as absorbâncias apresentadas também na tabela 1,
medidas no comprimento de onda 410 nm:

Tabela 1 – Protocolo de preparação do experimento e absorbâncias obtidas

Tampão PNFF Enzima


Tubo pH Água (µL) A410
(µL) (µL) (µL)
1 2,5 500 100 300 100 0,111
2 3,0 500 100 300 100 0,165
3 3,5 500 100 300 100 0,292
4 4,0 500 100 300 100 0,358
5 4,5 500 100 300 100 0,469
6 5,0 500 100 300 100 0,587
7 5,5 500 100 300 100 0,590
8 6,0 500 100 300 100 0,376
9 6,5 500 100 300 100 0,342
10 7,0 500 100 300 100 0,223

2
Utilizando a lei de Lambert-Beer (A = εbc), foi possível calcular a concentração da
-1 -1
enzima, sabendo que o coeficiente de extinção molar é de 17600 M cm e o caminho óptico é
de 1 cm. A concentração foi calculada para 2,0 mL, volume final do tubo, para determinar a
quantidade de enzima em μmols por cada tubo. Em seguida, a velocidade foi calculada dividindo
a quantidade em μmols no tubo pelo tempo de reação, que no caso deste experimento, foi de 30
minutos para todas as reações. Por fim, obteve-se a quantidade de p-nitrofenolato formado por
quantidade de enzima, ou seja, a atividade enzimática (U/mL) e (U/mg), levando em
-6
consideração que no tubo havia 0,1 mL e 10 ng (10 x 10 mg) de enzima. Os resultados
encontrados estão registrados na tabela 2.

𝐴 1𝐿 𝑛
𝑐= ⇒ 𝑛 = 𝐶µmol /L 𝑥 2,0 𝑚𝐿 𝑥 ⇒ 𝑣=
17600 𝑀−1 𝑐𝑚−1 𝑥 1 𝑐𝑚 1000 𝑚𝐿 30 𝑚𝑖𝑛

𝑈 𝑣 𝑈 𝑣
= =
𝑚𝐿 0,1 𝑚𝐿 𝑚𝑔 10 𝑥 10−6 𝑚𝑔

Tabela 2 - velocidade das reações e quantidade de produto formado por quantidade de enzima

Tubo pH A410 C (µmol/L) n (µmol) (em 2mL) v (µmol/min) (U/mL) (U/mg)


1 2,5 0,111 6,30 0,0126 -4 -3 42,0
4,20 x 10 4,20 x 10
2 3,0 0,165 9,38 0,0187 -4 -3 62,5
6,25 x 10 6,25 x 10
3 3,5 0,292 16,6 0,0332 -3 -2 110
1,10 x 10 1,10 x 10
4 4,0 0,358 20,3 0,0407 -3 -2 135
1,35 x 10 1,35 x 10
5 4,5 0,469 26,6 0,0533 -3 -2 177
1,77 x 10 1,77 x 10
6 5,0 0,587 33,3 0,0667 -3 -2 222
2,22 x 10 2,22 x 10
7 5,5 0,590 33,5 0,0670 -3 -2 223
2,23 x 10 2,23 x 10
8 6,0 0,376 2,13 0,0427 -3 -2 142
1,42 x 10 1,42 x 10
9 6,5 0,342 1,94 0,0389 -3 -2 129
1,29 x 10 1,29 x 10
10 7,0 0,223 1,27 0,0253 -4 -3 84,5
8,45 x 10 8,45 x 10

Em seguida foi preparada uma curva da atividade enzimática (U/mg) em função da


variação do pH, registrada na figura 1 a seguir.

3
250

200

150

U/mg
100
(U/mg)

50

0
0 2 4 6 8
pH

Figura 1 - atividade enzimática em função da variação do pH

Como se observa no gráfico, o pH-ótimo da fosfatase ácida na reação de hidrólise do


pNFF é de 5,5, já que este corresponde ao pH em que se observou maior atividade enzimática,
demonstrada pela maior quantidade de produto produzido. Este resultado está de acordo com o
relatado na literatura (JONSSON e AOYAMA, 2010).
Por serem proteínas, as enzimas têm propriedades sensíveis ao pH. A variação do pH do
meio pode influenciar em quatro fatores: (1) a ligação do substrato à enzima, (2) a atividade
catalítica da enzima, (3) a ionização do substrato e (4) a variação da estrutura da proteína
(normalmente importante apenas em extremos de pH). Mudanças no sítio ativo da enzima
implicam em mudanças na interação da enzima com o substrato, que depende dos grupos
ionizáveis e do formato deste sítio ativo, diminuindo então a atividade enzimática e a velocidade
da reação. Mudanças no substrato também podem comprometer a interação com o sítio ativo e
afetar a velocidade das reações enzimáticas (VOET, 2013).
Devido a estes efeitos causados pela variação do pH, torna-se importante utilizar uma
solução tampão nas determinações de atividade enzimática, pois a solução tampão é capaz de
atenuar esta variação do pH, e manter o meio reacional dentro do pH ótimo da enzima, fazendo
com que estes efeitos não comprometam a determinação da velocidade das reações.

2.2. Determinação do Km: efeito da concentração do substrato sobre a velocidade da reação

Assim como no experimento anterior, preparou-se uma bateria de tubos de ensaio nos quais
foram mantidas constantes as concentrações de tampão e enzima, variando apenas a
concentração do substrato pNFF. Foram calculados os volumes utilizados de tampão, substrato,
água e enzima para que o volume final fosse 1,0 mL, segundo o protocolo indicado na tabela 3.

4
As soluções estoque utilizadas foram: tampão de citrato de sódio (200 mmol/L), pH 5.5;
substrato pNFF (20 mmol/L, 2 mmol/L e 1 mmol/L); e a enzima fosfatase ácida (100 ng/mL).
A enzima foi adicionada ao tubo em intervalos de 1 minuto foi e a reação foi interrompida no
tempo determinado para cada tubo, adicionando 1,0 mL de NaOH 1 mol/L. Assim como no
experimento anterior, o mesmo produto p-nitrofenol foi obtido e pode ser dosado
espectrofotometricamente, obtendo-se as absorbâncias apresentadas também na tabela 3,
medidas no comprimento de onda 410 nm:

Tabela 3 – Protocolo de preparação do experimento e absorbâncias obtidas

Tubo Tampão Água [pNFF] estoque pNFF [pNFF] Enzima A410


(µL) (µL) (mmol/L) (µL) (mmol/L) (µL)
1 500 350 1 50 0,05 100 0,039
2 500 330 1 70 0,07 100 0,062
3 500 300 1 100 0,10 100 0,085
4 500 250 1 150 0,15 100 0,140
5 500 200 1 200 0,20 100 0,179
6 500 0 1 400 0,40 100 0,270
7 500 150 2 250 0,50 100 0,294
8 500 350 20 50 1,00 100 0,313
9 500 300 20 100 2,00 100 0,377
10 500 150 20 250 5,00 100 0,365

Utilizando a lei de Lambert-Beer (A = εbc), foi possível calcular a concentração da


-1 -1
enzima, sabendo que o coeficiente de extinção molar é de 17600 M cm e o caminho óptico é
de 1 cm. A concentração foi calculada para 2,0 mL, volume final do tubo, para determinar a
quantidade de enzima em mols por cada tubo. Por fim, a velocidade foi calculada dividindo a
quantidade em mols no tubo pelo tempo de cada reação, que no caso deste experimento, foi de
30 minutos para todas as reações. Os resultados encontrados estão registrados na tabela 4.

𝐴 1𝐿 𝑛
𝑐= ⇒ 𝑛 = 𝐶µmol /L 𝑥 2,0 𝑚𝐿 𝑥 ⇒ 𝑣=
17600 𝑀−1 𝑐𝑚−1 𝑥 1 𝑐𝑚 1000 𝑚𝐿 30

5
Tabela 4 - concentração de enzima em cada tubo e velocidade de cada reação

[pNFF] C n (µmol) v 1/ [pNFF]/ v/


Tubo A410 1/v
(mmol/L) (µmol/L) (em 2mL) (µmol/min) [pNFF] V [pNFF]

1 0,05 0,039 2,22 0,00443 1,48 x 10-4 6769 20,0 338 0,00295
2 0,07 0,062 3,52 0,00704 2,35 x 10-4 4258 14,2 298 0,00335
3 0,10 0,085 4,82 0,00966 3,22 x 10-4 3106 10,0 310 0,00322
4 0,15 0,140 7,95 0,0159 5,30 x 10-4 1886 6,67 283 0,00354
-4
5 0,20 0,179 10,2 0,0203 6,78 x 10 1475 5,0 295 0,00339
-3
6 0,40 0,270 15,3 0,0307 1,02 x 10 978 2,50 391 0,00256
7 0,50 0,294 16,7 0,0334 1,11 x 10-3 898 2,00 449 0,00223
8 1,00 0,313 17,8 0,0356 1,19 x 10-3 843 1,00 843 0,00118
9 2,00 0,377 21,4 0,0428 1,42 x 10-3 700 0,50 1400 0,000714
-3
10 5,00 0,365 20,7 0,0415 1,38 x 10 723 0,20 3616 0,000276

A partir dos valores da tabela 4, foram preparadas quatro curvas:


1) v x [pNFF] (Representação de Michaelis-Menten) – figura 2;
2) 1/v x 1/[ pNFF] (Representação de Lineweaver-Burk) – figura 3;
3) [pNFF]/v x [pNFF] (Representação de Hanes) – figura 4;
4) v x v/[pNFF] (Representação de Hofstee) – figura 5;

0,0016
0,0014
0,0012
v (μmol/L.min)

0,001
0,0008
0,0006
0,0004
0,0002
0
0 1 2 3 4 5 6
[pNFF] (mmol/L)

Figura 2 - Representação de Michaelis-Menten

6
8000
y = 296,7x + 919,5
7000
R² = 0,975
6000
5000

1/v
4000
3000
2000
1000
0
0 5 10 15 20 25
1/[pNFF]

Figura 3 - Representação de Lineweaver-Burk

4000
3500 y = 673,2x + 185,0
R² = 0,994
3000
2500
[pNFF]/v

2000
1500
1000
500
0
0 1 2 3 4 5 6
[pNFF]

Figura 4 - Representação de Hanes

0,0016
0,0014
0,0012
0,001
0,0008
v

0,0006
y = -0,346x + 0,001
0,0004
R² = 0,744
0,0002
0
0 0,001 0,002 0,003 0,004
v/[pNFF]

Figura 5 - Representação de Hofstee

7
Observa-se pela curva da figura 2 que se mantendo fixa a quantidade de enzima e se
aumentando gradativamente a concentração de substrato, a velocidade da reação aumenta
progressivamente até certo ponto, e a partir daí v0 não apresenta variações significativas, mesmo
que sejam adicionadas grandes quantidades de substrato. Considera-se, nesta situação que v0

aproxima-se de seu valor máximo (vmáx), indicando que todas as enzimas estão com substrato
ligado aos seus sítios ativos.
Uma reação catalisada por uma enzima pode ser descrita por um modelo que considera
duas reações elementares, nas quais o substrato forma um complexo com a enzima que,
subsequentemente, decompõe- se nos produtos e na enzima, de acordo com a equação:

Nesta equação, E, S, ES e P simbolizam, respectivamente, a enzima, o substrato, o


complexo enzima-substrato e os produtos. Segundo este modelo, quando a concentração do
substrato for alta o suficiente para converter complemente a enzima no complexo ES, a segunda
etapa da reação torna-se a etapa limitante da velocidade e a velocidade total da reação é
insensível ao aumento da concentração do substrato. A cinética da reação enzimática pode ser
descrita pela equação de Michaelis-Menten:

𝑣𝑚á𝑥 [𝑆] 𝑘−1 + 𝑘2


𝑣0 = 𝐾𝑀 =
𝐾𝑀 + [𝑆] 𝑘1

Na qual KM é a constante de Michaelis (VOET, 2013).


Há vários métodos para determinar os valores dos parâmetros da equação de Michaelis-
Menten experimentalmente. Quando [S] tem valores muito altos, a velocidade inicial v0

aproxima-se assintoticamente a vmáx. Na prática, entretanto, é muito difícil obter o valor de vmáx
com precisão a partir dos gráficos de v x [S], como na figura 2 (VOET, 2013).
Quando v0 = ½ vmáx, tem-se que:

1 𝑣𝑚á𝑥 [𝑆] 1 1
𝑣𝑚á𝑥 = ⇒ 𝐾𝑀 + 𝑆 = 𝑆 ⇒ 𝐾𝑀 = [𝑆]
2 𝐾𝑀 + [𝑆] 2 2

-3
Assim, pela análise da curva da figura 2, assumindo que vmáx seja 1,43 x 10 μmol/min, sua
-3
metade será 0,71x 10 μmol/min. A partir da estimativa gráfica, tem-se que a concentração de

substrato referente a esta velocidade é 0,3 mmol/L, que é o valor de KM encontrado.

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Um método melhor para determinar os valores de vmáx e KM, que foi formulado por Hans
Lineweaver e Dean Burk, usa a recíproca da equação de Michaelis-Menten (VOET, 2013):

1 𝐾𝑀 1 1
= +
𝑣0 𝑣𝑚á𝑥 𝑆 𝑣𝑚á𝑥

Sendo assim, o coeficiente angular obtido na equação da reta da curva da figura 3


(y = 296,7x + 919,5) refere-se ao valor de KM/vmáx, e o coeficiente linear ao valor de 1/vmáx:

1
= 919,5 ⇒ 𝑣𝑚á𝑥 = 1,09𝑥10−3 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1
𝑣𝑚á𝑥

𝐾𝑀 𝐾𝑀
= 296,7 ⇒ = 296,7 ⇒ 𝐾𝑀 = 0,323 mmol/𝐿
𝑣𝑚á𝑥 1,09𝑥10−3

O método de Hanes também permite encontrar os valores de vmáx e KM, multiplicando a


equação anterior por [S] (SIQUEIRA et al, 2011):

[𝑆] 1 𝐾𝑀
= [𝑆] +
𝑣0 𝑣𝑚á𝑥 𝑣𝑚á𝑥

Sendo assim, o coeficiente angular obtido na equação da reta da curva da figura 4


(y = 673,2x + 185,0) refere-se ao valor de 1/vmáx, e o coeficiente linear ao valor de KM/vmáx:
1
= 673,2 ⇒ 𝑣𝑚á𝑥 = 1,48𝑥10−3 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1
𝑣𝑚á𝑥

𝐾𝑀 𝐾𝑀
= 185,0 ⇒ = 185,0 ⇒ 𝐾𝑀 = 0,275 mmol/𝐿
𝑣𝑚á𝑥 1,48𝑥10−3

O método de Hofstee rearranja os parâmetros da equação de Michaelis-Menten e também


permite encontrar os valores de vmáx e KM (SIQUEIRA et al, 2011):

𝑣0
𝑣0 = − 𝐾𝑀 + 𝑣𝑚á𝑥
[𝑆]

Sendo assim, o coeficiente angular obtido na equação da reta da curva da figura 5


(y = -0,346x + 0,00161) refere-se ao valor de KM: 0,346 mmol/L; e o coeficiente linear refere-se

ao valor de vmáx: 0,00161.

9
Os valores de vmáx e KM encontrados por cada método foram reunidos na tabela 5. Os

valores de KM obtidos por cada método são próximos, com pequenas diferenças devido às
condições experimentais. O método de Hanes foi o que apresentou melhor linearidade.

Tabela 5 – valores de vmáx e KM encontrados em cada método

Método KM (mmol/L ) vmáx (μmol/min)


-3
Michaelis-Menten 0,3 1,43 x 10
-3
Lineweaver-Burk 0,323 1,09 x 10
-3
Hanes 0,275 1,48 x 10
-3
Hofstee 0,346 1,61 x 10

Os valores de velocidade determinados não são todos considerados valores de velocidade


inicial, pois foi consumido mais do que 5% da quantidade inicial de substrato em muitos deles. A
quantidade inicial de substrato nos tubos de ensaio neste experimento foi variada, de modo que a
porcentagem consumida de substrato em cada tubo está registrada na tabela 6 a seguir. Percebe-
se que até o valor de 0,50 μmol de substrato em 1 mL de solução, o consumo foi maior do que
5%. Nas concentrações de substratos mais altas, acima de 1,00 μmol/mL, o consumo foi menor
que 5%. Portanto, para estes valores, as velocidades determinadas são valores de velocidade
inicial. Considera-se, nesta situação que v0 aproxima-se de seu valor máximo (vmáx), indicando
que todas as enzimas estão com substrato ligado aos seus sítios ativos.

Tabela 6 – consumo de substrato em cada reação

pNFF inicial (μmol) Produto formado (μmol) Consumo de substrato (%)


0,05 0,00443 8,86
0,07 0,00704 10,0
0,10 0,00966 9,66
0,15 0,0159 10,6
0,20 0,0203 10,2
0,40 0,0307 7,68
0,50 0,0334 6,68
1,00 0,0356 3,56
2,00 0,0428 2,14
5,00 0,0415 0,830

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3. CONCLUSÕES

O primeiro experimento realizado permitiu observar o efeito do pH sobre a velocidade


das reações enzimáticas. Preparou-se uma bateria de tubos de ensaio nos quais foram mantidas
constantes as concentrações de tampão, substrato e enzima, variando apenas o pH do tampão
utilizado, na faixa de 2,5 a 7,0. Os resultados indicaram que o pH-ótimo da fosfatase ácida na
reação de hidrólise do pNFF é de 5,5, já que este corresponde ao pH em que se observou maior
atividade enzimática, demonstrada pela maior quantidade de produto produzido.
O segundo experimento realizado permitiu observar o efeito da concentração de substrato
sobre a velocidade das reações enzimáticas. Preparou-se uma bateria de tubos de ensaio nos
quais foram mantidas constantes as concentrações de tampão e enzima, variando apenas a
concentração do substrato pNFF, na faixa de 0,05 a 5,00 mol/L. Os resultados indicaram que
mantendo-se fixa a quantidade de enzima e aumentando-se gradativamente a concentração de
substrato, a velocidade da reação aumenta progressivamente até certo ponto, e a partir daí v0 não
apresenta variações significativas, mesmo que sejam adicionadas grandes quantidades de
substrato, situação em que v0 aproxima-se de seu valor máximo (vmáx), indicando que todas as

enzimas estão com substrato ligado aos seus sítios ativos. A constante de Michaelis (KM) foi
calculada através de quatro diferentes métodos, que apresentaram valores próximos a 0,3
mmol/L.

4. REFERÊNCIAS

JONSSON, C. M.; AOYAMA, H. Alteração da atividade enzimática em organismos aquáticos


por poluentes de origem agrícola: uma abordagem geral e sobre a suscetibilidade da fosfatase
ácida. Química Nova. 2010, v. 33, n. 4, 920-928.

SIQUEIRA, A. J. S. et al. Determinação do Km e V Max: revisão e uma nova proposta. Ciência


em Movimento. 2011, n. 27, 47-52.

VOET, D. Bioquímica. Porto Alegre: Artmed, 2013. 4ª ed.

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