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Universidade de São Paulo

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

Departamento de Química

Bioquímica Experimental

Prática 7 – Cinética Enzimática: Efeito de inibidores sobre a velocidade de


reação

Renato Alexandre Polins Junior

Saira Vitória de Aquino Veneziani

Ribeirão Preto/SP

2019
1. OBJETIVOS

Observar o efeito do inibidor fosfato de sódio na velocidade da reação com a enzima


fosfatase ácida, bem como determinar o tipo de inibição e calcular a constante de dissociação Ki.

2. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Prepararam-se quatro baterias de tubos de ensaio nos quais foram mantidas constantes as
concentrações de tampão e enzima, e variou-se a concentração do substrato pNFF e de inibidor
fosfato de sódio. Foram calculados os volumes utilizados de tampão, substrato, inibidor, água e
enzima para que o volume final fosse 1,0 mL, segundo os protocolos indicados nas tabelas 1 a 3.
A tabela 1 refere-se à bateria de tubos sem inibidor, também utilizada para preparar o branco,
trocando a quantidade de enzima por água. A tabela 2 refere-se à bateria de tubos com inibidor
(concentração 0,5 mM) e a tabela 3 refere-se à bateria de tubos com inibidor (1,5 mM).
As soluções estoque utilizadas foram: tampão de citrato de sódio (200 mmol/L), pH 5.5;
substrato pNFF (20 mmol/L, 2 mmol/L e 1 mmol/L); inibidor fosfato de sódio (5 mmol/L e 15
mmol/L); e a enzima fosfatase ácida (100 ng/mL). Em intervalos de 1 minuto foi adicionada a
quantidade de enzima calculada em cada tubo, deixando reagir por 30 minutos e então
interrompendo cada reação adicionando 1,0 mL de NaOH 1 mol/L. A base foi adicionada pois
desnatura a enzima e transforma o substrato p-nitrofenilfosfato (pNFF) em p-nitrofenol
(amarelo) e fosfato inorgânico. O p-nitrofenol pode ser dosado espectrofotometricamente,
obtendo-se as absorbâncias apresentadas na tabela 1, medidas no comprimento de onda 410 nm:

Tabela 1 – Protocolo do experimento sem inibidor e absorbâncias obtidas

Tubo Tampão Água [pNFF] estoque pNFF [pNFF] Fosfato Enzima A410
(µL) (µL) (mmol/L) (µL) (mmol/L) (µL) (µL)
1 500 350 1 50 0,05 - 100 0,105
2 500 330 1 70 0,07 - 100 0,132
3 500 300 1 100 0,10 - 100 0,171
4 500 250 1 150 0,15 - 100 0,233
5 500 200 1 200 0,20 - 100 0,280
6 500 200 2 200 0,40 - 100 0,387
7 500 150 2 250 0,50 - 100 0,445
8 500 350 20 50 1,00 - 100 0,515
9 500 300 20 100 2,00 - 100 0,571
10 500 150 20 250 5,00 - 100 0,615

2
Tabela 2 – Protocolo do experimento com inibidor (0,5 mM) e absorbâncias obtidas

Tubo Tampão Água [pNFF] estoque pNFF [pNFF] Fosfato Enzima A410
(µL) (µL) (mmol/L) (µL) (mmol/L) (µL) (µL)
1 500 250 1 50 0,05 100 100 0,041
2 500 230 1 70 0,07 100 100 0,049
3 500 200 1 100 0,10 100 100 0,064
4 500 150 1 150 0,15 100 100 0,081
5 500 100 1 200 0,20 100 100 0,111
6 500 100 2 200 0,40 100 100 0,211
7 500 50 2 250 0,50 100 100 0,256
8 500 250 20 50 1,00 100 100 0,308
9 500 200 20 100 2,00 100 100 0,427
10 500 50 20 250 5,00 100 100 0,538

Tabela 3 - Protocolo do experimento com inibidor (1,5 mM) e absorbâncias obtidas

Tubo Tampão Água [pNFF] estoque pNFF [pNFF] Fosfato Enzima A410
(µL) (µL) (mmol/L) (µL) (mmol/L) (µL) (µL)
1 500 250 1 50 0,05 100 100 0,021
2 500 230 1 70 0,07 100 100 0,028
3 500 200 1 100 0,10 100 100 0,039
4 500 150 1 150 0,15 100 100 0,058
5 500 100 1 200 0,20 100 100 0,068
6 500 100 2 200 0,40 100 100 0,109
7 500 50 2 250 0,50 100 100 0,164
8 500 250 20 50 1,00 100 100 0,180
9 500 200 20 100 2,00 100 100 0,301
10 500 50 20 250 5,00 100 100 0,357

Utilizando a lei de Lambert-Beer (A = εbc), foi possível calcular a concentração da


-1 -1
enzima, sabendo que o coeficiente de extinção molar é de 17600 M cm e o caminho óptico é
de 1 cm. A concentração foi calculada para 2,0 mL, volume final do tubo, para determinar a
quantidade de enzima em mols por cada tubo. Em seguida, a velocidade foi calculada dividindo a
quantidade em mols no tubo pelo tempo de cada reação, que no caso deste experimento, foi de
30 minutos para todas as reações. Por fim, obteve-se a quantidade de p-nitrofenolato formado
por quantidade de enzima, ou seja, a atividade enzimática (U/mg), levando em consideração que
3
-6
no tubo havia 10 ng (10 x 10 mg) de enzima. Os resultados encontrados estão registrados nas
tabelas 4 a 6.

𝐴 1𝐿
𝑐= ⇒ 𝑛 = 𝐶µmol /L 𝑥 2,0 𝑚𝐿 𝑥
17600 𝑀−1 𝑐𝑚−1 𝑥 1 𝑐𝑚 1000 𝑚𝐿

𝑛 𝑈 𝑣
𝑣= ⇒ =
30 𝑚𝑔 10 𝑥 10−6 𝑚𝑔

Tabela 4 – atividade enzimática nos tubos sem adição de inibidor

Tubo [pNFF] (mmol/L) A410 C (µmol/L) n (µmol) (em 2mL) v (µmol/min) (U/mg)

1 0,05 0,105 5,96 0,0119 3,98 x 10-4 39,8


2 0,07 0,132 7,50 0,0150 5,00 x 10-4 50,0
3 0,10 0,171 9,72 0,0194 6,48 x 10-4 64,8
-4
4 0,15 0,233 13,2 0,0265 8,83 x 10 88,3
-3
5 0,20 0,280 15,9 0,0318 1,06 x 10 106
-3
6 0,40 0,387 22,0 0,0440 1,47 x 10 147
-3
7 0,50 0,445 25,3 0,0506 1,69 x 10 169
8 1,00 0,515 29,7 0,0585 1,95 x 10-3 195
9 2,00 0,571 32,4 0,0649 2,16 x 10-3 216
10 5,00 0,615 34,9 0,0699 2,33 x 10-3 233

Tabela 5 – atividade enzimática nos tubos com adição de inibidor (0,5 mM)

Tubo [pNFF] (mmol/L) A410 C (µmol/L) n (µmol) (em 2mL) v (µmol/min) (U/mg)

1 0,05 0,041 2,32 0,00466 1,55 x 10-4 15,5


2 0,07 0,049 2,78 0,00557 1,86 x 10-4 18,6
3 0,10 0,064 3,64 0,00727 2,42 x 10-4 24,2
4 0,15 0,081 4,60 0,00920 3,07 x 10-4 30,7
-4
5 0,20 0,111 6,31 0,0126 4,20 x 10 42,0
-4
6 0,40 0,211 12,0 0,0240 7,99 x 10 79,9
-4
7 0,50 0,256 14,5 0,0291 9,70 x 10 97,0
8 1,00 0,308 17,5 0,0350 1,17 x 10-3 117
9 2,00 0,427 24,3 0,0485 1,62 x 10-3 162
10 5,00 0,538 30,6 0,0611 2,04 x 10-3 204

4
Tabela 6 – atividade enzimática nos tubos com adição de inibidor (1,5 mM)

Tubo [pNFF] (mmol/L) A410 C (µmol/L) n (µmol) (em 2mL) v (µmol/min) (U/mg)

1 0,05 0,021 1,19 0,00239 7,95 x 10-5 7,95


2 0,07 0,028 1,59 0,00318 1,06 x 10-4 10,6
3 0,10 0,039 2,22 0,00443 1,48 x 10-4 14,8
4 0,15 0,058 3,30 0,00659 2,20 x 10-4 22,0
5 0,20 0,068 3,86 0,00773 2,58 x 10-4 25,8
6 0,40 0,109 6,19 0,0124 4,13 x 10-4 41,3
7 0,50 0,164 9,32 0,0186 6,21 x 10-4 62,1
-4
8 1,00 0,180 10,2 0,0204 6,82 x 10 68,2
-3
9 2,00 0,301 17,1 0,0342 1,14 x 10 114
-3
10 5,00 0,357 20,3 0,0406 1,35 x 10 135

A partir dos dados anteriores, calculou-se o inverso da velocidade e da concentração de


substrato em cada tubo. Com estes dados, preparou-se a representação de Lineweaver-Burk
(duplos inversos), registrada na figura 1 a seguir.

0,14
y = 0,00600x + 0,00700
R² = 0,9980
0,12

0,10

y = 0,00317x + 0,00612 Sem inibidor


0,08
R² = 0,9783
Inibidor 0,5 mM
1/v

0,06 Inibidor 1,5 mM


Linear (Sem inibidor)

0,04 Linear (Inibidor 0,5 mM)


y = 0,00108x + 0,00410
R² = 0,9980 Linear (Inibidor 1,5 mM)
0,02

0,00
0 5 10 15 20 25
1/[pNFF]

Figura 1 - Representação dos duplos inversos

5
Pela análise da figura conclui-se que a inibição que ocorre é competitiva, pois o aumento
da concentração de inibidor resulta em linhas com um intercepto no eixo 1/Vmáx, com
inclinações diferentes, de forma que vmáx é constante (dentro de uma margem de erro), e o valor
de KM aumenta conforme se aumenta a concentração de inibidor (VOET, 2013).
Foram calculados os valores de vmáx e KM, através do método formulado por Hans
Lineweaver e Dean Burk, que usa a recíproca da equação de Michaelis-Menten (VOET, 2013):

1 𝐾𝑀 1 1
= +
𝑣0 𝑣𝑚á𝑥 𝑆 𝑣𝑚á𝑥

Sendo assim, o coeficiente angular obtido na equação da reta de cada curva da figura 1
refere-se ao valor de KM/vmáx, e o coeficiente linear ao valor de 1/vmáx:

Equação da reta obtida para a bateria de tubos com inibidor 1,5 mM: y = 0,00600x + 0,00700

1
= 0,00700 ⇒ 𝑣𝑚á𝑥 = 143 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1
𝑣𝑚á𝑥

𝐾𝑀 𝐾𝑀
= 0,00600 ⇒ = 0,00600 ⇒ 𝐾𝑀 = 0,857 mmol/𝐿
𝑣𝑚á𝑥 143

Equação da reta obtida para a bateria de tubos com inibidor 0,05 mM: y = 0,00317x + 0,00612

1
= 0,00612 ⇒ 𝑣𝑚á𝑥 = 163 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1
𝑣𝑚á𝑥

𝐾𝑀 𝐾𝑀
= 0,00317 ⇒ = 0,00317 ⇒ 𝐾𝑀 = 0,518 mmol/𝐿
𝑣𝑚á𝑥 163

Equação da reta obtida para a bateria de tubos sem inibidor: y = 0,00108x + 0,00410

1
= 0,00410 ⇒ 𝑣𝑚á𝑥 = 244 𝜇𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛−1
𝑣𝑚á𝑥

𝐾𝑀 𝐾𝑀
= 0,00108 ⇒ = 0,00108 ⇒ 𝐾𝑀 = 0,263 mmol/𝐿
𝑣𝑚á𝑥 244

Os valores de KM aparente (KMapp) encontrados para cada bateria de tubos foram

reunidos na tabela 7. Em seguida, preparou-se uma curva dos valores de KMapp em função da
concentração de inibidor, que está registrada na figura 2.

6
Tabela 7 – valores de vmáx e KMapp encontrados em cada método

Concentração de inibidor KMapp (mmol/L )


Sem inibidor 0,263
0,5 mM 0,518
1,5 mM 0,857

1,000
0,900 y = 0,387x + 0,287
R² = 0,988
0,800
0,700
0,600
Kmapp

0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
Concentração de inibidor (mM)

Figura 2 – KMapp em função da concentração de inibidor

É possível se obter o valor da constante de dissociação do complexo enzima-inibidor (Ki)


quando a linha de tendência cruza o eixo x, no valor em que y = 0. Sendo assim, utilizando a
equação da reta encontrada, tem-se que:

0 = 0,387𝑥 + 0,287 ⇒ −𝑥 = 𝐾𝑖 = 0,742

3. CONCLUSÕES

O experimento realizado permitiu observar o efeito do inibidor fosfato de sódio nas


reações enzimáticas realizadas. Conclui-se que conforme se aumenta a concentração do inibidor,
ocorre aumento no valor de KM, porém vmáx permanece constante, indicando que a inibição é do
tipo competitiva. O valor da constante de dissociação do complexo enzima-inibidor (Ki)
encontrado foi de 0,742.

4. REFERÊNCIAS

VOET, D. Bioquímica. Porto Alegre: Artmed, 2013. 4ª ed.

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