Você está na página 1de 7

Programas de Computador para Desenho e Análise de Primers para

PCR

Parâmetros principais
Tm, Tamanho do primer e conteúdo de CG (GC%)
Temperaturas elevadas iram separar (ou “derreter”) a fita dupla de DNA em
fitas simples de DNA através da quebra das pontes de hidrogênios. A temperatura de
melting (Tm) é a temperatura na qual metade do DNA está como fita simples e metade
está como fita dupla. A Tm caracteriza a estabilidade do híbrido de DNA formado entre
o primer (o oligonucleotídeo) e sua fita complementar, sendo um dos principais
parâmetros analisados durante o desenho de primers. Esse parâmetro pode ser afetado
pelo tamanho do primer, a sequência do primer, concentração de sais, concentração
do primer e pela presença de desnaturantes (como formaldeído e DMSO).
Com todas as outras condições definidas, a Tm é característica da composição
do primer. Primers com alto conteúdo de G+C (GC%) apresentam alto Tm por conta
das três pontes de hidrogênio entre G e C em comparação com as duas pontes de
hidrogênio entre A e T. A Tm de um primer também aumenta com o seu tamanho. Uma
fórmula simples para calcular o Tm é: Tm = 2 × AT + 4 × CG, onde AT é a soma de
todos os A e T e CG é a soma de todos o C e G do primer.

Especificidade do primer
A especificidade do primer é outro parâmetro importante no desenho do
primer de PCR. Para amplificar somente o fragmento pretendido, os primers devem
se ligar apenas à sequência de destino, mas não em outro local. Em outras palavras, a
sequência de destino (do gene alvo) deve ocorrer apenas uma vez naquele genoma. O
comprimento do primer afeta não apenas a Tm, como discutido anteriormente, mas
também a singularidade (especificidade) da sequência no template (o alvo). Suponha
que a sequência de DNA é inteiramente aleatória (o que pode não ser verdade), a
chance de encontrar um A, G, C ou T em qualquer sequência de DNA é um quarto
(1/41), então um primer de 16 bases, estatisticamente, ocorrerá apenas uma vez em
cada 416 bases, ou cerca de 4 bilhões de bases, que é aproximadamente do tamanho do
genoma humano. Por conseguinte, a ligação de um iniciador de 16 bases ou mais com
a sua sequência alvo é um processo extremamente sequência-específico. É claro que,
para ter certeza de que a sequência alvo ocorra apenas uma vez, você precisaria
verificar toda a sequência do DNA modelo, o que não é possível na maioria dos casos.
No entanto, é frequentemente útil pesquisar as bases de dados de sequências de DNA
atuais para verificar se o iniciador escolhido tem uma homologia com sequências
repetitivas ou com outros loci noutras partes do genoma (utilizando o BLAST, por
exemplo). Para amplificação do DNA genômico, os primers 17-mer ou mais são
rotineiramente usados.
Sequência do primer e grampo de cabelo (hairpin)
A parte mais difícil no desenho do primer de PCR é evitar a
complementaridade do primer, especialmente nas extremidades 3'. Quando parte de
um primer é complementar a outra parte de si mesmo, o primer pode dobrar-se ao meio
e formar uma estrutura denominada hairpin (grampo de cabelo), que é estabilizada
pelo emparelhamento de bases complementares (Fig. 1). A estrutura em hairpin é um
problema para a PCR porque o primer está interagindo consigo mesmo e não está
disponível para a reação desejada. Além disso, a molécula de iniciador pode ser
prolongada pela DNA polimerase de modo a que a sua sequência seja alterada e não
seja mais capaz de se ligar ao sítio-alvo.

Figura 1. Estrutura de hairpin em um primer que


apresenta auto-complementariedade

Semelhante à estrutura em grampo, se não for cuidadosamente projetado, uma


molécula de primer pode hibridizar com outra molécula de primer e atuar como
modelo para o outro, resultando em dímeros de primers (Fig. 2). A formação do
dímero de primers causa os mesmos problemas à reação de PCR que a estrutura de
hairpin. Pode também atuar como um concorrente para amplificação do DNA alvo.
Normalmente, é muito difícil e demorado encontrar a estrutura em hairpin ou a
formação de dímeros de iniciadores manualmente, a olho nu. No entanto, eles podem
ser facilmente detectados por programas de análise de primer.

Figura 2. Dímero de primer causado pela complementariedade


entre os dois iniciadores da PCR.
Regras gerais para o desenho de primers
1. Primers deve ter 17-28 bases de comprimento;
2. A composição básica deve ser de 50 a 60% (G + C);
3. Os primers devem terminar (3') em um G ou C, ou CG ou GC: isso evita a
“respiração” das extremidades e aumenta a eficiência do anelamento;
4. Tms entre 55-80 °C são preferidos (ótimo perto de 60 ºC);
5. Evite primers com complementaridade de 3' (que resulta em dímeros de primer). As
extremidades 3' dos iniciadores não devem ser complementares (isto é, pares de bases),
pois de outro modo os dímeros de iniciadores serão sintetizados e formarão outro
produto;
6. A auto-complementaridade do primer (capacidade de formar estruturas secundárias,
como hairpin) deve ser evitada;
7. As execuções de três ou mais Cs ou Gs nas extremidades 3' dos iniciadores podem
promover o anelamento errôneo em sequências ricas em G ou C (devido à estabilidade
do reconhecimento), e devem ser evitadas.
Como são necessários dois iniciadores diferentes para a reação de PCR, a
formação de dímero de iniciadores entre os dois iniciadores também deve ser
verificada e evitada, se possível. É desejável que a Tm dos iniciadores seja semelhante.
Se forem muito diferentes, uma temperatura de anelamento adequada pode ser difícil
de encontrar. Na temperatura de anelamento alta, o primer com a Tm mais baixa pode
não funcionar, enquanto que na temperatura de hibridação baixa, a amplificação será
menos eficiente porque o primer com a Tm mais alta não anelará perfeitamente.
Na realidade, a seleção de primers é geralmente empírica. Varia muito de
pesquisador para pesquisador em relação aos critérios que eles usam.

Programas de Computador para o Desenho e Análise de primers

Programas para desenho de primers não-degenerados (convencionais)


Para o desenho de primers, a maioria dos pesquisadores costumava
inspecionar visualmente a sequência de DNA alvo para encontrar primer(s) com as
características que eles preferiam, que são geralmente semelhantes às diretrizes
mencionadas anteriormente. Como os computadores são amplamente utilizados em
biologia molecular, um grande número de programas de computador foi desenvolvido
especificamente para a seleção de primers não-degenerados, o que torna o desenho de
primers de PCR mais eficiente e confiável. A maioria dos pacotes de análise de
sequenciamento, como o Vector NTI (InforMax Inc.), geralmente contém um módulo
de desenho de primer. Os programas de computador selecionados para o desenho de
iniciadores de PCR não-degenerados e seus recursos estão listados na Tabela 1.
Tabela 1. Programas computacionais para desenho de primers não-degenerados.
Programa Características URL
Online / grátis
Desenho de primer
Primer3 para PCR e http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
hibridização
Vários parâmetros
configuráveis
Online / download /
Primerize grátis https://primerize.stanford.edu/
Desenho de primers
para PCR
Online / grátis
Primer- Desenho de primers https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
BLAST para PCR usando
Primer3 e BLAST
PCR Primer Online / grátis https://www.eurofinsgenomics.eu/en/ecom/tools/pcr-
Design Tool Desenho de primers primer-design/
para PCR

Do ponto de vista computacional, o desenho de primers de PCR não-


degenerados é relativamente simples: encontrar substrings (pedaços da fita) curtas a
partir de cadeias de nucleotídeos de DNA que atendam a determinados critérios.
Embora os critérios variem entre os programas, os parâmetros centrais, como
comprimento do primer, Tm, conteúdo do GC e auto-complementaridade, são
compartilhados por esses programas.

Programas para desenho de primers degenerados


Uma sequência de iniciadores de PCR é chamada degenerada se algumas das
suas posições tiverem várias bases possíveis. Por exemplo, no primer GG {C, G} A
{C, G, T} A, a terceira posição é C ou G e a quinta é C, G ou T. A degeneração do
primer é o número de combinações de sequências que ele contém. Por exemplo, a
degenerescência do iniciador acima é 6. Os iniciadores degenerados são tão fáceis e
baratos de produzir como iniciadores únicos convencionais, são úteis para amplificar
várias sequências genômicas filogeneticamente relacionadas e são utilizados em várias
aplicações. A maioria das aplicações existentes usa desde baixa degeneração até
centenas.
Suponha que se tenha uma coleção de sequências-alvo filogeneticamente
relacionadas, por exemplo, sequências de DNA de genes homólogos, e o objetivo é
projetar primers que combinem com o maior número deles possível (ou seja, que
consiga amplificar a maioria em uma PCR). Uma solução ingênua seria alinhar as
sequências sem intervalos, contar o número de nucleotídeos diferentes em cada
posição ao longo do alinhamento e buscar uma janela de comprimento de primer
(normalmente 20-30) onde o produto das contagens é baixo. Tal solução é insuficiente
devido a lacunas, a função objetiva inadequada do alinhamento e, mais notavelmente,
a degeneração excessivamente alta. Quando a degeneração é muito alta, sequências
não relacionadas também podem ser amplificadas, perdendo especificidade. Podemos
ter que comprometer, tentando combinar muitas, mas não necessariamente todas as
sequências.
Nas experiências para amplificar os novos membros descobertos de famílias
de genes ou sequências cognatas de diferentes organismos por PCR, a sequência exata
do gene alvo não é conhecida. Geralmente, alinhamos todas as sequências conhecidas
para esse gene e encontramos as regiões mais conservadas, então desenhamos os
primers "degenerados" correspondentes (Fig. 3), que são um conjunto de primers com
diversidade de nucleotídeos em várias posições na sequência. As degenerescências
obviamente aumentam as chances de amplificação da sequência alvo, mas reduzem a
especificidade do(s) primer(s) ao mesmo tempo.

Figura 3. Exemplo de algoritmo realizado por um programa utilizado para


o desenho de primers degenerados. Os passos gerais para a produção de um
primer degenerado são: 1. primeiramente, faz-se alinhamento múltiplo e
procura a sequência consenso de proteínas; 2. traduzir para uma sequência
de nucleotídeos a partir da sequência consenso aminoácidos; 3. encontrar
regiões mais conservadas e desenhar os primers a partir delas; 4. analisar
parâmetros do primer (Tm, GC%, formação de estruturas secundárias...)
Desenhar primers degenerados tem sido considerado mais uma arte do que
uma ciência. Há muito menos programas de computador para o desenho de primers
degenerados (Tabela 2) do que para o desenho de primers não-degenerados.

Tabela 2. Programas computacionais para desenho de primers degenerados.


Programa Características URL
Online / grátis
GeneFisher2 Calcula sequências https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/genefisher2
consenso ambíguas
Programa para PC
Pesquisa regiões
FAS-DPD conservadas através https://sourceforge.net/projects/fas-dp
de alinhamento
múltiplo
Programa para PC
J-CODEHOP Calcula sequências https://virology.uvic.ca/virology-ca-tools/j-codehop/
consenso ambíguas
HYDEN Programa para PC http://acgt.cs.tau.ac.il/hyden/HYDEN.htm

Programas para análise de primers


Mesmo se você preferir desenhar primers por si mesmo, à mão, não por um
programa de computador, é aconselhável que seus primers sejam analisados por um
programa de computador para determinar a Tm, possível estrutura hairpin, dímeros de
primer e outras propriedades antes de fazer o pedido para a empresa que construirá os
primers. A Tabela 3 lista dois programas de computador para essa finalidade.

Tabela 3. Programas computacionais para análise de primers.


Programa Características URL
Programa para PC
Oligo Calcula Tm, encontra https://www.idtdna.com/calc/Analyzer/Ho
Analyzer possíveis estruturas de me/Instructions
hairpin e dímeros, encontra
homologia
Programa para PC
Net Calcula Tm, propriedades do https://sourceforge.net/projects/fas-dp
Primer primers, encontra estruturas
secundárias
Referências
Chen BY., Janes H.W., Chen S. (2002) Computer Programs for PCR Primer Design
and Analysis. In: Chen BY., Janes H.W. (eds) PCR Cloning Protocols. Methods
in Molecular Biology™, vol 192. Humana Press.
Linhart C., Shamir, R. (2012) The Degenerate Primer Design Problem: Theory and
Applications. Journal of Computational Biology. 12(4):431-456.

Você também pode gostar