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INTRODUÇÃO

A determinação de um analito em qualquer amostra biológica se baseia primariamente na


reação do analito que se deseja avaliar, qualitativa ou quantitativamente, com um ou mais
reagentes visando a formação de um produto, que pode ser identificado visualmente ou
medido através de um equipamento.

Os produtos formados podem ter as mais variadas apresentações, podendo ser uma
aglutinação de partículas, turvação, formação de cor ou formação de um produto sem cor,
que pode ser identificado ou medido através de fotômetros ou contadores de radiação.
Portanto, o trabalho no Laboratório Clínico se baseia, quase na sua totalidade, no uso de
reagentes que produzem as reações desejadas, formando os produtos indicadores da reação.

Reagentes para pesquisa visual ou qualitativa


Os reagentes utilizados para pesquisa visual podem ser partículas de látex, células,
principalmente hemácias, onde são aderidos antígenos ou anticorpos, destinados a reagir
com a substância cuja presença se deseja identificar. As partículas têm a função de mostrar
visualmente a reação ocorrida, que se manifesta pela presença ou ausência de aglutinação.

Os reagentes podem ainda ser anticorpos específicos para antígenos que desejamos
pesquisar ou quantificar e que desenvolvem reações cujo produto pode ser uma turvação ou
uma precipitação em um meio sólido. Um dos exemplos correntes é a dosagem de
imunoglobulinas por imunodifusão radial.

Outra forma de identificação visual consiste na coloração de células onde os corantes


reagem com substâncias presentes dentro das células, mostrando cores diferentes em função
das reações ocorridas.

A pesquisa visual utiliza também reagentes (antígenos ou anticorpos) imobilizados em


membranas ou microplacas, que reagem com a substância a ser pesquisada. A ocorrência da
reação antígeno-anticorpo é mostrada pela ação de reagentes auxiliares que desenvolvem
cor, podendo até mesmo mostrar símbolos de fácil interpretação.

A cromatografia de coluna ou camada delgada é também um modelo de pesquisa visual,


que permite a separação de vários componentes em uma amostra biológica. A identificação
dos analitos é realizada através dos mais variados processos de coloração ou pode ser feita
através da própria cor dos analitos separados, como na separação cromatográfica das
hemoglobinas. Em muitos casos pode-se utilizar um instrumento para quantificar os
analitos separados.

A pesquisa visual, quando qualitativa, é denominada genericamente como um "teste" que


gera uma decisão de confirmar a ausência ou presença do analito. É um resultado em que a
resposta é sim ou não, positivo ou negativo.
Reagentes para análise instrumental
Na grande maioria das vezes, os reagentes utilizados na análise instrumental ou quantitativa
devem gerar produtos, cuja quantidade pode ser medida com a utilização de um
equipamento. Os dados obtidos são comparados com padrões para se obter a concentração
do analito presente na amostra. Durante muito tempo os reagentes empregados na pesquisa
instrumental utilizaram somente substâncias químicas, orgânicas ou inorgânicas, capazes de
gerar um produto mensurável. Para gerar os produtos, estes reagentes em muitos casos,
devem produzir grandes quantidades de energia ou necessitam da adição de energia externa
fornecida por incubações em temperaturas elevadas. Estes reagentes químicos apresentam
os seguintes problemas:

a) dificuldades de manuseio por serem em muitos casos reagentes cáusticos;


b) como o ensaio pode requerer o emprego de mais de um reagente e estes reagentes não
podem ser combinados para formar reagente único ou porque o sistema de reagentes
requer incubações em temperaturas elevadas, dificilmente aplicáveis nos analisadores
automáticos modernos;
c) em muitas situações utilizam sistemas analíticos complexos ou demorados, que por
diversas razões não podem ser aplicados em aparelhos automáticos.

O desenvolvimento de métodos eficientes de fermentação e separação, permitiram a


obtenção de enzimas purificadas de custo bastante acessível, fazendo com que as enzimas
possam ser utilizadas como reagentes, substituindo os reagentes químicos em muitos
sistemas analíticos. As enzimas passaram a fazer parte da formulação de um número cada
vez maior de sistemas analíticos com as seguintes vantagens operacionais:

a) emprego de reagentes pouco agressivos e de fácil utilização;


b) facilidade para utilização de reagentes únicos, reduzindo as operações manuais;
c) aplicação em analisadores automáticos, por empregarem reagentes únicos poucos
agressivos que não requerem incubações em temperaturas elevadas;
d) custos operacionais totais muito similares aos dos reagentes químicos, porque reduzem
as operações manuais e são facilmente automatizados, reduzindo o custo teste/homem-
hora.

As enzimas são também produtos químicos, mas devido a características próprias destes
reagentes, os sistemas analíticos utilizando enzimas são denominados enzimáticos. Os
usuários dos reagentes enzimáticos sentiram a necessidade de distinguir estes reagentes dos
reagentes químicos e criou-se então a denominação de reagentes colorimétricos para os
reagentes químicos e de reagentes enzimáticos para aqueles utilizando enzimas. Entretanto,
muitos reagentes enzimáticos formam produtos coloridos, sendo colorimétricos também.
Assim, para distinguir os dois tipos de reagentes, devemos denominar como enzimáticos os
reagentes que utilizam enzimas, e como reagentes químicos aqueles que não utilizam
enzimas. Os reagentes para dosagem do colesterol formam produtos coloridos, mas podem
utilizar reagentes químicos ou enzimáticos. Assim, os métodos para dosagem de colesterol
devem ser denominados como químico e enzimático e não como colorimétrico e
enzimático.
Os métodos quantitativos têm a denominação genérica de "ensaios".

A água como reagente

A água é o suprimento de laboratório mais barato. Talvez, por este motivo, sua qualidade
seja tão negligenciada, apesar de ser um reagente importante e o mais largamente utilizado.
A água utilizada no laboratório deve ser PURA e este termo pode significar coisas
diferentes, dependendo da situação. Se falamos que a água de um rio é pura, estamos
afirmando que não é poluída e é adequada para natação, pescaria e esportes náuticos.
Pureza da água de uso doméstico significa que ela é livre de microrganismos patogênicos,
agentes tóxicos e própria para consumo humano. No Laboratório Clínico, a água é utilizada
como reagente químico. Neste caso a denominação água pura significa que ela é usada
como H2O e nada mais.

A água de torneira contém quantidades variáveis de microrganismos, matérias orgânicas e


inorgânicas dissolvidas ou em suspensão, com quantidades que dependem da região e
estação do ano. Portanto, a água de torneira, apesar de ser adequada ao uso doméstico, não
é própria para uso no Laboratório Clínico e deve ser purificada por meios apropriados.
Hoje, nem mesmo a água de chuva é pura, devido à poluição atmosférica que ocorre nas
grandes cidades e regiões industrializadas.

O efeito das impurezas da água nos diversos testes de laboratório tem sido estudado
sistematicamente e existem evidências de numerosas causas de erro. O cloro utilizado na
água servida à população, na concentração em torno de 1,0 mg/l, pode introduzir erros de
até 25% na dosagem de cloretos e interfere com vários procedimentos em bacteriologia e
enzimologia. Traços de metais aceleram ou inibem várias reações e introduzem erros,
muitas vezes consideráveis, nas dosagens de enzimas ou em procedimentos que utilizam
enzimas como reagentes. A dimensão do erro gerado pela impureza da água depende em
muito da concentração do analito. Um miligrama de sódio por litro de água pode introduzir
um aumento de 4,3 mEq/l na dosagem de sódio se a diluição utilizada for de 1:100,
representando um erro de 3,1%, em uma concentração de sódio de 140 mEq/l. Por outro
lado, 1,0 mg de potássio por litro de água introduz um aumento de 2,5 mEq/l. Em uma
amostra com potássio de 4,0 mEq/l, o erro é de 62%.

Fica então claro que a água a ser utilizada no laboratório deve ser purificada para que não
produza interferências nos testes ou ensaios. Vários são os processos de purificação que
estão disponíveis para utilização no laboratório e a tabela que se segue relaciona os vários
procedimentos de purificação da água e sua eficiência na remoção dos principais
interferentes.

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Principais contaminantes e eficiência da purificação

Tabela 1: E = excelente; B = boa; P = pobre (remoção pequena ou nula)

Uma combinação dos processos de purificação da água para uso no Laboratório Clínico,
que é eficiente e de baixo custo, consiste de:

1. filtro inicial para reter partículas e bactérias.


2. filtro de carvão ativado para eliminar matérias orgânicas.
3. sistema deionizador de leito misto ou separado para reter íons. Uma coluna de leito
misto é mais eficiente que duas colunas de leitos separados, com os mesmos volumes
de resinas.

O processo de deionização, devido ao baixo custo de manutenção porque economiza água e


energia elétrica, tem aplicação muito comum nos Laboratórios Clínicos, mas o sistema
pode apresentar os seguintes problemas:

1. pequena sensibilidade no sistema de informação da qualidade da água processada,


permitindo a utilização de água imprópria.
2. contaminação com bactérias, que deteriora rapidamente as resinas.
3. liberação de silicatos, substâncias alcalinas e potentes oxidantes, que interferem nas
reações, principalmente as enzimáticas.

A água deionizada pode ser utilizada com sucesso no Laboratório Clínco, supondo que os
cuidados de controle da qualidade sejam tomados e que a água seja testada todas as vezes
em que se obtiver um novo lote. A água de uso no laboratório foi classificada em quatro
graus de pureza, em função da concentração de contaminantes mais importantes. Os quatro
graus de pureza da água são mostrados na tabela abaixo.

Todas as especificações foram estabelecidas no momento da produção da água.

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Especificações da água como reagente

NM = não mensurável; ufc = unidades formadoras de colônias; PZ = próximo de zero

Existe ainda uma especificação para a água que é usada em HPLC, cultura de células e
tecidos, análise de cromossomas e testes de HLA, que é denominada água tipo 'Especial'.

A medida da resistividade deve ser feita com um condutivímetro. Os silicatos podem ser
facilmente medidos, conforme será mostrado adiante quando for abordado o controle da
qualidade da água. O número de bactérias pode ser determinado utilizando uma cultura
quantitativa. Para obter uma água que somente contenha partículas menores que 0,22 mm,
deve-se filtrá-la em um filtro com poro de diâmetro igual a 0,22 mm.

A água de tipo I só existe nesta forma no momento de sua produção, pois a resistividade irá
diminuir porque metais ou matéria orgânica podem se desprender do recipiente de
armazenamento. Portanto, quando um reagente requerer este tipo de água, ele deve ser
preparado imediatamente após a produção da água. Deve-se minimizar o armazenamento
da água tipo IIa, para que se mantenha uma consistência de qualidade específica para a
aplicação da água.

Os sistemas de armazenamento da água de tipos IIb e III devem ser construídos com
materiais que não facilitem a contaminação química ou bacteriana.

Certos cuidados devem ser tomados após obter água destilada ou deionizada, pois não tem
sentido obter uma água de boa qualidade e contaminá-la durante o processo
armazenamento.

Não se deve armazenar a água tipo IIb ou III por mais de uma semana, e o recipiente de
armazenamento deve ser lavado, todas as vezes em que se adicionar novo lote de água. Não
utilizar tubos de borracha como saídas da água e deve-se constantemente lavar as vedações
da torneira.
De modo geral, como a água deionizada se encontra em um estado antinatural e tem a
tendência a retornar ao estado anterior à purificação, deve-se evitar armazená-la, qualquer
que seja a aplicação. Quando se usar água deionizada, é recomendável obter a quantidade
suficiente para um dia de trabalho, utilizando a porção que sobrar para recompor a água do
banho-maria.

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Aplicações da água como reagente

Tabela 3

Para a preparação dos diversos regentes é necessário selecionar o tipo de água mais
adequado, em função da qualidade requerida. A tabela acima mostra a aplicação dos tipos
de água na preparação dos reagentes utilizados no laboratório. Assim, se desejamos
preparar um reagente enzimático, devemos utilizar água Tipo IIa, no mínimo e os reagentes
para fluorescência quantitativa devem ser preparados com água tipo I, imediatamente após
sua produção.

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Controle da qualidade da água

O controle da qualidade da água deionizada pode ser realizado por verificação do


aparecimento de alcalinidade, utilizando solução alcoólica de fenolftaleina a 1%. Adicionar
uma gota de fenolftaleina a 10 ml de água. O aparecimento de cor vermelha indica perda da
qualidade da água. Outro procedimento de controle consiste em verificar a quantidade de
silicatos, que são os primeiros elementos a aparecerem na água quando ela começa a se
tornar imprópria para utilização. Como os reagentes para dosagem de silicatos são os
mesmos empregados para dosar fósforo inorgânico, pode-se utilizar o branco da dosagem
de fósforo. A absorbância do branco, quando lida contra água em 650 nm ou filtro
vermelho (640-700), não deverá ser maior que 0,010 ou não deve ocorrer formação de cor
azul visível, que corresponde a uma concentração de silicatos maior que 0,10 mg/l. Esta
informação indica que a água deionizada está imprópria, contendo uma concentração de
silicatos acima do máximo aceitável, devendo ser feita a regeneração ou troca da resina.
Limpeza do material de laboratório
A utilização de material limpo é fundamental para a qualidade dos resultados, pois a
introdução de contaminantes pode inibir ou potencializar as reações de modo indesejável.
Os contaminantes no material de trabalho poderão atuar como reagentes adicionais, que
irão agir como inibidores ou ativadores e até mesmo podem ser da mesma qualidade do
analito, produzindo resultados falsamente elevados.Os diversos procedimentos no
laboratório podem requerer formas distintas de limpeza do material. Assim, na dosagem de
traços de elementos como cálcio, ferro, cobre e outros, deve-se tratar a vidraria com ácido
clorídrico a 50% ou nítrico a 30% e lavar exaustivamente com água de torneira e água
deionizada.

Entretanto, um modelo básico que tem aplicação geral no laboratório pode ser proposto.
Em primeiro lugar devemos nos preocupar com a prevenção, para impedir que reagentes e
proteínas fiquem aderidos a pipetas, ponteiras e tubos de ensaio.

A vidraria deve ser imersa, logo após o uso, em uma solução de detergente a 0,5 ou, no
máximo, a 1,0%. Soluções de detergentes muito concentradas dificultam sua remoção da
vidraria e os detergentes aderidos podem atuar como inibidores ou ativadores de outras
reações. A vidraria deverá ficar imersa na solução de detergente por um mínimo de 1 hora
ou tempo maior quando a contaminação for muito grande. As pipetas e tubos de ensaio
devem ser enxaguados exaustivamente com água de torneira e lavados pelo menos duas
vezes com água deionizada ou destilada. Secar em estufa a 80 °C.

As ponteiras, imediatamente após serem usadas, devem ser colocadas em um frasco de


boca larga, contendo solução de detergente a 0,5% ou de hidróxido de sódio a 1%. O frasco
deve ser suficientemente grande para permitir que todas as ponteiras fiquem imersas na
solução. Para lavar as ponteiras, tampar o frasco e agitar várias vezes por um período de
aproximadamente 30 minutos. Pode-se usar um agitador mecânico. Lavar em seguida,
exaustivamente, com água de torneira, usando o mesmo processo de agitação. Enxaguar
finalmente com água deionizada ou destilada e secar em estufa a 37 °C.

As cubetas devem ser lavadas com água deionizada, imediatamente após as leituras. As
cubetas usadas para as dosagens de ferro e cálcio, capacidade de ligação de ferro e
magnésio devem ser lavadas com ácido clorídrico ou nítrico e enxaguadas com água de
torneira e água deionizada. Cubetas de fluxo devem ser lavadas com solução de hipoclorito
de sódio a 1%, ou hidróxido de sódio a 1%. Lavar em seguida com água deionizada.

As multicubetas dos sistemas automáticos de análise devem ser colocadas, imediatamente


após o uso, em solução de detergente (0,5 - 1,0%), lavados então com água de torneira e
enxaguadas com água destilada ou deionizada. Secar em estufa a 37 °C.

Como a limpeza de ponteiras e multicubetas é uma tarefa difícil e trabalhosa, muitas vezes
não garantindo a limpeza química do material, deve-se avaliar a relação custo benefício
entre executar esta tarefa ou descartar estes materiais.
Reações

As reações correspondem ao resultado da atuação de um ou mais reagentes sobre o analito


para formar o produto. Existem vários modelos de reação e aquele a ser escolhido para
determinado sistema analítico irá depender dos reagentes a serem utilizados ou disponíveis
e das facilidades instrumentais.

Reações de aglutinação

Utilizam partículas ligadas a antígenos ou anticorpos que reagem com um analito


produzindo uma reação visível a olho nú ou ao microscópio. Nos formatos analíticos
utilizando microplacas a aglutinação se manifesta pela formação de um tapete no fundo da
escavação, enquanto a ausência de aglutinação é mostrada por uma deposição das partículas
em forma de botão. Em muitas reações de aglutinação utiliza-se o modelo da inibição de
aglutinação e as reações positivas se manifestam pela ausência de aglutinação.

Reações de turvação e precipitação

Ocorrem por precipitação de um analito, na maioria das vezes uma proteína, por ação de
um reagente, que pode ser químico ou um anticorpo. As turvações podem ser observadas
visualmente ou medidas por fotometria ou nefelometria e, nestes dois casos, a proteína
precipitada permanece na forma de suspensão. As precipitações podem ocorrer em meio
sólido ou líquido e quase sempre são analisadas visualmente.

Reações colorimétricas

São aquelas em que os produtos formados têm uma cor e as intensidades das cores são
medidas na faixa visível do espectro (380 - 680 nm).

Reações ultravioleta

São reações cujos produtos formados absorvem energia radiante ("luz") na porção do
ultravioleta próximo, mais especificamente em 365 ou 340 nm.

As reações colorimétricas ou ultravioleta podem ser utilizadas em vários modelos, como


reações de ponto final e reações cinéticas.

Reações de ponto fnal

As reações de aglutinação, turvação ou precipitação são, em muitas situações, reações de


ponto final, mas o termo é especialmente dedicado àquelas reações que formam um produto
cuja concentração chega a um ponto máximo, permanecendo inalterada por um
determinado tempo em função da estabilidade do produto. Estas reações podem ser
colorimétricas ou ultravioleta (UV). Um número bastante elevado de ensaios utiliza as
reações de ponto final e a concentração do produto formado é medida através de leituras
fotométricas. Podemos mencionar alguns exemplos, como as dosagens químicas ou
enzimáticas de ácido úrico, colesterol, glicose e triglicérides. A reação de ponto final é a
mais empregada no laboratório devido à sua flexibilidade de aplicação instrumental, pois
pode ser utilizada em metodologias manuais e automatizadas. Sua aplicação em métodos
manuais é facilitada pela estabilidade do produto da reação, permitindo ensaiar muitas
amostras simultaneamente, com a manutenção da qualidade nos ensaios.

A figura 1 mostra graficamente uma reação de ponto final.A divisão em três etapas mostra
o início e incremento na formação do produto, a etapa de estabilidade, e o decaimento do
produto por perda da estabilidade.

Figura 1: a: início da formação do produto; b-c: período de estabilidade onde a medida


fotométrica é realizada; c: perda da estabilidade do produto.

Reações cinéticas

São reações onde a velocidade da formação do produto é medida durante um intervalo de


tempo, que pode ser horas, minutos ou segundos e a denominação cinética é decorrente do
relacionamento da reação com o tempo. Muitos consideram que as reações cinéticas são
aquelas em que se mede a formação de produto usando pequenos intervalos de tempo,
minuto a minuto, na faixa ultravioleta do espectro (340 ou 365 nm). Estas reações, sem
dúvida, são cinéticas, mas também o são aquelas reações em que se mede a formação de um
produto em 5, 10 ou 30 minutos de incubação. As dosagens de fosfatase alcalina, amilase,
entre outras, são realizadas utilizando reações cinéticas. As reações que utilizam medidas
contínuas da formação de produtos, muitas vezes chamadas de espectrofotométricas, devem
ser denominadas "reações de cinética contínua".
A figura 2 mostra, graficamente, uma reação de cinética contínua, sendo também dividida
em 3 etapas para melhor entendimento do comportamento da reação.

Figura 2: a-b: fase inicial da reação onde a velocidade não é constante; b-c: reação com
velocidade constante onde pode-se obter as diferenças de absorbância/minuto (D 1 - D 9),
usadas para calcular o resultado; c: redução da velocidade de reação por consumo do
substrato.

As reações que utilizam um tempo fixo de incubação e a formação de produtos é


interrompida por qualquer processo, muitas vezes chamadas de colorimétricas, devem ser
denominadas mais corretamente como "reações cinéticas de tempo fixo".

Cada modelo de reação tem seus méritos, que vamos discutir a seguir, mostrando os
benefícios de cada um dos modelos metodológicos.

Vantagens da reação de cinética contínua:

1. Elimina o uso de brancos, porque a primeira leitura é usada como branco.


2. A monitorização frequente ou contínua da absorbância permite a verificação da
velocidade da reação, possibilitando, utilizar nos cálculos, os intervalos onde a
velocidade da reação é constante.
3. Os pequenos tempos de incubação minimizam possíveis inibições por produtos da
reação e também reduzem o tempo total de operações.
4. Os métodos são mais específicos porque a velocidade da reação, na maioria das vezes,
não é afetada por interferentes, tais como bilirrubina, hemoglobina ou turvação da
amostra.
5. Os métodos permitem eliminar dos cálculos da atividade enzimática ou da concentração
do analito a fase inicial da reação, onde a velocidade é dependente do sistema de
reações e pode não ser constante.
6. Muitas reações que utilizam o ultravioleta são mais facilmente adaptáveis a uma grande
variedade de determinações da atividade enzimática.
7. Extensa documentação clínica mostra excelente correlação entre os resultados das
dosagem de enzimas por reação de cinética contínua UV e o diagnóstico final.
8. Habitualmente, as reações têm melhor precisão.
9. São facilmente automatizáveis.

Um dos cuidados mais importantes nas reações de cinética contínua é o controle da


temperatura. Muitos usuários executam a reação em equipamentos desprovidos de controle
de temperatura, assumindo que a temperatura será de 25 °C. Em muitas situações a
temperatura dentro do fotômetro poderá estar acima ou abaixo de 25 °C, fornecendo
resultados falsamente elevados ou diminuídos. Quando não se dispõe de um fotômetro com
temperatura controlada, deve-se utilizar de reações cinéticas de tempo fixo.

Vantagens da reação cinética de tempo fixo

1. Como as reações são interrompidas após um tempo de incubação, pode-se processar


bateladas de testes.
2. Nos procedimentos manuais, o envolvimento dos técnicos é menor.
3. Não requer fotômetros com temperatura controlada, possibilitando a incubação em
banho-maria com temperatura constante.
4. Todas as dosagens de enzimas podem ser interrompidas, mas nem todas podem utilizar
uma reação de cinética contínua.
5. Quando a reação é colorimétrica, pode-se utilizar de um sistema de reagentes que
formam produtos com maior absortividade molar e obter uma sensibilidade melhor que
nas reações de cinética contínua.
6. Em muitos analisadores modernos podem ser facilmente automatizadas.
7. Pode-se, em muitos casos, utilizar padrões primários.
8. Nas reações que utilizam NAD/NADH, necessita-se de menor quantidade da coenzima,
reduzindo o custo do reagente.
9. As reações colorimétricas não requerem espectrofotômetros de alta resolução, podendo
ser aplicadas em colorímetros.
10. Em muitos casos pode-se eliminar as reações acopladas, muitas vezes necessárias nas
reações de cinética contínua, reduzindo os problemas de otimização e de custos de
reagentes.
11. Nas dosagens de amostras com elevada atividade enzimática, pode-se reduzir o tempo
de incubação e eliminar a diluição da amostra, que sempre introduz erros nos ensaios,
principalmente valores falsamente elevados.

As reações cinéticas de tempo fixo requerem também um rigoroso controle do tempo e da


temperatura de incubação, para que os resultados tenham a qualidade esperada. Um dos
erros mais comuns neste tipo de reação ocorre no controle do tempo de incubação. Deve-se
marcar o tempo no momento em que a amostra entra em contato com o substrato, que já
deve estar na temperatura de incubação, isto é, dentro do banho-maria. Quando houver
várias amostras a serem dosadas, pipetá-las com intervalos de tempo, 10 a 15 segundos.
Quando o tempo se completar, interromper a reação com os mesmos intervalos.
Um mesmo analito pode ser dosado tanto por uma reação de cinética contínua como por
uma reação de cinética de tempo fixo e podemos citar como exemplo a dosagem da g-
Glutamil Transferase.

As reações cinéticas são geralmente aplicadas nas dosagens de enzimas, mas podem ser
utilizadas para dosagem de analitos, habitualmente ensaiados por reações de ponto final. A
creatinina é comumente dosada com uma reação de ponto final, mas pode-se também
utilizar uma reação cinética de dois tempos. Neste caso, a reação de ponto final é aplicada
em metodologias manuais e a reação cinética é utilizada, principalmente, em metodologias
automatizadas. Outro analito medido por reações de ponto final e reações cinéticas é a
uréia.

Quando se dispõe de facilidades instrumentais para medidas fotométricas contínuas em


tempos reduzidos, pode-se medir em modo cinético de dois tempos vários analitos
habitualmente ensaiados por reações de ponto final. Se uma dosagem de glicose, usando a
enzima glicose oxidase, é medida em 15 minutos na reação de ponto final, pode-se realizar
a mesma dosagem usando um instrumento capaz de medir a reação em um tempo de 5
minutos ou menos, quando se tem a certeza de que as medições das amostras
desconhecidas, padrões e controles serão feitas no mesmo tempo de reação e que a
velocidade de reação é a mesma para amostras, controles e padrões.

As reações de cinética de dois tempos podem ser utilizadas para diminuir o tempo de
reação, reduzir a influência de interferentes (creatinina) ou estender a linearidade do
sistema analítico (uréia UV). Comumente, as reações cinéticas de 2 tempos utilizam a fase
inicial da reação com uma leitura aos 30 segundos, que servirá como branco, e outra leitura
aos 90 segundos. Utiliza-se então o DA correspondente a um minuto para calcular a
concentração do analito.

Figura 3: uma das diferenças de absorbância: (B-A, C-B ou D-C )


pode ser usada para cálculo do resultado.

A escolha da diferença mais adequada irá depender da melhor linearidade, da eliminação de


interferentes ou da melhor sensibilidade. Observar que a velocidade da reação é maior nos
tempos iniciais, onde logicamente a sensibilidade é maior.
Existem reações cinéticas de dois tempos em que os intervalos são maiores, como no caso
da frutosamina, quando é necessário um tempo mais longo na fase inicial para maximizar a
eliminação de interferentes. Deve-se enfatizar que o controle da temperatura também é
fundamental nas reações cinéticas de dois tempos.

As reações cinéticas de dois tempos são reações cinéticas de tempo fixo, em que a primeira
leitura é usada como branco e o tempo de incubação é reduzido para se obter melhor
desempenho ou agilizar o procedimento.

CONCLUSÕES
As reações representam a base do trabalho no Laboratório Clínico e o conhecimento dos
vários modelos é relevante para uma atuação adequada e intervenção em muitas
dificuldades técnicas encontradas no dia a dia do trabalho.

Para finalizar, procuramos sintetizar nas duas figuras abaixo, as principais reações
utilizadas no Laboratório, classificando-as de acordo com o produto ou o modelo da reação.

Figura.4: Reações Segundo o Produto Formado

Fig.5: Reações Segundo o Procedimento


Intervenção em problemas técnicos

Um problema técnico ocorre quando existe uma dificuldade em se obter o resultado de um


determinado ensaio ou quando a reação não se mostra com o desempenho adequado ou
esperado.

A criação de um modelo de orientação, capaz de identificar todas as causas de problemas e


com habilidades suficientes para indicar as formas de solução, é uma tarefa bastante difícil,
pois são inúmeras as causas e fatores responsáveis por problemas técnicos. Entretanto, estas
dificuldades não impedem a criação de um modelo experimental tentativo e com muitas
possibilidades de fornecer ajuda efetiva.

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Modelo experimental tentativo

A forma inicial para abordar um problema técnico consiste em definir o erro que está
ocorrendo, o que pode facilitar a identificação do problema e permitir sua correção
adequada.

Se os resultados de padrões ou de controles apresentam uma variabilidade muito grande,


seja nas dosagens em duplicata ou no dia a dia, está ocorrendo um Erro Aleatório.

Este erro pode ser devido às seguintes causas: amostra inadequada, erros na medida da
amostra, temperaturas ou tempos incorretos de incubação, técnica mal conduzida, vidraria
contaminada, defeitos no fotômetro e água de má qualidade.

Se os resultados mostram valores consistentemente elevados ou diminuídos, está ocorrendo


um Erro Sistemático, que tem como causas principais os seguintes fatores: amostras
inadequadas, seja por erros de medida, de conservação ou de preparo, temperaturas ou
tempos incorretos de incubação, erros de calibração, erros de comprimento de onda,
presença de interferentes, reagentes contaminados, inadequadamente conservados ou
preparados de modo incorreto, defeito no fotômetro, bias do analista e água de má
qualidade.

Quando ocorre um problema técnico, deve ser feito um esforço sistemático para encontrar a
causa e introduzir as medidas de correção.

Deve-se, em primeiro lugar, fazer uma revisão de todo o processo operacional, procurando
as causas mais óbvias como: pipetas utilizadas, principalmente a usada na medida da
amostra; avaliar se não houve omissão ou troca de reagentes; verificar o desempenho do
fotômetro e a correção dos cálculos dos resultados.
É evidente que um conhecimento adequado da metodologia, das causas de erro e a
experiência com a metodologia irão contribuir decisivamente para identificar as causas do
problema e encontrar um solução.

Deve ser criado um esquema de avaliação dos problemas, que, para conveniência, pode ser
dividido em 3 sub-unidades: pré analítica, intra-analítica e pós-analítica.

A idéia é estabelecer pontos de verificação em cada passo da metodologia, visando


identificar o erro e ajudar na solução do problema técnico ou de qualidade.

Cada método deve ter seu esquema próprio, pois eles diferem em etapas e procedimentos.
Relacionaremos a seguir um roteiro básico contemplando as três sub-unidades analíticas. É
evidente que etapas na sub-unidade intra-analítica deverão ser suprimidas ou inseridas.

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Etapa pré-analítica

Preparo do paciente

• paciente foi corretamente preparado?


• paciente está em uso de medicamentos provavelmente interferentes?

Obtenção da amostra

1. Foi conferida a identificação do paciente?


2. A amostra foi obtida no momento adequado?
3. Foi utilizado o anticoagulante correto?
4. A amostra foi preservada corretamente?
5. A identificação está correta? Não houve troca de amostras?

Processamento da amostra

1. As células foram separadas no tempo correto?


2. Foi realizada extração ou outro processo preparativo?
3. armazenamento foi correto (refrigeração, proteção da luz)?
4. A amostra está turva ou hemolisada e é adequada para o teste?

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Etapa intra-analítica

Passo 1 - Pipetagem da amostra

1. A vidraria e ponteiras estão corretamente limpas?


2. As ponteiras estão bem conservadas e são de boa qualidade, adequadas para a pipeta
automática?
3. Foi utilizada a pipeta correta?
4. procedimento de pipetagem foi correto, com a amostra pipetada no fundo do tubo de
ensaio?
5. Não houve troca de amostras?
Passo 2 - Adição do reagente n° 1

1. reagente foi corretamente preparado a partir da solução estoque (quando for o caso)?
2. reagente está dentro de sua validade e foi armazenado corretamente?
3. Ocorrem modificações visuais no reagente (turvação, precipitação, modificação da
cor)?
4. Foi pipetado o volume recomendado?
5. A mistura reagente/amostra foi correta?

Passo 3 - Adição do reagente nº 2

Mesmas observações do passo 2

Passo 4 - Incubação

1. tempo e temperatura de incubação estão corretos?


2. A adição de amostra ao substrato foi efetuada na temperatura de incubação?
3. Na dosagem de enzimas, após a mistura de amostra e substrato, foi observado o tempo
crítico de incubação?
4. nível de água do banho-maria estava superior ao nível de reagentes nos tubos de ensaio?

Passo 5 - Medida fotométrica

1. Foi realizada a manutenção preventiva do aparelho?


2. As funções Absorbância e/ou Transmitância estão operando corretamente?
3. Foram verificados os Zeros mecânico e elétrico?
4. A cubeta estava limpa e corretamente posicionada?
5. volume de reagente na cubeta foi suficiente para leitura?
6. filtro ou comprimento de onda estavam corretos?

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Etapa pós-analítica

Cálculos

1. Os cálculos estão corretos? Refazê-los, se feitos manualmente.


2. resultado está dentro da linearidade do método?
3. Foi feita diluição da amostra e a diluição não considerada no momento dos cálculos?
Curva de calibração ou fator

1. A curva de calibração ou fator estão corretos?


2. valor do fator está próximo daqueles anteriormente obtidos?
3. Foi feito arredondamento em fatores menores que 1,0?
4. Valores dos controles
5. Os valores dos controles estão dentro dos limites estabelecidos?
6. Observam-se tendências ou desvios na análise dos mapas de controle?

Resultados ou relatórios

1. Estão legíveis para impedir erros na interpretação?


2. Estão limpos, com datilografia de boa qualidade?
3. Não ocorreram erros de transcrição?
4. É possível comparar os resultados com o quadro clínico do paciente, para confirmação
de resultados fora da faixa de referência?

Os problemas técnicos ocorrem em situações inesperadas, muitas vezes em metodologias


que estão operando em condições estáveis no laboratório. Portanto, na ocorrência de uma
dificuldade com determinado método, deve-se procurar uma das causas de erro
mencionadas acima, para encontrar a solução para o problema.