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Extracção de ADN de plantas

Artigo - Janeiro de 2001

DOI: 10.1079/9780851995151.0239 - Fonte: OAI

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1 autor:

Robert James Henry

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 Capítulo 16

Extração de DNA de plantas

R.J. HENRY
Centre for Plant Conservation Genetics, Southern Cross
University, Lismore, Austrália

Introdução

A extração de DNA das plantas é o ponto de partida para a análise de

genótipos. A abordagem para a preparação do DNA das plantas é
determinada pela espécie, pelo tipo de tecido ou amostra disponível e pela
análise necessária no DNA. Por exemplo, a extração de DNA da folha de um
cereal para análise usando um teste robusto pode requerer uma técnica muito
diferente daquela necessária para o isolamento do DNA da casca de uma
árvore para análise de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado
(AFLP).
Este capítulo considera a variedade de técnicas disponíveis para extração
de DNA de plantas em relação à grande variedade de aplicações de
genotipagem de plantas. O processo global é definido na Fig. 16.1. As
amostras de plantas podem ser recolhidas e armazenadas, o ADN pode ser
extraído imediatamente ou analisado directamente. Amostras de plantas
armazenadas podem ser extraídas e o ADN pode ser armazenado antes da
análise ou ser subtraído à análise imediata.

Recolha e armazenamento de amostras de

plantas

O processo de isolamento do DNA da planta pode ser considerado como

tendo início quando a planta é amostrada no campo ou no laboratório. A
colheita e o armazenamento adequados são essenciais. A rotulagem também é
uma questão importante, especialmente quando um grande número de plantas
de amostra está sendo analisado.
A amostragem de pequenos pedaços de folhas de plantas para DNA foi
obtida usando pontas de pipeta plástica para perfurar um pequeno disco da
folha (Berthomieu e Meyer, 1991); o tecido pode então ser esmagado sobre
uma membrana de nylon (Langridge et al,
© CAB International 2001. Genotipagem de plantas: a impressão digital de DNA
de Plants (ed. R.J. Henry) 239
 24 R.J. Henry

ADN

ADN

ADN

Fig. 16.1. Análise de DNA de plantas. 1 A análise directa do ADN evita o isolamento do
ADN; 2 O isolamento imediato do ADN evita o armazenamento de tecidos; 3 A análise
imediata do ADN evita o armazenamento de ADN.

1991). Esta abordagem permite que um grande número de amostras seja

processado e armazenado. As amostras são frequentemente congeladas para
armazenamento. A amostra deve permanecer congelada até à extracção do
ADN, uma vez que o descongelamento do tecido congelado resulta muitas
vezes na degradação do ADN. Alternativamente, o ADN pode ser extraído de
material fresco ou tecido que tenha sido seco para armazenamento.

Análise de tecido fresco

Amostras frescas podem ser extraídas imediatamente ou armazenadas por

horas ou dias a temperaturas adequadas antes da extração. Refrigeração (4°C se
possível) geralmente permite que a extração seja adiada por vários dias.
Condições de armazenamento que não estimulam o crescimento de fungos
nestes tecidos são desejáveis. O álcool pode ser usado para ajudar a preservar
alguns tecidos para análise (Flournoy et al. , 1996). A análise de tecido fresco é
provavelmente a opção preferida para a extração de DNA na maioria dos casos.
 Análise de tecido seco

O armazenamento a longo prazo de tecido seco é possível para muitos tipos de

tecido (Savolainen et al. , 1995; Fu et al. , 1998). A abordagem mais simples
para a amostragem da maioria das folhas é colocar a folha fresca num saco
de papel e armazená-la num ambiente com ar condicionado. Qualquer
arquivo de escritório pode permitir o armazenamento de um grande número
de amostras (Thomson e Henry, 1993). A secagem forçada pode resultar na
ruptura do tecido e na degradação do DNA. As condições que produzem
amostras de herbário da melhor qualidade também resultam em boa
preservação do DNA. As sementes secas também podem ser usadas em muitos
estudos (McDonald et al. , 1994). A análise de amostras secas pode ser útil
quando amostras para um único estudo devem ser coletadas durante um
período prolongado. A secagem permite a extracção quando a amostragem
está completa.

Análise de ADN antigo

A análise do DNA antigo pode ser valiosa em estudos de evolução (Soltis e

Soltis, 1993; Cano, 1996). Podem ser necessários procedimentos especiais
para recuperar o DNA degradado nessas amostras e para evitar contaminação
(Yang, 1997; Yang et al. , 1997; Schlumbaum e Jacomet, 1998).

Análise da casca

Amostras de folhas podem ser muito difíceis de recolher de grandes árvores,

tornando a casca de árvore numa fonte atractiva de ADN. A extração de DNA
da casca pode ser muito mais diffi- cult do que a extração das folhas em
algumas espécies.

Análise de patógenos vegetais

O diagnóstico de doenças de plantas requer frequentemente a preparação de

amostras de plantas para a análise do ADN de agentes patogénicos. Foram
concebidos métodos para análise de fungos (Bonito et al. , 1995; Niepold e
Schober-Butin, 1997), bactérias (Mahuku e Goodwin, 1997; Llop et al. ,
1999; Toth et al. , 1999), vírus e fitoplasmas (Gibb e Padovan, 1994; Green
e Thompson, 1999).

Análise de pólen

A análise do DNA polínico pode ser de grande valor na genética da

população e no mapeamento genético. Métodos específicos têm sido
desenvolvidos para trabalhar com grãos de pólen únicos (Petersen et al. , 1996;
Krabel et al. , 1998).
 Análise de alimentos e outros produtos vegetais

A genotipagem da planta pode ter interesse nos alimentos, especialmente no

estabelecimento da precisão da rotulagem ou no processamento dos alimentos
para fazer corresponder os genótipos a prod- utos específicos. Técnicas de
extração de DNA foram desenvolvidas para muitos produtos. O DNA de
levedura, mas não de plantas, foi recuperado da cerveja (Hotzel et al. ,
1999). A identificação de produtos de cereais durante o processamento pode
ser baseada na análise de DNA (Henry et al. , 1997).

Extracção de ADN de material vegetal

As etapas que podem ser incluídas na preparação do DNA vegetal são

definidas na Fig.
16.2. Os componentes do processo podem incluir o isolamento de tecidos
específicos, a moagem (ou outra perturbação mecânica), a extracção em
solução, a purificação do solvente e a precipitação.

Componentes de soluções de extração de DNA

• Buffer. Os tampões são utilizados para controlar o pH da solução de

extracção.
• Sais. Os sais podem influenciar a solubilidade do ADN e de outras
moléculas na extracção.
• Agentes quelatantes. Agentes quelantes como os iões metálicos de ligação
EDTA na solução de extracção.
• Detergentes. Os detergentes ajudam a perturbar os tecidos. Muitos
detergentes diferentes têm sido empregados em protocolos de extração de
DNA de plantas.
• Agentes de ligação fenólicos. A PVP é frequentemente incluída para
proteger contra os fenólicos (Kim et al. , 1997). O ácido cítrico foi
adicionado a extratos para prevenir a for- mação de polifenóis (Singh et
al. , 1998).
• Outro. O carvão activado tem sido utilizado para ligar contaminantes na
isola-ção de ADN do café, borracha, mandioca e banana (Vroh-Bi et al. ,
1996).
• Enzimas. O uso mais comum de enzimas em procedimentos de
isolamento de DNA é a ribonuclease para remover o RNA
contaminante.
• Solventes. A água é o solvente usado em quase todos os protocolos.

Ruptura de tecidos

• Mecânica. A ruptura física do tecido permite que o ADN seja libertado para
a solução de extracção. O excesso de disrupção mecânica corre o risco
de tosquiar o ADN. O ideal é utilizar apenas a acção mecânica mínima
necessária para libertar o ADN do tecido. Tecidos vegetais duros podem
ser alvos difíceis para o isolamento do ADN de alto peso molecular.
 Planta

1
Isolar tecidos específicos

2 Moer em

Adicionar extratoíon de ação

solut 3

Extracção por solventes (por exemplo, fenol/clorofórmio)

4

Purifico (por exemplo,ation

et precipit
hanol ation)
5

preparação do ADN

Fig. 16.2. Isolamento de ADN. 1 Separa tecidos ricos em contaminantes (seleciona tecidos
ricos em DNA); 2 Quebra tecidos para liberar DNA; 3 Fornece meio para isolamento de
DNA; 4 Remove proteínas e outros contaminantes; 5 Purifica DNA.

• Aquecimento. O aquecimento, especialmente a altas temperaturas (por

exemplo, fervura), contribui para a ruptura dos tecidos.
• Microondas. O calor de microondas é uma opção para extrações rápidas
(Saini et al. , 1999).
 Métodos de extração com alto rendimento

A extracção de um grande número de amostras é possível através da

automatização. O processamento em placas de 96 poços de microtítulo pode
aumentar a produção (Dilworth e Frey, 2000). Estes procedimentos são de
valor em aplicações de melhoramento vegetal (Gu et al. , 1995). No futuro,
pode esperar-se uma maior automatização dos métodos de extração de DNA
de plantas, uma vez que a etapa de extração é limitada em muitas análises
baseadas em DNA em plantas.

Armazenamento de DNA de plantas

O ADN puro livre do risco de contaminação biológica pode ser armazenado por
longos períodos de tempo à temperatura ambiente. O armazenamento a baixa
temperatura é recomendado para o armazenamento a longo prazo,
especialmente de amostras valiosas.

Purificação do ADN

Há uma variedade de métodos disponíveis para a purificação do ADN.

Geralmente é melhor conceber um método para isolar o ADN com a pureza
necessária directamente da amostra de planta. Os protocolos que resultam no
isolamento do DNA com impurezas indesejáveis específicas devem ser
evitados. Em alguns casos, pode ser necessário purificar o DNA em um extrato
para aplicações específicas.

Requisitos de diferentes protocolos de genotipagem

A análise de microssatélites (repetições de seqüência simples) requer protocolos

relativamente simples de extração de DNA (Virk et al. , 1999) porque a PCR
envolvida é rela- tivamente robusta. Em contraste, o DNA polimórfico
amplificado aleatório (Boiteux et al. , 1999) e os procedimentos de AFLP são
influenciados pela quantidade e qualidade da preparação do DNA que requer
procedimentos de iso lação de DNA muito uniformes e geralmente mais
complexos. A preparação do DNA vegetal para o sequenciamento é outro
requisito comum (Nickrent, 1994). Aplicações envolvendo a análise de
grande número de amostras, como estudos de diversidade em grandes
coleções de germoplasma (Virk et al. , 1996) requerem protocolos especiais
de extração de DNA com alto rendimento.

Exemplos de métodos de extração de DNA

A literatura contém um número muito grande de protocolos de extração de

DNA. Muitos destes são pequenas variações de outros procedimentos
(Graham et al., 1994). Alguns tecidos são alvos especialmente difíceis para
extração de DNA (Steenkamp et al., 1994) devido à presença de materiais (por
exemplo, polissacarídeos, secundários, etc.).
metabólitos) que reagem com DNA ou co-purificam com DNA durante a
extração. O método descrito por Graham e Henry (1997) é amplamente
utilizado. O método a seguir é uma boa opção para aplicação geral.

Método padrão (Henry, 1997)

1. Triturar amostra para um pó fino em nitrogênio líquido usando um
almofariz e pilão.
2. Transferir o tecido para um tubo de tamanho adequado e adicionar 1 ml
de extracção
tampão (2% (p/v) brometo de hexadeciltrimetilamónio (CTAB), 100 mM
Tris-HCl, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA) por grama de tecido.
3. Misturar por inversão suave e aquecer a 55°C durante 20 minutos.
4. Centrifugação a 15.000 × g durante 5 minutos.
5. Transfira o sobrenadante para um tubo fresco e adicione um volume de
cloro...
forma:álcool isoamílico (24:1).
6. Misture por inversão suave durante 2 min e centrifugue a 15.000 × g
durante 20 s.
7. Transferir a fase aquosa superior para um tubo novo e adicionar 1/10 de
volume de
7,5 M de acetato de amônio e dois volumes de etanol gelado.
8. Misturar por inversão suave e colocar num congelador a -20°C durante 60
min.
9. Centrifugar a 15.000 × g durante 1 min e descartar o sobrenadante.
10. Lavar a pelota duas vezes com etanol a 70% (v/v), misturando cada vez
com
inversão.
11. Secar o ADN num exsicador.
12. O DNA pode ser ressuspendido em um volume apropriado de tampão TE
(10
mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) ou solução apropriada para a aplicação
pretendido.
Muitas aplicações não requerem um procedimento desta complexidade.

Procedimentos simples para uso em PCR

Screening

O método final é aquele que elimina completamente a etapa de extração do

DNA e permite a análise direta do DNA nos tecidos das plantas. Esta
abordagem tem sido bem sucedida em casos limitados. Quantidades muito
pequenas de tecido vegetal podem ser introduzidas directamente nos
protocolos PCR. Alguma forma de processamento é normalmente necessária
ou vantajosa. Klimyak et al. (1993) aquecido em álcali (40 µl de NaOH 0,25
M durante 30 s num banho de água a ferver), a solução foi neutralizada pela
adição de 40 µl de HCl 0,25 M e 20 µl de Tris-HCl 0,5 M, pH 8,0, 0,25% (v/v)
Nonidet P-40 e fervura durante 2 min antes da utilização em PCR. Neste
procedimento, o tempo de aquecimento pode requerer optimização para cada
espécie ou tipo de tecido. Este método tem sido aplicado na análise de tecidos
de cevada (Clancy et al. , 1996).
A maioria dos métodos rápidos tem envolvido a preparação de um
extracto para adicionar à PCR devido à dificuldade de amostragem de pequenas
quantidades de tecido para introdução directa na PCR e devido à presença de
substâncias inibitórias no tecido vegetal. Steiner et al. (1995) desenvolveram
um protocolo que envolveu
aquecendo a amostra moída durante 20 minutos a 90°C em 10 mM Tris-HCl,
pH 8,0,
312,5 mM EDTA, 1% lauryl sarkosyl sódio e 1% polivinilpolipirrolidona.
Chunwongse et al. (1993) aqueceu meias sementes a 50°C durante 1 h
em 200 µl de 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM KCl, 1.5mM MgC12, 0.01%
de gelatina, 0.45% de P-40 nãoidet, 0.45% de Tween e 12-48 µg de
proteinase K. A temperatura foi aumentada para 100°C durante 5 min antes
do uso do sobrenadante em PCR.
O melhor método é geralmente o método mais simples que dá um
resultado confiável. O seguinte protocolo foi desenvolvido como uma
abordagem geral para a preparação do DNA.

Método simples (Thomson e Henry, 1995; Henry, 1997)

1. Coloque um pequeno pedaço (0,5-1 mg funciona bem para a maioria

dos tecidos) da planta tis- processar em um tubo de microfuga.
2. Adicionar 20 µl de 100 mM Tris-HCl (pH 9,5), 1 M KCl, 10 mM EDTA.
3. Aqueça a 95°C durante 10 minutos.
4. Adicionar 1 µl directamente à PCR.
Estes extractos requerem normalmente diluição com água ou tampão PCR
antes de serem utilizados em PCR. Muitas vezes podem ser armazenados
durante vários meses à temperatura ambiente.

Remoção de contaminantes específicos

Contaminantes específicos podem ser removidos dos tecidos nos quais

causam sondas. Uma mistura de hidrolases glicosídicas tem sido usada para
remover os passeios de polissaca (Rether et al. , 1993). As trocas de íons
também podem ser usadas (Marechal-Drouard e Guillemaut, 1995).

Estimativa da quantidade de ADN

A concentração de DNA em um extrato pode ser medida de várias maneiras. O

A260 da preparação é uma boa medida de concentração se o DNA for rela-
tively puro (A260 = 1 para 50 pg ml1 DNA). As preparações impuras contêm
outro material absorvente na faixa de UV. A eletroforese em gel sobre a agarose
permite a esti-
mação tanto da qualidade como da quantidade. Também estão disponíveis
métodos fluorometicos para a estimativa do ADN. Estes são provavelmente
mais precisos do que os métodos baseados em UV, especialmente para
amostras impuras.

Estimativa da qualidade do ADN

A pureza do ADN pode ser estimada a partir da absorvância UV ( A260/A280 = 1,8

para ADN puro). A electroforese pode ser utilizada para avaliar o tamanho das
moléculas de ADN
em extractos. A digestão com enzimas de restrição é muitas vezes usada para
testar a pureza do DNA e a adequação para uso em protocolos de DNA
recombinante.

Isolamento de DNA de mitocôndrias e cloroplastos

O isolamento do ADN das organelas requer o isolamento prévio das organelas.

A centrifugação por gradiente de sacarose pode ser usada para separar
organelas específicas. O DNA pode então ser facilmente isolado da
preparação das organelas. O isolamento de organelas também pode ajudar a
evitar contaminantes específicos (Scott e Playford, 1996). Existem
procedimentos simples para análise do DNA cloroplástico (Fangan et al. ,
1994).

Agradecimentos

A pesquisa do autor nesta área tem sido apoiada pela Grains Research and
Development Corporation e pelo Cooperative Research Centre for Molecular
Plant Breeding.

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