Bioquímica I

2010/2011
Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose

Alunas: Andreia Sousa n.º 40261 Alexandra Salvado n.º 40267

29 de Março de 2011
1.º Ano - 2.º Semestre

Apresentação. o movimentam-se Imagem 2 Esquema de uma electroforese. neste caso. Quando as proteínas têm carga global negativa – pH superior ao pI da proteína para –. As macromoléculas. Tratamento e Discussão de Resultados Tira de acetato de celulose obtido na electroforese 1 – Albumina 2 – Globulinas 1 3 – Globulinas 2 4 – Globulinas  5 – Globulinas  6 – Ponto de aplicação Imagem 1 Tira de acetato de celulose obtida na electroforese (após a transparentização). eléctrodo com carga 29 de Março de 2011 . vão se movimentar no sentido oposto à sua carga (num determinado valor de pH). quando têm carga global positiva – pH inferior ao pI da proteína para –.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 2 1. o movimentam-se eléctrodo com carga positiva (ânodo). proteínas. Interpretação do electroforama obtido A electroforese envolve o movimento de espécies carregadas em solução sob a acção de um campo eléctrico.

29 de Março de 2011 . e inversamente proporcional ao tamanho da molécula e à viscosidade do meio (ɳ) em que se processa a electroforese. No entanto. Se o pH da solução for superior ao pI (ponto isoeléctrico). No soro de coelho normal estão presentes 15 proteínas que influenciam o modelo electroforético. a proteína ficará com carga global negativa (logo irá mover-se para o ânodo). a proteína ficará com carga global positiva (logo irá mover-se para o cátodo). A mobilidade electroforética (µ) de um composto é definida como sendo igual à sua velocidade de migração (v) por unidade de intensidade de campo eléctrico aplicado (E). q.6 todas migram para o ânodo. a proteína ficará no ponto de aplicação. é válida a relação: A carga das proteínas. Globulinas 1. Se o pH for igual ao pI. Globulinas . Esta grandeza é inversamente proporcional à carga. Globulinas 2. Se o pH da solução for superior ao pI. No caso de a molécula ser esférica. que lhes confere a mobilidade numa electroforese. Como todas as proteínas ficam com carga global negativa quando em solução tampão a pH 8. logo a amostra foi aplicada perto do cátodo pois assim seria mais fácil observar a diferença entre as bandas. como apresentam mobilidades semelhantes geralmente apresentam apenas 5 bandas distintas:      Albumina. depende do valor de pH da solução tampão em que se encontram. já que a sua carga global será nula – logo não migrará para nenhum eléctrodo.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 3 negativa (cátodo). Globulinas . com um raio r.

9 – 6.3 – 7.6 29 de Março de 2011 .0 4. Quadro 1 Quadro com a massa relativa de cada proteína.as suas concentrações no plasma são menores. então. Verifica-se.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 4 Na tira de acetato de celulose apresentada acima (Imagem 1) é possível observar 5 bandas distintas. No entanto.9 4. o factor de diferenciação das moléculas na tira vai ser a massa molecular relativa. como a que tem menor massa relativa é a albumina e é nesta que a diferença entre o pH e o pI é maior. que a banda correspondente à albumina é a de cor mais intensa – pois está presente no plasma em maiores concentrações – e as menos intensas são as globulinas α. é a albumina a proteína que mais migra. quando as cargas das proteínas são semelhantes. .  (esta última é a que apresenta uma diferença entre o pH e o pI menor e a que tem maior massa). 2. β e  . Pode-se também verificar que as intensidades das cores são diferentes.3 6. sendo seguida pelas globulinas 1.5 11.5 6. Quanto maior a diferença entre o pH e o pI e menor a massa relativa da proteína mais esta migra.0 66 000 40 000 – 60 000 100 000 – 400 000 110 000 – 120 000 150 000 – 400 000 4. devido às concentrações em que estão presentes no plasma. Proteínas Nível no plasma (g dm-3) Mr pI aproximado Albumina Globulinas 1 Globulinas 2 Globulinas  Globulinas  40. o seu nível no plasma e o seu pI.5 8. Assim.

Tira nº Tempo(min) 0 I (mA) 9 13 14 15 6 3 1 2 3 4 5 6 45 50 60 70 90 100 No inicio da electroforese.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 5 Justificação do aumento da intensidade de corrente ao longo da electroforese Quadro 2 Medição da amperagem. pois a área por onde passa a corrente eléctrica é maior (pela equação é a corrente eléctrica. 6 mA. é a área. registada pelos diferentes grupos. O aumento da intensidade de corrente deve-se não só ao número de tiras. logo ligou-se os eléctrodos da tina à fonte de alimentação e regulou-se a diferença de potencial para 200V. onde é a carga) como também ao aumento da temperatura (devido a energia dissipada) que 29 de Março de 2011 . Para que elas começassem a migrar era necessário criar uma diferença de potencial entre eles (um tinha de ficar com carga positiva – ânodo – e outro com carga negativa – cátodo). ao ligarmos os dois compartimentos através da tira de acetato de celulose houve uma corrente eléctrica no sentido do cátodo para o ânodo. Durante a realização da electroforese verificou-se um aumento da intensidade de corrente. Esta corrente só existe enquanto houver diferença de potencial entre os compartimentos – para que continue a existir corrente eléctrica é necessário manter ligada a fonte de alimentação. os dois compartimentos (que continham solução tampão) tinham a mesma carga. Como consequência. logo as proteínas não migravam. como se pode observar no quadro 2. é a velocidade de impulso e . a tempos de exposição à intensidade de corrente diferentes.

no final da electroforese. e. Quando se retirou as tiras de acetato de celulose. Quando se retirou a terceira tira (no total de seis) é possível observar que a intensidade de corrente começou a baixar. sendo à intensidade da corrente) para uma diferença de potencial constante e uma diminuição da resistência. pela lei de Ohm ( que corresponde ao potencial eléctrico. Este reagente permite corar as proteínas. estas foram mergulhadas em solução de Ponceau S. 29 de Março de 2011 . pois liga-se aos grupos amina (carregados positivamente) e às regiões apolares da proteína. o que se traduz numa diminuição da resistência. bem como determinar a que estava em maior ou menor concentração – a com cor mais intensa é que existia em maior concentração. portanto. o aumento da Função do Ponceau S Imagem 3 Fórmula estrutural da solução de Ponceau S. A coloração das proteínas tornou possível visualizar com maior facilidade as cinco bandas referidas acima. Desta forma. numa tira de acetato de celulose é possível observar bandas vermelhas (que são as proteínas coradas) num fundo transparente. isto deve-se ao facto de haver menos tiras a ligar os dois compartimentos (a área por onde passa a corrente eléctrica é menor).Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 6 tem como consequência uma diminuição da viscosidade da solução tampão. à resistência e . aumenta a intensidade da corrente mobilidade dos iões na solução.

O tempo pré-definido fora os 45 minutos – tempo ao qual foi retirada a primeira tira. aproximadamente. Tiras 1 (45 minutos) Resultado 2 (50 minutos) 3 (60 minutos) 4 (70 minutos) 5 (90 minutos) 6 (100 minutos) A electroforese realizada na aula prática foi deixada a decorrer durante tempos diferentes para os diferentes grupos.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 7 Comparação dos resultados obtidos pelos diferentes grupos Quadro 3 Resultados obtidos pelos diferentes grupos. A partir daí as tiras foram retiradas de 10 em 10 minutos. 29 de Março de 2011 . de modo a podermos comparar os resultados da eficiência de uma electroforese.

também esteve exposta a uma menor intensidade 8 29 de Março de 2011 . Esta tira. Por esse motivo. retirou-se a quinta tira. Aos 100 minutos. No entanto. foi retirada a segunda tira. Após 90 minutos desde que se retirou a primeira tira. nesta tira também não foi possível distinguir com facilidade as 5 bandas das diferentes proteínas do soro de coelho e não se observou uma boa migração por parte das mesmas. assim como uma fraca migração das 5 proteínas. devido ao maior tempo de exposição. resulta numa fraca distinção das bandas. pelo que a corrente eléctrica a que esta tira foi exposta também foi fraca o que. foi retirada a sexta e a última tira. As bandas das proteínas não são claramente visíveis e são difíceis de distinguir (pouca migração das 5 proteínas) por esse mesmo motivo (fraca exposição à corrente eléctrica) Após 50 minutos do início da electroforese. Esta tira apresenta uma intensidade de corrente eléctrica semelhante à registada quando se retirou a quarta tira. Nesta tira podemos assumir que a corrente eléctrica foi mais fraca.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose O primeiro grupo foi aquele cujos resultados foram menos visíveis – a tira deste grupo esteve exposta a uma corrente eléctrica durante um curto tempo. somando ao pouco tempo da sua exposição. uma vez que havia menos tiras na tina de electroforese. Aos 70 minutos foi retirada a quarta tira. Dez minutos depois foi retirada a terceira tira. Aqui a intensidade de corrente era praticamente idêntica à que se verificava quando se retirou a primeira tira. Como esta tira esteve mais tempo exposta a uma passagem de corrente eléctrica. Esta tira ainda se apresentava na condição atrás mencionada: pouco tempo de exposição á corrente eléctrica. pelo que o factor determinante na distinção das 5 bandas e a sua migração foi o tempo. foi possível distinguir-se com alguma facilidade as diferentes bandas de proteínas assim como o diferente nível das suas migrações. quando comparada com as restantes tiras. podemos afirmar e observar que se conseguiu distinguir mais facilmente as 5 bandas distintas de proteínas e a migração das mesmas também foi mais eficaz. em semelhança às últimas duas.

. mais fácil se torna a distinção das bandas assim como o diferente grau das suas migrações. Lidel. o factor determinante na distinção das 5 bandas e a sua migração foi o tempo.. Freire. Lisboa. 2008 http://www.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 9 de corrente eléctrica e. Bibliografia   Quintas. Como esta tira esteve ainda mais tempo exposta a uma passagem de corrente eléctrica. Eds. podemos dizer que quanto mais tempo estiver exposta e mais forte for a passagem de corrente eléctrica.angelfire. Em conclusão. “Bioquímica – Organização Molecular da Vida”.J. A. M. 2. A. foi possível distinguir-se com mais facilidade as diferentes bandas de proteínas assim como o diferente nível das suas migrações. às 15:04 h) 29 de Março de 2011 ..pdf (2 de Abril de 2011. Halpern.com/clone2/fouad/techniques/ponceau_S_sol ution.P. mais uma vez.

para uma diferença de potencial constante e uma diminuição da resistência. Preveja as consequências das seguintes acções. Questões a desenvolver As instruções para a realização de uma electroforese em papel indicam que a amostra deve ser aplicada numa tira de papel 10x10cm. Ao usar um tampão com maior concentração aumenta-se a força iónica da solução. o que se traduz numa diminuição da resistência. pela lei de Ohm ( corresponde ao potencial eléctrico. à resistência e .5) 100mM na separação. Ao aumentar a força iónica da solução provoca-se uma super condutividade eléctrica que gera calor (energia dissipada). a viscosidade da solução tampão diminuiria bem como a sua resistência. aumenta a intensidade da corrente e.Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 10 3. Ao diminuir a resistência de acordo com a lei de Ohm ( . Ao não se ligar o sistema de refrigeração do aparelho a temperatura aumentaria logo. sendo que V corresponde ao potencial eléctrico. R à resistência e I à intensidade da corrente). portanto. Desta forma. não se ligou o sistema de refrigeração do aparelho. sendo que à intensidade da corrente) para uma diferença de potencial constante e uma diminuição da resistência. o que iria provocar que as proteínas mergulhassem na solução tampão. usou-se um tampão de fosfatos de sódio (pH 6. justificando:  Por engano. a electroforese decorreria mais rapidamente.  Por engano. aumenta a intensidade da corrente o que leva a que 29 de Março de 2011 .5) 1mM. Este calor tem como consequência uma diminuição da viscosidade da solução tampão. o aumento da mobilidade dos iões na solução. e sujeita depois a 10mA durante 1h a 0ºC. previamente impregnada de uma solução tampão de fosfato de sódio (pH 6.

Separação das Proteínas do Soro de Coelho por Electroforese em Acetato de Celulose 11 as proteínas da amostra possam atravessar totalmente a tira de acetato de celulose mergulhando na solução. situação que corresponde a equilíbrio. Este facto iria afectar os resultados da electroforese pois: 1.  Um compartimento do aparelho de electroforese tinha um volume maior de solução tampão do que o outro. podendo mergulhar na solução. Se num dos compartimentos houvesse um volume maior de solução tampão. Esta diferença de pressão conduziria a um movimento de iões da solução da zona de maior pressão para a de menor pressão. 2. 29 de Março de 2011 . até que a pressão nas duas extremidades da tira se igualassem. Se o sentido da migração das proteínas e o sentido do deslocamento do volume fossem opostos: as proteínas migrariam no sentido contrário ao que deveriam (sentido da sua carga) e por isso o resultado obtido seria errado. Se o sentido da migração das proteínas e o sentido do deslocamento do volume fossem iguais: as proteínas migrariam mais rapidamente. haveria a tendência para que esta se deslocasse no sentido de equilibrar os volumes. A diferença entre os volumes levaria a uma maior pressão na extremidade da tira de acetato de celulose em relação à outra extremidade.

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