AFİNİTE

KROMATOGRAFİSİ
 Kromatografi Nedir?

 Kromatografi, bir karışımda bulunan

maddelerin, biri sabit diğeri hareketli
olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki
fazlı bir sistemde ayrılması yöntemidir.
 Kromatografi
İlk kez Rus botanikçi
Mikhail Tsvett (1903)
tarafından geliştirilmiştir.
Tsvett bu yöntemi bitki
pigmentlerinin renkli
bileşenlerini ayırmakta
kullanılmıştır. Kullandığı
kolonda renkli bantlar
oluştuğundan, bu ayırma
yöntemine kromatografi
adını vermiştir.
 Afinite Kromatografisi
Arne Wilhelm Tiselius
1930 yılında afinite
kromatografisini
geliştirmiş ve 1945 yılında
Nobel ödülü almıştır.

Afinite kromatografisi,
araştırmalarda yaygın
olarak kullanılan bir
yöntemdir.
 Afinite kromatografisi ile ilgili çeşitli tekniklerin
geliştirilmesiyle bir çok alt kategoriler oluşmuştur

 Hidrofobik Kromatografi
 İmmünoafinite Kromatografisi
 Kovalent Afinite Kromatografisi
 Metal-Kelat Afinite Kromatografisi
 Membran Temelli Afinite Kromatografisi
 Lektin Afinite Kromatografisi
 Boya-Ligand Afinite Kromatografisi
Afinite
 Reseptör Afinite Kromatografisi
Kromatografisi
 Zayıf Afinite Kromatografisi
 Perfüzyon Afinite Kromatografisi
 Tiyofilik Afinite Kromatografisi
 Yüksek Performans Afinite Kromatografisi
 Afinite Yoğunluk Pertübasyonu
 Afinite Elektroforezi
 Afinite Kapiler Elektroforezi
 Afinite kromatografisi, biyolojik
aktiviteye sahip molekülün
özelliklerinden yararlanarak sabit,
spesifik ve dönüşümlü kompleksler
oluşturma ilkesine dayanır.
 Affinite Kromatografisi

Hedef protein
Katı destek
ligand +
materyali
 İnert katı destek materyali ve bu
destek materyale kovalent
bağlarla bağlanmış ligand sabit
fazı oluşturur.
 Hedef proteini içeren protein
çözeltisi bu sabit fazın bulunduğu
kolondan geçirilir.
 Geçiş esnasında liganda ilgisi olan
protein kolon içerisinde
tutuklanır, ilgisi olmayanlar
kolondan ayrılır.
 Ligand ve hedef molekül arasında
oluşan bağ dönüşümlü bir
karaktere sahip olduğu için,
liganda adsorblanan molekül ortam
koşulları değiştirilerek geri
alınabilir.
 Adsorblanan molekül sürekli fazın
pH, sıcaklık veya iyonik kuvvet
gibi kompozisyonları
değiştirilerek ya da üre, guanidin
gibi ajanlar kullanılarak da geri
alınır.
Afinite Kromatografisi

 Afinite kolonunun
katı destek
materyali ile
doldurulması.
Afinite Kromatografisi

 Hedef proteini de
içeren protein
çözeltisinin afinite
kolonuna verilmesi.
Afinite Kromatografisi

 Hedef protein ile

afinite ligandının
etkileşime girmesi.
Afinite Kromatografisi

 Bağlanmayan
proteinlerin
yıkanarak afinite
kolonundan
ayrılması.
Afinite Kromatografisi

 Zayıf bağlanan
proteinlerin de
yıkanarak
ayrılması.
Afinite Kromatografisi

 Liganda bağlanan
hedef proteinlerin
elüe edilmesi ile
saflaştırılmış
proteinlerin
ayrılması.
 Afinite Ligandları
Ligand Nedir?

 Biyomolekülün
spesifik ve dönüşümlü
bağlarla bağlandığı
moleküldür.
 Ligand ve hedef
protein arasında
moleküler kuvvetler ve
etkileşimler vardır.
Bunlar;
 iyonik bağ,
 kovalent bağ
 dipol dipol
etkileşimidir.
 Afinite ligantı seçiminde iki kriter aranmaktadır:

 Ligand katı destek materyaline tutunacak bir

fonksiyonel gruba sahip olmalıdır.
 Hedef proteine yeterince ilgisi olmalıdır.

 Ligand katı destek materyaline bağlanacak fonksiyonel

gruplara sahip değilse tutuklanmanın olabilmesi için bu
amaçla destek materyali ile ligand arasında köprü
vazifesi görecek uzatma kolları kullanılır.
Ligand Grupları Ligandın Etki Ettiği Gruplar

Enzim Substrat, inhibitör, kofaktör

Antikor Antijen, virüs

Lektin Polisakkarit, glikoprotein,

hücre reseptörü

Nükleik Asit Tamamlayıcı baz dizisi, histon,

nükleik asit, polimeraz, bağlayıcı
protein

Hormon, vitamin Reseptör, taşıyıcı protein

Ligand ile hedef molekül arasındaki
etkileşim çok zayıf ise adsorblanma
gerçekleşmez.
Ligand ile hedef molekül arasındaki
etkileşim çok kuvvetli olursa adsorblanan
proteinin elüe edilmesi zorlaşır.
 Boya Ligandları

 Cibacron Blue F3GA

 Procion Green HE4BD
 Cibacron Yellow 3-GP
Boyalar genellikle aromatik halkalardan oluşur.

Sulu çözeltide çözünürlük, sülfonik asit

grupları ile artırılır. Bu gruplar tüm pH
değerlerinde negatif yüklüdür.

Boyaların çoğu aromatik halkanın içinde veya

dışında azot içerirler.

Bazı boyalar karboksilat, amino, klorür ya da

metal kompleks grupları içerirler.
 Tekstil boyaları değişik proteinlerin, substrat,
koenzim veya efektörleri için proteine onlardan daha
fazla ilgi duyan inhibitörleridir.
 Bazı boya maddeleri yapı olarak nükleotid
kofaktörlerine benzerler ve bu kofaktörlerle
birleşebilen bir çok enzim ile spesifik olarak
etkileşime girerler. Binlerce çeşit protein immobilize
tekstil boyaları ile etkileşime geçebilmektedir
(örneğin: oksidoredüktazlar, fosfokinazlar,
hidrolazlar, çeşitli transferazlar, mono ve
polinükleotitler v.b.).
 Kromatografik çözücüler, içerisinde bulundurulan
düşük konsantrasyonlarda Zn+2, Co+2, Cu+2 ya da Ni+2
gibi katyonlar bir takım proteinlerin kolonda
tutulmasına yardımcı olurlar. Proteinlerin kolondan
ayrılması işlemi, ortama kelatlama ajanlarının verilmesi
ile gerçekleştirilir.
 Protein Saflaştırmada Boya Ligandlarının
Kullanım Avantajları

 Ekonomik ve kolaylıkla bulunabilir olma

 İmmobilizasyon kolaylığı
 Matriks aktivasyonu esnasında toksik ve zararlı
madde kullanılmayışı
 Aktivite kaybı olmadan adsorbantın saklanabilmesi
 Temizlenip sterilize edildikten sonra tekrar
kullanılabilme
 Ölçek büyütme kolaylığı
 Yüksek kapasite
Katı Destek Materyali ( Matriks)

Matriksin doğru seçimi, ligand ve matriksin kovalent

bağlarla bağlanması önemlidir.
 İdeal bir matriksin özellikleri;
1) Kullanılan çözelti ve tamponlarla çözünme göstermemelidir.
2) Yeterli geniş yüzey alanı
3) Yüksek sağlamlık ve uygun partikül formu
4) Sıfır adsorbsiyon kapasitesi
5) Adsorbsiyon, desorbsiyon ve tekrar elde etme gibi
bağlanmayı gerektiren koşullarda kimyasal kararlılık
6) Mikrobiyel ve enzimatik saldırılara karşı dayanıklı
7) Hidrofilik karakter
8) Afnite ligandının bağlanmasına uygun kimyasal yatkınlık
 Matriks Çeşitleri
1) Aktive Edilmiş Matriksler
2) Amino Asit Reçineler
3) Avidin / Biyotin Matriksi
4) Karbonhidrat Bağlı Matriksler
5) Karbonhidrat Matriksleri
6) Boya Ligandı Reçineleri
7) Glutatiyon Reçineler
8) Heparin Reçineler
9) Hidrofobik Etkileşimli Reçineler
10) İmmünoafinite Matriksler
11) İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi Matriksleri
12) Nükleotid / Koenzim Reçineler
13) Protein A / Protein G Matriksleri
14) Özel Reçineler
 Aktive Edilmiş Matriksler
Bağlanma Çeşidi;
Reçineye Grubun Reaksiyon
Aktivasyon Reaktif Grup Bağlanmanın
Bağlanma Spesifisitesi Koşulları
Stabilitesi

Carbamate; good
Carbonyl- Imidazole
Carbamate Amine pH 8-10 stability below
dimidazole Carbamate pH 10

Cyanogen Final Cyanate Isourea;

Amine pH 8-9.5
Bromide isourea ester moderately stable

SH>NH2> pH 7-8 SH Thioether sec

Epichloro-
Ether Epoxy pH 9-11 NH2 amine ether; all
hydrin OH pH >11 OH very stable

SH>NH2> pH 7-8 SH Thioether sec

Epoxy (bis) Ether Epoxy pH 9-11 NH2 amine ether; all
OH pH >11 OH very stable
 Avidin / Biyotin Matriksi
Avidin, kofaktör biyotine karşı yüksek bir afiniteye
sahiptir. Bu karakteristik özellik ayırma ve
saflaştırmada kullanılan tek ve güçlü bir araçtır.

Avidin ve biyotin arasındaki güçlü etkileşimin tek

dezantajı iyi bir dissosiyasyon için şiddetli
denatürasyon koşullarına gereksinim duyulmasıdır.

Bunu engellemek için avidinden daha kolay koşullar

altında dissosiye olan 2-iminobiyotin gibi biyotin
türevleri kullanılabilir. Alternatif bir çözüm yolu da
biyotine doğal tetramerden daha düşük afiniteye sahip
monomerik avidinin kullanılmasıdır.
 Karbonhidrat Bağlı Matriksler

Lektinler şekerlere bağlanma ve hücreleri aglütine

etme yeteneğine sahip proteinlerdir.
Lektin reçineleri ;
• Polisakkaritleri saflaştırmak
• Hücre parçalarını fraksiyone etmek
• Glukoproteinler ve diğer glukokonjuge molekülleri
saflaştırmak
• Bir protein çözeltisinden karbonhidrat içeren
safsızlıkları uzaklaştırmak, için kullanılır.
Sugar Specificity Lectin
β-D-gal(1-3)-D-galNAc Arahis hypogaea (Peanut)

Methyl-α-D-gal Artocarpus integrifolia (Jacalin)

α-D-man, α-D-glc Concanavalin A Type VI (Con A)

α-D-man, α-D-glc Succinyl Concanvalin A

Nonreducing end of terminal α-D- Galanthus nivalis (Snowdrop)

mannosyl residue of glycoconjugates
D-galNAc Glycine max (Soybean)

D-galNAc Helix pomatia (Roman or edible snail)

α-D-man Lens culinaris (Lentil)

Oligosaccharide Phaseolus vulgaris PHA-E (Red kidney bean)

(D-glcNAc)2, NeuNAc Triticum vulgaris (Wheat germ)

α-L-fuc Ulex europaeus UEA-1 (gorse of Furze)

 Hidrofobik Etkileşimli Reçineler
Hidrofobik kromatografi, proteinlerin hidrofobisite
temeline dayanan ve proteinlerin ayrılmasında ve
saflaştırılmasında kullanılan çok yönlü bir tekniktir.
Kolonda yüksek iyonik güç gibi hidrofilik etkileşimler
gerçekleşir.

Hidrofobik jeller 3 fonksiyonel grupta toplanabilir:

• Saf hidrofobik reçineler: Bu jeller stabil eter bağı ile

bağlı ligandlar içerirler ve hiç yüklü bölgeleri yoktur.
• Karışık reçineler: Bu jeller amino grubu ile bağlanmış
ligandlar içerirler ve bazı durumlarda yüklüdürler.
• Amino alkil reçineler: Bu jeller diğer fonksiyonel
gruplarla bağlanan hidrofobik kısımlar içerirler.
 IMAC Matriksleri

İmmobilize Metal Afinite Kromatografisi farklı

kelatlarla çeşitli proteinlerin etkileşimine dayanan
bir protein ayırma prosesidir. Bu etkileşimler:
• Belirli aminoasitlerin proteinlerdeki relatif
miktarları ve yerleşmesine (histidin, sistein,
tirozin ve triptofan)
• Kullanılan metal miktarlarına bağlıdır.

Genellikle kullanılan metaller: bakır, çinko, demir ve

nikeldir.
Metal Uygulama

Kobalt Purification of HIS-tagged proteins

Nikel Purification of HIS-tagged proteins

Usually for purification of HIS-tagged proteins and

Bakır histidine containing peptides

Çinko Usually for the purification of HIS-tagged proteins

Demir Purification of Phosphopeptides

Galyum Purification of Phosphopeptides

 Protein A / Protein G Matriksleri
Protein A ve protein G çeşitli immünoglobulin-
lerin Fc parçalarına bağlanma gösteren
proteinlerdir. Protein A ve protein G
matriksleri;
• İmmünoglobulinlerin saflaştırılmasında
• Fab fragmanlarından (Immünglobulin
molekülünde bulunan, antijen bağlayan
fragman) Fc’nin ayrılmasında kullanılırlar.

Protein A ve protein G’nin farkları;

Protein A;
 Geniş tür reaktivitesi; insan, tavşan, inek ve
domuzun IgG ‘sine bağlanır.
 Monoklonal antikorlara karşı düşük bağlanma

Protein G
 Dar tür reaktivitesi; fare, sıçan ve keçinin
IgG’sine daha güçlü bağlanır.
 Monoklonal antikorlara karşı güçlü bağlanma
 Afinite Kromatografisi Prosesinin
Tasarımı
Elde edilmek istenen proteinin özelliklerine ve
proteinin hangi amaç için kullanılacağına göre
proses tasarımı önceden belirlenmelidir.

Örneğin; ticari kullanım için elde edilen protein-

lerin tamamen saf olmasına gerek yokken
terapötik proteinlerin yan etki ya da
immünolojik yanıt riskini minimize etmek için
%99,9’un üzerinde saf olarak elde edilmeleri
gereklidir.
Afinite kromatografisinin başarısını etkileyen faktörler

1) Ligand seçiciliği En önemli parametredir.

2) Geri kazanım Proses sonunda elüe edilen biyolojik olarak

aktif proteinin miktarını verir.

3) Verimlilik Prosesin maliyet etkinliğini etkiler.

4) Tekrarlanabilirlik Prosesin validasyonunun

yapılabilmesi için gereklidir.

5) Stabilite Kolonun sürekliliği ve prosesin maliyeti

etkilediği için önemli bir faktördür.
 Bu çalışmada; immobilize metal afinite kromatografisi
rekombinant insan büyüme hormonu somatotropinin
saflaştırılması için kullanılmıştır. Selüloz temelli kelatlama
destekleri, Granocel kelatı, Cu(II) ile yüklenmiş ligand
kullanılarak iki komatografi basamağı ile ham ekstakt ve
saflaştırılan çözeltideki proteinlerin bağlanma yeteneği
incelenmiştir.
 Bu çalışmada insan büyüme hormonunun Cu(II) yüklü kelatlama
destek materyaline karşı yüksek afinitesi olduğu bulunmuştur.
Granocel kelatı ile immobilize edilmiş metal afinite
kromatografisinin ilk basamağında proteinin % 80’i
saflaştırılmıştır.
 The Journal of Nutrition, Volume 136, Number 12 (December 2006)

Use of the affinity/HPLC method for quantitative estimation

of folic acid in enriched cereal-grain products
Rosalia Póo-Prieto et al

Bu çalışmanın amacı; takviye besinlerde bulunan folatlardaki folik

asit ve 5-metiltetrahidrofolatı güvenilir ve güçlü bir metotla ayırmak
ve miktarlarını belirlemektir.

Folatlar gıda örneğinden ekstrakte edilmiş, daha sonra da

ekstrakta 3lü enzim (a-amilaz, rat plazma konjugaz, & proteaz)
uygulanmıştır. Bu uygulamadan sonra afinite kromatografisi ile
saflaştırma yapılmıştır.

Folik acid ve 5-metiltetrahidrofolatı ayırmak ve miktarlarını

belirlemek için de UV dedektörlü ters faz HPLC kullanılmıştır.
 Bu çalışmada, etanol fraksiyonlama ya da iyon değişim
kromatografisi ile ön saflaştırma işlemi yapılmış daha
sonra plazma proteinleri afinite kromatografisi ile
saflaştırılmıştır.

 Afinite kromatogtafisi Faktör VIII, Faktör IX, von

Willebrand Faktör, Protein C, Antitrombin III ve
Faktör XI konsantratları gibi çeşitli lisanslı terapötik
plazma ürünlerinin üretiminde kullanılmıştır. Bu amaçla
en çok kullanılan ligandlar heparin, jelatin, mürin
antikorları ve az miktarda Cu+2’ dir.
 Bu çalışmada; insan
plazmasından immünoglobulin-
G’nin (IgG) en etkili ve en
ucuz yolla adsorbsiyonu için
bentonit-histidin mikro
komposit (Bent-His) afinite
sorbentlerinden
yararlanılmıştır. Afinite
ligandı L- histidin bentonitle
kovalent bağlanarak
reaksiyona sokulmuştur.

 Bent-His mikro komposit afinite sorbenti kullanılarak sulu

çözeltiden 15,6 mg/g düzeyinde yüksek bir adsorbsiyon elde
edilmiştir. En fazla IgG adsorbsiyonu pH 7’de görülmüştür.
Kaynaklar
 Yılmaz, F., Supermacroporous hydrophobic affinity
sorbents for protein chromatography, (2008).
 Durdu, A., Yüksek performanslı sıvı kromatografisi için
afinite sorbenti tasarımı ve kromatografik
karakterizasyonu, (2004).
 Porath, J., 1974, Methods of Enzymology, 34, 13.
 Turkova, J.,1999, Journal of chromatography B:
Biomedical sciences and Aplications 722 (1-2)
 Kline, T., Handbook of Affinity Chromatography.
 The Prinsible of Affinity Chromatography, Amersham
Bioscience