Biologia Molecular

Aplicada à Biomedicina
Técnicas Básicas e Avançadas de Biologia Molecular

Responsável pelo Conteúdo:

Prof.ª Me. Thaís de Oliveira Cardoso

Revisão Técnica:
Prof.ª Dr.ª Gabriela Cavagnolli

Revisão Textual:
Prof.ª Dr.ª Selma Aparecida Cesarin
 Técnicas Básicas e Avançadas
de Biologia Molecular

• Genes Silenciadores e a Importância do RNAi na Regulação Gênica;

• O RNAi como Ferramenta Experimental;
• Vias de Sinalização;
• Interações Proteína-Proteína;
• Do Sequenciamento de Sanger ao Sequenciamento Genômico
de Última Geração,
• Microarranjo de DNA e RNA-seq – Análise da Expressão Gênica;
• Tecnologia do DNA Recombinante;
• PCR em Tempo Real Quantitativo;
• Eletroforese em Gel de Agarose Separa Moléculas de DNA
de Diferentes Tamanhos;
• Espectrometria de Massas.

OBJETIVO

DE APRENDIZADO
• Compreender as principais Técnicas de Biologia Molecular e suas aplicabilidades.
UNIDADE Técnicas Básicas e Avançadas de Biologia Molecular

Genes Silenciadores e a Importância

do RNAi na Regulação Gênica
Existe um grupo especial de pequenos RNAs não codificadores que fazem a inter-
ferência de RNA (RNA de interferência – RNAi).
Esses pequenos RNAs de fita simples, com 20 a 30 nucleotídeos, por meio de pa-
reamento de bases, ligam-se a outros RNAs na célula e, sendo esses mRNA maduros,
são capazes de inibir a tradução desse alvo ou até mesmo induzir a sua destruição.
Há três principais classes de RNAs não codificadores pequenos que atuam des-
se modo – micro-RNAs (miRNAs), pequenos RNAs de interferência (siRNAs) e
RNAs que interagem com piwi (piRNAs).
Os micro-RNAs (miRNAs) parecem regular pelo menos um terço de todos os ge-
nes codificadores de proteínas. Os miRNAs são sintetizados pela RNA-polimerase II
e também são submetidos à adição de quepe e de poliadenilados.
Seguidamente, sofrem um tipo especial de processamento, após o qual o miRNA
é acoplado a um conjunto de proteínas, formando o complexo de silenciamento
induzido por RNA (RISC, do inglês RNA-induced silencing complex) (Figura 1).

Figura 1 – RNA de interferência – RNAi

Fonte: Adaptado de Wikimidia Commons

O RISC possui um componente denominado Argonauta, que encaixa a região 5’

do miRNA, posicionando-a de forma a otimizar o pareamento com outra molécula
de RNA. Isso permite a busca pelo mRNA-alvo com sequência complementar.
Caso haja um extenso pareamento, o mRNA é clivado em pedacinhos pela prote-
ína Argonauta, ocorrendo, inclusive, remoção da cauda poli-A, tornando-o exposto
a exonucleases.
Após a clivagem do mRNA, o RISC é liberado e pode procurar outros mRNAs
adicionais, atuando cataliticamente para destruir muitos mRNAs complementares.

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 Em contrapartida, se o pareamento de bases entre o miRNA e o mRNA é menos
extenso, o que ocorre na maioria dos miRNAs humanos, o Argonauta não faz a
clivagem em pedacinhos do mRNA, mas a tradução do mRNA é reprimida e, even-
tualmente, pode ocorrer a perda da cauda poli-A, remoção do quepe e degradação.
Um único miRNA pode controlar centenas de mRNAs diferentes, visto que sua
atuação consiste em uma pequena sequência complementar. Uma vantagem na utili-
zação do miRNA para regulação da expressão é que ocupa um espaço pequeno no
genoma quando comparado a uma proteína.
Além disso, também servem como mecanismo de defesa: elas orquestram a de-
gradação de moléculas de RNA estranhas, especialmente aquelas que ocorrem em
forma de fita dupla.
A presença de RNA de fita dupla livre desencadeia a RNAi pela atração de um
complexo proteico contendo Dicer, uma nuclease que processa miRNA.
Esse complexo proteico cliva o RNA de fita dupla em pequenos fragmentos (de
aproximadamente 23 pares de nucleotídeos) chamados de pequenos RNAs de inter-
ferência (siRNAs, do inglês small interfering RNAs).
Esses siRNAs de fita dupla são ligados pelo Argonauta e outros componentes do
RISC, em que fita duplex de RNA é clivada pelo Argonauta e descartada.
A molécula de siRNA de cadeia simples que permanece, direciona o RISC de
volta para moléculas de RNA complementares estranhas que são potencialmente
danosas, e o Argonauta cliva essas moléculas, levando à sua rápida destruição.
Um terceiro sistema de interferência de RNA se baseia nos piRNAs (RNAs que
interagem com piwi – uma classe de proteínas relacionadas ao Argonauta).
Os piRNAs são produzidos especificamente na linhagem germinativa, na qual
eles bloqueiam o movimento de elementos transponíveis. Uma vez formados, os piR-
NAs procuram os alvos de RNA por pareamento e, de forma muito semelhante aos
siRNAs, silenciam em nível transcricional genes intactos de transposons e destroem
qualquer RNA (incluindo mRNAs) produzido por eles.

Teste seu conhecimento

• Quais são as principais classes de pequenos RNAs não codificadores? Qual é a função
de cada uma?
• O que é RNA de interferência?
• Qual é a função da proteína agronauta?

O RNAi como Ferramenta Experimental

A partir dos RNAi, desenvolveu-se uma ferramenta que revolucionou o estudo de
biologia molecular, de forma que, experimentalmente, tornou-se possível que quase
qualquer gene seja inativado evocando a resposta de RNAi para ele.

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Isso permite diversas abordagens, como, por exemplo, silenciando determinado

gene você observa o que se modifica no funcionamento celular e, consequentemente,
há uma predição da função que esse gene exerce.
Além disso, há um grande potencial para o tratamento de doenças humanas,
principalmente, as decorrentes de mutação de um gene único. Assim, é possível a
introdução de moléculas complementares de siRNA.

“RNA de interferência (RNAi) – Os pioneiros”: Pesquisadores moldaram a visão do que o

RNAi pode significar para a Medicina e lançaram as bases que transformariam a esperança
do tratamento com RNAi em realidade. Disponível em: https://youtu.be/VlhIAWwSUxM

Recentemente, uma descoberta foi ainda mais reveladora, verificando que muitas
espécies de bactérias usam um repositório de pequenas moléculas de RNA não co-
dificadoras para procurar e destruir o DNA de vírus invasores. Esse mecanismo de
defesa, conhecido como CRISPR, possui muitas das características observadas para
miRNAs e siRNAs.
No entanto, há duas diferenças importantes – quando bactérias são infectadas
pela primeira vez por um vírus, elas apresentam um mecanismo que leva pequenos
fragmentos desse DNA viral a se integrarem nos seus genomas.
Isso funciona como se fosse uma vacina natural, no sentido de que eles se tornam mol-
des para a produção de pequenos RNAs não codificadores, denominados crRNAs (CRIS-
PR RNAs), que destroem o vírus caso ele reinfecte os descendentes da célula original.
Outra diferença é que, no Sistema CRISPR, esses crRNAs passam a se associar a
proteínas especiais, e o complexo procura e destrói moléculas de DNA de fita dupla,
em vez de moléculas de RNA de fita simples.

A animação disponível no link a seguir descreve o Método CRISPR-Cas9 para edição

de genoma – uma nova e poderosa Tecnologia com muitas aplicações em pesquisa
biomédica, incluindo o potencial para tratar doenças genéticas humanas.
Disponível em: https://youtu.be/2pp17E4E-O8

A Tecnologia de CRIPR-Cas9
Antes do recente desenvolvimento dessa Tecnologia, havia uma grande dificul-
dade para fazer um camundongo transgênico, sendo que se inseria a molécula de
DNA numa célula tronco embrionária, carregando um determinado gene alterado
experimentalmente que, recorrentemente, insere-se de forma aleatória no genoma,
tornando-se muito difícil rastrear a célula tronco embrionária individualmente para
encontrar uma que tenha a substituição gênica “correta”.
O uso do Sistema CRISPR, descoberto nas bactérias como defesa contra os vírus,
resolveu esse problema e se revelou como uma incrível ferramenta de edição gênica.

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 Ferramenta que permite editar genes pode ajudar a barrar infecção pelo novo coronavírus,
Disponível em: https://bit.ly/2ZJUtnb

Como vimos, esse Sistema utiliza uma sequência de RNA guia para se ligar ao
DNA de fita dupla por pareamento de bases complementares que, então, ele cliva.
O gene que codifica o componente-chave desse Sistema, a proteína bacteriana
Cas9, foi transferido para uma variedade de organismos, nos quais ele simplifica
muito o processo de produzir organismos transgênicos.
A estratégia é que a proteína Cas9 é expressa em células-tronco embrionárias
(ES) junto com um RNA guia desenhado pelo pesquisador para se ligar a uma deter-
minada localização no genoma.
A Cas9 e o RNA-guia se associam, o complexo é levado até a sequência-alvo no
genoma e a proteína Cas9 faz uma quebra na dupla fita.

Figura 2 – Sistema CRISPR/Cas9

Fonte: Adaptado de Arq Bras Cardiol., 2017, p. 82

Devemos recordar que as quebras da dupla fita, muitas vezes, são reparadas por re-
combinação homóloga e, neste caso, o molde escolhido pela célula para reparar o dano
é, muitas vezes, o gene alterado, que é introduzido nas células ES pelo pesquisador.
Dessa forma, o gene do organismo pode ser modificado de forma seletiva pelo sis-
tema CRISPR e substituído com alta eficiência pelo gene alterado experimentalmente.
Cas9 deve ser expressa apenas uma vez, mas muitos RNAs-guia podem ser ex-
pressos na mesma célula. Assim, essa estratégia permite ativar ou inativar um con-
junto inteiro de genes de uma só vez.
Muitos testes promissores têm sido feitos utilizando essa técnica como um possível
tratamento a algumas doenças genéticas.

CRISPR: edição de genes e mais além. Disponível em: https://youtu.be/4YKFw2KZA5o

Teste seu conhecimento

• O que é CRISPR?
• Como funciona a Tecnologia de CRIPR-Cas9? Qual é a função da Cas9?

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Vias de Sinalização
Uma característica fundamental à sobrevivência das células é sua capacidade de
responder às alterações no ambiente.
O estudo da sinalização celular está tradicionalmente focado nos mecanismos
pelos quais as células eucarióticas se comunicam umas com as outras pelo uso de
moléculas de sinalização extracelular, como hormônios e fatores de crescimento.
Algumas delas atuam a longas distâncias, sinalizando para células distantes; ou-
tras sinalizam apenas para células vizinhas.
Em muitos casos, as células sinalizadoras secretam moléculas para o fluido extra-
celular, que são moléculas mediadores locais – atuam somente sobre as células no
ambiente da célula sinalizadora, o que é determinado como sinalização parácrina.
Pode ocorrer, também, de produzirem sinais aos quais elas mesmas respondem:
a isso se denomina sinalização autócrina.

Figura 3 – Formas de sinalização parácrina e autócrina

Fonte: Adaptado de khanacademy.org

Os organismos multicelulares grandes, como os humanos, necessitam de meca-

nismos de longo alcance para coordenar o comportamento de células em partes
distantes do corpo.
Um exemplo sofisticado desse tipo de sinalização são os neurônios, que estendem
longos prolongamentos (axônios), que lhes permitem entrar em contato com células-
-alvo distantes.
Outra estratégia de sinalização a longas distâncias que é bem diferente utiliza as
células endócrinas em que as suas moléculas sinalizadoras, denominadas hormô-
nios, são secretadas na corrente sanguínea, que irá transportá-las por todo o corpo
e permitirá que atuem sobre células-alvo de qualquer localização.

Figura 4 – Forma de sinalização endócrina

Fonte: Adaptado de khanacademy.org

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 Você pode imaginar que, com tanta diversidade de atuações e tipos celulares tão
diversos, seria necessário um número muito grande de tipos de moléculas de sinali-
zação e de receptores, o que não é verdade.

A complexidade encontra-se, na realidade, na maneira pela qual uma célula irá

responder às combinações dos sinais que recebe.

A maioria das proteínas receptoras de superfície celular pertence a três classes,

dependendo do mecanismo de transdução.

Os receptores acoplados a canais iônicos (ou simplesmente canais iônicos)

são controlados por receptores ionotrópicos, que se abrem para permitir que íons
passem pela membrana em resposta à ligação de um mensageiro químico.

Os receptores acoplados à proteína G atuam indiretamente na regulação da

atividade de uma proteína-alvo ligada à membrana plasmática.

A interação entre o receptor e essa proteína-alvo é mediada por uma proteína –

chamada Proteína Trimérica de Ligação a GTP (Proteína G).

A ativação da proteína-alvo, caso seja uma enzima, altera pequenas moléculas

sinalizadoras intracelulares que, por sua vez, alteram o comportamento de outras
proteínas de sinalização na célula ou, caso a proteína-alvo seja um canal iônico, alte-
ra a permeabilidade da membrana plasmática aos íons.

Alguns receptores acoplados à Proteína G ativam ou inativam a adenililciclase, alte-

rando, assim, a concentração intracelular de um “segundo mensageiro” – o AMP cíclico.

Outros inativam uma fosfolipase C específica de fosfoinositídeos, que gera dois

segundos mensageiros – o inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), que libera Ca2+ do RE,
aumentando, dessa forma, a concentração do íon no citosol. O outro é o diacilglicerol,
que permanece na membrana plasmática e ativa a proteína-cinase C (PKC).

Um aumento nos níveis de AMP cíclico ou de Ca2+ citosólicos afeta as células

principalmente por estimular uma proteína-cinase dependente de cAMP (PKA) e as
proteínas-cinase dependentes de Ca2+/calmodulina (CaM-cinases), respectivamente.

A PKC, a PKA e a CaM-cinase fosforilam proteínas-alvo específicas, alterando a

atividade dessas proteínas.

Cada tipo de célula possui seu conjunto característico de proteínas-alvo que é

regulado dessa maneira, permitindo que a célula construa sua resposta característica
própria aos segundos mensageiros.

Teste seu conhecimento

• Qual é a função das moléculas de sinalização?
• Qual é a diferença entre sinalização parácrina, autócrina e endócrina?
• Qual é a função dos receptores acoplados a canais iônicos e receptores acoplados à
proteína G?

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Interações Proteína-Proteína
Você consegue imaginar o funcionamento de uma célula sem que haja interação
entre proteínas? É impossível!

A complexa rede de interações formadas em qualquer processo é a base da fun-

ção celular. As proteínas podem ligar-se entre si de múltiplas maneiras.

Pode ocorrer de apenas uma parte da superfície de uma proteína entrar em conta-
to com uma alça da cadeia polipeptídica de uma segunda proteína. Há interações em
que duas α-hélices, uma de cada proteína, pareiam-se formando uma super-hélice.

A forma mais comum de as proteínas interagirem é a combinação de uma super-

fície rígida com outra. As interações superfície-superfície podem ser extremamente
específicas, vez que há grande quantidade de ligações sendo feita. Uma interação
específica permite que uma proteína selecione uma ligante dentre milhares de prote-
ínas encontradas em uma célula.

Os anticorpos, proteínas produzidas pelo Sistema Imunológico, são excelentes

exemplos da importância da interação proteica e sua especificidade.

Cada anticorpo tem uma molécula-alvo – denominada antígeno, a qual se liga de

maneira extremamente forte, inativando essa molécula ou a marcando para destruição.

É um grande desafio a compreensão dos complexos proteicos, de quais proteínas

interagem com quais e como é essa interação. No entanto, é fundamental para o
entendimento da dinâmica de uma célula, além de ser um fator que contribui muito
para descobrir a função de uma proteína. Já ouviu aquela velha expressão – diga-me
com quem andas e eu direi que és.

No caso das proteínas, em grande parte das vezes, isso pode ser aplicado, visto
que com quem elas interagem está frequentemente ligado à sua função.

No entanto, note que a análise disso em grande escala exige muitos cuidados. Há
proteínas que interagem transitoriamente. Assim, dependerá do momento que se
observar a célula, obtendo-se um cenário diferente a cada observação.

Ferramentas de bioinformática têm sido amplamente utilizadas para permitir que

milhares de proteínas sejam investigadas em um único conjunto de experimentos.

Há um termo específico criado para o estudo de todas essas redes de interação

proteica que consiste em interactoma. Por sua vez, utiliza-se o termo proteômica
para definir a análise de proteínas em larga escala.

Um método fundamental para identificar proteínas que se ligam umas às outras

de maneira forte é a imunoprecipitação. Uma proteína-alvo específica é imunopreci-
pitada a partir de lisados celulares utilizando anticorpos específicos.

Se a proteína-alvo estiver fortemente associada à outra proteína quando esta é

capturada pelo anticorpo, a proteína ligada precipita junto e pode ser identificada
por espectrometria de massa (técnica abordada adiante).

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Do Sequenciamento de Sanger ao
Sequenciamento Genômico de Última Geração
Conceitos e Aplicabilidades na Pesquisa
Científica e nas Análises Clínicas
A possibilidade de determinar toda sequência nucleotídica do genoma foi uma das
principais revoluções da Biologia Molecular.
Quando foi desenvolvido o primeiro sequenciamento de DNA, os cientistas acha-
vam que dominariam completamente a compreensão acerca do DNA e teriam, prati-
camente, a solução e o entendimento de todas as doenças. Evidentemente, sabemos
que não foi bem assim, pois saber a sequência, na realidade, gerou um monte de
quebra-cabeças a ser desvendado.
De qualquer forma, uma vez que a sequência nucleotídica de um genoma é co-
nhecida, qualquer gene individual pode ser facilmente isolado e grandes quantidades
do produto gênico (seja RNA ou proteína) podem ser produzidas introduzindo-se o
gene em bactérias ou células animais e induzindo essas células a superexpressar o
gene estranho. Essa é a abordagem utilizada para produzir grandes quantidades de
proteínas humanas (como insulina, interferon e proteínas da coagulação do sangue)
para uso como fármacos humanos.
A maioria dos métodos atuais de manipulação do DNA, do RNA e das proteínas ba-
seia-se no conhecimento prévio da sequência de nucleotídeos do genoma de interesse.
Na Metodologia Manual de Sanger (nome de quem desenvolveu a técnica), é feita
uma reação semelhante à PCR, no entanto, além dos quatro deóxinucleotídeos
comuns (dNTPs), adicionam-se, também, dideóxinucleotídeos (ddNTPs), os quais
nada mais são que dNTPs sem a hidroxila na posição 3’, o que resulta na parada
precoce da síntese da fita de DNA.
A mistura de DNA-polimerase, juntamente com oligonucleotídeos iniciadores e
um excesso de dNTPs, é dividida em quatro tubos de reação, cada qual contendo
uma pequena quantidade de um único ddNTP (A, C, G ou T).
Sempre que um ddNTP for adicionado à cadeia, como não há hidroxila disponí-
vel, a cadeia termina com o determinado ddNTP, o qual é marcado com radioisótopo
ou com uma cor particular de algum corante, a depender da base. Assim como na
PCR, vários ciclos são realizados.
Visto que os ddNTPs serão incorporados apenas ocasionalmente, cada ciclo pro-
duz um conjunto de cópias de DNA que termina em cada uma das posições de nu-
cleotídeos da sequência do DNA original.
Os produtos dessas quatro reações são separados por eletroforese em quatro po-
ços paralelos de um gel de poliacrilamida, o qual permite a detecção de diferenças de
tamanho mínimas, sendo capaz de separar fragmentos muito pequenos.
Em cada um dos poços, as bandas representam os fragmentos que foram termi-
nados em um dado nucleotídeo (quatro poços → A, T, C e G), mas em diferentes

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UNIDADE Técnicas Básicas e Avançadas de Biologia Molecular

posições no DNA. É possível decifrar a sequência fazendo a leitura das bandas em

ordem, iniciando na parte inferior do gel e passando por todas os poços.
Note que o menor fragmento possui apenas um nucleotídeo após a sequência do
oligonucleotídeo iniciador e atravessa a malha da eletroforese primeiro, seguido dos
fragmentos aos quais foram adicionados apenas dois nucleotídeos após o oligonucle-
otídeo iniciador, e assim por diante.

Assista ao vídeo 3D do “Método Sanger de sequenciamento de DNA”.

Disponível em: https://bit.ly/3jluomr

O método automatizado, da mesma forma, utiliza quantidade excessiva de dNTPs

mais uma mistura dos quatro ddNTPs ligados a um marcador fluorescente com cor
diferente para cada um.
Os produtos da reação são separados em eletroforese por capilar e uma câmara
detecta a fluorescência e lê a cor. Os dados registrados em um computador consis-
tem em uma série de picos relativos à intensidade de fluorescência, formando um
cromatograma, no qual a sequência de DNA é lida a partir de seus picos. Cada pico
colorido representa um nucleotídeo específico na sequência de DNA.
Métodos de menor custo e mais rápidos são utilizados rotineiramente para se-
quenciar DNA e estratégias mais eficientes estão sendo desenvolvidas.
O sequenciamento completo do genoma humano, finalizado em 2003, custou
mais de 1 bilhão de dólares e teve muitos cientistas do mundo inteiro trabalhando
em conjunto por 13 anos.
Atualmente, devido ao enorme progresso realizado, é possível uma única pessoa
completar a sequência de um genoma humano em menos de um dia (Figura 5).

Figura 5 – Etapas do método Sanger

Fonte: Adaptado de Wikimedia Commons

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Sequenciamento de segunda geração
Sequenciamento Illumina®
Esta técnica de sequenciamento baseia-se na construção de bibliotecas de frag-
mentos de DNA representando todo o genoma de determinada célula.

Entretanto, essas bibliotecas não são geradas a partir de bactérias, elas são feitas
usando a amplificação por PCR de bilhões de fragmentos de DNA, cada qual ligado
a um suporte sólido.
A amplificação é feita de modo que as cópias geradas permanecem ligadas na
proximidade do fragmento de DNA original. Isso leva à formação de grupos de frag-
mentos de DNA, como se fossem colônias bacterianas que representam um clone,
nos quais cada grupo possui cerca de mil cópias idênticas de um determinado frag-
mento de DNA do genoma.
Por sua vez, é formado cerca de 1 bilhão desses grupamentos distribuídos em uma
única lâmina e, dessa forma, são sequenciados ao mesmo tempo.
A reação de sequenciamento é semelhante ao descrito no método de Sanger,
porém diferenças fundamentais incluem que cada nucleotídeo está ligado a uma
molécula fluorescente, que é removível, e os nucleotídeos carregam um grupamento
químico que realiza a parada da síntese pela DNA-polimerase, mas que pode ser
removida quimicamente.
Dessa forma, os quatro nucleotídeos marcados fluorescentemente juntamente ao
DNA-polimerase são adicionados aos bilhões de agrupamentos de DNA imobilizados
sobre uma lâmina.
O nucleotídeo apropriado, complementar ao próximo nucleotídeo no molde, é
incorporado covalentemente a cada agrupamento. Então, são realizadas lavagens
removendo os nucleotídeos não incorporados e os agrupamentos podem ser sequen-
ciados pelo uso de um microscópio especial que capta uma imagem e registra qual
dos quatro nucleotídeos foi adicionado à cadeia em cada grupamento.
O marcador fluorescente e o grupamento de parada de síntese são removidos
enzimaticamente. Esse ciclo é repetido cerca de 100 vezes, resultando em bilhões de
sequências com aproximadamente 100 nucleotídeos.
A sequência de DNA de cada grupamento é determinada com essas mudanças de
cor que ocorrem seguidamente, conforme a elongação procede a partir dessas etapas.
Cada ciclo de incorporação dos nucleotídeos modificados, aquisição de imagem,
remoção do bloqueador e do grupo fluorescente leva menos de 1 hora. Assim, é
possível que ocorra bilhões de reações de sequenciamento simultaneamente e a se-
quência de DNA em cada ponto pode ser lida.

Sequenciamento pelo método Íon Torrent

Neste outro método amplamente utilizado, o genoma é fragmentado e os frag-
mentos individuais são ligados a esferas microscópicas.

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UNIDADE Técnicas Básicas e Avançadas de Biologia Molecular

Por meio de PCR, amplifica-se cada um desses fragmentos de DNA de tal modo
que essas cópias cubram a esfera na qual ele foi ligado inicialmente.
Dessa forma, é produzida uma biblioteca de bilhões de esferas individuais, cada
uma coberta com cópias idênticas de um determinado fragmento de DNA.
As esferas são depositadas em poços individuais junto com oligonucleotídeos ini-
ciadores e DNA-polimerase. A síntese de DNA é iniciada em cada esfera a partir do
oligonucleotídeo iniciador.
A base desse método é que cada vez que um nucleotídeo é incorporado, um íon
hidrogênio (H+) é liberado e isto altera o pH, mudança que é registrada por um chip
semicondutor localizado logo abaixo dos poços com as esferas. São feitas lavagens
com cada um dos quatro nucleotídeos, um de cada vez. Enfim, a sequência de DNA
em determinada esfera é lida a partir do padrão de alterações de pH.
O chip íon torrente é semelhante a um sensor de alta resolução, podendo registrar
grandes quantidades de informação e rastrear as bilhões de reações de sequencia-
mento simultâneas. Utilizando um único chip, atualmente, é possível determinar as
sequências de nucleotídeos de um genoma humano em poucas horas.
Métodos de sequenciamento de DNA ainda mais atualizados, e potencialmente
mais rápidos, estão sendo desenvolvidos. Essas tecnologias de terceira geração
evitam as etapas de amplificação de DNA e determinam a sequência de moléculas
únicas de DNA.
Em um método, uma molécula de DNA é empurrada por um canal muito estreito
e, à medida que se move pelo poro, ela gera correntes elétricas que vão depender
da sua sequência de nucleotídeos. Esse padrão das correntes pode ser usado para
deduzir a sequência de nucleotídeos.
Outro método tem como base a imobilização de uma única molécula de DNA
polimerase, juntamente a um molde, medindo o tempo de “residência” de cada um
dos quatro nucleotídeos marcados com corantes fluorescentes removíveis.
Os nucleotídeos que permanecem por mais tempo na polimerase antes da remo-
ção do corante são aqueles incorporados pela polimerase e registrada a sequência.

Sequenciamento shotgun
A fim de determinar a sequência de nucleotídeos de um genoma inteiro, um se-
gundo método, chamado de sequenciamento shotgun, pula a etapa de isolamento de
uma coleção ordenada de segmentos de DNA que abrange todo o genoma.

Nessa técnica, o DNA genômico é primeiramente fragmentado em pedaços pe-

quenos e uma biblioteca genômica é construída, normalmente, usando plasmídeos
e bactérias. É feito o sequenciamento de clones aleatórios da biblioteca.

Escolhe-se uma determinada quantidade de clones para sequenciamento de ma-

neira tal que cada segmento seja sequenciado em média cerca de 10 vezes – que
determina o grau de cobertura, assegurando que cada segmento do genoma seja
sequenciado mais de uma vez.

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 Para a montagem da sequência do genoma inteiro, é necessária a utilização de
algoritmos de computador, que alinham todas as sequências a partir das regiões de
sobreposição, como se fosse de fato um quebra-cabeça.

Este costuma ser o método mais eficiente e rentável para o sequenciamento de

longas regiões de DNA, e a maioria dos genomas, inclusive o genoma humano, foi
sequenciada por tal método.

Teste seu conhecimento

• Como é realizado o Sequenciamento Illumina®?
• Como são feitas as bibliotecas de fragmentos de DNA?
• Como é realizado o sequenciamento pelo método Íon Torrent?;
• Como é realizado o sequenciamento shotgun?

Microarranjo de DNA e RNA-seq –

Análise da Expressão Gênica
Embora o genoma permaneça o mesmo de célula para célula e de tecido para
tecido, a expressão gênica pode variar muito.

Uma maneira de determinar quais genes estão sendo expressos por uma popula-
ção de células ou um tecido é analisar quais mRNAs estão sendo produzidos.

Ainda que existam métodos sendo desenvolvidos para sequenciar o RNA

diretamente, é mais comum realizar a conversão do RNA para o DNA complementar
(cDNA), usando uma transcriptase reversa e um dos métodos de segunda geração
descritos para o sequenciamento do DNA, realizando o sequenciamento do
RNA (RNA-seq).

Uma técnica muito usada é dos microarranjos de DNA (microarray) que consti-
tuem lâminas de microscopia que possuem milhares de sondas de DNA para um
mRNA de um gene específico.

Para a análise de expressão, os mRNAs das células ou tecidos são extraídos e

convertidos em cDNAs, os quais são marcados fluorescentemente e hibridizados aos
fragmentos ligados ao microarranjo.

Então, um microscópio de fluorescência automatizado determina quais mRNAs

estão presentes na amostra original com base nas posições do arranjo às quais os
cDNAs estão ligados.

As principais desvantagens dessa técnica é a necessidade das sequências das

amostras de mRNA a serem analisadas serem previamente conhecidas e representa-
das por uma sonda correspondente no arranjo, ocorrência de artefatos de hibridação
cruzada, além da dificuldade de quantificação de genes com pouca expressão.

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UNIDADE Técnicas Básicas e Avançadas de Biologia Molecular

Atualmente, utiliza-se cada vez mais RNA-seq como uma abordagem mais direta
para catalogar os RNAs produzidos por uma célula.

Ambas abordagens permitem o monitoramento simultâneo de um grande número

de RNAs e podem detectar mudanças sutis em uma célula que não poderiam ser
manifestadas em sua aparência ou em seu comportamento.

Dessa forma, são muito utilizadas no estudo e na detecção de câncer, entre

outras doenças.

Teste seu conhecimento

• O que é transcriptase reversa?
• Como é realizada a técnica de microarranjos de DNA?
• Qual é a desvantagem da técnica de microarranjos de DNA?

Tecnologia do DNA Recombinante

A manipulação do DNA in vitro permite uma infinitude de realizações e estu-
dos diferentes.

A partir desta Tecnologia se possibilitou a produção de insulina humana, o que

revolucionou completamente o tratamento da Diabetes.

Para compreendermos essa Tecnologia, devemos nos aprofundar em alguns par-

ticipantes essenciais.

Enzimas de restrição
Embora a molécula de DNA na célula possa ser rompida aleatoriamente em pe-
quenos pedaços por força mecânica, sabemos que ela é constituída por repetições
de apenas quatro variantes de nucleotídeos.

Imagine só, dentro de um genoma humano com centenas de milhares de nucleo-

tídeos, de que maneira poderia ser separado um gene específico de todos os outros?

Para isso, foi fundamental a descoberta e a caracterização de enzimas especiais

– endonucleases de restrição.

Como muitas das ferramentas da Tecnologia de DNA recombinante, as nucleases de

restrição foram ocasionalmente incluídas no estudo, para melhor compreender um fenô-
meno biológico, ressaltando a importância da Ciência básica em grandes descobertas.

Observou-se que certas bactérias sempre degradavam o DNA “estranho” introduzido

nelas, experimentalmente, e a busca do mecanismo responsável revelou uma classe
de nucleases bacterianas que clivam a ligação fosfodiéster do DNA em sequências
nucleotídicas específicas.

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 De forma inteligente, passou-se a manipular e a se utilizar as endonucleases de
restrição no Laboratório.

Dessa forma, para uma determinada amostra de DNA, contendo várias moléculas
idênticas, uma endonuclease de restrição específica gerará seguramente o mesmo
conjunto de fragmentos de DNA.

O tamanho dos fragmentos resultantes depende do comprimento das sequências

reconhecidas pelas nucleases de restrição (denominado sítio de restrição).

Note que um sítio de restrição maior é mais difícil de ser encontrado em um geno-
ma, enquanto um sítio de restrição que seja pequeno será encontrado mais vezes no
genoma e, consequentemente, este irá clivar mais vezes e gerar fragmentos menores.

Os sítios de restrição são pequenas sequências – geralmente de 4 a 8 pares de

bases – palindrômicas, isto é, a sequência de nucleotídeos é a mesma em cada fita
de DNA quando lida na direção 5’ -3’.

As enzimas de restrição podem ser consideradas do tipo coesivas ou “cegas”,

dependendo de como clivam a dupla fita de DNA, ou seja, os cortes podem ser uni-
formes nas duas fitas de DNA em seus sítios de reconhecimento, gerando fragmentos
que possuem uma cauda de fita simples – chamadas extremidades coesivas. Por sua
vez, as extremidades “cegas” são geradas quando a clivagem de ambas as fitas de
DNA é no mesmo ponto do sítio e não é gerada nenhuma região de fita simples.

A vantagem de enzimas que produzem extremidades coesivas é que as fitas corta-

das pela mesma enzima são complementares, portanto, sob temperatura ambiente,
as regiões de fita simples podem parear com fragmentos de DNA complementares,
gerados a partir da mesma enzima de restrição.

A ligação fosfodiéster clivada por uma enzima de restrição pode ser restaurada
com a utilização de uma enzima DNA-ligase.

DNA ligase
Lembre-se de que, na replicação do DNA, vimos a importância da enzima DNA-
-ligase para unir os fragmentos de Okazaki, restabelecendo a ligação fosfodiéster.

Para formar um DNA recombinante, precisamos unir fitas de DNA provindas de

origem diferente, certo?

Para isso, geralmente é utilizada a enzima DNA-ligase purificada a partir do bac-

teriófago T4 que, além de ligar extremidades coesivas complementares, pode ligar
quaisquer extremidades cegas de DNA, apesar de muitas vezes necessitar de uma
concentração maior de DNA e DNA-ligase do que a ligação de extremidades coesivas.

Vetores de clonagem
Uma forma de clonagem do DNA é a formação de um DNA recombinante, que
seria a união de um gene de interesse a um vetor, que é o que permite que esse ma-
terial genético “estranho” seja replicado dentro de uma célula hospedeira.

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UNIDADE Técnicas Básicas e Avançadas de Biologia Molecular

Os vetores mais frequentemente utilizados são os plasmídeos, os quais são en-

contrados em bactérias como pequenas moléculas circulares de DNA fita dupla, que
é um material genético extracromossomal não essencial à sobrevivência da célula;
logo, pode ser manipulado.
Os DNAs extracromossomais ocorrem naturalmente em bactérias e em células de
eucariotos inferiores, como leveduras.
É mais comum a clonagem em bactérias Escherichia coli, usando plasmídeos que
essas bactérias reconheçam.
Um fator fundamental é que durante a divisão celular as cópias do plasmídeo de
DNA são segregadas para cada célula-filha, garantindo a propagação desse material
genético (Figura 6).
Visto que é o mais frequente, aqui focaremos na discussão da clonagem gênica
com plasmídeos utilizando bactérias E. coli como hospedeiras.

Figura 6 – Transformação do plasmídeo em células bacterianas

Fonte: Getty Images

Os plasmídeos foram manipulados geneticamente para uso em Laboratório como

vetor de clonagem.
Dessa forma, possui três regiões essenciais: uma origem de replicação que seja
reconhecida pela célula hospedeira; uma região de inserção do fragmento de DNA
exógeno e um marcador que permita a seleção das células que incorporaram os
plasmídeos no processo de transformação (Figura 7).

Figura 7 – Plasmídeo
Fonte: Adaptado de Getty Images

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 Para ser utilizado como vetor de clonagem, o plasmídeo é inicialmente clivado
com uma endonuclease de restrição, abrindo a molécula circular. O DNA a ser clo-
nado é ligado ao plasmídeo clivado utilizando a enzima DNA-ligase.

O DNA recombinante formado é introduzido nas células bacterianas hospedeiras, as

quais precisam de uma preparação que as tornam transitoriamente permeáveis a DNA.

No entanto, apenas uma pequena fração das células capturará o DNA plasmidial,
processo conhecido como transformação.

Geralmente, uma célula em cerca de 10.000 incorpora um único plasmídeo, o

qual deve possuir um marcador que permita a seleção e que, na maioria das vezes, é
um gene que confere resistência a algum antibiótico, como a ampicilina.

Dessa forma, semeando as bactérias em um meio contendo ampicilina, apenas

células transformadas podem sobreviver por terem o gene de resistência.

A divisão celular bacteriana é muito rápida – cerca de 30 minutos, um dos motivos

de serem muito utilizadas. Assim, à medida que essas células se dividem, os plasmí-
deos recombinantes também replicam produzindo um número enorme de cópias.

A seguir, as células são rompidas, o DNA plasmidial é isolado e o fragmento

de DNA clonado é facilmente recuperado cortando-o do DNA plasmidial com as
mesmas endonucleases de restrição que foram utilizadas na etapa de formação do
DNA recombinante. Portanto, essas etapas fazem a amplificação e a purificação de
qualquer gene a partir do genoma de qualquer organismo.

Para alguns propósitos, necessita-se clonar fragmentos muito grandes de DNA,

mas, por sua vez, não é possível utilizar plasmídeos que comportam apenas peque-
nos fragmentos.

É o caso, por exemplo, do isolamento e da manipulação de grandes segmentos

do genoma humano, esperando-se a clonagem de segmentos tão grandes quanto
megabases [1 megabase (Mb) = 1 milhão de nucleotídeos]. Os mais utilizados, nesse
caso, são cromossomos bacterianos artificiais (BACs).

Vetores de expressão e o Operon Lac

Na construção de um vetor que tem como fundamento a expressão em larga esca-
la de proteínas, além de todos os itens de um vetor de clonagem, o ponto crucial é a
inclusão de um promotor, permitindo a tradução desse gene e a expressão proteica.

As bactérias E. coli podem quebrar a lactose, mas o principal metabólito que

utilizam como fonte de energia é a glicose. Caso a lactose seja o único carboidrato
disponível, ela é utilizada. No entanto, como a utilização da glicose é preferível,
envolvendo menos etapas, é necessária a regulação para que as bactérias somente
usem lactose quando ela estiver presente e na ausência de glicose.

Dessa forma, para usar a lactose, elas precisam expressar o operon lac, o qual
codifica as enzimas para a absorção e o metabolismo da lactose. Para o controle dos

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UNIDADE Técnicas Básicas e Avançadas de Biologia Molecular

níveis de ambos os metabólitos, há duas proteínas importantes: o repressor lac é um

sensor dos níveis de lactose e a Proteína Ativadora de Catabólito (CAP) é um sensor
dos níveis de glicose.

Um operon apresenta mais de um gene transcrito em um único mRNA e sob o

controle de um mesmo promotor. No operon lac há três genes: lacZ, lacY, e lacA –
transcritos como um único RNAm, todos específicos para proteínas envolvidas na
metabolização da lactose.

O lacZ codifica uma enzima que quebra a lactose em monossacarídeos e, por sua vez,
o lacY codifica um transportador de membrana que auxilia a passagem da lactose para
dentro da célula. O promotor, como já vimos, é o sítio de ligação da RNA polimerase.

Há um outro sítio de regulação negativa, o operador, no qual se liga a proteína re-

pressora lac. Quando o repressor lac está ligado, a RNA polimerase não consegue se
ligar ao promotor. O sítio de ligação CAP é um sítio de regulação positiva e quando
a CAP está ligada, favorece a RNA polimerase a se ligar ao promotor.

Diante disso, se houver lactose no meio, o repressor lac não pode se ligar ao opera-
dor. No entanto, a RNA polimerase sozinha não é muito efetiva em se ligar ao promotor.

A CAP se liga à região do DNA que precede o promotor do operon lac e auxilia
na ligação da RNA polimerase ao promotor, levando a altos níveis de transcrição.

A proteína CAP é regulada por AMP cíclico (AMPc), que é um sinalizador celular
amplamente utilizado. Nesse caso, é produzido quando os níveis de glicose estão bai-
xos e, assim, liga-se à CAP, mudando a conformação da proteína e a impedindo de
se ligar ao DNA e de promover a transcrição. Logo, o operon lac apenas é transcrito
em altos níveis quando a glicose está ausente e a lactose está presente.

A Figura 8 representa um exemplo de vetor de clonagem plasmidial. No centro

está a nomeação dele (pUC19), com o número total de pares de bases (2686). Há um
gene para resistência à ampicilina (amp), a origem de replicação está anotada (ori) e
há um gene do operon Lac (lacZα).

Figura 8 – Vetor de clonagem plasmidial

Fonte: Adaptado de Wikimedia Commons

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Bibliotecas
Para algumas abordagens, é conveniente dividir o genoma em fragmentos meno-
res e clonar cada fragmento separadamente, usando um vetor plamidial. Isso permite
trabalhar com segmentos menores de um genoma, individualmente.

É feita a clivagem do DNA genômico em pequenos pedaços com uma endonu-

clease de restrição, ligação de toda essa coleção de fragmentos de DNA em vetores
plasmidiais, usando condições que favoreçam a inserção de um único fragmento de
DNA em cada plasmídeo, introdução em E. coli em uma concentração que assegure
que apenas uma molécula de plasmídeo seja captada por cada bactéria.

Cada colônia bacteriana formada conterá um clone com um fragmento de DNA

clonado diferente e o conjunto de colônias é uma representação de todo genoma –
denominado biblioteca genômica.

Outra estratégia possível é quando você não quer a representação do genoma

total de um organismo, mas de todos os genes expressos. Para essa abordagem, são
selecionadas as sequências de DNA transcritas em mRNA, o que corresponde aos
genes que estão sendo expressos.

Extraído o Mrna, é feita uma transcrição reversa (utilizando enzima transcriptase

reversa) produzindo uma cópia de DNA de cada molécula de mRNA – chamado de
DNA complementar (ou cDNA).

As moléculas de cDNA de fita simples sintetizadas pela transcriptase reversa são

convertidas pela DNA-polimerase em moléculas de cDNA de fita dupla, inseridas em
vetor plasmidial e clonadas. Cada clone é um clone de cDNA, e o conjunto de clones
derivados de uma preparação de mRNA constitui uma biblioteca de cDNA.

Para determinar a sequência de nucleotídeos do genoma humano, utilizou-se bi-

blioteca genômica, formando dezenas de milhares de colônias bacterianas, cada uma
contendo um inserto de DNA humano diferente.

A sequência de nucleotídeos de cada inserto foi sequenciada separadamente. Pos-

teriormente, o genoma foi montado como um quebra-cabeças a partir dos milhares
de segmentos individuais.

Reação em Cadeia da Polimerase – PCR

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) consiste, de forma resumida, em ciclos
de desnaturação e hibridização de moléculas de DNA, com síntese da sequência de
interesse por uma DNA polimerase.

Sabemos que uma das formas de separar a dupla fita de DNA (desnaturação) é
por aquecimento a cerca de 90ºC, vez que as ligações não covalentes são relativa-
mente fracas e podem ser facilmente rompidas.

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Essa desnaturação do DNA separa as duas fitas, sem romper as ligações covalen-
tes que ligam os nucleotídeos em cada fita. Quando restabelecida a temperatura, as
fitas complementares se unem formando novamente a dupla hélice. Na PCR, utiliza-
-se um aparelho denominado termociclador que realiza as variações de temperatura
nas amostras.

Para copiar o DNA, a polimerase requer um oligonucleotídeo iniciador que forne-

ça a extremidade 3’, tal como estudado para a replicação do DNA, a partir da qual
a síntese pode iniciar.

Na PCR, são usados dois oligonucleotídeos iniciadores, que são produzidos de

acordo com o interesse, para hibridizar em sequências que flanqueiam a região de
interesse e é possível incluir alguma sequência que seja reconhecida por uma enzima
de restrição específica. Esses iniciadores marcam os limites da direita e da esquerda
do DNA a ser amplificado.

Permite-se, então, que a DNA polimerase replique cada fita de forma independente.
Nos ciclos subsequentes, todas as moléculas de DNA recém-sintetizadas produzidas
pela polimerase servem de molde para o próximo ciclo de replicação.

Uma típica reação de PCR começa com a desnaturação do DNA, a 95ºC, seguido
por redução da temperatura para 50 a 60ºC possibilitando o anelamento dos oligo-
nucleotídeos iniciadores à extremidade 3’ do segmento de DNA que se deseja isolar.

Com as duas fitas do molde de DNA de fita dupla separadas, um iniciador diferente
é anelado a cada uma. Os oligonucleotídeos específicos, que estão em concentração
muito alta, ligam-se por complementaridade no DNA, mas, por outro lado, as longas
fitas de DNA da amostra permanecerão separadas devido à sua baixa concentração.

A síntese pela DNA polimerase ocorre a partir dos oligonucleotídeos hibridizados,

na presença de desoxinucleotídeos (dNTPs).

É necessária uma enzima DNA-polimerase termorresistente, visto que a amos-

tra passará por diversas variações de temperatura atingindo uma temperatura muito
alta para a grande maioria das enzimas.

A descoberta de uma DNA polimerase que resistisse a altas temperaturas foi fun-
damental para permitir o desenvolvimento da técnica. Interessantemente, foi obser-
vado que em águas termais eram encontradas bactérias; logo, essas deveriam pos-
suir uma DNA polimerase que permitisse replicar seu material genético e altamente
resistentes à temperatura.

Dessa forma, purificaram a Taq-polimerase presente em bactérias Thermus

aquaticus (que vivem em águas termais). Após a síntese do fragmento delimitado
pelos oligonucleotídeos, a amostra é novamente aquecida a 95ºC e as mesmas eta-
pas novamente seguidas. Esses ciclos de desnaturação, seguidos por hibridização
e síntese se repetem por cerca de 20 vezes e levam à amplificação exponencial da
sequência de interesse.

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 As sequências amplificadas por PCR podem ser clivadas com enzimas de restrição
apropriadas que produzam extremidades coesivas para a ligação eficiente do frag-
mento em um vetor plasmidial clivado pela mesma enzima de restrição.

A utilização da PCR é altamente sensível para detectar uma única molécula de

DNA em uma amostra, necessitando que ao menos parte da sequência daquele DNA
seja conhecida. É possível detectar patógenos mesmo em estágios iniciais da infecção.

Nesse caso, utilizam-se oligonucleotídeos complementares a um segmento do ge-

noma do patógeno.

A PCR é também amplamente utilizada na análise forense, permitindo aos inves-

tigadores isolar um DNA a partir de traços mínimos de sangue humano ou algum
tecido, deixados nas cenas de crimes, para obter a impressão digital de DNA (DNA
fingerprint). Essas análises de Biologia Molecular revolucionaram as análises foren-
ses, não apenas identificando indivíduos que cometeram crimes, mas também exo-
nerando indivíduos acusados injustamente.

Na Figura 9, está exemplificado as etapas da PCR. Em 1 ocorre a desnaturação,

em 2 o anelamento de oligonucleotídeos e em 3 o elongamento da cadeia de DNA.

Figura 9 – Etapas da PCR

Fonte: Adaptado de Wikipedia Commons

Teste seu conhecimento

• Qual é a função das enzimas de restrição?
• A ligação fosfodiéster pode ser restaurada? De que forma?
• O que são vetores de clonagem? Qual é o mais utilizado e quais as três regiões essenciais?
• De que forma as bactérias utilizam a lactose na falta de glicose?;
• O que é a biblioteca genômica?
• Quais são as etapas da Reação em Cadeia da Polimerase – PCR?
• Como ocorre a desnaturação do DNA na técnica de PCR?
• Qual é a função do termociclador?
• Qual é a função dos dNTPs e taq-polimerase?

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PCR em Tempo Real Quantitativo

Essa variante da PCR permite realizar a quantificação do gene alvo durante o
processo de amplificação do DNA, dispensando a eletroforese. Isso é possível pela
adição de sondas fluorescentes às reações de PCR.
À medida que o DNA é amplificado, o nível de fluorescência cresce proporcional-
mente. Nesse caso, o termociclador é acoplado a um sistema ótico para a excitação
e a captura da emissão da fluorescência, além de um computador para a aquisição
e a análise de resultados.
A essência da Técnica consiste na utilização da atividade de exonuclease 5’-3’ da enzi-
ma Taq DNA polimerase e na construção de oligonucletídeos duplamente marcados que
funcionam como sondas que emitem sinal de fluorescência somente quando clivadas.
Outro fator importante para a avaliação do resultado é que é gerado um Ciclo
Limiar (Cycle Threshold – CT) para cada amostra, ponto em que a fluorescência
cruza um limite pré-determinado (threshold).
Quanto maior a quantidade do gene alvo (sequência a ser amplificada), mais baixo
é o CT, sendo necessário menor número de ciclos para ultrapassar o limite.
Há duas tecnologias principais usadas na PCR em tempo real – o SYBR Green®
e o TaqMan®.
A atividade exonucleolítica 5’-3’ da Taq DNA Polimerase degrada uma sonda mar-
cada que anela especificamente na parte interna do gene a ser amplificado entre dois
oligonucleotídeos iniciadores (primers).
A TaqMan® usa uma sonda, específica para o gene de interesse, duplamente
marcada com um fluoróforo “repórter” em uma extremidade e um fluoróforo “silen-
ciador” (quencher) na outra.
A emissão de fluorescência pelo repórter é absorvida pelo quencher. No entanto,
devido à atividade exonucleolítica da enzima TaqDNA polimerase, a sonda será de-
gradada e o fluoróforo ficará distante do quencher que agora não mais será capaz
de absorver a luz emitida.
Dessa forma, há aumento da emissão de fluorescência pelo repórter, a qual é de-
tectada e quantificada. Atingindo o limiar (threshold), todas as amostras podem ser
comparadas, correspondendo ao momento utilizado para a análise da fluorescência.
Esse ponto pode ser definido e deve estar na faixa em que a quantidade de fluo-
rescência gerada pela amplificação das amostras torna-se significativamente maior
que a fluorescência basal (background).
A qPCR pode ser utilizada para avaliar a presença de um patógeno em uma
amostra, podendo ser um teste qualitativo ou quantitativo. Um exemplo é a realiza-
ção de exame para diagnóstico na pandemia de COVID-19.
Nesse caso, como o material genético desse vírus é RNA, é necessária a técnica
de transcrição reversa para se obter o cDNA. Assim, uma das metodologias de esco-
lha é a PCR em tempo real após Transcrição Reversa (rRT-PCR).

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 Teste seu conhecimento
• Qual é a diferença entre o PCR convencional e o PCR em tempo real?
• Quais as duas principais tecnologias usadas na PCR em tempo real?
• Qual é a aplicabilidade do na PCR em tempo real?
• Como é feto o rRT-PCR?

Eletroforese em Gel de Agarose Separa

Moléculas de DNA de Diferentes Tamanhos
Utiliza-se uma malha de agarose, que forma como se fosse uma gelatina, porém
as ligações dessa malha são rigorosamente uniformes e, assim, o DNA é colocado
em uma extremidade da malha que apresentará como se fossem poros em que a
molécula de DNA poderá passar de forma direcionada.
Essa malha de agarose é acoplada com um eletrodo positivo em uma extremidade
e positivo em outra.
Como cada nucleotídeo em uma molécula de ácido nucleico carrega uma única
carga negativa (no grupo fosfato), as moléculas de DNA movem-se uniformemente
na direção do eletrodo positivo.
Os fragmentos de DNA maiores migrarão mais lentamente, pois terão mais difi-
culdade para passar matriz do gel.
Dessa forma, é aplicada uma corrente e, depois de um tempo, os fragmentos de DNA
estarão separados no gel de acordo com seu tamanho, formando bandas individuais,
cada uma composta por um conjunto de moléculas de DNA de mesmo comprimento.

Figura 10 – Esquema dos passos da PCR

Fonte: BIANCO; LIPAY, 2015

A amostra passa pelo termociclador (A) e o produto da PCR é submetido a uma

carga elétrica (B) sendo, posteriormente, visualizado em gel de agarose (C).

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UNIDADE Técnicas Básicas e Avançadas de Biologia Molecular

Espectrometria de Massas
A espectrometria de massa determina a massa e a sequência das proteínas.

Esse método permite a determinação direta e altamente exata da razão da massa (m)

de uma molécula carregada (íon molecular) pela sua carga (z), ou m/z.

É uma técnica que requer pouco material e as massas podem ser obtidas com
bastante acuidade, muitas vezes com um erro entre 1 milhão.

Há três principais componentes essenciais na realização da espectrometria de

massa – uma fonte íons, o analisador de massa e o detector.

A ionização de uma amostra proteica leva à formação de moléculas de peptídeos

individuais carregadas que são aceleradas por um campo elétrico ou magnético, se-
parando os íons com base em suas relações massa/carga.

Os íons separados, seguem colidindo com um detector, o qual gera uma série de
picos das massas das moléculas na amostra, que representam os “espectros de massa”.

Existem variados espectrômetros de massa, diferindo, sobretudo, em relação às

fontes de íons e analisadores de massa utilizados. Uma das fontes íons mais comu-
mente utilizadas depende de uma técnica chamada ionização e dessorção a laser as-
sistida por matriz (MALDI, do inglês Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization).

Nessa abordagem, as proteínas na amostra são primeiramente clivadas em peptí-

deos menores por uma protease, usualmente a tripsina.

Os peptídeos depostos em uma lâmina de metal sofrem um disparo de laser,

produzindo uma nuvem gasosa de peptídeos ionizados, cada um carregando uma ou
mais cargas positivas.

A fonte de íons MALDI frequente encontra-se acoplada a um analisador de mas-

sa chamado de Analisador Time-Of-Flight (TOF), que é uma câmara longa pela qual
os peptídeos ionizados são acelerados por um campo elétrico em direção ao detector.

Nesse caso, determina-se a massa e carga pelo “tempo de voo” que levam para
chegar até o detector.

A diferença de tempo deve-se ao fato de que peptídeos maiores se movem mais

lentamente e moléculas muito carregadas se movem mais e de forma mais rápida.

Por meio da variação do campo elétrico, íons com um amplo espectro de valores
de razão m/z podem ser examinados individualmente, produzindo o espectro de
massas, ou seja, o gráfico de m/z (eixo x) pela abundância relativa (eixo y).

Os dados são analisados usando Bancos de Dados nos quais as massas de todas
as proteínas e de todos os seus fragmentos peptídicos preditos estão organizadas de
acordo com suas sequências genômicas no organismo.

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 A espectrometria de massa possui muitas aplicações e pode ser usada tanto em
misturas complexas de proteínas como proteínas purificadas. Um tipo de espectro-
metria de massa, utilizando dois analisadores de massa, pode detectar modificações
pós-traducionais das proteínas, tais como fosforilações ou acetilações.

Imagine que essas modificações conduzem a um aumento de massa característico

em um aminoácido, ainda que sutil. Isso pode ser identificado na análise dos frag-
mentos peptídicos no segundo analisador de massa.

Vamos imaginar que você está estudando o câncer. Uma abordagem seria usar a
espectrometria de massa para comparar as quantidades de uma determinada proteí-
na em duas amostras diferentes – amostra de tumor e de tecido normal.

Para isso, é necessário ter um padrão interno como referência para as duas amos-
tras, cuja quantidade não difira.

Teste seu conhecimento

• Qual é a utilidade da Eletroforese em gel de agarose?
• Qual é a função da espectrometria de massa? Quais os três principais componentes
essenciais na realização da espectrometria de massa?
• Qual é a aplicabilidade da espectrometria de massa?

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UNIDADE Técnicas Básicas e Avançadas de Biologia Molecular

Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:

 Livros
Biologia Celular e Molecular
DE ROBERTIS, E. M. Biologia celular e molecular. 16.ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2014.
Biologia Molecular da Célula
ALBERTS, B. Biologia molecular da célula. 6.ed. Porto Alegre: ArtMed, 2017.

 Leitura
RNAi: uma Estratégia a ser Explorada para a Indução de Resistência a Viroses em Tomateiro
https://bit.ly/2ONgifj
Visão Geral sobre Micro RNA
https://bit.ly/3fLWpRV
O Sistema CRISPR/Cas9 e a Possibilidade de Edição Genômica para a Cardiologia
https://bit.ly/2OEq5od
PCR em Tempo Real
https://bit.ly/39bwMre
Animação 3D do PCR e outras Técnicas
https://bit.ly/2OJ7QOc
Introdução à Sinalização Celular
https://bit.ly/3fKuMsk

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Referências
ALBERTS, B. Biologia molecular da célula. 6.ed. Porto Alegre ArtMed 2017.

BIANCO; L. Biologia Molecular – Métodos e interpretação. Rio de Janeiro: Roca, 2015.

DE ROBERTIS, E. M. Biologia celular e molecular. 16.ed. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 2014.

LODISH, H. et al. Biologia celular e molecular. 7.ed. Porto Alegre: ArtMed, 2014.

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