Ministério Da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-Graduação

Ministério da Saúde
Instituto Nacional de Câncer

Coordenação de Pós-graduação
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER

Pós-Graduação em Oncologia
ROBERTO RODRIGUES CAPELA DE MATOS
ESTUDO CITOGENÉTICO MOLECULAR PARA A CARACTERIZAÇÃO DOS

CARIÓTIPOS COMPLEXOS DA LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA DA INFÂNCIA
Orientador: Profa. Dra. Maria Luiza Macedo Silva
RIO DE JANEIRO
2014

ROBERTO RODRIGUES CAPELA DE MATOS

Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Câncer

como parte dos requisitos para obtenção do título
de Mestre em Oncologia
Orientador: Profa. Dra. Maria Luiza Macedo Silva
RIO DE JANEIRO
2014
i
M425e Matos, Roberto Rodrigues Capela de.
Estudo citogenético molecular para a caracterização dos

cariótipos complexos da leucemia mielóide aguda da infância.
/ Roberto Rodrigues Capela de Matos. – Rio de Janeiro:
INCA, 2014.
xvi, 78 f.: il.
Dissertação (Mestrado em Oncologia) - Instituto Nacional

de Câncer José Gomes da Silva, 2014.
Orientadora: Maria Luiza Macedo Silva.
1. Leucemia Mieloide Aguda. 2. Células-Tronco

Hematopoéticas. 3. Análise Citogenética. 4. Citogenética –
métodos. 5. Criança. I. Silva, Maria Luiza Macedo Silva
(orient.). II. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes
da Silva. III.Título.
CDD 616.99419
ii

AUTOR: ROBERTO RODRIGUES CAPELA DE MATOS

ORIENTADOR: Profa. Dra. Maria Luiza Macedo Silva
Aprovada em: ___/___/___
EXAMINADORES:
Prof. Dr. Fernando Regla Vargas

Prof. Dr. André Luiz Mencalha
Profa. Dra. Mariana Emerenciano Cavalcanti de Sá
Profa. Dra. Elaine Sobral da Costa – Suplente externo
Profa. Dra. Claudia Esther Alicia Rocio Hassan – Suplente interno
RIO DE JANEIRO
2014
iii
À minha querida tia Vera, “in memorian”,
que, em tudo, me apoiou até o fim,
e a todas as crianças com Câncer...
Dedico
iv
AGRADECIMENTOS
À Deus, por ser meu refúgio e minha fortaleza;

Aos meus pais Marize e Roberto, pelo apoio em minha formação acadêmica;
À minha orientadora Drª Maria Luiza, por seus ensinamentos em mais um
trabalho, por me incentivar e acreditar em mim, e principalmente por me
introduzir neste campo desafiador que é a citogenética humana;
À Drª Eliana Abdelhay, por sua excelente didática, presteza, e por toda a
estrutura física e suporte material, para a realização deste trabalho;
Às crianças, adolescentes e seus responsáveis, protagonistas deste
trabalho;
Ao Programa de Pós-graduação em Oncologia do INCA, pela
oportunidade;
Ao corpo docente do Programa de Pós-graduação em Oncologia do INCA,
por sua contribuição em minha formação acadêmica;
Aos membros da banca examinadora, pela gentileza de aceitar o convite;
Ao pessoal da secretaria de Pós-Graduação do INCA, por toda sua
paciência e presteza;
Ao Dr. Raul Ribeiro, por toda a ajuda em discussões dos resultados e nos
manuscritos apresentados neste trabalho;
Ao Dr. Thomas Liehr, pela colaboração com nosso laboratório através do
intercâmbio CAPES (PROBRAL/DAAD - no. 419/14);
Aos médicos hematologistas das instituições que forneceram o material,
colaborando com este estudo, e com nosso projeto;
Aos meus amados amigos Mariana, Amanda, Daniela, Deborah, Thiago e
Luana, que são minha segunda família, pela convivência maravilhosa no dia
a dia, por toda ajuda, seja esta, em discussões científicas ou naquele ombro
amigo;
Aos colegas do CEMO, pela convivência alegre e agradável do dia a dia;
À minha querida noiva Alice, que além de me apoiar contribuiu na
elaboração das figuras deste trabalho, e a seus pais, Maria Auxiliadora e
José Jacinto, pelo apoio.
v
“Ser pequeno é não desanimar com as faltas próprias,
pois as crianças caem com frequência,
mas são demasiado pequenas para
machucar-se seriamente”
“Je promets de mettre à terre une pluie de roses,

et de passer ciel à faire du bien sur la terre”
“Prometo fazer cair sobre a terra uma chuva de rosas,
e passar o céu fazendo o bem sobre a terra”
Thérèse de Lisieux
vi
ESTUDO CITOGENÉTICO MOLECULAR PARA A CARACTERIZAÇÃO

DOS CARIÓTIPOS COMPLEXOS DA LEUCEMIA MIELÓIDE AGUDA DA
INFÂNCIA
RESUMO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Roberto Rodrigues Capela de Matos
As leucemias são um grupo heterogêneo de doenças que se caracterizam pela

proliferação clonal de células hematopoéticas, que sofreram alterações genéticas,
manifestadas durante sua diferenciação. Na leucemia mielóide aguda, o evento
leucemogênico ocorre em uma célula-tronco, comprometida com a linhagem
mielóide, impedindo a maturação e a diferenciação das células. As leucemias
mielóides agudas são morfologicamente subclassificadas em 8 subtipos, que variam
entre M0 e M7 de acordo com o grau de maturação celular. Na leucemia mielóide
aguda podem ser encontradas alterações citogenéticas associadas com os subtipos
da classificação FAB, como por exemplo, a t(8;21)(q22;q22) associada ao subtipo
M2, a t(15;17)(q22;q21) ao M3, e a inv(16)(p13;q22) ao M4, as quais estão
associadas a um prognóstico favorável. Por outro lado, pacientes que apresentam -5
ou a del(5q), -7, a del(7q), a inv(3q)/t(3;3)(q21;q26), a t(6;9)(p23;q34), del(9q),
t(9;22)(q34;q11), rearranjo do gene MLL e, cariótipos complexos, com estas
anormalidades e/ou outras aberrações crípticas, são selecionados para protocolo de
alto risco, incluindo o transplante de medula óssea. A citogenética é uma importante
ferramenta de estudo na leucemia mielóide aguda, e embora algumas aberrações já
sejam classificadas, ainda, 10-12% dos pacientes com leucemia mielóide aguda,
apresentam cariótipos com três ou mais aberrações, muitas vezes crípticas. Uma
vez que tem sido sugerida uma possível correlação entre a combinação das
aberrações detectadas, em um cariótipo complexo, e a resposta clínica, fica clara a
necessidade de um refinamento na caracterização deste tipo de perfil cariotípico.
Neste contexto, o presente estudo pôde refinar a caracterização de cariótipos
complexos, bem como suas anormalidades crípticas, a partir de amostras de
pacientes pediátricos diagnosticados com leucemia mielóide aguda, através da
aplicação técnicas de citogenética molecular, fluorecense in situ hibridization,
Multiplex-FISH e o multicolor chromosome banding. Este trabalho pôde contribuir
com a literatura, descrevendo duas novas anormalidades cromossômicas crípticas,
presentes em cariótipos complexos, onde uma teve importância na citogenética
inicial e a outra apresentou impacto na evolução clínica e estratificação de risco do
paciente. Deste modo, nosso trabalho mostrou a importância da combinação das
três técnicas de citogenética molecular, em refinar os cariótipos complexos dos
pacientes pediátricos com leucemia mielóide aguda, na tentativa de identificar
biomarcadores que sejam potenciais alvos terapêuticos.
vii
MOLECULAR CYTOGENETIC STUDIES FOR THE CHARACTERIZATION

OF COMPLEX KARYOTYPES IN CHILDHOOD ACUTE MYELOID
LEUKEMIA
ABSTRACT
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Roberto Rodrigues Capela de Matos

Leukemias represent a heterogeneous group of diseases that are characterized by
the clonal proliferation of hematopoietic cells, which, during their differentiation, have
undergone genetic alterations. In acute myeloid leukemia, the leukaemogenic event
occurs in a myeloid lineage stem cell, preventing maturation and cell differentiation.
Acute myeloid leukemias are sub classified in 8 subtypes, which varies between M0
and M7 according to cell maturation degree. In acute myeloid leukemia, cytogenetic
alterations are associated with FAB subtypes. For example, the t(8;21)(q;22q;22) is
associated to FAB M2 subtype, the t(15;17)(q22;q21) is associated to M3, and
inv(16) is associated to M4 subtype, being all before mentioned, related to a good
prognosis. On the other hand, patients which presents -5 or del(5q), -7, or del(7q),
inv(3q)/t(3;3)(q21;q26), t(6;9)(p23;q34), del(9q), MLL rearrangements and, complex
karyotypes, with these and/or other críptical aberrations, are stratified into high risk
protocols, including bone marrow transplantation. Cytogenetic analysis is an
important tool in acute myeloid leukemia, and although some chromosomal
aberrations are already classified, still 10-12% of acute myeloid leukemia patients
presents karyotypes with three or more aberrations, being many of these críptical
aberrations. Once the literature suggests a possible correlation between the
combination of the detected aberrations, in a complex karyotype, and patient’s
clinical outcome, it becomes clear the relevance of a refinement in the
characterization of such karyotypic profile. In this context, by the application of
molecular cytogenetic techniques such as fluorecense in situ hibridization, Multiplex-
FISH and multicolor chromosome banding, in samples from pediatric acute myeloid
leukemia patients, the present study was able to refine the characterization of the
complex karyotypes, and its críptical abnormalities. In addition, this work could
contribute to the literature by describing two new cryptic chromosomal abnormalities
in complex karyotypes. One was important for initial cytogenetic diagnosis, and the
other had an impact both on patient’s risk stratification and, on her clinical outcome.
Thus, our work showed the importance of the above mentioned molecular
cytogenetic techniques combined in refining complex karyotypes from pediatric acute
myeloid leukemia patients, regarding an attempt to identify biomarkers that could be
potential therapeutic targets.
viii
ÍNDICE
ITEM
Resumo ..................................................................................................................... vii
Abstract ..................................................................................................................... viii
Lista de tabelas .......................................................................................................... xi
Lista de figuras .......................................................................................................... xii
Lista de abreviaturas e siglas .................................................................................... xiii
1. Introdução .............................................................................................................. 1
1.1 Leucemias....................................................................................................1
1.2 Leucemia Mielóide Aguda ..........................................................................3
1.3 Classificação, diagnóstico laboratorial e padrão citogenético da LMA........4
1.3.1 Leucemia Mielóide Aguda minimamente diferenciada
– LMA-M0.....................................................................................8
1.3.2 Leucemia Mielóide Aguda sem maturação – LMA-M1.................9
1.3.3 Leucemia Mielóide Aguda com maturação – LMA-M2.................9
1.3.4 Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) – LMA-M3.......................10
1.3.5 Leucemia Mielomonocítica Aguda – LMA-M4..............................11
1.3.6 Leucemia Monoblástica Aguda – LMA-M5..................................11
1.3.7 Eritroleucemia Aguda – LMA-M6.................................................12
1.3.8 Leucemia Megacarioblástica Aguda – LMA-M7...........................13
1.4 A relevância da caracterização citogenética tumoral................................16
1.5 Fatores prognósticos e classificação de risco da LMA..............................20
1.6 Cariótipos complexos na LMA...................................................................23
2. Objetivos .............................................................................................................. 25
2.1 Objetivos específicos.................................................................................25
3. Material e Métodos .............................................................................................. 26
3.1 Desenho Experimental..............................................................................26
3.2. Amostra e considerações éticas...............................................................27
3.3 Critérios de inclusão e exclusão................................................................27
3.4 Estudo cromossômico por bandeamento G..............................................27
3.5. Estudo por citogenética molecular............................................................28
3.5.1 FISH e M-FISH.............................................................................28
3.5.2 MCB.............................................................................................29
4. Resultados ........................................................................................................... 31
4.1 Pacientes, período e local de estudo.........................................................31
ix
4.2 Cromossomos e subtipos morfológicos encontrados no estudo...............32
4.3 Anormalidades envolvendo o cromossomo 8............................................33
4.3.1 Envolvimento dos cromossomos 1, 8 e 11..................................33
4.3.2 t(8;21) associada a outras anomalias cromossômicas................34
4.3.3 Translocações three-way envolvendo o cromossomo 8..............34
4.3.3.1 Envolvimento dos cromossomos 8, 21 e 22...................34
4.4 Anormalidades envolvendo o cromossomo 16..........................................37
4.4.1 inv(16) .........................................................................................37
4.4.2 del(16) .........................................................................................38
4.4.3 t(16;21) ........................................................................................39
4.5 Anormalidades envolvendo o cromossomo 11..........................................40
4.5.1 Envolvimento dos cromossomos 9 e 11......................................40
4.5.2 Envolvimento do cromossomo 11 com rearranjo do gene MLL...41
4.5.2.1 Rearranjo do gene MLL com
envolvimento do cromossomo 10...................................41
4.6 Anormalidade variante da t(15;17) ........................................................... 42
4.7 Envolvimento dos cromossomos 5 e 7
associados a outras anomalias cromossômicas.......................................43
5. Discussão ............................................................................................................ 46
6. Conclusão ............................................................................................................ 53
7. Referências .......................................................................................................... 54
8. Anexos ................................................................................................................. 66
8.1 Anexo I.......................................................................................................66
8.2 Anexo II......................................................................................................70
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1 Classificação morfológica, imunológica e citoquímica da LMA............5

Tabela 1.2 Classificação da Leucemia Mielóide Aguda proposta pela
Organização Mundial da Saúde (2008)................................................7
Tabela 1.3 Sumário das anormalidades cromossômicas numéricas e
estruturais da LMA................................................................................19
Tabela 1.4 Estratificação de risco, recaída e sobrevida da LMA............................22
Tabela 4.1 Dados clínicos dos pacientes diagnosticados com LMA apresentando
cariótipos complexos – Sexo, Idade, Leucócitos, Plaquetas e Estado
Clínico...................................................................................................31
Tabela 4.2 Pacientes diagnosticados com LMA apresentando cariótipos complexos
– bandeamento G, FISH e MCB...........................................................45
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 Medula óssea hipercelular com diversos blastos mielóides..................2

Figura 1.2 Sintomas de Leucemia..........................................................................2
Figura 1.3 Esquematização da maturação das células hematopoéticas e suas
respectivas linhagens de acordo com a classificação FAB. .................4
Figura 1.4 Leucemia Mielóide Aguda – LMA-M0....................................................8
Figura 1.5 Leucemia Mielóide Aguda – LMA-M1....................................................9
Figura 1.6 Leucemia Mielóide Aguda – LMA-M2...................................................10
Figura 1.7 Leucemia Promiélocítica Aguda – LMA-M3..........................................10
Figura 1.8 Leucemia Mielomonocítica Aguda – LMA-M4.......................................11
Figura 1.9 Leucemia Monoblástica Aguda – LMA-M5...........................................12
Figura 1.10 Eritroleucemia Aguda – LMA-M6..........................................................13
Figura 1.11 Leucemia Megacarioblástica Aguda – LMA-M7....................................14
Figura 1.12 As anormalidades genéticas na genéticas
na Leucemia Mielóide Aguda................................................................15
Figura 3.1 Multicolor Chromosome Banding..........................................................30
Figura 4.1 Subtipos FAB associados às diferentes faixas etárias
encontradas no presente estudo...........................................................32
Figura 4.2 Comparação entre o número de cromossomos envolvidos nas
anormalidades apresentadas neste estudo..........................................32
Figura 4.3 Comparação entre número de subtipos morfológicos
presentes neste estudo.........................................................................33
Figura 4.4 Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 4.............33
Figura 4.5 Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 11...........34
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABL C-Abl Oncogene 1, Non-Receptor Tyrosine Kinase

ALM Activating Loop Mutations
BACs Bacterial Artificial Chromosomes – Cromossomos artificiais
bacterianos
BCR Breakpoint Cluster Region
CBF Core-Binding Factor
CBFβ Core-Binding Factor, Beta Subunit
CC Cariótipo(s) Complexo(s)
CCD Charge Coupled Device / Dispositivo de carga acoplada
CEP Centromere probes / Sondas para centrômero
CD Cluster Diferentiation / Antígeno de diferenciação
CEBPA CCAAT/enhancer-binding protein alpha
CEMO Centro de Transplante de Medula Óssea
CGH Comparative Genomic Hybridization / Hibridização
Genômica Comparativa
DAPI 4,6-Diamino-2-Fenilindol
DEK DEK Oncogene
DNA Desoxorribonucleic acid / Ácido Desoxorribonucleico
DOP-PCR Degenerate oligonucleotide primed – polymerase chain reaction /
Reação da polimenrase em cadeia com oligonucleotídeos
degenerados
EVI1 Ecotropic Virus Integration Site 1 Protein Homolog
FAB French-American-British Classification / Classificação
Franco-americano-britânica
FISH Fluoresence in situ Hybridization – Hibridização
in situ por fluorescência
FLT3 FMS-like Tyrosina Kinase 3
HLA-DR Antígeno humano do complexo de histocompatibilidade de
classe 2
INCA Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da SIlva
IPPMG Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira
xiii
ISCN International System for Chromosome Nomenclature /
Sistema Internacional de Nomenclatura Cromossômica
ITD Internal Tandem Duplication
KCl Cloreto de Potássio
LMA Leucemia Mielóide Aguda
LPA Leucemia Promielocítica Aguda
LSI Locus Specific - lócus específico
M Molar
M3v Subtipo M3 variante
M4Eo Subtipo M4 com eosinofilia
MAL Mal, T-Cell Differentiation Protein
mb megabases
MCB Multicolor Chromosome Banding / Bandeamento
cromossômico multicor
M-FISH Multiplex-FISH
mL Mililitro
MLL Mixed Lineage Leukemia gene/ Gene de linhagem
leucêmica mista
MLLT (1/3/4/10/11) Mixed-Lineage Leukemia; Translocated To (1/3/4/10/11)
mm Milímetro
MPO Mieloperoxidase
MRC Medical Research Council
MYH11 Myosin, Heavy Chain 11
NPM Nucleophosmin
NUMA Nuclear Mitotic Apparatus Protein
NUP214 Nucleoporin 214kDa
OTT One-Twenty Two Protein
PCP Partial Chromosome Painting - Pintura Cromossômica Parcial
Ph Cromossomo Philadelphia
pH Potencial Hidrogeniônico
PLZF Promyelocytic Leukemia Zinc Finger
PML Promyelocytic Leukemia Protein
xiv
PTPN11 tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11
RARα Retinoic Acid Receptor Alpha / Receptor de Ácido Retinóico Alfa
RAS GTPase activating protein
RPN1 Ribophorin-1
RQ-PCR Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction
RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction /
Transcriptase reversa seguida de reação em cadeia da
polimerase
RUNX1 Runt-Related Transcription Factor 1
RUNX1T1 Runt-Related Transcription Factor 1; Translocated To 1
SB Sudan Black B
SKY Spectral Karyotype / Cariótipo Espectral
SNP Single Nucleotide Polymorphism array
SMD Síndrome Mielodisplásica
SSC Solução salina de citrato
ST Sobrevida Total
TdT Terminal deoxynucleotidyl Transferase
WCP Whole Chromosome Painting - Pintura cromossômica total
WHO World Health Organization / Organização Mundial da Saúde
WT1 Wilms Tumor 1
μg/mL micrograma/mililitro
μl Microlitro
μg Micrograma
μm Micrômetro
(gene) / (gene) Fusão gênica entre os genes descriminados
Termos citogenéticos - Simbologia da nomenclatura:

c constitucional
del Deleção
der Derivativo
dic Dicêntrico
dup Duplicação
xv
inv Inversão cromossômica
ter Região cromossômica terminal
mar Cromossomo marcador
p Braço curto do cromossomo
q Braço longo do cromossomo
subtel Região Subtelomérica
t translocação
(-) sinal negativo Perda de material genético
(+) sinal positivo Ganho de material genético
() parênteses Delimita os cromossomos alterados e os pontos de
quebra
[Nº], nº entre [ ] Representa o número de células com determinada alteração
(,) vírgula Separa nº de cromossomos, cromossomos sexuais e
anormalidades cromossômicas
(;) ponto e vírgula Separa cromossomos e as regiões cromossômicas quando os
rearranjos estruturais envolvem mais de um cromossomo
(/) barra inclinada Separa os clones de um cariótipo
(?) interrogação Identificação questionável de cromossomo ou estrutura
cromossômica
XeY Cromossomos sexuais
(:) dois pontos Quebra
(::) dois pontos Quebra e união
duplos
-> de – à
xvi
1. Introdução
1.1 Leucemias
As leucemias são um grupo heterogêneo de doenças que se caracterizam

pela proliferação clonal de células de linhagem hematopoética, que sofreram
alterações genéticas, as quais se manifestam em uma determinada fase durante a
sua diferenciação. Tais alterações afetam genes importantes para o controle de
mecanismos naturais de proliferação, diferenciação/maturação e apoptose. Estas
células neoplásicas, originadas na medula óssea, podem se infiltrar no sangue
periférico e tecidos tais como amígdalas, linfonodos, pele, baço, rins e sistema
nervoso central, entre outros. (GILLILAND; JORDAN; FELIX, 2004; INCA, 2013).
Dependendo do curso clínico, as leucemias podem ser classificadas como crônicas
ou agudas. As leucemias podem ser de origem mielóide, quando acometem a
linhagem dos mieloblastos, ou linfóide, quando acometem a linhagem linfoblástica
(LO-COCO & AMMATUNA, 2006).
Do mesmo modo que outros tipos de câncer, a leucemia pode resultar da

consequência de múltiplas etapas mutacionais de diversos genes nas células
progenitoras, no microambiente medular (ALBERTS et al., 2004).
A princípio, o primeiro evento – mutação – culmina em uma hematopoese

clonal. São oriundas desta etapa, alterações clonais comumente associadas à perda
de genes supressores de tumor. Contudo, sabe-se que isoladamente, este único tipo
de mutação não é suficiente para o desenvolvimento da leucemia, sendo para isso,
necessária a aquisição de anormalidades cariotípicas e/ou mutações nas células da
medula óssea. Neste último estágio, prévio ao estabelecimento da doença, é
evidenciada a parada maturativa, seguido por um aumento da população blástica na
medula (GILLILAND; JORDAN; FELIX, 2004).
A medula óssea, de pacientes portadores de leucemia, normalmente se

apresenta hipercelular, e no sangue periférico é então observada uma leucocitose,
predominando as células imaturas (Fig., 1.1), sugerindo que as células alteradas
possuem vantagem na sobrevivência. Conforme vai aumentando a população
destas células imaturas, na medula óssea, elas acabam por substituir mielócitos,
megacariócitos, eritrócitos ou seus progenitores, culminando na perda da função da
medula óssea e levando a complicações como hemorragias, infecções e anemia. Ao
exame físico, o paciente pode apresentar palidez, febre, esplenomegalia,
1
sangramento nasal, hemorragias conjuntivais, sangramentos gengivais, equimoses
(Fig., 1.2A) e petéquias (Fig., 1.2B). No entanto, a confirmação do diagnóstico só é
feita no exame da medula óssea (mielograma) (BENNETT et al., 1976;
BLOOMFIELD; FOON; LEVINE, 1993). A susceptibilidade à infecções e as
hemorragias são os principais fatores que podem levar a óbito.
Figura 1.1 – Medula óssea hipercelular com diversos blastos mielóides. Fonte:
http://www.flickr.com/photos/lunarcaustic/2938630316/in/set-72157603324290191
Figura 1.2 – Sintomas de Leucemia. (A) Pele apresentando equimose; (B) Pele com a presença
de petéquias. Fonte: http://www.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=344
O principal evento causador da leucemia ainda é desconhecido, porém alguns

fatores podem estar associados com o desenvolvimento desta neoplasia no ser
humano, como a exposição a radiações, agentes químicos, viroses e
hereditariedade. Com o advento das técnicas moleculares, houve progressos no
entendimento das transformações malignas a nível molecular como os mecanismos
de ativações de oncogenes e suas consequentes alterações no DNA, as quais se
ressaltaram como fatores de risco em potencial para elucidar os mecanismos
etiopatológicos das leucemias. Do mesmo modo, aberrações de determinadas
2
expressões de proto-oncogenes também já estão bem estabelecidas como fatores
que podem induzir o aparecimento da leucemia mielóide aguda, por exemplo
(SANDLER & ROSS, 1997; ESTEY & DÖHNER, 2006).
1.2 Leucemia Mielóide Aguda
A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma doença heterogênea caracterizada

pela transformação e expansão de uma célula-tronco progenitora de origem mielóide
(HEAD, 2004). Através desta, no microambiente da medula óssea, ocorrerá um
acúmulo excessivo de precursores mielóides, os quais perderam a competência
para diferenciação e de resposta a reguladores normais de proliferação. A LMA é
uma doença mais comum em adultos, correspondendo a cerca de 80% dos casos
de leucemias agudas em pacientes com uma média de idade de 70 anos, com uma
incidência de 4 casos a cada 100.000 indivíduos. Em pacientes pediátricos, chega a
marca de 7.6 milhões de novos casos por ano, o que corresponde a 20% das
leucemias agudas nesta faixa etária e a cerca de 5% de todos os tipos de cânceres
pediátricos, apresentando dois picos de incidência, um logo ao nascer, diminuindo
até o 1 ano de vida e outro na adolescência (HEAD, 2004; KASPERS; REINHARDT,
2011).
Ainda é desconhecido o mecanismo que leva a célula progenitora mielóide a

perder o controle da proliferação celular, causando a expansão do clone leucêmico.
Estas aberrações genéticas podem ser oriundas de diferentes possíveis eventos
mutacionais, como translocações cromossômicas, deleções, dentre outras
(ROWLEY, 1999).
A LMA pode se apresentar como uma doença de novo ou pode ser

secundária à: uma evolução de mielodisplasia, uma crise blástica de leucemia
mielóide crônica, tratamentos que utilizam agentes alquilantes, inibidores de
topoisomerase e/ou radiação ionizante (RUND & BEN-YEHUDA, 2004).
Estudos demonstram que há uma importante diferença geográfica em relação

à incidência de leucemias pediátricas, inclusive relatados entre diferentes grupos
étnicos e raciais. Por exemplo, Arceci e Aplenc (2004), relataram que crianças
negras sofrem a incidência de 5.8 casos por milhão, comparados a 4.8 casos por
milhão em crianças brancas. Em relação às diferenças geográficas no aparecimento
da LMA, já foi descrita uma alta incidência da doença nas crianças de origem latina,
3
hispânica e asiática, sendo a leucemia promielocítica aguda o subtipo mais
encontrado entre as crianças de origem hispânica e latina (JÁCOMO; DE
FIGUEIREDO-PONTES; REGO, 2008) Tais diferenças podem conter informações
importantes, as quais poderão ajudar no esclarecimento dos mecanismos etiológicos
da LMA.
1.3 Classificação, diagnóstico laboratorial e padrão citogenético da LMA
Devido a heterogeneidade desta neoplasia, foram criadas classificações com

o intuito de uniformizá-la. Inicialmente, a classificação francesa-americano-britânica
(FAB) (BENNETT et al., 1976; BENNETT et al., 1985) foi a primeira classificação
utilizada para as LMA. Esta utiliza critérios morfológicos e citoquímicos, considera
um percentual >30% de blastos na medula óssea e divide as LMA em 8 subtipos que
variam entre M0 e M7 de acordo com o grau de maturação celular (Fig., 1.3), cada
qual com suas respectivas peculiaridades (Tabela 1.1).
Figura 1.3 – Esquematização da maturação das células hematopoéticas e suas respectivas linhagens
de acordo com a classificação Franco-Americana-Britânica (FAB). Fonte: Modificado de
<http://hastane.deu.edu.tr/merkezlab/dokuman/ismia/web/www.irvingcrowley.com/cls/maturation.htm>
M0, M1, M2, M3, M4, M5, M6 e M7 – Subtipos morfológicos FAB da LMA
Tabela 1.1 – Classificação morfológica, imunológica e citoquímica da LMA
4
Subtipo
Identificação / % Citoqúmica & Imunofenotipagem
FAB
LMA com diferenciação SB e EN (-), TdT(+/-), aMPO (+), CD33 ou CD13 (+),
M0 mínima CD7+/-, CD14, CD15+/-, CD34
(2%)
MPO(+) e SB (+),aMPO (+),TdT, CD13 ou CD33, HLA-DR
LMA sem maturação
M1 +, CD14, CD15, CD34, CD4+/-
(10-20%)
MPO (+) SB (+), EN (-):, CD14(+/-);CD11(+), CD33 e/ou
LMA c/ maturação
M2 CD13 (+), aMPO(+), HLA-DR +,CD14, CD4
(27-29%)
MPO (+), SB (+), CD14(-);CD11(+);CD15(+);HLA(-),
Leucemia promielocítica
M3 CD33/CD13 (+), aMPO (+)
aguda (5-19%)
MPO (+) SB (+) e EN (+)CD14(+);CD11(+/-);HLA(+),
Leucemia mielomonocítica CD33/CD13 (+),
M4
(16-25%) CD13, CD33, CD15, CD36, HLA-DR +/-, CD4, CD34+/-,
TdT+/-
M4Eo Leucemia mielomonocítica MPO (+) SB (+) EN (+)CD14(+/-);CD11(+); HLA (+),
(variante c/ eosinófilos anormais CD33/CD13 (+/-), CD15, CD36,CD34+/-, TdT+/-
M4) (5-10%)
Leucemia monocítica CD11c, CD13, CD33, CD36, HLA-DR +, CD15, CD14,
M5 aguda CD4, CD34, CD7+/- ,MPO (-) SB (-),EN (+)
(10-22%)
Eritrócito: Glicoproteina A+, CD71, CD45+/-, Mieloblasto:
M6 Eritroleucemia (2-5%) os mesmos da M1, SB (+), MPO (+), EN (-)
CD36, CD41, CD42, ou CD61+, CD34, CD13, CD33+/-,

Leucemia megacariocítica
M7 HLA-DR+, SB (-), MPO(-), EN (+)
Aguda (4-8%)
M0, M1, M2, M3, M4, M4Eo, M5, M6 e M7 – Subtipos morfológicos FAB da LMA, CD – Cluster
Differentiation, SB – Suddan Black, MPO – mieloperoxidase, aMPO – anti-mieloperoxidase, TdT
Terminal deoxynucleotidyl Transferase, EN – Esterase não-específica, HLA-DR – Antígeno humano
do complexo de histocompatibilidade de classe 2. Adaptado de Bennett et al., 1976
Porém, mesmo que a classificação FAB reconheça a heterogeneidade da

LMA, e que a mesma ainda seja utilizada, ela nem sempre consegue abranger toda
a diversidade clínica e genética da doença. Contudo, a morfologia que leva em
consideração o tipo de célula predominante, seu grau de maturação e o
delineamento mais preciso da linhagem hematopoética, não poderia ser descartada,
mas sim deveria ser incorporada nos sistemas de classificação atuais (HEEREMA-
MCKENNEY & ARBER, 2009).
Portanto, uma nova classificação para as neoplasias hematopoéticas
mielóides e linfóides foi estabelecida pela Organização Mundial da Saúde (WHO)
(Tabela 1.2), atualizando as propostas da classificação FAB e levando em
consideração a importância do padrão citogenético e sua associação na doença.
Esta requer, a avaliação dos blastos leucêmicos através de análises moleculares e
de citometria de fluxo (HARRIS et al., 1999).
5
Os resultados combinados destes 4 métodos de avaliação (aspectos clínicos,
biológicos, imunofenotípicos e genéticos) não apenas melhor diferenciam a LMA da
leucemia linfoblástica aguda, mas também categorizam os subtipos das leucemias
agudas. Definindo mais claramente as distintas entidades envolvidas na LMA,
através da introdução de informações citogenéticas e moleculares, podemos
caracterizar melhor o subtipo de leucemia de um paciente, e ajudar a prever o
comportamento clínico da doença, seu prognóstico, bem como indicar o tratamento
mais adequado (REGO & FALCÃO, 2002; CUCUIANU, 2005).
As duas diferenças mais significantes entre a classificação FAB e a WHO são:
(a) Um limite de blastos inferior para o diagnóstico de LMA. A WHO estabelece uma
suspeita de diagnóstico de LMA quando o percentual de blastos, na medula óssea,
chega a 20%, ao invés dos, pelo menos, 30% estipulados pela FAB. (b) Pacientes
com anormalidades citogenéticas clonais recorrentes, t(8;21)(q22;q22),
t(16;16)(p13;q22), inv(16)(p13;q22), ou a t(15;17)(q22;q12), devem ser
diagnosticados com LMA, independente do percentual de blastos (ABDUL-HAMID,
2011).
6
Tabela 1.2 – Classificação da Leucemia Mielóide Aguda proposta pela Organização
Mundial da Saúde (2008)
Leucemia Mielóide Aguda (LMA) e precursores relacionados à neoplasia
LMA com anormalidades genéticas recorrentes

LMA com t(8;21)(q22;q22); RUNX1/RUNX1T1
LMA com inv(16)(p13.1q22) ou t(16;16)(p13.1;q22); CBFβ/MYH11
Leucemia Promiélocítica Aguda com t(15;17)(q22;q12); PML/RARα
LMA com t(9;11)(p22;q23); MLLT3/MLL e demais rearranjos do gene MLL
LMA com t(6;9)(p23;q34); DEK/NUP214
LMA com inv(3)(q21q26.2) ou t(3;3)(q21;q26.2); RPN1/EVI1
LMA com mutação em NPM1
LMA com mutação em CEBPA
LMA com displasia de múltiplas linhagens
- Seguida de Síndrome Mielodisplásica (SMD)
- Sem antecedente de SMD
LMA e SMD associadas a tratamento
- Associada a agentes alquilantes/radiação
- Associada a inibidores de topoisomerase-II
Sarcoma mielóide
Proliferações mielóides relacionadas à Síndrome de Down
- Mielopoese anormal transitória
- Leucemia mielóide associada à Síndrome de Down
Neoplasia de células dendríticas plasmocitóides blásticas
LMA – Leucemia Mielóide Aguda, t – translocação, inv – inversão, p – braço curto do cromossomo, q
– braço longo do cromossomo, SMD – Síndrome Mielodisplásica. Fonte: Adaptado de Dohner et
al., 2010
Trabalhos na literatura têm apontado que aproximadamente 85% das crianças

com LMA apresentam alterações cromossômicas na medula óssea e/ou no sangue
periférico, no momento do diagnóstico (RAIMONDI et al., 1999; MANOLA, 2009); já
nos pacientes adultos acometidos pela doença, estas alterações são detectadas em
aproximadamente 60% dos casos (MRÓZEK; HEEREMA; BLOOMFIELD, 2004).
7
Na LMA podem ser encontradas alterações citogenéticas dos tipos numéricas
e/ou estruturais. As alterações numéricas abrangem monossomias e nulissomias, o
que resulta em um cariótipo com menos de 46 cromossomos ou, trissomias,
tetrassomias, dentre outras, demonstrando um cariótipo hiperdiplóide, com mais de
46 cromossomos (MANOLA, 2009). As anomalias estruturais são principalmente as
translocações e inversões. Algumas anormalidades cromossômicas estão
associadas com os subtipos da classificação FAB. A t(8;21)(q22;q22) está associada
ao subtipo M2, a t(15;17)(q22;q21) associada ao M3 e a inv(16) à M4, por exemplo
(RAIMONDI et al., 1999; MANOLA, 2009).
1.3.1 Leucemia Mielóide Aguda minimamente diferenciada – LMA-M0
Este subtipo é considerado raro, acometendo cerca de 2-10% dos pacientes

com LMA. Estes pacientes apresentam 40% de leucocitose e mais de 50% de
leucocitopenia. Sua citologia apresenta 3% ou menos dos blastos positivos para a
reação de mieloperoxidase (MPO) e “sudan black B” (SB), positividade para os
marcadores mielóides CD13, CD14, CD15 ou CD33, CD34 e negatividade para os
marcadores de linhagem de células B ou T (BENNETT et al., 1991; DA SILVA et al.,
2006). Os blastos são indiferenciados (Fig., 1.4A). O M0 apresenta um alto
percentual de cariótipos complexos (20%) e desbalanceados. Também é comum
observar anormalidades envolvendo os cromossomos 5 e 7 em 15-20% dos casos,
anormalidades envolvendo o cromossomo 8 e a região 11q23 em 10-15% e cariótipo
normal em 25% dos casos, sugerindo mutações pontuais. A t(9;22)(q34;q11) (Fig.,
1.4B) pode ser encontrada em 5% dos casos (BOHLANDER, 2005).
Figura 1.4 – Leucemia Mielóide Aguda – LMA-M0. A) Blastos característicos do M0. Fonte:
Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo parcial apresentando a t(9;22)(q34;q11). As setas em
vermelho indicam a translocação cromossômica. Fonte: Modificado de Bohlander, 2005.
<http://AtlasGeneticsOncology.org/Anomalies/t0922p24q11ID1331.html>
8
1.3.2 Leucemia Mielóide Aguda sem maturação – LMA-M1
O subtipo M1 está presente em cerca de 10-20% dos casos de LMA, porém é
raro na infância, representando apenas 1-2% dos casos. Dos pacientes acometidos
por este subtipo, 50% apresentam leucocitose no momento do diagnóstico. Quanto à
citologia, no sangue periférico, a célula predominante é normalmente um mieloblasto
pouco diferenciado (Fig., 1.5A). Bastões de Auer são encontrados em
aproximadamente 50% dos blastos do M1. Mais de 3% dos blastos são positivos
para a reação de MPO e SB, indicando diferenciação dos granulócitos (BENNETT et
al., 1976), e os antígenos mielóides frequentemente positivos são: CD13, CD14,
CD15, CD33 e CD34. Quanto à caracterização citogenética, o M1 apresenta uma
alta frequência de aberrações cromossômicas clonais, mostrando uma associação
com a trissomia dos cromossomos 4, 11, 13 e 21. A t(6;9)(p23;q34) (Fig., 1.5B) está
associada a este subtipo, presente em 1% dos casos totais de LMA (BACHER, U. et
al., 2005; DA SILVA et al., 2006).
Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo parcial demonstrando translocação t(6;9)(q23;q34).
As setas em vermelho indicam a translocação cromossômica. Fonte: Modificado de Huret, 1998.
<http://atlasgeneticsoncology.org/Anomalies/t0609.html>
1.3.3 Leucemia Mielóide Aguda com maturação – LMA-M2

O subtipo M2 está presente em cerca de 27-29% dos casos. As
características e sintomas presentes neste subtipo são similares às do M1. Em
relação a citologia, a característica que distingue a LMA-M2 da M1 é justamente a
maturação, maior ou a nível do estágio de promielócito (Fig. 1.6A). A medula óssea
é hipercelular, e o tipo celular mais comum é o mieloblasto. Os antígenos,
diferenciais, frequentemente observados em casos de LMA-M2 são CD13 e CD15
(ABDUL-HAMID, 2011). A anormalidade citogenética específica associada a este
subtipo é a t(8;21)(q22;q22) presente em 10-15% dos casos, sendo a segunda
alteração citogenética estrutural mais encontrada na LMA da infância (Fig., 1.6B). A
fusão gênica RUNX1-RUNX1T1 (ou AML1/ETO), que resulta da t(8;21)(q22;q22),
também é associada a este subtipo (DA SILVA et al., 2006).
9
Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo parcial demonstrando a translocação t(8;21)(q22;q22).
As setas em vermelho indicam a translocação cromossômica. Fonte: Capela de Matos, R.R. –
Laboratório de Citogenética – CEMO - INCA
1.3.4 Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) – LMA-M3

A LPA corresponde a cerca de 5-19% dos casos de LMA. Quanto à citologia,
a LPA apresenta prevalência de promielócitos anormais hipergranulares (Fig., 1.7A),
com muitos bastonetes de Auer por célula. O subtipo M3v (M3 variante) se
caracteriza por fina granulação e pequeno número de bastões de Auer. As reações
para MPO e SB, são bem marcadas, tanto para M3 quanto para M3v. Os
marcadores imunofenotípicos mais frequentes são: CD13, CD15, CD1, CD33, CD2 e
CD19, com negatividade para HLA-DR e CD34 (ABDUL-HAMID, 2011). Os
pacientes com LPA podem vir a desenvolver coagulação intravascular disseminada,
a mais séria complicação clínica da LMA-M3. Estudos citogenéticos têm revelado
que quase a totalidade dos casos de LPA (>95%) apresentam a translocação
t(15;17)(q22;q21) (Fig., 1.7B), levando à fusão gênica PML/RARα ou RARα/PML. As
translocações variantes comumente descritas são: t(11;17)(q23;q12) levando à
fusão RARα/PLZF; a t(5;17)(q23;q12) levando à RARα/NPM; t(11;17)(q13;q12)
levando à RARα/NUMA (SCHOCH, 2006). Anormalidades adicionais são comuns,
observadas em 35-45% dos casos de LPA, sendo a mais frequente a trissomia do
cromossomo 8.
Figura 1.7 – Leucemia Promiélocítica Aguda – LMA-M3. A) Blastos característicos do M3. Fonte:
Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Translocação t(15;17)(q22;q21) – cariótipo parcial. As setas em
vermelho indicam a translocação cromossômica. Fonte: Capela de Matos, R.R. – Laboratório de
Citogenética – CEMO – INCA
10
1.3.5 Leucemia Mielomonocítica Aguda – LMA-M4
Este subtipo, presente em 16-25% dos casos de LMA, se distingue dos M1,
M2 e M3 devido a um aumento na proporção de células monocíticas na medula
óssea e/ou sangue periférico (Fig., 1.8A). O paciente acometido por este subtipo
apresenta hiperplasia gengival com sangramento na gengiva, anemia e
trombocitopenia. A contagem leucocitária apresenta normalmente um aumento das
células monocíticas. Quanto à citologia, a soma de células mielocíticas, incluindo
mieloblastos, promielócitos e granulóctios maduros é >20% e <80% das células não-
eritróides. Com uma leve discrepância, alguns casos raros de LMA-M4 são
caracterizados por um aumento de eosinófilos na medula óssea, e estes são
classificados como M4Eo (M4 Eosinofílica) (BERGER et al., 1985; DA SILVA et al.,
2006). O M4 apresenta reações positivas para SB, MPO, além de esterase
específica e não específica. O perfil imunológico demonstra positividade para CD13,
CD33, CD11b e CD14. Quanto à citogenética, a anormalidade característica mais
frequente é a inv(16)(p13;q22) (Fig., 1.8B) acometendo de 6-12% dos pacientes
pediátricos e de 8-12% dos adultos com LMA. Suas conhecidas variantes são a
del(16)(q22) e a t(16;16)(p13;q22) (HURET, 1999).
Figura 1.8 – Leucemia Mielomonocítica Aguda – LMA-M4. A) Blastos característicos do M4. Fonte:
Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo parcial apresentando a recorrente inv(16)(p13;q22). A
seta em vermelho indica a inversão cromossômica. Fonte: Capela de Matos, R.R. – Laboratório de
Citogenética – CEMO - INCA
1.3.6 Leucemia Monoblástica Aguda – LMA-M5

Este subtipo corresponde a aproximadamente 10-22% dos casos. Os
sintomas comuns do subtipo M5 são: fraqueza, sangramento e uma erupção
cutânea eritematosa difusa. Há uma alta frequência de infiltração extramedular nos
pulmões, cólon, meninges, linfonodos, bexiga e laringe, além de hiperplasia
gengival. Quanto à citologia, o critério diferencial para o diagnóstico laboratorial é
que 80% ou mais de todas as células não-eritróides, na medula óssea, sejam células
monocíticas (Fig., 1.9A). Existem dois tipos distintos, o 5a, com índice de maturação
11
menor que 4%, e o 5b, com índice de maturação maior que 4%. O M5a apresenta o
número de granulócitos menor que 20%, monócitos maior que 80% e monoblastos
maior que 80%. O tipo M5b apresenta o número de granulócitos menor que 20%,
monócitos maior que 80% e monoblastos menor que 80%. MPO e SB se
apresentam fracos no monoblasto, e a imunofenotipagem mostra o perfil com
positividade para CD11b e CD14. Em relação à citogenética, normalmente,
pacientes acometidos por este subtipo, e pelo previamente descrito (M4), são
estratificados como alto risco devido a forte associação da LMA M5 e M4 com
deleções ou translocações envolvendo a região 11q23 (loci do gene MLL), e neste
contexto, destaca-se a translocação recorrente t(9;11)(p22;q23), presente em 8-10%
dos casos em pacientes pediátricos e de 1-2% em adultos (Fig., 1.9B), levando à
fusão gênica MLL-MLLT3 (DA SILVA et al., 2006; ABDUL-HAMID, 2011).
Figura 1.9 – Leucemia Monoblástica Aguda – LMA-M5. A) Blastos característicos do M5; Fonte:
Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo parcial apresentando a recorrente t(9;11)(p22;q23).
As setas em vermelho indicam a translocação cromossômica. Fonte: Capela de Matos, R.R. –
Laboratório de Citogenética – CEMO - INCA
1.3.7 Eritroleucemia Aguda – LMA-M6

O M6 é um subtipo raro de leucemia, especialmente na infância,
representando apenas de 2-5% dos casos de LMA. As manifestações clínicas mais
comuns são sangramento, anemia com eritrócitos e hemácias anormais. Há,
normalmente, diminuição na contagem de leucócitos e plaquetas. Seu diagnóstico
pode ser determinado quando mais de 50% de todas as células nucleadas da
medula óssea são eritróides (ABDUL-HAMID, 2011). Neste subtipo morfológico,
eritroblasto se apresenta anormal (Fig., 1.10). O perfil imunofenotípico das células
blásticas expressa CD13, CD33, anti-MPO, com ou sem a expressão de marcadores
de precursores determinantes para as células blásticas dos demais subtipos de
LMA, como: CD34 e HLA-DR. Quanto à caracterização citogenética, assim como os
subtipos morfológicos M0 e M1, o M6 não está associado à anomalias
12
cromossômicas específicas, porém apresenta uma alta incidência de cariótipos
complexos, chegando a cerca de 61% dos casos (BACHER et al., 2005).
Figura 1.10 – Eritroleucemia Aguda – LMA-M6. A) Blastos característicos do M6. Fonte: Modificado
de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo complexo M6. Fonte: Modificado de
<http://www.meds.com/leukemia/facts/facts_m6.html>
1.3.8 Leucemia Megacarioblástica Aguda – LMA-M7

O subtipo M7 é raro, presente em apenas 2% dos pacientes pediátricos. É
caracterizado pela ocorrência de megacarioblastos com fibrose medular associada.
Seu diagnóstico inicial demonstra pancitopenia. Quanto à citologia, o M7 apresenta
mais de 30% de blastos na medula, e um número elevado de fibroblastos (Fig.,
1.11A) e/ou reticulina. A reação para MPO é negativa, e o perfil imunofenotípico
demonstra positividade para CD41, CD42 e CD61. Em relação à caracterização
citogenética, não há uma anormalidade cromossômica específica associada ao
subtipo M7. Comumente, o cariótipo dos pacientes acometidos por este subtipo da
doença se apresentam anormais, com aberrações complexas e anormalidades
envolvendo os cromossomos 5 e 7. Porém, no que diz respeito estritamente aos
pacientes pediátricos, a t(1;22)(p13;q13) (Fig., 1.11B) vem sendo reportada na
literatura em aproximadamente 50% dos casos. Ainda nesta faixa etária, em cerca
de 10% dos pacientes o cariótipo é normal, sugerindo possíveis mutações pontuais
(CUNEO; CAVAZZINI; CASTOLDI, 2003).
13
Figura 1.11 – Leucemia Megacarioblástica Aguda – LMA-M7. A) Blastos característicos do M7. Fonte:
Modificado de Abdul-Hamid, 2011. B) Cariótipo parcial apresentando a t(1;22)(p13;q13). Fonte:
Modificado de Huret, 1997. <http://atlasgeneticsoncology.org/Anomalies/t0122.html>
Apesar da LMA ser uma doença bastante hetrerogênea, seus vários subtipos
parecem compartilhar caminhos similares que levam a leucemogênese. Atualmente,
um modelo bem aceito é o modelo multistep, no qual a LMA se origina a partir da
cooperação entre duas classes de mutações genéticas, responsáveis por regular a
diferenciação e a auto renovação hematopoética. As mutações de tipo II (como as
translocações) alteram a habilidade de diferenciação das células precursoras,
enquanto que as mutações de tipo I (FLT/ITD ou mutações pontuais no c-KIT),
fornecem um sinal proliferativo, levando ao surgimento da LMA. Uma vez que 80%
das crianças com LMA apresentam alterações estruturais genômicas associadas à
doença, e 76% daquelas que apresentam cariótipo normal têm ao menos uma
mutação conhecida, em seu perfil mutacional, observa-se que atualmente 90% dos
pacientes pediátricos com LMA tem pelo menos uma anormalidade genômica
conhecida (Fig., 1.12) (PUI et al, 2011).
14
Figura 1.12 – As anormalidades genéticas na Leucemia Mielóide Aguda – O painel da esquerda mostra as alterações cariotípicas mais comuns. O Perfil de
mutação naqueles sem anomalias citogenéticas (cariótipo normal) é mostrado no painel da direita. Fonte: Modificado de Pui et al., 2011. del – deleção, (-) –
monossomia, (+) – trissomia, t – translocação, inv – inversão, q – braço longo do cromossomo
15
1.4 A relevância da caracterização citogenética tumoral
Recentes dados da literatura, à exemplo da revisão de Braoudaki e
Tzortzatou-Stathopoulou (2012), tem demonstrado que a análise citogenética de
genes envolvidos em translocações específicas à doença, é considerada uma das
mais poderosas ferramentas, levando a uma melhor compreensão das causas dos
rearranjos cromossômicos e dos mecanismos subjacentes à transformação
leucêmica. Mais precisamente, a análise citogenética vem propiciando
conhecimentos notáveis quanto à heterogeneidade de uma população celular, além
de permitir a detecção de diversas anormalidades genéticas e cromossômicas em
diversos tipos de malignidades mielóides, incluindo a LMA, e os demais tipos de
leucemias. Por exemplo, para tais neoplasias, a presença ou ausência de
aberrações cromossômicas é um fundamental fator prognóstico (BRAOUDAKI &
TZORTZATOU-STATHOPOULOU, 2012).
Porém, até chegar ao presente nível de conhecimento, foi a uma longa
jornada, pois o potencial da citogenética tumoral estava limitado aos recursos
tecnológicos e científicos da primeira metade do século XX. Se fazia necessário o
aprimoramento das técnicas de obtenção cromossômica e também das técnicas de
análise cariotípica. Este aprimoramento pode ser acompanhado de modo
esquemático, dividindo o desenvolvimento da análise dos cromossomos em 5 fases.
A citogenética tumoral deu seus primeiros passos com a descoberta de
métodos para obtenção de células metafásicas, em culturas celulares in vitro, e se
estendeu até 1969, levando à descoberta do cromossomo philadelphia (Ph) na
leucemia mielóide crônica (NOWELL & HUNGERFORD, 1960). Nesta fase, devido
aos cromossomos serem corados por corante de Giemsa, sem tratamento prévio,
era muito difícil a distinção confiável entre os pares não-homólogos.
A fase 2 teve seu marco com o desenvolvimento da técnica de bandeamento
(1969–1971), a qual tornou possível dar uma identidade precisa aos pares de
cromossomos, bem como caracterizar as alterações cromossômicas de diversas
doenças. Foi então descrita a primeira translocação no câncer humano, a
t(8;21)(q22;q22), em pacientes com LMA (ZECH, 1969) e a natureza do
cromossomo Ph como produto de uma translocação recíproca, envolvendo os
cromossomos 9 e 22, a t(9;22)(q34;q11) (ROWLEY, 1999).
A fase 3 se iniciou com o uso de sondas específicas de DNA marcadas com
material fluorescente, que permitiam identificar genes ou lócus gênicos específicos.
Estas sondas originaram a técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH)
16
(VAN PROOIJEN-KNEGT et al., 1982). O advento desta técnica permitiu a
identificação de anormalidades cromossômicas que envolvem segmentos de DNA
ainda menores, por exemplo revelando os pontos de quebra envolvidos na inversão
pericêntrica do cromossomo 16, ajudando a melhor caracterizar o subtipo M4,
encontrado em pacientes com LMA (KUNDU & LIU, 2001). Porém, o grande impacto
causado pela implementação desta técnica é que ela não necessita de metáfases de
boa qualidade, permitindo a identificação de aberrações cromossômicas,
diretamente em células em intérfase, obtidas a partir de suspensões, de tecido
congelado ou fixado e incluso em parafina, além da análise em preparações
cromossômicas.
A fase de número 4 começou quando, com a valiosa ideia da combinação de
mais de três fluorocromos, foram desenvolvidas sondas para cromossomos inteiros,
gerando assim um padrão específico de cor para cada um dos 23 pares de
cromossomos (SPEICHER; BALLARD; WARD, 1996; SCHRÖCK et al., 1996). Esta
técnica chamada de cariótipo espectral (SKY) ou FISH multiplex (M-FISH), desde
sua implementação, tem se mostrado uma importante ferramenta na detecção de
translocações, e principalmente, para detectar anomalias cromossômicas
complexas. Previamente, a amplificação de regiões nos braços longos dos
cromossomos 11 (11q), 21 (21q) e 22 (22q), as quais podem desempenhar um papel
importante na leucemogênese, não eram possíveis de ser detectadas em pacientes
com LMA que apresentavam cariótipos complexos (MRÓZEK et al., 2002).
A fase 5 surgiu juntamente com o M-FISH e esta fez uma grande diferença na
caracterização cariotípica. Pelo uso de sondas que foram confeccionadas a partir da
microdissecção de pedaços de todos os cromossomos humanos e posteriormente
marcadas com cinco fluorocromos diferentes, são gerados padrões de cores, para
as bandas e sub-bandas, de cada um dos 24 cromossomos, pela sobreposição
destes vários fragmentos de DNA (WEISE et al., 2008). Denominada Multicolor
Chromosome Banding (MCB), esta técnica tem se mostrado muito importante na
caracterização de cariótipos complexos, e/ou cariótipos com anormalidades crípticas
nas LMA (MACEDO SILVA et al., 2005; SILVA et al., 2008; MARQUES-SALLES et
al., 2009). Isto junto ao fato desta técnica permitir a identificação, com exatidão, dos
pontos de quebra dos cromossomos envolvidos nas alterações cromossômicas,
muitas delas crípticas.
Contudo, em meio a todo o avanço proporcionado pelas técnicas de FISH
multicor, estas apresentam uma limitação bastante pontual, pois necessitam de
17
metáfases de boa qualidade para uma análise fidedigna. Esta limitação foi superada
através da implementação da hibridização genômica comparativa (CGH), técnica
baseada na comparação do DNA genômico normal com o DNA genômico
neoplásico. Nesta, as amostras de DNA são, cada qual, marcadas com fluorocromos
verde e vermelho, respectivamente, misturados em quantidades iguais e
posteriormente é feita a co-hibridização.
O advento desta técnica trouxe avanços na compreensão da biologia de
diversas doenças, como a exemplo da citogenética aplicada a tumores sólidos, que
apresentam limitações na qualidade das metáfases (KEARNEY, 2001). Porém, as
técnicas de FISH não podem ser deixadas para trás, uma vez que para os rearranjos
que não envolvem perdas genômicas, a exemplo das translocações balanceadas e
as inversões, o uso da CGH é limitado, pois não é capaz de detectar rearranjos
estruturais nos quais não ocorrem perdas ou ganhos de material cromossômico, não
fornecendo, portanto, informações sobre os segmentos cromossômicos envolvidos
nestes rearranjos.
Descrito na década de 90, o array CGH utiliza pequenas regiões específicas
do genoma humano. Estes arrays cobrem todo o genoma, com apenas um clone
para cada megabase (mb) de DNA. Esta técnica é aplicada tanto na pesquisa em
genética clinica quanto em genética tumoral. Estes arrays também foram aplicados,
devido a sua flexibilidade, na detecção de perdas de heterozigosidade de
nucleotídeos únicos ou de alterações no número de cópias de determinados
segmentos cromossômicos. Estes foram nomeados Single Nucleotide Polymorphism
(SNP) array e diferentemente do array CGH, no array SNP é hibridizada apenas uma
amostra genômica, possibilitando então a identificação de alterações no número de
cópias pela comparação com a hibridização de um controle independente
(EMANUEL & SAITTA, 2007).
18
Tabela 1.3 – Sumário das anormalidades cromossômicas numéricas e estruturais da LMA
Anormalidades cromossômicas numéricas na LMA
Métodos citogenéticos moleculares para
Anormalidade Número de cromossomos Prognóstico
detecção
Alta hiperdiploiodia 51-67 Citogenética convencional, FISH, M-FISH e CGH Favorável
del (7q) - Citogenética convencional, FISH, M-FISH e CGH Desfavorável
-5 45 Citogenética convencional, FISH, M-FISH e CGH Desfavorável
+8 47 Citogenética convencional, FISH, M-FISH e CGH Favorável
+21 47 Citogenética convencional, FISH, M-FISH e CGH Desfavorável
Anormalidades cromossômicas estruturais na LMA
Métodos citogenéticos moleculares para
Anormalidade Fusão gênica Prognóstico
detecção
t(8;21) (q22;q22) AML1/ETO or RUNX1/RUNX1T1 FISH, RT-PCR Favorável
Inv(16)(p13;q22) CBFβ/MYH11 FISH, MCB, RT-PCR, RQ-PCR Favorável
t(9;22)(q34;q11) BCR/ABL1 FISH, RT-PCR, RQ-PCR Desfavorável
t(15;17)(q22;q21) PML/ RARα FISH, RT-PCR Favorável
11q23 MLL FISH, MCB, RT-PCR Intermediário / Mau
t(11;19)(q23;p13.3) MLL/MLLT1 FISH, MCB, RT-PCR Desfavorável
t(6;11)(q27;q23) MLL/MLLT4 FISH, MCB, RT-PCR Desfavorável
t(9;11)(p22;q23) MLL/MLLT3 FISH, MCB, RT-PCR Favorável
t(10;11)(p12;q23) MLL/MLLT10 FISH, MCB, RT-PCR Desfavorável
9q Desconhecido FISH, RT-PCR Desfavorável
t(1;22)(p13;q13) OTT/MAL FISH, MCB Desfavorável
del – deleção, (-) – monosomia, (+) – trissomia, p – braço curto do cromossomo, q – braço longo do cromossomo, t – translocação, FISH – Fluorescense in
situ Hibridization, MCB – Multicolor Chromosome Banding, CGH – Comparative Genomic Hybridization, RQ-PCR – Real-Time Quantitative Polymerase Chain
Reaction, RT-PCR – Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction. Fonte: Adaptado de Braoudaki & Tzortzatou-Stathopoulou, 2012
19
Neste contexto, a técnica de bandeamento G consegue revelar um cariótipo
complexo, porém não pode apontar a origem dos rearranjos envolvidos, enquanto
que o M-FISH pode identificar os rearranjos cromossômicos presentes, porém não
consegue precisar informações sobre os desbalanceamentos genômicos. Além
disto, o ponto forte do M-FISH (ou SKY) está em definir translocações e
cromossomos marcadores em cariótipos complexos, enquanto que a CGH pode
revelar amplificações e/ou deleções escondidas. Portanto, as tecnologias M-FISH,
MCB e CGH se provaram parceiros eficazes, e ferramentas poderosas na
descoberta de genes (BISHOP, 2010; GREISMAN; HOFFMAN; HI, 2011).
Em suma, devido a heterogeneidade desta doença e seu número cada vez
maior de significância prognóstica individualizada, é importante o uso combinado do
maior arsenal de técnicas citogenéticas disponível, de modo a melhor caracterizar e
desvendar rearranjos cromossômicos complexos (Tabela 1.3).
1.5 Fatores prognósticos e classificação de risco da LMA

A caracterização – e extensões – da LMA, descritas acima, possuem
relevância prognóstica. Acima de aspectos clínicos como idade, sexo, contagem
leucocitária, extensão da doença e morfologia das células, as anormalidades
cromossômicas dominam a nível de fatores prognósticos, em todas as faixas etárias
(KASPERS & REINHARDT, 2011). Devido a ampla e crescente evolução das
técnicas utilizadas na detecção destas anormalidades, cada vez mais é possível
identificar e caracterizar alterações moleculares como possíveis mediadoras da
leucemogênese (Tabela 1.3). Neste contexto, nos últimos 20 anos, o prognóstico
das crianças com LMA melhorou, chegando atualmente a uma taxa de sobrevida
livre de recidiva em 5 anos de quase 40%, para o conjunto de pacientes (HEAD,
2004; BRAOUDAKI & TZORTZATOU-STATHOPOULOU, 2012; PELOQUIN; CHEN;
FATHI, 2013).
A citogenética per se pode dividir os pacientes com LMA em três amplos
grupos de risco (Tabela 1.4), abordando o impacto sobre o risco de recaída, a
sobrevida livre de doença e a sobrevida total: favorável (baixo risco), intermediário, e
desfavorável (alto risco). O grupo com LMA favorável inclui o das leucemias Core
Binding Fator (CBF) t(8;21)(q22;q22) (RUNX1-RUNX1T1), inv(16)(p13;q22)
(MYH11/CBFβ), bem como a t(15;17)(q22;q21) (PML/RARα). O grupo com LMA
desfavorável inclui pacientes que apresentam monossomia do cromossomo 7,
monossomia do cromossomo 5, del(5q), t(6;9)(q23;q34), t(9;22)(q34;q11) e o
20
cromossomo 3 anormal, e cariótipos complexos com estas supracitadas e/ou outras
anormalidades crípticas. O grupo de risco intermediário inclui as demais
anormalidades vistas comumente na LMA, como a trissomia do cromossomo 8 e a
trissomia do cromossomo 21, além de anormalidades associadas à região 11q23
(MLL), bem como pacientes com cariótipo normal (RADHI; MESHINCHI; GAMIS,
2010; KASPERS & REINHARDT, 2011).
Um relevante estudo apontou que cerca de 45% das LMA apresentam
cariótipo normal pela análise da citogenética convencional, sendo necessário então
estudos moleculares para detectar rearranjos ocultos (invisíveis ao nível de
cromossomo, por causa do tamanho, que pode variar de 1 a 2 mb) ou aberrações
moleculares, como por exemplo, mutações pontuais que não podem ser detectadas
na análise por citogenética convencional (YAMAMOTO et al., 2001; CUNEO et al.,
2002; GAMERDINGER et al., 2003; KLAUS et al., 2004).
Ainda como um grupo de anormalidades mal definido, os cariótipos
complexos são possíveis indicadores de mau prognóstico, inclusive em pacientes
pediátricos, o que em parte se deve à raridade da doença, porém ainda assim são
poucos os dados publicados (BETTS et al., 2007). Neste contexto,
concomitantemente, terapias atuais ainda são falhas para tratar pacientes que
apresentam cariótipos complexos. A principal causa da falha no tratamento é a
recaída, ilustrando a ineficiência das abordagens terapêuticas atuais em erradicar o
clone maligno na maioria dos pacientes, até mesmo naqueles que receberam
transplante de medula óssea (TMO) alogênico (SCHOCH et al., 2001).
Portanto, na medida em que as técnicas de citogenética molecular tais como
FISH, M-FISH e MCB são aprimoradas, e a detecção molecular vem sendo
incorporada, as anormalidades citogenéticas podem ser melhor compreendidas e
diferenciadas por seus respectivos impactos sobre o prognóstico (RADHI;
MESHINCHI; GAMIS, 2010). Matos e colaboradores (2013), por exemplo,
demonstraram que abordagens de citogenética molecular puderam precisar
detalhadamente a caracterização de uma anomalia citogenética críptica, nunca
previamente revelada por quaisquer ensaios prévios, que teve importância na
citogenética inicial, na evolução clínica e estratificação de risco do paciente.
Portanto, com pacientes sistematicamente testados e uniformemente tratados,
explorando anormalidades complexas e revelando suas especificidades
moleculares, marcadores prognósticos podem ser identificados, para serem então
possíveis alvos terapêuticos (MATOS et al., 2013).
21
Tabela 1.4 – Estratificação de risco, recaída e sobrevida da LMA
Estratificação de risco
Anormalidades genéticas tipo II Anormalidades genéticas tipo I
Favorável t(8;21) (RUNX1/RUNX1T1), t(15;17) Cariótipo normal: com mutação de NPM1 ou uma mutação
(PML/RARα), t(16;16), inv(16) isolada de CEBPA na ausência de FLT3 mutado
(MYH11/CBFβ)
Intermediário Cariótipo normal, +8, t(9;11) Mutação em c-KIT concomitante à t(8;21), t(16;16), inv(16):
mutação FLT3-ITD com mutação de NPM1
Desfavorável Cariótipos complexos, -5, -7, 5q-, 7q-, Cariótipo normal com mutação FLT3-ITD na ausência de
anormalidades na região 11q23 (MLL) mutação em NPM1
Recaída e sobrevida
Risco de Recaída (RR) % Sobrevida Total (ST) %
Favorável Pacientes pediátricos 32 78
Todas as idades (≤55) 35 65
Intermediário Pacientes pediátricos 40 55
Desfavorável Pacientes pediátricos 61 42
t – translocação, inv – inversão, q – braço longo do cromossomo, (+) – trissomia, (-) – ausência, (%) – por cento, (RR) – Risco de Recaída, (ST) – Sobrevida
Total. Fonte: Adaptado de Radhi; Meschinchi; Gamis, 2010; Arceci & Aplenc, 2011
22
1.6 Cariótipos complexos na LMA
A citogenética é considerada um dos mais importantes parâmetros de
prognóstico na LMA, e embora algumas aberrações cromossômicas já sejam bem
descritas e associadas à subtipos citomorfológicos, ainda, 10-12% de todos os
pacientes acometidos pela LMA, apresentam cariótipos com múltiplos rearranjos
cromossômicos, muitas vezes crípticos, envolvendo três ou mais anormalidades
cromossômicas (MARCHESI et al., 2011; AL-ACHKAR et al., 2013).
Qualquer cariótipo com pelo menos três aberrações cromossômicas,
independentemente do seu tipo e os cromossomos individuais envolvidos, pode ser
referido como cariótipo complexo (CC) (MRÓZEK, 2008; OROZCO & APPELBAUM,
2012; AL-ACHKAR et al., 2013).
Alguns trabalhos tem mostrado que a presença de CC nos blastos da medula
óssea, de pacientes com LMA, tem representado um possível indicador de mau
prognóstico, podendo influenciar negativamente na evolução clínica do paciente. A
literatura também tem demonstrado que na maior parte dos casos, a doença tem
sido resistente ao tratamento inicial, com recaída prematura dos pacientes (BETTS
et al., 2007; MARCHESI et al., 2011).
Além disto, pesquisadores do Medical Research Council (MRC) demostraram,
em um recente trabalho, que a cada anormalidade adicional presente no cariótipo,
aumentam-se os riscos de não se atingir a remissão completa (RC) e o risco de
mortalidade do paciente (OROZCO & APPELBAUM, 2012).
Outros relatos tem demonstrado que a incidência de CC aumenta com a
idade, uma vez que a frequência de CC é significantemente menor em pacientes
pediátricos com LMA quando comparados a adultos também acometidos por esta
neoplasia. Neste contexto, um estudo envolvendo pacientes pediátricos relatou que
a taxa mais alta de CC foi observada em crianças com menos de 3 anos, porém
poucos dados de significância prognóstica foram publicados sobre pacientes nesta
faixa etária (MRÓZEK, 2008; MANOLA, 2009).
Os cariótipos complexos são mais comuns na LMA secundária –
aproximadamente duas vezes mais frequentes do que na LMA de novo – embora
para ambas seja um possível indicador de mau prognóstico – proveniente de um
acúmulo progressivo de aberrações cromossômicas oriundas de tratamento prévio
(agentes alquilantes ou radiação), ou de uma outra doença hematológica (BETTS et
al., 2007; OROZCO & APPELBAUM, 2012). Neste contexto, a literatura também
relata que há um alto percentual de chance de pacientes com SMD, e que
23
apresentam CC, evoluírem para LMA, e ainda mais, que a complexidade do cariótipo
está associada a baixa taxa de sobrevida total (ST) na SMD, bem como a esta
evolução para LMA (VALCÁRCEL et al., 2013).
Como relatado acima, os CC têm sido relacionados, na literatura, com uma
evolução clínica desfavorável, e faz-se importante ressaltar que estes cariótipos
podem carrear, de modo críptico, uma anomalia cromossômica específica,
responsável por um prognóstico adverso, dentre suas alterações (DE FIGUEIREDO
et al., 2012; NEY-GARCIA et al., 2012). Uma vez que tem sido sugerida uma
possível correlação entre a combinação das aberrações detectadas – em um CC – e
a resposta clínica, fica clara a necessidade de um refinamento na caracterização
deste tipo de perfil cariotípico.
24
2. Objetivo
Caracterizar cariótipos complexos e/ou inconclusivos a partir de amostras de
pacientes pediátricos diagnosticados com Leucemia Mielóide Aguda.
2.1 Objetivos específicos:

a) Refinar a caracterização dos cariótipos complexos e/ou inconclusivos
utilizando as técnicas de citogenética molecular: FISH, M-FISH e MCB.
b) Detectar e descrever as anormalidades crípticas, e não crípticas,
encontradas nos cariótipos complexos.
c) Avaliar a eficácia das técnicas de citogenética molecular (FISH, M-FISH e
MCB), na caracterização dos cariótipos complexos e/ou inconclusivos.
25
3. Material e métodos
3.1 Desenho Experimental
Medula óssea/ sangue periférico
Colchicina
Cultura celular
Preparação
Cromossômica
Hipotonia e fixação dos cromossomos
Lâmina teste
Sem mitose Com mitose
FISH Bandeamento G
Cariótipos
Complexos,
Suspeita de
Anormalidades
Crípticas
M-FISH, MCB
26
3.2. Amostra e considerações éticas
O presente estudo teve caráter multicêntrico, utilizando amostras
provenientes de diferentes instituições hospitalares de vários estados brasileiros,
incluindo no Rio de Janeiro, o Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da
Silva (INCA), o Hospital Federal da Lagoa, o Instituto de Puericultura e Pediatria
Martagão Gesteira (IPPMG), e o Hospital dos Servidores do Estado (HSE), na Bahia,
o Hospital ONCOSUL e a Santa Casa de Misericórdia de Itabuna e, em Santa
Catarina, o Hospital Pequeno Príncipe.
Os dados clínicos, os relatos de caso para acompanhamento, bem como os
exames citoquímicos, de imunofenotipagem e morfológicos foram cedidos por
intermédio dos hematologistas responsáveis – na instituição de admissão – pelos
respectivos pacientes.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do INCA,
Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil, sob o cadastro #088/07 e atualizado no último
relatório parcial, em 22/08/2013.
3.3 Critérios de inclusão e exclusão

De acordo com os critérios de inclusão deste estudo foram selecionadas as
amostras com diagnóstico de LMA, nas quais a análise por bandeamento G revelou
cariótipo complexo e/ou inconclusivo, representadas por:
• Amostras que apresentaram metáfases ou cromossomos com

morfologia inadequada para análise;
• Amostras que apresentaram cromossomos marcadores;
• Amostras que apresentaram alterações cromossômicas não possíveis
de serem caracterizadas pela citogenética convencional.
Nos critérios de exclusão estavam:

• Os cariótipos de pacientes com idade superior a 18 anos;
• Os cariótipos de pacientes que, após a análise citogenética com uma
boa morfologia, foram normais.
3.4 Estudo cromossômico por bandeamento G

Os estudos cromossômicos foram realizados em aspirado de medula óssea
e/ou sangue periférico, seguindo os critérios descritos por Silva e colaboradores
27
(2008). Para obtenção de mitoses, foram cultivadas 5 x 10 6 células em 5mL de meio
de cultura composto de RPMI 1640 (Sigma-Aldrich®) (80%) e soro bovino fetal
(HyClone) (20%) em tubos tipo Falcon de 15mL. As células foram incubadas durante
24 horas em estufa de CO2 a 37°C. Após 22-23 horas, foi adicionada uma solução
de colchicina (Difco) numa concentração de 0,05μg/mL. Ao término do período de
incubação, seguiu-se a retirada da cultura e o preparo das lâminas. Após o período
de 24 horas de incubação, as células foram centrifugadas e o precipitado obtido foi
submetido a choque hipotônico, utilizando uma solução de KCl a 0,07M em banho-
maria a 37ºC. Após 15 minutos, as células foram fixadas três vezes em solução de
Carnoy (3 metanol : 1 ácido acético glacial). Na primeira fixação, o material foi
deixado à temperatura ambiente por 20 minutos. Na última fixação, o material foi
ressuspenso em um pequeno volume de fixador para o preparo de lâminas,
pingando-se uma gota da suspensão em lâmina limpa e umedecida. Uma lâmina de
cada tubo Falcon foi observada em microscopia para verificação dos resultados, e
então o material foi estocado na geladeira para posterior análise cromossômica.
Para análise cromossômica, as lâminas de 2-10 dias de preparo foram
incubadas em uma solução de tripsina (Sigma-Aldrich®) 0,1% aquecida a 37°C em
tempos que variaram de 1 segundo a 1 minuto. Em seguida as lâminas foram
lavadas com soro fisiológico e coradas em solução de Giemsa (Merck) a 2% em
tampão fosfato (pH 6,8), por 10 minutos. O padrão cariotípico dos pacientes foi
determinado pela análise de uma média de 20 células metafásicas em microscopia
ótica. Um caso foi considerado anormal quando mais de três células apresentaram a
mesma anomalia cromossômica. A documentação dos cariótipos foi realizada no
computador por um programa analisador de imagem (Ikaros - MetaSystem),
utilizando-se para isso, uma câmera CCD acoplada ao microscópio Olympus BX51.
Os cariótipos foram identificados e classificados de acordo com os sistemas
internacionais para nomenclatura de citogenética humana de 2009 (SHAFFER;
SLOVAK; CAMPBELL, 2009).
3.5. Estudo por citogenética molecular
3.5.1 FISH e M-FISH

Para investigação de rearranjos moleculares, pela técnica FISH, foram
utilizadas sondas comerciais de sequência homóloga de DNA para locus específicos
(LSI) AML1/ETO dual color, dual fusion, CBFβ/MYH11 dual color, break-apart,
28
PML/RARα dual color, dual fusion, e dual color, break-apart para o gene MLL
(Vysis®/Abbott®) e, sondas whole chromosome painting (WCP), partial chromosome
painting (PCP), subteloméricas (subtel), centroméricas (CEP), e sondas
confeccionadas a partir de cromossomos bacterianos artificiais (BAC) específicas
para aberrações e/ou translocações complexas não recorrentes. Além disso, nos
casos que fora detectada a presença de cromossomos marcadores ou de rearranjos
crípticos, foram utilizados diferentes conjuntos de sondas para a técnica do M-FISH,
que consiste na utilização simultânea de pelo menos três diferentes ligantes ou
fluorocromos para a marcação específica de DNA. A técnica de FISH foi aplicada no
restante do material das culturas, mantidas em fixador, sob refrigeração. Depois de
preparadas, as lâminas foram mantidas por dois dias à temperatura ambiente, pré-
tratadas por imersão em 2X SSC, pH 7,0 a 37°C por 30 minutos e desidratadas em
série de etanol 75%, 85% e 100% por dois minutos em cada álcool. Para a
hibridização, 10μl desta mistura (7μl de tampão de hibridação; 2μl de água; 1μl de
sonda) foram colocadas sobre as lâminas e cobertas com lamínulas de vidro de
25x25mm, sendo mantidas aquecidas em placa térmica a 43°C por dois minutos. A
seguir, as lamínulas foram imediatamente vedadas com borracha selante e
incubadas em câmara úmida (50% formamida/2X SSC) a 37°C por 12-16 horas.
Após o período de incubação, as lâminas foram lavadas em três banhos de 50% de
formamida/2X SSC pH 7,0 por 10 minutos cada, seguido da imersão em 2X SSC, pH
7,0 por 10 minutos e por último em 2X SSC 0,1% NP-40 (Vysis®) ou IGEPAL
(Sigma®) por 5 minutos, a 45°C. Para a análise, foi utilizada a contra coloração com
DAPI II. A análise pelo FISH foi feita em microscópio de fluorescência Olympus
BX51 munido de lâmpada HBO 100W e filtros apropriados. A documentação foi
realizada através de uma câmera CCD e do analisador de imagem (Isis da
MetaSystem).
3.5.2 MCB
Para a investigação de rearranjos crípticos e a confirmação de cariótipos
anormais, a técnica de MCB foi aplicada a partir de sondas, que foram
confeccionadas pelo Dr. Thomas Liehr. Estas sondas são geradas pelo processo de
microdissecção de regiões específicas dos cromossomos, como descrito
previamente (LÜDECKE et al., 1989; SENGER et al., 1990). Cada uma das sondas
é baseada em um número de fragmentos cromossômicos que varia de 15 a 20, que
são retirados de cada cromossomo, intencionalmente, de forma imprecisa, para que
29
eles se sobrepusessem. Com isso, são geradas 169 sondas de regiões específicas
que cobrem todo o genoma humano (Fig., 3.1A-B) (LIEHR & CLAUSSEN, 2002;
LIEHR et al., 2002; WEISE et al., 2008).
O DNA isolado é então amplificado pela técnica DOP-PCR (TELENIUS et al.,
1992). A reação de PCR original é feita em um volume de 50μl da amostra inicial.
Desta amostra, um volume de 0.5μl é re-amplificado e um volume de 50μl é obtido
no final. Depois esse processo é repetido e, então, é feita a marcação das sondas
com 5 diferentes fluorocromos: SpectrumOrange, Rhodamine 110, TexasRed,
Cyanine 5 e Cyanine 5.5. Essa marcação também é feita pela técnica de DOP-PCR.
Com isso, de 2 a 10 bibliotecas de sondas são criadas para cada cromossomo.
Quando sobrepostas, essas sondas criam um padrão de pseudocores para cada um
dos 24 cromossomos humanos (Fig., 3.1C). A técnica de MCB é baseada na
mudança da taxa de intensidade de fluorescência ao longo dos cromossomos.
O processo de hibridização, a pós-lavagem e a detecção do sinal foram feitos
de acordo com os experimentos realizados para a técnica de FISH. Os resultados da
hibridização foram documentados em um microscópio de fluorescência da Zeiss
Axioplan equipado com o sistema de análise de imagem Ikaros e Isis de imagem
digital para FISH (MetaSystem), utilizando uma câmera XC77 CCD.
Figura 3.1 – Multicolor Chromosome Banding. A) Padrão de bandeamento cromossômico

multicolorido utilizando as sondas de MCB para os 24 pares de cromossomos humanos; B) Processo
de microdissecção cromossômica utilizado na preparação das sondas de MCB; C) Esquema
ilustrativo do padrão de pseudocores criado pela sobreposição de fragmentos cromossômicos
marcados pelos 5 fluorocromos identificados no rodapé da figura.
30
4. Resultados
4.1 Pacientes, período e local de estudo
Amostras de sangue periférico e/ou medula óssea de 98 pacientes pediátricos
com diagnóstico de LMA, foram encaminhadas para o laboratório de citogenética
(divisão de laboratórios do CEMO-INCA), no período que compreende de Maio de
2007 a Setembro de 2013. Dentre estas, 12 amostras de crianças (12%), foram
diagnosticadas citogenéticamente como cariótipos complexos ou cariótipos
inconclusivos. Tais cariótipos foram então selecionados para estudos moleculares. A
citogenética molecular, através da técnica de FISH, foi realizada no laboratório de
citogenética do INCA, enquanto que as análises por M-FISH e MCB foram feitas no
laboratório de citogenética molecular do instituto de genética humana da
universidade de Jena, na Alemanha, como parte de uma colaboração (CAPES –
PROBRAL/DAAD – projeto # 419/14).
Dentre os pacientes deste estudo, houve predominância do sexo masculino

sobre o feminino na proporção de 2:1. A mediana de idade foi de 6,5 anos. A figura
4.1 relaciona Subtipos FAB associados às diferentes faixas etárias encontradas no
estudo. A mediana da contagem de leucócitos foi de aproximadamente 30.000, e a
mediana da contagem de plaquetas foi de aproximadamente 95.000. A tabela 4.1,
abaixo, ilustra os dados clínicos dos pacientes referidos neste estudo.
Tabela 4.1 – Dados clínicos dos pacientes diagnosticados com LMA apresentando
cariótipos complexos – sexo, idade, leucócitos e plaquetas
Subtipo Estado
Paciente Sexo Idade Leucócitos Plaquetas
morfológico clínico
1 M1 M 8 anos 4.600 90.000 Óbito

2 M4 M 5 anos 68.900 11.000 Em remissão
3 M5 F 13 anos 6.400 318.000 Óbito
4 M4/M5 M 10 meses 53.800 27.000 Óbito
M4/M5 Recada da
5 M 6 anos 18.000 26.000
doença
6 M4 F 1ae2m 140.000 19.000 Óbito
8 M5 M 1 ano e 6m 6.900 208.000 Em remissão
9 M1/M2 F 9 anos 5.400 51.000 Óbito
10 M1/M2 F 13 anos 22.000 96.000 Óbito
M – sexo masculino, F – sexo feminino, a – anos, m – meses de idade, M1, M2, M3, M4, M5 –
Subtipos morfológicos FAB da LMA
31
Figura 4.1 – Subtipos FAB associados às diferentes faixas etárias encontradas no presente estudo.
M1, M2, M3, M4, M5 – Subtipos morfológicos FAB da LMA
4.2 Cromossomos e subtipos morfológicos encontrados no estudo

Todos os cromossomos autossomos do cariótipo humano foram envolvidos
nas anormalidades apresentadas neste estudo, exceto pelos cromossomos 4 e 14.
Quanto aos cromossomos sexuais, 3 casos apresentaram monossomia do
cromossomo Y e 1 caso apresentou monossomia do cromossomo X. O cromossomo
mais envolvido nas aberrações cromossômicas deste estudo foi o 21, presente em 5
/12 casos, seguido pelo cromossomo 8 presente em 4/12 casos (Fig., 4.2). Os
subtipos de LMA mais prevalentes, envolvidos nas anormalidades, foram o M2, M4 e
M5 associados a 4 casos cada um (Fig., 4.3).
Figura 4.2 – Comparação entre o número de cromossomos envolvidos nas anormalidades

apresentadas neste estudo. del – deleção cromossômica, X e Y – cromossomos sexuais
32
Figura 4.3 – Comparação entre número de subtipos morfológicos presentes neste estudo. M1, M2,
M3, M4, M5 – Subtipos morfológicos FAB
4.3 Anormalidades envolvendo o cromossomo 8
4.3.1 Envolvimento dos cromossomos 1, 8 e 11

Através da análise citogenética convencional, por bandeamento G, suspeitou-
se de uma translocação complexa t(1;8;11)(q21;p21;q23) em 25 das 30 metáfases
analisadas, no caso 4 (Fig., 4.4A). Através da aplicação da técnica de FISH com a
utilização da sonda LSI dual color, break-apart para o gene MLL (Vysis®/Abbott®),
foi possível observar o sinal sobreposto verde e vermelho no cromossomo 11
normal, e no braço longo do cromossomo derivativo 11, os sinais estavam
separados com material cromossômico extra entre eles (Fig., 4.4B). A análise por
MCB revelou o cariótipo: 46,XY, der(1)t(1;8)(q21;p21), der(8)t(1;8)(q31;p21),
der(11)ins(11;1)(q23;q21q31) (Fig., 4.4C). Na recaída, o paciente apresentou o
cariótipo: 46,XY, t(11;19)(q23;p13) em 23 metáfases analisadas.
Figura 4.4 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 4. A) Cariograma. Os

colchetes, em vermelho, demostram as regiões cromossômicas envolvidas no rearranjo. B) FISH, em
cariótipo parcial, com a sonda dual color, break-apart para o gene MLL, demonstra um padrão
diferente de sinais para o cromossomo 11 normal e, o derivativo do 11. C) MCB para os
cromossomos 1, 8 e 11. der – derivativo, # –número, MCB – Multicolor Chromosome Banding
33
4.3.2 t(8;21) associada a outras anomalias cromossômicas
Pela técnica de banda G, a amostra do paciente 11 apresentou 3
anormalidades adicionais, além da recorrente t(8;21), caracterizando o cariótipo
complexo: 45,X,-Y,del(2)(q33),t(8;21)(q22;q22),del(9)(q22), em 13 metáfases das 20
analisadas (Fig., 4.5A). Neste caso, complementarmente, a aplicação da técnica de
FISH com a sonda LSI AML1/ETO dual color, dual fusion (Vysis®/Abbott®), foi
suficiente para confirmar a fusão RUNX1/RUNX1T1 (Fig., 4.5B).
Figura 4.5 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 11. A) Cariograma

demonstrando a t(8;21), além de deleções nos cromossomos 2 e 9. B) FISH, com aplicação da sonda
LSI AML1/ETO dual color, dual fusion, indicando a fusão RUNX1/RUNX1T1, como representado pela
sobreposição dos sinais verde e vermelho.
4.3.3 Translocações three-way envolvendo o cromossomo 8
4.3.3.1 Envolvimento dos cromossomos 8, 21 e 22

No momento do diagnóstico, o caso 5 revelou o cariótipo complexo: 45,X,-
Y,del(8)(q22),add(22)(q22),add(22)(q22) em 22 metáfases analisadas (Fig., 4.6A),
apontando três cromossomos marcadores. A aplicação da técnica de FISH através
da sonda para centrômero (CEP) Y (Vysis®/Abbott®), confirmou a perda do
cromossomo Y (Fig., 4.6B). A técnica de M-FISH confirmou a identidade de cada
cromossomo anormal. (Fig., 4.6C). Contudo, o cariótipo final somente pôde ser
devidamente caracterizado através da técnica de MCB, aplicada aos cromossomos
1 e 22, e FISH complementar com a aplicação de um conjunto de sondas LSI e de
sondas WCP para os cromossomos 8, 21 e 22:
45,X,-Y,t(8;22;21)(q22;q13.3;q22.12),der(22)t(1;22)(q23;q13.3) (Fig., 4.6D-G). Na
recaída, o paciente apresentou o cariótipo: 45X,-Y, del(6)(q21),t(8;22;21)
(q22;q13;q22),der(22)t(1;22)(q23;q13) em 23 metáfases analisadas.
34
Figura 4.6 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 5. A) Cariograma. As setas,
em cinza, demostram as regiões cromossômicas envolvidas no rearranjo, bem como a perda do
cromossomo Y. B) FISH, em núcleos interfásicos confirmando a monossomia do Y. C) M-FISH. As
setas em cinza indicam os rearranjos cromossômicos. D) MCB demonstrando a t(1;22)(q23;q13.3). E-
G) FISH, com sondas WCP e sondas subtelloméricas, confirmando a origem e destino de cada
cromossomo envolvido neste rearranjo. # – número, der – derivativo, t – translocação, subtel – sonda
subtelomérica, wcp – sonda WCP, qter – região terminal do braço cromossômico longo, MCB –
Multicolor Chromosome Banding

A análise por banda G da amostra da paciente 10, revelou o cariótipo 46,X,-
X,del(8q22),+der(13q3?) em 23 metáfases analisadas (Fig., 4.7A), caracterizando
um cariótipo complexo. A análise por FISH, com a sonda LSI AML1/ETO dual color,
dual fusion (Vysis®/Abbott®), confirmou a fusão RUNX1/RUNX1T1 no cromossomo
derivativo 8 e revelou um sinal do RUNX1T1 no cromossomo derivativo 13 (Fig.,
4.7B1). Complementarmente, com uma sonda subtelomérica para a região terminal
do cromossomo 13 (Kreatech®) foi possível observar o sinal da região 13qter no
cromossomo derivativo 21 (Fig., 4.7B2). Para caracterizar os pontos de quebra deste
35
rearranjo complexo, foram conduzidos estudos por MCB, além da aplicação de
sondas WCP, para os cromossomos 8 13 e 21, definindo o cariótipo final como:
46,X,-X,t(8;13;21)(q22;q33;q22) (Fig., 4.7C).
Figura 4.7 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 10. A) Cariótipo parcial. A
seta em vermelho, indica perda de parte de material cromossômico no cromossomo 8, e a seta verde
indica material cromossômico adicional no cromossomo 13. B1) FISH com a sonda AML1/ETO
demonstrando o envolvimento dos cromossomos 8, 13 e 21 no rearranjo. B2) FISH utilizando uma
sonda subtelomérica para o cromossomo 13, revela que parte deste cromossomo foi crípticamente
translocada para o cromossomo 21. C) MCB e FISH com sondas WCP indicam a origem e o destino
de cada material cromossômico, dos cromossomos envolvidos neste rearranjo. MCB – Multicolor
Chromosome Banding, WCP – Whole Chromosome Painting

O estudo por citogenética convencional do paciente 12, mostrou o cariótipo
complexo 46,X-Y,del(8q22)+der(17q?24) em 22 metáfases analisadas (Fig., 4.8A). A
técnica de FISH com a aplicação da sonda LSI AML1/ETO dual color, dual fusion
(Vysis®/Abbott®) confirmou a fusão RUNX1/RUNX1T1 no cromossomo derivativo 8,
e revelou um sinal do gene RUNX1T1 no cromossomo derivativo 17 (Fig., 4.8B).
Para precisar os pontos de quebra, foi então utilizada a técnica de MCB e com o
auxílio de sondas de WCP específicas para os cromossomos 8, 17 e 21, o cariótipo
final foi caracterizado como: 46,X-Y,t(8;17;21)(q22;q21;q22) (Fig., 4.8C).
36
Figura 4.8 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 12. A) Cariograma. As setas
em vermelho indicam perda de parte do material cromossômico no cromossomo 8, e material
cromossômico adicional no cromossomo 17. B) FISH em cariótipo parcial, com a aplicação da sonda
AML1/ETO, ilustra a fusão RUNX1/RUNX1T1 no cromossomo derivativo 8, e demonstra parte do
gene RUNX1T1 translocada no cromossomo derivativo 17. C) FISH, com sondas WCP para os
cromossomos 8, 17 e 21, revela a origem e o destino de cada material cromossômico envolvido neste
rearranjo. der – derivativo, # – número, WCP – Whole Chromosome Painting
4.4.1 inv(16)
A análise por bandeamento G do paciente 2 apresentou o cariótipo:
46,XY,inv(16)(p13q22),+19,-22 em 18 das 22 metáfases analisadas (Fig., 4.9A),
caracterizando-o como cariótipo complexo. Através da técnica de MCB aplicada nos
cromossomos 16, 19 e 22, e utilizando complementarmente sondas WCP para os
cromossomos 19 e 22, além de uma centromérica e, uma sonda subtelomérica para
o cromossomo 22, o cariótipo pôde ser refinado, e definido como:
46,XY,inv(16)(p13q22),dic(22)(qter->p10::p10->qter) (Fig., 4.9B).
37
Figura 4.9 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 2. A) O bandeamento G
mostrou o cariótipo 46,XY,inv(16)(p13q22),+19,-22. B) FISH com sondas WCP, CEP e Subtel,
mostraram o cromossomo dicêntrico 22. WCP – Whole Chromosome Painting, CEP – Centromeric
Probe, ST – Subtelomeric Probe, dic – dicêntrico, q – braço cromossômico longo
4.4.2 del(16)
A análise, por citogenética convencional, da amostra da paciente 6,
apresentou o cariótipo inconclusivo: 46,XX,del(16)(q2?) em 8 das 20 metáfases
analisadas (Fig., 4.10A). O experimento por FISH, utilizando a sonda LSI dual color,
break-apart para o gene CBFβ (Vysis®/Abbott®), foi revelada a perda de um dos
sinais, mostrando uma deleção em uma das cópias do gene CBFβ (Fig., 4.10B). A
técnica de MCB foi aplicada para ambos os cromossomos 16, demonstrando uma
deleção no braço longo de um dos cromossomos 16 e uma inversão em seu
homólogo. O cariótipo final foi definido como: 46,XX,inv(16)(p13;q22),del(16)(q22)
(Fig., 4.10B-C).
38
Figura 4.10 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 6. A) Cariograma. O
colchete em vermelho indica um cromossomo 16 nitidamente menor. B) FISH com a sonda LSI dual
color, break-apart para o gene CBFβ e, com sondas PCP para o cromossomo 16, ilustra a perda de
parte de uma das cópias do gene CBFβ. C) MCB demonstrando a inv(16)(p13;q22). LSI – lócus
específico, MCB – Multicolor Chromosome Banding, der – derivativo, p – braço cromossômico curto, q
– braço cromossômico longo, inv - inversão
4.4.3 t(16;21)
A paciente 9 apresentou um cariótipo inconclusivo na análise por
bandeamento G:
47,XX,der(2)t(2;?)(q2?;?),t(3;13)(q13;p11),add(5)(q35),t(16;21)(p11;q22), em 14 das
20 metáfases analisadas (Fig., 4.11A). A análise por FISH através da aplicação da
sonda LSI AML1/ETO dual color, dual fusion (Vysis®/Abbott®) revelou que havia
material adicional no cromossomo 21 (Fig., 4.11B). Complementarmente, com a
utilização da sonda LSI dual color, break-apart para o gene CBFβ (Vysis®/Abbott®),
foi possível descartar o envolvimento do gene CBFβ no rearranjo (4.11C). Através
da abordagem por M-FISH, MCB e FISH complementar, utilizando sondas WCP
para os cromossomos 2, 5, 3, 13, 16 e 21, foi então possível caracterizar o cariótipo
final como:
46,XX,der(2)t(2;3)(q2?;?),t(3;13)(q13;p11),der(5)t(3;5)(?;q35),t(16;21)(p11;q22) (Fig.,
4.11D).
39
Figura 4.11 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 9. A) Resultado do
bandeamento G, mostrando o cariótipo 47,XX, der(2)t(2;?)(q2?;?), t(3;13)(q13;p11), add(5)(q35),
t(16;21)(p11;q22). B) FISH com a sonda AML1/ETO mostrando material adicional no cromossomo 21.
C) FISH com a sonda CBFβ mostrando um padrão normal de sinais, revelando que o gene CBFβ não
estava rearranjado. D) M-FISH, e seu respectivo contraste revelando cada anormalidade no cariótipo.
t - translocação
4.5.1 Envolvimento dos cromossomos 9 e 11

O caso 1, por citogenética clássica, demonstrou em 11 das 20 metáfases
analisadas o cariótipo inconclusivo: 46,XY,del(9)(q31),t(?X;?11)(p22;q22) (Fig.,
4.12A). Os estudos citogenéticos moleculares realizados através da técnica de MCB,
para os cromossomos 9 e 11, possibilitaram o refinamento do cariótipo, sendo
portanto novamente caracterizado como: 46,XY,del(9)(q12q31),del(11)(q13orq14)
(Fig., 4.12B).
40
Figura 4.12 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 1. A) Cariótipo por
bandeamento G. As setas demonstram a perda de parte do material dos cromossomos 9 e 11. B)
MCB para os cromossomos 9 e 11, revelando os pontos de quebra nas anormalidades del(9)(q12q31)
e del(11)(q13 or q14). del – deleção, q – braço cromossômico longo
4.5.2 Envolvimento do cromossomo 11 com rearranjo do gene MLL

O paciente 4 apresentou rearranjo do gene MLL, porém este já foi
propriamente descrito acima (sub item 4.3.1).
4.5.2.1 Rearranjo do gene MLL com envolvimento do cromossomo 10

Por bandeamento G, a amostra do paciente 8 revelou o cariótipo:
46,XY,del(10)(p12) (Fig., 4.13A) em 18 das 20 metáfases analisadas. A aplicação da
técnica de FISH, com a sonda LSI dual color, break-apart para o gene MLL
(Vysis®/Abbott®), demonstrou inserção de um material cromossômico desconhecido
na região do gene MLL (Fig., 4.13B). Em outro ensaio por FISH, desta vez em
metáfases, foi observada a inserção de um material da região 10p, na região 11q23
(Fig., 4.13C); foi possível observar a t(10;11)(p1?;q23) (Fig., 4.13D); e
adicionalmente, com uma abordagem feita pela técnica de MCB, foi demonstrada
uma inversão pericêntrica no cromossomo derivativo 10 (Fig., 4.13E). O cariótipo
41
final foi portanto caracterizado como: 46,XY,der(10)(11qter->11q23.3::10q11.2-
>10p12::10q11.2->10qter),der(11)(11pter->11q23.3::10p12->10p12::11q23.3-
>11q23.3::10p12->10pter).
Figura 4.13 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 8. A) Cariograma mostrando

uma deleção no cromossomo 10 (seta). B) FISH, em núcleos interfásicos, com a aplicação da sonda
MLL break-apart, mostrando uma pequena inserção entre os sinais (verde e vermelho) do gene MLL.
C) FISH, em metáfases, com sondas WCP e PCP, mostrando a inserção de um material
cromossômico da região 10p, na região 11q23. D) FISH, com sondas Subtel para os cromossomos
10 e 11 e, sonda WCP para o cromossomo 11, revelando a t(10;11)(p1?;q23). E) MCB mostrando
uma inversão pericêntrica no cromossomo derivativo 10. # – número, der – derivativo, p – braço
cromossômico curto, q – braço cromossômico longo, ter – região cromossômica terminal, subtel –
sonda subtelomérica, PCP – Partial Chromosome Painting, WCP – Whole Chromosome Painting
4.6 Anormalidade variante da t(15;17)

O estudo por banda G, do paciente 7, possibilitou a caracterização do
cariótipo: 46,XY,-6,t(15;17)(q22;q21),+mar, em 21 das 23 metáfases analisadas
(Fig., 4.14A). Portanto, sendo considerado um cariótipo complexo e inconclusivo, foi
referido para os estudos por citogenética molecular. A análise por FISH confirmou a
fusão gênica PML/RARα (Fig., 4.14B). A aplicação das técnicas de MCB e FISH com
sondas confeccionadas a partir de BACs para o cromossomo 6, mostraram que o
42
cromossomo marcador era um cromossomo derivativo 6 e este apresentava duas
aberrações cromossômicas. O cariótipo final foi caracterizado como:
46,XY,t(15;17)(q22;q21),inv(6)(p24;q15) [10]/ 46,XY,t(15;17)(q22;q21),der(6)(6p21.3
>6q16.1)[4] (Figs., 4.14C-E).
Figura 4.14 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 7. A) Cariótipo parcial. A

seta verde mostra um cromossomo 6 anormal, e as setas vermelhas indicam a t(15;17)(q22;q21). B)
FISH confirmando a fusão PML/RARα. C) MCB mostrando uma inversão no cromossomo 6. D) MCB
para o cromossomo 6 homólogo, mostrando uma deleção e uma inversão. E) FISH com BACs
demonstrando uma inversão no cromossomo 6. # – número, der – derivativo, inv – inversão, del –
deleção, p – braço cromossômico curto, q – braço cromossômico longo, MCB – Multicolor
Chromosome Banding
4.7 Envolvimento dos cromossomos 5 e 7 associados a outras

anomalias cromossômicas
A paciente 3 apresentava o cariótipo: 44,XX,?der(4),-5,-7,-10,?dic(13),-15,+2
mars em 18 das 20 metáfases analisadas (Fig., 4.15A). Classificada como
apresentando um cariótipo complexo, foi então referida para estudos moleculares. A
43
técnica de FISH, com a sonda subtelomérica 7q, revelou uma deleção na região 7q
(Fig., 4.15B). Adicionalmente foram realizados estudos por M-FISH, e MCB para os
cromossomos 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 13, 17, 18, 19, 20 e 21. O cariótipo final foi então
caracterizado como:
44,XX,der(5)t(5;19)(q13.3;q12),t(6;18;17)(q24.3;q21;q23.2),der(7)t(7;13)(p11.2;q12),
der(10)(7qter->7q11.23::12q22->12q21.2::10p14->10q21::12q12->12qter),
der(12)(::p13->q12::),-15,del(19)(q12),der(20)t(20;21)(p11.2;q11.2),
+der(21)t(12;21)(q22;q22) (Fig., 4.15C-D).
Figura 4.15 – Resultados citogenéticos – clássico e molecular – Paciente 3. A) No cariograma

podemos notar a ausência de um dos cromossomos 5, 7, 10 e 15. As setas indicam material
cromossômico adicional nos cromossomos 4, 5 e 13. B) FISH, com sondas CEP e Subtel para o
cromossomo 7, mostra a perda do sinal correspondente à região qter. C) mMCB, revelando a
identidade de cada cromossomo no cariótipo. D) MCB para o cromossomo 7, caracterizando o ponto
de quebra envolvido na deleção. CEP – sonda centromérica, ST – sonda subtelomérica, del –
deleção, q – braço cromossômico longo, mMCB e MCB – Multicolor Chromosome Banding
44
Tabela 4.2 – Pacientes diagnosticados com LMA apresentando cariótipos complexos – Bandeamento G, FISH e MCB
Subtipo
Paciente Citogenética (GTG) FISH MCB
morfológico
M1 46,XY,del(9)(q12q31),del(11)(q13orq14)[4]/46,XY,del(9)(q12q31)[2]/46,X
1 46, XY, del(9)(q31), t(?X;?11)(p22;q22) [11] / 46, XY [9] NF
Y[7]
2 M4 46,XY,inv(16)(p13q22),+19,-22 [18] / 46, XY [4] NF 46,XY,inv(16)(p13q22),dic(22)(qter->p10::p10->qter)
44,XX,der(5)t(5;19)(q13.3;q12),t(6;18;17)(q24.3;q21;q23.2),der(7)t(7;13)(
M5 p11.2;q12),der(10)(7qter->7q11.23::12q22->12q21.2::10p14-
3 44,XX,?der(4),-5,-7,-10,?dic(13),-15,+2 mars [18] NF
>10q21::12q12->12qter),der(12)(::p13->q12::), -
15,del(19)(q12),der(20)t(20;21)(p11.2;q11.2),+der(21)t(12;21)(q22;q22)
M4/M5 46,XY,der(1)t(1;8)(q21;p21),der(8)t(1;8)(q31;p21),der(11)ins(11;1)(q23;q
4 46, XY, t(1;11;8)(q21;p21;q23) [25] MLL rearranjado
21q31)
M4/M5 RUNX1/RUNX1
5 45,X,-Y,del(8)(q22),add(22)(q22),add(22)(q22) [22] 45,X,-Y,t(8;22;21)(q21.3;q13.3;q22.12),der(22)t(1;22)(q23;q13.3)
T1
6 M4 46,XX,del(16)(q2?) [8]/ 46, XX [14] NF 46,XX,inv(16)(p13;q22),del(16)(q22) [14]
46,XY,t(15;17)(q22;q21),inv(6)(p24;q15) [10]/
7 M3 46,XY,-6,t(15;17)(q22;q21),+mar [21] PML/ RARα 46,XY,t(15;17)(q22;q21),der(6)(6p21.3 >6q16.1)[4]
46,XY,der(10)(11qter->11q23.3::10q11.2->10p12::10q11.2-
8 M5 46, XY, del(10)(p12) [18]/ 46, XY [2] MLL rearranjado >10qter),der(11)(11pter->11q23.3::10p12->10p12::11q23.3-
>11q23.3::10p12->10pter)
M1/M2 47,XX,der(2)t(2;?)(q2?;?),t(3;13)(q13;p11),add(5)(q35),t(16; RUNX1/RUNX1 46,XX,der(2) t(2;3)(q2?;?),t(3;13)(q13;p11),der(5)
9
21)(p11;q22) [14] T1/ CBFβ t(3;5)(?;q35),t(16;21)(p11;q22)
M1/M2 RUNX1/RUNX1
10 46,X, -X, del(8q22), + der(13q3?) [23] 46,X, -X, t(8;13;21)(q22;q33;q22)
T1
M2 45, X, -Y, del(2)(q33), t(8;21)(q22;q22), del(9)(q22) [13]/ 45, RUNX1/RUNX1
11 NF
X, -Y, t(8;21)(q22;q22), del(9)(q22) [4] / 46, XY [3] T1
M2 RUNX1/RUNX1
12 46,X-Y,del(8q22),+der(17q?24) [22] 46,X-Y,t(8;17;21)(q22;q21;q22)
T1
NF – não feito, c - constitucional, del - deleção, der - cromossomo derivativo, dic - dicêntrico, ter – região
M1, M2, M3, M4, M5 – Subtipos morfológicos FAB da LMA,
cromossômica terminal, dup - duplicação, inv – inversão cromossômica, mar - cromossomo marcador, p - braço curto do cromossomo, q - braço longo do
cromossomo, subtel - região subtelomérica, t - translocação, (-) - sinal negativo: perda de material genético, (+) - sinal positivo: ganho de material genético, ( ) -
parênteses: delimita os cromossomos alterados e os pontos de quebra, [Nº] - nº entre [ ]: representa o número de células com determinada alteração, (,) - vírgula:
separa nº de cromossomos, cromossomos sexuais e anormalidades cromossômicas, (;) ponto e vírgula: separa cromossomos e as regiões cromossômicas quando
os rearranjos estruturais envolvem mais de um cromossomo, (/) - barra inclinada: separa os clones de um cariótipo, (?) - interrogação: identificação questionável de
cromossomo ou estrutura cromossômica, X e Y - Cromossomos sexuais, (:) - dois pontos: quebra, (::) - dois pontos duplos: Quebra e união, -> - de – à
45
5. Discussão
A análise citogenética da leucemia mielóide aguda é considerada uma das
mais poderosas ferramentas de estudo, propiciando conhecimentos notáveis quanto
à heterogeneidade de uma população celular e, consequentemente, levando a uma
melhor compreensão das causas dos rearranjos cromossômicos e dos mecanismos
subjacentes à transformação leucêmica. Estas informações vêm sendo importantes
para o diagnóstico e prognóstico dos pacientes pediátricos acometidos por esta
doença (RADHI; MESHINCHI; GAMIS, 2010; KASPERS & REINHARDT, 2011).
Como citado anteriormente, uma (ou mais) anomalia(s) cromossômica(s)
responsável(is) por um prognóstico adverso, pode(m) estar envolvida(s) em
rearranjos complexos e/ou crípticos. Neste contexto, a resolução cromossômica
proporcionada pelo bandeamento G não permite a detecção de determinadas
anomalias, e a origem de cromossomos marcadores (MRÓZEK, 2008). Portanto,
para superar estas limitações, foram desenvolvidas técnicas de citogenética
molecular, tais como FISH, M-FISH e MCB, de modo a contribuir para uma melhor
definição, do perfil cariotípico, da heterogeneidade molecular, bem como revelar
novas fusões gênicas, nas neoplasias hematológicas malignas.
No presente estudo, 12 pacientes pediátricos, diagnosticados com LMA,
apresentaram cariótipo complexo e/ou inconclusivo em estudos citogenéticos por
bandeamento G. Para isto, a combinação das três técnicas, de citogenética
molecular (FISH, M-FISH e MCB), foi fundamental no refinamento da caracterização
dos cariótipos complexos.
Grimwade e colaboradores (2001), assim como Byrd e colaboradores (2002),
utilizando uma amostra de 1.065 e 1.213 pacientes, respectivamente, detectaram a
frequência de 12% de cariótipos complexos na LMA, e observaram um pior
prognóstico nestes pacientes. Vale salientar que estes estudos investigaram os
cariótipos dos pacientes apenas por citogenética convencional. Em nossa amostra
total de casos de LMA pediátrica, com um número menor (98 casos), foi observado o
mesmo percentual (12%). Portanto, é possível que com a investigação dos
cariótipos através da refinação feita pela combinação das técnicas (convencionais e
moleculares), a frequência dos cariótipos complexos na LMA poderá mudar
futuramente, contribuindo para a investigação de seu valor prognóstico.
O cromossomo 21 foi um dos mais envolvidos nas anormalidades
apresentadas neste estudo, presente em 5/12 casos. A trissomia do cromossomo
21, presente em cerca de 5% dos cariótipos complexos, é a segunda mais comum
46
depois da trissomia do cromossomo 8 (RAIMONDI, 1993), estando ambas
relacionadas a um prognóstico intermediário/desfavorável na LMA, de acordo com a
literatura (MANOLA, 2009; MARCHESI et al., 2011). No entanto, em nosso estudo,
estes cromossomos não estiveram envolvidos como alterações numéricas.
A del(9q) é uma anormalidade cromossômica recorrente na LMA e, que de
acordo com a literatura, tem apresentado um desfecho clínico ruim. Além disto,
embora a t(8;21)(q22;q22) esteja relacionada a um bom prognóstico, a presença da
del(9q) associada a esta translocação, é reportada na literatura como um evento não
aleatório, associada a um prognóstico desfavorável (MANOLA, 2009; BRAOUDAKI
& TZORTZATOU-STATHOPOULOU, 2012). Em nosso estudo, foram detectados em
2/12 casos, a deleção no cromossomo 9, em pontos de quebra diferentes. O
cariótipo do paciente 1 apresentou a del(9q) como a anormalidade primária,
enquanto que no caso 11, esta anomalia estava associada à translocação recorrente
t(8;21). Nestes casos, o MCB foi importante para a definição dos respectivos pontos
de quebra. Porém, estudos posteriores, com um maior número de pacientes, serão
necessários para melhor avaliar o impacto prognóstico de cada um destes pontos de
quebra, na doença.
Rearranjos do gene MLL (11q23) são comuns na LMA da infância, se
apresentando em 40-50% dos casos (MARCHESI et al., 2011). Neste estudo, 2/12
pacientes apresentaram esta anormalidade. A análise citogenética convencional, da
amostra do paciente 4, mostrou aparentemente uma translocação complexa,
envolvendo os cromossomos 1, 8 e 11. A técnica de FISH foi fundamental,
permitindo observar material cromossômico adicional no cromossomo derivativo 11,
e portanto elucidando a diferença de uma translocação para uma inserção
cromossômica. Com uma análise ainda mais detalhada, através da técnica de MCB,
foi possível refinar ainda mais o cariótipo em questão demonstrando que ao invés de
uma translocação envolvendo os cromossomos 1, 8 e 11 concomitantemente,
haviam, na verdade, três anormalidades cromossômicas crípticas distintas, sendo
duas translocações envolvendo pontos de quebra distintos entre os cromossomos 1
e 8, e uma translocação do tipo inserção entre os cromossomos 1 e a região q23 do
cromossomo 11. A t(1;11)(q21;q23), que leva à fusão gênica MLLT11/MLL, é uma
importante translocação recorrente na LMA, porém, informações sobre seu impacto
prognóstico ainda são controversas (BALGOBIND et al., 2009). Nosso grupo foi o
primeiro a descrever esta translocação, do tipo inserção entre os cromossomos 1 e
11, na literatura (DE FIGUEIREDO et al., 2010). Em nosso presente estudo,
47
atualizamos o prognóstico do paciente pela citogenética molecular. Este recaiu, da
doença, 2 anos após atingir remissão, apresentando uma nova anormalidade
citogenética. Na recaída, foi possível detectar a t(11;19)(q23;p13). Esta é a
translocação mais comum na LMA secundária, e está relacionada a um prognóstico
desfavorável, envolvendo a região 11q23 do gene MLL. Esta anormalidade também
vem sendo descrita na literatura como uma leucemia relacionada ao tratamento
(HURET, 1998). Após a recaída, o paciente foi a óbito.
Outro caso interessante foi o 8, no qual o bandeamento G apontava apenas
uma deleção no braço longo do cromossomo 10. Este trabalho demonstrou que a
combinação da análise tanto de metáfases como núcleos interfásicos deve ser
considerada para o diagnóstico citogenético final do paciente. Com o emprego do
FISH, foi possível observar uma inserção bastante críptica na região 11q23, vista
somente pela análise em núcleos interfásicos. Adicionalmente, pelo MCB, foi
possível detalhar ainda mais o cariótipo, permitindo a observação de uma inversão
pericêntrica no cromossomo derivativo 10. Estes achados foram publicados na
literatura por nosso grupo (DE FIGUEIREDO et al., 2012). A t(10;11)(p12;q23),
resulta na fusão gênica MLL/MLLT10. Esta fusão é rara na LMA da infância, e é
descrita na literatura como um indicador de mau prognóstico (BALGOBIND et al.,
2009). Portanto, de um ponto de vista clínico, a combinação das técnicas de FISH e
MCB, detectando uma inserção extremamente críptica, foi crucial para revelar
importantes informações prognósticas.
Em relação ao cromossomo 16, foi possível caracterizar o seu envolvimento e
comportamento em três casos. O paciente 2 apresentou duas anormalidades
adicionais à uma inversão do cromossomo 16, observadas através da análise por
bandeamento G. A inv(16) é descrita na literatura como uma anormalidade
citogenética recorrente, presente em 6-12% dos casos pediátricos, conferindo um
bom prognóstico (MANOLA, 2009). A aplicação da técnica de MCB foi importante na
refinação do cariótipo, confirmando a inversão do cromossomo 16, e mostrando que
a anormalidade adicional era, na verdade um cromossomo 22 dicêntrico. Segundo
dados da literatura, o cromossomo 22 tem sido frequentemente envolvido como uma
anormalidade secundária à inv(16), sem implicações prognósticas (MANOLA, 2009).
O paciente 6 demonstrou um cariótipo inconclusivo, com a presença de uma
del(16) por bandeamento G. A combinação das técnicas de FISH e MCB elucidou
que havia uma inversão em um dos cromossomos 16, além da deleção da região
q22 em seu homólogo, onde está localizado o gene CBFβ. Apesar da inv(16) estar
48
relacionada a um prognóstico favorável, sua associação à del(16q), ainda não foi
bem estabelecida na literatura, devido a sua baixa incidência. Além disso, os casos
que apresentam inv(16) e t(16;16) são de difícil detecção pela citogenética clássica,
podendo ser confundidos com a del(16q) (VARDIMAN; HARRIS; BRUNNING, 2002),
ou ainda com alterações mascaradas em cariótipos complexos (SILVA et al., 2008),
daí a necessidade da associação das técnicas de citogenética molecular na
caracterização da fusão CBFβ/MYH11.
O caso 9 apresentou em seu cariótipo, material adicional no cromossomo 5,
um cromossomo derivativo 2, uma t(3;13), um cromossomo marcador, além da rara
translocação t(16;21)(p11;q22). Apesar de seu real impacto prognóstico ainda não
ter sido determinado, devido a sua raridade, a literatura têm demonstrado que
pacientes pediátricos com a t(16;21)(p11;q22) apresentam um prognóstico
desfavorável (MANOLA, 2009). Mais uma vez, a citogenética molecular foi
fundamental não somente para a refinação do cariótipo, mas também para a
estratificação de risco do paciente. A técnica de FISH revelou que havia material
adicional no cromossomo 21 e descartou o envolvimento do gene CBFβ no
rearranjo. Porém, as anormalidades cromossômicas envolvidas neste rearranjo
críptico e citogeneticamente desbalanceado foram reveladas somente através da
abordagem por M-FISH e MCB.
O paciente 3 apresentou uma citogenética convencional bastante complexa,
envolvendo os cromossomos 5, 7, 10, 13 e 15, além de dois cromossomos
marcadores. No entanto, a aplicação da técnica de MCB, revelou um rearranjo
citogeneticamente balanceado, altamente complexo, e envolvendo adicionalmente
os cromossomos 6, 12, 16, 17, 18, 19, 20 e 21. Portanto, a técnica de MCB foi
importante para elucidar e detectar a participação de cromossomos adicionais neste
cariótipo. Neste contexto, vale ressaltar que a literatura tem demonstrado que
quanto maior o número de anormalidades envolvidas em um cariótipo complexo, pior
pode ser a evolução clínica do paciente (OROZCO & APPELBAUM, 2012). Contudo,
se faz necessário um estudo com um maior número de pacientes que apresentam
este tipo de cariótipo utilizando técnicas de citogenética molecular.
Outro achado importante, dentre nossos resultados, foi que o mesmo
cromossomo esteve envolvido em duas anormalidades distintas ao mesmo tempo.
Esta descoberta foi detectada no caso 7. A refinação da caracterização, feita pela
combinação das técnicas de MCB e FISH com a utilização de BACs, revelou duas
anomalias citogenéticas crípticas, em um mesmo cromossomo. Embora as
49
anomalias envolvendo o cromossomo 6 venham sendo associadas a uma evolução
clínica desfavorável, ainda não foi determinado seu impacto prognóstico na
literatura, o que reforça a importância de uma detalhada refinação da caracterização
citogenética nestes casos. Os achados deste caso, fazem parte de um manuscrito
publicado na literatura (MATOS et al., 2013) (Anexo I).
A t(8;21)(q22;q22) está entre as anormalidades recorrentes mais frequentes
da LMA da infância, acometendo cerca de 7-16% dos pacientes nesta faixa etária.
Esta translocação, justapõe os oncogenes RUNX1 e RUNX1T1, resultando na fusão
gênica RUNX1/RUNX1T1, que é relacionada a um bom prognóstico (MANOLA,
2009). Em raras ocasiões, ocorre a presença de um cromossomo a mais nesta
translocação, podendo conferir um prognóstico adverso ao paciente, de modo que o
valor prognóstico da fusão RUNX1/RUNX1T1 vem sendo bastante discutido na
literatura.
Em nosso estudo, a t(8;21) foi encontrada em 4/12 casos (pacientes 5, 10, 11
e 12), dentre os quais, três (pacientes 5, 10 e 12) apresentaram o envolvimento de
um terceiro cromossomo, caracterizando translocações do tipo three-way. Este
estudo pôde detectar e descrever, pela primeira vez na literatura, duas variantes
cromossômicas novas, descritas a seguir.
Através da citogenética clássica, o paciente 10 apresentou monossomia de X,
uma deleção no cromossomo 8 e um cromossomo derivativo 13. A análise por FISH
provou sua eficiência demonstrando, mais uma vez, uma variante molecular da
fusão gênica RUNX1/RUNX1T1. Uma porção do cromossomo 21 estava translocada
no 8, porém a porção do 8 que deveria estar translocada no 21, foi para o
cromossomo 13. Com uma abordagem mais detalhada, feita pelas técnicas de FISH
e MCB para os cromossomos 8, 13 e 21, pôde-se observar que havia parte do
material do cromossomo 13 crípticamente translocado no cromossomo 21. Os
achados clínicos, citogenéticos e moleculares fazem parte de um manuscrito, a ser
submetido (Anexo II). Portanto, a combinação das técnicas de citogenética
molecular (FISH, M-FISH e MCB), utilizadas na caracterização deste tipo de
variante, podem potencialmente revelar alterações genéticas, que podem colaborar
com a caracterização de fusões gênicas novas na leucemogênese, de modo a
determinar suas implicações prognósticas. Deste modo, estas técnicas devem ser
referidas como ferramentas complementares para o monitoramento de pacientes
com LMA.
50
Pela análise por bandeamento G, o paciente 5 mostrou monossomia do
cromossomo Y e perda de material dos cromossomos 8 e 22. A técnica de M-FISH
se destacou neste caso, confirmando a identidade de cada cromossomo anormal,
bem como revelando rearranjos entre os cromossomos 1, 8, 21 e 22. Com a
aplicação das técnicas de MCB e FISH complementar, foi possível revelar uma
translocação desbalanceada entre os cromossomos 1 e 22 e demonstrar o
envolvimento do cromossomo 22, como o terceiro cromossomo na translocação
three-way, t(8;22;21), pela primeira vez. Este caso é mais um exemplo no qual a
combinação das três técnicas foi indispensável, permitindo assim a caracterização
desta nova variante three-way críptica. Estes achados, fazem parte de um
manuscrito publicado por nosso grupo (DE FIGUEIREDO et al., 2011). Neste
presente estudo, atualizamos o prognóstico do paciente que recaiu da doença, 3
anos e 9 meses após a remissão, incluindo terapia com TMO. Na recaída, o
paciente apresentou, adicionalmente à t(8;21;22), uma deleção na região 6(q21).
Anormalidades envolvendo o cromossomo 6 são referidas na literatura como mau
prognóstico, no entanto, não se sabe se esta anormalidade foi adquirida devido à
quimioterapia ou se foi proveniente de um clone que não pôde ser detectado no
primeiro diagnóstico.
O paciente 12 demonstrou pela banda G, monossomia do cromossomo Y,
uma deleção no cromossomo 8 e um cromossomo derivativo 17. A análise por FISH
revelou que um material do cromossomo 21 estava translocado no 8, porém o
material do 8 que deveria estar translocado no 21, foi observado no cromossomo 17.
Portanto, foram aplicadas as técnicas de MCB e FISH complementar com sondas
WCP para os cromossomos 8, 17 e 21. Assim, foi possível observar que havia uma
porção do cromossomo 17 translocada crípticamente no cromossomo derivativo 21,
o que foi fundamental na caracterização deste caso. Esta translocação é a mais
frequente entre as t(8;21) variantes three-way (GALLEGO et al., 1994;
UDAYAKUMAR et al., 2008), entretanto, nosso trabalho pôde definir, através das
técnicas de citogenética molecular, os pontos de quebra precisos nesta
anormalidade, o que será de grande importância para futuros estudos de genes
putativos.
Com relação ao mecanismo deste tipo de translocação, Downing e
colaboradores (1993) e Tanaka e colaboradores (2012), descreveram que existem
pelo menos duas etapas para a formação da variante complexa t(8;21). Uma porção
do braço longo do cromossomo 21(q22) transloca para o braço longo do
51
cromossomo 8, enquanto que a porção final do cromossomo 8 transloca para um
terceiro cromossomo. O material cromossômico restante do terceiro cromossomo
então transloca para o cromossomo 21. Em nosso estudo, as t(8;21) variantes three-
way demonstraram o mesmo comportamento nos três casos apresentados, assim
como em outros casos reportados na literatura (UDAYAKUMAR et al., 2008). Porém
vale salientar que, até aonde sabemos, os demais casos com translocação three-
way, relatados na literatura, apresentavam um cariótipo sugestivo com material
adicional evidente no cromossomo 21. Diferentemente, os casos reportados no
presente estudo foram crípticos, reafirmando a importância de um diagnóstico
acurado da fusão RUNX1/RUNX1T1.
Em suma, este trabalho mostrou a eficácia da combinação de técnicas
citogenéticas moleculares no refinamento de cariótipos complexos, além de
contribuir com novos achados, como, anomalias crípticas que apresentaram impacto
prognóstico para a leucemia mielóide aguda da infância.
52
6. Conclusão
 O percentual de casos que apresentam cariótipos complexos encontrado

em nossa amostra total de LMA (98 casos) foi de 12%, o mesmo
demonstrado em trabalhos publicados na literatura que utilizaram um
número muito maior de pacientes.
 Com o emprego da técnica de MCB e FISH utilizando BACs, foi possível
descrever, pela primeira vez na literatura, que um único cromossomo pode
participar de duas anormalidades cromossômicas diferentes, como uma
anomalia secundária na Leucemia Promielocítica Aguda.
 Novas variantes das translocações recorrentes, tiveram importância no
diagnóstico clínico e no emprego de protocolos terapêuticos dos pacientes
deste estudo.
 A combinação das técnicas de citogenética molecular, podem
potencialmente revelar alterações genéticas, que podem colaborar com a
caracterização de fusões gênicas novas na leucemogênese, de modo a
determinar suas implicações prognósticas.
 A combinação das quatro técnicas (Bandeamento G, FISH, M-FISH e
MCB) demonstrou eficácia na caracterização de cariótipos inconclusivos,
cariótipos complexos, bem como suas anormalidades crípticas.
 A citogenética molecular foi importante no monitoramento de
translocações recorrentes da LMA, pois permitiu identificar possíveis
variações moleculares das fusões gênicas resultantes destas
translocações, as quais podem alterar o prognóstico já conhecido.
53
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65
8. Anexos
8.1 Anexo I
66
67
68
69
8.2 Anexo II
Complex karyotype masked a novel variant three-way t(8;13;21)(q22;q33;q22), in

childhood acute myeloid leukemia
Capela de Matos RRac, De Figueiredo AFac, Liehr Td, Othman MAKd, Binato Rbc, Abdelhay
Ebc, Ribeiro RCe, Silva MLMac
a
Bone Marrow Unit, Cytogenetics Department, bStem cell Department, and cPost-Graduation
Program in Oncology, National Cancer Institute, Rio de Janeiro, Brazil.
d
Institute of Human Genetics, Jena University Hospital, Jena, Germany;
e
Department of Oncology and International Outreach Program, St. Jude Children’s Research
Hospital, Memphis, Tenn. , USA
Abstract
The translocation t(8;21)(q22;q22) is a frequent non-random cytogenetic anomaly in Acute
Myeloid Leukemia, and is the most common translocation in pediatric AML patients (10-
20%). On the other hand, complex t(8;21) variants that involves one or more chromosomes
occurs in about 0.05-1.1% of childhood AML patients. Although t(8;21) is associated with
good prognosis in general, the clinical relevance and implications of its variants are yet to be
determined, underscoring the relevance of further studies regarding such abnormalities in
AML. The present work presents the case of a child with AML and a novel complex variant
t(8;21) harboring a novel three-way cryptic variant t(8;13;21), studied by molecular
approaches. The GTG-banding showed a complex rearrangement. FISH analysis revealed a
three-way translocation. Multicolor chromosome banding technique clarified the breakpoints
of this complex rearrangement, defining the final karyotype as: 46,X, -X,
t(8;13;21)(q22;q33;q22). Through RT-PCR and sequencing approaches, we were able to
determine that RUNX1 was fused to RUNX1T1 sequence. Thus, in summary, the combination
of molecular techniques (FISH, MCB, RT-PCR and Sequencing), can potentially reveal
genetic changes that might collaborate for the characterization of new gene fusions in
leukemogenesis.
70
Introduction
The history of t(8;21) in patients with Acute Myeloid Leukemia (AML) FAB M2
subtype is dated from 1973, when Rowley JD first described this reciprocal translocation. The
translocation t(8;21)(q22;q22) is a frequent non-random cytogenetic anomaly in AML [1], and
is the most common translocation in pediatric AML patients (10-20%) [2]. Since then, a
variety of additional cases, 3% to 4% of AML [3, 4], in which chromosomes 8 and 21 were
involved in complex rearrangements, have been described, with only a few cases reported in
children [5, 1, 6].
The complex t(8;21) variants that involves one or more chromosomes occurs in about
0.05-1.1% of childhood AML patients [7, 3].
At molecular genetic level, this neoplasm is defined by the involvement of the AML1
(RUNX1) gene on chromosome 21q22 and ETO (RUNX1T1) gene, on chromosome 8q22,
resulting in the AML1/ETO (RUNX1/RUNX1T1) fusion gene product [8]. It is believed that
the fusion protein disrupts the Core Binding Factor (CBF) transcription complex leading to
abnormalities of cell differentiation, proliferation and apoptosis and is a driver of myeloid
leukemogenesis [8].
Although t(8;21) is associated with good prognosis in general, the clinical relevance
and implications of its variants are yet to be determined. Because of its rarity, there is limited
information on the prognostic impact of this translocation, although the few cases reported
suggested that complex karyotypes involving this translocation is associated with unfavorable
prognosis [9, 1].
To contribute to the registry of this rare translocation, we report the clinical and
laboratory features of a child with AML and a complex variant t(8;21) harboring a novel
three-way cryptic variant t(8;13;21), revealed by detailed molecular studies.
Patient, Material and Methods
From May 2007 to September 2013 we received samples from 98 children (0-18 years
old) with AML. Sixteen (16.32%) of these patients had AML-M2, and 12 (12.24%) presented
with the characteristic t(8;21)(q22;q22). Among all of our childhood AML cases, 3 (3.1%)
showed a variant t(8;21) in a masked karyotype.
71
Conventional Cytogenetics
Cytogenetic analysis was performed at presentation on bone marrow cells cultured for 24
hours, without mitogenic stimulation, according to standard protocols. The karyotype was
characterized in accordance with the International System for Human Cytogenetic
Nomenclature (ISCN) [10].
Molecular Cytogenetics
Fluorescence in situ hybridization (FISH) experiments were performed using

commercially available probes LSI AML1/ETO, subtelomeric probe for 13qter and whole
chromosome painting (wcp) probes for chromosomes 8, 13 and 21, according to the
manufacturer’s instructions (Abbott Molecular, Inc., Kreatech biotechnology B.V.,
Wiesbaden-Delkenheim, Germany). Multicolor chromosome banding (MCB) was done for
chromosomes 8 (9 pcp) and 13 (6 pcp). Ten metaphases were evaluated each [11, 12].
RT-PCR / Sequencing
RT-PCR analysis was performed with a combination of 5´RUNX1 and 3´RUNX1T1

primers. All RT-PCR analysis were performed with one microgram of mRNA, treated with
DNAse Amplification Grade I (Invitrogen) and reverse transcribed with Super-script II
Reverse transcriptase® (Invitrogen). Each reaction was carried out with Taq DNA Polymerase
(Invitrogen). The reactions were performed using the following program: 94oC for 2 min and
40 cycles at 94oC for 30s, 58oC for 1min and 72oC for 1 min. β-Actin was used as control and
Kasumi-1 cells was used as a positive control. The following primers were used:
RUNX1/RUNX1T1 - Fw - 5' ATGACCTCAGGTTTGTCGGTCG 3', / Rev- 5'
TGAACTGGTTCTTGGAGCTCCT 3'; β-Actin - Fw - 5´ ACCTGAGAACTCCACTACCCT
3´ /Rev, 5´GGTCCCACCCATGTTCCAG 3´. PCR products were subjected to direct
sequencing, using the BigDye® Terminator kit (Applied Biosystems TM) and the 3130xl
Genetic Analyzer (Applied BiosystemsTM).
The Ethical Committee of The National Cancer Institute (INCA), Rio de Janeiro, RJ,
Brazil, approved this study (#088/07).
72
Case Report
A 13-year-old Caucasian girl that was admitted to Itapetinga's hospital with a history
of 5 months anemia, persistent cold associated with fever, otalgia and dysacousia. At
admission, her white blood cell count (WBC) was 22 x 109/l, platelet count was 96 x 109/l and
hemoglobin 6,2 g/dl X-ray examination of the chest was consistent with pneumonia. Physical
examination revealed lymphadenopathy involving the cervical and inguinal regions,
hepatosplenomegaly (4cm palpable liver and 7cm palpable spleen), skin pallor, pale mucosa
and anicteric state. Morphological examination of her bone marrow showed a hypercellular
content with 64% myeloid blast cells classified as AML-M2 by the FAB classification. Flow
cytometry revealed that the blasts were positive for CD45, CD34, CD117, MPO, CD33,
CD13, HLA-DR, CD123, CD15, CD19, thus compatible with the diagnosis of AML. The
patient was stratified into standard risk and treated on AML-BFM-2004 protocol. She
achieved remission, after three courses of chemotherapy. After receiving the intensification
block, she evolved with febrile neutropenia and sepsis. The patient died of cardiac and
respiratory failures.
Results
The GTG-banding analysis defined the karyotype as 46,X, -X, del (8q22), + der
(13q3?) in 23 metaphases analyzed (Fig.A), thus characterizing a complex rearrangement.
FISH analysis confirmed a cryptic fusion RUNX1/RUNX1T1 on derivative chromosome 8
with a RUNXIT1 signal on derivative chromosome 13 (Fig.B1). Complementary FISH
analysis using a subtelomeric probe for the terminal region of chromosome 13 showed a
13qter signal on chromosome 21 (Fig.B2). In order to clarify the breakpoints of this complex
rearrangement, we conducted MCB studies, defining the final karyotype as: 46,X, -X,
t(8;13;21)(q22;q33;q22) (Fig.C). RT-PCR for RUNX1/RUNX1T1 fusion revealed the PCR
product with 260bp (Fig. D). By sequencing the PCR product, it was possible to determine
that RUNX1 was fused to RUNX1T1 sequence (Fig.E).
Discussion
Current treatment of AML with citarabine (Ara-C) and anthracycline, harboring

children and adults, have been showing a good effectiveness with a 5-year overall survival
rate of 69%; However these patients present a relevant risk of relapse, reaching 29% [13].
73
This fact suggests that further biological factors may conceal important prognostic
information. Besides, the literature remains controversial regarding the relevance of variant
t(8;21) to AML outcome, underscoring the importance of detailed cytogenetic characterization
[6].
Recently, studies have demonstrated that the chromosomes more frequently involved
in this variant, as a third chromosome, were 17 (13 cases) 1 (8 cases), 15 (8 cases), 11 (3
cases), 14 (3 cases) and 13 with three cases, including the one reported in this work [5, 1].
The variant t(8;13;21) is exceedingly rare, with only two similar cases previously reported. In
these cases, presented by Gallego et al., 1994 and Achandira et al., 2008, the variant
t(8;13;21) presents itself in a suggestive karyotype, due to evident additional material on
derivative chromosome 21.
In the present work we characterize a rare masked karyotype, harboring a novel three-
way rearrangement t(8;13;21)(q22;q33;q22). In our patient, FISH analyses with the specific
probe LSI AML1/ETO demonstrated the fusion on 8q22. RT-PCR with specific primers
confirmed the presence of RUNX1/RUNX1T1 transcript; furthermore, MCB assay for
chromosomes 8 and 13 accurate the breakpoint at 13q33. In addition, in order to refine the
characterization, we conducted the sequencing of the transcript.
As described by Lindgreen and coworkers in 1977, Downing and coworkers in 1993
and further detailed later by Tanaka and coworkers, 2012, there is at least two steps for the
formation mechanism of the complex t(8;21), following formation of standard t(8;21) and
RUNX1/RUNX1T1 fusion gene [14]. The distal long arm of chromosome 21q22 translocates
to the long arm of chromosome 8, whereas the end of chromosome 8 translocates to a third
chromosome. The remainder of the third chromosome translocates to chromosome 21. This
aberration displayed exactly the same behavior in our patients as well as in the patients
described by Gallego et al., and Achandira et al. In this context, our work reached beyond,
better characterizing the variant t(8;13;21) through molecular studies comprising FISH, MCB,
RT-PCR and Sequencing. The product of the PCR was sequenced, allowing to exactly
ascertain the fusion point. By the application of FISH technique using a subtelomeric probe
(13qter), we could more precisely reveal the exact portion of the chromosome 13 that was
translocated, and where to. In addition, with MCB approaches, we were able to refine the
characterization of this new variant three-way translocation, thus defining the final karyotype
as t(8;13;21)(q22;q33;q22).
As mentioned before, literature data shows that t(8;21), as a complex variant,
involving a third or fourth chromosome is uncommon (0.05-1.1%) in childhood AML [7, 3].
Interestingly, through our data, we demonstrate a percentage of 3.1% (non-published data),
74
among 98 childhood AML patients presenting such aberration.
Literature also have reported variants t(8;21) to be unfavorable [4], although clinical
relevance and implications of such aberrations is yet to be determined. That is because, in this
context, some works have reported that there have been no complications with the patients
related on previous studies, including cases in which there was chemotherapy tolerance and
complete remission was achieved [1, 4, 5]. Regarding this issue, literature remains
controversial, and due to the rarity of this abnormality, this work could contribute to the
literature by adding another novel case, along with clinical and molecular information [14,
15]. Despite the literature points out that deletions in chromosome 13 are associated to
malignant disorders, thus justifying the search for genes related to human disease, no
biomarker was yet identified. Therefore, future studies, using clones from the 13q32-13q34
region, make themselves necessary in order to refine this region and better indicate the
prognostic value of the genes involved [16].
Thus, in summary, the combination of molecular techniques (FISH, MCB, RT-PCR
and Sequencing), used to characterize the novel variant t(8;13;21), can potentially reveal
genetic changes that might collaborate for the characterization of new gene fusions in
leukemogenesis in order to determine prognostic implications. Hence, these techniques should
be important complementary tools for AML patients' screening [6].
Acknowledgements
The authors thank Mariana Tavares de Souza and Daniela Ney-Garcia for their support, and
pathologist Fabia Neves for her contributions. We are grateful to Sharon Naron for editing the
manuscript. This work was supported by CAPES (PROBRAL/DAAD - project no. 419/14);
CNPq (project no. 473878/2011-9), FAPERJ (project no. E-26/110.868/2013); the INCT para
Controle do Câncer, Brazil (Grants CNPq 573806/2008-0) and the American Lebanese Syrian
Associated Charities (ALSAC); and a Center of Excellence Grant from the State of
Tennessee.
75
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77
Figure
Figure Legend – A) Partial karyotype. The red arrow displays a missing portion in
chromosome 8, and the green arrow shows a gain of chromosome material on chromosome
13. B1) FISH with AML1/ETO dual color, dual fusion probe showing the RUNX1/RUNX1T1
fusion on derivative chromosome 8, but also a RUNX1T1 signal on chromosome 13. B2)
Complementary FISH, with a subtelomeric probe for 13qter region, revealing that a portion of
this region was translocated to chromosome 21. C) FISH with wcp probes and MCB, for
chromosomes 8, 13 and 21, confirming the origin and destination of each rearrangement. D)
RT-PCR confirming RUNX1/RUNX1T1 fusion, and revealing the PCR product with 260bp.
E) Sequencing of the PCR product, determining that RUNX1 was fused to RUNX1T1
sequence.
78

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ROBERTO RODRIGUES CAPELA DE MATOS

ESTUDO CITOGENÉTICO MOLECULAR PARA A CARACTERIZAÇÃO DOS

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INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER

ROBERTO RODRIGUES CAPELA DE MATOS

ESTUDO CITOGENÉTICO MOLECULAR PARA A CARACTERIZAÇÃO DOS

Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Câncer

Orientador: Profa. Dra. Maria Luiza Macedo Silva

Estudo citogenético molecular para a caracterização dos

xvi, 78 f.: il.

Dissertação (Mestrado em Oncologia) - Instituto Nacional

Orientadora: Maria Luiza Macedo Silva.

1. Leucemia Mieloide Aguda. 2. Células-Tronco

INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER

AUTOR: ROBERTO RODRIGUES CAPELA DE MATOS

ESTUDO CITOGENÉTICO MOLECULAR PARA A CARACTERIZAÇÃO DOS

ORIENTADOR: Profa. Dra. Maria Luiza Macedo Silva

Aprovada em: ___/___/___

Prof. Dr. Fernando Regla Vargas

À Deus, por ser meu refúgio e minha fortaleza;

“Je promets de mettre à terre une pluie de roses,

INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER

ESTUDO CITOGENÉTICO MOLECULAR PARA A CARACTERIZAÇÃO

Roberto Rodrigues Capela de Matos

As leucemias são um grupo heterogêneo de doenças que se caracterizam pela

INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER

MOLECULAR CYTOGENETIC STUDIES FOR THE CHARACTERIZATION

Roberto Rodrigues Capela de Matos

Tabela 1.1 Classificação morfológica, imunológica e citoquímica da LMA............5

Figura 1.1 Medula óssea hipercelular com diversos blastos mielóides..................2

ABL C-Abl Oncogene 1, Non-Receptor Tyrosine Kinase

Termos citogenéticos - Simbologia da nomenclatura:

As leucemias são um grupo heterogêneo de doenças que se caracterizam

Do mesmo modo que outros tipos de câncer, a leucemia pode resultar da

A princípio, o primeiro evento – mutação – culmina em uma hematopoese

A medula óssea, de pacientes portadores de leucemia, normalmente se

O principal evento causador da leucemia ainda é desconhecido, porém alguns

1.2 Leucemia Mielóide Aguda

A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma doença heterogênea caracterizada

Ainda é desconhecido o mecanismo que leva a célula progenitora mielóide a

A LMA pode se apresentar como uma doença de novo ou pode ser

Estudos demonstram que há uma importante diferença geográfica em relação

1.3 Classificação, diagnóstico laboratorial e padrão citogenético da LMA

Devido a heterogeneidade desta neoplasia, foram criadas classificações com

Tabela 1.1 – Classificação morfológica, imunológica e citoquímica da LMA

CD36, CD41, CD42, ou CD61+, CD34, CD13, CD33+/-,

Porém, mesmo que a classificação FAB reconheça a heterogeneidade da

Leucemia Mielóide Aguda (LMA) e precursores relacionados à neoplasia

LMA com anormalidades genéticas recorrentes

Trabalhos na literatura têm apontado que aproximadamente 85% das crianças

1.3.1 Leucemia Mielóide Aguda minimamente diferenciada – LMA-M0

Este subtipo é considerado raro, acometendo cerca de 2-10% dos pacientes

1.3.3 Leucemia Mielóide Aguda com maturação – LMA-M2

1.3.4 Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) – LMA-M3

1.3.6 Leucemia Monoblástica Aguda – LMA-M5

1.3.7 Eritroleucemia Aguda – LMA-M6

1.3.8 Leucemia Megacarioblástica Aguda – LMA-M7

1.5 Fatores prognósticos e classificação de risco da LMA

2.1 Objetivos específicos:

3.1 Desenho Experimental

Aprovada em: _/_/___