EFEITO DO CONSUMO DE FITO-HORMÔNIOS NA MICROBIOTA

INTESTINAL DURANTE O HIPOGONADISMO HIPERGONADOTRÓFICO: ESTUDO

PRÉ-CLÍNICO

Equipe do Estudo:
Natália Martins de Aguiar
Sabrina Picin Domingues

Orientadora
Profa Dra Tamara Veiga Faria

SÃO JOSÉ DO RIO PRETO - SP

Outubro, 2020

1
SUMÁRIO

Resumo.......................................................................................................................03
1. Introdução...............................................................................................................05
1.1 Justificativa ...........................................................................................................09
1.2 Hipótese.................................................................................................................09
1.3Desfecho Primário..................................................................................................09
1.4 Desfecho secundário..............................................................................................10
2. Objetivos.................................................................................................................10
2.1 Objetivo Geral.......................................................................................................10
2.2 Objetivo Específico...............................................................................................10
3. Metodologia............................................................................................................11
3.1. Questões éticas.....................................................................................................11
3.2. Desenho do estudo................................................................................................11
3.2.1Realização da ooferectomia.................................................................................12
3.2.2.Análise Sérica e da Microbiota intestinal............................................................13
3.2.3Preparo dos produtos investigacionais.................................................................15
3.3. Análise estatística.................................................................................................15
4. Resultados esperados...............................................................................................16
5. Cronograma.............................................................................................................17
6. Orçamento...............................................................................................................18
Referências Bibliográficas..........................................................................................19

2
RESUMO
Introdução: A diminuição dos hormônios gonadotróficos pelos ovários evidencia o período do
climatério e é responsável por sintomas que influenciam nos fatores biológicos, psicológicos e
sociais das mulheres. Uma opção terapêutica com melhor aderência, fácil acesso e baixo custo é a
utilização de plantas medicinais e de fito-hormônios que podem causar alterações na efetividade
da microbiota intestinal. Objetivo geral: Investigar os efeitos do consumo de fito-hormônios nas
alterações da microbiota intestinal durante o hipogonadismo hipergonatrófico. Objetivos
Específicos: Comparar a microbiota intestinal com o uso de fito-hormônios (Isoflavona a qual é
um fitoestrogênio, folha da amora fitoterápico) e estrogênio sintético durante o hipogonadismo
hipergonatrófico; avaliar o efeito acumulativo dos produtos em estudo e analisar a possibilidade
de desenvolvimento de hiperplasia endometrial); avaliar o perfil lipídico e glicêmico com o uso
dos fito-hormônios durante o hipogonadismo hipergonatrófico. Materiais e Métodos:
Primeiramente, o projeto será submetido para apreciação e aprovação da Comissão de Ética do uso
de Animais (CEUA) – FACERES. Serão selecionados 28 animais (ratos fêmeos da linhagem
Wistar com peso entre 200 e 240g os quais receberão ração balanceada padrão para roedores). Irão
ser separados em quatro grupos: Grupo folha de amora (grupo FTA): fêmeas ooferectomizadas em
tratamento com a cápsula da folha da amora (N=7); Grupo isoflavona (grupo FEI): fêmeas
ooferectomizadas em tratamento com Isoflavona (N=7); Grupo controle (grupo C):fêmeas
ooferectomizadas em tratamento com água (N=7); Grupo estrogênio sintético (grupo ES): fêmeas
ooferectomizadas em tratamento com estrogênio sintético (N=7) . Cada animal será analisado
diariamente por 120 dias. O swab anal para coleta da microbiota será realizado no baseline e a
cada 30 dias até o sacrifício. Resultados esperados: Espera-se que os resultados desse estudo
possam contribuir para melhor entendimento dos efeitos dos fito-hormônios na microbiota
intestinal e entendimento do mecanismo de ação desses produtos naturais bastante utilizados pela
população brasileira por serem de fácil acesso a baixo custo. Além disso, espera-se que o projeto
contribua para a concretização das iniciações científicas de 3 (três) alunas de medicina permitindo
as que realizem a presente pesquisa experimental.

Palavras-chave: Fitoestrogênio, fito-hormônio, Isoflavona, folha de amora, estudo experimental,

hipogonadismo hipergonadotrófico, climatério

ABSTRACT
Introduction: The decrease in gonadotrophic hormones by the ovaries evidences the climacteric
period and is responsible for symptoms that influence the biological, psychological and social
factors of women. A therapeutic option with better adherence, easy access and low cost is the use
of medicinal plants and phyto-hormone that can cause changes in the effectiveness of the intestinal
microbiota. General objective: To investigate the effects of phyto-hormone intake on changes in
the intestinal microbiota during hypergonatrophic hypogonadism. Specific Objectives: To
compare the intestinal microbiota with the use of phyto-hormone during hypergonatrophic
hypogonadism; evaluate the improvement of possible signs and symptoms related to
hypergonatrophic hypogonadism and the use of phyto-hormones; evaluate the cumulative effect
of the two products under study and analyze the possibility of development of endometrial
hyperplasia); evaluate the lipid and glycemic profile with the use of phyto-hormone and

3
phytoestrogen during hypergonatrophic hypogonadism. Materials and Methods: First, the
project will be submitted for consideration and approval of the Ethics Committee on the use of
Animals (CEUA) - FACERES. Twenty-one animals (wistar rats with weight between 200 and
240g will be selected, which will receive standard balanced ration for rodents). They will be
separated into three groups: Blackberry leaf group (FTA group): oooferectomized females in
treatment with the blackberry leaf capsule (N=7); Isoflavone group (FTI group): ooferectomized
females undergoing Treatment with Isoflavone (N=7); Control group ( C group): ooferectomized
females (N=7) in water treatment; Sintetic Estrogen group (ES group) : ooferectomized females
undergoing Treatment with Sintetic Estrogen (N=7). Each animal will be analyzed daily for 120
days. The anal swab for microbiota collection will be performed at baseline and weekly until
sacrifice. Expected results: It is expected that the results of this study may contribute to a better
understanding of the effects of phytohormones on the intestinal microbiota and understanding the
mechanism of action of these natural products widely used by the Brazilian population because
they are easily accessible at low cost. In addition, it is expected that the project will contribute to
the scientific initiation of 3 (three) medical students allowing them to carry out this experimental
research.

Keywords: Phytoestrogen, phyto-hormone, Isoflavone, blackberry leaf, experimental study,

hypogonadism hypergonadotrophic, climacteric

4
 1- INTRODUÇÃO

A diminuição dos hormônios gonadotróficos (estrogênio e progesterona) pelos ovários

evidencia o período do climatério, que compreende uma fase biológica vital da mulher, dos 40 aos

65 anos de idade. Dessa forma, os sintomas associados ao climatério sofrem influência de fatores

biológicos, psicológicos e sociais. Esses fatores são caracterizados por: ondas de calor ou

fogachos, insônia, nervosismo, depressão, hipertensão arterial, incontinência urinária e secura

vaginal.1Esse período, também definido como hipogonadismo hipergonadotrófico, caracteriza-se

pelo aumento dos hormônios FSH (folículo estimulante) e LH (luteinizante) seguido da disfunção

gonadal, isso ocorre devido a falência dos folículos representada pela redução de níveis de

estrógenos e testosterona. 2,3

Assim, como opção terapêutica recomendada pelo SUS e pela Federação Brasileira de

Ginecologia e obstetrícia (FEBRASGO), a terapia de reposição hormonal é indicada para amenizar

os sintomas relacionados ao climatério. A indicação dessa referida depende da fase ovariana em

que a mulher se encontra, classificando-a como: pré-menopausa, peri-menopausa e pós-

menopausa. Então, a reposição hormonal é feita para corrigir a perda da função ovariana e aliviar

sintomas vasomotores desses períodos, e principalmente na pós-menopausa, quando a terapia

hormonal é indicada para cessar ou amenizar os sintomas decorrentes da diminuição do estrogênio.

Os sintomas referidos incluem sintomas vasomotores e neuropsíquicos, atrofia urogenital,

distúrbios urinários, alterações da pele e das mucosas, sintomas osteoarticulares, disfunção sexual,

entre outros. 3,4

Dentre as desvantagens absolutas associadas a terapia de reposição hormonal, é possível

elencar: neoplasias malignas de mama e endométrio recentes, dependendo do estágio clínico,

hepatopatia severa ativa, tromboembolismo agudo, sangramento genital anormal de causa

5
desconhecida e porfiria. Ademais, tem como contraindicações relativas: tromboembolismo

venoso prévio, doença coronariana estabelecida, hipertensão arterial sistêmica (HAS) severa ou

hipertensão previa sem estabilização após tratamento, diabete melito (não controlada), história

familiar de câncer de endométrio e mama, além de antecedentes de hiperplasia atípica de mama,

doenças auto-imunes em atividade (lúpus eritematoso sistêmico), meningioma, mioma uterino e

endometriose pregressa, doença da vesícula biliar e melanoma.4

Considerando as desvantagens da adesão de terapia de reposição hormonal, os fito-

hormônios podem ser sugeridos como uma alternativa de tratamento, sendo de fácil acesso, baixo

custo e com representação popular e cultural. 5

Os principais fito-hormônios utilizados no Brasil são fontes de fitoestrogênio, sendo eles

Glycine max, Trifolium pratense e a Cimicífuga racemosa. De acordo com Rocha 5 e colegas, para

os sintomas psicoemocionais, que podem acompanhar esta fase da vida da mulher, é valido

ressaltar o uso de Hiperico perforatum, Valeriana officinalis, Melissa officinalis. No Canadá, estão

regulamentadas Glycine max, Hypericum perforatum (sintomas da depressão), Dioscorea villosa

(reduz sintomas da menopausa), Cimicifuga racemosa (reduz fogachos), coincidindo com duas

plantas da legislação brasileira. 5

A amoreira-preta (espécie Morus nigra) é demasiadamente utilizada na medicina popular,

haja vista, que sua ação terapêutica possibilita uma atuação antioxidante, antinociceptiva,

hipoglicemiante e anti-inflamatória. Além disso, estudos revelam que o chá da folha de amoreira-

preta, é utilizado para aliviar sintomas climatéricos, sugeridos na hormônio terapia e para alívio

pré-menstruais e cefaleia.6

6
 A espécie Morus nigra, no Brasil é popularmente conhecida como amoreira-preta,

apresentando folhas simples, cartáceas, variáveis e lobadas. Sua medida varia entre 6 a 12 cm de

comprimento, com inervação elevada e superfície reluzente. Esse chá, ao contrário do estrogênio

não apresentaria efeitos adversos, sendo uma possível fonte de fito-hormônios e, portanto, uma

possibilidade substituindo a terapia de reposição hormonal. 7

Entretanto, Franzotti7 (2006) investigou se extratos aquosos e hexânicos das folhas de

Morus nigra contêm compostos que, possivelmente, poderiam exercer alguma ação sobre os

receptores de estrogênio alfa e beta. Sugeriu que a ausência de efeito estrogênico seria ideal para

o tratamento de pacientes que têm histórico de câncer de mama e endométrio, os quais é

contraindicado medicamentos à base de hormônios, por isso recomenda o uso desse fitoterápico

uma vez que não se classificaria como um fitoestrogênio. 8

Os fito-hormônios mais estudado e aprovado pela ANVISA são os derivados da isoflavona

os quais são utilizados como medicação fitoterápica para alívios dos sintomas da menopausa e dos

níveis do colesterol.9

O mecanismo de ação da isoflavona se dá através de sua interação com os receptores

estrogênicos, esse produto a base de soja, possui efeitos antioxidantes e propriedades de inibição

enzimática importantes. É sabido que após a administração oral da isoflavona, ocorre algumas

alterações enzimáticas na microbiota intestinal. De acordo com Cota 10 e colegas, as isoflavonas

sofrem, no início, ação de enzimas da flora intestinal, ocorrendo hidrólise dos éteres, que libera a

genisteína, a daidzeína e a gliciteína. Estas são submetidas a um metabolismo secundário, quando

ocorre a perda do grupo hidroxila, formando a dihidrogenisteína, 6-hidroxi-O-demetilangolensina,

equol e o demetilangolensina, que são absorvidas através do epitélio intestinal, portanto essa

adequação à microbiota pode interferir em sua resposta terapêutica.10

7
 Um dos produtos do metabolismo da daidzeína é o equol, substância que possui grande

importância na flora intestinal e que é hidrolisada da isoflafona. Esse metabólito é conhecido por

possuir alta afinidade pelos receptores estrogênicos, maior absorção de nutrientes, propriedades

antioxidantes e, principalmente, efeitos anti-carcinogênicos pela ação da microbiota intestinal. 11

A microbiota intestinal possui papel importante na resposta imune, atua na imunidade

natural e específica desempenhando papel inflamatório no local. 12 O sistema gastrointestinal tem

sua maior importância no organismo em absorver água, sais e nutrientes. As bactérias intestinais

possuem uma função de defesa do organismo contra patógenos exógenos. Dessa forma, os

microorganismos que existem no intestino compõem a microbiota intestinal com espécies

autóctones (membros permanentes) e alóctones (membros transitórios adquiridos do meio

externo). 13,14

No sistema entérico existem aproximadamente 100 trilhões de bactérias, destas, cerca de

500 estão presentes nos alimentos. Fatores como padrões alimentares e uso de antibióticos podem

alterar a forma com a flora intestinal atua, a exemplo da relação ecológica interespecífica

denominada comensalismo. Nesse contexto, na relação comensalista, juntamente com a

mutualista, as bactérias se nutrem do quilo alimentar, que chega ao intestino, e ao mesmo tempo

contribuem para a imunidade do organismo defendendo contra agressões intestinais existentes.13

A quantidade de bactérias para realizar sua ação no trato gastrointestinal depende de alguns

fatores, como o PH local e a velocidade do fluxo do quilo. Em relação ao PH sabe-se que as

bactérias se proliferam com maior facilidade em ambientes com PH neutro/ básico. Já em locais

onde o quilo se move com maior velocidade a exemplo do intestino delgado há a propensão de

haver menor quantidade de bactérias devido a diminuição da absorção e retenção de nutrientes

quando comparado a todo sistema digestivo. 13

8
 1.1 - Justificativa

Cada vez mais busca-se por técnicas alternativas que possam amenizar os efeitos

climatéricos sem que ocorra alterações significativas na microbiota intestinal. A microbiota

intestinal tem sido foco de estudos nas áreas básicas e tem se mostrado como importante estratégia

no tratamento de muitas doenças.14 Infelizmente, os estudos sobre uso dos fito-hormônios no

climatério ainda são escassos e principalmente desatualizado, por isso faz-se relevante o presente

projeto de pesquisa o qual poderá representar um embasamento para futuros estudos clínicos nessa

área e contribuir para a melhora na qualidade de vida das mulheres no período climatérico.

Ademais, a terapia de reposição hormonal possui mais eventos adversos quando comparada

a utilização dos fito-hormônios, até mesmo porque a mesma representa forte relação com o câncer

de mama e endométrio. maior probabilidade em causar neoplasias, devido à presença do estrogênio

sintético4. Nesse sentido, a proposta do presente estudo é salientar que a utilização da cápsula da

folha de amora e a cápsula da isoflavona pode ser mais eficazes em reduzir os sintomas

climatéricos e que a isoflavona, um fito-estrogênio, diferente do chá da amora, um fitoterápico

pode interferir na microbiota intestinal e ser menos eficaz que a cápsula da folha da amora.

modelo

1.2 – Hipótese

As alterações da microbiota com o uso do fito-hormônio contribuem para sua melhor

eficácia quando comparada ao fito-estrogênio.

1.3 – Desfecho primário

Análise da microbiota intestinal das fêmeas ooferectomizadas após 120 dias de tratamento.

9
 1.4– Desfecho secundário

Investigação da presença de hiperplasia endometrial como evento adverso relacionado ao uso

dos fito-hormônios (Isoflavona) e (folha de Morus Nigra).

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Investigar os efeitos do consumo dos fito-hormônios (Isoflavona e folha de amora) e terapia

de reposição hormonal nas alterações da microbiota intestinal durante o hipogonadismo

hipergonatrófico.

2.2. Objetivos específicos

1. Comparar a microbiota intestinal com o uso do fito-hormônios durante o

hipogonadismo hipergonatrófico.

2. Avaliar o efeito acumulativo dos dois produtos em estudo e analisar a possibilidade de

desenvolvimento de hiperplasia endometrial.

3. Avaliar o perfil lipídico e glicêmico diante do uso dos fito-hormônios durante o

hipogonadismo hipergonatrófico.

10
 3- Metodologia

3.1 Questões éticas

Antes de qualquer procedimento do estudo o projeto de pesquisa será submetido a

Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da FACERES, sob a responsabilidade da profa Dra

Tamara Veiga Faria.

3.2 Desenho do estudo

Trata-se de um estudo pré-clínico no qual serão utilizados 28 ratos (fêmeas) da linhagem

Wistar.

Os animais serão provenientes do Biotério – UNESP e serão transportados aos 21 dias ao

biotério da Faculdade Ceres (FACERES) onde serão alocados em caixa individual com dimensões

de 21 cm x 23.5 cm x 21.5 cm (comprimento x largura x altura), permanecendo em ambiente

controlado com temperatura de 22± 2°C, umidade relativa do ar de 60% e ciclo de luz de 12 horas.

Serão utilizados nesse estudo ratos fêmeas da linhagem Wistar com peso entre 200 e 240 gramas

e para experimentação de animais de laboratório, e serão identificados por números e cores. Todos

os animais receberão as mesmas condições de alimentação, sendo ração balanceada padrão para

roedores (Labina, Purina), água ad libitum. 15

Ao completarem pelo menos 6 (seis) semanas de vida e ao atingirem 240g serão alocados

de acordo com a divisão abaixo:

• Grupo folha de amora (grupo FTA): fêmeas ooferectomizadas em tratamento com a

cápsula da folha da amora. (N=7)

• Grupo isoflavona (grupo FEI): fêmeas ooferectomizadas em tratamento com

Isoflavona.(N=7)

11
 • Grupo controle (grupo C): fêmeas ooferectomizadas em tratamento com água. (N=7)

• Grupo estrogênio sintético (grupo ES): fêmeas ooferectomizadas em tratamento com

estrogênio sintético. (N=7)

Os animais serão pesados com balança semi-analítica digital uma vez por semana para verificar

se está ou não ocorrendo variação de peso. Também serão pesadas as rações depositadas e sobras,

bem como serão medidos os volumes líquidos (folha da amora, Isoflavona, estrogênio sintético e

água) depositados e consumidos. Serão 120 dias de tratamento com os produtos investigacionais

conforme a agenda de procedimentos representada pela figura 1.

Figura 1 – Agenda de procedimentos

Início do
tratamento
D (-) 30 D0 D1 D30 D60 D90 D120
30 dias

Ooferectomia Glicemia
bilateral Glicemia
Análise microbiota Análise microbiota
Sacrifício
(swab) (swab)
Coleta de sangue
*as pesagens serão realizadas semanalmente

3.2.1 Realização da ooferectomia

Será realizada uma ooforectomia com 6 semanas de vida os ratos quando serão

anestesiados com 10 mg/Kg de Cloridrato de Xilazina e 85mg/Kg de Ketamina ambas vias

intraperitoneais.15 A cirurgia será realizada em um fluxo laminar horizontal (Veco CFLH-18). Os

pelos presentes na área da cirurgia serão retirados e a área será desinfetada com etanol 70% e

12
clorexidina. Será realizada uma incisão transversal de 0.4 a 0.6 cm no meio do abdômen,
15
ligeiramente para a direita, perto do mamilo direito, com uma lâmina de bisturi cirúrgico.

O músculo transversal abdominal será exposto depois da incisão na pele e, após o músculo

ser dissecado, o espaço peritoneal e o tecido adiposo em torno dos ovários ficarão expostos. Após

acessar a cavidade peritoneal, o tecido adiposo será retirado até que o tubo uterino direito e o

ovário direito cercados pela gordura foram identificados. O ovário juntamente com a gordura serão

facilmente localizados e exteriorizados por uma retração suave. 15

O procedimento será repetido no ovário esquerdo com a mesma incisão. Será feita uma

ligadura no útero a fim de remover completamente os ovários, um de cada vez e o útero foi

recolocado na cavidade peritoneal após a retirada dos ovários. A incisão será fechada com duas

camadas (músculo e pele) usando suturas estéreis. O peritônio e as camadas musculares serão

suturadas com uma sutura absorvível e a pele será suturada com uma sutura não absorvível. Será

aplicado iodopolvidine na área para a pele ser desinfetada após a cirurgia. Alto grau de

procedimento asséptico será mantido durante a cirurgia.15

Um mês após a ooferectomia, os grupos iniciarão o tratamento de estudo por 120 dias

conforme descrição de agenda de procedimentos. Semanalmente os ratos serão pesados para

avaliação da massa corpórea e também será coletado amostra da microbiota intestinal, com o

auxílio de uma haste flexível com extremidades recobertas de algodão conforme descrito no item

3.2.2.

3.2.2 Análise sérica e da microbiota intestinal

A análise do perfil lipídico será realizada no último dia de experimento, sendo coletado o

sangue dos animais após a eutanásia, por superdosagem analgésicos. Os parâmetros analisados

13
serão: colesterol total, HDL, LDL e triglicerídeos, a partir de kits comerciais (Labtest). A análise

do perfil lipídico será realizada no D0 pela coleta de 1(um) ml de sangue pela cauda do animal e

último dia de experimento, sendo coletado o sangue (1 (um) ml) dos animais após a eutanásia, pela

veia cava abdominal. Os parâmetros analisados serão: colesterol total, HDL, LDL e triglicerídeos,

a partir de kits comerciais (Labtest). 16

A dosagem de glicemia será realizada nos animais em jejum (12-14 horas) no início do

experimento (dia 0) e no dia da eutanásia), por meio do sistema de fitas (monitor digital)

glicosímetro G-TECH sistema NO CODE, a partir de gota de sangue obtida através de um corte

na extremidade da cauda do animal. Para essa coleta os animais permanecerão 12 horas em jejum,
16
quando será realizada a coleta de sangue (tempo 0') e dosada sua glicemia.

As concentrações de glicose sanguínea serão determinadas com o sistema de fitas (monitor

16
digital) glicosímetro G-TECH sistema NO CODE.

Será realizado, mensalmente, um swab anal nas fêmas Wistar para verificação de possíveis

alterações da microbiota intestinal. Para isso, utilizaremos luvas de procedimento, tubo coletor

estéril para armazenamento do conteúdo coletado, álcool, tesoura e alumínio para envolver a área

analisada. O instrumento de coleta será introduzido no canal anal com a finalidade de coletar uma

amostra da mucosa da parte final do intestino grosso e assim analisar a microbiota existente. 17

As fezes serão coletadas no último dia do tratamento. Para evitar a degradação e de

isomerização de resveratrol o procedimento será realizado em frascos esterilizados e âmbar. O

material será armazenado a -20 ° C. 17

Do conteúdo entérico, que será coletado e armazenado, o DNA bacteriano total será extraído

a partir das 21 amostras. Para isso, será utilizado o QIAamp DNA Stool Mini kit. As amostras de

14
DNA extraídas serão analisadas em gel de agarose 0,8% em tampão. Após a eletroforese, o gel

será mantido sob agitação em solução de brometo de etídio (0,25ìgmL-1). O DNA extraído será

submetido à visibilização em sistema de digitalização de imagem. Após a eletroforese, o gel será

mantido sob agitação em solução de brometo de etídio (0,25ìgmL-1). Marcador de tamanho 100pb

DNA Ladder será utilizado para estimativa dos tamanhos dos diferentes amplicons.18

Após a eutanásia, os intestinos dos animais serão retirados e será realizada a coleta de 1 g de

fezes contidas no intestino grosso de cada animal. Para o preparo dos meios, serão pesados 70 g

de Agar MRS Lactobacillus (Acumedia) e para preparar 1 litro do meio o agar será dissolvido em

água destilada. Também, se utilizará o meio BMS Bifidobacterium (Sigma), pesando-se 55,5 g de

ágar para 1 litro de meio, com adição de 2,0 g de extrato de levedura por litro, sendo ambos os

meios autoclavados a 121ºC por 15 minutos. 16

Para o sacrifício, os animais receberão altas dosagens de anestesiados, 20 mg/Kg de

Cloridrato de Xilazina e 170 mg/kg de Ketamina, em seguida, mantendo-se o nível anestésico, será

realizada a secção da aorta abdominal. Após a eutanásia, os órgãos pesados serão: fígado, rins,

intestino. 16

3.2.3 Preparo dos produtos investigacionais

Cápsula da amora: 3,5g em pó para 150ml por dia. Todos os dias será avaliado a quantidade

ingerida do produto estudado. Foram utilizadas folhas de Morus adquiridas na cidade de São José

do Rio Preto. Essas folhas foram higienizadas, secas à sombra e realizada maceração mecânica,

reproduzindo o uso popular.

Isoflavona: 30mg (2x ao dia) em pó totalizando 60mg ao dia. Essa substância será diluída em 150

ml. Todos os dias será avaliado a quantidade ingerida do produto estudado.

15
 Estrogênio:

3.3. Análise Estatística

Os dados coletados durante o desenvolvimento do projeto serão transferidos para planilha

Excel de acordo com as descrições dos apêndices e com posterior transferência para o programa

de estatística SPSS versão 23.0.

As variáveis, peso inicial e final e valores de glicemia serão analisados pelo teste t de

Student. A análise conjunta dos efeitos do tempo de epitelização e do grupo controle de variável

numérica (área de ferida) será feita pela Análise de Variância (ANOVA) e para comparação entre

as médias foi utilizado o teste de Tukey. As variáveis da avaliação histológica serão analisadas

pelo teste não paramétrico de Mann Whitney. Será considerado o nível de significância menor ou

igual a 5%.

4- Resultados Esperados

Espera-se conhecer mais sobre a ação dos fitoterápicos e estudar possibilidades

terapêuticas de melhor efetividade, menos eventos adversos e de baixo custo que possam contribuir

para a melhoria da qualidade de vida de mulheres no climatério. Espera-se relacionar uma

terapêutica pouco estudada, que é o uso de fito-hormônios no climatério, com uma temática que

atualmente tem sido foco de importantes estudos, que é a microbiota intestinal. Espera-se ainda

que esse projeto de pesquisa colabore com as iniciações científicas de 3 (três) alunas do curso de

medicina através da pesquisa experimental.

16
 5- Cronograma

10/19 11/19 08/21 09/21 10/21 11/21 12/21 07/20 08/20 09/20 10/20
Preparo e submissão
X X
ao CEUA
Treinamento para
X X
manejo dos animais
Recebimento dos
X X X
animais no biotério
Início do tratamento
X X X X
dos animais
Sacrifício dos
X
animais
Análise dos dados
X
Discussão
Preparo do artigo
X X
científico

17
 6- ORÇAMENTO

Descrição do material Valor unitário R$ Quantidade Valor total R$

Amora 179,00 3kg 537,00
Isoflavona 126,00 3kg 378,00
3.780 L 40,00
Água mineral 12,00 para cada 20 L

Sacos plásticos 6x24 6,0 (200 unidades) 1000 30,00

Ratos Wistar 45,00 21 630,00
Ração roedores 30,0 30kg 90,00
Caneta porosa (4 cores diferentes) 4,00 10 40,00
Seringas BD 1 ml 0,72 500 360,00
Xilazina 25,0 2g 50,00
Ketamina 40,0 2g 80,00
Tubo EppendorF 1,5 ml 30,0 Caixa com 100 30,00
Tubo soro gel 1,3 ml 40,0 100 40,00
Tenoxican (Roche Farm. Brasil) 34,0 200 mg 34,00
lamina para microscopia 26x76 lisa sem lapidar 4,50 8 36,00
caixa com 50 und
0,24 105 25,20
swab estéril com haste plástica pacote com 100 und

agar macconkey 200,0 (Kg) 0,5 100,00

placa de petri 80x15 de vidro 6,50 100 650,00
Kit colesterol 6,00 1 6,00
Papel alumínio 11,00 1 11,00
Luvas 18,00 5 90,00
Fita para dextro 0,8 50 40,00
Cloridrato de Xilazina 110,00 50ml 110,00
Etanol 70% 6,00 1l 6,00
Clorexidina 18,60 1l 18,60
Tubo coletor estéril 1,07 150 unidades 140,00
QIAamp DNA Stool Mini kit 255,00 1 kit 255,00
solução de brometo de etídio (0,25ìgmL-1) 100,00 10mg/ml 100,00
Agar MRS Lactobacillus 83,00 100g 83,00
BMS Bifidobacterium (Sigma) 25,00 100g 25,00
Valor total 4.035

18
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