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FUNGOS

1. INTRODUÇÃO
Micologia: é o ramo da Biologia que estuda os fungos, ela engloba o estudo de um grande número
de seres pluricelulares ou macroscópicos ou unicelulares ou microscópicos. Estes últimos, principalmente os
micro-fungos parasitas, pertencem ao domínio da Microbiologia.
Definir os exatos limites do grupo é virtualmente impossível. Atualmente, os biologistas usam o
termo FUNGO para incluir: "os organismos aclorofilados, nucleados, produtores de esporos, que geralmente
se reproduzem sexuadamente à assexuadamente e cujas estruturas somáticas filamentosas e ramificadas são
envolvidas por paredes celulares contendo celulose ou quitina ou ambas."
Os fungos incluem organismos muito diversificados e em muitos casos pouco relacionados.
Apresentam algumas características comuns aos vegetais e outras aos animais, sendo que sua posição entre
os seres vivos foi polêmica durante muitos tempo. No sistema de cinco reinos, proposta por Wittaker (1969)
para a classificação dos seres vivos, o grupo adquiriu identidade própria: Reino Fungi (grego: sphongos =
esponja; latin = fungus).
Alexopoulos & Mimus (1979) adotaram a posição do reino para o grupo, mas com outra
terminologia: Reino Mycetae (grego: mykes = cogumelo).
A taxonomia dos fungos tem sido tratada, classicamente, em livros textos de botânica. Micologia é
relativamente recente (cerca de 250 anos), se comparada com a Botânica e Zoologia. Muito grupos de
fungos são conhecidos somente a 30-40 anos. Os fungos são popularmente pouco conhecidos. Poucas
pessoas têm consciência da importância dos fungos em nosso dia a dia. Basta lembrar que a Micologia tem
ramificação, aplicações e disciplina na Medicina, Veterinária, Bioquímica, Genética, Citologia, etc.

2. CARACTERÍSTICAS GERAIS

Os fungos são encarióticos, diferem, portanto, das bactérias, algas azuis e proclorofíceas. Como já
foi mencionado anteriormente, os fungos não possuem clorofila e nesta característica constituem um grupo
bastante homogêneo; não há exceções.
Excetuando-se os raros casos, possuem paredes celulares definidas, são geralmente imóveis, porém
podem possuir estágios reprodutivos móveis, reproduzindo-se assexuadamente através de esporos, na maior
parte dos casos. Não possuem caule, raízes ou folhas, nem um sistema de condução sofisticado como as
plantas superiores. A forma varia desde um simples talo esférico sem qualquer outro acessório e que se
transforma totalmente em um esporângio na maturidade, até a forma filamentosa multicelular (micelial),
ramificada ou não. Os núcleos são relativamente fáceis de serem observados e as estruturas somáticas, com
raras exceções, demonstram possuir restrita ou nenhuma divisão de trabalho.
ESTRUTURA GERAL DOS FUNGOS

O crescimento do filamento - a hifa - é apical, porém as outras partes do fungo possuem


potencialidades de crescimento. Assim um pequeno fragmento de quase qualquer parte do fungo é suficiente
para dar início a um novo talo.
De modo geral as estruturas somáticas são diferentes das estruturas reprodutivas e estas possuem
uma diversificação de formas nas quais se baseia a classificação desses organismos. Poucos são os fungos
que podem ser identificados na ausência de seus estágios sexuados. Neste caso devem ser colocados na
classe formal: Deuteromycetes.

3. NUTRIÇÃO E CRESCIMENTO

Os fungos são aclorofilados e heterotróficos. Possuem pigmentos responsáveis pelas cores variadas que
apresentam mas nenhuma capaz de absorver energia para síntese de carbohidratos a patir de CO2. Assim,
são heterotróficos, mas se nutrem por obsorção, ao contrário dos animais, por ingestão. Excetuam-se os
representantes da classe Nyxomicetes que também se nutrem por ingestão.
Os fungos dependem de água líquida para seu crescimento e desenvolvimento. A maioria também
depende do oxigênio para a respiração, sendo, portanto, aeróbicos. Muitos entretanto, são anaróbicos
facultativos, isto é, respiram na presença de oxigênio e fermentam na ausência.
Conforme a nutrição, os fungos são classificados em duas categorias: s aprófitas (ou sapróbios) e
parasitas. Os saprófitas se alimentam de matéria orgânica animal ou vegetal morta e os parasitas vivem
dentro de ou sobre organismos vivos (animais ou vegetais), deles retirando seus alimentos.
Entretanto, nem sempre se pode fazer uma clara distinção entre parasitas e saprófitas. Entre os
parasitas, pode-se distinguir 3 níveis de parasitismo:
a) Parasita obrigatório: é aquele que só pode viver sobre um hospedeiro.
Ex.: Erysiphe sp.
b) Saprófita facultativo : normalmente vive como parasita e deste modo atinge seu maior
desenvolvimento. Entretanto, dependendo das circunstâncias pode viver como saprófita. Ex.: Phytophtora
infestans (parasita de batata) pode se desenvolver em meio de ágar, em laboratório.
Fotografia de um Basidiomycete
Vulgar “Orelha de Pau”

c) Parasita facultativo: é aquele que geralmente é saprófita, mas pode se tornar parasita. Isto ocorre, por
exemplo, com certas espécies da Fusarium que habitam o solo vivendo como saprófitas. Se um hospedeiro
vegetal (plântulas, por exemplo) adequado for colocado no solo, o fungo passa a atacá-lo, vivendo agora
como parasita.
Os fungos vivem exclusivamente como saprófitas, são chamados saprófitas obrigatórios . São
incapazes de infectar plantas ou animais vivos. São exemplos destes: Rhizopus ("bolor preto do pão");
Penicillium ("bolor azul").

A Penicilina é um importante antibiótico derivado deste fungo saprófita Penicillum notatum

Os fungos podem viver ainda em simbiose com outros organismos. O exemplo mais notável são os
líquens, nos quais uma determinada espécie de fungo vive em simbiose com uma alga.
Outro exemplo é o da micorriza, onde o fungo vive associado às raízes de plantas superiores. As
hifas do fungo funcionam como pelos absorventes, retirando água e sais da solução de solo, transferindo-os
às raízes da planta. Esta, por sua vez fornece substâncias elaboradas ao fungo.
Para o seu desenvolvimento, necessitam de carboidratos. Estes são necessários para a construção do
corpo do fungo e como fonte de energia. Num fungo típico, 50% do peso seco são representados por
Carbono. Dos carboidratos, os fungos utilizam glicose, frutose, maltose. A sacarose é também boa fonte de
carbono para algumas espécies. Alguns fungos utilizam proteínas, lipídios e certos ácidos orgânicos como
fontes de energia.
O crescimento, entretanto, é sempre melhor quando o fungo se encontra sobre um substrato que
contém um carboidrato apropriado.
Além do carbono, os fungos necessitam de Nitrogênio. Para conseguí-lo, eles se utilizam de fontes
orgânicas ou inorgânicas daquele elemento. As principais fontes orgânicas são as proteínas, peptídios e
aminoácidos. Na natureza, os fungos decompõem proteínas, e outras matérias para obterem seu suprimento
de Nitrogênio. Muitos fungos, entretanto, obtém o Nitrogênio a partir de fontes inorgânicas, como nitratos e
sais de amonia.
Hidrogênio e Oxigênio são obtidos na forma de água que representa cerca de 85-90% do peso total
do micélio.
Entre os macronutrientes, os fungos requerem além do Nitrogênio, Enxofre, Fósforo, Potássio e
Magnésio. Estes elementos são obtidos a partir de sais inorgânicos ou de outras fontes como sulfatos para o
Enxofre e fosfatos para o Fósforo.
Para o seu completo desenvolvimento, utilizam ainda micronutrientes como: Ferro, Zinco, Cobre,
Manganez, Boro, Cobalto e Molibdênio.
Como os outros organismos, necessitam de diminutas quantidades de Vitaminas . Muitas espécies
sintetizam suas próprias vitaminas; outras obtem, ou aos seus precursores, a partir de substratos. Tais
vitaminas incluem: tiamina (B1 ), piridoxina (B6) e riboflavina (B2). Poucas espécies usam também ácido
nicotínico e ácido pantotênico, sendo que a grande maioria, contudo, requer a tiamina.
Quanto à temperatura, a maioria dos fungos cresce bem entre 0ºC e 35ºC, mas o ótimo fica na faixa
de 20ºC a 30ºC. Podem ocorrer casos extremos de tolerância tanto à altas como baixas temperaturas.
Quanto ao pH, os fungos preferem meio ácido para o seu crescimento, ficando o ótimo no redor de 6.
O fator luz não é importante para o seu desenvolvimento, mas um pouco de luz é essencial para a
ocorrência de esporulação em muitas espécies. A luz também toma parte na dispersão dos esporos, sendo
que os esporângios de muitos fungos são positivamente fototrópicos e descarregam seus esporos em direção
à luz.
Tipicamente, o talo de um fungo consiste de filamentos ramificados em todas as direções, sobre ou
dentro de substrato que exploram como alimento. Tais filamentos se denominam HIFAS (grego: hiphe =
tecido, trama). O conjunto de hifas se chama MICÉLIO (grego: mykes = fungo). Cada hifa pode ou não
estar interrompido por septos. O micélio que contém septos é chamado septado e o que não apresenta septos
em suas hifas, é dito cenocítico (grego: Koinos = comum; Kytos = cavidade).
As septadas podem apresentar septo completo, com poro simples ou poro doliporo.

Fotografia de um Zigomycete, evidenciando os esporos


O micélio pode ser classificado em dois tipos de acordo com o arranjo das hifas: Prosênquima e
pseudoparênquima . O micélio do tipo prosênquima caracteriza-se por sua aparência distintamente
filamentosa, enquanto no pseudoparênquima a estrutura filamentosa não pode ser reconhecida, isto é,
lembra um parênquima. Os fungos parasitas emitem hifas especiais por entre as células do hospedeiro ou
para dentro delas, sugando-lhes os nutrientes através de uma estrutura denominada HAUSTÓRIO. (Latim:
haustor = o que bebe).

4. REPRODUÇÃO

Pode ser sexuada ou assexuada. Na formação dos órgãos reprodutivos (sexuada ou assexuada) o talo
pode se converter em tais estruturas de reprodução, não ocorrendo, portanto, fases somáticas ou
reprodutivas ao mesmo tempo e no mesmo indivíduo. Tal condição é apresentada pelos chamados fungos
HOLOCÁRPICOS (Grego: holos = total; Karpos = fruto). Na maioria dos fungos porém, tais órgãos de
reprodução surgem apenas em certas porções do micélio, permanecendo a porção remanescente com
funções vegetativas. Fungos que apresentam este padrão são chamados EUCÁRPICOS (Grego: eu =
verdadeiro; Karpos = frutos).
4.1. Reprodução assexuada (propagação vegetativa)
Os vários processos de propagação vegetativa podem ser memorizados como seguem:
A) Fragmentação somática: na qual cada fragmento se desenvolve em um novo indivíduo. É uma forma
usual de propagação nos fungos. A hifa se quebra em seus componentes celulares que passam a se chamar
oídios (Grego: oidio = pequeno ovo) ou artrósporos (Grego: arthron = articulado; sporos = semente) que se
comportam como esporos.
Se as células se tornam envolvidas por uma parede espessa antes de se separarem, uma das outras ou
das células adjacentes, são então chamadas clamidósporos (Grego: chlamys = capa).
2) Fissão celular: é a simples divisão de uma célula em outras duas. Ocorre em algumas leveduras.
3) Brotamento: também é chamado de gemulação, é a produção de uma gema a partir de uma célula.
Enquanto a gema é produzida, o núcleo da célula-mãe se divide e um dos núcleos migra para a gema. Esta
cresce e se destaca, originando um novo indivíduo. Às vezes, são formados vários brotos em cadeia,
simulando um curto micélio. Ocorre em freqüência em levedura.
4) Esporulação: é o processo mais comum de propagação entre os fungos. Os esporos variam muito na
cor, forma e tamanho. Quando produzidos dentro de esporângio, são ditos esporangiósporos . Estes podem
ser móveis (zoósporos) ou imóveis (aplanósporos). Se forem produzidos no ápice de hifas especiais, são
chamados conídios ou conidiósporos (Grego: Konys = poeira).
Método de propagação através de esporos

4.2. Reprodução sexuada (ocorre isogamia e heterogamia - anisogamia e oogamia)


Consiste, como nos outros organismos vivos, na união de 2 núcleos compatíveis. Tipicamente
consiste em 3 fases distintas: PLASMOGAMIA, CARIOGAMIA e MEIOSE.
A plasmogamia frequentemente é seguida por cariogamia nos fungos inferiores. Nos superiores,
porém, tais processos são separados no tempo e no espaço, ficando a célula com 2 núcleos. Este par de
núcleos é denominado DÍCARO (Grego: di = dois; Karyon = núcleo) e esta situação pode permanecer
indefinidamente no micélio.
A fusão nuclear, que ocorre nos fungos que se reproduzem sexuadamente, é, mais cedo ou mais
tarde, seguida por meiose que restaura a condição haplóide.
Para que a reprodução sexuada ocorra, é necessário que haja compatibilidade nuclear.
Com base nesta compatibilidade, os fungos podem ser separados em:
• HOMOTÁLICOS: são aqueles cujo micélio (ou talo) é auto-fértil e podem, portanto, reproduzir-se
sexuadamente por si só, sem a participação de outro micélio.
• HETEROTÁLICOS: são os que possuem micélio auto-estéril e requerem a participação de outro
talo compatível para a reprodução sexuada.
O processo de fecundação, isto é, de encontro dos gametas é muito diverso:
• Conjugação de planogametas: isto é, gametas móveis de modo semelhante ao que ocorre em
muitas algas.
• Espermatização: onde o gameta feminino permanece fixo ao talo, enquanto o masculino
(aplanosporo) desprende-se do talo, aderindo-se ao feminino, de modo semelhante ao que ocorre nas
algas vermelhas.
Nos três casos seguintes, não são produzidos gametas diferenciados. Hifas diferenciadas ou
não entram em contato, após o que ocorre sua fusão ou migração dos núcleos gaméticos masculinos.
• Somatogamia : linfas sométicas pouco ou não diferenciadas entram em contato.
• Contato de gametângios : gametângios diferenciados se justapõem.
• Conjugação de gametângios : gametângios diferenciados se fundem.
Caracterização do grandes grupos:
Os fungos são muito diversos. Cerca de 80.000 espécies tem sido descritas e sua classificação é
relativamente instável, tendo sofrido muitas modificações nas últimas décadas. Nosso estudo dará ênfase ao
nível de classe e gênero porque estas categorias taxonômicas permitem agrupar melhor as informações
morfológicas, biológicas e evolutivas.

Líquens - Associação simbiótica de Algas e Fungos

5. IMPORTÂNCIA DO GRUPO

1. Promovem a desintegração da matéria orgânica, vegetal ou animal (decompositores).


2. Contaminam e decompõem os alimentos (pão, frutas, carnes).
3. São a base de processos industriais que envolvem fermentação, como a produção de pão, vinho, álcool,
cerveja, queijos (Camembert, Roquefort e outros).
4. São usados na fabricação de antibióticos (Penicilina).
5. Provocam doenças (micoses) nos animais e no homem, podendo causar lesões superficiais na pele, nos
pelos e nas mucosas ou profundas, atingindo e lesando os pulmões, o sistema nervoso e até mesmo os ossos.
6. Produzem doenças em plantas cultivadas, trazendo grandes prejuízos econômicos. Exemplos:
"ferrugens" e "carvões" que atacam o café, o milho, o feijão, a cana-de-açucar, etc.
7. Algumas espécies são usadas como alimentos. Exemplos: entre os Ascomycetes podem ser citados:
Morchella , Poziza, Tuber , e entre os Basidiomycetes: Agaricus , Lepigta , Boletus , Clavarig e outros.

Basidiomycete típico de uma floresta decídua

8. Outras espécies são valiosos materiais para estudos genéticos, como por exemplo: Neurospora,
Sordaria.
9. Alguns se associam com raízes de plantas superiores, constituindo o que se chama de micorriza. Esta
associação é geralmente benéfica para os dois organismos. Provavelmente representa uma condição de
parasitismo equilibrado, através da qual a planta deve obter nutrientes através das hifas do fungo. Se,
entretanto, o equilíbrio é alterado, o fungo pode causar grandes danos à raiz.
10. Há espécies que causam grande danos às indústrias de madeira, couro e de instrumento ópticos, pelo
emboloramento das lentes.
11. Outras espécies produzem substâncias altamente tóxicas ao organismo dos animais e ao próprio
homem. A literatura registra alguma espécies de Aspergilus e Penicillium como produtoras de aflatoxinas,
metabolitos altamente tóxicos para o organismo animal e humano.
12. Certas tribos indígenas mexicanas usam várias espécies de "fungos sagrados" (gênero Psilocybe) em
ritos religiosos. Certos povos primitivos da Ásia usam certas espécies de Agaricus (A. muscarius), por
exemplo, em banquete orgíacos. Tais fungos produzem substâncias alucinógenas que provocam alucinações
ou estados oníricos, de confusão mental ou de despersonalização.

6. TAXONOMIA DO GRUPO

Reino Miceteas (Myceteae) ou Fungi


Divisão 1. Gimnomicotes (Gymnomycota)
Subdivisão 1. Acrasiogimnomicotinas (Acrasiogymnomycotina)
Classe 1. Acrasiomicetes (Acrasiomycetes)
Subdivisão 2. Plasmodiogimnomicotinas (Plasmodiogymnomycotina)
Classe 1. Protosteliomicetes (Protosteliomycetes)
Classe 2. Mixomicetes (Myxomycetes)
Divisão 2. Mastigomicotes (Mastigomycota)
Subdivisão 1. Haplomastigomicotinas (Haplomastigomycotina)
Classe 1. Quitridiomicetes (Chytridiomycetes)
Classe 2. Hifoquitridiomicetes (Hyphochytridiomycetes)
Classe 3. Plasmodioforomicetes (Plasmodiophoromycetes)
Subdivisão 2. Diplomastigomicotinas (Diplomastigomycotina)
Classe 1. Oomicetes (Oömycetes)
Divisão 3. Amastigomicotes (Amastigomycota)
Subdivisão 1. Zigomicotinas (Zygomycotina)
Classe 1. Zigomicetes (Zygomycetes)
Classe 2. Tricomicetes (Trichomycetes)
Subdivisão 2. Ascomicotinas (Ascomycotina)
Classe 1. Ascomicetes (Ascomycetes)
Subclasse 1. Hemiascomicétidas (Hemiascomycetidae)
Subclasse 2. Pletomicétidas (Plectomycetidae)
Subclasse 3. Himenoascomicétidas (Mymenoascomycetidae)
Subclasse 4. Laboulbeniormicétidas (Laboulbeniomycetidae)
Subclasse 5. Loculoascomicétidas (Loculoascomycetidae)
Subdivisão 3. Basidiomicotinas (Basidiomycotina)
Classe 1. Basidiomicetes (Basidiomycetes)
Subclasse 1. Holobasidiomicétidas (Holobasidiomycetidae)
Subclasse 2. Fragmobasidiomecétidas (Phragmobasidiomycetidae)
Subclasse 3. Teliomicétidas (Teliomycetidae)
Subdivisão 4. Deuteromicotinas (Deuteromycotina)
Forma-classe 1. Deuteromicetes (Deuteromycetes)
Forma-subclasse 2. Celomicétidas (Coelomycetidae)
Forma-subclasse 2. Hifomicétidas (Hyphomycetidae)
Forma-subclasse 3. Agonomicétidas (Agonomycetidae)

TAXONOMIA NOS FUNGOS

Os métodos utilizados na identificação de fungos de uma maneira geral tem sido baseados
predominantemente nas observações das características morfológicas, tanto da fase assexual, através do grau
de crescimento, coloração e textura superficial da colônia, odores existentes e características das hifas;
assim como da fase sexual através das características completas do corpo de frutificação (Day, 1979). Uma
revisão dos fatores morfológicos usados para os ascomicetos à nível de classe proveu uma base para avaliar
tanto os avanços da filogenia molecular quanto estudos do desenvolvimento de fatores para chaves
morfológicas. Esses fatores incluem : crescimento como um unicelular (leveduras) ou um filamento (hifas),
a presença ou ausência de um corpo de frutificação (ascocarpo) e sua morfologia, e a saída passiva ou
forçada do esporo meiótico (ascosporos) do meiosporângio (ascos). Em alguns casos é considerado também
a produção dos esporos mitóticos (conidiosporos) (Taylor et al, 1993).
Há, entretanto, alguns grupos de fungos que devido sua importância prática, tem sido estudado mais
intensivamente. E não só morfologia, mais outros fatores tem sido usados na classificação. A correta
identificação de fungos é de grande importância nos estudos de patologia de plantas e animais,
biodeterioração, biotecnologia e em estudos ambientais. Muitos dos fatores usados na classificação também
podem ser utilizados na identificação. O uso de experimentos relacionados com sequência única de DNA
para espécie é o mais recente desenvolvimento na taxonomia de fungos. Alguns dos fatores considerados de
maior importância e mais utilizados na classificação e identificação dos fungos atualmente são : morfologia,
nutrição e fisiologia, compostos químicos de baixo peso molecular (CoQ, metabólitos secundários), pirólise-
espectrometria de massa, composição da parede celular, composição de proteínas (eletroforese em gel) e
ácidos nucléicos (composição de base de DNA - %C+G; hibridização DNA:DNA; RFLP (Restriction
Fragment Lenght Polymorphisms); e sequência de ácido nucléico ribossomal) (Carlile e Watkinson, 1996).
Tradicionalmente, a classificação dos ascomicetos tem sido baseada nas características do corpo de
frutificação. Alguns micologistas insistem no fato de que apenas estes caracteres não são suficientes para
definir seguramente a identidade do organismo, porém são questões ainda não definidas. Berbee e Taylor
(1992), conduziram análises filogenéticas determinando a sequência do gene RNA 18S ribossomal de
fungos das classes Plectomicetos e Pirenomicetos (peritécios), para uma melhor classificação dos grupos.
Atualmente esta técnica tem sido desenvolvida com sucesso na identificação e classificação de alguns
fungos, reduzindo as convergências detectadas quando somente se faz uso de características morfológicas,
porém para o grupo de Neurospora os estudos moleculares tem confirmado as conclusões morfológicas.
Os ascomicetos são caracterizados por :
1. esporos sexuais (ascosporos) desenvolvidos em ascos, e descarregados forçadamente
2. ascos desenvolvidos a partir de um zigoto, célula vegetativa 2N, ou hifas ascogênia
3. hifas ascogênias dicarióticas (homocariótica ou heterocariótica)
4. estágio vegetativo uni-celular ou filamentoso; hifas com células delimitadas por septos
5. septos perfurados permitindo a migração nuclear e formação de heterocarion
6. parede celular composta usualmente por 1,3 ou 1,6 glucano ou manana, também quitina
7. todos, exceto o grupo Hemiascomiceto tem ascocarpo
8. muitos apresentam estágio sexual pleomórfico
9. são heterotálicos ou homotálicos
10. os heterotálicos são bipolar
11. reprodução sexual pode ser por : fusão gametangial, contato gametangial, espermatização,
somatogâmia e conidiação (Neurospora)
A classificação baseada na estrutura do corpo de frutificação divide os Ascomicetos em seis grupos :
1. Hemiascomicetos - são distinguidos pela ausência de um corpo de frutificação; ascos a partir de
células diplóides; inclue as leveduras
2. Plectomicetos - o ascocarpo é representado por um cleistotécio, o qual não apresenta abertura, e tem
forma esférica
3. Pirenomicetos - corpo de frutificação chamado de peritécio, o qual tem uma abertura (ostiole), e
apresenta uma forma de frasco contendo ascos com parede única
4. Discomicetos - onde o ascocarpo é um apotécio onde os ascos ficam expostos
5. Loculoascomicetos - o ascocarpo é um pseudotécio, similar ao peritécio, porém com ascos de
parede dupla
6. Laboubeniomicetos - ascocarpo é um peritécio, são parasitas de inseto; pouco estudados.
2. Importância de Neurospora
Principalmente pelo fato de ser considerado como organismo modelo, ou seja, possuem certas
características que permitem serem mais facilmente estudados, e os resultados aplicados para outros
microrganismos.
A maioria dos estudos moleculares utilizam espécies modelos em seus experimentos, e os
taxonomistas podem alterar os estudos de desenvolvimento molecular para entender bases genéticas de
diferenças morfológicas as quais são tão importantes na classificação de fungos.
N. crassa é a éspecie mais utilizada como organismo modelo, principalmente pelo fato de sua
morfologia e fisiologia terem sido tão bem sucedidos em laboratórios de genéticas e por apresentarem um
número impressionante de "primeiros" neste campo (primeiros fungos filamentosos que moléculas intactas
de DNA foram separadas por eletroforese; primeiro fungo a ter todos os grupos mapeados
geneticamente....).
Os ascomicetos tem sido os fungos mais populares em estudo de desenvolvimento molecular pelos
geneticistas, começando com Neurospora, e depois Saccharomyces e Aspergillus.
Características que fazem de Neurospora um organismo modelo :
1. fisiologia e morfologia bem definida
2. apresentam bom mapa genético
3. suficientes referências para comparação de estudos
4. tem uma certa importância econômica
5. sustentam um número impressionante de "primeiros" na genética
3. Ciclo de Vida de Neurospora

3.1 Sistema Vegetativo


Durante o crescimento vegetativo os micélios espalhados formam esporos assexuais chamados
conídeas (macroconídeas e/ou microconídeas) que são produzidos na extremidade dos conidióforos (hifas
aéreas). A reprodução vegetativa também pode ocorrer através de fragmentos miceliais (Leslie, 1996). O
resultado da germinação dos esporos leva à saída de um ou mais filamentos finos, conhecidos como tubos
germinativos, que crescem prolongando-se de uma maneira notável, mas com pouco desenvolvimento em
diâmetro. Os tubos germinativos ramificam-se em todos os sentidos formando uma massa de filamentos
conhecida como micélio, que constitue o corpo vegetativo dos fungos filamentosos. Cada filamento ou hifa,
são segmentadas por septos perfurados no centro, que permitem a migração dos núcleos. Os esporos
germinam por um ou mais poros, por onde sai a massa, tomando a forma de longos tubos germinativos. São
chamados de assexuais, quando produzidos puramente pelas transformações do sistema vegetativo.

3.2 Reprodução Sexual


Na reprodução sexual as espécies seguem uma das três estratégias básicas: homotalismo,
pseudohomotalismo e heterotalismo. As linhagens homotálica e pseudohomotálica podem ser auto-fértil, e
esta última ainda pode cruzar com outro indivíduo de sua espécie para completar a parte sexual do ciclo de
vida. As linhagens heterotálicas, requerem contribuições de dois parentes distintos geneticamente para êxito
no cruzamento sexual (Leslie e Klein, 1996).
Uma cultura de Neurospora sitophila por exemplo pode produzir abundantes conídeas e protoperitécios. Os
protoperitécios são estruturas, mais ou menos esféricas, com 60 um em diâmetro, contendo uma estrutura
multicelular enrolada, o ascogônio, os quais são cercados por hifas estéreis. A partir da extremidade do
ascogônio, crescem tricogônios ramificados, mais o desenvolvimento não segue adiante, a menos que os
protoperitécios sejam fertilizados por conídeas de uma linhagem compatível. O fungo neste caso é
heterotálico, com dois mating types, e que requer a interação de duas linhagens compatíveis, uma de cada
mating type, para completar a reprodução. O ciclo sexual é iniciado somente quando um protoperitécio de
um mating type (A) é fertilizado pela célula macho de um outro mating type (a)
O orgão sexual feminino, ou protoperitécio, é formado pelas linhagens mating-type, em resposta à
carência de nitrogênio, luz e temperatura baixa (25oC) (genes expressados preferencialmente durante a fase
sexual são pouco ou não detectados durante o crescimento de linhagens em condições vegetativas (alto
nitrogênio), sugerindo que a carência de nitrogênio é requerida para sua síntese (Nelson e Metzenberg,
1992). Dando continuidade ao ciclo sexual a hifa especializada tricogônia se estende a partir do
protoperitécio em busca de um conídeo ou hifa de um mating-type oposto. A extremidade tricogonial fundi
com células fertilizantes, e núcleos do doador macho migram para o protoperitécio, ocorrendo o
desenvolvimento dos ascos. Nestas células em forma de gancho, o núcleo de mating-type oposto fundi para
formar um núcleo diplóide que imediatamente iniciam meioses. Os ascos resultantes contém os produtos
derivados de um único evento meiótico e uma subsequente mitose pós-meiose; os oito ascosporos gerados
são arranjados em ordem linear dentro do asco, os quais são expulsos do corpo de frutificação (peritécio)
para a continuação do ciclo (Nelson, 1996).

4. Identificação de Neurospora
Para a distinção entre espécies de Neurospora, diferenças na conidiação (px.pigmentação e
morfologia grosseira) na fase vegetativa, são de pequeno valor taxonômico para a classificação do
organismo. Entretanto, informações morfológicas da fase sexual ou telemórfica do fungo, vem sendo usadas
com sucesso até hoje na sua classificação e identificação.
Descrições já publicadas tem enfatizado convenientemente o ciclo sexual; homotalismo versus
heterotalismo e a presença de 4 esporos versus oito esporos nos ascos, são por exemplo, tipos claramente
diferentes, fáceis de se obter e portanto fundamentais, na identificação de Neurospora (Perkins, 1976).
O cruzamento seguido das observações morfológicas é o procedimento preferido como critério
taxonômico para a identificação das linhagens heterotálicas de Neurospora. A produção de peritécios férteis
e abundantes ascos, com viáveis esporos negros, quando um isolado é cruzado com uma linhagem de
referência autêntica, é o mais prático e convencional método para estabelecer, através de diferenças nos
detalhes morfológicos, a que espécie pertence uma determinada linhagem.
Outros fatores que também podem ser utilizados na classificação e identificação de Neurospora são :
análises quimiotaxonômicas, como diferenças no número de unidades isoprenóides (CoQ), que no caso
deste gênero é representado pela CoQ 10; A composição de proteínas, através de eletroforese em gel; e
técnicas moleculares, usando principalmente a reação em cadeia de polimerase (PCR).

4.1. Características morfológicas


Apesar do questionamento com relação à classificação e identificação dos fungos apenas através de
informações morfológicas não ser sufuciente para caracterizar uma espécie, a identificação de Neurospora
ainda sustenta a morfologia como principal fator na sua caracterização (Nelson, 1996). Através de
diferenças de detalhes dos esporos sexuais entre as espécies conhecidas, como a presença de estrias, de um
ou dois poros de germinação, diâmetro e forma, da quantidade presente nos ascos, e tamanho de peritécios,
o organismo pode ser identificado à nível de espécie. Para as culturas heterotálicas, que são estéreis, e não
podem ser fertilizadas por linhagens de mesmo mating type, e consequentemente produzir o corpo de
frutificação, procede-se com o cruzamento, onde uma cultura de mating type A produz protoperitécios que
podem ser fertilizados por um mating type a compatível, e vice versa (ver ciclo de vida). O resultado é a
formação de peritécios, ascos e ascosporos, dos quais pode-se obter as informações para a identificação do
fungo, através de comparação com a chave para identificação de Neurospora descrita por Frederick (1969).
A cultura em lâmina é utilizada para se obter informações morfológicas da fase vegetativa.

4.1.1. Cultura em lâmina


Para execultar esta técnica utiliza-se placas de Petri estéril montadas com papel de filtro, lâmina e
lamínula conforme descrito por Soares et al, 1987. O meio PDA, o qual favorece o crescimento vegetativo
do fungo, é distribuido numa placa e em seguida cortado com auxílio de uma espátula, em pedaços
quadrados de aproximadamente 5mm. O microrganismo é então semeado dos 4 lados do quadrado (meio de
cultura). O papel de filtro no fundo da placa é umedecido com água estéril, repetindo sempre que estiver
seco, no decorrer do experimento. Em seguida a placa é incubada à temperatura ambiente por
aproximadamente 12 dias, seguindo com a fixação da cultura com etanol 70% lavando a lamínula e lâmina
após o crescimento do fungo, secar ao ar livre e corar com azul de algodão/lactofenol. As bordas da
lamínula são fechadas com esmalte, quando então estão aptas para serem observadas no microscópio as
formas vegetativas como hifas, conídeos e septos do microrganismo. Com este método se obtém estruturas
em boas condições para o estudo morfológico detalhado.
4.1.2. Cruzamento
Os cruzamentos são realizados rotineiramente a 25oC, em tubos de 15 cm, ou em placas de Petri, no
meio sintético para cruzamento (SC), proposto por Westegaard e Mitchell (1947), onde os ascosporos são
germinados por volta de 18 dias após a fertilização. O meio de cultura Ágar de milho (Cornmeal agar) pode
ser usado em casos especiais, em que não se obtém sucesso com o meio sintético pra cruzamento (Stanford
Neurospora Methods, 1996). Em algumas linhagens de Neurospora que aparentemente não produzem
protoperitécios em meio com sacarose, foi constada grande abundância do orgão feminino em meio com
papel (Fairfield e Turner, 1996). O cruzamento é inibido com alta presença de nitrogênio amônia ou amino,
porém se o total de aminoácido não exceder 0.3 mg/ml não há problema com a fertilização (Perkins, 1996).
Um simples método para cruzamento de linhagens de Neurospora crassa foi sugerido por Pandit e
Russo (1996). O meio de cruzamento sintético (Davis e de Serres, 1970), foi utilizado nos testes, exceto na
concentração de sacarose, modificada para 0.1% e a adição de 0.5% de sorbose, 0.1% de extrato de levedura
e 0.1% de hidrolizado de caseína. E a presença de papel de filtro como fonte de carbono. Em
aproximadamente 18 dias pode-se verificar a presença dos esporos sexuais.

4 2. Taxonomia molecular
A taxonomia molecular envolve o estudo dos ácidos nucléicos microbianos, principalmente DNA
cromossômico e RNA ribossômico, para a obtenção de informações taxonômicas. As informações derivadas
de ácidos nucléicos podem ser empregadas na classificação de linhagens microbianas em diversos níveis
taxonômicos hierárquicos, desde o estabelecimento de relações infra-específicas entre linhagens até relações
entre espécies, gêneros e níveis taxonômicos supra genéricos.Com os ascomicetos, a consequência de
simples ou reduzida morfologia tem sido uma ploriferação de sistemas de classificação mutuamente
impróprios. Dados de sequências, prover resolução de identidade para alguns casos onde a morfologia
reduzida tem criado confusão (Spatafora, 1995a). Estes questionamentos tem levado ao crescimento de
aplicações de técnicas moleculares para a classificação e identificação dos fungos, anteriormente mais
utilizado para as bactérias. Para os grupos bem suportados morfologicamente, como é o caso de Neurospora
os dados de sequência de DNA são convenientes (Berbee e Taylor, 1992). Neste trabalho, os autores
chegaram às seguintes conclusões, baseados nos dados de sequência :
1. permitiu deduzir relações de uma ampla faixa de fungos
2. a árvore filogenética pode ser bem solucionada e foi compatível com a morfologia e classificação
tradicional
3. prover melhor evidências dos eventos evolutivos morfológicos
4. não revela como os ascos são desenvolvidos ou como o corpo de frutificação é originado

PCR
Tem sido descrito o uso de reação em cadeia de polimerase (PCR) na amplificação e sequenciamento
direto de genes de RNA ribossomal das classes Pirenomicetos e Plectomicetos. Estes genes são
suficientemente conservados para a designação de primers em bases de sequências homólogas. Usando
diferentes primers por diferentes regiões do rDNA, estes podem ser diretamente sequenciados e os dados
obtidos da sequência, mostram conveniência na diferenciação de isolados de fungos em diferentes níveis e
taxas (Berbee e Taylor, 1992, 1995).
Para aplicação do método de PCR, primeiramente é necessário isolar o DNA do microrganismo. Um
método proposto por Cambareri e Kinsey (1996) para a extração do DNA a partir de Neurospora utilizando
tampão, contendo NaCl e solução de DE/GTC (terra diatomácea/tiocianato de guanidina) pode ser usado
para aplicações de PCR.Seguindo portanto com a amplificação do rDNA 18S, usando a reação em cadeia de
polimerase, a clonagem do fragmento, o sequenciamento e finalmente a análise genética (Berbee e Taylor,
1992; Lee e Taylor, 1990).

5. Espécies de Neurospora
Atualmente são conhecidas 14 espécies de Neurospora, identificadas baseadas principalmente nas
características morfológicas. Mas, dados baseados em hibridização de DNA sugeriram que várias das taxas
homotálicas possivelmente poderão ser sinônimos (Glass et al, 1990). A mais nova espécie de Neurospora
foi identificada também através de observações morfológicas por Turner e Fairfield (1996), conhecida
provisioramente por N. celeata.

1. N. tetrasperma Shear e Dodge (1927)


2. N. sitophila Shear e Dodge (1927)
3. N. crassa Shear e Dodge (1927)
4. N. toroi Tai (1935)
5. N. intermedia Tai (1935)
6. N. phoenix Dennis (1960)
7. N. terrícola Gochenaur e Backus (1962)
8. N. dodgei Nelson e Novak (1964)
9. N. galapagosensis Mahoney e Backus (1969)
10. N. africana Mahoney et al (1969)
11. N. lineolata Frederick et al (1969)
12. N. discreta Perkins e Raju (1986)
13. N. pannonica Krug e Khan (1991)
14. N. celeata Turner e Fairfield (1996)

BASIDIOMICETOS

1. INTRODUÇÃO
Os organismos da linhagem fúngica incluem os cogumelos, os bolores, os "bufa-de-lobo", as trufas,
os mofos, e muitos outros organismos que ainda não são bem conhecidos (Alexopoulos et al., 1996). Cerca
de 70.000 espécies de fungos já foram descritas, entretanto, algumas estimativas do número total sugerem
que aproximadamente 1,5 milhões de espécies devam existir (Hawksworth , 1991).
Os fungos verdadeiros, classificados como Ascomicetos, Basidiomicetos, Zigomicetos e
Quitridiomicetos, são distinguidos dos musgos e das algas pela presença de quitina em suas paredes
celulares e pela síntese de um sistema multienzimático para o aminoácido lisina (Berbee e Taylor, 1992).
Esses organismos são de grande importância por várias razões: eles são os decompositores primários em
todo os ecossistemas terrestres; são importantes associações simbióticas de plantas vasculares em ambas as
relações de mutualismo e parasitismo; constituem a avassaladora maioria dos patógenos de plantas e como
tais possuem um tremendo impacto econômico (muitos significantes patógenos humanos também são
fungos); oferecem bons desenvolvimentos de sistemas genéticos para os biologistas moleculares
(Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans); e são cruciais para a fermentação e
biotecnologia industrial (Bruns et al., 1991).
Dentre os fungos verdadeiros, o grupo monofilético de espécies do filo Basidiomicota representa
cerca de um terço das espécies descritas (Hawksworth, 1995) e é um componente ecológico vital,
principalmente de ecossistemas terrestres. Esse extraordinário bem sucedido grupo de fungos é classificado
em sistemática tradicional separadamente em Basidiomicetos sexuais e assexuais. Entretanto, esta prática
está se tornando obsoleta devido a aplicação dos princípios de sistemática filogenética para a sua
classificação. Os avanços tecnológicos têm provido o acesso a caracteres ultraestruturais, bioquímicos e
genéticos, os quais estão presentes em todas as espécies independentemente da capacidade sexual (como por
exemplo a composição da parede celular, sequências de nucleotídios, etc). O uso desses caracteres
onipresentes permite à sistemática integrar espécies sexuais e assexuais em um simples sistema de
classificação.
Apesar de sua grande importância, muito pouco se sabe sobre as relações evolucionárias dentro dos
fungos. Suas simples e frequentemente convergente morfologia, a ausência de registros fósseis úteis, e sua
diversidade, têm sido o principal impedimento para o progresso nesse campo. Com o desenvolvimento de
técnicas moleculares, novos caminhos são agora avaliáveis permitindo contornar esses obstáculos (Bruns et
al., 1991).
Muitas técnicas têm sido utilizadas no estudo de evolução dentro dos fungos, tais como: estudos de
hibridização DNA-DNA, análises por enzimas de restrição, análises de sequências, RFLP, e cariotipagem
eletroforética que são as mais utilizadas para investigação de relações evolucionárias ( Bruns et al., 1991).
O presente trabalho tem como objetivo relatar as principais técnicas utilizadas em sistemática
molecular de fungos e fornecer uma descrição dos fungos da classe dos Basidiomicetos, apresentando a
utilização de dados moleculares em estudos filogenéticos e identificação de espécies biológicas para esses
fungos.

2. MÉTODOS UTILIZADOS EM SISTEMÁTICA MOLECULAR DE FUNGOS


2.1. HIBRIDIZAÇÃO DNA-DNA
O pequeno tamanho do genoma fúngico e o fato da proporção de sequências repetitivas ser muito
menor do que em plantas ou animais parece ser ideal para estudos de hibridização, mas de fato a técnica
possui uso muito restrito devido à maneira com a qual o genoma fúngico se desenvolve (Bruns et al., 1991).
Praticamente todos os estudos com fungos têm focado a porcentagem de cross-hibridização entre o total
DNA extraído preferivelmente do que a estabilidade térmica dos híbridos. A porcentagem de DNA de cross-
hibridizados entre espécies intimamente relacionadas é excessivamente baixa, tipicamente menor do que
20%, enquanto a porcentagem de cross-hibridização entre individuos dentro de espécies biológicas é maior
do que 90% (Bruns et al., 1991). Vilgalys e Johnson (1987) evidenciam que baixos níveis de cross-
hibridização entre espécies que parecem estar intimamente relacionadas encontram-se em total contraste
com a redução gradual em hibridização entre animais distancialmente relacionados. Os mecanismos que
sublinham esta rápida mudança genômica nos fungos permanecem desconhecidos e seja qual for a causa, o
fenômeno efetivamente limita o método para questões de relacionamentos muito íntimos (Jahnk e Bahnweg,
1986; Kurtzman et al., 1983).
Outro principal obstáculo para o uso dessa técnica é a necessidade por comparações pareadas. Para N
taxa o número de experimentos é igual a N(N-1)/2. Portanto, para um estudo de 25 taxa, 300 experimentos
são necessários. Uma grande quantidade de DNA é necessária para estudos de hibridização e este
requerimento elimina a possibilidade de examinar fungos que não cresceram bem em cultura ou não
produziram suficiente quantidade de biomassa facilmente coletada na natureza. Um outro obstáculo é que os
resultados de dois estudos diferentes de organismos relacionados não são realmente comparados sem
experimentos adicionais (Bruns et al., 1991).
A técnica de cross-hibridização tem comumente sido usado para ajudar a definir espécies. Esta
prática tem provado ser de grande utilidade em sistemática de leveduras onde a correlação com estudos de
conjugação tem geralmente suportado o conceito de que espécies biológicas podem ser reconhecidas por
níveis de cross-hibridização maiores do que 80% (Kurtzman et al., 1983). Em fungos filamentosos,
descrever espécies com níveis de cross-hibridização tem sido usado com menor frequência (Bruns et al.,
1991).

2.2. ANÁLISES POR ENZIMAS DE RESTRIÇÃO


2.2.1. RFLPs versus Mapeamento
Os padrões de restrição são gerados pela quebra do DNA com enzimas de restrição, seguido de
separação por tamanho dos fragmentos resultantes via eletroforese em gel. Os padrões de fragmentos podem
ser comparados de duas maneiras: (a) um RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) é utilizado no
qual o padrão de fragmentos ou os fragmentos individuais são analisados, ou (b) um caminho de
mapeamento é empregado pela utilização de padrões de fragmentos para deduzir o mapa dos sítios
enzimáticos, os quais então tornam-se as unidades de análise juntamente com o comprimento mapeado de
mutações de comprimento (Bruns et al., 1991).
Análise por RFLP tem sido utilizada com sucesso para distinguir fungos intimamente relacionados
(Levy et al., 1991), entretanto, essa técnica consome muito tempo e requer grande quantidade de DNA e
padrões específicos (Tommerup et al., 1995). O principal poder dos RFLPs é a sua utilização como
"fingerprinting" para identificação de linhagens (Bruns et al., 1991).
O mapeamento é a única maneira para determinar o relacionamento físico dos fragmentos de
restrição uns com os outros. Em teoria, os mapas podem ser comparados diretamente, mas na prática, o
detalhado alinhamento dos mapas provenientes de diferentes estudos não é sempre possível (Bruns et al.,
1991). A resolução resultante de relacionamentos filogenéticos é frequentemente marginal por que os
fungos não possuem grandes regiões genômicas próximas que estão relativamente livres de diferenças no
comprimento. As mutações no comprimento (como por exemplo inserções ou deleções) complicam o
mapeamento, e sítios de restrições são propensos a covergentes perdas e saturam rapidamente. Por estas
razões o mapeamento para fazer comparações filogenéticas entre fungos é de valor limitado (Bruns et al.,
1991).

2.2.2. Análise de Regiões Alvo por Enzimas de Restrição


O DNA mitocondrial tem sido amplamente utilizado para estudos evolucionários em fungos. Muitos
aspectos contribuem para sua popularidade (Bruns et al., 1991): (a) Ele possui um tamanho utilizável (176-
17 Kb). (b) Não existem evidências para metilação de bases¾ neste caso um potencial fator de confusão é
evitado. (c) A forte composição predisposta A + T fornece um isolamento de mtDNA purificado
relativamente fácil (Hudspeth et al., 1980). (d) O alto número de cópia do genoma mitocondrial torna
possível visualizar facilmente os fragmentos de restrição por hibridização de DNA total para mtDNA
investigados. (e) MtDNA é rico em RFLPs até o nível intraespecífico (Foster et al., 1990; Gardes et al.,
1991).
Os plasmídeos são extremamente comuns em fungos (Somac e Leong, 1989) e potencialmente
oferecem outra região multicópia alvo ou estudos por RFLP, mas as desvantagens de usar plasmídeos
geralmente superam qualquer vantagem. Eles não estão universalmente presentes nem conservados em
sequências, e podem ser horizontalmente transmitidos (Bruns et al., 1991).
A unidade repetida do DNA nuclear ribossomal (rDNA) também tem sido usada extensivamente
para estudos com enzimas de restrição em fungos. Em muitos eucariotas, incluindo todos os fungos
verdadeiros, existe rDNA como um arranjo repetido dos três grandes genes rRNA separados por espaços
transcritos e não transcritos. A sequência de genes parece ser universalmente conservada com exceção do
gene 5S, o qual pode ou não pode estar dentro da repetição e é informado para existir em orientação oposta
pelo menos em alguns Basidiomicetos (Cassidy e Pukkila, 1987).
O arranjamento gene-espaço-gene da ordem multicópia é parte da razão implícita que o rDNA tem
sido tão popular. Porções de regiões gênicas são tão altamente conservadas que todos os heterólogos
investigados hibridizam fortemente com eles, contudo outras regiões gênicas variam consideravelmente para
comparar níveis taxonômicos moderados. Os espaços, particularmente o espaço intergênico (IGS),
frequentemente varia significativamente até o nível interespecífico (Bruns et al., 1991).
As sequências universalmente conservadas dentro dos genes ribossomais também fornecem uma
imprimação alvo ideal para amplificação enzimática; Vilgalys e Hester (1990) tem tomado vantagens desse
fato para acelerar o mapeamento de porções da subunidade grande do rRNA. Seus métodos tornam o
mapeamento apenas levemente mais trabalhoso do que análise por RFLP (Bruns et al., 1991).

2.3. ANÁLISE DE SEQUÊNCIAS


2.3.1. Sequenciamento Direto
O uso de sequências de DNA para estudos evolucionários pode superar muito dos problemas
associados com as análises por enzimas de restrição. O grande número de caracteres comparados pode
substancialmente aumentar o poder de resolução. Também pode ser observado o modo da variação de
sequência, como por exemplo se a mudança é transverção ou transição, e o grau de movimento do
nucleotídeo pode ser medido; essas observações podem ser incorporadas nas análises filogenéticas de várias
maneiras. Os resultados de diferentes laboratórios podem ser diretamente comparados, e a publicação de
sequências e sua deposição em databases eletrônicas facilita a confirmação de resultados e suas aplicações
para outros taxa sem a necessidade da obtenção de linhagens ou clones ou repetição de experimentos (Bruns
et al., 1991).
O seqüenciamento direto dos dois maiores RNAs por extensão da "cartilha" tem alargado a
aplicabilidade para os estudos sistemáticos. A deficiência do método é que apenas é obtido a sequência de
um fio de ácido nucléico. Estes resultados possuem uma alta frequência de erros (1-5%) por causa da
ambiguidade que não pode ser resolvida por comparação com o fio oposto (Bruns et al., 1991).
Em contraste com o sequenciamento de RNA, a reação da polimerase em cadeia (PCR) desenvolvida
por Mullis e Faloona (1987) foi seguida por biologistas para sequenciar DNA de muitas espécies em poucos
dias. Muitos métodos são avaliáveis para sequenciamento direto de produtos de PCR. Estes incluem
métodos que geram e sequenciam fios simples ou que diretamente sequenciam fios duplos. A exatidão do
sequenciamento direto de produtos de PCR é melhor do que sequenciamento de RNA por que ambos os fios
podem ser determinados. Uma segunda vantagem é que outras regiões que não as dos genes RNA nucleares
são acessíveis para análise de sequência. Outra importante vantagem do PCR é que apenas minúsculas
quantidades de DNA são necessárias. Como resultado, fungos raros ou parasitas obrigatórios são agora
acessíveis à sistemática molecular (Bruns et al., 1991).
2.3.2. Seleção de Regiões Apropriadas para Sequenciamento
Existem vários fatos para considerar em selecionamento de região para análise sequencial (Bruns et
al., 1991). Incluindo: (a) A região deve ser expandida até um grau apropriado para a comparação de
interesse. Idealmente isso significa que a região deve fornecer diferenças consistentes para separar a taxa em
grupos monofiléticos suportados estatisticamente. Regiões que são muito conservadas forneceriam poucas
chances. Regiões que são muito variadas conteriam muitos caracteres inconsistentes devido a múltiplas
substituições até posições únicas, e o alinhamento seria um problema adicional. (b) A região deve estar
presente idealmente como uma cópia única ou deve pelo menos evoluir como uma região de cópia única
(como por exemplo rRNA, mtDNA). O perigo de regiões multicópias é que diferentes cópias podem ser
comparadas em diferentes espécies. (c) A região deve ter a mesma função em todo o taxa. A evolução de
uma nova função mudaria as pressões seletivas e consequentemente a rota de mudança da sequência.
Praticamente todos os estudos de sequência em fungos tem focado em genes rRNA. Sua
popularidade é causada principalmente pela presença de regiões conservadoras universais que servem como
posições "cartilhas" ideais. Regiões diferenciadas dos genes RNA mitocondrial e ribossômico divergem em
diferentes graus; por esse motivo se alguém quiser conseguir a máxima quantidade de informações de uma
mínima quantidade de sequenciamento a questão de quais regiões são mais apropriadas para um nível
específico de comparações é importante. A situação com o rRNA é complicada pois substituições de bases e
mutações no comprimento fazem alinhamento de algumas regiões ambíguas. Desta forma, como
comparações de maiores distâncias são feitas, o número de nucleotídeos alinhados decresce. Este problema
é muito mais forte em genes mitocondriais; elas não são portanto utilizados para comparações filogenéticas
distantes. Em níveis taxonômicos intermediários, entretanto, os genes mitocondriais podem ter uma alta
proporção de posições variáveis (Bruns et al., 1991).
Genes que codificam proteínas tem algunhas vantagens sobre genes rRNA e o alinhamento das
sequências é menos problemático, entretanto, nenhum primer universal foi desenvolvido para genes de
proteínas de fungos (Bruns et al., 1991).

2.4. CARIOTIPAGEM ELETROFORÉTICA


Recentes avanços em tecnologia de eletroforese em gel tem permitido que moléculas de DNA de
tamanhos megabases sejam eficientemente separadas. Essa técnicas tem sido extensivamente aplicada para a
separação de cromossomos fúngicos (Bruns et al., 1991). Mills e McCluskey (1990) listaram 25 espécies de
fungos cujos cariótipos eletroforéticos foram examinados. O mais surpreendente resultado desse estudo foi a
alta frequência de polimorfismo de comprimento de cromossomos observada dentro das espécies; isto
adiciona uma nova dimensão do quadro emergente do genoma fúngico e elimina o método para estudos
filogenéticos sobre o nível populacional.

3. FUNGOS BASIDIOMICETOS
3.1. CARACTERÍSTICAS
Os Basidiomicetos são assim denominados por apresentarem uma estrutura característica
denominada de basídio. É nessa célula que a cariogamia (fusão nuclear) e a meiose ocorrem, e também onde
os basidiosporos haplóides exógenos são formados. Existe um bom nível de variação na morfologia do
basídio, no número de esporos formados, e como os esporos nascem na superfície do basídio (Ingold, 1991).
Normalmente quatro esporos são produzidos em cada basídio, no apix das protuberâncias basidiais
chamadas esterigmas (Figura 1). Cada esporo usualmente contém um dos produtos meióticos haplóides.

Figura 1. Micrografia eletrônica do Basidiomiceto Coprinus cinereus, mostrando os basídios, alguns com
quatro basidiósporos fixados. (McLaughlin, 1985)
Os membros dos Basidiomicetos são incomuns pelo fato de existirem principalmente em um estado
dicariótico, ou seja, os dois núcleos trazidos juntos no mating não fundem no talo do fungo, eles existem
lado a lado em cada célula. A fusão do núcleo haplóide para formar núcleos diplóides ocorre apenas no
basídio.
Os Basidiomicetos também são caracterizados pela "clamp connection" (Figura 2), que nada mas é
do que um ramo de hifa que se forma em associação com a divisão simultânea dos dois núcleos na célula
apical da hifa dicariótica. Um dos núcleos divide-se no axis da hifa principal, enquanto o outro dividi-se
dentro do "clamp". O ramo cresce e toca a célula próxima ao núcleo inferior, onde haverá migração do
núcleo da ramificação em direção ao núcleo axial. Dois septos são formados através de cada fuso mitótico,
um longitudinal (na origem do ramo) e outro transversal. A célula do apix do sentido contrário da "clamp"
monocariótica funde-se com a célula subapical, restabelecendo a condição dicariótica. Todos os fungos que
produzem "clamp connection" são membros dos Basidiomicetos, entretanto, nem todos os Basidiomicetos
produzem "clamp connections". Essas conecções devem ter se desenvolvido prematuramente na
evolução dos Basidiomicetos, pois elas são encontradas nas mais antigas linhagens divergentes.
Figura 2. Diagrama da formação da clamp connection: A. Hifa dicariótica, a seta demonstra a direção do
crescimento do topo da hifa. B. Crescimento do gancho (clamp) celular, divisão nuclear sincrônica. C.
Conecção formada (Swann, 1987).

Uma das mais fascinantes características dos Basidiomicetos é a produção da explosiva descarga de
esporos denominados balistosporos. Esses esporos podem ser sexuais ou assexuais, podem ser produzidos
pelos basídios, hifas, células de leveduras, ou por outros balistosporos. Este tipo de descarga de esporos
deve ter evoluído precocemente na histótia evolucionária dos Basidiomicetos, pois é encontrada em
membros das mais precoces linhagens divergentes dentro do filo. Sabe-se que o líquido de preenchimento
da gota hilar (Figura 3) está envolvido no mecanismo da descarga de balistosporos, mas a física do
mecanismo permanece desconhecida (McLaughlin et al., 1985; Webster et al., 1984a, b; Yoon and
McLauglin, 1986).

Figura 3. Micrografia eletrônica mostrando a gota hilar na base do basidiosporo do Himenomiceto


Coprinus cinereus (McLaughlin et al., 1985).
Embora não exclusivamente restrito aos Basidiomicota a habilidade para causar mudança de cor no
composto o-dianisidina é característico desse filo (Summerbell, 1985).
3.2. REPRODUÇÃO
A maioria dos Basidiomicetos está capacitada para reprodução sexual e assexual. O número de sexos
(ou mating types) é variável de espécie para espécie. Algumas espécies possuem apenas dois sexos,
enquanto outras podem ter quatro ou mais sexos. Os produtos da reprodução sexual, os basidiosporos,
podem ser fortemente ou passivamente liberados. A reprodução assexual pode consistir da simples
fragmentação do talo, brotamento em espécies leveduriformes, ou produção de vários tipos de esporos
(Alexopoulos et al., 1996).

3.3. CICLO DE VIDA


Os Basidiomicetos podem crescer em uma fase de levedura (célula simples), ou uma fase
filamentosa (hifas) (Bandoni, 1995; Wells, 1994). Muitos Basidiomicetos são capazes de produzir ambas as
fases durante alguma parte do seu ciclo de vida, denominado dimórfico. As leveduras e hifas podem ser
haplóides ou dicarióticas, entretanto leveduras dicarióticas são raras.
Os membros sexuais dos Basidiomicetos iniciam seu ciclo sexual pela fusão entre células haplóides
de "mating types" compatíveis. Este processo é conhecido como somatogamia, uma vez que o talo haplóide
fúngico por ele mesmo desenvolve o papel que células gaméticas especializadas desenvolveriam em planta e
animais. Os esporos assexuais podem algumas vezes agir como agentes de fertilização, fundindo com outras
células de "mating types" compatíveis.
Os dois núcleos da fase dicariótica permanecem separados, formando um núcleo diplóide apenas em
células que se desenvolvem dentro dos basídios. A fusão do núcleo haplóide para formar um diplóide é
denominada cariogamia. O tempo entre a cariogamia e a meiose é altamente variável, e depende largamente
da história de vida do organismo. Algumas espécies sofrem meiose e formam basidiosporos minutos após a
cariogamia, enquanto outras podem invernar antes de ocorrer a meiose. Os basidiosporos podem germinar
para formar a fase haplóide que pode reproduzir indefinidamente de maneira assexual. Alternativamente, o
talo haplóide pode ser capaz de apenas limitar o desenvolvimento, e deve participar na formação do talo
dicariótico para o posterior crescimento ocorrer (Alexopoulos et al., 1996).

Figura 4. Ciclo de vida generalizado do filo Basidiomicota (Swann, 1997).


3.4. CLASSIFICAÇÃO
Os Basidiomicetos são classificados de acordo com a presença ou ausência de basidiocarpo (corpo
de frutificação); natureza do basidiocarpo que pode ser angiocárpica, hemiangiocárpica ou gimnocárpica;
presença de basídios septados ou asseptados; descarga do basidiosporo explosiva ou passiva.

3.5. DISCUSSÃO DE RELACIONAMENTOS FILOGENÉTICOS EM BASIDIOMICETOS


Existem fortes evidências de que o filo Basidiomicota é monofilético. Os complexos aspectos
morfológicos como os balistosporos, basídios, "clamp connections" estão presentes em cada um dos
principais subgrupos, indicando uma origem comum. Alguns Basidiomicotas não possuem uma ou mais
dessas características esteriotípicas, mas evidências ultraestruturais e bioquímicas podem ser usadas para
acessar sua posição filogenética.
O peso da evidência é consistente com a hipótese de que existem três principais grupos de
Basidiomicetos (Urediniomicetos, Ustilaginomicetos e Himenomicetos). A maioria das análises
filogenéticas de sequências do RNA ribossomal indicam que cada grupo é monofilético, e caracteres
bioquímicos e ultraestruturais são concordantes com esses resultados.

3.6. ESTUDOS FILOGENÉTICOS EM BASIDIOMICETOS


Tratamentos taxonômicos de fungos Basidiomicetos, particularmente aqueles relativos a taxa
superiores, têm estado em fluência desde o começo da micologia taxonômica. Fries (1821-1832) agrupou os
fungos baseados em caracteres morfológicos macroscópicos, misturando ascomicetos, Basidiomicetos, e
mixomicetos. Na metade do século 19, com a ascensão de estudos microscópicos, diferenças básicas entre
Basidiomicetes e Ascomicetes foram descobertas. Posteriormente micologistas transferiram a taxonomia a
qual separou Basidiomicetos dos outros fungos, mas essencialmente perseguiram a tradição Friesiana
(Swann e Taylor, 1993).
Patouillard (1900) foi o principal "quebrador" da tradição Friesiana. Patuillard dividiu os
Basidiomicetos em dois grupos baseados nas características microscópicas da morfologia dos basídios e
modo de germinação basidióspora. Os Basidiomicetos heterobasídios, ou heterobasidiomicetos, foram
caracterizados por basidios septados ou asseptados, e/ou a capacidade de dois ou mais do que quatro modos
de germinação do basidiosporo: brotamento, germinação por repetição (esporos secundários), formação da
mitocôndria, e formação do tubo germinal. Os Basidiomicetos homobasídios, ou homobasidiomicetos,
foram caracterizados apenas pelos basídios não septados, e germinação do basidiósporo por tubos
germinativos (Swann e Taylor, 1993).
O conjunto de caracteres da definição de heterobasidiomicetos por Patuillard admitiu grande
plasticidade, e encompassou uma grande quantidade de diversidade evolucionária. Alguns micologistas na
segunda metade do século 20 tornaram-se insatisfeitos com os aspectos das classes de Patuillard por causa
da sua plasticidade e, como resultado, definiram novos taxa superiores (Donk, 1972; Lowy, 1968; Talbord,
1965), enquanto outros continuaram a usar nomes da classe Patuillardiana formalmente (Jülich, 1981) ou
informalmente (Oberwinkler, 1987).
3.6.1. Perspectivas Filogenéticas em Sistemática de Basidiomicetos: Evidência para o gene rRNA 18S
Swann e Taylor (1993) utilizaram sequências de genes do 18S, genes RNA da pequena subunidade
ribossomal para uma representação diversa dos Basidiomicetos no intuito de identificar grupos
monofiléticos de Basidiomicetos e avaliar classificações taxonômicas conflitantes. Com os resultados
obtidos por análise de parcimônia foi construída uma única árvore principal, onde foram utilizados como
grupo de fora os Ascomicetos Neurospora crassa, Eurotium rubrum e Taphrina deformans. Os
Basidiomicetos demonstraram três linhagens principais. A primeira composta pelos fungos parasitas de
plantas (Ustilaginales); a segunda composta pelos Basidiomicetos com septos simples (Urediniomicetos), a
maioria com basidia auricularioide; e a terceira linhagem composta pelos Himenomicetos com septos
complexos.
A sistemática de Basidiomicetos tem uma história de dramáticas mudanças devido a introdução de
novas formas de informação. Baseados na análise do gene rRNA 18S, Swann e Taylor (1995) apresentaram
uma nova classe de nível taxonômico para Basidiomicetos composta por Urediniomicetos (modificado),
Ustilaginomicetos, e Himenomicetos. Outros caracteres como os morfológicos (morfologia dos basídios,
septos, etc) e bioquímicos (composição celular de carboidratos, principal sistema de ubiquinonas), também
foram considerados.
3.6.2. Utilização de Dados Moleculares para Identificação de Espécies Biológicas de Basidiomicetos
Filamentosos
Os Basidiomicetos são caracterizados principalmente pelos aspectos morfológicos, bioquímicos e
ultraestruturais, e apenas alguns grupos apresentam dificuldades taxonômicas. Dentro dos Basidiomicetos
filamentosos, a maioria dos estudos filogenéticos têm sido limitados às formas de cogumelos (‘mushroom"):
agaricus, boletes e seus gasteróides relativos. A maioria dos estudos publicados com agaricus têm sido
focado em espécies biológicas complexas (como por exemplo espécies difíceis de serem separadas
morfologicamente), ou espécies intimamente relacionadas morfologicamente. Em ambos os níveis
problemas de resolução tem sido comuns com as técnicas utilizadas (Bruns et al., 1991).
A técnica de DNA "fingerprinting" tem sido amplamente adotada para diferenciar organismos ao
nível de espécies e subespécies (Maclean et al., 1993). Análises de RFLP têm sido utilizadas com sucesso
para distinguir fungos intimamente relacionados, entretanto, esta técnica consome tempo e requer grande
quantidades de DNA e sondas específicas. Recentemente, Williams et al. (1990) e Welsh e McClelland
(1990) descreveram uma técnica que utiliza uma única espécie de "primers" arbitrários para amplificar
polimorfismos de DNA (RAPD) usando uma reação de polimerase em cadeia modificada. Os padrões
eletroforéticos dos fragmentos gerados por cada "primer" para um isolado pode ser usado como um DNA
"fingerprint" para determinar diversidade. Essa técnica apresenta vantagens como a economia em tempo, o
não requerimento de informação de sequência alvo e pode prover marcadores em regiões genômicas não
acessíveis em análises de RFLP (Williams et al.,1990). Análises RAPD podem ser utilizadas para
identificação de linhagens fúngicas, estudos ecofisiológicos e mapeamento (Williams et al., 1990).
Recentemente, Tommerup et al. (1995) reportaram a ação de alguns componentes na mistura de reação e o
perfil de temperaturas termocíclicas na determinação da reprodutibilidade do RAPD "fingerprint" de três
fungos Basidiomicetos, confirmando a confiança na utilização dessa técnica.

3.6.2.1. Utilização de RAPD para diferenciar grupos interestérieis entre isolados de Heterobasidion
annosum (Garbelloto et al., 1992).
O Basidiomiceto Heterobasidion annosum pertencente a classe dos Himenomicetos é considerado
um patógeno principalmente de árvores coníferas, podendo também ser encontrados em algumas árvores de
madeira dura, em florestas temperada e boreal por todo o hemisfério norte (Hodges, 1969). Ele é
reconhecido como um complexo no qual diferentes espécies biológicas ou grupos que possuem
interesterilidade (IGSs) podem ser distinguidos. Estes grupos exibem uma marcante especialização ao
hospedeiro (Cobb et al., 1989) e diferem em suas características fisiológicas (Karlsson e Stenlid, 1991),
epidemiológicas, e ecológicas.
São três os grupos descritos de H. annosum que apresentam interesterilidade: o grupo P está mais
associado com Pinnus spp., Juniperus spp., e Calocedrus, enquanto o grupo S está associado com Picea
spp., Abies spp., Tsuga spp., e Sequoiadendro. O grupo F está exclusivamente limitado ao Abies alba Mill.
na Itália. A interesterilidade entre os grupos é determinada pela ausência de alelos positivos divididos em
algum dos pelo menos cinco locos de interesterilidade (Chase e Ullrich, 1990). Embora cruzamentos entre
dois diferentes grupos interestéreis não possam ser observados na natureza, a interesterilidade entre grupos
não é completa e a interfertilidade entre pares de laboratórios varia entre 4 a 18% (Stenlid and Karlsson,
1991; Chase et al., 1989; Korhonen, 1978).
A determinação de grupos que possuem interesterilidade pode reduzir perdas causadas por esse
patógeno. Diferentes grupos interestéreis podem ser identificados por testes "mating"; métodos moleculares;
atividade de enzimas pécticas, análises de aloenzimas, e análises de RFLP. Entretanto, essas técnicas
possuem limitações para distinção entre grupos interestéreis e entre as fontes geográficas dentro dos grupos.
O estudo de Garbellotto et al. (1992) descreve o uso de RAPDs para diferenciar IGSs de H. annosum como
sendo um método que oferece rapidez, baixo custo relativo, e extrema sensibilidade de caracterização e
tipagem para linhagens desse fungo.
Garbelotto et al. (1992) utilizaram 23 isolados de H. annosum provenientes da América do Norte e
13 isolados da Europa. Os "primers" de RAPD foram utilizados com sucesso para todos os isolados. O perfil
de RAPD de cada isolado foi correlatado com o grupo interestéril e com a procedência geográfica dos
isolados. O grupo F, o qual, baseado em isoenzimas está intimamente relacionado com o grupo Europeu S,
foi claramente diferenciado de todos os outros grupos interestéreis pelo "primer" ATG (Figura 5).
Os resultados obtidos por Garbelotto et al. (1992) indicaram que as diferenças entre os grupos que
possuem interesterilidade são realmente detectadas por uma vasta lista de "primers". Sobre a questão da
variabilidade dentro de um grupo interestéril, as populações dos grupos norte americanos e europeus P,
pareceram ser facilmente diferenciadas por ambos 15-mers e 10-mers. Em contraste, a variabilidade dentro
do grupo interestéril S foi difícil de detectar, e o 15-mers não detectou polimorfismo entre o grupo S norte
americano e europeu; entretanto, os isolados foram diferenciados pelo "primer" G5. A partir desses
resultados Garbelotto et al. (1992) inferiram que os isolados S da Europa e América do Norte são
geneticamente intimamente relacionados, enquanto que para os isolados do grupo P dos dois continentes
existe um bom grau de divergência genética. Esta interpretação é suportada por estudos de aloenzimas
(Otrosina et al., 1992) no qual foi observado maior divergência entre os isolados europeus e norte
americanos do grupo P do que entre entre os isolados S dos dois continentes.
O poder diagnóstico dessa técnica pode ser utilizado por aqueles que administram florestas pela
capacidade de caracterizar precisamente os grupos interestéreis de isolados coletados de árvores, galhos
submersos, e troncos infectados. A importância dessa caracterização está relacionada com o fato de que os
fungos podem agir como saprófitas generalistas em troncos e muitas espécies de árvores. A especificidade
pelo hospedeiro em grupos interestéreis é altamente correlacionada (Worrall et al., 1983; Cobb et al., 1989;
Otrosina et al., 1992), e então pela determinação de grupos interestéreis isolados de H. annosum que
crescem saprofitamente, torna-se possível uma previsão para espécies de árvores vizinhas, se algumas ou
todas, podem ser infectadas por tais isolados.
Figura 5. Fragmentos RAPD obtidos com o "primer" ATG. 1: B351, isolado do grupo P de H. annosum do
oeste dos Estados Unidos; 2 e 3: isolados do grupo P, CW5 e CW7 do leste dos Estados Unidos; 4 e 5:
isolados P 172-10 e 346-1 da Escandinávia (Europa); 6 e 7: isolados do grupo S B228 e B147 do oeste dos
Estados Unidos; 8 e 9: isolados S da Escandinávia 211-3 e 217-3; 10: isolado S 871104.3.1 da Itália. As
duas primeiras colunas não numeradas são padrões de DNA, o pUC19 cortado pela TaqI e o pUC19 cortado
pela Sau3A, respectivamente. As setas indicam o diagnóstico de seleção das bandas, identificadas como F1-
F3, S1 e S2, P1 e P2, e Eu.P1 (Garbelotto et al., 1992)
A importância do reconhecimento da origem geográfica dos isolados de H. annosum está relacionada
com a possibilidade de se determinar a proveniência de novas linhagens introduzidas. A mesma informação
pode ser muito útil em estudo populacional e epidemiológico visados em investigação da propagação das
linhagens desse patógeno sobre vastas áreas (Garbelotto et al., 1992).

FUNGOS DE INTERESSE INDUSTRIAL

Os fungos influenciam a vida do homem participando de processos desejáveis ou prejudiciais.


Os fungos encontram-se amplamente em todos os ecossistemas e habitats. Podem ser parasitas,
simbiontes, sendo, em sua grande parte, sapróbios.
Crescem onde existe matéria orgânica disponível, viva ou morta, geralmente apreciando calor e umidade.
Água, solo, troncos, folhas, frutos, sementes, excrementos, insetos, alimentos frescos e processados, têxteis
e inúmeros outros produtos fabricados pelo homem constituem substratos para o desenvolvimento de
fungos.
O reino Fungi está dividido em Mixomycota (fungos limosos ou gelatinosos) e Eumycota (fungos
verdadeiros).
Os fungos verdadeiros ou Eumycota foram divididos em 4 subdivisões:
1. - Mastigomycotina (4 classes) - fungos inferiores
2. - Zygomycotina (2 classes) - fungos inferiores
3. - Ascomycotina (6 classes) - fungos superiores
4. - Basidiomycotina (3 classes) - fungos superiores
5. - Deuteromycotina (3 classes) - fungos imperfeitos

1 – Mastigomycotina
Inclui muitos fungos parasitas obrigatórios que causam sérias doenças em plantas, e fungos
aquáticos. Normalmente, associados com matéria orgânica em decomposição.

2 - Zygomycotina
• Destacam-se os gêneros Rhizopus e Mucor .
• Rhizopus, Mucor: Produção de enzimas amilolíticas (amilases e glucoamilases) para a produção de
alimentos.
• Rhizopus: Produção de enzimas pécticas empregadas na clarificação de sucos de frutas.
• Desde 1950, esse gênero tem sido empregado na indústria farmacêutica para introduzir grupos OH
em córtico-esteróides para a produção de preparações contendo corticóides.
• Rhizomucor miehei e Rhizomucor pusillus: produzem a enzima protease rennet, usada na produção
de queijos.
• Rhizopus stolonifer: responsável pôr doenças em frutas durante o armazenamento e transporte,
provocando o amolecimento de batatas, morangos, framboesas, pêssegos, etc.
3 - Ascomycotina
• *Gênero Aspergillus:
o A . niger: Produção de ácido cítrico; ácido glucônico;

o - Produção de enzimas.

• *Gênero Penicillium: (fungo azul-verde)


o - Manufatura de queijos;

o - Produção de antibióticos;

o - Parasita de plantas;

o - Produção de enzimas.

• *Gênero Neurospora: (bolor vermelho do pão)


o - Produz contaminações em padarias, causando perdas econômicas.
4 - Basidiomycotina
• Formadores de cogumelos (Agaricus campestris, Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus etc).
• Parasitam e destroem material lignocelulósico.
Características Fisiológicas
• - Faixa de temperatura de crescimento: 0 - 35oC
• - Temperatura ótima: 20 - 30oC
• - Faixa de pH de crescimento: 2,0 - 8,5
• - pH ótimo: 4,5 - 5,5
- Necessidades hídricas:
• - Bolores < Leveduras < Bactérias
• - Aw (atividade de água) menor que 0,70 inibe o crescimento da maioria dos bolores que causam a
deterioração de alimentos.
• - Aw = estima a proporção de água disponível no sistema para reações bilológicas, bioquímicas e
químicas.

Organismo Aw mínimo para crescimento

Bactérias 0.91

Leveduras 0.88

Bolores 0.80

6. Os Fungos na Biotecnologia

Muitas espécies de fungos tem sido testadas e utilizadas para a produção de substâncias de interesse
industrial ou médico:
• O etanol, ácido cítrico, ácido glucônico, aminoácidos, vitaminas, nucleotídeos e polissacarídeos são
exemplos de metabólitos primários produzidos por fungos, enquanto que os antibióticos constituem
importantes metabólitos secundários.
Além da aplicação em indústrias de fermentação, novos aspectos biotecnológicos têm sido explorados,
inclusive de caráter ambiental, ou seja, os fungos podem atuar como agentes benéficos à melhoria do meio
ambiente:
• - Tratamento de resíduos líquidos e biorremediação de solos poluídos;
• - Mineralogia e biohidrometalurgia;
• - Produção de biomassa, incluindo proteína comestível;
• - Tecnologia de combustíveis, particularmente na solubilização de carvão;
• - Emprego em controle biológico

7. Leveduras
• As leveduras, são fungos como os bolores, mas se diferenciam deles por se apresentarem
predominantemente sob forma unicelular. Por serem células mais simples, elas crescem e se
reproduzem mais rapidamente do que os bolores.
• Uma levedura típica consta de células ovais, que se multiplicam assexuadamente comumente por
brotamento ou gemulação.
• A maioria das leveduras, não vive no solo mas adaptou-se a ambientes com alto teor de açúcares, tal
como néctar das flôres e a superfície de frutas.
• As leveduras fermentativas vêm sendo exploradas pelo homem há milhares de anos, na produção de
cerveja e do vinho e na fermentação do pão, embora, somente no século dezenove tenha sido
reconhecida a natureza biológica dos agentes responsáveis por estes processos.
• As leveduras são classificadas em todas as três classes de fungos superiores: ascomicetos,
basidiomicetos e fungos imperfeitos.
• O principal agente da fermentação alcoólica, Saccharomyces cerevisae, é uma levedura
ascomicética.

7.1. Utilização de Compostos de Carbono


A habilidade para fermentar açúcares varia entre os vários gêneros de leveduras.
• - Fermentação vigorosa da glicose: Saccharomyces, Kluyveromyces, etc.
• - Gêneros não fermentativos: Lipomyces
• - Gênero Hansenula: espécies fermentativas e não fermentativas

7.2. Assimilação de Fontes de Carbono (Aerobiose)


• Ocorre diferenças entre as espécies: pentose (xilose, amido, alcóois (manitol, sorbitol), ácidos
orgânicos (ácido acético, lático, cítrico).

7.3. Leveduras de Interesse em Alimentos


1. Top yeast: leveduras de superfície
2. Botton yeast: leveduras de profundidade

S. cerevisae, S. calrsbergensis botton yeast, após o crescimento e fermentação precipitam. Usadas na


panificação, cerveja, vinhos, etc
S. fragilis, S. lactis fermentam lactose (tratamento de resíduos)
S. roufii, S. mellis osmofílicas - frutas secas, xaropes, geléias
S. baillie fermentação de sucos (cítricos)
Torulopsis osmofílica - leite condensado
Candida produz grande quantidade de proteínas, ataca leite e derivados
Rodutorula deterioração de pickles, chucrutes e carnes (cor vermelha ou amarelo
Picchia, Hansenula, Debarymocyces, Thricosporum deterioração de pickles com produção de película,
oxida o ácido acético e altera o sabor
Debaryomyces carnes, queijo e salsichas

TÉCNICAS DE COLETA E MANUTENÇÃO DE LÍQUENS E FUNGOS

1. INTRODUÇÃO
A classificação dos grandes grupos de fungos tem sido baseada no tipo e complexidade da
morfologia, nas características das estruturas de reprodução e no padrão de comportamento exibido nos
processos sexuais.
Inúmeros botânicos e, seguramente, poucos micologistas podem, ainda hoje, admitir os fungos como
plantas. Por revelarem estruturas específicas, exibirem comportamento diferenciado e serem incapazes de
realizar a fotossíntese, os fungos tornam-se organismos distintos dos demais seres vivos.
A situação dos líquens é mais complexa, uma vez que constituem produto da associação simbiôntica
entre fungo e alga. Além de revelarem característica metabólica e, de certa forma, estrutura própria, os
integrantes liquênicos mantêm sua individualidade biológica.
Como organismo heterotrófico, todo fungo depende, direta ou indiretamente, de outro ser vivo, para
sua alimentação. A condição sapróbia é bastante evidente quando o fungo é encontrado sobre troncos,
ramos, folhas, restos ou partes de vegetais ou animais mortos. O predatismo leva ao abate sumário do
hospedeiro, enquanto o parasitismo é o tipo de associação em que o fungo provoca série gradativa de danos
ao hospedeiro que, eventualmente, podem provocar sua morte. Entre os fungos, o parasitismo pode ser
facultativo ou obrigatório.
Nos casos de fungos sapróbios e parasitas, a atenção ao complexo fungo-substrato é de grande valia
nas iniciativas de coleta. É oportuno chamar a atenção para a ocorrência de fungos com desenvolvimento
intramatrical, cujo ciclo se passa inteiramente no interior do hospedeiro e o extramatrical, que se desenrola
em seu exterior.
E como se tudo isso não bastasse, há determinadas estruturas, como esporos e suas variações
morfológicas e funcionais, que efetivamente não exibem qualquer manifestação de relacionamento físico e
biológico ao substrato orgânico, até o momento em que iniciam o processo de germinação.
As estruturas mais visíveis de um fungo não representam, necessariamente, todas as suas partes, nem
tudo o que constitui o ciclo do organismo coletado. Grande parte do seu ciclo ou dos remanescentes
estruturais poderá estar sendo perdida no interior do substrato ou, simplesmente, já ocorreu em outro lapso
de tempo, em outro hospedeiro, ou em partes distintas do mesmo substrato.
Resultado: o que se coleta de um fungo constitui, em geral, um momento, no ciclo biológico da
espécie.
As condições ideais para o estudo e compreensão dos fungos reside no isolamento de organismos, a
partir de diferentes substratos e nos diversos ambientes em que os fungos ocorrem: ar, água e solo.
As partes mais evidentes, nos fungos, constituem, como regra geral, o que mais resiste ao manuseio e
ao tratamento que leva à constituição da amostra do material (a exsicata) a ser incorporado ao herbário. Os
espécimes podem ser preservados pela simples secagem; em meios líquidos, o picles; em lâminas, para
exame ao microscópio, sob forma desidratada e liofilizada; em nitrogênio líquido, e por outros processos.

2. Coleta e Manutenção de Fungos e Líquens macroscópicos


Existe uma variação muito grande de fungos e líquens macroscópicos. Para coleta, preservação e
herborização levam-se, especialmente, em consideração, o tamanho e a consistência. Alguns, após coleta,
decompõem-se rapidamente, tornando-se impossível reconhecê-los.
Líquens ocorrem tanto sobre madeira como sobre rochas e folhas vivas. Quando sobre pedra, é
necessário equipamento especial, como martelo e talhadeira usados pelos geólogos.
São relalcionados materiais considerados ideais embora, algumas vezes, dispensáveis ou
substituíveis.
Em qualquer caso, cuidado e bom senso são essenciais para uma coleta adequada.
2.1 Coleta
A) Materiais
• carta de cores
• cristalizador
• espátula
• folha de papel com uma das metades branca e outra preta, para coleta de esporos
• frasco de vidro com tampa de plástico (±200ml)
• frasco de vidro escuro com fixador: FAA+sulfato de cobre ou FAA ou álcool a 5%
• instrumento com pé-de-cabra, machadinha e martelo, conjugados
• martelo e talhadeira (para o caso específico de coleta de material sobre rocha)
• papel de filtro ou algodão

B) Métodos
• Coletar preferencialmente pela manhã para dispor do resto do dia para o preparo e secagem do
material mas, não muito cedo, pois o orvalho deixa o material muito molhado e fácil de embolorar.
• Retirar, com faca ou espátula, o material por inteiro com cuidado, afofando em volta do substrato,
evitando quebra ou esfarelamento. Trazer junto parte do substrato.
• Não misturar materiais diferentes num mesmo saco para evitar mistura de esporos.
• Procurar coletar amostra significativa com espécimes em diferentes estágios de desenvolvimento, ou
mesmo formas teratológicas ou doentes e assegurar-se, sempre que possível, da presença de partes
férteis. A quantidade de material coletado deverá prever as atividades de intercâmbio da instituição.
Deve-se coletar, sempre que possível, um número mínimo de cinco duplicatas. A coleta de material
fica limitada às condiões de transporte.
• Acomodar com cuidado e convenientemente o material coletado dentro da cesta ou sacola. Proteger
com folhas de jornal. Quando muito grande embrulha-se em jornal amarrando com barbante.
Quando muito pequenos e frágeis (mixomicetos), fixa-se o material com cola plástica no fundo de
uma caixa de fósforo.
• No caso de fungos e líquens de textura crostosa procurar sobre o solo e outros substratos, como
também em qualquer superfície voltada para o solo.
• Na coleta de fungos de textura carnosa ou macia (delicada) é aconselhável fotografar ou desenhar o
material no local, assim como anotar suas cores, utilizando para tanto uma carta de cores, pois
podem mudar muito de aspecto depois de secos. Em seguida, colocar em saco de papel ou plástico
acompanhado de pedaços de folhas verdes para preservar umidade.
• Tão cedo quanto possível, separar os píleos (Fig. 6) para coleta de esporos (excluídos gasteromicetos
cujos esporos se acumulam no interior e em seguida: a) separar o estipe do píleo; b) colocar o píleo
sobre o meio da folha de coleta de esporos com as lamelas, dentes, poros ou a parte fértil, voltadas
para o papel; metade deve ficar sobre a parte branca e metade sobre a parte negra; c) colocar em
câmara úmida (recipiente coberto - cristalizador - contendo em seu interior papel de filtro ou algodão
para manter a umidade); d) aguardar 12 horas; e, retirar o fungo, dobrar as folhas, secá-las e guardar
no mesmo saco de coleta. Os esporos serão utilizados para identificação da espécie.
• Para fungos deliqüescentes, como por exemplo Coprinus , é melhor trazer em saco aberto para
diminuir a autodigestão ou colocar diretamente em frasco contendo fixador.

2.2. Preservação
A) Materiais
• bisturi ou lâmina de barbear
• caixa de fósforo ou papelão
• cola plástica
• estufa (na falta, seca-se ao sol ou próximo a uma lâmpada)
• fixador
• jornal
• placa-de-petri com meio de cultura (preferencialmente, extrato de malte ou BDA
• prensa
• tampão de gaze e algodão para os tubos de ensaio
• tubo de ensaio com meio de cultura
B) Métodos
Para preservação de material seco em herbário, coletar cuidadosamente com a espátula o material de
interesse, se possível com parte do substrato. No caso de fungos de aspecto pulverulento, acondicionar os
diferentes espécimes em caixas de fósforo ou papelão, de acordo com a conveniência e dimensões do
material.
Como geralmente os fungos pulverulentos são frágeis, liberando com facilidade grande quantidade de
esporos, sugere-se, no momento da coleta, fixar o material nas caixas, com o auxílio de cola plástica. Esta é
mais indicada, por ser menos susceptível ao ataque por outros fungos e insetos e por secar rapidamente.
No caso de fungos crustosos a secagem pode se processar ao sol ou em estufa por cerca de 24 horas a uma
temperatura de aproximadamente 40ºC.
Os demais fungos são secados ao sol, ou em estufa, no próprio saco de coleta, à temperatura entre 50-60ºC.
No caso de material carnoso muito espesso ou quando conveniente, cortar em fatias, dispor sobre cartolina,
envolver com diversas camadas de jornal, prensar e secar.
Quando um material, após a secagem, se torna muito rígido e quebradiço, recomenda-se deixá-lo absorver a
umidade do ar por 24 horas antes de guardá-lo.
Para preservação em meio líquido coloca-se o material em frasco com fixador. Isso pode ser feito no
momento da coleta ou depois.
Outros tipos de preservação são a liofilização (ONIONS, 1971) e preservação em meio de cultura por
inoculação de esporos ou por pedaços do corpo frutífero.

2.3. Herborização
A) Materiais
• Caixa de papelão (tamanhos diversos - são mais usadas as caixas de 10 x 12 x 5cm, 10 x 12 x 15cm,
14 x 22 x 15cm, respectivamente, de largura, comprimento e altura).

3. Organização do herbário
Herbário é uma coleção de plantas mortas, secas e montadas de forma especial, destinadas a servir
como documentação para vários fins. O herbário é utilizado nos estudos de identificação de material
desconhecido, pela comparação pura e simples com outros espécimes da coleção herborizada; no
levantamento da flora de uma determinada área; na reconstituição do clima de uma região; na avaliação da
ação devastadora do homem ou da ação deletéria da poluição; na reconstituição do caminho seguido por um
botânico coletor, etc. Muito é possível conseguir-se pelo simples manusear de exsicatas de um herbário.
Um herbário é também o centro de treinamento e capacitação de pessoal especializado em taxinomia
vegetal. A metodologia proposta no presente trabalho é a adotada no Herbário do Estado "Maria Eneyda P.
Kauffmann Fidalgo", do Instituto de Botânica de São Paulo.

3.1. Montagem
A) Materiais
• agulha
• cartolina branca - fls. 42 x 28cm
• cola tipo Cascolar hidrossolúvel
• linha branca
• rótulo em cartolina branca de 12,5 x 8cm
B) Métodos
Na medida das possibilidades, todo material deve ser montado para permitir mais fácil estudo e
manuseio. Para tanto, recomenda-se que a planta seja costurada com pontos, com agulha e linha, em
pedaços de cartolina branca de boa textura cortados em tamanho padrão de aproximadamente 42 x 28cm, ou
colada com cola tipo Cascolar, solúvel em água, sobre a folha de cartolina. A primeira forma permite um
manuseio mais seguro do material, pois retirá-lo da cartolina torna-se tarefa relativamente fácil e oferece
menor risco de dano para o material do que quando colado. Esta diferença é especialmente significativa com
materiais delicados.
Cola-se o rótulo do material em toda sua extensão, de preferência no canto inferior direito da
cartolina de montagem. No canto superior esquerdo, diametralmente oposto, deve-se afixar um pequeno
envelope para conter as partes eventualmente despencadas do material, tanto caídas durante o processo de
secagem da estufa, como daquelas necessariamente retiradas para o estudo do vegetal. Os demais rótulos,
principalmente os de anotações dos especialistas, devem ser colados conforme alguma ordem pré-
estabelecida e próximos aos rótulos originais.

3.2. Preservação
A) Materiais
• armário de aço de 198 x 100 x 50cm
• caixa de madeira ou lata especial de 45 x 28 x 30cm
• estufa
• formalina (formol à 40%)
• naftalina em bola ou cânfora cristalizada
• paradiclorobenzeno
• saco de pano de algodão cru

B) Métodos
As exsicatas, após serem montadas na cartolina, são guardadas em recipientes secos e fechados, tais
como, caixa de madeira, lata especial ou armário de madeira ou de aço especialmente desenhado e
construído ou adaptado para tal fim, a fim de evitar umidade e acesso a insetos.
Para a profilaxia dos insetos de modo geral, coloca-se naftalina em bolas ou cânforas cristalizadas
em contato com os espécimes montados. Sempre que possível, usa-se, preferencialmente, em substituição,
mistura de naftalina triturada com paradiclorobenzeno em partes iguais. Para evitar que o material
profilatizante entre em contacto direto com as exsicatas de herbário, costuma-se guardá-lo em pequenos
sacos costurados de pano de algodão cru alvejado. O contato direto pode provocar a cristalização do
material químico sobre as exsicatas e prejudicá-las em maior ou menor extensão.
Mais recentemente, em alguns herbários, as exsicatas recebem apenas o tratamento térmico, isto é, as
plantas são colocadas a uma temperatura determianda, 50-80ºC, variável conforme o tipo de material, por
cera de 3-4 horas, eliminando, assim, os insetos e suas larvas, bem como a umidade. Obviamente, o tempo
acima é médio, pois material muito delicado necessita um tempo sensivelmente menor de exposião térmica,
bem como, plantas suculentas ou mais espessas demandam maior tempo de secagem. Na prática, o tempo de
secagem é determinado pelo acompanhamento periódico do material na estufa, o que deve ser
providenciado pelo próprio especialista. Somente este é capaz de indentificar o melhor tempo de secagem
para o seu material, através de exames sucessivos e periódicos dos espécimes na estufa.
Em muitos casos, usa-se pincelar o material a ser secado com uma solução à 10% de formalina
(formol a 40%), antes de colocá-lo na estufa.

3.3. Organização
A) Materiais
• caixa de papelão em tamanhos diversos
• cartolina dobrada para o tamanho 42 x 28cm, em cores diversas branca, rosa, marron, havana, verde,
preta, azul, amarela e vermelha)
• ficha em cartolina branca de 12,5 x 8cm
• frasco com tampa de plástico papel Kraft em folhas dobradas para o tamanho de 42 x 28cm

B) Métodos
Embora existam maneiras diversas de organizar um herbário, recomenda-se pelo menos até o nível
de ordem a adoção de um sistema de classificação. Para melhor orientação sugerem-se os seguintes
sistemas:
ALGAS: Cyanophyceae, Rhodophyceae, Chlorophyceae, Euglenophyceae, Chloromonadophyceae,
Charophyceae, Dinophyceae, Xantophyceae, Chrysophyceae, Crytophyceae, Bacillariophyceae e
Phaeophyceae.
Sistemas recomendados: SMITH (1950) e para as Chloromonadophyceae, PRESCOTT (1969).
FUNGOS: Plasmodiophoromycetes, Myxomycetes, Acrasiomycetes,
Labyrinthulomycetes,Chytridiomycetes,Oomycetes,Trichomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes,
Basidiomycetes e Deuteromycetes.
Sistema recomendado: ALEXOPOULOS (1962).
LÍQUENS: Ascolichenes e Hymenolichenes.
Sistema recomendado: HALE (1961).
BRIÓFITAS: Hepaticopsida, Anthocerotopsida e Bryopsida.
Sistema recomendado: PARIHAR (1972).
PTERIDÓFITAS: Psilophytinae, Lycopodinae, Psilotinae, Articulatae, Filicinae.
Sistema recomendado: VERDOORN (1967).
GIMNOSPERMAS: Cycadae, Coniferae, Chlamydospermae.
Sistema recomendado: CRONQUIST (1968).
ANGIOSPERMAS: sistema recomendado: CRONQUIST (1968).
Sob seus respectivos táxons, famílias, gêneros e espécies são distribuídos por ordem alfabética. A
identificação da origem dos espécimes é feita pela cor da sobrecapa na seguinte conformidade:
• Brasil - branca ou papel Kraft;
• Canadá e EUA - rosa;
• do México ao Paraguai - marron;
• Chile, Argentina e Uruguai - havana;
• Europa - verde;
• África - preta;
• Ásia - amarela;
• Oceania - azul.
A sobrecapa de cor vermelha é usada exclusivamente para identificar os espécimes-tipo, independente
de sua origem geográfica. Espécimes-tipo são organizados em armários separados, acompanhando o mesmo
sistema.
Conforme a necessidade, espécimes podem ainda ser guardados em caixas ou em líquidos preservativos.
Para cada exsicata em caixa ou em líquido, deve ser montada uma folha de cartolina, com rótulos e dados, a
ser guardada no lugar devido na coleção geral, contendo a anotação: espécime em caixa ou espécime em
vidro.
Rótulos e fichas devem conter: nome da instituição, da cidade, do país, sigla do herbário conforme
registrada no Index Herbarium, nome da família, nome científico da espécie, nome do determinador e data
da determinação, procedência, nome e número do coletor e data da coleta.