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Dosagem de proteínas no leite pelo método de Lowry

Ouro Branco
Novembro/2010
Resumo
O experimento teve como objetivo aplicar o método de Lowry a um material
biológico, no caso, soro de leite, para dosagem de proteínas totais. Para que o objetivo
fosse atingido foram realizados alguns cálculos em conjunto com os resultados
experimentais. Os resultados obtidos estão um pouco fora dos valores esperados, mas
pode ter sido causado por algum sistemático durante o experimento.
Introdução
As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes nas
células, uma vez que são fundamentais sob todos os aspectos da estrutura e função
celulares. Existem muitas espécies diferentes de proteínas, cada uma especializada para
uma função biológica diversa. Além disso, a maior parte da informação genética é
expressa pelas proteínas. Pertencem à classe dos peptídeos, pois são formadas por
aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas [1].
As proteínas do soro do leite, também conhecidas como whey protein, são
extraídas durante o processo de fabricação do queijo. Possuem alto valor nutricional,
contendo alto teor de aminoácidos essenciais, especialmente os de cadeia ramificada.
Também apresentam alto teor de cálcio e de peptídeos bioativos do soro [2].
A Tabela 1 apresenta o teor de proteínas em alguns alimentos de origem animal
[3].

Tabela 1 – Teor de proteínas em alimentos de origem animal


Alimento Proteínas (%)
Leite integral 3,5
Carne assada 25
Ovo integral 13

As frações, ou peptídeos do soro, são constituídos de: beta-lactoglobulina


(BLG), alfa-lactoalbumina (ALA), albumina do soro bovino (BSA), imunoglobulinas
(Ig‘s) e glicomacropeptídeos (GMP). Essas frações podem variar em tamanho, peso
molecular e função, fornecendo às proteínas do soro características especiais[2].
A BLG é o maior peptídeo do soro (45,0%-57,0%), representando, no leite
bovino, cerca de 3,2 g/L. Em termos quantitativos, a ALA é o segundo peptídeo do soro
(15%-25%) do leite bovino e o principal do leite humano. A BSA corresponde a cerca
de 10% das proteínas do soro do leite [2]. A caseína constitui de 76 a 86% da proteína
presente no leite [3].
O uso da espectofometria para determinação de proteínas totais em amostras
vem sendo utilizado em diversas áreas de pesquisa, desde indústrias de alimentos a
laboratórios de análises clínicas [4].
Dentre os métodos espectofométricos, existe o método de Lowry, que baseia-se
numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico (reagente Folin
Ciocalteau), que sofre uma redução quando reage com proteínas na presença do
catalisador cobre (II), e produz um composto com absorção máxima em 750 nm [5].
A principal vantagem do método de Lowry é a sua alta sensibilidade e, por isso,
tem sido utilizado para a determinação da concentração de proteínas totais em diversos
meios, sendo eles: plasma sanguíneo, saliva humana, tecido animal, plantas, suco biliar,
membranas, leite humano e produtos alimentícios. Além da alta sensibilidade e
exatidão, há também menor consumo da amostra. No entanto, esse método também
possui algumas desvantagens, como estar sujeito a muitos interferentes, apresentar
longo tempo de análise e possuir absortividade específica altamente variável para
diferentes proteínas [5].
O reagente de Folin- Ciocalteau sofre redução ao reagir com proteínas,
propiciando uma coloração azulada à solução. Quanto mais intensa essa coloração,
maior é a concentração de proteínas na amostra [6].
O experimento teve como objetivo aplicar o método de Lowry a um material
biológico, no caso, soro de leite, para dosagem de proteínas totais.

Materiais e métodos
Para a realização do experimento, primeiramente foram preparadas seis soluções
de BSA de 0,2 mL cada uma com concentrações diferentes. Adicionou-se a cada
solução um reagente E e o reagente de Folin – Ciocalteau.Em seguida, fez-se a leitura
de absorbância nas seis soluções de BSA e anotou-e os resultados que estão
representados na Tabela 2.
Foram preparadas também duas amostras. Para a amostra 1, mediu-se 5 mL de
leite e adicionou-se 30 mL de H2O em um béquer de 100 mL. Em seguida, acrescentou-
se ácido clorídrico 5M com uma pipeta de 2 mL até ocorrer a coagulação do leite.
Anotou-se o volume de ácido gasto. Filtrou-se a solução. O material retido no papel de
filtro foi descartado, o filtrado foi utilizado no experimento como amostra 1.
Para a amostra 2 diluiu-se o leite em 1/80 com H2O destilada ( 1 mL de leite +
79 mL de H2O).
Enumerou-se três tubos de ensaio em duplicata e preparou-se as soluções de
acordo com o volume estabelecido na Tabela 1.

Tabela 1 - Volumes gastos de cada amostra para preparo da solução.


Soluções Tubos
Branco 1 2
H2O 0,2 mL ---- ----
Amostra 1 ---- 0,2 mL ----
Amostra 2 ---- ---- 0,2 mL
Reagente E 2mL 2mL 2mL
Agitou-se os tubos e deixou-se em repouso por 15 min.
Reativo de Folin- Ciocalteau 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL
Agitou-se os tubos e deixou-se em repouso por 30 minutos no escuro (dentro de um
armário).
Em seguida, ligou-se o espectofotômetro e zerou-se o equipamento com o tubo
branco (água destilada). Fez-se as leituras dos padrões e das amostras n o aparelho a 750
nm. Anotou- se as leituras de absorbâncias.

Resultados e discussão
O primeiro passo para calcular a concentração de proteínas totais no soro do leite
foi construir a curva padrão de BSA (concentração de BSA versus absorbância).
A Tabela 3 mostra o volume que foi gasto de solução de BSA e de água
destilada na preparação dos seis tubos de ensaio, a absorbância e a concentração em
cada tubo.

Tabela 3 – Volume gasto de solução de BSA e de H2O para o preparo dos tubos, absorbância e
concentração das soluções.
Tubo Volume de solução Volume de H2O Absorbância a

padrão de BSA (2mg/mL) µL 750 nm (duplicata)

µL
1 0 200 0
2 40 160 0,187 / 0,190
3 80 120 0,323 / 0,326
4 120 80 0,430 / 0,442
5 160 40 0,536 / 0,547
6 200 0 0,623 / 0,630

No tubo 1, colocou-se apenas água destilada, sendo este utilizado como o


branco. A concentraçao de BSA em água destilada foi 0 mg/mL.
Para o cálculo da concentração de BSA no tubo 2, primeiramente achou-se a
massa de BSA presente em solução a partir de uma regra de três simples:
2 mg--------------------1000 μL
x (mg)----------------- 40 μL
x = 0,08 mg
A concentração em mg/mL é dada por:
C2 = massa (mg)volume da solução (mL)
Assim,
C2 = 0,080,2
C2 = 0,4 mg/mL
Para calcular a concentração de BSA nos outros tubos utilizou-se o mesmo
procedimento. Os valores obtidos foram:
C3 = 0,8 mg / mL
C4 = 1,2 mg/mL
C5 =1,6 mg/mL
C6 = 2,0 mg/mL

Com esses valores foi construiu-se a curva padrão da proteína BSA, que está
mostrada na Figura 1.

Figura 1 - Curva padrão da proteína BSA.

A partir da regressão linear obteve-se a equação da reta e o valor do coeficiente


de regressão linear (R2):
R2 = 0,980
y = 0,307x + 0,045

O valor obtido para o R2 mostra que o ajuste feito foi bom.


A Tabela 4 mostra os valores de absorbância obtidos nas duplicatas das amostras
1 e 2.
Tabela 4 – Valores de absorbância obtidos nas duplicatas.
Amostras Absorbância 1 (Å) Absorbância 2 (Å) Média das absorbâncias (Å)
Branco 0 0 0
1 0,406 0,465 0,4355
2 0,315 0,318 0,3165

A partir das médias de absorbância obtidas foi possível estimar a concentração


nas amostras 1 e 2.

Amostra 1
A concentração de proteínas na amostra 1 foi calculada a partir da
equação da reta da curva padrão de BSA. Portanto, de forma a obter a concentração,
empregou-se:
x=y-ba mg/mL
x=0,4355-0,0450,307 mg/mL
x=1,272 mg/mL

Por se tratar de uma amostra diluída foi preciso encontrar o fator de diluição, que
é dado por:
Fator de diluição = volume totalvolume inicial

O volume total é dado por:


Volume total = volume de leite + volume da água + volume de HCl adicionado
Volume total = (5 + 30 + 4)mL
Volume total = 39 mL
Fator de diluição = 39/5
Fator de diluição = 7,8

Com o fator de diluição encontrou-se a concentração de proteínas do soro:

Concentração de proteínas do soro = (concentração da amostra) x (fator de diluição)


Concentração de proteínas do soro = (1,272 mg/mL) x (7,8)
Concentração de proteínas do soro = 9,922 mg/mL = 9,922 g/L

Amostra 2
A concentração de proteínas na amostra 2 foi calculada a partir da
equação da reta da curva padrão de BSA. Portanto, de forma a obter a concentração,
empregou-se:
x=y-ba mg/mL
x=0,3165-0,0450,307 mg/mL
x = 0,884 mg/mL= 0,884 g/L

Por se tratar de uma amostra diluída foi preciso encontrar o fator de diluição, que
é dado por:
Fator de diluição = volume totalvolume inicial
O volume total é dado por:

Volume total = volume de leite + volume da água


Volume total = (1 + 79) mL
Volume total = 80 mL
Fator de diluição = 80/1
Fator de diluição = 80

Com o fator de diluição encontrou-se a concentração total de proteínas do leite:


Concentração de total de proteínas do leite = (concentração da amostra) x (fator de
diluição)
Concentração total de proteínas do leite = (0,884 mg/mL) x (80)
Concentração total de proteínas do leite = 70,72 mg/mL

Para calcular a concentração de caseína utilizamos a seguinte relação:


[Caseína] = [proteína] total no leite – 0,9 x [proteína] soro
[Caseína] = 70,72 mg/mL – 0,9 x 9,922 mg/mL
[Caseína] = 61,79 mg/mL= 61,79 g/L

Em porcentagem, o valor é dado por uma regra de três simples:


70,72 g proteínas totais do leite-------------------------100%
61,79 g de caseína ----------------------------x
x = 87%
A porcentagem de proteínas no leite foi obtida por uma regra de três
simples:
70,72 g --------------------1000 mL
x g ---------------------------100 mL
x = 7,072% (p/v)
A porcentagem de proteínas totais e de caseína no leite encontradas estão acima
dos valores esperados. Essa diferença é devida ao valor da concentração da proteína
BSA na amostra utilizada para fazer a curva de calibração. O valor real seria de 1
mg/mL e o valor fornecido foi de 2 mg/mL. Isso levou a alteração em todos os
resultados.
Referências bibliográficas

[1]http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microor
g/proteinas.htm, acessado em 28/10/2010.

[2]http://www.scielo.br/pdf/rn/v19n4/a07v19n4.pdf, acessado em 28/10/2010.

[3] http://www.rehagro.com.br/siterehagro/publicacao.do?cdnoticia=471, acessado em


02/11/2010.

[4]http://www.molecularstation.com/pt/protein/lowry-protein-assay, acessado em
29/10/2010.

[5]http://www.moodle.ufba.br/mod/forum/discuss.php?d=23032, acessado em
29/10/2010.

[6] http://www.cnpab.embrapa.br/publicacoes/download/cot095.pdf, acessado em


29/10/2010.