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Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP

Instituto de Química - IQ

Disciplina: Química Analítica III – QA316 (Turma A)


Módulo 1 – Técnicas Cromatográficas

Relatório I

Técnicas Cromatográficas

Cromatografia em Coluna (E1)


Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – HPLC (E2)
Cromatografia Gasosa – CG (E3)

Grupo 03: Juliana Otávia Bahu R.A.: 102900


Lanna Claudia Dias da Silva R.A.: 083739
Luana M. C. Righetti R.A.: 103110
Lucila Andrade R.A.: 086370

Campinas, março de 2011.


Introdução
A cromatografia é um método físico-químico de separação no qual os
componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma que
permanece estacionária (Fase Estacionária – FE) e outra que se movimenta
sobre ela em uma direção definida (Fase Móvel – FM). [1] Os componentes são
distribuídos pelas duas fases de tal forma que cada um deles é seletivamente
retido pela FE, o que resulta em migrações diferenciais dos mesmos.
A técnica pode ser definida de acordo com a forma física do sistema; a
FE pode ser disposta sobre uma placa ou acondicionada em um tubo cilíndrico
sendo classificadas, respectivamente, como Cromatografia Planar e
Cromatografia de Coluna. Esta última pode ser subdivida de acordo com o
tamanho do diâmetro interno do tubo, sendo denominadas colunas preparativas
(6-50 mm), analíticas (2-6mm), microdiâmetros (1-2mm) e capilares (< 1mm). As
colunas preparativas e analíticas sempre apresentam a FE na forma de
partículas que atuam na separação dos analitos (a fase ativa da separação é um
sólido), que serve de suporte mecânico para um líquido (a fase ativa da
separação é um líquido), que apenas recobre a superfície do sólido ou esta
quimicamente ligado a ele. Colunas em microdiâmetro e capilares também
podem ser recheadas com FE sólida, ou possuir apenas um filme, líquido ou
sólido, que recobre as paredes capilares.
Considerando o estado físico da fase móvel, distingue-se a cromatografia
líquida (CL), na qual a FM é um liquido que pode interagir com os solutos,
participando da separação; a cromatografia gasosa (CG), na qual é utilizado um
gás de arraste inerte; e a cromatografia supercrítica, em que se usa um vapor
pressurizado, em temperatura e pressão acima de seu ponto crítico.[2]
Quando acoplada a detectores, a cromatografia permite análises
qualitativas e quantitativas.

Cromatografia Líquida (CL)


A condição primária para a utilização da CL é que os analitos precisam
ser solúveis na FM e existem diferentes mecanismos que governam as
separações, dependentes da natureza da FE, como os de partição por adsorção
ou absorção.
A técnica divide-se em dois grupos, a Cromatografia Clássica, feita em
colunas de vidro, com o fluxo da FM devido à força da gravidade; e a
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC, do inglês high-performance
liquid chromatography), que normalmente utiliza colunas metálicas e pressões
de FM elevadas, obtidas com o auxílio de uma bomba de alta pressão, que pode
empurrar a FM com vazão mais rápida e controlada, aumentando a
reprodutibilidade e precisão das operações.
Na HPLC a injeção precisa é alcançada através de sistemas de injetores,
que inserem a mostra no fluxo da FM de forma a minimizar o espalhamento de
banda e sem perda de pressão do sistema, em volumes precisos pré-
estabelecidos (loopings).
Os tipos de detectores mais empregados em HPLC são os fotométricos,
baseados na absorbância no ultra-violeta e visível e podem ser caracterizados
como não-destrutivos. Os detectores fotométricos têm maior detectibilidade, pois
os compostos têm alta absorbância no comprimento de onda fixado, em
conseqüência têm alta seletividade, pois permite que o composto de interesse
tenha alta absorbância no comprimento de onda fixado, permitem a separação
dos compostos pela obtenção da substância na cela do detector, também não
sofrem grandes variações de absorvância para diferentes concentrações. Já o
espectrômetro de massas fornece dados da massa molar e a estrutura do
analito, mas é caracterizada como uma análise destrutiva, pois a amostra
necessita ser ionizada (o espectrômetro de massas só detecta espécies
carregadas), mas apresenta boa detectibilidade. O espectrômetro de massas
apresenta algumas restrições: ele necessita de alto vácuo e HPLC apresenta
vazões constantes e elevadas; no seu acoplamento com o HPLC não é
permitido uso de aditivos não-voláteis e os compostos muito polares, iônicos e
de alta massa molar utilizados em HPLC são instáveis termicamente e são
difíceis de serem ionizados.

Cromatografia Gasosa (CG)


Gases ou substâncias volatilizáveis podem ser separados utilizando-se
CG. A amostra, por meio de um sistema de injeção (diferente para colunas
capilares e empacotadas – Split ou Splitless) é introduzida na coluna contendo a
FE. O uso de temperaturas convenientes no injetor e na coluna possibilita a
vaporização dos analitos que, de acordo com as interações intermoleculares
com a FE terão diferentes tempos de retenção.
Durante a análise a temperatura da coluna pode permanecer constante,
porém não oferecem uma boa resolução quando as misturas são complexas e
exigem maiores tempos de análise. As colunas mais utilizadas são as capilares,
com diâmetros internos menores que 1mm, por oferecerem baixa resistência à
passagem da FM e podendo ter comprimentos maiores que possibilitam melhor
resolução de misturas complexas.
Existem vários tipos de detectores empregados em CG. Alguns geram
respostas a todos os compostos, medindo a variação da composição de gás de
arraste que sai da coluna, sendo considerados universais (como por exemplo,
Detector de Ionização de chama – FID, ou Detector de Condutividade Térmica –
TCD). Outros são específicos a algumas classes de compostos, empregados
quando se quer maior seletividade e aumento da detectabilidade dos analitos.

Objetivos
Avaliar a separação em fase normal de pigmentos de espinafre por
cromatografia em coluna, bem como a técnica de separação preparativa.
Introdução à cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e gasosa
(CG); avaliação dos requisitos necessários para a separação e os efeitos dos
parâmetros instrumentais sobre a resolução e eficiência da separação em cada
técnica.

Parte experimental
Os procedimentos foram realizados conforme descritos na apostila de
QA316 – Técnicas Cromatográficas [3], porém, algumas modificações no roteiro
original foram efetuadas nos procedimentos realizados em laboratório.
Na primeira prática, cromatografia em coluna, não foi necessário a
preparação da mistura de hexano, éter de petróleo e acetona, pois a mesma foi
fornecida pelos técnicos.
No experimento de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) a
mistura B não foi analisada, assim como a proporção 80:20 prevista da fase
móvel, por falta de tempo disponível e a coluna cromatográfica com fase C18
possuia altura de 15cm.
Na terceira prática, cromatografia gasosa (CG), a mistura A continha
hidrocarbonetos lineares em hexano e as injeções dessa mistura na coluna
capilar se deram em temperaturas de forno constantes, T 1= 100 ºC e T2= 140 ºC.
O quinto tópico do roteiro, que previa a construção de curva analítica, não foi
realizado.

Resultados e discussão
Para melhor organização do relatório os experimentos foram discutidos
separadamente.

Experimento I. Cromatografia em coluna: separação dos pigmentos do


espinafre.
Verificou-se nesse experimento a separação de três fases identificadas
por suas colorações: amarelo intenso, verde e amarelo claro, respectivamente
por ordem crescente de tempo de retenção.
Foi utilizada como fase estacionária a sílica gel (composto polar) e como
fase móvel uma mistura de compostos apolares. A interação química dos
pigmentos com as fases estacionária e móvel se dá de acordo com sua
polaridade, o que determina a ordem de saída dos mesmos.
O primeiro composto a deixar a coluna, aquele com maior afinidade com
a fase móvel, foi a mistura de carotenos que são formados apenas por átomos
de carbono e hidrogênio, sendo assim o mais apolar. A clorofila foi o segundo
pigmento a deixar a coluna por sua polaridade intermediária devido aos grupos
ácido carboxílico e éster presente em sua estrutura. A terceira amostra a ser
coletada foi a xantofila que por apresentar dois grupos hidroxilas tem maior
interação com a fase estacionária, polar.
A estrutura química dos pigmentos do espinafre identificados, bem como
o gráfico que mostra os espectros obtidos das bandas estão apresentados no
anexo 1 e 2.

Experimento II. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC): Efeito da


composição da fase móvel na eluição de misturas.
As tabelas 2 e 3 mostram os parâmetros cromatográficos calculados para
as injeções realizadas da mistura A, em HPLC, separados pelas proporções de
MeOH:H2O da composição da FM. Os cálculos para os parâmetros
cromatográficos estão descritos nos anexos xx

Tabela 2. Parâmetros cromatográficos das injeções em HPLC da mistura A – Parte I.


Lucila

Tabela 3. Parâmetros cromatográficos das injeções em HPLC da mistura A – Parte I.


Lucila

As interações decorrentes da polaridade de cada composto são


fundamentais para o entendimento dos fenômenos envolvidos, tendo em vista
que cada um deles tem maior afinidade por seu “semelhante”. No experimento, a
FE utilizada apresenta caráter apolar e a FM caráter polar, cuja intensidade varia
de acordo com as mudanças na proporção de água e metanol na mistura, sendo
que com o aumento da proporção de metanol há diminuição do caráter polar.
Observando-se os parâmetros relacionados ao tempo e volume de
retenção indicados nas tabelas, verifica-se que os compostos eluem em ordem
de polaridade. Ou seja, compostos mais polares, com maior afinidade pela FM,
possuem menor tempo de retenção e eluem rapidamente enquanto os apolares,
com maior afinidade pela FE, demoram mais para eluir, possuindo maior tempo
de retenção. Outro parâmetro que evidencia esse fato é o tempo de retenção
ajustado (TR’), que expressa o tempo em que as moléculas do soluto ficam
retidas na FE e pode-se ver na tabela 1 que os compostos mais polares
possuem os menores valores de TR’.
O parâmetro k’ corresponde ao fator de retenção e tem seu valor
diminuído com o aumento da polaridade do composto, isso devido aos
compostos polares terem maior afinidade com a FM polar e menor afinidade
pela FE apolar, ficando pouco retidos na mesma e, conseqüentemente, eluindo
mais rapidamente.
A ordem de eluição obtida para a mistura A foi: uracila, fenol, benzonitrila
e nitrobenzeno. A uracila apresenta dois grupos amida que a torna um composto
muito polar, por isso interage muito pouco com a FE, sendo o primeiro a eluir e
tendo seu tempo de eluição considerado o tempo morto da análise. Embora
menos polar que a uracila, o fenol apresenta um grupo hidroxila diretamente
ligado ao anel benzílico e é mais polar que a benzonitrila e esta é mais polar que
o nitrobenzendo, último composto a eluir devido a maior interação com a FE.
Nos cromatogramas correspondentes à FM na proporção de 70:30 v/v
metanol e água (anexo), o tempo de análise foi menor, bem como os tempos de
retenção dos compostos, entretanto, os picos estão bem próximos uns dos
outros, inclusive com sobreposição, o que é totalmente indesejável. Nos
cromatogramas correspondentes a FM na proporção 50:50 v/v metanol e água
(anexo), há um maior tempo de análise e de retenção, contudo os picos
apresentam-se relativamente mais distantes um dos outros e não ocorre
sobreposição dos mesmos. Observa-se também, pelas tabelas, que o fator de
retenção aumenta quando a concentração de metanol na FM é menor. Os
cromatogramas referentes à FM na proporção de 60:40 v/v metanol e água
(anexo), apresentaram características intermediárias entre os dois anteriormente
discutidos.
A resolução da análise é melhor quando se utiliza o solvente na
proporção 50:50 v/v metanol e água do que nas demais proporções, como se
pode ver pelo parâmetro RS, que indica a otimização da resolução.
Em fase reversa, a força da FM aumenta com o aumento da proporção do
solvente menos polar, logo, a força é definida pelo solvente orgânico. Quanto
maior a proporção do solvente orgânico, mais forte é a FM. Assim, quando a
porcentagem de metanol é muito elevada, os compostos eluem mais
rapidamente e os picos se sobrepôem e não apresentam uma boa separação,
resultando em uma baixa resolução entre eles e em uma baixa eficiência na
separação. Isto também é evidenciado pelos parâmetros RS, que aumenta da
FM na proporção 70:30 para a FM na proporção 50:50 v/v metanol e água.

Experimento III. Cromatografia gasosa (CG): Estudo do efeito da


temperatura da coluna na separação de misturas.
Os resultados dos cálculos dos parâmetros cromatográficos para a
mistura A, nas diferentes condições de temperatura, seguem apresentados nas
tabelas 4 e 5.

Tabela 4. Parâmetros cromatográficos das injeções em CG da mistura A – Parte I.


Lucila

Tabela 5. Parâmetros cromatográficos das injeções em CG da mistura A – Parte II.


Lucila

Nas tabelas 6 e 7 se encontram os resultados dos cálculos dos


parâmetros cromatográficos para a mistura B, nas diferentes condições de
temperatura.

Tabela 6. Parâmetros cromatográficos das injeções em CG da mistura B – Parte I.


Lucila

Tabela 7. Parâmetros cromatográficos das injeções em CG da mistura B – Parte II.


Lucila

Para elaboração da rampa de aquecimento, realizou-se, inicialmente,


duas análises à temperatura constante. Para a mistura A 100°C e 140°C e para
mistura B 130°C e 150°C.
Foi observado, por meio dos cromatogramas apresentados no anexo X,
que tanto na mistura A (anexo) como na B (anexo), os compostos mais voláteis
(de menores ponto de ebulição) apresentaram sobreposição dos picos
(coeluição), evidenciando uma separação pouco eficiente. Para melhor
separação dos picos, aumento da eficiência e diminuição do tempo de análise,
com o menor tempo de retenção (TR) dos compostos com maior ponto de
ebulição, elaborou-se uma rampa de aquecimento com taxa de variação de
8°C/min em uma faixa de 60°C a 140°C para ambas misturas, expressa nos
cromatogramas a e b. (é isso mesmo?)
Comparando os cromatogras dos anexos a e b; coluna empacotada
versus coluna capilar, observou-se que os picos dos cromatogramas da
cromatografia gás-líquido (CGL) em coluna empacotada apresentam maior
assimetria frontal do que a de coluna capilar, o que pode ser consequência do
seu maior diâmetro.
Os mecanismos de separação envolvidos na CGL são baseados em
atrações eletrostáticas e solubilidade da amostra na FE. Como a FE é um líquido
espalhado na superfície de um suporte inerte, o processo é intrafacial, ocorrendo
por absorção ou partição e o retorno do componente a FM depende da sua
volatilidade.[2]
A FE utilizada na análise da mistura B em coluna cromatográfica
empacotada foi o Carbowax, uma mistura de poliglicois altamente polar. Assim,
os analitos polares interagem mais fortemente com a FE líquida da coluna, ou
seja, são absorvidos pela FE mais facilmente. Logo, esperava-se que o acetato
de etila apresentasse maior tempo de retenção na coluna, no entanto, como já
comentado, o parâmetro de maior relevância é a volatilidade dos componentes
da amostra. Assim, o composto mais volátil (de menor ponto de ebulição) será
eluído mais rapidamente pela FM.
A ordem de eluição dos componentes obtida nos cromatogramas da
mistura B foi: acetato de etila, hexanol, heptanol, octanol e nonanol, cujos pontos
de ebulição são respectivamente, (colocar pontos de ebulição). [4]
A mistura A foi analisada no cromatógrafo com coluna capilar, constituída
por 95% de ... e 5% de ...(não consegui entender a letra do professor, vê se
vc entende) – polisioxanas (silicones), apolares. A mistura A de hidrocarbonetos
apolares teve alta solubilidade na FE, por isso o parâmetro determinante na
separação também foi a volatilidade dos constituintes.
A seguinte ordem de eluição foi encontrada nos cromatogramas da
mistura A, seguindo por seus pontos de ebulição: hexano, 68,7°C, heptano,
98,4°C, octano, 125°C, nonano, 150,8°C e undecano, 174°C. [4]
As propriedades e estruturas moleculares dos analitos estão
apresentadas no anexo Q.

Conclusões

No experimento I, cromatografia em coluna, a primeira banda obtida não


obteve a cor característica dos carotenos que está entre o amarelo e o laranja,
tal fato pode ser devido a extração pouco eficiente dos pigmentos do espinafre,
ou seja, a maceração não foi suficiente para a obtenção de grandes quantidades
dos carotenos de interesse.
Analisando o espectro UV-visível para a primeira banda, mistura de
carotenos (anexo), observou-se que o comprimento de onda de
aproximadamente 450nm apresentou maior valor de absorbância, deste modo
conclui-se que os carotenos absorvem comprimento de onda correspondentes a
cor azul (430 – 490nm), portanto apresentam coloração alaranjada.
Para a segunda banda retirada (anexo), relativo à clorofila, destacaram-se
dois picos no espectro, correspondentes a cor azul e vermelha. O primeiro pico
refere-se a comprimentos de onda em torno de 430-490nm, região de absorção
do violeta e do azul, a cor visível seria o amarelo, contudo ela é encoberta pela
cor verde, característica deste corante, que tem a região de absorção do
vermelho com comprimento de onda entre 620 e 800nm.
O terceiro espectro visível-UV, referente a terceira banda (anexo), mostra
a absorção para a xantofila, um pigmento com coloração alaranjada. O maior
pico de absorção ocorre ocorreu em um comprimento de onda de
aproximadamente 450nm, ou seja, na região do azul. O segundo pico encontra-
se na região do vermelho em um comprimento de onda entre 620 a 800nm,
provavelmente a cor refletida, o verde, é mascarada pela forte coloração
alaranjada decorrente da maior absorção da luz azul por esse composto.
A observação dos cromatogramas da mistura A (anexos), do experimento
II de HPLC, revelou que, a medida que a razão MeOH:H2O aumenta, a
resolução torna-se mais baixa, havendo co-eluição, isto é, o tempo de retenção
dos componentes é curto, logo eluem de forma rápida e próxima um do outro,
dificultando a visualização do gráfico e sua análise. Este fato está relacionado à
força cromatográfica dos solventes na FM, que mede a capacidade da FM de
interagir com os componentes da amostra, que pode ser por meio de forças de
Van Der Waals, ligações de hidrogênio ou forças dielétricas, logo, a força é
determinada pela polaridade dos solventes.
Quando o grau de polaridade de um solvente da FM é semelhante ao da
FE, ele é classificado como forte, pois sua capacidade de arrastar o soluto pela
coluna é maior, ou seja, suas moléculas competem mais eficientemente com as
moléculas da FE nas interações com os componentes (eluição mais rápida). O
inverso é observado quando o grau de polaridade de um solvente da FM é
diferente em relação ao da FE, sendo classificado como fraco, uma vez que, sua
capacidade de interagir com as moléculas do soluto é inferior à capacidade de
interação da FE. Diante disso, ao diminuir a força da fase móvel, o tempo de
retenção dos componentes da amostra é aumentado (eluição mais lenta).
Neste experimento, a eluição foi realizada no modo fase reversa, isto é, a
FM (metanol/água) era mais polar que a FE (octadecil), sendo assim, o solvente
mais forte era o menos polar. Como o metanol é menos polar que a água, é
então o solvente mais forte.
À medida que a proporção de metanol é aumentada, a cada troca de FM,
sua força torna-se maior e o tempo de retenção dos componentes da amostra
diminui, acarretando na sobreposição dos picos no cromatograma (baixa
resolução), devido à rápida passagem desses componentes pela coluna.
Diante ao exposto, foi possível concluir que a proporção de solvente mais
adequada para a mistura A foi a de 60:40 v/v MeOH:H 2O, uma vez que o
cromatograma apresentou alta resolução, comparado aos demais.
No experimento III, de cromatografia gasosa, o fator temperatura da
coluna é determinante, sendo que com o aumento da temperatura, ocorre o
aumento da velocidade de migração dos componentes da amostra e assim, eles
eluem mais rapidamente.
Duas condições de análise foram empregadas: à temperatura constante
(isotérmica) e com variação linear da temperatura (temperatura programada).
A partir da análise dos cromatogramas da mistura A (anexo) e da mistura
B (anexo), evidenciou-se que com o aumento da temperatura do forno tanto a
técnica cromatográfica isotérmica quanto a com temperatura programada, o
tempo de retenção dos componentes e, portanto, o tempo total da análise
diminui. Entretanto, a programação da temperatura é extremamente importante,
já que melhora a separação e diminui o tempo de análise.
A técnica programada consistiu em iniciar a análise com a coluna em uma
temperatura mais baixa (60ºC), para que os solutos de pontos de ebulição
menores pudessem eluir com picos separados. Em seguida, durante o processo,
a temperatura da coluna foi aumentada em 8ºC/min com o objetivo de se reduzir
a retenção das substâncias de maior ponto de ebulição. Além disso, pode-se
citar outras vantagens desse método, como a maior simetria dos picos e melhor
detectabilidade para os picos com tempo de retenção excessivamente longos
sob condições isotérmicas.
A construção da rampa de temperatura foi adequada, pois as amostras
continham substâncias com uma grande diferença nos pontos de ebulição,
principalmente a mistura dos hidrocarbonetos lineares (mistura A).

Referências bibliográficas

[1] Augusto, F.; Material de apoio - Slides Técnicas Cromatográficas, IQ –


UNICAMP.
[2] Collins, C. H.; Braga, G. L.; Bonato, P. S.; Fundamentos de Cromatografia;
Editora da Unicamp, Campinas – SP, 2006.
[3] Apostila experimental – Técnicas Cromatográficas, QA316.
[4] Quim. Nova, Vol. 31, No. 5, 1259-1262, 2008. Extração de β – caroteno de
cenouras: uma proposta para disciplinas experimentais de química.
[5] PNP - PLANTA NATURAL PRODUCTS –
http://www.planta.at/chloro/download/proinf.pdf
[6]Figura 12 – solomons (referência pontos de ebulição).