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ÍNDICE

1 Apresentação do e-book

2 Classificação sorológica da E.coli

Caracterização fisiopatológica das STEC:

3 Mecanismos de ação e sorotipos relevantes

para a saúde pública.

4
4
Ocorrências de surtos por STEC
Ocorrências
no mundo de surtos por STEC
no mundo

5 Monitoramento das STEC

em alimentos pelo mundo

6
Testes para detecção de STEC
e a vantagens da PCR em Tempo Real

2
 1 Apresentação
No decorrer deste e-book vamos ajudá-lo
a entender melhor a patogenicidade da
E.coli, seus mecanismos de virulência e
como os principais serviços de Segurança
de Alimentos ao redor do mundo têm
atuado para controlar sua prevalência.
Além disso, explicamos com detalhes a
técnica de PCR em Tempo Real, que está
sendo usada como padrão no mundo,
e como interpretá-la.
É provável que você já conheça as
principais características da E.coli, como
sendo um microrganismo constituinte da
microbiota intestinal e indicador de
qualidade em água e alimentos, mas você
sabe como suas cepas patogênicas
oferecem sérios riscos à saúde humana?
A Escherichia coli é uma bactéria
pertencente à família Enterobacteriaceae,
um bacilo gram negativo e anaeróbio
facultativo, que pode ser imóvel ou ganhar
mobilidade através de flagelos. É
encontrado naturalmente no trato
gastrointestinal de humanos e outros
mamíferos endotérmicos, condição em
que não representa nenhum risco à saúde
e ainda contribui para o funcionamento
adequado do sistema. Associada a seu
reservatório natural, a E.coli é um
importante indicador de qualidade para
água e alimentos, já que pode sugerir
contaminação por material fecal.
3
É importante considerar que diversas
cepas de E. coli são também patogênicas
para humanos e animais, estando
envolvidas em surtos de doenças
transmitidas por alimentos (DTA).
De maneira geral, os mecanismos de No decorrer deste e-book você poderá

virulência da E. coli envolvem modificação entender melhor a patogenicidade desse

da superfície da célula hospedeira, microrganismo, seus mecanismos de

produção de toxinas e enterotoxinas (que virulência e como serviços de Segurança

interferem nos processos fisiológicos de Alimentos ao redor do mundo tem

normais das células), bem como fatores atuado para controlar sua prevalência

de colonização – que favorecem a íntima e, consequentemente, reduzir a exposição

ligação da bactéria aos enterócitos, da população aos riscos que ele traz.

impedindo que a remoção ocorra por Vamos caracterizar um dos principais

peristaltismo. sorogrupos sob a óptica de saúde

pública: as E.coli enterohemorrágica
(EHEC) do tipo STEC – E.coli produtoras
de toxina Shiga. Disponibilizamos ainda
os métodos para pesquisa desse
patógeno em alimentos de acordo com
as regulamentações vigentes nos Estados
Unidos e no Brasil, além de dicas valiosas
de como adequar seu laboratório para
realizar eficientemente testes moleculares.

4
De acordo com as síndromes clínicas, fatores de virulência e características
sorológicas, as E. coli são distribuídas em cinco principais grupos: E. coli
enteropatogênica (EPEC), E.coli Enterotoxigênica (ETEC), E.coli enteroinvasora (EIEC),
E.coli enteroagregativa (EAEC) e E.coli enterohemorrágica (EHEC).

As EHEC foram reconhecidas como um importante grupo vinculado à doenças

alimentares a partir de 1982, devido a um surto ocorrido pela ingestão de
hambúrgueres mal cozidos em um restaurante fast food nos Estados Unidos. As cepas
de EHEC são capazes de produzir toxinas idênticas aquelas produzidas pela Shigella
dysentariae, conhecidas como toxinas Shiga, que atribuem o nome característicos
as STEC (E.coli produtoras de toxina shiga). O sorotipo O157:H7 é o mais frequente
isolado de EHEC em pessoas doentes nos Estados Unidos, Japão e Reino Unido.
A ingestão de menos de 100 bacilos desse grupo já podem causar doença, cujas
complicações podem variar desde uma diarreia branda, que evolui rapidamente para
colite hemorrágica, com intensa dor abdominal e perda da função renal (síndrome
hemolítica urêmica).

5
 2 Classificação sorológica
da E.coli

A classificação sorológica da E.coli é baseada nas diferenças antigênicas encontradas

na parede celular (antígenos O), no envelope celular ou cápsula (antígenos K) e nos
flagelos (antígenos H).

Os antígenos “O” são relacionados à diversidade de polissacarídeos da parede

celular das bactérias e designados por números que vão de 1 a 173. Os antígenos
“K”, por sua vez, são os polissacarídeos capsulares (CPS), havendo 60 fatores
conhecidos, separados em dois grupos distintos, segundo o peso molecular dos
compostos de CPS. Antígenos flagelares “H” derivam da proteína flagelar (flagelina),
que carrega os fatores antigênicos designados por números que vão de 1 a 56.

Uma combinação específica dos antígenos

O e H definem o “sorotipo” de uma E.coli.
Os sorotipos são designados primeiro
pelos antígenos somáticos, seguido dos
capsulares e flagelares, como, por
exemplo, o sorotipo O157:H7, em que a
nomenclatura indica presença do antígeno
(sorogrupo) O157, ausência do antígeno
capsular e presença do antígeno H7.

6
 3
Caracterização fisiopatológica das STEC:
Mecanismos de ação e sorotipos relevantes para
saúde pública.
Parte do subgrupo Escherichia coli
enterohemorrágica (EHEC), as STEC
destacam-se pela capacidade de causar
doenças severas em seres humanos,
relacionada à secreção da toxina Shiga
(Stx e suas variantes toxigênicas).
Outro fator de virulência é a intimina,
codificada pelo gene eae e associada
à capacidade da bactéria aderir-se
intimamente ao enterócito, tornando
possível sua proliferação e produção
de toxinas.
Essas substâncias são absorvidas pela
mucosa, entram na circulação, são
internalizadas pelas células endoteliais
e interrompem a síntese proteica,
ocasionando a morte celular. A lesão das
células endoteliais do cólon resulta em
perda de sangue nas fezes e a do
endotélio glomerular em obstrução
e insuficiência renal.
Por isso, as manifestações clínicas da
infecção incluem diarreia, que pode evoluir
para diarreia sanguinolenta e síndrome
hemolítica urêmica, resultando em falência
renal. Uma alta taxa dos acometidos são
hospitalizados e alguns desenvolvem
doença renal de estágio terminal, levando
ao óbito.
As linhagens de STEC com o mesmo
sorotipo não necessariamente serão
portadoras dos mesmos genes de
virulência, assim como podem oferecer
diferentes níveis de perigo à saúde
humana, uma vez que muitos genes de
virulência das STEC são móveis e podem
ser transferidos para outras bactérias.
Os sorotipos podem ser úteis para
investigação epidemiológica, mas não
são o único fator decisivo para avaliação
de risco.
7
As complicações a partir de infecções por STEC são mais bem previstas com base
em fatores de virulência, codificados por genes. Baseado no conhecimento científico
atual, linhagens de STEC com gene Stx2 e genes de aderência (eae ou aggR) têm
o maior potencial para causar diarreia sanguinolenta e síndrome hemolítica urêmica
(SHU). Linhagens de STEC com outros subtipos de genes Stx podem causar o
quadro de diarreia característico, mas sua associação com a SHU é mais incerta
e altamente variável. A evolução da doença para seus estágios críticos também
depende da combinação e expressão dos genes de virulência, da dose infectante
e da suscetibilidade do hospedeiro.

Escherichia coli O157:H7 é o sorotipo de E. coli pertencente ao grupo EHEC que

melhor representa a categoria de patógenos emergentes, desde sua primeira
associação com surto alimentar em 1982, nos Estados Unidos. Uma característica
importante da E. coli O157:H7 é a sua baixa dose infectante, tão baixa quanto a da
Shigella, ou seja, inferior a 10 organismos. Outros sorogrupos de STEC também estão
ganhando importância epidemiológica, devido as suas associações com diarreias
sanguinolentas e SHU, como O26, O45, O103, O111, O121 e O145, os quais estão
sendo denominados de “Big Six STEC non O157”.

8
 4 Ocorrências de surtos por STEC
no mundo
Considerando que o principal reservatório de STEC, principalmente o sorotipo O157:H7,
é o trato gastrointestinal de bovinos, as infecções por este agente passam a ocorrer,
sobretudo, pelo consumo de carne malcozida e leite cru, podendo, entretanto, estar
associado ao consumo de vegetais e à ingestão de água. Diferentemente dos humanos,
em que a colonização das STEC ocorre no cólon, nos bovinos a interação se dá na junção
reto-anal, onde ela não exerce efeito patogênico.

O primeiro surto causado por E. coli

O157:H7 em humanos foi relatado nos
Estados Unidos, em 1982, quando esse
microrganismo causou diarreia
sanguinolenta severa envolvendo pelo
menos 47 pessoas, após a ingestão de
sanduíches contendo hambúrgueres de
carne bovina, molho de cebola e picles,
distribuídos em uma rede de fast-food.

No entanto, foi somente em 1992 que a E. coli O157:H7 foi reconhecida como patógeno
alimentar emergente, quando acometeu mais de 700 pessoas em um surto de colite
hemorrágica que resultou na morte de quatro crianças. Esse surto ocorreu após a ingestão
de hambúrgueres preparados com carne moída mal tratada termicamente, em uma
lanchonete de uma grande rede de fast-food nos Estados Unidos.

9
Na Argentina, a SHU causada por E. coli O157:H7 é considerada uma doença endêmica,
tendo um dos índices globais mais altos, aproximadamente 400 novos casos de SHU são
anualmente notificados em unidades de nefrologia dos hospitais argentinos.

Em 2011, a Alemanha apresentou o maior

surto de STEC já registrado, envolvendo
mais de 3.000 casos de diarreia
sanguinolenta e síndrome urêmica
hemolítica. A investigação epidemiológica
apontou o consumo de broto de feno
grego contaminado como a causa da
doença e a transmissão fecal-oral foi
relatada. O agente causador foi
identificado como E. coli O104:H4
e o estudo das sequências do genoma
desse patógeno revelou genes
característicos de E. coli enterohemorrágica
(EHEC) e enteroagregativa (EAEC).

Embora exista o registro de isolamentos e de diversos relatos de casos de SHU no Brasil,

a única implicação de E. coli O157:H7 veiculada por alimento envolvido em surto alimentar
descrita na literatura foi um surto com dois casos de diarreia, sem SHU, ocorrido em
Campinas, em 2001, supostamente causado por ingestão de carne malcozida.

10
 5 Monitoramento das STEC
em alimentos pelo mundo

Muitos países como Austrália, Canadá, Chile, França, Alemanha, Irlanda, Nova Zelândia
e Estados Unidos têm conduzido estudos para estimar a prevalência e a carga de STEC
O157 e não-O157 em carcaça bovina, carnes e produtos cárneos.

O objetivo comum dessas pesquisas é determinar níveis básicos de referência para

desenvolver programas de redução de patógenos em concordância com objetivos de
segurança dos alimentos, assim o governo e as indústrias poderiam medir a eficácia de
seus próprios sistemas de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle. As STEC
são normalmente testadas junto com outros patógenos, como Salmonella, Listeria
monocytogenes e indicadores de higiene.

Países que fazem importação normalmente solicitam dos países exportadores o mesmo
processo padrão de seus produtos locais. Isso obrigou os países que exportam carne
bovina para mercados com regulação obrigatória de STEC adotarem tais requisitos em
seus estabelecimentos de exportação, independente de seus regulamentos internos.
Essa medida pode resultar em um sistema duplo para análises de mercado local e
exportação a depender do país de destino. Por exemplo, os Estados Unidos solicitam
que todos os estabelecimentos que exportam carnes e produtos cárneos para eles
implemente programas relevantes de testagem de E.coli O157:H7 e certas cepas de
STEC não O157:H7 (O26, O45, O103, O111, O121, e O145). O requerimento inclui o uso
de metodologias laboratoriais aprovadas pelos Estados Unidos ou reconhecidas como
equivalentes. Os produtos são testados também no ponto de entrada.

No Japão, um programa de monitoramento para alimentos importados é aplicado para

toda importação de carne bovina, de cavalo e produtos cárneos não processados, com
teste de E.coli O157 e os sorogrupos de STEC O26, O103, O104, O111, O121, e O145.

11
 6 Testes para detecção de STEC
e a vantagens da PCR em Tempo Real

Os testes moleculares para detecção de

patógenos oferecem benefícios importantes
para os programas de segurança dos
alimentos, já que contam com alta
especificidade na identificação de
microrganismos ao buscar trechos de seu
material genético na amostra que está
sendo analisada.

A PCR em Tempo Real (qPCR) é uma técnica de Biologia Molecular que permite replicação
in vitro do DNA de forma extremamente rápida. Com a qPCR, quantidades mínimas de
material genético podem ser amplificadas milhões de vezes, tornando possível a detecção
da sequência alvo através da emissão de fluorescência, que é captada pelo equipamento
e interpretada adequadamente através dos algoritmos do software.

12
 Entenda o protocolo da PCR
em Tempo Real

A escolha de reagentes apropriados é importante para garantir a especificidade

e sensibilidade da metodologia. De maneira geral, além da amostra que será analisada
os constituintes para o mix são:

 Primers e sondas - Pequenas

sequências nucleotídicas que são
desenhadas para encontrar especificamente
a molécula de DNA alvo na amostra;

 dNTPs (nucleotídeos) - Bases

nitrogenadas livres em solução para compor
as novas fitas de DNA que serão replicadas;

 Taq polimerase - Enzima que inicia e

conduz o processo de replicação;

 Fluoróforo - Substância química que,

associada à sonda, é responsável por emitir
luz quando anilada à molécula de DNA alvo;

 Solução tampão.

13
 Entenda
Etapasodo
protocolo da PCR
processo:
em Tempo Real

Extração: Permite com que o material

genético das células presentes na amostra fique
disponível em solução

Amplificação: é o resultado de 3
subetapas que acontecem sequencialmente:

- Desnaturação do DNA: Abertura das fitas duplas que estavam em forma de hélice para
exposição de suas bases nitrogenadas, permitindo que as sondas possam reconhecer o
trecho complementar específico para o qual foram desenhadas;

-Anilamento: Após as sondas reconhecerem a região do DNA a qual são complementares,

ocorre a ligação entre elas.

- Extensão: Assim que ocorre o anilamento entre as sondas e o DNA alvo, inicia-se o
processo de extensão, que é cópia exponencial da região de interesse.

14
 Esse ciclo de desnaturação – anilamento - extensão ocorre repetidamente no termociclador,
em torno de 35 a 45 vezes, com variações de temperatura para cada etapa, a fim de obter
quantidade suficiente de material genético para detecção.

100 Denature DNA

80 Extended Primers

60
T ( C)

40 Anneal Primers

20
cycle #1 cycle #2
0
TIME

4th cycle
Wanted Gene
3th cycle EXPONENCIAL AMPLIFICATION

2nd cycle

1st cycle 35th cycle

Template DNA

2 3
2 2 36
2 68 billion copies
4 copies 8 copies 16 copies 32 copies
(Andy Vierstraete 1999)

15
 Detecção: Ocorre através da emissão
de fluorescência pela molécula que está sendo
amplificada.

O termociclador interpreta essa emissão de luz como um sinal de presença do DNA alvo,
já que as sondas que possuem o fluoróforo têm alta especificidade para evitar a cópia de
outras moléculas não desejadas. No decorrer dos ciclos, forma-se um gráfico característico
indicando o resultado da amplificação: positivo ou negativo para o alvo procurado.

Em abril de 2019, o USDA (U. S.

Department of Agriculture),
AMPLIFICATION
órgão similar ao MAPA nos
7000
Estados Unidos, modificou seu
Guia de Laboratório 6000
Microbiológico (MLG 5C.00) 5000
RFU

indicando os kits de PCR em 4000

Tempo Real STEC VirX e STEC 3000

SerO II da Bio-Rad como 2000

metodologia recomendada para 1000

0
pesquisa das sete principais 0 10 20 30 40 50
STEC em carne bovina in natura cycle log scale
e produtos cárneos prontos para
o consumo.

Na sequência, em junho de 2020 o MAPA atualizou seu Escopo de Referência para análise
de produtos de origem animal (DOC 004 do CGAL), alterando o método analítico para
pesquisa desse patógeno com referência à MLG 5C.00. O resultado é que as análises
oficiais para o mercado nacional, assim como para exportação aos Estados Unidos,
seguirão essas diretrizes no controle de qualidade microbiológico do produto.

16
 O kit iQ-Check STEC VirX permite um
screening inicial das amostras por detectar
individualmente os genes de virulência Stx1,
Stx2 e eae em uma única reação. Se o
resultado for positivo, o mesmo DNA extraído
pode ser usado para detecção das “Big six”,
assim como do sorotipo O157:H7, utilizando
o kit iQ-Check STEC SerO II. Segundo a
MLG, uma STEC verdadeira apresenta
ambos os genes de virulência
simultaneamente.

Contando com uma sensibilidade de 10² UFC/mL, a detecção dos genes de virulência pode
ser obtida em cerca de 70 minutos após o processo de enriquecimento da amostra. Ambos os
kits são multiplex e permitem a detecção de vários alvos em um mesmo poço, incluindo um
controle interno de amplificação, que valida qualquer resultado negativo.

O kit iQ-Check STEC VirX pode ser usado para até 94 amostras e o kit iQ-Check STEC SerO II
para até 30 amostras. Ambos possuem controles positivos e negativos e podem ser usados
paralelamente, contando com o sistema de PCR em Tempo Real de alto throughput da
Bio-Rad.

Além dos kits para pesquisa de STEC, a

Bio-Rad dispõe de um amplo portfólio para
detecção de outros patógenos importantes
para o controle microbiológico de alimentos,
baseados também na tecnologia de PCR em
tempo Real, que traz resultados consistentes
e fidedignos ao passo em que otimiza os
protocolos de análise, liberando laudos
negativos confirmatórios com mais rapidez,
sem comprometer a credibilidade do
laboratório e o fluxo da cadeia comercial dos
produtos.

17
 Vimos no decorrer

deste e-book a patogenicidade da E.coli, seus mecanismos de virulência e como os

principais serviços de Segurança de Alimentos ao redor do mundo têm atuado para
controlar sua prevalência, e consequentemente, reduzir a exposição da população aos
riscos que ela traz.

Além disso, trouxemos de uma forma resumida como a PCR em Tempo Real tem sido
aplicada como padrão de análise em diversos países do mundo e quais são seus
princípios básicos.

Esperamos que esse conteúdo tenha contribuído para sua atualização científica, que está
intimamente ligada ao seu desempenho profissional nesse segmento tão dinâmico
e importante como a Ciência dos Alimentos.

18
Referências Bibliográficas

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