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HIBRIDIZAÇÃO

IN SITU
Andressa Pinto, Gabriel Goedert, Jadder Baron, Leonardo
Brum, Luciano Bordin, Micaéla Althaus, Sofia Lyra

Como o nome sugere, é um método de localização e


detecção de sequências específicas de mRNA em seções de
tecidos morfologicamente preservados ou preparações
celulares, hibridizando a fita complementar de uma sonda
nucleotídea à sequência de interesse.

Preparo do Material
Seção congelada
Seção embutida com parafina
Células em suspensão

As sondas são sequências


complementares de bases de
nucleotídeos para a sequência
específica do mRNA de
interesse. A força dos laços
entre a sonda e o alvo
desempenha um papel
importante. A força diminui na
ordem RNA-RNA para DNA-RNA.
Essa estabilidade é, por sua vez,
influenciada pelas várias
condições de hibridização, como
concentração de formamida,
concentração de sal,
temperatura e pH.

Tipos de Sondas
Sondas de oligonucleotídeo
Produzidas sinteticamente; Pequenas; Possibilidade de padronização; Fita única impedindo
renaturação
Sondas de DNA de fita simples
Vantagens similares à sonda anterior porém são muito maiores; Produzidos por
transcrição reversa de RNA
Sondas de DNA de fita dupla
É possível se obter em grande quantidades; Geralmente são menos sensíveis e por isso
não são mais tão utilizadas
Sondas de RNA
Possibilidade de digestão pós-hibridizatória reduzindo chances de apresentar coloração
de fundo; Termoestáveis

Rotulando a sonda
Rótulo 5' final
Cauda 3'
Rótulo 3' final
Rótulo Incorporado
PERMEABILIZAÇÃO
O ato de fixação resulta na
reticulação de proteínas, o que mais
uma vez pode representar um
obstáculo para uma boa infiltração da
sonda e, finalmente, as sequências de
mRNA são frequentemente rodeadas
por proteínas que podem mascarar a
sequência alvo.
Três reagentes comuns usados para
permeabilizar o tecido são HCl,
detergentes (Triton ou SDS) e
Proteinase K.

HIBRIDIZAÇÃO
A hibridação depende da capacidade
do oligonucleotídeo de se emparelhar
com uma fita de mRNA
complementar logo abaixo de seu
ponto de fusão (Tm).
Tem utilidade na detecção de genoma viral nos Os fatores que influenciam a
tecidos, na separação dos subtipos virais e na hibridização da sonda são:
avaliação se a infecção é latente ou produtiva. Temperatura;
É também usada na identificação e diferenciação pH;
de hifas de várias espécies de fungos nos tecidos, Concentração de cátion
como os do gênero Aspergillus, entre outros. monovalente;
Presença de solventes orgânicos.

LAVAGEM
UTILIZAÇÃO DE CONTROLES Após a hibridização, o material é
Utiliza-se um controle para garantir que ocorreu a lavado para remover a sonda não
hibridização específica com a sequência mRNA alvo e ligada ou a sonda que se ligou
não ocorreu algum problema na preparação ou não fracamente a sequências com
há a presença da sequência em questão. correspondência imperfeita.

Aplicações clínicas
Quando usada no estudo das neoplasias, a técnica permite detectar RNAm de
peptídeos hormonais, cadeias leves de imunoglobulinas, albumina, etc., de
modo a se ter certeza de que são produtos das células neoplásicas em si, e não
provenientes da difusão nos fluidos teciduais.

Ela também é empregada no estudo de alterações genéticas em várias


neoplasias, assim como em combinação com outros métodos, a saber: imuno-
histoquímica, a reação em cadeia da polimerase (PCR in situ), com ouro
coloidal para visualização em microscopia eletrônica, etc.

A ISH é empregada para detecção e localização do HPV na célula infectada e


permite localizar sequências específicas de ácidos nucleicos em amostras
celulares ou teciduais infectadas, ou mesmo em cromossomos isolados, por
meio da ligação de uma sonda específica para um tipo de HPV, podendo ser
executada em tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina.
IMUNO-
HISTOQUÍMICA
É uma técnica poderosa baseada em microscopia para
visualizar componentes celulares, por exemplo, proteínas ou
outras macromoléculas em amostras de tecido. Revela a
existência e localização da proteína-alvo no contexto de
diferentes tipos de células, estados biológicos e/ou
localização subcelular em tecidos complexos.

Na técnica de imunocoloração ocorre a identificação seletiva de antígenos


(proteínas) em células de uma seção de tecido, o que é possível pelo
princípio de que anticorpos se ligam a antígenos específicos.

Entre as formas de visualização das proteínas coradas, as mais comuns são:


Imuno-histoquímica cromogênica, em que o anticorpo conjuga-se com uma
enzima que catalisa a reação de coloração.
Imunofluorescência, na qual um anticorpo é marcado com um fluoróforo
que absorve a luz e a emite em determinado comprimento de onda.

Princípio geral da técnica de imuno-histoquímica


Princípios da técnica
O anticorpo de detecção, antígeno-específico é marcado com uma
substância fluorescente, elemento radioativo, ouro coloidal ou uma enzima
para dar cor posteriormente.

As amostras são por exemplo, incubadas com substratos enzimáticos (se o


anticorpo estiver marcado com enzima), gerando uma coloração
castanha/vermelha que reflete a distribuição do antígeno alvo no tecido.

A reação é feita em lâminas de microscopia, e a observação


é realizada em microscópio óptico comum ou fluorescente.

Aplicações
As reações imuno-histoquímicas podem ser utilizadas para diferentes situações na
investigação do tecido, especialmente por marcadores característicos que indicam
proliferação ou apoptose celular. Alguns exemplos são:

Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente não diferenciadas;


Subtipagens de neoplasias;
Caracterização da localização primária de neoplasias malignas;
Pesquisa de fatores prognósticos e indicações terapêuticas de determinadas
doenças;
Diferenciação da natureza benigna ou maligna de determinadas proliferações
celulares;
Detecção de agentes infecciosos.

Referências
DETECT, Gene. In situ hybridization, 2020
NITTA, H; MUNGER, W.; WILSON, E.; RALSTON, R. & ALILA, H.- Improved in situ
immunodetection of leukocytes on paraffin-embedded mouse spleen. Cell Vision, 4: 73-80,
1997.
JOHNSON, G.D & ARAUJO, G. M.C.N.- A simple method of reducing the fading of
immunofluorescence during microscopy. Journal of Immunological Methods, 43: 349-350,
1981.
LEONG, A. S. Y & MILIOS, J. - Rapid immunoperoxidase staining of lymphocyte antigens using
microwave irradiation. Journal of Pathology, 148: 183-187, 1986.
LEONG, A.S.Y. - An assesment of the efficacy of the microwave antigen-retrieval procedure
on a range of tissue antigens. Applied Immunohistochemistry 1: 267-274, 1993.
Rosai, J. (ed.) - Chapter 3 - Special Techniques in Surgical Pathology. In: Rosai and Ackerman’s
Surgical Pathology. Vol. 1 e 2. 10th ed. Edinburg, Mosby/Elsevier, 2011, pp. 69
VAN DER BERG, F. et al. - Target unmasking fluid (TUF) for immunohistochemistry in (archival)
paraffin-embedded tissue. Eur. Clin. Lab. Feb: p. 24, 1993.

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