CLÍNICA Prof. Dr. Alvaro Galdos alvarogaldos@alumni.usp.br INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO - II
IMUNOFLUORESCÊNCIA CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
➢ A imunofluorescência permite a detecção e localização de
antígenos em células e tecidos utilizando anticorpos específicos, marcados com fluorocromos, de modo que a localização dos antígenos se torna visível ao microscópio de fluorescência.
➢ De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e
localizar anticorpos em fluidos biológicos usando seu antígeno correspondente. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
➢ Baseia-se na capacidade das moléculas de
anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno.
➢ Teste qualitativo/semi-quantitativo.
➢ Método de alta sensibilidade e alta especificidade.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS FLUOROCROMOS ➢ Nos testes de imunofluorescência são empregados conjugados constituídos de anticorpos ligados covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos.
➢ 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com
fluorocromos.
➢ Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta
(radiação) e emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS FLUOROCROMOS
➢ São utilizados vários fluorocromos diferentes nos
laboratórios clínicos para imunofluorescência.
➢ Isotionato de fluoresceína e compostos da
rodamina são os fluorocromos mais usados para conjugação com anticorpos para torná-los fluorescentes sob condições adequadas de iluminação. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS FLUOROCROMOS ➢ Isotionato de fluoresceína (FITC) Pico de absorção de 490 nm e de emissão de 520 nm.
➢ Compostos de Rodamina (Fluoronas) – (IFD)
São Rodamina 6G e Rodamina B. Elas são usadas como corantes, como corantes laser e como meio amplificador. Os corantes de rodamina fluoresce e pode ser medido facilmente e a baixo custo com instrumentos chamados fluorímetro. Os corantes do tipo Rodamina são usados extensivamente em aplicações biotecnológicas tais como a microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e os testes do tipo ELISA.
• O microscópio utilizado para a leitura de IFD pode ser de epiluminescência ou
confocal. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA • A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência ocorre através da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto comprimento de onda (UV). • Para deixar passar somente a emissão secundária desejada, devem-se utilizar filtros apropriados dependendo da cor do fluorocromo. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
TIPOS DE REAÇÃO:
Detecção de Ag Detecção de Ag Detecção de Ac
DIRETA INDIRETA IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD) • Os primórdios da imunofluorescência direta (IFD) datam de 1942, quando Albert Coons e colaboradores demonstraram a marcação de anticorpos anti-pneumococos A imunofluorescência direta é o padrão com fluoresceína no tecido ouro para estudo das glomerulopatias e outras doenças de imunodepósitos pulmonar. (Síndrome de Sjogren). IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
➢ Pesquisa-se um antígeno em uma reação com
anticorpo preparado com o fluorocromo (conjugado).
➢ Para este tipo de reação são utilizados anticorpos
purificados específicos para um determinado antígeno ou grupo de antígenos conjugados com um fluorocromo. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
Y Y • O anticorpo específico Y Y Y Y marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável.
• O anticorpo não ligado é
removido por lavagens.
Antígeno • O preparado é observado em
pesquisado microscópio de fluorescência. Y Conjugado IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
VANTAGENS ➢ Alta especificidade e sensibilidade. ➢ Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização. DESVANTAGENS ➢ Alto custo do microscópio de fluorescência. ➢ Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja identificar ou localizar. ➢ Subjetividade da leitura. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
APLICAÇÕES ➢ Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
Reação de Imunofluorescência Indireta utilizando-se antígeno de formas
amastigotas de Leishmania infantum chagasi. (A) Amostra não reagente; (B) Amostra reagente. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
• Também conhecida como técnica de dupla camada é realizada por
antígenos fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro um anticorpo específico não fluorescente.
• E por último coloca-se um anticorpo fluorescente com
especificidade marcada contra determinantes antigênicos do primeiro anticorpo utilizado para reagir com o antígeno. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOS Y Y Y Y ➢ Incuba-se a célula ou tecido em que se Y Y Y Y quer pesquisar o antígeno com o anticorpo Y Y específico, levando à formação de um imunocomplexo. ➢ Realiza-se lavagem para retirada do anticorpo não ligante excedente. Antígeno ➢ A preparação é incubada com um pesquisado conjugado antiimunoglobulina, marcado Y Conjugado com fluorocromo. Y ➢ O preparado é observado em microscópio Anticorpo de fluorescência. Monoclonal IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS Y Y Y Y ➢ Antígenos padronizados são fixados a Y Y Y Y lâminas de vidro. Y Y ➢ O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo. ➢ Realizam-se lavagens para a retirada dos anticorpos não ligados. Antígeno padronizado ➢ A preparação é incubada com o conjugado Y Conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo Y Anticorpo específico para o antígeno. pesquisado ➢ Observa-se o preparado em microscópio de fluorescência. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
VANTAGENS ➢ Sensibilidade ➢ Especificidade ➢ Reprodutibilidade ➢ De simples padronização e execução ➢ O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes ➢ Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados conjugados específicos
DESVANTAGENS ➢ Necessidade de microscópio de fluorescência ➢ Subjetividade na leitura ➢ Não-automação IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) APLICAÇÕES ➢ Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a sífilis, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes. IMUNOFLUORESCÊNCIA ➢ As técnicas de imunofluorescência ainda são empregadas na rotina laboratorial, mas estão sendo gradativamente substituídas por testes imunoenzimáticos, principalmente devido à necessidade de microscopia, subjetividade de leitura e impossibilidade de automação. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA PRINCÍPIO ➢ A quimioluminescência foi descrita pela primeira vez em 1888 por Eilhard Wiedeman. ➢ Energia luminosa a partir de uma reação química. ➢ Energia química gerada através de dissociação de ligações fracas. ➢ Imunoquimioluminescência quantifica Ag e Ac presentes no soro. ➢ A técnica se baseia na ligação de antígeno – anticorpo. Um dos dois reagentes é conjugado a uma substância que, quando ativada, emite luz visível. Então, a emissão de luz é proporcional ao reagente pesquisado.
23 CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
• Método imunológico baseado na emissão de energia luminosa a
partir de uma reação química.
• Quantifica antígeno ou anticorpo presente em fluidos corporais.
• Muito usado para dosagens de hormônios, marcadores tumorais
e outras proteínas séricas.
• Um dos métodos de escolha para substituir o radioimunoensaio.
COMPOSTOS QUIMIOLUMINESCENTES USADOS
➢ Derivados de Luminol • Necessita de um catalisador. • Apresenta uma série de interferências de fundo ao emitir sua luz. • Reação lenta e gradual. • Dependente de pH COMPOSTOS QUIMIOLUMINESCENTES USADOS
➢ Ésteres de Acridina • Não requer um catalisador. • Baixas interferências de fundo • Muito estável, grande vida média • Alto rendimento – linear. • Tempo de reação rápido – medição mais fácil • A conjugação não limita o rendimento. • Alta sensibilidade. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
➢ A técnica se baseia na ligação de antígeno –
anticorpo. Um dos dois reagentes é conjugado a uma substância que, quando ativada, emite luz visível. Então, a emissão de luz é proporcional ao reagente pesquisado. PASSOS DA TÉCNICA ➢ Uma microesfera de poliestireno é revestida com anticorpo monoclonal contra antígeno analisado ➢ Adição do soro do paciente, que é incubado com agitação intermitente. Y ➢ Lavagem para retirada do antígeno não fixado Y ➢ Adição de anticorpo monoclonal específico para o antígeno pesquisado conjugado a enzima. Y ➢ Incubação do conjugado e mais uma lavagem para tirar o anticorpo não fixado Y ➢ Adição do substrato da enzima, em seguida, incubação. Y ➢ A adição de substrato quimioluminescente Conjugado Y Anticorpo sofre hidrólise na presença da enzima, monoclonal Antígeno do soro produzindo substâncias instáveis que geram Substrat do paciente o emissão de fótons (luz). PASSOS DA TÉCNICA ➢ Estes fótons são medidos través de um fotomultiplicador (PMT) que tem a função de transformar a luz emitida pelos fótons em impulsos elétricos.
➢ ESTES IMPULSOS SÃO
LIDOS EM “CONTAGENS” DE LUZ POR SEGUNDO (CPS). ESSA UNIDADE É PROPORCIONAL A QUANTIDADE DE ANTÍGENOS PRESENTES NA AMOSTRA. • Os imunoensaios de quimioluminescência são realizados em aparelhos automatizados, onde todo o processo é guiado por computadores.
VANTAGENS Rapidez ✓Automatizado e rápido Maior sensibilidade ✓Elevada sensibilidade e especificidade Eficiência ✓Emprego de pequenas quantidades de reagentes ✓Várias amostras podem ser analisados e distintas moléculas podem ser quantificadas de uma só vez. ✓Reagentes não-perigosos
32 RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
➢ Primeira técnica a ser desenvolvida para dosagem hormonal e de
outras substâncias presentes em pequenas concentrações em fluídos biológicos, sendo um método muito sensível para análise quantitativa antígeno-anticorpo. RADIOIMUNOENSAIO (RIA)
➢ O princípio e as modalidades são os mesmos dos outros ensaios acima
mencionados – a diferença está na substância indicadora de reação, que neste caso é um isótopo radioativo e em geral se utiliza o 125I.
➢ LIMITAÇÕES DO RADIOIMUNOENSAIO: • envolve material radioativo. • a validade desse reagente reativo é curta. • demora na execução do teste. IMUNOFLUORIMETRIA
• Este método é muito utilizado para dosagens de proteínas séricas, hormônios,
marcadores tumorais, anticorpos específicos para alérgenos etc. • O teste é basicamente automatizado. • O resultado baseia-se na fluorescência emitida, mensurada pelo fluorômetro. • A fluorescência emitida é intensa, porém pouco duradoura. • Utiliza-se Ac ou Ag conjugado com um fluorocromo. • Fluorocromos como fluoresceína e rodamina podem ser utilizados, entretanto lantanídeos como o Európio são os mais usados. • Os tipos mais utilizados são: competição e sanduíche. • Pode detectar 10-12 a 10-16 g. IMUNOFLUORIMETRIA (Sanduiche / Eu)
+ Ag + -Eu
Fase Sólida contendo Ac Padrão, controle Ac monoclonal marcado
-Eu monoclonal contra Ag e amostra com Eu, contra um outro epítopo do Ag
+ + Eu
-Eu Incubação Solução de amplificação: dissocia os ions európio do Ac marcado na Os ensaios do tipo apresentado solução, e com eles forma a seguir, se baseiam na poten- estruturas fluorescentes cialização da emissão de luz vi- sível, a partir da dissociação de lantanídeos. REFERÊNCIAS VAZ, A. J. Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. 2. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2018, 416 p. ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. IMUNOLOGIA: Celular e Molecular. 8. Ed. Rio de Janeiro: ELSEVIER, 2018, 549 p. Alvaro Galdos - YouTube
