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IMUNOLOGIA

CLÍNICA
Prof. Dr. Alvaro Galdos
alvarogaldos@alumni.usp.br
INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO - II

IMUNOFLUORESCÊNCIA
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

➢ A imunofluorescência permite a detecção e localização de


antígenos em células e tecidos utilizando anticorpos
específicos, marcados com fluorocromos, de modo que a
localização dos antígenos se torna visível ao microscópio de
fluorescência.

➢ De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e


localizar anticorpos em fluidos biológicos usando seu antígeno
correspondente.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

➢ Baseia-se na capacidade das moléculas de


anticorpo se ligarem covalentemente a
fluorocromos sem perder sua reatividade específica
com o antígeno.

➢ Teste qualitativo/semi-quantitativo.

➢ Método de alta sensibilidade e alta especificidade.


CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
FLUOROCROMOS
➢ Nos testes de imunofluorescência são empregados conjugados
constituídos de anticorpos ligados covalentemente a moléculas
reveladoras denominadas fluorocromos.

➢ 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com


fluorocromos.

➢ Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta


(radiação) e emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
FLUOROCROMOS

➢ São utilizados vários fluorocromos diferentes nos


laboratórios clínicos para imunofluorescência.

➢ Isotionato de fluoresceína e compostos da


rodamina são os fluorocromos mais usados para
conjugação com anticorpos para torná-los
fluorescentes sob condições adequadas de iluminação.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
FLUOROCROMOS
➢ Isotionato de fluoresceína (FITC)
Pico de absorção de 490 nm e de emissão de 520 nm.

➢ Compostos de Rodamina (Fluoronas) – (IFD)


São Rodamina 6G e Rodamina B. Elas são usadas como corantes, como corantes
laser e como meio amplificador. Os corantes de rodamina fluoresce e pode ser
medido facilmente e a baixo custo com instrumentos chamados fluorímetro. Os
corantes do tipo Rodamina são usados extensivamente em aplicações
biotecnológicas tais como a microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e
os testes do tipo ELISA.

• O microscópio utilizado para a leitura de IFD pode ser de epiluminescência ou


confocal.
CARACTERÍSTICAS
BÁSICAS
MICROSCÓPIO DE
EPIFLUORESCÊNCIA
• A reação imunofluorescente que é
desencadeada no microscópio de
epifluorescência ocorre através da
emissão de luz de cor quando o
fóton é excitado por luz de curto
comprimento de onda (UV).
• Para deixar passar somente a
emissão secundária desejada,
devem-se utilizar filtros
apropriados dependendo da cor do
fluorocromo.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

TIPOS DE REAÇÃO:

Detecção de Ag Detecção de Ag Detecção de Ac

DIRETA INDIRETA
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)
• Os primórdios da
imunofluorescência direta
(IFD) datam de 1942, quando
Albert Coons e colaboradores
demonstraram a marcação de
anticorpos anti-pneumococos
A imunofluorescência direta é o padrão
com fluoresceína no tecido ouro para estudo das glomerulopatias e
outras doenças de imunodepósitos
pulmonar. (Síndrome de Sjogren).
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)

➢ Pesquisa-se um antígeno em uma reação com


anticorpo preparado com o fluorocromo (conjugado).

➢ Para este tipo de reação são utilizados anticorpos


purificados específicos para um determinado
antígeno ou grupo de antígenos conjugados com
um fluorocromo.
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)

Y Y • O anticorpo específico
Y Y Y Y marcado com Fluorocromo
(conjugado) é adicionado e se
fixa ao antígeno, formando
um imunocomplexo estável.

• O anticorpo não ligado é


removido por lavagens.

Antígeno • O preparado é observado em


pesquisado microscópio de fluorescência.
Y Conjugado
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)

VANTAGENS
➢ Alta especificidade e sensibilidade.
➢ Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de
sua localização.
DESVANTAGENS
➢ Alto custo do microscópio de fluorescência.
➢ Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se
deseja identificar ou localizar.
➢ Subjetividade da leitura.
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)

APLICAÇÕES
➢ Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina,
nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na
fenotipagem de células tumorais.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

Reação de Imunofluorescência Indireta utilizando-se antígeno de formas


amastigotas de Leishmania infantum chagasi. (A) Amostra não reagente; (B)
Amostra reagente.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

• Também conhecida como técnica de dupla camada é realizada por


antígenos fixados em uma lâmina, onde se aplica primeiro um anticorpo
específico não fluorescente.

• E por último coloca-se um anticorpo fluorescente com


especificidade marcada contra determinantes antigênicos do primeiro
anticorpo utilizado para reagir com o antígeno.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOS
Y Y Y Y ➢ Incuba-se a célula ou tecido em que se
Y Y Y Y quer pesquisar o antígeno com o anticorpo
Y Y específico, levando à formação de um
imunocomplexo.
➢ Realiza-se lavagem para retirada do
anticorpo não ligante excedente.
Antígeno ➢ A preparação é incubada com um
pesquisado conjugado antiimunoglobulina, marcado
Y Conjugado com fluorocromo.
Y ➢ O preparado é observado em microscópio
Anticorpo de fluorescência.
Monoclonal
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS
Y Y Y Y ➢ Antígenos padronizados são fixados a
Y Y Y Y lâminas de vidro.
Y Y ➢ O soro do paciente é diluído, colocado
sobre o antígeno e incubado para permitir a
formação do complexo antígeno-anticorpo.
➢ Realizam-se lavagens para a retirada dos
anticorpos não ligados.
Antígeno
padronizado ➢ A preparação é incubada com o conjugado
Y Conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro,
o conjugado reage com o anticorpo
Y Anticorpo
específico para o antígeno.
pesquisado
➢ Observa-se o preparado em microscópio de
fluorescência.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

VANTAGENS
➢ Sensibilidade
➢ Especificidade
➢ Reprodutibilidade
➢ De simples padronização e execução
➢ O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes
➢ Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados
conjugados específicos

DESVANTAGENS
➢ Necessidade de microscópio de fluorescência
➢ Subjetividade na leitura
➢ Não-automação
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
APLICAÇÕES
➢ Diagnóstico sorológico de várias doenças
infecciosas como a Doença de Chagas, a sífilis, a
SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças
auto-imunes.
IMUNOFLUORESCÊNCIA
➢ As técnicas de imunofluorescência ainda são empregadas na
rotina laboratorial, mas estão sendo gradativamente
substituídas por testes imunoenzimáticos, principalmente
devido à necessidade de microscopia, subjetividade de leitura
e impossibilidade de automação.
IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA
PRINCÍPIO
➢ A quimioluminescência foi descrita pela primeira vez em 1888 por
Eilhard Wiedeman.
➢ Energia luminosa a partir de uma reação química.
➢ Energia química gerada através de dissociação de ligações fracas.
➢ Imunoquimioluminescência quantifica Ag e Ac presentes no soro.
➢ A técnica se baseia na ligação de antígeno – anticorpo. Um dos dois
reagentes é conjugado a uma substância que, quando ativada, emite
luz visível. Então, a emissão de luz é proporcional ao reagente
pesquisado.

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CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

• Método imunológico baseado na emissão de energia luminosa a


partir de uma reação química.

• Quantifica antígeno ou anticorpo presente em fluidos corporais.

• Muito usado para dosagens de hormônios, marcadores tumorais


e outras proteínas séricas.

• Um dos métodos de escolha para substituir o radioimunoensaio.


COMPOSTOS QUIMIOLUMINESCENTES USADOS

➢ Derivados de Luminol
• Necessita de um catalisador.
• Apresenta uma série de interferências de fundo ao emitir sua
luz.
• Reação lenta e gradual.
• Dependente de pH
COMPOSTOS QUIMIOLUMINESCENTES USADOS

➢ Ésteres de Acridina
• Não requer um catalisador.
• Baixas interferências de fundo
• Muito estável, grande vida média
• Alto rendimento – linear.
• Tempo de reação rápido – medição mais fácil
• A conjugação não limita o rendimento.
• Alta sensibilidade.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

➢ A técnica se baseia na ligação de antígeno –


anticorpo. Um dos dois reagentes é conjugado a
uma substância que, quando ativada, emite luz
visível. Então, a emissão de luz é proporcional ao
reagente pesquisado.
PASSOS DA TÉCNICA
➢ Uma microesfera de poliestireno é revestida
com anticorpo monoclonal contra antígeno
analisado
➢ Adição do soro do paciente, que é incubado
com agitação intermitente.
Y ➢ Lavagem para retirada do antígeno não fixado
Y ➢ Adição de anticorpo monoclonal específico
para o antígeno pesquisado conjugado a
enzima.
Y ➢ Incubação do conjugado e mais uma
lavagem para tirar o anticorpo não fixado
Y
➢ Adição do substrato da enzima, em
seguida, incubação.
Y ➢ A adição de substrato quimioluminescente
Conjugado Y Anticorpo sofre hidrólise na presença da enzima,
monoclonal
Antígeno do soro produzindo substâncias instáveis que geram
Substrat
do paciente
o emissão de fótons (luz).
PASSOS DA TÉCNICA
➢ Estes fótons são medidos través de um
fotomultiplicador (PMT) que tem a
função de transformar a luz emitida
pelos fótons em impulsos elétricos.

➢ ESTES IMPULSOS SÃO


LIDOS EM “CONTAGENS”
DE LUZ POR SEGUNDO
(CPS). ESSA UNIDADE É
PROPORCIONAL A
QUANTIDADE DE
ANTÍGENOS PRESENTES
NA AMOSTRA.
• Os imunoensaios de quimioluminescência são realizados em
aparelhos automatizados, onde todo o processo é guiado por
computadores.

“Elecsys 1010”da “Roche”


“Access”, da “Sanofi-Winthrop”

“Immulite”, da “DPC” “ACS 180”, da “Ciba-Corning”


UTILIZADO EM:

➢ Doenças infecciosas bacterianas : Leptospira, Clostridium


botulinium,

➢ Doenças virais: Citomegalovírus, Herpes simples, rubéola, HIV,


hepatite B e C (vírus,anticorpos ou antígenos virais).

➢ Parasitarias: Chagas, Toxoplasmose, Esquistossomose.

➢ Marcadores tumorais

➢ Dosagem de hormônios (LH, FSH)

➢ Dosagem de IgE total: para alérgenos.

➢ Homocisteina (doenças cardiovasculares) 31


VANTAGENS
Rapidez
✓Automatizado e rápido
Maior sensibilidade
✓Elevada sensibilidade e especificidade
Eficiência
✓Emprego de pequenas quantidades de reagentes
✓Várias amostras podem ser analisados e distintas moléculas
podem ser quantificadas de uma só vez.
✓Reagentes não-perigosos

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RADIOIMUNOENSAIO (RIA)

➢ Primeira técnica a ser desenvolvida para dosagem hormonal e de


outras substâncias presentes em pequenas concentrações em fluídos
biológicos, sendo um método muito sensível para análise
quantitativa antígeno-anticorpo.
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)

➢ O princípio e as modalidades são os mesmos dos outros ensaios acima


mencionados – a diferença está na substância indicadora de reação,
que neste caso é um isótopo radioativo e em geral se utiliza o 125I.

➢ LIMITAÇÕES DO RADIOIMUNOENSAIO:
• envolve material radioativo.
• a validade desse reagente reativo é curta.
• demora na execução do teste.
IMUNOFLUORIMETRIA

• Este método é muito utilizado para dosagens de proteínas séricas, hormônios,


marcadores tumorais, anticorpos específicos para alérgenos etc.
• O teste é basicamente automatizado.
• O resultado baseia-se na fluorescência emitida, mensurada pelo fluorômetro.
• A fluorescência emitida é intensa, porém pouco duradoura.
• Utiliza-se Ac ou Ag conjugado com um fluorocromo.
• Fluorocromos como fluoresceína e rodamina podem ser utilizados,
entretanto lantanídeos como o Európio são os mais usados.
• Os tipos mais utilizados são: competição e sanduíche.
• Pode detectar 10-12 a 10-16 g.
IMUNOFLUORIMETRIA (Sanduiche / Eu)

+ Ag
+ -Eu

Fase Sólida contendo Ac Padrão, controle Ac monoclonal marcado


-Eu
monoclonal contra Ag e amostra com Eu, contra um outro
epítopo do Ag

+ + Eu

-Eu
Incubação Solução de amplificação: dissocia
os ions európio do Ac marcado na Os ensaios do tipo apresentado
solução, e com eles forma a seguir, se baseiam na poten-
estruturas fluorescentes
cialização da emissão de luz vi-
sível, a partir da dissociação
de lantanídeos.
REFERÊNCIAS
VAZ, A. J. Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. 2. Ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2018, 416 p.
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. IMUNOLOGIA: Celular e Molecular. 8.
Ed. Rio de Janeiro: ELSEVIER, 2018, 549 p.
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