Você está na página 1de 32

INTERAÇÕES ANTÍGENO-

ANTICORPO - III
Prof. Dr. Alvaro Galdos
alvarogaldos@alumni.usp.br
POR QUE REALIZAR TESTES DIAGNÓSTICOS?

Sinais clínicos
semelhantes
(diferentes agentes)

Descobrir
incidência e
prevalência do
agente
Adoção de medidas
preventivas e
estratégias de
manejo
IMUNOCROMATOGRAFIA
• A imunocromatografia é uma técnica
que começou a ser desenvolvida nos anos
60, sendo primeiro criada para o estudo
das proteínas séricas;

• Chamado de Testes rápidos (remotos).

• Atualmente para a detecção de muitas


doenças infecciosas: Dengue, malária,
amebíase, peste bubônica, brucelose,
giardíase, Leishmaniose visceral,
Hepatite B, Infecção por HIV, Cinomose,
Parvovirose, Helicobacter pylori,
Streptococcus pneumoniae, entre outras.

• De grande valor em situações nas quais


os profissionais de saúde necessitem
tomar decisões e assumir condutas https://mustaqbalweb.com/article
imediatas.
IMUNOCROMATOGRAFIA
• Alguns deles, como de determinação da glicemia (glicosímetros) (A), usam métodos
enzimáticos químicos; outros são imunológicos, como o teste de gravidez (B). Ambos
estão disponíveis comercialmente em farmácias e drogarias e são de uso fácil.
• Em ambiente extra-laboratorial, além dos glicosímetros e teste de gravidez, há vários
testes em uso por médicos e profissionais da enfermagem, como aqueles para pesquisa de
anticorpos anti-HIV (C), detecção de elevados níveis de troponina (D), entre outros.
http://womenshealthbrasil.com.br/mulher-e-viciada-em-fazer-teste-de-gravidez/

A B C D https://www.sabres
afety.com.br

https://tenhodiabetestipo1eagora.blogspot.com/2015/04/freestyle-optium-neo-e-os-glicosimetros.html https://egenschina.en.made-in-china.com/product/ZowmWbpDbElf/China-Anti-HIV-1-2-
Antigen-Test-Kit-Cassette-.html
CARACTERÍSTICAS

• Qualitativos

• Teste de triagem

• Rápido

• Econômico

• Fácil interpretação

• Leitura é feita a olho nu


PRINCÍPIO
• Utilizada uma matriz de membrana de nitrocelulose ligada a uma tira de
acetato transparente

• Para detectar antígeno, emprega-se um anticorpo de captura, ligado à matriz e


um anticorpo marcado específico ao antígeno pesquisado

• Para detectar anticorpo, utiliza-se um antígeno específico ligado à matriz e um


anticorpo anti-imunoglobulina marcado
PRINCÍPIO - ESPECIFICAÇÃO
• Para detecção de antígenos podem ser utilizados anticorpos
fixados na linha de captura e como conjugado um segundo
anticorpo conjugado ao corante. Um dos métodos imunológicos
desses testes emprega corante insolúvel, como ouro coloidal
(róseo) ou prata coloidal (azul marinho) como revelador da
interação antígeno-anticorpo.
INTERPRETAÇÃO

NEGATIVO: Apenas
uma linha é visível na
região controle (C),
não sendo observada
linha na região teste.

POSITIVO: Duas linhas são visíveis, INVÁLIDO: Não é evidenciada a


sendo uma linha na região controle (C) linha controle (C). As razões mais
e outra na região teste (T). A comuns de falha são o volume
intensidade de cor da linha teste (T) insuficiente de amostra ou falha
poderá variar de acordo com a no procedimento técnico. Neste
concentração presente na amostra. caso, reler a técnica e repetir o
Todavia, qualquer intensidade de cor na teste com uma nova tira.
linha teste indica resultado positivo.
ELISA: (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
https://usa.exportersindia.com/reagen-llc-moorestown/dimetridazole-elisa-test-kit-
moorestown-united-states-862025.htm
ELISA
• O imunoensaio enzimático (ELISA, enzyme-linked
immunosorbent assay) foi desenvolvido nos anos de
1970 e muito difundido comercialmente a partir de
1985, com o ensaio para anticorpos anti-HIV (à época,
chamado de anti-HTLV III).
ELISA
❑ É o ensaio mais comumente empregado nos
laboratórios
❑ Baseia-se na imobilização de um dos componentes,
antígeno ou anticorpo, em fase sólida, e na utilização
de um conjugado, que também pode ser antígeno ou
imunoglobulina, ligado a uma enzima, com a
preservação da atividade enzimática e imunológica.
❑ Como o substrato forma um produto colorido, a
alteração de cor é monitorada visualmente ou por meio
de espectrofotômetro, que determina a relação entre a
intensidade da cor e a quantidade do que está sendo
analisado na amostra.
O ELISA APRESENTA
• Elevada sensibilidade e especificidade

• Rapidez e custo baixo

• Objetividade de leitura

• Possibilidade de adaptação a diferentes graus de


automação.
O ELISA APRESENTA
• Sua eficiência depende da padronização
adequada de cada uma das etapas e reagentes
como:
• Concentração ideal de cada um dos
componentes,
• Tempo de incubação,
• Concentração iônica, proteica
• pH do meio.
ELISA
• Teste de ligação primária

• ELISA indireto
DETECÇÃO DE ANTICORPOS (Ac)
• ELISA competitivo

• ELISA sanduíche (de captura) DETECÇÃO DE ANTÍGENOS (Ag)


• ELISA competitivo (quantitativo)
Etapas ELISA
1. Diluição do soro sanguíneo
2. Incubação
3. Lavagem
4. Anticorpo conjugado à enzima
5. Incubação
COR
6. Lavagem
7. Substrato
8. Incubação
9. Solução de parada
10. 10. Leitura
ELISA - COMPONENTES
• Fase sólida ou suporte
• Amostra
• Bloqueio
• Diluente da amostra
• Solução de lavagem
• Conjugados
• Substratos: cromogênicos, fluorigênicos e quimiluminescentes (Qualitativa-visual e
Quantitativa-espectrofotometria).
• Antígeno
• Anticorpos
• Resultados
2 Enzyme-linked Ab

Serum Ab

Antigen
ELISA - COMPONENTES
FASE SÓLIDA OU SUPORTE (Liga antígeno ou
anticorpo).
• Agarose
• Poliacrilamida
• Dextran
• Poliestireno e outros.
ELISA - COMPONENTES
Amostra – Soro ou plasma deve ser bem processada (↓
variação = ↑D. O.)
• Deve ser límpida
• Sem hemólise
• Não-lipêmica
• Conservação por até 7 dias (2 e 8°C ou congelada a
20°C).
ELISA - COMPONENTES
Conjugados - Podem ser definidos como moléculas de antígenos ou anticorpos ligados
covalentemente à enzima, de modo a conservar as duas funções das duas moléculas
conjugadas: atividade enzimática da enzima e antigenicidade do antígeno ou
especificidade da imunoglobulina. Contudo, é preciso considerar que a definição de
conjugado é mais ampla: duas moléculas covalentemente ligadas e que preservam suas
funções originais.

O desempenho do conjugado é influenciado pelo método de conjugação, diluentes


empregados e condições de armazenamento. A quantidade ideal do conjugado no teste
deve ser determinada para cada lote e cada sistema de ensaio.
ELISA - COMPONENTES
Exemplos de conjugados:
• Proteína A conjugada com peroxidase. A proteína A é derivada
de parede bacteriana (Staphylococcus aureus) e apresenta elevada
afinidade pela região Fc da IgG humana. Assim, o conjugado irá
se ligar à IgG com atividade de peroxidase para formar produto
colorido a partir do substrato cromogênico
• Streptavidina-peroxidase. A streptavidina tem afinidade por
biotina e irá se ligar a um outro conjugado, por exemplo, hCG-
biotina. Ou seja, dois conjugados diferentes são usados no
sistema
• Anti-IgG conjugado a corante coloidal. Os corantes coloidais
são insolúveis em meio aquoso e formam manchas coloridas
(formado de linhas) na fase sólida onde são capturados.
ELISA - COMPONENTES
Substratos cromogênicos:
• Sob ação enzimática, originam produtos coloridos, solúveis ou
insolúveis, cuja quantificação é feita pela medida da densidade óptica
da solução em espectrofotômetro, ou pela intensidade de cor visual, ou
comparada a algum padrão de referência.
• O substrato utilizado para a enzima peroxidase é o H2O2, que pode ser
empregado com diversos cromógenos ou doadores de hidrogênio.
• O cromógeno frequentemente empregado é o ortofenilenodiamina
(OPD) ou tetrametilbenzidina (TMB) para obter coloração solúvel
(ELISA), e diaminobenzidina (DAB) ou 4-cloro-1-naftol quando o
sistema requer cor insolúvel (dot-ELISA, immunoblot). A concentração
de H2O2 é uma variável crítica do teste, devido à estabilidade limitada.
Por outro lado, a peroxidase é inibida na presença de excesso de H2O2.
• Para a enzima fosfatase alcalina, o substrato cromogênico solúvel é o p-
nitrofenilfosfato (NPP), e para obtenção de produto insolúvel é
utilizado 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fostafo (BCIP) e nitroblue
tetrazólio (NBT).
ELISA - COMPONENTES

Enzima Substrato Cor


Fosfatase alcalina P-nitrofenil-fosfato (pNPP) Amarelo
Peroxidase ABTS Verde
Peroxidase OPD Laranja
Peroxidase TMB Azul
ELISA - COMPONENTES
Substratos fluorigênicos:
• alguns testes imunoenzimáticos utilizam substratos que,
após ação da enzima, formam compostos que emitem
luz fluorescente.
• Para a enzima fosfatase alcalina, é muito utilizada a
solução de 4-metilumbelilferil-fosfato, que após
clivagem enzimática forma 4-metilumbeliferona,
absorvendo luz a 365 nm e emitindo a 448 nm.
• O produto formado é chamado de fluoróforo e a luz
emitida é detectada por um fluorômetro.
ELISA - COMPONENTES
Substratos quimioluminescente:
• Para ensaios imunoenzimáticos que necessitem de
amplificação do sinal (determinação de hormônios,
marcadores tumorais), uma opção é o uso de
quimiluminescência sistema de revelação.
• Por exemplo, a enzima fosfatase alcalina age sobre o
substrato adamantildioexietano-fosfato, formando o
ânion adamantildioxietano, que é instável, emite brilho
(glow) prolongado de luz e pode ser mensurado por um
luminômetro.
ELISA - COMPONENTES
ANTÍGENOS
Conjugados ou não à enzima, podem ser
naturais, extratos brutos ou fracionados e
purificados, peptídeos sintéticos ou

https://yournewhere.com/american-moderna-group-expects-to-provide-a-
recombinantes.
O grau de pureza e a acessibilidade dos
epítopos são fatores determinantes na
eficiência do teste.

ANTICORPOS
Conjugados à enzima ou não, podem ser

vaccine-against-covid-19-by-november/
policlonais ou monoclonais, totais ou
purificados. Também podem ser
empregados fragmentos ou frações de
imunoglobulinas. A marcação da
imunoglobulina com enzima é facilitada
pela presença de resíduos de açúcar na
fração Fc de imunoglobulinas
USO DIAGNÓSTICO
• Identificar se o paciente está com a doença:
• Presença do patógeno - Ag
• Título do mesmo

• Determinar se o paciente tem Ac:


• Teve a doença (IgM, IgG ou IgA)
• Se está protegido:
• Título de anticorpos (vacina ou exposição)
REFERÊNCIAS
VAZ, A. J. Imunoensaios: Fundamentos e aplicações. 2. Ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2018, 416 p.
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. IMUNOLOGIA: Celular e
Molecular. 8. Ed. Rio de Janeiro: ELSEVIER, 2018, 549 p.
Acessa aqui → Alvaro Galdos - YouTube