Metodologia HPLC

Fases móveis acetonitrila: água acidificada (com ácido acético a pH 4,18) em

proporções iniciais de 25:75, variando-se até 70:30, com retorno a proporção inicial
após 42 minutos em fluxo de 1 mL/min, conforme Quadro 1. Os solventes utilizados
foram grau HPLC, filtrados a vácuo com membrana de celulose regenerada 47 mm
de diâmetro e 0,45 μm de porosidade e degaseificados em ultrassom. O software LC
Solution® foi utilizado para registrar os cromatogramas e medir as áreas dos picos. Na
escolha da melhor condição de análise foram avaliados os tempos de retenção, fator
de retenção, simetria dos picos e resolução cromatográfica. A separação dos
fitoconstituintes foi executada em uma coluna de fase reversa C18 Kinetex (150 X 4,6
mm X 2,6 µm) da Phenomenex® com temperatura de 35°C.
Como marcadores químicos foram utilizados os compostos cumaroil, drimanial e
metoxi analisados em comprimento de onda de 310 nm e o poligodial analisado em
232 nm por apresentarem máxima absorção nestes comprimentos de onda. Os
padrões utilizados foram previamente isolados das cascas de D. brasiliensis
Quadro 1: Análise em CLAE: Gradiente 3
Tempo (min.) Fluxo %A %B
(mL/min)
0,00 1,00 75 25
5,00 1,00 65 35
40,00 1,00 30 70
42,00 1,00 75 25
45,00 1,00 75 25
A: Água acidificada com ácido acético – pH 4,18; B: Acetonitrila
Preparo das soluções para análise
As soluções foram preparadas a partir de 2 mg dos extratos e solubilizadas em 1 mL
de mistura de acetonitrila: água (acidificada com ácido acético a pH 4,18 na proporção
de 8:2. Cada amostra foi filtrada em membrana de PTFE modificada de 0,45 µm e
transferidas para viais (1,5 mL) para posteriores análises por CLAE