Clonagem por

Transferência Nuclear

Profa. Gabrielle Sant’ Anna Vieira Cambraia

 CLONAGEM
O que são clones???

Klón: broto

* Produção de indivíduos geneticamente idênticos;

 Clonagem

Naturalmente
➢ Reprodução Assexuada
➢ Divisão Celular por Mitose
➢ Gêmeos Monozigóticos

Artificialmente

➢ Bipartição de Embriões
➢ Transferência de Núcleo
CLONAGEM POR BIPARTIÇÃO EMBRIONÁRIA

Bipartição: um indivíduo divide-se em dois com

dimensões sensivelmente iguais, desenvolvendo-se a
partir de cada fragmento dois seres.

Fonte: EMBRAPA
CLONAGEM POR BIPARTIÇÃO EMBRIONÁRIA

1os Animais nascidos pela técnica na

América Latina (1987).

Fonte: EMBRAPA
CLONAGEM POR BIPARTIÇÃO EMBRIONÁRIA

Branca e Neve

Fonte: EMBRAPA
 Transferência de Núcleo

➢ Transferência Nuclear Embrionária

substituição da cromatina de um óvulo maturado, ou

seja , no estádio que ele estaria apto a ser fecundado,
pelo núcleo de uma célula retirada do animal a ser
clonado
 Transferência de Núcleo

➢ Transferência Nuclear Embrionária

Embrião ou
Células Tronco-embrionárias

➢ Transferência Nuclear Somática

Células
Somáticas

Conhecimento do
fenótipo e genótipo Fetais
 Transferência de Núcleo
• Etapas:

– Obtenção de citoplasma de ovócitos;

– Obtenção de células doadoras de núcleo;

– Fusão das duas partes;

– Desenvolvimento embrionário in vitro;

– Transferência para receptoras.

 Ovócitos Multiplicar as
recuperados células no
de abatedouro Amostra de laboratório
tecido de animal
superior. Ex. pele

Cultura de tecidos
Remoção Célula doadora
do núcleo de núcleo

Retirar células da cultura

Citoplasma Transferência para

receptor receptoras

MIcroinjeção
funde as
duas partes Alguns se
Novo desenvolvem
embrião
 Transferência de Núcleo

Preparação dos ovócitos receptores

Aspiração ou Abatedouro

Ovócitos imaturos
(cumulus compacto) Extrusão do 1ºCP.
18 horas de
maturação
Reorganização em
Ovócitos maduros número, tamanho e
(cumulus expandido)
posição das organelas.
Meiose II
Remoção do cumulus
 Transferência de Núcleo

Etapa 1: Enucleação do ovócito maduro desnudo

- Micromanipuladores (comum);

OVÓCITOS
- Tratados com citocalasina para
facilitar a penetração na Zona
Ovócito Maduro Pelúcida
desnudo
- Corados com Hoechst para
visualizar o DNA.
Citocalasina
15% citosol adjacente ao 1º CP
Fluorocromo específico para DNA
(Hoechst- corante de DNA) + UV.

-Ovócitos bovinos maturados a placa metafásica

(DNA) foi achada adjacente ao 1º corpúsculo
polar
 Transferência de Núcleo

Etapa 2: Preparação da Célula Doadora

Células Embrionárias

Células Somáticas
Célula
somática
adulta
Coordenação do ciclo celular
entre ovócito e núcleo.

Ovócito Maduro com

célula em G0
Reconstrução
 Reprogramação epigenética
» Cada gameta possui a sua marca epigenética, e após a fecundação
é necessário que ocorra uma reprogramação no genoma do zigoto,
para que essas sejam apagadas e estabelecido um padrão
embrionário (Surani, 2001).

(Surani, 2001).

» Ainda não está claro como o oócito reconhece e reprograma o

padrão de metilação de uma célula diferenciada (Fairburn et al., 2002).
 Transferência de Núcleo

Etapa 3: Reconstrução Embrionária

Eletrofusão
- Uso de pulsos elétricos para que a célula se
fusione com o citoplasma do ovócito e inicie as
divisões celulares

Fisiologicamente, no caso da fecundação, o espermatozoide

ao penetrar no óvulo, induz a degradação do MPF (Fator
promotor de maturação) desencadeando assim o fim da
meiose e inicio do desenvolvimento embrionário. No
entanto artificialmente a ativação dos oocitos se baseia na
indução de oscilações de cálcio (SWAN & OZIL, 1994).
Em bovinos a eletrofusão é o método mais usado.
 CONDIÇÕES:
-↓condutância elétrica
-Relação núcleo/citoplasma

-
O ovócito provoca a reprogramação nuclear.

Tempo de contato entre o núcleo e o citoplasma

(reprogramação)
 QUÍMICOS

-Ionomicina (Cálcio ionóforo);

-Etanol 7%;

Usado para iniciar a primeira divisão celular

 Cultivo por 7-8 dias.

• Estufa
Embrião clonado pode eclodir com D6
• Após 7 dias de cultivo na estufa o embrião
pode ser transferido para uma receptora
Transferência de Núcleo
 Histórico da Transferência Nuclear

➢ Wilmut et al (1997):
 Histórico
• 1981- Camundongos clonado com células
embrionárias;
• 1986 – Ovino com células embrionárias;
• 1987 – Bovino com células embrionárias;
• 1997 –Dolly – 1º. Mamífero clonado com
células somáticas;
 Dolly
Fev/1997

Reprogramação de
células somáticas
 A ovelha Dolly permanece empalhada no
Royal Museum of Scotland, em Edinburgh.
 Brasil
• Primeiro clone da América Latina
• primeiro clone a partir de célula
embrionária
• Vaca simental Vitória em 17 de março de
2001.
• Gerou 2 filhos.
• Morreu em 2011.
 Histórico no Brasil
• 2001- Vitória (bovino) clonado na
EMBRAPA;
• 2004- Glória- 1ª. filha de um clone na
America Latina , Glória da Embrapa;
• 2006 - nasceu Galante 2º.filho de Vitória
• 2003- nasceu Lenda, 1º.clone de células da
granulosa);
• 2007- Nasceu Fábula filha da Lenda.
• 2005- Potirã e Porã- raça Junqueira.
Vitória e
Glória

Fonte: EMBRAPA
PORÃ E POTIRA DA EMBRAPA

Fonte: EMBRAPA
 BRASIL
• No dia 27 de abril de 2002, em Monte-Mor – SP
• nasceu o primeiro clone a partir de célula
diferenciada jovem (fetais) , o Marcolino da USP
 BRASIL
• julho de 2002, em Jaboticabal- SP, nasceu o primeiro
clone a partir de célula diferenciada adulta, a Penta.
 LENDA DA EMBRAPA

T. Melo Lenda
Lenda da Embrapa

Fonte: EMBRAPA
LENDA DA EMBRAPA

Fonte: EMBRAPA
• 2013 - Primeiro clone produzido com
células do tronco do tecido adiposo –
Embrapa Brasília.
 MINISTRA

Lactação oficial de 8.166 quilos de leite em

305 dias na primeira lactação, vendida 50%
em 2010, no leilão da Jasdan, por R$ 160 mil

Fonte: CENATTE
Embriões
CLONE DE MINISTRA

Fonte: CENATTE
Embriões
DIVISA DA MATA VELHA

Fonte: GENEAL
 CLONE DE DIVISA DA MATA VELHA

Primeiro clone registrado pela ABCZ em

01/12/2009
Fonte: GENEAL
Fonte: In vitro
Brasil
Fonte: In vitro
Brasil
Fonte: In vitro
Brasil
 BRASIL

• 2012, nasce o primeiro clone equino no Brasil

• Turbante JO – MM
• realizado pela empresa In Vitro do Brasil na cidade
de Mogi Mirim
• seu material genético esteve guardado durante 15
anos
 Consequências da Transferência Nuclear
➢ Problemas de Viabilidade Embrionária, Fetal e
Neonatal.
-Baixa taxa de implantação embrionária;
↓ secreção de Interferon-tau
-Placentação anormal (todos os clones);
crescimento inapropriado da membrana alantóide.
↓produção de P4 pela placenta
- Desenvolvimento de fetos acima do peso;
- Morte neonatal;
problemas respiratórios ( cortisol fetal).
infecções constantes – deficiência imunológica.
- Umbigo grande ;
 Aplicações da Transferência Nuclear

➢ Clonagem Reprodutiva
- Animais geneticamente superiores e
de interesse comercial

- Espécies ameaçadas de extinção

- Animais transgênicos

- geração de células ou tecidos para fins

terapêuticos
 Aplicações da TN

• Experimentação animal
(Lamberson, 1994)

• Restauração de espécies em extinção (Gómez et al., 2006)

 2002/ Clones da porca Gaur (Bos gaurus) – citoplasma Bos taurus
Princess- a última fêmea TN Interespécie – 200 dias gestação
da linhagem de
Gloucestershire dos USA
 Eficiência
» Sucesso da técnica - Ovelha Dolly (Wilmut et al., 1997).

» Baixa eficiência
» 5% clonagem x 40% FIV (Wang et al., 2011)
» 4 a 8% de bezerros vivos aos 150 dias (Akagi et al., 2013)
 Tipos celulares

» Menos de 5% testados como doadores de núcleo (Oback e Wells, 2002)

» Não se conhece quais os tipos celulares mais bem sucedidos na TN

(Kato et al., 2000)

» Fibroblastos são o tipo celular mais usado na TN

 Melhoramento Genético

• Animais de alto valor clonados não

necessariamente terão o mesmo
desempenho.
• A influência do meio e do treinamento é
fundamental.
• Idaho Gem e Idaho Star, que competiram
numa importante corrida de mulas
chegando em terceiro e sétimo lugares,
respectivamente.
 Melhoramento Genético
• A clonagem deve ser usada para clonar
alguns animais superiores.
• Não deve ser usada como única ferramenta
pois diminui a diversidade genética.
• Deve ser associada com outras
biotecnologias para promover
melhoramento genético.
 Clonagem por Transferência de Núcleo

➢ Considerações Finais
-Produção de animais geneticamente superiores

-Necessita de mais estudos para ser eficaz.

CORDÃO UMBILICAL

Fonte: EMBRAPA
CORDÃO UMBILICAL

Fonte: Pivato,
2011
CORDÃO UMBILICAL

Fonte: Pivato,
2011
CORDÃO UMBILICAL

Fonte: Pivato,
2011
RECEPTORA COM HIDROPSIA

Fonte: EMBRAPA
RECEPTORA COM HIDROPSIA

Fonte: Pivato,
2011
RECEPTORA COM HIDROPSIA

Fonte: Pivato,
2011
PLACENTOMAS

Fonte: EMBRAPA
PLACENTOMAS

Fonte: Pivato,
2011
PLACENTOMAS

Fonte: Pivato,
2011
PLACENTOMAS

Fonte: Pivato,
2011
Síndrome do bezerro gigante