Cromatografia Gasosa e

Cromatografia Líquida

Prof. Aloísio J.B. Cotta

e-mail:
acotta@ceunes.ufes.br
http://www.ceunes.ufes.br/conteudo.asp?cod=1858

CAP. 31 e 32 do SKOOG.
 • Cromatografia Gasosa (CG) (Cap. 31)

Na CG, os componentes
voláteis de uma amostra são
separados dada sua partição
entre uma FM gasosa e uma
detector
FE líquida (ou sólida) contida
dentro da coluna. injetor

coluna

forno

sinal
Reservatório de gás tempo
 Quanto maior a solubilidade de um constituinte na FE,
mais lentamente ele caminha pela coluna.
As substâncias separadas saem da coluna dissolvidas
no gás de arraste e passam pelo detector gerando um sinal
elétrico proporcional à quantidade de material eluido.
• Cromatografia Gasosa (CG)
• Na FM não interage com as moléculas do
analito; sua única função é transportar o analito
através da coluna.
• cromatografia gás-líquido (CGL), princípio
partição entre a FM, gás, e FE, líquida,
imobilizada na superfície de partículas inertes
(recheio) ou nas paredes da coluna.
• cromatografia gás-sólido (CGS), princípio
adsorção, é restrita a separação de moléculas
de baixo MM, dificuldade dada a retenção
irreversível de moléculas polares na FE.
• Sistema de Gás de Arraste
A fase móvel em CG é denominada gás de
arraste (He, Ar, H2, N2) e deve ser
quimicamente inerte

vazões de 25 a
150 mL/min em
colunas
recheadas e de 1
a 25 mL/min
para as colunas
capilares
INSTRUMENTOS CG (Gás - Liq)
Sistema de Injeção da Amostra
Um divisor de amostra é
necessário com colunas capilares.
Uma pequena fração conhecida
(1:100 a 1:500) do volume injetado,
segue para coluna o restante é
descartado.
 Sistema de Injeção da Amostra
• A amostra deve ter tamanho adequado
e ser introduzida rapidamente. Injeção
lenta ou amostras muito volumosas
causa o espalhamento das bandas e
perda de resolução.
• O injetor é mantido 50º C acima do
ponto de ebulição do componente
menos volátil da amostra.
• Colunas recheadas Vamostra <20μL
• Colunas capilares Vamostra <1μL
Colunas e Forno de aquecimento
• colunas recheadas, mto usadas no passado,
constituída de um filme fino de líquido retido por
adsorção na superfície de pequenas partículas.
• Colunas capilares (mais eficientes e mais rápidas),
possuem 2-50 m enroladas em bobinas, são
construídas de aço inoxidável, vidro, sílica fundida ou
Teflon. A FE é um filme de líquido de 0,05-1μm de
espessura que recobre o interior do tubo capilar (com
ou sem revestimento).
• A temperatura da coluna deve ser controlada com
precisão, pois é fundamental para a reprodutibilidade
da separação.
 Fases Estacionárias (FE)
Geralmente, a polaridade da FE deve igualar-se
à dos componentes da amostra. Neste caso, a
ordem de eluição é determinada pelo ponto de
ebulição dos analitos.
 Polidimetilsiloxano, estrutura geral
Menos polar

Mais polar

Essas substituições aumentam a polaridade da FE

A FE é ligada ao suporte p/ aumentar a durabilidade da coluna
 Coluna capilar detector

injetor

Forno
 Isotérmico a 45º C

• Tforno ≈ ponto de
Isotérmico a 145º C ebulição (PE) médio
dos analitos
↑Temperatura = ↓tR

• Analitos com uma

Os + voláteis eluem Programa 30 a 180º C ampla faixa de PE
primeiro usa-se a
Os - voláteis (>PE)
eluem por último
programação de
temperatura, onde a
temperatura da coluna
é aumentada durante
a análise.
• Sistemas de Detecção
Características desejáveis:
• Sensibilidade adequada (10-8 a10-15g soluto).
• Boa estabilidade e reprodutibilidade.
• Resposta linear em várias ordens de grandeza
e não influenciável pela ΔT.
• Resposta rápida e independente da vazão do
gás de arraste.
• Não destruir a amostra.
NÃO EXISTE UM DETECTOR IDEAL!!!
 • Detector de Condutividade Térmica:
O elemento quente perde calor a uma
O elemento aquecido pode velocidade que depende da
ser um fio de Pt, Au ou W.
composição dos gases que o rodeiam.
A perda de calor é usada como
medida da composição do gás.
Quanto menor a molécula (H2, He),
maior a sua velocidade e mais alta
será sua condutividade térmica.
Com a chegada do analito (que
apresenta menor condutividade que a
FM) a composição da FM muda,
assim a taxa de perda de calor varia e
a temperatura do filamento se altera,
gerando o sinal elétrico.
baixa sensibilidade (10-8 g) compostos orgânicos e inorgânicos,
ampla faixa de resposta (105), não destrutivo.
Detector de Condutividade Térmica:

Fluxo de gás de arraste vindo da Fluxo de gás de arraste que não

coluna passou pela coluna, serve para
definir o sinal de base (background).
Detector de Condutividade Térmica:
Análise de compostos sulfurados em efluentes gasosos de refinaria de petróleo

Quím. Nova vol.33 no.4 São Paulo 2010

H2S, COS, SO2, metanotiol (MESH) e metiletilsulfeto (MES)

temperatura de injeção, 150 ºC; temperatura inicial do forno, 45 ºC, por 1 min;
aquecimento 10 ºC min-1; temperatura final, 195 ºC, por 24 min; He (11,3 mL/min)
 • Detector de Ionização em Chama:
É o mais empregado.
sensibilidade alta (10-13 g), O efluente da coluna é
ampla faixa de resposta (107),
desvantagem é destrutivo. queimado numa chama ar/H2
para produção de íons e
elétrons que são coletados.
Coletor de O nº de íons é proporcional ao
íons e nº de C. Assim o detector é
elétrons
(ddp +300V) sensível a massa do composto
e medição da orgânico queimado e não a
corrente
gerada (sinal) ar concentração.
Grupos funcionais como carbonila, álcool,
halogênicos e amínicos produzem poucos ou
H2 nenhum íon. Além disso, é insensível para gases

Coluna não combustíveis H2O, CO2 , SO2 e NOx.

 iso-Butano ou metil propano

Flame ionization detector n-Butano

Detector termiônico

O detector termiônico (similar ao de Ionização em Chama). Nele

os compostos contendo N e P produzem um aumento da corrente
em chamas nas presença de um sal de metal alcalino.
O detector termiônico é amplamente empregado para pesticidas
organofosforados e compostos farmacêuticos.
 • Detector de Captura de Elétrons (ECD):
Responde seletivamente aos
compostos orgânicos contendo
halogênios, como pesticidas e
bifenilas policloradas e a peróxidos,
63Ni
quinonas e grupos nitro.
Uma fonte radiativa emissora-β (63Ni)
causa a ionização do gás de arraste
(N2) com liberação de elétrons,
gerando uma corrente elétrica
constante passando pelo detector. A
corrente decresce na presença de
bifenilas policloradas moléculas orgânicas contendo grupos
eletronegativos que capturam
elétrons.

alta sensibilidade (10-13 g), curta faixa de resposta (102) , não

destrutivo. Insensível a grupos funcionais como aminas, quinona
alcoóis e hidrocarbonetos.
Preparo da amostra
Extração em fase
sólida (AccuBond C18
SPE) seguida de
extração em metanol.
• Espectrometria de Massas (CG-MS):
Detector mais poderoso para CG

O analito na forma de vapor passa por uma fonte de ionização/fragmentação

para produção de íons moleculares, que são extraído para dentro do MS e
separados num quadrupolo.
• O espectro de massas de uma molécula
simples, CO2. Quebrando-se uma ligação C-O,
leva a formação do CO+ (m/z=28) e O+
(m/z=16)

CO2+
etilbenzeno
Aplicações da CGL
• Pode ser aplicada às espécies relativamente voláteis e
termicamente estáveis à temperaturas de até poucas
centenas de ºC.

Testosterona

Alcaloide, codeína,
derivado do ópio.
Análise Quantitativa
• Análise quantitativa baseia-se na comparação da área
de um pico analítico com aquele de um ou mais
padrões.
• Se as condições são controladas adequadamente, os
tempos de retenção (tR) devem ser constantes e
permitir a comparação entre os valores obtidos para
padrões e amostras.
Calibração com Padrões: Concentração Vs Sinal
• O Método do Padrão Interno reduz as incertezas
introduzidas pela injeção da amostra, vazão e
variações nas condições da coluna.
Calcule a concentração na amostra?
 Área (P.I.)
Analito Área (Pico) normalizadora Área (Pico) normalizada

0,00 0,0 0,0

0,05 18,8 50 18,8
0,10 48,1 64,1 37,5
0,15 63,4 55,1 57,5
0,20 63,2 42,7 74
0,25 93,6 53,8 87

Amostra 58,9 49,4 59,6

Área da Amostra normalizada =
Área do Picoamostra(Área do P.I.normalizadora / Area P.I.amostra)
 100
Área = 354,6*Conc (%)
Y = 354,6*X
80
59,6 = 354,6*X
Área do pico

X = 0,17 %
60

40

20

0
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
Concentração

Área (Pico) Área (Pico) normalizada Regressão

Calcule a concentração na amostra?

Área (Pico) normalizada para Amostra = 59,6
 • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CAPÍTULO 32)
Injetor de amostra

Bomba

Coluna
Reservatório de FM

Processamento e Detector
armazenamento de dados
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CAPÍTULO 32)
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é
o tipo mais versátil e mais amplamente
empregado de cromatografia.

É utilizada para separar e determinar espécies em

uma grande variedade de materiais orgânicos,
inorgânicos e biológicos.
A fase móvel (FM) é líquido, no qual os analitos
estão dissolvidos e podem interagir com a FE
(líquida ou sólida).
• Inicialmente, a cromatografia
FM
líquida era realizada em colunas
de vidro.
• As colunas eram recheadas com
FE
partículas sólidas (≈200μm)
recobertas com um líquido
adsorvido, que formava a FE.
Porém, obtinha-se vazões ≈ 0,1 algodão

ml/min....mto lentas.
Reprodução do experimento
de Tswett, separação de um
extrato de folhas de
espinafre por cromatografia
em coluna aberta.

VEJA ANIMAÇÃO:
http://cromatografialiquida.com.br/
• INSTRUMENTAÇÃO
Pressões de bombeamento de dezenas de atm são
requeridas para obter vazões razoáveis com
recheios de 3 a 10 μm.
• Reservatórios de Fase Móvel
Deve-se remover os gases dissolvidos e partículas presentes na
FM.
• Eluição com um único solvente (ou com uma mistura constante
de solventes) é dita isocrática. Na eluição por gradiente dois
ou mais solventes são misturados durante a análise (melhora a
eficiência da separação, assim como a programação de
temperatura o faz na CG).
• Sistemas de Bombeamento
Requisitos:
(1) gerar altas pressões (dezenas de atm);
(2) saída livre de pulsação;
(3) vazões na faixa de 0,1 a 10 mL/min;
(4) reprodutibilidade da vazão de <0,5%;
(5) resistência à corrosão a vários solventes;
INJETOR
• Colunas para CLAE
Geralmente construídas de tubos de aço inoxidável;
Comprimento na faixa de 10-30 cm e possuem
diâmetros internos entre 2-5 mm, recheadas com
partículas (geralmente sílica) de diâmetros 3-10 μm,
recobertas com filme orgânico produzindo com
40.000-60.000 pratos/m.
• Recobrimento da partícula de Sílica p/ CLAE
Cromatografia por partição, a FE é um líquido imiscível na FM líquida.
Sílica

organoclorosilano
Fases quimicamente ligadas
R é geralmente um grupo octil (C8)
ou octadecil (C18) ou outros grupos
funcionais orgânicos para fornecer
polaridades diferentes.

FE apolar
Cromat em fase reversa
• Cromatografia de fase normal
A FE é altamente polar e um solvente não-polar
como FM.
O componente menos polar é eluído primeiro
O aumento da polaridade da FM diminui o tempo de eluição

Na cromatografia de fase
reversa, a FE é não-polar
(hidrocarboneto), e a FM um solvente
relativamente polar (como água,
metanol, acetonitrila, sol. aquosa)
• As substâncias que têm a maior interação
com a FE são retidas por mais tempo e,
por tanto, separadas daquelas de menor
interação.
Ácido málico

Análise de amostras de urina.

 FE apolar
Cromat em fase reversa

Polaridade: 2,7 2,8 0,1

Polaridade: 5,1 3,5 >6

Escolha das FM e FE
• O ajuste da polaridade é a chave das
separações em cromatografia por partição.
• Como regra, a maioria das separações
cromatográficas é realizada igualando-se a polaridade
do analito com aquela da FE. Uma FM de
polaridade diferente é então empregada.
PERGUNTA:

O que aconteceria se igualássemos a polaridade

do analitos com a polaridade da FM?
Dada a fraca afinidade do analitos pela FE, obteríamos
uma separação pobre com a rápida eluição dos
analitos.
 CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA
• FE é uma resina trocadora de íons.
• Detector de condutividade.
• O sinal da FM é suprimido com uma
segunda resina trocadora de íons é
empregada.
Ela converte efetivamente os íons do
solvente para espécies moleculares sem
afetar a condutividade dos íons dos
analitos.
P/ determinar cátions, o HCl é o eluente e a
coluna de supressão contém resina trocadora de
cátions na forma OH-. O produto da
reação na coluna de supressão é água.

coluna
supressora
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA

P/ determinar ânions, faz-se a eluição

com bicarbonato.
Os ânions não são retidos na coluna
supressora, que neutraliza o bicarbonato
para ácido carbônico. O contra íon é
retido no sítio ativo que fica vago na
resina.

coluna
supressora
• Detectores
Devem apresentar um volume morto pequeno de
forma a minimizar o alargamento de banda.
• O detector a ser empregado vai depender da
natureza da amostra.

linhas a 254 nm e 280 nm

é de uso geral
 Detector de Arranjo de Diôdos
Detectores espectrofotométricos

Caminho óptico
• Cromatografia Líquida (CL)-Espectrometria de
Massas (MS) e CL-MS.
• A combinação da CL com a MS pode ser vista como
a fusão ideal entre a separação e detecção.
• DIFICULADES: amostra deve ser vaporizada e o
grande volume gerado com a vaporização do solvente.
• A abordagem mais popular é a ionização à pressão
atmosférica de baixa vazão (ionização por eletrospray).
 Detector
O analito é oxidado ou reduzido
no eletrodo, gerando uma
corrente elétrica
Aplicações
• Exercícios marcados em amarelo nos
CAP 31 e 32.
• Também recomendo ler o livro (tem na
Biblioteca do CEUNES)