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RENORBIO

Programa de Pós-graduação em Biotecnologia

Efeitos do monoterpeno (-)-mirtenol sobre o Sistema


Nervoso Central: estudos in vitro e in vivo

Maria Rosilene Cândido Moreira

João Pessoa-PB
2013
MARIA ROSILENE CÂNDIDO MOREIRA

Efeitos do monoterpeno (-)-mirtenol sobre o Sistema


Nervoso Central: estudos in vitro e in vivo

Tese apresentada ao Programa de Pós-


graduação em Biotecnologia da Rede
Nordeste de Biotecnologia com sede na
Universidade Federal Rural de Pernambuco
e ponto focal na Universidade Federal da
Paraíba, como requisito para obtenção do
grau de Doutora em Biotecnologia.

ORIENTADOR:
Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida

CO-ORIENTADOR:
Prof. Dr. Rivelilson Mendes de Freitas

João Pessoa-PB
2013
MARIA ROSILENE CÂNDIDO MOREIRA

Efeitos do monoterpeno (-)-mirtenol sobre o Sistema


Nervoso Central: estudos in vitro e in vivo

Tese apresentada ao Programa de Pós-


graduação em Biotecnologia da Rede
Nordeste de Biotecnologia com sede na
Universidade Federal Rural de Pernambuco
e ponto focal na Universidade Federal da
Paraíba, como requisito para obtenção do
grau de Doutora em Biotecnologia.

Aprovada em _____/_____/_____

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________
Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida
Orientador (RENORBIO-UFPB)

___________________________________________________
Prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa
Examinador interno (RENORBIO-UFPB)

____________________________________________________
Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio
Examinador interno (RENORBIO-UFPB)

_____________________________________________________
Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley
Examinador externo (UFPE)

_____________________________________________________
Prof. Dr. José Pinto de Siqueira Júnior
Examinador externo (UFPB)
Dedico este trabalho à minha filha Gabrielle, que já
era desejada antes do doutorado e acompanhou
intraútero a concretização desta tese, um sonho
realizado, assim como sua concepção...

Gestá-la durante a etapa final do doutorado foi uma


experiência ímpar, pois, dividir o tempo em escrever
a tese e preparar seu enxoval contribuiu para reduzir
a ansiedade típica da fase de qualificação e
preparou-me para ter mais autoconfiança no
momento da defesa.

Dedico este título também ao meu esposo, Rogério


Moreira, companheiro e amigo, responsável maior
pelas minhas conquistas profissionais e pessoais,
pois é sempre o primeiro a me encorajar a tentar;
graças a ele, consegui chegar até aqui.

Amo vocês dois!!!


A Deus, que pôs pessoas de bom espírito no meu caminho, para colaborar, cada
uma a seu modo, para que eu pudesse obter este título;

Aos familiares, que apoiaram e acompanharam desde o início minha trajetória


acadêmica;

Ao dileto professor Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida, pessoa ímpar que, com sua
gentileza e sabedoria constantes, aceitou-me como sua orientanda, agregando ao
meu o seu valioso nome e conhecimento científico, para que eu pudesse aprender e
crescer como pesquisadora, por quem tenho e terei sempre uma grandiosa
admiração e a quem sou eternamente grata;

Ao estimado professor Dr. Rivelilson Mendes de Freitas, meu co-orientador, que


compartilhou comigo um pouco do seu saber, acreditou na minha capacidade
intelectual e encorajou-me a seguir em frente, ora instigando-me a produzir, ora
confortando-me com palavras otimistas que foram muito importantes para a
finalização desta fase da minha vida, a quem tenho e terei sempre como amigo,
exemplo de professor competente e referência como pesquisador na área da saúde.
Agradeço especialmente por me iniciar no mundo fascinante da pesquisa
experimental, dos ensaios pré-clínicos e das patentes;

Aos integrantes do Laboratório de Pesquisas em Neuroquímica Experimental da


UFPI (LAPNEX), Amanda Cardoso, Oskar Almeida, Jéssica Costa, Daianne Costa,
Rusbene Albuquerque e Giselle Zaira, pela valiosa ajuda nos ensaios experimentais
que lá realizei;

Ao professor Dr. José Maria Barbosa Filho pelas valiosas considerações efetuadas
na qualificação da tese;

Ao amigo ex-renorbiano professor Dr. José Ferreira Lima Júnior, que me falou sobre
o processo seletivo para o doutorado Renorbio, incentivando-me a concorrer a uma
vaga e, após minha aprovação, apoiando-me nesta trajetória até eu finalizá-la;

Aos amigos Marcylenne e Célio Adriano que abriram suas residências e me


acolheram durante minhas idas e vindas a João Pessoa, e ainda apresentaram-me
alguns lugares atrativos da capital paraibana;

Aos colegas de doutorado Allan Reis Albuquerque e Maria Soraya Franco, pelo
apoio e agradável presença durante as semanas intensivas em disciplinas cursadas
na UFPB;

Às colegas Renorbianas Leiz Veras e Adrianny Amorim pelas agradáveis


companhias nas disciplinas e congressos relacionados ao doutorado dos quais
participamos;

Às colegas e aos colegas docentes da Unidade Acadêmica de Enfermagem do


CFP/UFCG da qual faço parte, que compreenderam a importância do doutorado
para meu crescimento profissional, aprovando meu pedido de afastamento para
concluí-lo;
Às professoras Alba Rejane Moura, Edineide Nunes e Milena Costa, que aceitaram
me substituír nas atividades docentes, fator decisivo para a aprovação do meu
afastamento;

Às amigas Edina Rodrigues e Jackelya Araújo, pelo incentivo, apoio e envio de


palavras e pensamentos positivos nos momentos difíceis vividos na pós-graduação;

Aos professores doutores Damião Pergentino, Fábio Sampaio, Siqueira Júnior e


Almir Wanderley, pelas considerações pontuadas na seção de defesa;

À secretaria e a coordenação do Renorbio – Ponto Focal Paraíba, pelas orientações


fornecidas sobre matrícula, disciplinas, reuniões, qualificação e defesa da tese.
“A razão é o passo,
o aumento da ciência o caminho,
e o benefício da humanidade é o fim.”

Thomas Hobbes
MOREIRA, M.R.C. Efeitos do monoterpeno (-)-mirtenol sobre o Sistema
Nervoso Central: estudos in vitro e in vivo. 2013. 191p. Tese (Pós-graduação em
Biotecnologia, Rede Nordeste de Biotecnologia - RENORBIO), Universidade Federal
da Paraíba (UFPB), João Pessoa.

RESUMO

O (-)-mirtenol (MIR) é um monoterpeno encontrado em diversas plantas aromáticas.


Entretanto, ainda não foram descritas na literatura suas propriedades
psicofarmacológicas. Nesse sentido, este estudo teve como objetivo investigar a
influência do mirtenol sobre o sistema nervoso central de camundongos Swiss e
ratos Wistar para verificar seu efeito ansiolítico, neuroléptico e anticonvulsivante,
além do potencial antioxidante e tóxico. Foram realizados ensaios ansiolíticos
utilizando-se os testes do labirinto em cruz elevado (TLCE) e de transição claro-
escuro (TTCE), além dos testes do campo aberto (TCA) e Rota Rod para avaliar os
efeitos sobre o sistema locomotor desses animais. O efeito anticonvulsivante foi
analisado pelos testes de convulsão induzida por pentilenotetrazol (PTZ), picrotoxina
(PIC) e pilocarpina (P) e o neuroléptico pelo teste de catalepsia induzida por
haloperidol (HAL). Para verificar o potencial tóxico realizou-se screening hipocrático,
avaliação da massa corporal, consumo alimentar e produção de excretas, análise
dos parâmetros hematológicos e bioquímicos e avaliação morfológica macroscópica
e histopatológica de órgãos dos animais experimentais. Adicionalmente, estudou-se
o perfil antioxidante, através das metodologias in vitro (TBARS, remoção do radical
nitrito e hidroxila) e in vivo [lipoperoxidação, produção de nitrito e atividade das
enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa reduzida (GSH)].
No TLCE, o mirtenol aumentou significativamente o número de entradas (MIR=5,6;
Controle=3,1) e o tempo de permanência dos animais nos braços abertos
(MIR=106,8s; Controle=47,5s) e, no TTCE, aumentou significativamente o tempo de
permanência dos animais no compartimento claro (MIR=187,4s; Controle=105,1s).
No TCA e Teste do Rota Rod, não houve alterações significativas dos parâmetros
observados. Nos testes sobre convulsão, o mirtenol aumentou a latência para a
primeira convulsão [P(MIR=21,5s; Controle=11,9s); PTZ(MIR=280,4s;
Controle=87,3s); PIC(MIR=696,0s; Controle=522,4s)] e diminuiu a porcentagem
destas [P(MIR=53,3%;); PTZ(MIR=37,3%); PIC(MIR=33,3%)], assim como o
percentual de mortes dos animais [P(MIR=53,3%); PTZ(MIR=48,3%);
PIC(MIR=33,3%)]. No teste da catatonia o mirtenol reduziu significativamente o
tempo de permanência dos animais na posição antifisiológica induzida (MIR=0,9s;
HAL=29,7s). Na avaliação da toxicidade, o screening hipocrático revelou boa
tolerabilidade do mirtenol e não houve alterações significativas no padrão alimentar,
produção de excretas, massa corporal, parâmetros hematológicos, bioquímicos,
morfológicos ou histopatológicos. Quanto ao potencial antioxidante, o mirtenol
reduziu a lipoperoxidação (MIR=86,8%; VitC=56%), o teor de nitrito (MIR=85,3%;
VitC=24,5%) e aumentou a atividade das enzimas antioxidantes nos animais
tratados [CAT(MIR=102,3%; SOD (MIR=39,5%); GSH(MIR=12,2%)]. Conclui-se que
o mirtenol apresenta potencial ansiolítico sem efeito sedativo, atividade neuroléptica,
anticonvulsivante e antioxidante, com baixa toxicidade, podendo ser considerado
potencial bioproduto na formulação de fitomedicamentos.

Palavras-chave: mirtenol, ansiolítico, antioxidante, neuroléptico, anticonvulsivante,


sistema nervoso central, monoterpeno, óleos essenciais.
MOREIRA, M.R.C. Effects of monoterpene (-)-myrtenol in Central Nervous
System: studies in vitro and in vivo. 2013. 191p. Thesis (Pós-graduate in
Biothecnology, Northeast Biotechnology Network - RENORBIO), Federal University
of Paraíba (UFPB), João Pessoa.

ABSTRACT

(-)-myrtenol (MYR) is a monoterpene found in various aromatic plants. However, te


scientific literature has not yet described any psychopharmacological properties of
this molecule. This study aimed to investigate the influence of myrtenol on the central
nervous system of male Swiss mice and Wistar rats checking their anxiolytic,
neuroleptic and anticonvulsant activities, in addition to its antioxidant and toxic
potentials. Anxiolytic assays were performed using the elevated plus maze test
(EPM) and light-dark transition test (LDT), besides the open field test (OFT) and
Rota Rod test to assess the effects on the locomotor system of these animals. The
neuroleptic activity was checked by the test of catalepsy induced by haloperidol
(HAL). The anticonvulsant effect was analyzed by seizures induced by
pentylenetetrazol (PTZ), picrotoxin (PIC) and pilocarpine (P). To check the potential
toxicity hippocratic screening was performed, by assessment of body weight, food
consumption and production of excreta, the hematological and biochemical
parameters, as well as macroscopic and histopathological organs of experimental
animals. Additionally, was studied the antioxidant profile the study on the antioxidant
profile, through in vitro (TBARS, removal of nitrite and hydroxyl radical) and in vivo
techniques [lipid peroxidation, nitrite production and activity of catalase (CAT),
superoxide dismutase (SOD) and reduced glutathione (GSH)]. In EPM, myrtenol
administration significantly increased the input numbers (MYR=5.6; Control=3.1) and
time spent by the animals in the open arms (MYR=106.8s; Control=47.5s) when
compared with the control group and in the LDT myrtenol increased significantly the
time spent by animals in the light compartment (MYR=187.4s; Control=105.1s). In
OFL and Rota Rod test, the results revealed no significant changes in the
parameters observed. In seizures induced, the results revealed that the myrtenol
increased the latency to the first seizure [P(MYR=21.5s; Control=11.9s);
PTZ(MYR=280.4s; Control=87.3s); PIC(MYR=696.0s; Control=522.4s)] and
decreased the percentage of seizures [P(MYR=53.3%;); PTZ(MYR=37.3%);
PIC(MYR=33.3%)], as well as the percentage of deaths of animals [P(MYR=53.3%);
PTZ(MYR=48.3%); PIC(MYR=33.3%)]. The test of catatonia showed a significant
reduction in the time spent in the antiphysiologic position (MYR=0.9s; HAL=29.7s).
On the toxicity studies, the hippocratic screening showed good tolerability of myrtenol
and no significant changes in dietary patterns, production of excreta, body weight,
hematological and biochemical parameters and morphological or histopathological
findings. About the antioxidant potential, myrtenol reduced lipid peroxidation
(MYR=86.8%; VitC=56%), level of nitrite (MYR=85.3%; VitC=24.5%) and increased
antioxidants enzymes activity [CAT(MYR=102.3%; SOD (MYR=39.5%);
GSH(MYR=12.2%)] in treated animals. In conclusion, myrtenol has anxiolytic
potential without sedative effect, possesses neuroleptic, anticonvulsant and
antioxidant activities, with low toxicity and can be considered a potential bioproduct in
formulation of phytomedicine.

Keywords: (-)-myrtenol, anxiolytic, antioxidant, neuroleptic, central nervous system,


monoterpene, essential oils.
LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação esquemática do receptor GABAA ............................... 33


Figura 2. Myrtus communis L. ........................................................................... 41
Figura 3. Flores e frutos de mirta........................................................................ 41
Figura 4. Animais experimentais utilizados no estudo ....................................... 48
Figura 5. Estrutura química do mirtenol ............................................................. 49
Figura 6. Aparelho de Campo Aberto ................................................................. 50
Figura 7. Aparelho Rota Rod .............................................................................. 51
Figura 8. Labirinto em cruz elevado ................................................................... 51
Figura 9. Aparelho de Transição Claro - Escuro ................................................ 52
Figura 10. Esquema do estudo dos efeitos do mirtenol sobre o SNC .............. 53
Figura 11. Esquema do estudo do potencial tóxico do mirtenol ......................... 54
Figura 12. Esquema do estudo do perfil antioxidante do mirtenol ..................... 55
Figura 13. Parâmetros observados no teste do Campo Aberto ......................... 56
Figura 14. Protocolo experimental do mirtenol no Teste do Campo Aberto ....... 57
Figura 15. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de
ação do mirtenol no Teste do Campo Aberto ...................................................... 57
Figura 16. Parâmetros observados no Teste do Rota Rod ................................ 58
Figura 17. Protocolo experimental do mirtenol no Teste do Rota Rod .............. 59
Figura 18. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de
ação do mirtenol no Teste do Rota Rod ............................................................. 59
Figura 19. Parâmetros observados no TLCE ..................................................... 61
Figura 20. Protocolo experimental do mirtenol no Teste do LCE ....................... 61
Figura 21. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de
ação do mirtenol no Teste do LCE ...................................................................... 62
Figura 22. Parâmetros observados no Teste de Transição Claro - Escuro ....... 63
Figura 23. Protocolo experimental do mirtenol no Teste de Transição Claro-
Escuro ................................................................................................................. 63
Figura 24. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de
ação do mirtenol no Teste de Transição Claro-Escuro ....................................... 64
Figura 25. Protocolo experimental do mirtenol no Teste de Convulsão
induzida por PIC, PTZ ou P ................................................................................. 65
Figura 26. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de
ação do mirtenol no Teste de Convulsão induzida por PIC, PTZ ou P ............... 65
Figura 27. Parâmetros observados no Teste de Catatonia ................................ 66
Figura 28. Protocolo experimental do mirtenol no Teste da Catatonia .............. 67
Figura 29. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de
ação do mirtenol no Teste da Catatonia.............................................................. 67
Figura 30. Áreas cerebrais dos animais experimentais removidas para estudo
neuroquímico ....................................................................................................... 71
Figura 31. Efeito do tratamento agudo com mirtenol sobre o hipocampo dos
animais experimentais ......................................................................................... 116
Figura 32. Efeito do tratamento agudo com mirtenol sobre o corpo estriado
dos animais experimentais .................................................................................. 116
Figura 33. Efeito do tratamento agudo com mirtenol sobre o tecido hepático
dos animais experimentais .................................................................................. 117
LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Efeito do mirtenol sobre a atividade locomotora espontânea dos


animais no teste do campo aberto ...................................................................... 80
Gráfico 2. Efeito do mirtenol sobre o comportamento de empinar dos animais
no teste do Campo Aberto .................................................................................. 81
Gráfico 3. Efeito do mirtenol sobre o tempo de permanência dos animais na
barra giratória do Rota Rod ................................................................................. 82
Gráfico 4. Efeito do mirtenol sobre o número de entradas dos animais nos
braços abertos no TLCE .................................................................................... 83
Gráfico 5. Efeito do mirtenol sobre o tempo de permanência dos animais nos
braços abertos no TLCE ..................................................................................... 85
Gráfico 6. Efeito do mirtenol sobre o tempo de permanência dos animais no
compartimento claro no TTCE ............................................................................ 86
Gráfico 7. Efeito do mirtenol sobre o tempo de catatonia induzida por
haloperidol nos intervalos mensurados ............................................................... 101
Gráfico 8. Efeito do mirtenol sobre o tempo total de catatonia induzida por
haloperidol ........................................................................................................... 102
Gráfico 9. Efeito da aministração oral de mirtenol em doses repetidas sobre o
consumo de ração dos animais ........................................................................... 110
Gráfico 10. Efeito da administração oral de mirtenol em doses repetidas sobre
o consumo de água dos animais ......................................................................... 111
Gráfico 11. Efeito da administração oral de mirtenol em doses repetidas sobre
a produção de excretas pelos animais ................................................................ 111
Gráfico 12. Efeito da administração oral de mirtenol em doses repetidas sobre
a massa corporal dos animais ............................................................................. 112
Gráfico 13. Efeito do mirtenol sobre a produção de TBARS .............................. 124
Gráfico 14. Efeito do mirtenol sobre a remoção do radical nitrito ...................... 125
Gráfico 15. Efeito do mirtenol sobre a remoção do radical hidroxila .................. 126
Gráfico 16. Efeito do mirtenol sobre o nível de peroxidação lipídica no
hipocampo dos animais experimentais ............................................................... 127
Gráfico 17. Efeito do mirtenol sobre o teor de nitrito no hipocampo dos
animais experimentais ......................................................................................... 128
Gráfico 18. Efeito do mirtenol sobre a atividade da catalase no hipocampo dos
animais experimentais ......................................................................................... 129
Gráfico 19. Efeito do mirtenol sobre a atividade da superóxido dismutase no
hipocampo dos animais experimentais ............................................................ 130
Gráfico 20. Efeito do mirtenol sobre a atividade da glutationa reduzida no
hipocampo dos animais experimentais ............................................................... 131
LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Classificação dos transtornos de ansiedade ....................................... 31


Quadro 2. Mecanismos de ação e efeitos adversos de algumas drogas
utilizadas no tratamento da ansiedade ................................................................. 34
Quadro 3. Modelos animais de ansiedade dos estudos pré-clínicos com
produtos naturais .................................................................................................. 36
Quadro 4. Screening hipocrático dos animais tratados com mirtenol .................. 109
LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Efeito do mirtenol sobre o grooming dos animais ................................ 80


Tabela 2. Efeito do mirtenol sobre o número de quedas dos animais ................. 83
Tabela 3. Efeito do mirtenol na convulsão induzida por pilocarpina .................... 93
Tabela 4. Efeito do mirtenol na convulsão induzida por pentilenotetrazol ........... 94
Tabela 5. Efeito do mirtenol na convulsão induzida por picrotoxina .................... 95
Tabela 6. Efeito da administração crônica de mirtenol sobre os parâmetros
hematológicos dos animais experimentais .......................................................... 113
Tabela 7. Efeito da administração crônica de mirtenol sobre os parâmetros
bioquímicos dos animais experimentais ............................................................. 114
Tabela 8. Efeito da administração crônica de mirtenol sobre o peso dos órgãos
dos animais experimentais ................................................................................... 115
Tabela 9. Patentes encontradas nas bases de dados ....................................... 136
Tabela 10. Aplicações das patentes relacionadas ao mirtenol ............................ 137
Tabela 11. Categorias de detentores das patentes concedidas relacionadas ao
mirtenol ................................................................................................................ 138
Tabela 12. Patentes relacionadas ao mirtenol depositadas por país .................. 138
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAPH 2,2’-azobis [2 metilpropionamidina] diidroclorido


AC Ácido ascórbico
ADT Antidepressivo tricíclico
ALE Atividade Locomotora Espontânea
ALT Alanina aminotransferase
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AST Aspartato aminotransferase
BZD Benzodiazepínico
CAT Catalase
CI50 Concentração Inibitória 50%
CID-10 Classificação Internacional de Doenças – versão 10
CHCM Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média
CT Colesterol Total
DSM-IV Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais – IV
DZP Diazepam
EP Espacenet
E.P.M. Erro Padrão da Média
FLU Flumazenil
GABA Ácido Gama Aminobutírico
GSH Glutationa Reduzida
HAL Haloperidol
HCM Hemoglobina Corpuscular Média
IC Intervalo de confiança
IMAO Inibidor da monoamina oxidase
INPI Instituto Nacional de Propriedade Intelectual
ISRS Inibidor seletivo da reabsorção de serotonina
LCE Labirinto em Cruz Elevado
MDA Malondialdeído
MIR Mirtenol
NEBA Número de Entradas nos Braços Abertos
NO Óxido Nítrico
NPS Nitroprussiato de Sódio
OH Radical hidroxila
OMS Organização Mundial de Saúde
P Pilocarpina
PEBA Porcentagem de Entradas nos Braços Abertos
PIC Picrotoxina
PTBA Porcentagem do Tempo de Permanência nos Braços Abertos
PTZ Pentilenotetrazol
5-HT1A Receptor 5-Hidroxitriptamina – 1ª
SNC Sistema Nervoso Central
SNGPC Sistema Nacional de Gerenciamento de Produtos Controlados
SOD Superóxido Dismutase
TA Transtorno de Ansiedade
TAG Transtorno de Ansiedade Generalizada
TBA Ácido Tiobarbitúrico
TBARS Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
TCA Teste do Campo Aberto
TLCE Teste do Labirinto em Cruz Elevado
TTCE Teste de Transição Claro – Escuro
TPBA Tempo de Permanência nos Braços Abertos
Trolox 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico
USPTO United States Trademark Office
VCM Volume Corpuscular Médio
WHO World Health Organization
SUMÁRIO

INTRODUÇÃO .................................................................................................... 19

REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 24


1 Produtos naturais na saúde coletiva: do preparado popular ao fitofármaco 25
2 Ansiedade e ansiolíticos: dos sintéticos aos produtos naturais ................ 30
3 Considerações sobre Myrtus communis L. e o monoterpeno (-)-mirtenol.. 40

OBJETIVOS .......................................................................................................... 45
1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................ 46
2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 46

MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 47


1 MATERIAL ..................................................................................................... 48
2 MÉTODOS ..................................................................................................... 52
3 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................... 75

RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 76


CAPÍTULO 1 - Avaliação do efeito ansiolítico do mirtenol .......................... 77
CAPÍTULO 2 - Avaliação do efeito anticonvulsivante do mirtenol ............. 90
CAPÍTULO 3 - Avaliação do efeito neuroléptico do mirtenol ...................... 97
CAPÍTULO 4 - Avaliação do potencial tóxico do mirtenol ........................... 105
CAPÍTULO 5 - Avaliação do perfil antioxidante do mirtenol ....................... 121
CAPÍTULO 6 - Prospecção do mirtenol no tratamento da ansiedade ........ 134

CONCLUSÕES ..................................................................................................... 140

PERSPECTIVAS ................................................................................................... 142

REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 144

ANEXOS ............................................................................................................... 174


20
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO

A utilização de plantas medicinais para o tratamento, cura e prevenção de


doenças que acometem a espécie humana é tão antiga quanto a própria existência
do homem na Terra. O Brasil apresenta uma grande diversidade genética vegetal,
englobando de 15 a 25% de todas as espécies vegetais do planeta (JOLY et al,
2011), sendo a região Nordeste uma das regiões exploradoras desta riqueza
vegetal, embora ainda de maneira tímida, na investigação de plantas para o
tratamento de diversos tipos de doenças.
Nas condições que afetam o Sistema Nervoso Central (SNC), pesquisas em
diversos países têm sido desenvolvidas com o intuito de desvelar novas
possibilidades de tratamento contra a ansiedade, uma condição patológica que
acomete cada vez mais pessoas em todo o mundo, sendo considerada pela
Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma das condições mentais mais
preocupantes da saúde pública deste século (WORLD HEALTH ORGANIZATION -
WHO, 2002).
Os transtornos fóbicos-ansiosos e os de ansiedade, assim denominadas as
condições inseridas na categorias F40 e F41 da Classificação de Transtornos
Mentais e de Comportamento da CID-10 (OMS, 1993), revelam-se através de
manifestações de angústia extrema, com alterações cardiovasculares que levam a
taquicardia, palpitações e até dor precordial, com início insidioso e diagnóstico
tardio, o que leva muitos acometidos a carregarem o problema durante anos, sem
realizar tratamento adequado (WHO, 2002).
Uma vez diagnosticado o transtorno de ansiedade, dependendo do grau em
que o mesmo é classificado, o tratamento pode consistir de acompanhamento
psicoterapêutico e realização de práticas corporais integrativas ou complementares,
com ou sem o auxílio de terapêutica medicamentosa; entretanto, pelo fato de muitos
só se descobrirem doentes após muito tempo, geralmente os ansiolíticos estão
associados à abordagem multiprofissional.
A venda de ansiolíticos lidera o ranking dos medicamentos controlados mais
comercializados no Brasil. Após os ansiolíticos, aparecem os anticonvulsivantes.
Uma pesquisa realizada pela Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Introdução
21
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

revelou que, de 2007 a 2010, os ansiolíticos Clonazepam, Bromazepan e


Alprazolan, nesta ordem, foram os três mais vendidos no país (BRASIL, 2012).
No Estado da Paraíba, dados do Sistema Nacional de Gerenciamento de
Produtos Controlados (SNGPC/ANVISA) revelaram que, no período compreendido
entre 2009 e 2011, Clonazepam, Bromazepam e Diazepam foram os três princípios
ativos mais consumidos pela população paraibana; um reflexo do panorama
nacional (BRASIL, 2012).
Embora o estudo tenha listado somente os princípios ativos, os
medicamentos conhecidos pela população apresentam-se com nomes comerciais
variados, muitas vezes, confundindo as pessoas por apresentarem nomes
parecidos, porém, em concentrações diferenciadas e outras características que
alteram a farmacocinética da droga, desencadeando efeitos colaterais que incluem
variações do humor, alterações na locomoção, relaxamento muscular, tremores,
dependência química, dentre outros.
No campo da neuropsicofarmacologia, a busca por novas farmacoterapias de
plantas medicinais para doenças psiquiátricas progrediu significativamente na
década passada. Entre essas plantas, o grupo das aromáticas tem despertado muito
interesse, por possuírem amplas indicações na medicina popular. No Brasil,
aproximadamente 65 a 80% da população depende unicamente dos preparados
obtidos das plantas para o tratamento de desordens na saúde (AGRA; FREITAS;
BARBOSA-FILHO, 2007). No entanto, o uso popular não constitui processo
suficiente para validação etnofarmacológica de uma planta ou constituinte,
necessitando de estudos que comprovem sua segurança e eficácia. Nesse contexto,
e considerando a imensa diversidade da flora brasileira, existem diversas espécies
sendo estudadas, revelando muitas descobertas promissoras para a área de saúde.
Dentre as plantas com promissoras atividades farmacológicas, Myrtus
communis L., uma espécie da família Myrtaceae tem sido investigada. É uma planta
arbustiva aromática procedente da região mediterrânica da Europa, sendo muito
cultivada mundialmente. Conhecida popularmente como “murta-comum” ou “mirta”, o
seu habitat preferencial é xerofílico (seco), podendo ser encontrada em diversas
regiões do Brasil, tradicionalmente utilizada no sul do país no tratamento de
problemas estomacais (SALVAGNANI et al., 2008).

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MOREIRA, M.R.C. Introdução
22
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Diversas indicações medicinais estão atribuídas à mirta. Textos médicos


egípcios já referiam seu uso como remédio para desordens urinárias, dores, azia,
inchaços e expectorante. Na Grécia, era utilizada como contraceptivo e na Turquia,
para tratamento de problemas menstruais (ÖZKAN; GÜRAY, 2009). É ainda
indicada no tratamento de insônia e condições nervosas (REZAIE et al., 2012).
Ainda nesse sentido, o óleo essencial de mirta tem sido encontrado no
comércio popular como substância medicinal, indicado para condições patológicas
diversas, tais como as descritas anteriormente, podendo ser adquirido no comércio
virtual, através de sites que comercializam produtos naturais.
Na composição desse óleo, o mirtenol, um monoterpeno álcool, tem sido
identificado como um dos constituintes majoritários, visto que os óleos essenciais
são compostos por duas classes químicas, a saber: os terpenóides e os
fenilpropanóides, destes, os monoterpenóides e os sesquiterpenóides são os mais
freqüentes (RAHIMMALEK et al., 2009). Embora constituam somente 1 a 2% da
composição das plantas aromáticas (FATURI et al., 2010; ALMEIDA et al., 2011), os
óleos essenciais têm sido utilizados no tratamento de doenças como a epilepsia e a
ansiedade, uma vez que vários estudos já comprovaram suas atividades
antidepressivas, sedativas, ansiolíticas e anticonvulsivantes (DE SOUSA et al.,
2007; SANTOS et al., 2011).
Trabalhos que utilizaram óleos essenciais de plantas contendo mirtenol como
um dos constituintes majoritários revelaram algumas propriedades deste
monoterpeno, apontando-o como possível agente antimicrobiano, por apresentar
efeito contra o Bacillus subtilis (LEPOITTEVIN et al., 2011), anti-cancerígeno
(EVSTATIEVA et al., 2010), inibindo células neoplásicas cervicouterinas, anti-
hiperglicêmico (ELFELLAH; AKHTER; KHAN, 1984; SEPICI-DINCEL et al., 2007),
anti-mutagênico (HAYDER et al., 2003) e agente hipotensor (SAITO et al., 1996;
SANTOS et al., 2011). Entretanto, ainda não foram encontrados estudos sobre suas
propriedades farmacológicas sobre a ansiedade e a convulsão, embora sua
estrutura química assemelhe-se a outros monoterpenóides álcoois com comprovada
atividade ansiolítica (GOMES et al., 2010; NOGUEIRA NETO et al., 2012; DE
ALMEIDA et al., 2012; LIMA et al., 2013) e anticonvulsivante (ELISABETSKY;
BRUM; SOUZA, 1999; DE SOUSA et al., 2006; SILVA et al., 2009; SAMPAIO, et al.,
2012). Além disso, por não terem sido encontrados estudos relacionando
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MOREIRA, M.R.C. Introdução
23
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monoterpenóides alcoóis com o fenômeno da catalepsia, surgiu o interesse em


utilizar o mirtenol nos ensaios experimentais com modelos animais específicos para
essas condições.
Nesse sentido, este estudo teve como objetivo investigar a influência do
mirtenol sobre o SNC, especialmente para verificar sua atividade ansiolítica,
anticonvulsivante e anticataléptica, além do seu potencial tóxico e antioxidante, de
forma aguda e crônica, em modelos animais.
Pretende-se com este trabalho fornecer subsídios para que futuros
fitomedicamentos contra ansiedade, convulsão e outras condições que acometem o
sistema nervoso central possam ser produzidos, a fim de que sejam financeiramente
mais acessíveis à coletividade necessitada e desprovidos de efeitos colaterais,
favorecendo ainda neuroproteção contra danos oxidativos decorrentes dos
processos patológicos e ampliando assim a listagem de produtos biotecnológicos na
área da saúde atualmente formulados e comercializados no Brasil.

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MOREIRA, M.R.C. Introdução
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REVISÃO DE LITERATURA

1 Produtos naturais na saúde coletiva: do preparado popular ao fitofármaco

O uso de plantas com a finalidade de tratar e curar condições que acometem


a saúde do homem acompanha a evolução humana, datando dos tempos primitivos,
em que as mulheres retiravam das ervas seus princípios ativos, por meio de
processos variados, que tempos depois se tornou uma função atribuída aos
curandeiros (SIMÕES; SCHENKEL; SIMON, 2001 apud FIRMO et al., 2011).
No século XIX, com o advento das descobertas científicas relacionadas a
diversas condições patológicas, a indústria pôde se dedicar a fabricação de produtos
farmacêuticos sintéticos que fossem capazes de produzir os efeitos desejáveis em
curto espaço de tempo. Nesse aspecto, a indústria farmacêutica obteve seu apogeu,
produzindo e comercializando uma variedade de medicamentos, com cores,
tamanhos e sabores diferentes, que satisfaziam as necessidades de saúde da
população nos casos em que a medicina tradicional ainda não havia alcançado,
proporcionando assim, uma associação do avanço tecnológico ao conhecimento
popular (FRANÇA et al., 2008).
No panorama contemporâneo, as plantas têm sido usadas como matéria-
prima para a fabricação de fitoterápicos e outros medicamentos. Além de seu uso
como substrato para a fabricação de medicamentos, as plantas são também
utilizadas em práticas populares e tradicionais como remédios caseiros e
comunitários, constituindo um conjunto de conhecimentos, habilidades e práticas
baseado em teorias, crenças e experiências de diferentes culturas, utilizadas na
manutenção, prevenção, diagnóstico ou tratamento de doenças físicas e mentais,
processo conhecido como medicina tradicional (WHO, 2005).
No âmbito das políticas de saúde, referência à importância das plantas
medicinais já era preocupação da Organização Mundial de Saúde quando, na
Conferência Internacional sobre Cuidados Primários de Saúde em Alma-Ata (1978),
recomendou que os governos formulassem mecanismos para incorporar os
remédios tradicionais de eficiência comprovada junto à população, em seus
diferentes níveis de cuidados primários de saúde (OMS, 1979).
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MOREIRA, M.R.C. Revisão de Literatura
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Anos após, oriundas de intensas discussões promovidas na 1ª. Conferência


Nacional de Vigilância Sanitária (2001), na 1ª. Conferência Nacional de Assistência
Farmacêutica (2003), na 2ª Conferência Nacional de Ciência, Tecnologia e Inovação
em Saúde (2004) e nas Conferências Nacionais de Saúde, as Práticas Integrativas e
Complementares surgiram no escopo das políticas de saúde brasileiras,
corroborando para que a atenção à saúde estivesse pautada nos princípios
doutrinários e operacionais do SUS, dando ênfase à humanização e à integralidade,
viabilizando-se pelas diferentes abordagens de prevenção, promoção e reabilitação
da saúde, cujas práticas se dão no campo da integração e da complementaridade
das demais ações já existentes (BRASIL, 2006a).
Considerando as práticas populares existentes no país e sua crescente
legitimação social, bem como as demandas emergentes das organizações
governamentais e não-governamentais brasileiras relacionadas à saúde coletiva, o
Ministério da Saúde iniciou o processo de construção de uma política que tornasse
viável desenvolver práticas de saúde já executadas em vários pontos do país e do
mundo, mas até o momento presente desprovidas de diretrizes específicas (BRASIL,
2006a).
Resultado de inúmeros estudos e diagnósticos situacionais realizados em
âmbito nacional, após 3 anos de trabalho, foi publicada, na forma das portarias
ministeriais n°971, de 3 de maio de 2006, e n°1.600, de 17 de julho de 2006, a
Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no SUS (PNPIC), cujo
documento atende também às diretrizes e recomendações de várias Conferências
Nacionais de Saúde e às recomendações da OMS (BRASIL, 2006a).
Em sua abordagem mais ampla, a PNPIC visa estimular os mecanismos
naturais de prevenção de agravos e recuperação da saúde por meio de tecnologias
eficazes e seguras, com ênfase no acolhimento, escuta ativa, estabelecimento de
vínculo terapêutico e na integração do ser humano com seu meio social, a fim de
consolidar a compreensão ampliada do processo saúde-doença e promover o
autocuidado, de forma ajustada aos hábitos e costumes da população (BRASIL,
2006a).
Por ter sido verificada como a prática integrativa de maior predominância
entre os municípios e estados brasileiros (BRASIL, 2006a), a fitoterapia merece
destaque dentre as práticas integrativas e complementares na atenção à saúde,
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MOREIRA, M.R.C. Revisão de Literatura
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especialmente no tocante aos achados já elucidados no Brasil nas últimas décadas,


além das potencialidades dos estudos em desenvolvimento quanto à utilização de
plantas próprias da flora brasileira na elaboração de produtos bioativos, com
propriedades farmacológicas terapêuticas, que podem contribuir para o tratamento,
prevenção e promoção da saúde coletiva.
O Brasil possui potencial e oportunidades para desenvolvimento do setor,
uma vez que além do conhecimento tradicional associado às plantas medicinais, da
tradição de uso pela população, da rica diversidade de espécies vegetais, da grande
sócio-diversidade, possui infra-estrutura tecnológica para o desenvolvimento de
produtos oriundos da biodiversidade brasileira com vistas à ampliação do acesso da
população a serviços e produtos, assim como a redução da dependência tecnológica
de insumos farmacêuticos.
Nesse sentido, o uso de plantas medicinais e de seus metabólitos como fonte
de produtos terapêuticos tem sido objeto de larga aceitação e interesse por parte
dos estudiosos da área de saúde, desencadeando uma intensa produção acadêmica
com resultados obtidos em pesquisas pré-clínicas e posteriormente clínicas,
originando diversos produtos farmacêuticos já disponíveis no mercado, com alcance
nas áreas da terapêutica, alimentos e cosmética.
Compreende-se por fitoterápico qualquer medicamento que tenha sido
produzido exclusivamente de constituintes ativos vegetais, que podem ser extratos,
tinturas, óleos, ceras, exsudatos, sucos (ALMEIDA; MORAIS; OLIVEIRA, 2011), cuja
eficácia e segurança são validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos,
documentações tecno-científicas ou evidências clínicas (BRASIL, 2010a), sendo
regulamentados no Brasil por meio de Portarias, Resoluções de Diretoria Colegiada
(RDC) e outros dispositivos regulatórios. Podem ser industrializados ou
manipulados, sendo os primeiros produzidos em indústrias farmacêuticas e com
registro na Agência Nacional de Vigilância Santitária (ANVISA) antes de serem
comercializados.
O Decreto nº 5.813, de 22 de junho de 2006, que aprova a Política Nacional
de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, tem como finalidade primordial garantir o
acesso da população a esses produtos, porém, de maneira segura, pautada no uso
racional, preservando a biodiversidade e ao mesmo tempo incrementando a
produção industrial nacional (BRASIL, 2006b). Outro dispositivo, a RDC 14/10, de 31
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MOREIRA, M.R.C. Revisão de Literatura
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de março de 2010, dispõe sobre o registro dos mesmos junto a ANVISA (BRASIL,
2010b), a fim de garantir os três requisitos essenciais (qualidade, eficácia e
segurança), juntamente com a RDC 17/10, de 16 de abril de 2009, que autoriza os
laboratórios farmacêuticos a produzirem os fitoterápicos.
Há ainda documentos legais relacionados à produção, testagem e
venda/disponibilização de fitoterápicos no Brasil; regulamento sobre as bibliografias
que devem ser consultadas para avaliação da segurança e eficácia dos fitoterápicos;
normas para elaboração das bulas dos produtos; aspectos da rotulagem dos
medicamentos; normas sobre a avaliação da estabilidade dos produtos; dispositivos
que regulam o processo de inspeção de órgãos fabricantes de fitoterápicos e outras
normativas que sejam oportunas para ampliar as ações de eficácia, segurança e
qualidade dos medicamentos fitoterápicos (BRASIL, 2010c).
Com todo esse aparato legal, busca-se o controle dos fitoterápicos produzidos
e comercializados no país, primando-se pela qualidade, eficácia e segurança, além
de viabilizar rápida detecção dos problemas e possíveis reações indesejáveis
relacionadas à utilização inadequada dos mesmos pela população.
Dentre os principais fitoterápicos com registro na ANVISA, alguns apresentam
efeitos sobre o Sistema Nervoso Central, exercendo grande importância sobre o
tratamento e a prevenção de algumas psicopatologias. Dentre os mais conhecidos,
pode-se citar: Ginkgo biloba L., extraído da árvore de ginkgo, que abriga
propriedades anticoagulantes, antioxidantes, neuroprotetora, sendo utilizado no
tratamento da demência, vasculopatia e Mal de Alzheimer; Hypericum perforatum L.,
conhecido como erva-de-são-joão ou hipérico, tem sido utilizado como
antidepressivo; Matricaria recutita L., que tem como nomes populares a camomila,
camomila-alemã, marcela-nobre e matricaria, que é utilizada no tratamento da
ansiedade, insônia e enjôo; Melissa officinalis L., conhecido como melissa, erva-
cidreira ou melissa-romana, possui efeito ansiolítico e sedativo; Panax ginseng C. A.
Mey., que age na doença neurodegenerativa, demência senil, mal de Parkinson,
câncer, diabetes, processos inflamatórios e deficiência imunológica, tendo ainda
demonstrado efeito antinociceptivo; Passiflora incarnata L., conhecido pelo seu fruto,
o maracujá, tem propriedades ansiolíticas, prolonga o período de sono e eleva o
limiar nociceptivo; Paullinia cupana H.B. & K, conhecido como guaraná, que produz
efeito estimulante, afrodisíaco, broncodilator e diurético; e Piper methysticum G.
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MOREIRA, M.R.C. Revisão de Literatura
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Forst., conhecido como kava-kava, que possui ação ansiolítica, relaxante e sedativa
(ALMEIDA; MORAIS; OLIVEIRA, 2011).
É valioso mencionar que, dentre a diversidade botânica existente no Brasil e
no mundo, algumas plantas conseguem se destacar pelo seu poder terapêutico,
verificado quando extraídas suas propriedades metabólicas. Além disso, esses
produtos, por apresentarem rápida resposta farmacológica e poucas reações
indesejáveis, fazem com que seu uso seja incentivado, em substituição à terapêutica
alopática. Desse modo, é crescente a pesquisa no campo das plantas medicinais,
buscando-se isolar constituintes ativos presentes em seus extratos para a
formulação de fitoterápicos e fitofármacos, tornando crescente o interesse nesta
área por parte da comunidade acadêmica e das companhias farmacêuticas
(CALIXTO, 2005).
Com o intuito de estabelecer a diferença entre fitoterápico e fitofármaco, a
ANVISA publicou a nova Resolução de Diretoria Colegiada (RDC Nº 24/2011), na
qual estabelece por fitofármaco a substância purificada e isolada a partir de matéria-
prima vegetal com estrutura química definida e atividade farmacológica. É utilizada
como ativo em medicamentos com propriedade profilática, paliativa ou curativa. Não
são considerados fitofármacos compostos isolados que sofram qualquer etapa de
semi-síntese ou modificação de sua estrutura química (BRASIL, 2011a). Com esta
nova RDC, a ANVISA cria a categoria de medicamentos específicos, que não era
prevista na RDC Nº 48/2004, a qual define fitoterápico o medicamento obtido
empregando-se exclusivamente matérias-primas ativas vegetais. É caracterizado
pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela
reprodutibilidade e constância de sua qualidade. Sua eficácia e segurança são
validadas através de levantamentos etnofarmacológicos de utilização,
documentações tecno-científicas em publicações ou ensaios clínicos fase 3. Com
base nessa definição, não se considera medicamento fitoterápico aquele que, na
sua composição, inclua substâncias ativas isoladas, de qualquer origem, nem as
associações destas com extratos vegetais (BRASIL, 2004), nos quais os
medicamentos a base de fitofármacos estão contemplados.
Com esta nova legislação, os fitofármacos passam a constituir uma nova
proposta para a terapêutica de doenças antes tratadas unicamente pelos
medicamentos sintéticos, pois apresentam o mesmo rigor exigido para os demais
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medicamentos comercializados no país, uma vez que sua indicação terapêutica


deve ser oriunda de relatório de segurança e eficácia verificadas em estudos pré-
clínicos e clínicos (BRASIL, 2011a).
Nesse contexto, considerando diversa e pouco explorada, a flora brasileira
detém inúmeras espécies vegetais que vem sendo investigadas e utilizadas para a
produção de fitofármacos. Como exemplo, as plantas aromáticas, cujas
propriedades farmacológicas são observadas destacadamente em seus óleos
essenciais, os quais são largamente utilizados na indústria cosmética, devido ao seu
agradável aroma, baixo custo e disponibilidade em diversos vegetais, porém, ainda
em pequena escala na indústria farmacêutica.
Contudo, os óleos essenciais também vêm sendo estudados quanto às suas
possíveis propriedades antiinflamatórias, analgésicas, antioxidantes e outras.
Resultantes da extração, isolamento e purificação desses óleos, seus constituintes
são objeto de estudo de variados laboratórios de farmacologia no país e no exterior,
conforme pode ser verificado através das publicações científicas realizadas pelos
cientistas destas instituições.

2 Ansiedade e ansiolíticos: dos sintéticos aos produtos naturais

Cotidianamente, a ansiedade é tida como uma manifestação natural humana


frente a situações especiais. Denominada de ansiedade fisiológica, funciona como
mecanismo biológico contra ameaças à sobrevivência, modulando o funcionamento
cognitivo. Quando ocorre de maneira extrema, persistente, clinicamente
reconhecível e com interferência em funções pessoais, classifica-se como
Transtorno de Ansiedade (TA), apresentando como manifestações clínicas os sinais
sistêmicos (sudorese, taquicardia, medo e insônia) e cognitivos (apreensão,
nervosismo, irritabilidade e desatenção) (OMS, 1993).
Os TA são subdivididos em categorias, segundo a Classificação de
Transtornos Mentais e de Comportamento da CID-10 (OMS, 1993) e o Manual
Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais - Texto revisado [DSM-IV-TR]
(AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION - APA, 2002), dentre as quais
destacam-se: fobias sociais; transtorno de pânico; transtorno de ansiedade
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MOREIRA, M.R.C. Revisão de Literatura
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generalizada (TAG); transtorno obsessivo-compulsivo e transtorno de estresse pós-


traumático, daí as denominações gerais de Transtornos neuróticos, relacionados ao
estresse e somatoformes (CID-10) ou Transtornos de ansiedade (DSM-IV-TR).
Tanto o DSM-IV-RT (2002) como a CID-10 (1993) definem os TA através de
critérios definidos, garantindo assim, a formulação de diagnósticos mais precisos e
confiáveis. Um diagnóstico adequado é importante não só para o planejamento da
intervenção terapêutica como também para a condução de pesquisas que visam
compreender melhor estas condições. O Quadro 1 expõe de maneira mais
detalhada, a classificação dos TA e suas categorias.

Quadro 1. Classificação dos Transtornos de Ansiedade.


Transtornos neuróticos, relacionados ao Transtornos de ansiedade
estresse e somatoformes (CID - 10) (DSM - IV - TR)
F40 Transtornos fóbico-ansiosos 300.01 Transtorno de Pânico sem
F40.0 Agorafobia Agorafobia
F40.1 Fobias sociais 300.21 Transtorno de Pânico com
F40.2 Fobias específicas (isoladas) Agorafobia
F40.8 Outros transtornos fóbico-ansiosos 300.22 Agorafobia sem Histórico de
F40.9 Transtorno fóbico-ansioso, não Transtorno de Pânico
especificado 300.29 Fobia Específica
F 41 Outros transtornos de ansiedade 300.23 Fobia Social
F41.0 Transtorno de pânico 300.3 Transtorno Obsessivo-
F41.1 Transtorno de ansiedade generalizada Compulsivo
F41.2 Transtorno misto de ansiedade e 309.81 Transtorno de Estresse Pós-
depressão Traumático
F41.3 Outros transtornos mistos de ansiedade 308.3 Transtorno de Estresse Agudo
F41.8 Outros transtornos de ansiedade 300.02 Transtorno de Ansiedade
especificados Generalizada
F41.9 Transtorno de ansiedade, não especificado 293.83 Transtorno de Ansiedade
Devido a ... [Indicar a Condição Médica
Geral]
Fonte: OMS, 1993; WHO, 2002.

Os transtornos de ansiedade estão entre os transtornos mentais mais


variados, gerando conseqüências diversas nos acometidos, com impacto
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considerável na qualidade de vida. Com uma ocorrência global de 16,6%, os TA


estão entre os transtornos mentais mais comuns e uma das principais causas de
incapacidade funcional (SOMERS et al., 2006). Dentre os TA, a TAG constitui o
grupo de maior prevalência de casos, conforme verificado nos dois únicos estudos
epidemiológicos relacionados à temática desenvolvidos no Brasil (MARI; JORGE;
KOHN, 2007).
No TAG, o aspecto essencial é a ansiedade, a qual é generalizada e
persistente, mas não restrita a circunstâncias ambientais em particular. Os sintomas
mais presentes são o nervosismo, tremores, tensão muscular, sudorese,
palpitações, tonturas e desconforto epigástrico, onde expressões de medo são
frequentemente verbalizadas, acompanhadas de pressentimentos (OMS, 1993).
Nesta condição, o indivíduo considera difícil controlar a preocupação, assim como
evitar que esta interfira nas tarefas que precisam ser realizadas (APA, 2002).
Os benzodiazepínicos e os ansiolíticos não benzodiazepínicos, tais como a
buspirona, têm sido o pilar para o tratamento dos TA. Como a ansiedade
generalizada tende a ser uma condição crônica, o tratamento farmacológico é muitas
vezes necessário e o uso pode durar muitos anos. Isto levanta a preocupação com a
utilização de benzodiazepínicos, uma vez que estes compostos podem estar
associados a riscos de abuso e dependência (SCHMITT et al., 2005).
Os benzodiazepínicos, a exemplo o diazepam e o clonazepam, possuem
efeitos colaterais como sedação, amnésia, dependência, síndrome de abstinência e
interações com agentes depressores do SNC (ANDREATINI; BOERNGEN-
LACERDA; ZORZETTO FILHO, 2001). Já a buspirona é desprovida de riscos
associados à dependência; no entanto, tem um espectro mais limitado de eficácia e
atraso no início da ação, quando comparada a outros tratamentos (SCHMITT et al.,
2005). Além disso, pode mostrar-se ineficaz em algumas situações, além da possível
demora para o início da ação e insatisfação por parte dos usuários (MARTIN, 1998).
Os antipsicóticos, outro grupo também utilizado em alguns casos de TA,
podem promover o desenvolvimento de parkinsonismo e hiperprolactinemia, além de
apresentar riscos a longo prazo, como discinesia tardia e síndromes metabólicas
(BALLENGER, 1999). Já os antidepressivos utilizados, como venlafaxina, paroxetina
e imipramina, apresentam alta prevalência de não adesão ao tratamento e podem
causar disfunção sexual (TONELLI; ANDREATINI, 2000). Por outro lado, os anti-
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histamínicos, fármacos inespecíficos para o controle da ansiedade, porém utilizados


em alguns casos, são fortemente relacionados com sedação (ANDREATINI;
BOERNGEN-LACERDA; ZORZETTO FILHO, 2001).
Com tais considerações, fitoterápicos e fitofármacos estão sendo cada vez
mais o alvo das pesquisas no campo da farmacoterapia da ansiedade e de outros
transtornos psiquiátricos, haja vista que um dos fatores motivadores desta
preferência tem sido a preocupação com os efeitos adversos ocasionados pelas
drogas sintéticas atuais (FAUSTINO; ALMEIDA; ANDREATINI, 2010), que são
muitas vezes consumidas de maneira abusiva ou incorreta (RATES, 2001).
Outros motivos que disparam a procura por drogas vegetais como recurso
terapêutico em substituição às drogas sintéticas disponíveis no comércio tem sido a
insatisfação com os resultados obtidos com estes medicamentos, a dificuldade de
acesso a eles e a crença de que o natural é desprovido de efeitos indesejáveis
(RATES, 2001).
Frente à dinâmica neuronal bastante complexa, diversos neurotransmissores
envolvem-se na etiopatologia dos TA. O primeiro neurotransmissor apontado como
agente primordial na ansiedade foi o ácido -aminobutírico (GABA). O GABA é o
neurotransmissor inibidor primário do SNC presente no Sistema Límbico, capaz de
atenuar as reações serotoninérgicas responsáveis pela ansiedade (Figura 1).

Figura 1. Representação esquemática do receptor GABAA.


Fonte: STUART et al., 2009.

Ao se combinar com o receptor, o neurotransmissor GABA altera-lhe a


conformação e essa deformação transmite-se ao canal de Cl (Cloro), abrindo-o. Em
conseqüência, íons Cl penetram na célula, onde sua concentração é menor que no
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exterior. Com isso, ocorre uma hiperpolarização da membrana pós-sináptica que


inibe os disparos do neurônio pós-sináptico por dificultar a despolarização de sua
membrana, necessária à geração de impulso nervoso (STUART et al., 2009).
Ao se combinarem com seus receptores, os benzodiazepínicos produzem
uma deformação que afeta o receptor GABA, tornando-o mais apto a receber esse
neurotransmissor. Em decorrência de sua maior afinidade com seu receptor, o
neurotransmissor GABA tem sua ação ampliada, passando a ativar com mais
facilidade os canais de Cl. Assim, sob a ação de benzodiazepínicos, o GABA é
potencializado e a atividade inibitória aumentada (STUART et al., 2009), reduzindo a
ansiedade.
Entretanto, já são conhecidas outras vias envolvidas no mecanismo
ansiogênico-ansiolítico, que incluem a serotoninérgica, noradrenérgica,
glutamatérgica e neuroendócrinas [eixo hipotálamo-pituitária-adrenal e fator de
liberação de corticotrofina], daí o surgimento de novas classes de fármacos com
ação ansiolítica e mecanismos de ação diferentes dos BZD (KENT; MATHEW;
GORMAN, 2002), conforme ilustrado no Quadro 2.

Quadro 2. Mecanismos de ação e efeitos adversos de algumas drogas


utilizadas no tratamento da ansiedade.
DROGA MECANISMO DE AÇÃO EFEITOS ADVERSOS
Ansiolíticos
BZD Bloqueio dos receptores GABAA sedação, dependência, abstinência
Azapirona Bloqueio dos receptores 5-HT1A nervosismo, tontura, cefaléia
(Buspirona)
Antidepressivos
Imipramina ADT Cardiotoxicidade
Fenelzina IMAO visão turva, constipação, mania
Fluoxetina ISRS náusea, vômito, agitação
Antipsicóticos
Haloperidol Bloqueio dos receptores D2-símile Parkinsonismo,hiperprolactinemia
BZD= benzodiazepínicos; ADT= antidepressivo tricíclico; IMAO=inibidor da monoamina oxidase;
ISRS=inibidor seletivo da reabsorção da serotonina
Fonte: PAGE et al., 1999.

É importante ressaltar que, além do mecanismo de ação diversificado e dos


efeitos adversos gerados por cada classe de fármaco, estes ainda são mais ou
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menos indicados para o tratamento de subtipos específicos de transtornos de


ansiedade, como por exemplo, a Buspirona no TAG, os ADT e os ISRS no
transtorno de pânico e os IMAO no transtorno de estresse pós-traumático. Os BZD
são mais indicados para o tratamento dos transtornos ansiosos de curta duração
(PAGE et al., 1999).
Nessa seara, estudos pré-clínicos e clínicos têm sido desenvolvidos com o
intuito de descobrir novas formulações farmacêuticas para o tratamento dos
transtornos de ansiedade, em especial, da ansiedade generalizada (FAUSTINO;
ALMEIDA; ANDREATINI, 2010), revelando-se as plantas medicinais como um
grande potencial para estas descobertas, com o intuito de que sejam desprovidas de
efeitos indesejáveis, mas que tenham igual ou melhor eficácia do que os sintéticos.
Quanto aos estudos pré-clínicos, diversas plantas aromáticas e seus
derivados já foram revelados pela comunidade científica como detentores de
atividade ansiolítica, conforme pode ser verificado ao efetuar buscas nas bases de
dados nacionais e internacionais. São resultados de experimentos que envolvem
óleos essenciais, extratos ou constituintes isolados da matéria vegetal de diversas
plantas, que serão detalhados a seguir.
A revisão sistemática da literatura na busca de estudos pré-clínicos
envolvendo plantas medicinais ou seus compostos bioativos com potencial
ansiolítico foi desenvolvida utilizando os critérios: estudos com plantas cultivadas no
Brasil e comparativos com placebo ou droga padrão e as palavras de busca
“anxiety”, “ansiolytic”, “ansiolytic effect”, “extract”, “essential oil”, “monoterpene”,
“animal models” e “rodents”. Os artigos foram localizados a partir de busca eletrônica
em bases de dados (PubMed e SciELO Brazil). Como resultados da investigação, 28
artigos científicos apresentaram plantas cujos óleos, extratos ou constituintes
secundários apresentaram atividade ansiolítica em modelos animais (Quadro 3).
Estudos com óleos essenciais apontaram atividade ansiolítica das espécies
Cymbopogon citratus (DC.) Stapf (COSTA et al., 2011), Citrus sinensis (L.) Osbeck
(FATURI et al., 2010), Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt & Smith (DE ARAÚJO et al.,
2009), Citrus aurantium L. (PULTRINI; GALINDO; COSTA, 2006) e Lippia Alba (Mill)
N. E. Brown (HATANO et al., 2012).
Estudos com extratos hidro-alcoólicos apontaram atividade ansiolítica nas
espécies Erythrina mulungu Mart. ex Benth (ONUSIC et al., 2002; RIBEIRO et al.,
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2006), Achillea millefolium L. (BARETTA et al., 2012), Erythrina velutina Willd


(RAUPP et al., 2008), Passiflora quadrangularis L. (DE CASTRO et al., 2007),
Kielmeyera coriácea Mart. (AUDI et al., 2002) e Cissus sicyoides L. (DE ALMEIDA et
al., 2009).

Quadro 3. Modelos animais de ansiedade dos estudos pré-clínicos com produtos naturais.
Espécie Material Modelo Autores
Vegetal Experimental
T T T T O
L P T C U
C P C A T
E E R
O
Rauvolfia ligustrina Willd. ex EE X X Mendonça Neto et al.,
Roem. & Schult. 2009
Erythrina mulungu Mart. ex Benth EHA X X X Onusic et al., 2002;
Ribeiro et al., 2006
Bellis perennis L. EE X Marques; Melo; Freitas,
2012
Bauhinia platypetala Benth. ex EE X X Dos Santos et al., 2012
Hemsl.
Passiflora actinia Hooker EM X Dos Santos et al., 2006
-- Florais X De-Souza et al., 2006
de Bach
Hydrocotyle umbellata L. EE X X Rocha et al., 2011
Discaria americana Gillies & Hook EM X Da Silva et al., 2012
Hibiscus tiliaceus L. EM X Vanzella et al., 2012
Pimenta pseudocaryophyllus EE X X Fajemiroye et al., 2012
(Gomes) L. R. Landrum
Achillea millefolium L. EHA X X X Baretta et al., 2012
Justicia pectoralis Jacq. EP X X X Venâncio et al., 2011
Erythrina velutina Willd EHA X Raupp et al., 2008

EHA=extrato hidro-alcoólico; EM=extrato metanólico; EA=extrato aquoso; EE=extrato etanólico;


EP=extrato padronizado; OE=óleo essencial; CI=composto isolado; TLCE=teste do labirinto em cruz
elevado; TCA=teste de campo aberto; TTCE=teste de transição claro-escuro; TPP=teste da placa
perfurada. Fonte: PubMed, ScieLO (2013)
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37
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Quadro 3. Modelos animais de ansiedade dos estudos pré-clínicos com produtos naturais.
(cont.)

Espécie Material Modelo Autores


Vegetal Experimental
T T T T O
L P T C U
C P C A T
E E R
O
Passiflora quadrangularis L. EHA X X X De Castro et al., 2007
Hypericum perforatum L. EP X Beijamini; Andreatini, 2003
Kielmeyera coriacea Mart. EHA X X Audi et al., 2002
Não especificado CI X X Melo et al., 2010
(carvacrol)
Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt & OE X De Araújo et al., 2009
Smith
Citrus aurantium L. OE X X Pultrini;Galindo;Costa,2006
Não especificado CI X X De Almeida et al., 2012
(epóxi-
limoneno)
Não especificado CI X X Souto-Maior et al., 2011
(linalol)
Não especificado CI X X X Gomes et al., 2010
(1,4-cineol)
Não especificado CI X X X Silva et al., 2007
(isopulegol)
Lippia alba (Mill.) N.E. Brown OE + CI X Hatano et al., 2012
(carvona)
Não especificado CI X Linck et al., 2010
(linalol)
Citrus sinensis (L.) Osbeck OE X X Faturi et al., 2010
Cymbopogon citratus (DC) Stapf OE X X Costa et al., 2011
Cissus sicyoides L. EHA X X De Almeida et al., 2009

EHA=extrato hidro-alcoólico; EM=extrato metanólico; EA=extrato aquoso; EE=extrato etanólico;


EP=extrato padronizado; OE=óleo essencial; CI=composto isolado; TLCE=teste do labirinto em cruz
elevado; TCA=teste de campo aberto; TTCE=teste de transição claro-escuro; TPP=teste da placa
perfurada. Fonte: PubMed, ScieLO (2013).
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MOREIRA, M.R.C. Revisão de Literatura
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Atividade ansiolítica de extratos etanólicos foi verificada em trabalhos que


utilizaram as espécies Rauvolfia ligustrina Willd. ex Roem. & Schult. (MENDONÇA
NETO et al., 2009), Bellis perennis L. (MARQUES; MELO; FREITAS, 2012),
Bauhinia platypetala Benth. ex Hemsl. (DOS SANTOS et al., 2012), Hydrocotyle
umbellata L. (ROCHA et al., 2011), Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes) L. R.
Landrum (FAJEMIROYE et al., 2012).
Alguns estudos avaliaram a atividade ansiolítica dos extratos metanólicos
das espécies Passiflora actinia Hooker (DOS SANTOS et al., 2006), Discaria
americana Gillies & Hook (DA SILVA et al., 2012), Hibiscus tiliaceus L. (VANZELLA
et al., 2012).
Extratos padronizados também foram investigados quanto ao potencial
ansiolítico das espécies Justicia pectoralis Jacq. (VENÂNCIO et al., 2011) e
Hypericum perforatum L. (BEIJAMINI; ANDREATINI, 2003).
É importante mencionar ainda um estudo que verificou o potencial ansiolítico
dos Florais de Bach em camundongos machos da linhagem Swiss (De-SOUZA et
al., 2006). Considera-se este um achado importante, uma vez que os Florais de
Bach são largamente utilizados em mais de 50 países e aprovados pela OMS desde
o ano de 1956 (MANTLE apud De-SOUZA et al., 2006), mesmo sem elucidação
prévia quanto ao seu mecanismo de ação terapêutica ou de isolamento de
substâncias químicas que expliquem seus efeitos terapêuticos.
Quanto aos compostos bioativos, alguns estudos buscaram isolar os
componentes que poderiam estar funcionando como o principal agente ansiolítico
dos extratos que apresentaram a atividade, enquanto que outros trabalhos
resumiram-se a identificar os componentes majoritários dos extratos estudados.
Entretanto, alguns trabalhos com compostos especiais, especialmente os terpenos,
tem sido investigados e revelado potencial ansiolítico em estudos com modelos
experimentais.
Estudos com monoterpenos, diterpenos e sesquiterpenos revelaram o
potencial ansiolítico destes compostos das plantas aromáticas. Foi encontrada na
literatura pesquisada a atividade ansiolítica dos terpenos carvacrol (MELO et al.,
2010), epóxi-limoneno (DE ALMEIDA et al., 2012), óxido de linalol (SOUTO-MAIOR
et al., 2011; LINCK et al., 2010), 1,4-cineol (GOMES et al., 2010), isopulegol (SILVA
et al., 2007), entretanto, sem registros de estudos posteriores (ensaios clínicos).
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MOREIRA, M.R.C. Revisão de Literatura
39
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Contrariamente aos estudos pré-clínicos, poucos estudos clínicos


conseguiram evidenciar propriedades ansiolíticas de produtos naturais investigads.
Algumas destas, encontradas na literatura nacional e internacional, apresentam
limitações quanto ao desenho metodológico adotado, número reduzido de
participantes e outros fatores que podem deixar dúvidas quanto à validade dos
resultados apresentados, segundo crivo dos autores (FAUSTINO; ALMEIDA;
ANDREATINI, 2010).
A revisão sistemática da literatura na busca de estudos clínicos envolvendo
plantas medicinais com potencial ansiolítico foi desenvolvida (FAUSTINO; ALMEIDA;
ANDREATINI, 2010), sendo adotados os seguintes critérios: estudos randomizados,
comparativos com placebo ou droga padrão e duplo-cegos, sobre a utilização de
plantas medicinais ou medicamentos fitoterápicos. Os artigos foram localizados a
partir de busca eletrônica em bases de dados (Medline, Web of Science, Cochrane e
SciELO). Como resultados da investigação, sete artigos científicos apresentaram as
plantas Piper methysticum G. Forst (kava-kava), Passiflora incarnata L. (maracujá),
Valeriana officinalis L. (valeriana), Ginkgo biloba L., Galphimia glauca Cav. e
Matricaria recutita (camomila) como eficazes no tratamento da ansiedade.
Dois estudos utilizaram o extrato de kava-kava nas investigações, onde o
primeiro (CONNOR; DAVIDSON, 2002) apresentou melhor efeito do grupo placebo
sobre o grupo teste, além de não ter apresentado dados sobre o grupo padrão, o
que põe em dúvida os resultados apresentados. O outro estudo (BOERNER et al.,
2003), comparou o extrato com as drogas-padrão opipramol e buspirona, revelando
ausência estatística entre os grupos. A limitação deste estudo foi a ausência do
grupo placebo, o que dificulta uma melhor validação dos resultados evidenciados.
O estudo que utilizou o extrato de Passiflora incarnata L. foi comparado com
oxazepam (AKHONDZADEH et al., 2001). Os resultados apontaram ausência
estatística entre os grupos, revelando efeito ansiolítico. Entretanto, a ausência do
grupo placebo constituiu fator limitante do estudo, além do pequeno tamanho da
amostra (16 participantes por grupo).
No estudo que investigou o extrato de Valeriana officinalis L. (ANDREATINI et
al., 2002), comparou-se o extrato com o placebo e com o diazepam, onde os grupos
apresentaram resultados similares, o que não deixa claro o efeito ansiolítico do

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MOREIRA, M.R.C. Revisão de Literatura
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extrato. Outro fator limitante do estudo foi o pequeno número de participantes (12
por grupo).
As investigações sobre o Ginkgo biloba L. resultaram da comparação do seu
extrato padronizado com o placebo (WOELK et al., 2007). Os resultados apontaram
melhor efeito do extrato quando comparado ao placebo, entretanto, não foi possível
comparar seu efeito com alguma droga padrão, o que torna o estudo carente de
novos testes.
Investigação com Galphimia glauca Cav. foi realizado, comparando-se o
extrato ao lorazepam (HERRERA-ARELLANO et al., 2007), onde não foram
encontradas diferenças estatísticas entre os grupos, revelando seu potencial
ansiolítico. A ausência do grupo placebo foi um aspecto limitante do estudo.
A camomila foi investigada ao comparar seu extrato padronizado com placebo
(AMSTERDAM et al., 2009). Os resultados apontaram diferenças estatísticas entre
os grupos, indicando potencial ansiolítico. Entretanto, a ausência da droga padrão e
o número de participantes (28 por grupo) foram aspectos limitantes do estudo.
Uma investigação utilizando o fitoterápico composto por CPV (extrato seco de
Crataegus oxyacantha L., Passiflora incarnata L. e Valeriana officinalis L.) em
animais de laboratório evidenciou sua atividade ansiolítica nos animais submetidos
ao teste do labirinto em cruz elevado, ratificando os efeitos manifestos por estas
plantas, quando analisadas separadamente (TABACH; MATTEI; CARLINI, 2009).

3 Considerações sobre Myrtus communis L. e o monoterpeno (-)-mirtenol

Myrtaceae (do grego Myrtus = perfume) é uma família botânica com cerca de
145 gêneros e mais de 3650 espécies de árvores e arbustos que se distribuem por
todos os continentes (DAHLGREN; THORNE, 1984 apud DONATO; DE
MORRETES, 2007).
No Brasil existem 23 gêneros e cerca de 1.000 espécies de Myrtaceae. No
Brasil, a família Myrtaceae compreende diversos gêneros de árvores e arbustos que
podem ser utilizados de forma ornamental ou na produção comercial de frutos.
Nesta classificação estão inclusas a goiaba, a pitanga e a jabuticaba (DELGADO,
2006 apud CONCEIÇÃO; ARAGÃO, 2010).
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41
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Myrtus communis L. (Figura 2) é uma planta arbustiva aromática procedente


da região mediterrânica da Europa, que possui flores e frutos (Figura 3), sendo muito
cultivada mundialmente. Pertencente à família Myrtaceae, é conhecida
popularmente como “murta-comum” ou “mirta”; o seu habitat preferencial é xerofílico
(seco), podendo ser encontrada em diversas regiões do Brasil, tradicionalmente
utilizada como medicamento no sul do país, onde suas folhas são empregadas no
tratamento de problemas estomacais (SALVAGNANI et al., 2008).

Figura 2. Myrtus communis L.


Fonte: ÖZKAN; GÜRAY, 2009

A mirta é amplamente utilizada em parques, jardins e vias públicas (DE


AZEREDO; RODRIGUES; CASSINO, 2004) e, por apresentar em sua composição
química monoterpenos, diterpenos, cetonas e alcoóis, pode ser considerada como
uma potencial riqueza em exploração pela indústria farmacêutica.

(A) (B)

Figura 3. Flores (A) e frutos (B) de mirta.


Fonte: http://www.florestar.net/murta/murta.html
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42
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Diversas indicações medicinais tradicionais estão atribuídas à mirta. Textos


médicos egípcios já referiam seu uso como remédio para desordens urinárias,
dores, azia, inchaços e expectorante. Na Grécia, era utilizada como contraceptivo,
através da aplicação de uma pasta no colo do útero com o intuito de bloquear a
passagem dos espermatozóides, sendo denominada de “remédio anti-fertilidade”.
Em Roma, há relatos de uso da mirta como constipante e como remédio para
diarréia, além de ser componente na confecção de vinhos. Na Turquia, era utilizada
contra queixas respiratórias, picadas de aranhas venenosas e escorpiões,
inflamações intestinais e problemas menstruais (ÖZKAN; GÜRAY, 2009).
Quanto aos estudos científicos, diversas são as atividades farmacológicas
identificadas com a mirta. Suas propriedades antibacterianas foram verificadas em
estudos in vitro contra as formas Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Klebsiella aerogenes,
Salmonella typhi e Shigiella (ALEM et al., 2008); o óleo essencial contra Escherichia
coli, Staphylococcus aureus e Candida albicans (YADEGARINIA et al., 2006),
Mycobacterium tuberculosis (ZANETTI et al., 2010) e Helicobacter pylori (DERIU et
al., 2007); o extrato metanólico contra Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus,
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae,
Listeria monocytogenes [bactérias Gram positivas] e Escherichia coli, Proteus
vulgaris, Pseudomonas aeruginosa e Campylobacter jejuni [bactérias Gram
negativas] (MANSOURI et al., 2001) e o extrato aquoso contra Pseudomonas
aeruginosa (AL-SAIMARY, 2002).
As propriedades antifúngicas contra Aspergillus (MOHAMMADI et al., 2008),
antiinflamatórias (AL-HINDAWI et al., 1989; FEISST et al., 2005), antioxidantes
(AMENSOUR et al., 2010; MONTORO et al., 2006; MIMICA-DUKIC et al., 2010) e
contra Trichomonas vaginallis (MAHDI; GANY; SHARIEF, 2006) também foram
verificadas.
Ainda há registros científicos do efeito protetor de mirta contra a
hipercolesterolemia (ROSA et al., 2008), hiperglicemia (ELFELLAH; AKHTER;
KHAN, 1984; SEPICI et al., 2004; SEPICI-DINCEL et al., 2007; BENKHAYAL et al.,
2009) e úlcera gástrica (SUMBUL et al., 2010) em animais de laboratório, atividades
anticancerígena (TRETIAKOVA et al., 2008) e antimutagênica (HAYDER et al.,

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MOREIRA, M.R.C. Revisão de Literatura
43
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2003; 2008), além de exercer efeito protetor contra a estomatite aftosa (BABAEE et
al., 2010) em pacientes tratados com uma pasta à base de mirta.
O óleo essencial de mirta é constituído de três grupos de metabólitos
secundários: monoterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanóides (DE LAURENTIS et
al., 2005; FARAH et al., 2006; BHATIA et al., 2008). A composição fitoquímica do
óleo essencial é: 1,8-cineol, α-pineno, α-terpineno, α-terpineol, acetato de α-terpinil,
acetato de mirtenil, acetato de neril, β-cariofileno, β-cimeno, β-pineno, butirato de
isobutil, cis-carveol, felandreno, geraniol, limoneno, linalol, metil-benzoato, metil-
butirato, metil-eugenol, metil-geranato, mirceno, sabineno, terpineol, trans-carveol e
mirtenol (SUMBUL et al., 2011).
Dentre esses metabólitos, os monoterpenos aparecem como componentes
majoritários, a exemplo o (-)-mirtenol, também conhecido como “cis-mirtenol” ou
simplesmente “mirtenol”, um monoterpeno representante do grupo químico dos
alcoóis monocíclicos, que pode ser obtido por hidrodestilação a partir das folhas de
mirta, sendo suas formas isoméricas (+)-mirtenol e (-)-mirtenol provavelmente as
mais versáteis.
Mirtenol pode ser encontrado em diversas espécies de plantas aromáticas,
sendo algumas delas: Cyperus articulatus L. (COUCHMAN; PINDER; BROMHAM,
1964), da família Cyperaceae; Fragaria chiloensis spp. (AHARONI et. al., 2004), da
família Rosaceae; Tanacetum vulgare L. (KESKITALO; PEHU; SIMON, 2001;
JUDZENTIENE; MOCKUTE, 2005; DICKEL; RATES; RITTER, 2007) e Achillea
ligustica All. (MAGGI et al., 2009), pertencentes à família Asteraceae; Rosmarinus
officinalis L. (USAI et al., 2011), Salvia hydrangea DC. ex Benth (KOTAN et al.,
2008), Salvia hypoleuca Benth (NICKAVAR; MOJAB; ASGARPANAH, 2005), Salvia
lanígera Poir (TENORE et al., 2011), Salvia microstegia Boiss ex. Balansa
(SENATORE et al., 2006) e Salvia multicaulis Vahl. var. simplicifolia Boiss
(SENATORE; ARNOLD; PIOZZI, 2004), pertencentes à família Lamiaceae; Myrtus
communis L. (GUARRERA; LEPORATTI, 2007), da família Myrtaceae e Paeonia
lactiflora Pall (NGAN et al., 2012), da família Paeoniaceae.
Embora inicialmente utilizado como agente flavorizante de perfumes e vinhos,
estudos com plantas que apresentam o mirtenol em sua composição têm revelado
potenciais efeitos farmacológicos.

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MOREIRA, M.R.C. Revisão de Literatura
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Um estudo que utilizou uma planta herbácea da Europa central que é utilizada
em tratamentos relacionados à memória e aprendizagem, a resposta imune, a
função dos órgãos e a terapia de câncer, revelou que o mirtenol é o segundo
composto majoritário na referida planta. Embora, neste estudo, o mirtenol não tenha
sido investigado isoladamente, os resultados apontam que este monoterpenóide
possui estreita relação com as propriedades terapêuticas atribuídas a essa planta
estudada (EVSTATIEVA et al., 2010).
Outro estudo, utilizando ratos, verificou o efeito do mirtenol associado ao
controle da hipertensão arterial, cujo efeito hipotensor já havia sido evidenciado por
outros monoterpenos (SANTOS et al., 2011).
Mais recentemente, o mirtenol vem sendo estudado por seu potencial efeito
antimicrobiano e antifúngico. Um estudo que investigou as propriedades bactericidas
do mirtenol utilizando bactérias gram-positivas e negativas revelou o efeito
desinfetante do mirtenol sobre ambas, sugerindo seu uso no preparo de substâncias
desinfetantes para prevenir contra a contaminação bacteriana (LEPOITTEVIN et al.,
2011).
Pesquisadores relataram também que o mirtenol inibe convulsões induzidas
por pentilenotetrazol em roedores (SALVADORI et al., 2012). Além disso, outra
investigação recente tem apresentado o mirtenol como potencial agente protetor
gástrico e antiulcerogênico, em testes realizados com ratos e camundongos com
úlcera gástrica induzida por etanol (VIANA et al., 2013).
Esses estudos, bastante promissores no campo da psicofarmacologia, abrem
novas possibilidades para investigar as propriedades farmacológicas do mirtenol
sobre o sistema nervoso central e doenças correlatas; entretanto, o que já se sabe
sobre este monoterpeno é suficiente para subsidiar a formulação de compostos
medicamentosos que substituam os já disponíveis no comércio, garantindo bons
resultados terapêuticos com menos efeitos colaterais.

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MOREIRA, M.R.C. Revisão de Literatura
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OBJETIVOS

1 OBJETIVO GERAL

Investigar a influência do mirtenol sobre o sistema nervoso central de


roedores, especialmente para verificar seus efeitos ansiolíticos, neurolépticos e
anticonvulsivantes, além do seu perfil antioxidante e potencial tóxico de forma
aguda, subaguda, subcrônica e crônica, após doses repetidas.

2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Verificar os possíveis efeitos do mirtenol em nível do SNC de modelos


experimentais de ansiedade, catatonia e convulsão;

 Estabelecer possíveis mecanismos de ação ansiolítica, neuroléptica e


anticonvulsivante do mirtenol através de metodologias farmacológicas e
neuroquímicas;

 Verificar o potencial tóxico do mirtenol após tratamento agudo, subagudo,


subcrônico e crônico com doses repetidas;

 Avaliar o perfil antioxidante do mirtenol, através de metodologias in vitro e in


vivo.

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MOREIRA, M.R.C. Objetivos
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MATERIAL E MÉTODOS

1 MATERIAL

1.1 Animais

Para realização dos experimentos foram utilizados camundongos da linhagem


Swiss (Mus musculus), albinos, machos, com massa corporal variando entre 25-35
gramas, com aproximadamente 3 meses de idade, e ratos da linhagem Wistar
(Rattus novergicus), machos, albinos, com massa corporal variando entre 250–300
gramas (Figura 4), com aproximadamente 3 meses de idade, provenientes do
Biotério Central do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Piauí.

(A) (B)

Figura 4. Animais experimentais utilizados no estudo.


(A) Camundongo Swiss e (B) Rato Wistar.
Fonte: arquivo pessoal.

Os animais foram mantidos alojados em gaiolas de polipropileno, contendo


dez animais cada, mantidos sob condições monitoradas de temperatura equivalente
a 22±1°C, com livre acesso a ração tipo pellets (Purina®) e água (mamadeiras
especiais para gaiolas), em ciclo claro/escuro de 12 horas (fase clara de 6:00 - 18:00
e fase escura de 18:00 - 6:00).
Antes da realização de qualquer ensaio experimental, os animais foram
colocados sobre a bancada da sala de testes, por pelo menos 30 minutos, para que
os mesmos pudessem adaptar-se ao ambiente, evitando-se assim possíveis
interferências nos experimentos. Todos os experimentos foram realizados no
período de 8:00 às 17:00.
Os testes experimentais foram realizados no Laboratório de Pesquisas em
Neuroquímica Experimental da Universidade Federal do Piauí (LAPNEX/UFPI).
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
49
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Previamente ao início dos experimentos in vivo, o projeto foi submetido ao


Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal do Piauí,
aprovado para execução com protocolo CEEA UFPI 013/2011 (ANEXO A).

1.2 Drogas e reagentes

O mirtenol apresenta a fórmula química C10H16O (Figura 5). Tem como


sinônimos: (-)-Mirtenol; (1R)-2-Pineno-10-ol; (1R)-6,6-Dimetilbiciclo[3.1.1]hept-2-eno-
2-metanol. Está registrado no CAS sob o número 19894-97-4. Seu peso molecular é
equivalente a 152,23 g/mol e apresenta grau de pureza de  95%. Seu ponto de
ebulição corresponde a 221-222 °C e sua densidade de vapor é 0,954 g/mL a 25 °C
(SIGMA-ALDRICH BRASIL, 2013). Com relação as suas propriedades físico-
químicas, tem aparência incolor a amarelo pálido e encontra-se naturalmente na
forma líquida com aspecto oleoso.

Figura 5. Estrutura química do mirtenol.

Nos ensaios in vitro, foram utilizadas as concentrações de 0,9, 1,8, 3,6, 5,4 e
7,2µg/mL de mirtenol. Outras drogas utilizadas nos ensaios in vitro foram o 2-
desoxirribose, ácido acético, AAPH (2,2’-azobis [2 metilpropionamidina]
diidroclorido), reagente de Griess, peróxido de hidrogênio, tampão fosfato,
nitroprussiato de sódio, TBA (Ácido Tiobarbitúrico), TBARS (substâncias reativas do
ácido tiobarbitúrico) e Trolox [6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido
carboxilíco], utilizado como controle positivo.
Nos experimentos in vivo, mirtenol foi administrado nas doses de 25, 50 e
75mg/kg, por via intraperitoneal, para os testes de verificação do efeito ansiolítico e
neuroléptico, e 50, 100 e 150 mg/kg, por via oral, para os testes de verificação do
efeito anticonvulsivante. Todas as doses foram calculadas de forma a possibilitar a

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
50
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injeção de 0,1mL/10g de massa de cada camundongo e 1mL/10g de massa de cada


rato. O veículo utilizado como controle negativo foi composto por solução de Tween
80 a 0,05% dissolvido em salina 0,9% e as drogas padrão utilizadas no controle
positivo (Diazepam, 5mg/kg; Haloperidol, 4mg/kg; Flumazenil, 5mg/kg) foram
diluídas em solução salina 0,9% antes da administração.
Todo o mirtenol utilizado foi adquirido da empresa Sigma Aldrich (EUA) e
gentilmente cedido pelo Laboratório de Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
(LAPROBIO) da Universidade Federal de Sergipe (UFS).

1.3 Aparelhagem

1.3.1. Aparelho de Campo Aberto


O aparato consiste em uma caixa de acrílico, com dimensões 30 cm de
comprimento por 30 cm de largura por 15 cm de altura, com piso dividido em
quadrantes [quatro para ratos e nove para camundongos], onde o centro da caixa é
o local de posicionamento do animal para observação (ARCHER, 1973). O piso é
dividido para melhor mensurar a locomoção. A iluminação é freqüentemente intensa
para provocar aversão (RAMOS; MORMÈDE, 2007).

Figura 6. Aparelho de Campo Aberto.


Fonte: Arquivo pessoal.

1.3.2. Aparelho Rota Rod


O aparelho utilizado é o modelo EFF412 da marca Insight, Brasil,
confeccionado em acrílico resistente, com 450mm de altura por 540mm de largura
por 350mm de profundidade, divididos em 4 compartimentos iguais (baias)
separados por paredes de plásticas. Possui uma barra giratória suspensa, com
velocidade regulável em rotações por minuto (r.p.m.).
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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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As baias possuem sistema de detecção de queda do animal através de


impacto, em um circuito micro-processado que liga uma prancha ao contador digital,
para cronometragem de permanência do animal na baia e contagem de vezes em
que este caiu. Assim, por meio do impacto do animal sob a prancha (queda da
barra), o contador do tempo é imediatamente interrompido e o número de quedas é
registrado (GRUPO INSIGHT LTDA, 2013).

Figura 7. Aparelho Rota Rod.


Fonte: Arquivo pessoal.

1.3.3. Aparelho do Labirinto em Cruz Elevado (LCE)


O aparelho utilizado foi fabricado conforme o modelo da marca Insight,
Brasil, que consiste de quatro braços, sendo dois com paredes laterais (braços
fechados), com 30cm de comprimento, 25cm de altura e 5cm de largura, fixados
perpendicularmente a dois sem paredes (braços abertos), com mesmo comprimento
e largura. Cada braço forma um ângulo de 90º do braço adjacente e ambos são
conectados por uma plataforma central, com 5cm de comprimento por 5cm de
largura, onde o animal é posicionado para observação. O labirinto é apoiado sob um
suporte, ficando a 45cm do solo (LISTER, 1987).

Figura 8. Labirinto em cruz elevado.


Fonte: Arquivo pessoal.
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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
52
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1.3.4. Aparelho de Transição Claro-Escuro


O aparato, de modelo EP157C da marca Insight, Brasil, consiste em uma
caixa de acrílico, de dimensões 27cm de largura por 20cm de altura por 45cm de
comprimento, dividida em dois quadrantes, sendo um na cor branca, representando
2/3 do total da caixa e o outro em acrílico preto, representando 1/3 do total. Entre os
dois compartimentos, há uma abertura de 5cm x 5cm, que permite a passagem livre
do animal (CRAWLEY; GOODWIN, 1980).

Figura 9. Aparelho de Transição Claro - Escuro.


Fonte: Arquivo pessoal.

2 MÉTODOS

O delineamento experimental para realização dos testes psicofarmcológicos


utilizados para verificar a atividade do mirtenol está detalhado em três esquemas:

- Esquema do estudo do efeito do mirtenol sobre o SNC (Figura 10)


- Esquema do estudo do potencial tóxico do mirtenol (Figura 11)
- Esquema do estudo do perfil antioxidante do mirtenol (Figura 12)

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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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Figura 10. Esquema do estudo dos efeitos do mirtenol sobre o SNC.


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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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Figura 11. Esquema do estudo do potencial tóxico do mirtenol.

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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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Figura 12. Esquema do estudo do perfil antioxidante do mirtenol.

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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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2.1. Avaliação geral da atividade no Sistema Nervoso Central

2.1.1 Teste de movimentação espontânea (Campo Aberto)

Este teste é baseado na metodologia descrita por Sielgel (1946) e validado


por Archer (1973). Tem como objetivo primordial avaliar a locomoção de animais ou
a reatividade emocional de roedores tratados com a substância de interesse no
estudo.
O pressuposto deste teste é que maior emocionalidade dos animais se
manifesta em ambientes amplos, nos quais os roedores, por instinto, se locomovem
perto das paredes, onde se sentem mais protegidos. Assim, agentes ansiolíticos
tendem a aumentar a movimentação dos animais, ao passo que os ansiogênicos
provocam redução dos movimentos espontâneos.
O protocolo consiste em posicionar o animal no centro do campo aberto e
registrar os comportamentos através da observação sistemática do pesquisador. Os
parâmetros avaliados (Figura 13) são o número de cruzamentos nos quadrantes
invadidos com as quatro patas pelo animal (crossing); o número de empinamentos
do animal apoiado apenas sobre as patas traseiras (rearing); e o reflexo de auto-
limpeza do animal, no qual o roedor desliza as patas dianteiras nas vibrissas,
orelhas e cabeça (grooming).

(A) (B) (C)

Figura 13. Parâmetros observados no Teste do Campo Aberto.


(A) Animal realizando Crossing. (B) Animal efetuando Rearing. (C) Animal fazendo Grooming.
Fonte: Arquivo pessoal.

Neste estudo, camundongos foram reunidos em cinco grupos de 10 animais


(n=10), sendo um tratado com veículo, três com mirtenol e um com diazepam. Após
30 minutos dos tratamentos, cada animal foi submetido individualmente ao teste e
observado por cinco minutos (Figura 14).

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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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Tratamento com mirtenol, Animal posicionado


veículo ou diazepam no campo aberto Término do teste

Tempo 0 min 30 min 35 min

Animal mantido Observação


na gaiola do animal

Figura 14. Protocolo experimental do mirtenol no teste do Campo Aberto.

Após este procedimento experimental, realizou-se a avaliação da possível


participação do sítio benzodiazepínico dos receptores GABAA no efeito do mirtenol
sobre a movimentação espontânea. Para este fim, três grupos de 10 camundongos
(n=10) foram pré-tratados com flumazenil, um antagonista competitivo do receptor
central benzodiazepínico, e após 15 minutos foram tratados com o veículo, mirtenol
ou diazepam. Decorridos 30 minutos, a movimentação espontânea dos animais foi
verificada (Figura 15).

Tratamento com
Pré-tratamento mirtenol, veículo Animal posicionado
com Flumazenil ou diazepam no campo aberto Término do teste

Tempo 0 min 15 min 45 min 50 min

Animal mantido Observação


na gaiola do animal

Figura 15. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de ação


do mirtenol no teste do Campo Aberto.

Após a observação de cada animal foi realizada a limpeza da caixa com


álcool para remover quaisquer sujeiras que pudessem atrapalhar a deambulação
espontânea e/ou observação do animal seguinte.

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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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2.1.2 Teste de coordenação motora (Rota Rod)

O teste do Rota Rod foi inicialmente descrito por Dunham e Miya (1957) e
validado por Carlini e Burgos (1979). Tem como objetivo verificar se a droga testada
interfere na coordenação motora dos animais [atividade neurotóxica ou
miorrelaxante] (HAMM et al., 1994).
O pressuposto deste teste é que algumas drogas podem alterar a
coordenação motora dos animais, podendo ser um indicativo de efeito indesejado da
substância investigada.
O protocolo consiste em posicionar o animal com as quatro patas sobre a
barra giratória de 2,5cm de diâmetro e registrar seu desempenho através da
observação sistemática do pesquisador. Os parâmetros avaliados (Figura 16) são o
tempo de permanência na barra giratória e o número de quedas da barra.

(A) (B)

Figura 16. Parâmetros observados noTeste do Rota Rod.


(A) Permanência do animal na barra. (B) Quedas do animal da barra.
Fonte: Arquivo pessoal.

Neste estudo, ratos foram reunidos em cinco grupos de 10 animais (n=10),


sendo um tratado com veículo, três com mirtenol e um com diazepam. Após 30
minutos dos tratamentos, cada animal foi posicionado individualmente na barra
giratória, sob velocidade de rotação de 7 r.p.m. e observado por três minutos (Figura
17).

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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Tratamento com mirtenol, Animal posicionado


veículo ou diazepam no Rota Rod Término do teste

Tempo 0 min 30 min 33 min

Animal mantido Observação


na gaiola do animal

Figura 17. Protocolo experimental do mirtenol no Teste do Rota Rod.

Após este procedimento experimental, realizou-se a avaliação da possível


participação do sítio benzodiazepínico dos receptores GABAA no efeito do mirtenol
sobre a coordenação motora dos animais. Para este fim, três grupos de 10
camundongos (n=10) foram pré-tratados com flumazenil e, após 15 minutos, foram
tratados com o veículo, mirtenol ou diazepam. Decorridos 30 minutos, a
movimentação espontânea dos animais foi verificada (Figura 18).

Tratamento com
Pré-tratamento mirtenol, veículo Animal posicionado
com Flumazenil ou diazepam na barra giratória Término do teste

Tempo 0 min 15 min 30 min 35 min

Animal mantido Observação


na gaiola do animal

Figura 18. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de ação


do mirtenol no teste do Rota Rod.

Após a observação de cada animal foi realizada a limpeza da baia com álcool,
para remover os bolos fecais que pudessem atrapalhar a movimentação do animal
seguinte.

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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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2.2. Avaliação da atividade ansiolítica

2.2.1. Teste do Labirinto em Cruz Elevado (TLCE)

Este teste foi originalmente descrito para ratos (PELLOW et. al., 1985) e
posteriormente validado para camundongos (LISTER, 1987), sendo adequado para
verificar o comportamento ansiolítico/ansiogênico do animal com o intuito de
desvelar novos agentes ansiolíticos (PELLOW; FILE, 1986; DAWSON;
TRICKLEBANK, 1995).
O TLCE tem como princípio básico a geração de respostas comportamentais
no animal semelhantes às de humanos em situações de ansiedade. O roedor é
exposto a uma combinação de dois aspectos: ambiente aberto e altura, o que gera a
alteração do seu comportamento natural, que é refugiar-se em ambientes sombrios
e lá permanecer, esquivando-se também de lugares elevados (BRADLEY et al,
2007).
O pressuposto deste teste é que drogas ansiolíticas favorecem o aumento do
número de entradas e a permanência do animal nos braços abertos, enquanto que
as ansiogênicas induzem as mesmas alterações comportamentais nos braços
fechados.
O protocolo consiste em posicionar o animal centro da cruz (área neutra), com
a cabeça voltada para um dos braços fechados e registrar a movimentação do
animal através da observação sistemática do pesquisador. Os parâmetros avaliados
(Figura 19) são o número de entradas nos braços abertos (NEBA), a porcentagem
de entradas nos braços abertos (PEBA), o tempo de permanência nos braços
abertos (TPBA) e a porcentagem de tempo de permanência nos braços abertos
(PTBA). Considera-se que o rato entra em um dos braços quando ele está com as
quatro patas fora do centro da cruz (GRUNDMANN et al., 2007; BIALA; KRUK,
2008).

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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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(A)
(B)

Figura 19. Parâmetros observados no TLCE.


(A) Animal no braço fechado. (B) Animal no braço aberto.
Fonte: Arquivo pessoal.

Neste experimento, ratos foram reunidos em cinco grupos de 10 animais cada


(n=10), sendo um grupo tratado com veículo, um com diazepam e os outros com as
doses-teste de mirtenol. Trinta minutos após os tratamentos, cada animal foi
colocado no centro do labirinto e observado por cinco minutos (Figura 20).

Tratamento com mirtenol, Animal posicionado


veículo ou diazepam no LCE Término do teste

Tempo 0 min 30 min 35 min

Animal mantido Observação


na gaiola do animal

Figura 20. Protocolo experimental do mirtenol no Teste do LCE.

Após este procedimento experimental, realizou-se a avaliação da possível


participação do sítio benzodiazepínico dos receptores GABAA no efeito do mirtenol
sobre a movimentação dos animais nos braços abertos do labirinto. Para este fim,
três grupos de 10 camundongos (n=10) foram pré-tratados com flumazenil e, após
15 minutos, foram tratados com o veículo, mirtenol ou diazepam. Decorridos 30
minutos, os animais foram observados (Figura 21).
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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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Tratamento com
Pré-tratamento mirtenol, veículo Animal posicionado
com Flumazenil ou diazepam no LCE Término do teste

Tempo 0 min 15 min 30 min 35 min

Animal mantido Observação


na gaiola do animal

Figura 21. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de ação


do mirtenol no Teste do LCE.

Após a observação de cada animal realizou-se a limpeza dos braços com


álcool, para remover os bolos fecais que pudessem atrapalhar a movimentação do
animal seguinte.

2.2.2. Teste da Transição Claro - Escuro

Este teste foi originalmente elaborado por Crawley e Goodwin (1980), sendo
muito utilizado para avaliar o poder ansiolítico/ansiogênico de drogas experimentais.
Tem como princípio básico o conflito natural que ocorre quando os animais são
expostos a um ambiente não familiar, que é gerado devido à tendência natural do
roedor de evitar o desconhecido.
O pressuposto deste modelo é que as drogas ansiolíticas induzem um
aumento nos comportamentos executados na parte clara. Um aumento na transição
entre o ambiente claro e escuro, sem um aumento na locomoção espontânea, é
considerado reflexo da atividade ansiolítica (BOURIN; HASCÖET, 2003; GARGANO,
2007).
O protocolo consiste em posicionar o animal no lado claro da caixa, com a
cabeça voltada para a abertura de comunicação com o lado escuro e registrar a
movimentação do animal através da observação sistemática do pesquisador. Os
parâmetros avaliados (Figura 22) são a latência para a primeira entrada no lado
escuro da caixa, o tempo total de permanência no compartimento claro e o número
de transições entre eles.
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(A) (B) (C)

Figura 22. Parâmetros observados no Teste de Transição Claro - Escuro.


(A) Animal na parte clara. (B) Animal na parte escura. (C) Animal em transição livre.
Fonte: Arquivo pessoal.

Neste teste, ratos foram reunidos em cinco grupos de 10 animais cada (n=10),
onde um grupo foi tratado com veículo, um com diazepam e os outros três com as
doses-teste de mirtenol. Trinta minutos após os tratamentos, cada animal foi
colocado na caixa e observado por um período de cinco minutos (Figura 23).

Tratamento com mirtenol, Animal posicionado


veículo ou diazepam na caixa Término do teste

Tempo 0 min 30 min 35 min

Animal mantido Observação


na gaiola do animal

Figura 23. Protocolo experimental do mirtenol no Teste de Transição Claro - Escuro.

Após este procedimento experimental, realizou-se a avaliação da possível


participação do sítio benzodiazepínico dos receptores GABAA no efeito do mirtenol
sobre a coordenação motora dos animais. Para este fim, três grupos de 10
camundongos (n=10) foram pré-tratados com flumazenil e, após 15 minutos, foram
tratados com o veículo, mirtenol ou diazepam. Decorridos 30 minutos, a
movimentação espontânea dos animais foi verificada (Figura 24).

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Tratamento com
Pré-tratamento mirtenol, veículo Animal posicionado
com Flumazenil ou diazepam na caixa Término do teste

Tempo 0 min 15 min 30 min 35 min

Animal mantido Observação


na gaiola do animal

Figura 24. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de ação


do mirtenol no Teste de Transição Claro - Escuro.

Após a observação de cada animal foi realizada a limpeza da caixa para


remover os bolos fecais que pudessem atrapalhar a observação do animal seguinte.

2.3. Avaliação da atividade anticonvulsivante

2.3.1. Teste da convulsão induzida por picrotoxina (PIC), pentilenotetrazol (PTZ) ou


pilocarpina (P)

O Teste tem como princípio básico a definição de convulsão induzida no


animal, que é uma manifestação clínica caracterizada pelos episódios de tremores
irregulares e constantes, em frequência variada, podendo ter o desfecho ou não de
morte.
O pressuposto deste teste é que algumas drogas promovem episódios
convulsivos, podendo ter como desfecho a morte, sendo estes os indicativos de que
a substância apresenta efeito indesejado no animal e é então classificada como
convulsivante. Do contrário, tem-se uma substância com perfil anticonvulsivante.
O protocolo (Figura 25) consiste em colocar o animal em um recipiente após o
tratamento, para ser observado livremente pelo pesquisador. Os parâmetros
avaliados são o tempo de latência para o início das convulsões, o percentual de
convulsões e o percentual de mortes dos animais.

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Neste experimento, ratos foram reunidos em seis grupos de oito animais cada
(n=8), sendo um grupo tratado com veículo, um com picrotoxina, um com diazepam
e os outros com as doses-teste de mirtenol. Todos os grupos receberam picrotoxina,
pentilenotetrazol ou pilocarpina antes do início das observações. Os animais foram
observados por até 24 horas após os tratamentos.

Tratamento
com controle, Tratamento com Término
DZP, mirtenol PIC, PTZ ou P do teste

Tempo 0 min 30 min Até 24 horas

Animal mantido Observação


na gaiola do animal

Figura 25. Protocolo experimental do mirtenol no Teste de Convulsão induzida por PIC, PTZ ou P.

Após este procedimento experimental, realizou-se a avaliação da possível


participação do sítio benzodiazepínico dos receptores GABAA no efeito do mirtenol
sobre a convulsão induzida. Para este fim, três grupos de oito camundongos (n=8)
foram pré-tratados com flumazenil, um antagonista competitivo do receptor central
benzodiazepínico, e após 15 minutos foram tratados com o veículo, mirtenol ou
diazepam. Decorridos 30 minutos, os animais foram observados (Figura 26).

Tratamento
Tratamento com Tratamento com com controle, Término
PIC, PTZ ou P Flumazenil DZP, mirtenol do teste

Tempo 0 min 15 min 30 min 35 min

Animal mantido Animal mantido Observação


na gaiola na gaiola do animal

Figura 26. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de ação do mirtenol
no Teste de Convulsão induzida por PIC, PTZ ou P.

Após a observação de cada animal foi realizada a limpeza do recipiente para


remover os bolos fecais que pudessem atrapalhar a observação seguinte.
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2.4. Avaliação da atividade neuroléptica

2.4.1. Teste da Catalepsia

Este teste foi originalmente descrito por Carlini (1973), sendo adequado para
verificar o comportamento estereotipado do animal quando está sob o efeito de
drogas antipsicóticas com poder de causar alterações motoras do tipo catatônicas.
O Teste tem como princípio básico a definição de catalepsia ou catatonia, que
é uma manifestação clínica caracterizada pela rigidez muscular, apresentando tanto
imobilidade posicional quanto dificuldade de iniciar movimentos voluntários
(CORREIA; FERNANDES; BERNARDI, 2008), levando à permanência do indivíduo
em postura prolongada. Em animais de laboratório, é definida pelo tempo em que o
animal permanece imóvel na postura que lhe é imposta, pois, por ser incômoda para
o animal, este tem a tendência natural de sair dela o mais rápido possível.
O pressuposto deste teste é que algumas drogas promovem a permanência
do animal em postura antifisiológica (incômoda), sendo este um indicativo de que a
substância apresenta efeito indesejado sobre o sistema locomotor.
O protocolo consiste em posicionar o animal sobre uma barra de madeira ou
vidro, elevada a 6,5 cm do chão, apoiado apenas pelas patas dianteiras e observado
livremente pelo pesquisador. Os parâmetros avaliados (Figura 27) são o tempo de
latência para retirada de uma ou ambas as patas da barra.

(A) (B)

Figura 27. Parâmetros observados no Teste da Catatonia.


(A) Animal posicionado na barra em estado de latência. (B) Animal saindo da posição antifisiológica.
Fonte: Arquivo pessoal.

Neste experimento, ratos foram reunidos em cinco grupos de 8 animais cada


(n=8), sendo um grupo tratado com veículo, um com haloperidol e os outros com as
doses-teste de mirtenol após o pré-tratamento com haloperidol.
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Catatonia foi definida como a permanência do animal na postura bípede, com


apoio das patas anteriores na barra de vidro, por pelo menos 30 segundos, e seu
término quando o animal volta à postura natural, com a retirada de pelo menos uma
pata da barra. O tempo de catatonia foi registrado após 15, 60 e 90 minutos após a
administração dos tratamentos e os animais foram observados por até 5 minutos em
cada um desses momentos (Figura 28).

Tratamento com
mirtenol
Pré-tratamento
com Animal apoiado Animal apoiado Animal apoiado Término
haloperidol na barra na barra na barra do teste

Tempo 0 min 15 min 20min 60 min 65min 90 min 95min

Animal mantido 1ª. 2ª. 3ª.


na gaiola observação observação observação
do animal do animal do animal

Figura 28. Protocolo experimental do mirtenol no Teste da Catatonia.

Após este procedimento, realizou-se a avaliação da possível participação do


sítio dopaminérgico no efeito do mirtenol sobre a catatonia induzida. Para este fim,
três grupos de 8 camundongos (n=8) foram co-tratados com haloperidol e mirtenol e,
após 15 minutos, foram observados por 5 minutos (Figura 29).

Tratamento com Término


Haloperidol + mirtenol do teste

Tempo 0 min 15 min 20 min

Animal mantido Observação


na gaiola do animal

Figura 29. Protocolo experimental para verificar o possível mecanismo de ação


do mirtenol no Teste da Catatonia.

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Após a observação de cada animal foi realizada a limpeza da barra e do piso


com álcool para remover os bolos fecais que pudessem atrapalhar a movimentação
do animal seguinte.

2.5. Avaliação do potencial tóxico

2.5.1 Triagem comportamental (screening hipocrático)

O método do screening hipocrático na avaliação da toxicidade tem sido um


método bastante útil e comumente usado na triagem preliminar de plantas e/ou
compostos químicos para detectar essas atividades farmacológicas e toxicológicas
(LUCIO et al., 2000), assim, como os hábitos fisiológicos diários.
Quarenta camundongos machos foram divididos em quatro grupos de 10
animais para cada dose (n=10) e um grupo controle. Os animais foram tratados por
via oral durante 120 dias com doses repetidas de 25, 50 e 75mg/kg de mirtenol.
Durante o período de tratamento foram realizadas observações comportamentais
sistemáticas para avaliar o screening hipocrático que fornece uma estimativa geral
da toxicidade da substância sobre o estado de consciência e disposição geral,
atividade e coordenação do sistema motor, reflexos e atividades sobre os sistemas
nervoso central e autônomo (MALONE; ROBICHAUD, 1983).
Os parâmetros (atividade geral, frênito vocal, irritabilidade, resposta ao toque,
contorção, reflexo de endireitamento, tônus muscular, força para agarrar, ataxia,
reflexo auricular, reflexo corneal, tremores, convulsões, calda em straub, hipnose,
anestesia, lacrimação, ptose palpebral, micção, defecação, piloereção, hipotermia,
respiração, cianose, hiperemia, morte) foram avaliados durante o período de 30, 60,
90 e 120 dias, sendo avaliados a cada dois dias e, a partir de então, diariamente, até
o último dia de administração do mirtenol. Sinais de toxicidade, a época do seu
aparecimento, a intensidade, a duração e a progressão dos mesmos foram anotados
para posterior análise.

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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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2.5.2 Toxicidade aguda (dose única e doses repetidas), subcrônica e crônica (doses
repetidas)

Para determinação da dose letal 50% (DL50) para verificar a toxicidade aguda,
mirtenol foi administrado por via intraperitoneal em doses diferentes 50, 100, 200,
300, 400, 500 e 1000mg/kg, em grupos de 10 camundongos, além do grupo
controle. Após a administração, os animais foram observados continuamente por um
período de 4 horas a fim de avaliar possíveis alterações comportamentais e, após 24
horas, foram observados uma vez ao dia durante 14 dias, a fim de registrar a
mortalidade causada pelo mirtenol.
A massa corporal e o padrão alimentar dos animais também foram
quantificados e analisados. Os camundongos foram colocados individualmente em
gaiolas metálicas e aclimatados por um período de 15 dias. Grupos de animais
(n=10) foram tratados diariamente no mesmo horário, por via oral (gavagem), nas
doses de 25, 50 e 75mg/kg de mirtenol ou com o veículo (0,1mL/100g, v.o.), durante
um período de 120 dias. Diariamente foram registrados para cada animal: o volume
de água ingerida (mL), o peso da ração consumida (g), o volume de urina excretada
(mL) e o peso das fezes produzidas (g), além de alterações comportamentais
durante todo o estudo (CUNHA et al., 2009). Em intervalos de trinta dias, os animais
foram pesados para a determinação da evolução ponderal durante o período
experimental de 30, 60, 90 e 120 dias.

2.5.3. Avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos

Quarenta camundongos divididos em quatro grupos de 10 animais (n=10)


foram tratados diariamente por via oral durante 120 dias com o veículo (Tween 80
0,05% dissolvido em solução salina 0,9%; grupo controle) e com as doses de 25, 50
e 75mg/kg de mirtenol. Após 120 dias de tratamento os animais foram anestesiados
com pentobarbital sódico (40mg/kg, i.p.) e a coleta do sangue foi realizada por
punção do plexo venoso orbital, utilizando-se agulhas e seringas e tubos de
microhematócrito. O sangue foi acondicionado em dois tipos de tubo: um com
anticoagulante HB (Laborlab®) para determinação dos parâmetros hematológicos, e

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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
70
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o outro, sem anticoagulante, para obtenção do soro para avaliação dos parâmetros
bioquímicos.
Os valores para eritrócitos, leucócitos, plaquetas, hemoglobina, hematócrito e
os índices hematimétricos volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina
corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média
(CHCM) foram determinados imediatamente após a coleta por meio de um
analisador automático de células hematológicas Advia 120/Hematology Siemens. A
contagem diferencial de leucócitos foi realizada em extensões coradas com May-
Grünwald-Giemsa. Em cada ensaio, 100 células foram analisadas e contadas.
Para análise bioquímica, o material foi centrifugado por força G durante 10
minutos e, em seguida, determinados os parâmetros glicose, uréia, creatinina,
aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), colesterol total,
triglicerídeos, bilirrubinas total e direta e ácido úrico. Os ensaios foram realizados em
aparelho automático Labmax 240 (Labtest) com sistemas comerciais da Labtest®.

2.5.4.Análise morfológica macroscópica

Após 120 dias de tratamento com doses repetidas de mirtenol nas doses de
25, 50 e 75mg/kg, os animais receberam pentobarbital sódico 40mg/kg, conforme
protocolo da Cornell University/Cornell Center for Animal Resources and Education,
conforme descrito por Flecknell (1996) e Kohn e colaboradores (1997), e foram
eutanasiados por deslocamento cervical para realizar a avaliação macroscópica.
Para tanto, foi realizada a análise morfológica macroscópica à vista desarmada dos
órgãos, além da pesagem de fígado, pulmão, coração, rim, cérebro e baço para
determinar os pesos relativos e verificar se houve ou não alteração morfológica
macroscópica nos principais órgãos avaliados.

2.5.5. Análise histopatológica

Após 120 dias de observação dos animais, estes foram eutanasiados pela
administração de pentobarbital sódico por via intraperitoneal na dose de 10-
15mg/100g de peso e os encéfalos foram rapidamente retirados e colocados sobre
papel alumínio numa placa de petri com gelo.
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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
71
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Acompanhando a fissura sagital mediana, a camada cortical cerebral foi


retirada das leptomeninges com o auxílio de uma pinça reta de microdissecação, a
qual, progredindo delicadamente e tangencialmente aos ventrículos laterais,
divulsionou o cortéx em toda a sua extensão fronto-occiptal. O córtex já divulsionado
foi rebatido para os lados, expondo parte do hipocampo que, com divulsionamento,
foi descolado e retirado (Figura 30).

(A) (B)

Figura 30. Áreas cerebrais dos animais experimentais


removidas para análise histopatológica.
(A) Córtex cerebral dos animais. (B) Hipocampo dos animais.
Fonte: Arquivo pessoal.

Após o término da dissecação, a peça foi colocada em papel de alumínio,


identificada, pesada e conservada a -80°C para confecção de lâminas histológicas.
Cortes sagitais feitos em intervalos de 1mm foram obtidos a partir de um corte inicial
próximo aos corpos mamilares. Para o estudo microscópico, secções de 10 foram
feitas, coradas em Hematoxilina - Eosina (HE) e analisadas com auxílio de um
microscópio óptico.
As áreas cerebrais foram observadas e classificadas de acordo com as
descrições do Atlas de Paxinos e Watson (1986). O grau de lesão foi expresso
através de uma escala percentual de 0 (nenhum) a 100 (total) para cada hipocampo
e corpo estriado, analisados de acordo com o método descrito anteriormente
(BUREAU; PEREDERY; PERSINGER, 1994; FERREIRA; MATSUBARA, 1997). A
lesão cerebral foi definida pela presença de pelo menos 50% de alteração
histopatológica em cada hipocampo e corpo estriado.
Também foi realizada a análise do tecido hepático dos animais submetidos
aos tratamentos com mirtenol, para verificar a existência de lesão tecidual.

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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
72
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2.6. Avaliação do efeito antioxidante

A atividade antioxidante do mirtenol foi avaliada, já que a ação de algumas


substâncias e o desenvolvimento de patologias no SNC pode estar relacionada ao
estresse oxidativo induzido por certas condições neurológicas. Também é
importante avaliar este potencial antioxidante, uma vez que ainda não se conhece
todos os mecanismos de ação da droga em questão. Várias evidências indicam que
o estresse oxidativo tem um papel crucial na sinalização do SNC, estando envolvido
no processo da ansiedade.
O perfil antioxidante de uma substância pode ser avaliada por meio de uma
grande variedade de testes in vitro e in vivo. Neste trabalho, três metodologias in
vitro e três in vivo foram utilizadas.

2.6.1 Efeito antioxidante in vitro

O ensaio para determinação das substâncias reativas com o ácido


tiobarbitúrico (TBARS) é um método usado para quantificar a peroxidação lipídica
que corresponde a um dano na membrana celular causado pelos radicais livres que
são formados durante o estresse oxidativo.
Nesse método, um composto azo hidrossolúvel, é utilizado como gerador de
radicais livres, uma vez que a decomposição desse composto produz nitrogênio
molecular e radicais carbonilas, os quais, por sua vez, reagem com o ácido
tiobarbitúrico, resultando na formação de substâncias reativas com ácido
tiobarbitúrico. Este método é um dos mais empregados para estudos relacionados
com a peroxidação lipídica, sendo bastante utilizado para avaliar a atividade
antioxidante de vários produtos naturais.
O grau de lipoperoxidação foi medido por meio da determinação dos níveis de
TBARS, conforme o método de DRAPER e HADLEY (1990). O ensaio TBARS foi
utilizado para quantificar a peroxidação lipídica (ESTERBAUER; CHEESEMAN,
1990) e este método foi usado para medir a capacidade antioxidante do mirtenol
usando gema de ovo homogeneizado como substrato rico em lipídio (GUIMARÃES
et al., 2010). Anteriormente, a gema de ovo foi homogeneizado (1% w/v) em 20mM
de tampão fosfato (pH 7,4), 1mL de homogenato foi sonicado e homogeneizada
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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
73
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com 0,1mL de mirtenol em diferentes concentrações. A peroxidação lipídica foi


induzida pela adição de 0,1mL de solução AAPH (0,12M). O controle foi apenas
veículo de mirtenol. As reações foram realizadas por 30min a 37ºC. Após o
resfriamento, as amostras (0,5mL) foram centrifugadas com 0,5mL de ácido
tricloroacético (15%) a 1.200g x por 10min. Uma alíquota de 0,5mL de sobrenadante
foi misturada com 0,5mL de TBA (0,67%) e aquecida a 95°C por 30min. Após o
resfriamento, absorbâncias da amostra foram medidas, utilizando um
espectrofotômetro a 532nm. Os resultados foram expressos em porcentagem de
TBARS formadas por AAPH sozinho (controle induzido).
Outras metodologias bastante empregadas para avaliar a atividade
antioxidante in vitro de uma substância baseiam-se na capacidade sequestrante,
que consiste na interação direta de uma substância com moléculas reativas,
convertendo os radicais livres formados em espécies menos reativas e,
consequentemente, mais estáveis.
O Ensaio de remoção do radical hidroxila (OH scavenging) mede a
capacidade de uma substância em remover o radical hidroxila e está diretamente
relacionada à sua atividade antioxidante. O radical hidroxila é uma espécie
extremamente reativa, capaz de causar danos ao DNA, proteínas e lipídios. Neste
método, o OH é gerado pela reação de Fenton, na qual o peróxido de hidrogênio
reage com o íon ferroso. Na presença do OH, o açúcar desoxirribose é degradado à
malondialdeído e ao reagir com o ácido tiobarbitúrico, é quantificado.
Para a verificação da concentração de radical hidroxila foi usado o método
com base na reação de Fenton. A formação de OH na reação de Fenton foi
quantificada usando a degradação oxidativa de 2-desoxirribose (LOPES;
SCHULMAN; HERMES-LIMA, 1999). O princípio do ensaio é a quantificação do
produto de degradação de 2-desoxirribose, malondialdeído, por sua condensação
com 2-ácido tiobarbitúrico. Resumidamente, as reações típicas foram iniciados pela
adição de Fe2+ (concentração final FeSO4 6mM) para soluções contendo 5mM de 2-
desoxirribose, 100mM de H2O2 e 20mM de tampão fosfato (pH 7,2). Para medir a
atividade antioxidante do mirtenol contra o radical hidroxila, diferentes concentrações
foram adicionados ao sistema antes da adição Fe2+. Reações foram realizadas por
15 min em temperatura ambiente e foram paradas pela adição de ácido fosfórico a
4% (v/v), seguido por TBA 1% (w/v, em 50mM de NaOH). Soluções foram aquecidos
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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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em banho maria por 15min a 95°C, e depois resfriado à temperatura ambiente. A


absorbância foi medida em 532nm e os resultados foram expressos como
equivalentes do MDA formada por Fe2+ e H2O2.
O ensaio da atividade removedora do radical nitrito (NO scavenging) é outro
método de avaliação antioxidante in vitro. Baseia-se na produção de óxido nítrico
(NO) a partir da decomposição espontânea do nitroprussiato de sódio em solução
aquosa. O NO, por sua vez, interage com o oxigênio, produzindo íons nitrito, os
quais podem ser medidos pela reação de Griess. Estes íons nitritos têm um forte
poder oxidante, reagindo com várias moléculas biológicas, o que leva a danos
celulares severos. Substâncias com capacidade removedora de NO competem com
o oxigênio, levando à redução na produção de nitrito, caracterizando atividade
antioxidante.
Para a verificação da concentração de nitrito foi usado o método descrito
anteriormente por Green, Tannenbaum e Goldman (1981). O óxido nítrico foi gerado
a partir da decomposição espontânea de nitroprussiato de sódio em 20mM tampão
fosfato (pH 7,4). Uma vez gerado NO, ele interage com o oxigênio para produzir íons
nitrito, que foram medidos pela reação de Griess. A mistura de reação (1mL)
contendo 10mM nitroprussiato de sódio (SNP) em tampão fosfato e mirtenol em
diferentes concentrações foram incubados a 37°C por 1 hora. Uma alíquota de
0,5mL foi retirada e homogeneizada com 0,5mL de reagente de Griess. A
absorvância do cromóforo foi medida a 540nm. A porcentagem de inibição do óxido
nítrico gerado foi medida através da comparação dos valores de absorbância dos
controles negativos (apenas 10mM de nitroprussiato de sódio e veículo) e
preparações para o ensaio. Os resultados foram expressos em porcentagem de
nitrito formado por SNP sozinho.

2.6.2. Efeito antioxidante in vivo

Para avaliar os efeitos antioxidantes nos animais, os camundongos foram


tratados durante 30 dias consecutivos com mirtenol, nas doses de 25, 50 e 75mg/kg
e 24 horas após a administração da droga, foram sacrificados por decapitação e os
hipocampos dissecados. Após a dissecação, a área foi usada para estudo

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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
75
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neuroquímico, através das determinações do nível de peroxidação lipídica, teor de


nitrito e atividade das enzimas antioxidantes.
Os hipocampos foram homogeneizados em 1mL de tampão fosfato de sódio,
pH 7,0. A concentração de proteína foi medida pelo método de Lowry e
colaboradores (1951). Os 10% de homogenatos foram centrifugados (800×g, 20min)
e os sobrenadantes usados para os ensaios.
Para a determinação da atividade enzimática da catalase (CAT) foi usado o
método descrito por Maehly e Chance (1954). Os resultados foram expressos em
U/µg de proteína. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Lowry
et al. (1951).
A atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) foi determinada através
da técnica previamente descrita por Flohé e Otting (1984). Os resultados foram
expressos em U/mg de proteína. A concentração de proteína foi determinada pelo
método de Lowry et al. (1951).
A determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH) foi feita
conforme a técnica previamente descrita por Sedlak e Lindsay (1968). As
concentrações de GSH foram expressas em g de GSH/g de tecido.

3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As amostras utilizadas nos ensaios experimentais foram previamente


verificadas quanto ao padrão de normalidade através do teste de Kolmogorov-
Smirnov para então proceder-se a análise estatística.
Os resultados dos testes comportamentais gerais e específicos para
ansiedade e convulsão foram então analisados por análise de variância de uma via
(one-way ANOVA), seguido pelo teste de t-Student-Neuman-Keuls. No estudo da
catatonia experimental, os dados foram analisados também por ANOVA, de duas
vias de medidas repetidas (two-way ANOVA), com pós-teste de Bonferroni.
Todas as análises foram efetuadas utilizando-se o software GraphPad Prism
versão 5.03 (GraphPad Sotware Incorporated, San Diego, CA 92121 EUA), cujos
valores foram apresentados como média ± erro padrão da média (E.P.M.),
considerando-se diferenças significativas quando p<0,05.
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MOREIRA, M.R.C. Material e Métodos
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CAPÍTULO 1
Avaliação do efeito ansiolítico do mirtenol

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MOREIRA, M.R.C. Resultados e Discussão
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1. MODELOS EXPERIMENTAIS DE ANSIEDADE

No campo da neuropsicofarmacologia, as investigações apontam diversos


modelos animais desenvolvidos e padronizados para o estudo experimental da
ansiedade em humanos. Embora seja compreensível que animais apresentem
respostas comportamentais diferentes das manifestadas em humanos, parece haver
uma semelhança em relação aos estímulos neurais de ambos sob condições
ansiogênicas (CRUZ; LANDEIRA-FERNANDEZ, 2012), possibilitando que os
estudos pré-clínicos possam sinalizar seus achados como hipóteses para os estudos
clínicos.
Os modelos experimentais para a avaliação de drogas ansiolíticas ou
ansiogênicas utilizam roedores como sujeitos experimentais na maioria dos estudos
(BRITO, 2011), sendo o labirinto em cruz elevado um dos principais modelos
utilizados e o mais adotado em estudos pré-clínicos com óleos, extratos e
metabólitos secundários de plantas com atividade sobre o SNC desenvolvidos no
Brasil (ver Quadro 3).
Outro modelo experimental de ansiedade consiste no teste do campo aberto,
que utiliza como referências ansiogênicas a preferência do animal pelos cantos do
campo, enquanto que a busca pelo centro do ambiente como um padrão
comportamental ansiolítico (JOHNSTON; FILE, 1991).
Um terceiro modelo utilizado em estudos relacionados ao potencial
ansiolítico/ansiogênico de substâncias é o teste de transição claro-escuro. Trata-se
de um modelo baseado na aversão inata dos animais a ambientes extremamente
claros e consequente preferência por ambientes escuros, onde o inverso desse
padrão reflete potencial ansiolítico da substância teste, assim como o menor número
de transições entre os dois compartimentos (BOURIN; HASCÖET, 2003).
Outros modelos são também adotados, embora em menor freqüência, em
estudos com a mesma finalidade, dente eles o teste de esconder esferas, labirinto
em T elevado, esquiva ativa e passiva, ocultação defensiva, interação social e
sobressalto intensificado pelo medo (CRUZ; LANDEIRA-FERNANDEZ, 2012).
Nesse sentido, o propósito deste capítulo foi apresentar os resultados do
potencial ansiolítico do mirtenol, utilizando os testes do labirinto em cruz elevado e o

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
79
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de transição claro-escuro, além dos testes comportamentais de campo aberto e Rota


Rod.

2. RESULTADOS

2.1. Avaliação geral da atividade do mirtenol no SNC

2.1.1. Efeito do mirtenol no teste da movimentação espontânea (Campo Aberto)

Na análise da atividade locomotora espontânea (Gráfico 1), os resultados


demonstraram que não houve diferença significativa nas médias dos animais
tratados com mirtenol (14,1 ± 1,1; 14,4 ± 1,2; 14,8 ± 0,8; respectivamente) quando
comparadas com o grupo controle (14,5 ± 1,1). Entretanto, os animais tratados com
mirtenol apresentaram ALE significativamente maior do que os do grupo diazepam
(6,1 ± 0,8).
O diazepam, usado como droga padrão ansiolítica, promoveu a redução
significativa do número de cruzamentos do animal neste parâmetro, quando
comparado ao grupo controle.
Para verificar o possível mecanismo de ação do mirtenol sobre a
movimentação espontânea dos animais, utilizou-se a administração do Flumazenil,
um antagonista competitivo dos receptores benzodiazepínicos, utilizado como droga
padrão neste tipo de teste. Os resultados revelaram que o mirtenol, administrado
após o pré-tratamento com o flumazenil, não alterou a movimentação espontânea
dos animais quando comparado ao grupo controle, mas foi significativamente maior
(14,4 ± 0,9) do que o grupo que recebeu somente diazepam.
De modo similar, o diazepam, após tratamento com flumazenil, promoveu o
aumento da movimentação dos animais no campo aberto (14,1 ± 0,9), sugerindo que
a atividade do mirtenol pode envolver os receptores benzodiazepínicos.

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
80
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atividade locomotora espontânea (ALE)


20

b b
b b b b
15

10

0
Controle DZP FLU 5 FLU 5 + DZP MIR25 MIR50 MIR75 FLU 5 + MIR 25

Gráfico 1. Efeito do mirtenol sobre a atividade locomotora espontânea dos animais


no teste do campo aberto. Controle (veículo), DZP (Diazepam, 2mg/kg), MIR (mirtenol:
25, 50 e 75mg/kg), FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média ± E.P.M.
a b
(n=10). p<0,0001 versus Controle; p<0,0001 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-
Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

O reflexo de auto-limpeza do animal (grooming) também foi analisado neste


teste (Tabela 1), não havendo alteração significante nos grupos tratados com
mirtenol quando comparados ao grupo controle ou a droga padrão.
Quando utilizado o pré-tratamento com flumazenil, para verificar o possível
mecanismo de ação do mirtenol, este monoterpeno, de modo similar ao diazepam,
não alterarou o número de groomings dos animais, sugerindo possível envolvimento
dos receptores benzodiazepínicos neste processo.

Tabela 1. Efeito do mirtenol sobre o grooming dos animais.


Grupos Número de groomings
Controle 3,3 ± 0,9
DZP 5,5 ± 0,6
MIR 25 5,3 ± 0,6
MIR 50 5,3 ± 0,4
MIR 75 5,3 ± 0,6
FLU 3,3 ± 0,5
FLU+DZP 3,3 ± 0,3
FLU+MIR 25 3,3 ± 0,7
Controle(veículo); DZP(diazepam, 2mg/kg); MIR(mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg);
a
FLU(flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média± E.P.M.(n=10). p<0,01 versus
Controle (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
81
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O terceiro parâmetro analisado neste teste foi o número de empinamentos


sob as patas traseiras (rearing) (Gráfico 2). Os resultados revelaram que o mirtenol
não alterou este parâmetro quando comparado ao grupo controle. Porém, nas três
doses testadas (5,2 ± 0,3; 5,2 ± 0,4; 5,2 ± 0,4; respectivamente), aumentou
significativamente o número de rearings dos animais quando comparado ao grupo
padrão (2,8 ± 0,3). O diazepam reduziu significativamente o número de rearings dos
animais quando comparado ao grupo controle.
No grupo pré-tratado com flumazenil, o mirtenol aumentou o número de
rearings (5,3 ± 0,4) quando comparado ao grupo que recebeu somente diazepam, de
modo similar ao grupo padrão pré-tratado (5,3 ± 0,6), sugerindo um possível
envolvimento dos receptores benzodiazepínicos nesse processo.

8
número de empinamentos

6 b b c
b b b

4
a

0
Controle DZP FLU 5 FLU 5 + DZP MIR25 MIR50 MIR75 FLU 5 + MIR 25

Gráfico 2. Efeito do mirtenol sobre o comportamento de empinar dos animais no


teste do campo aberto. Controle (veículo), DZP (Diazepam, 2mg/kg), MIR (mirtenol: 25,
50 e 75mg/kg), FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média ± E.P.M.
a b
(n=10). p<0,05 versus Controle; p<0,05 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-
Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

2.1.1. Efeito do mirtenol no teste de coordenação motora (Rota Rod)

Neste ensaio, os animais tratados com mirtenol nas três doses testadas
(175,4 ± 2,3; 179,3 ± 0,6 e 178,1 ± 1,6; respectivamente) não apresentaram
alterações significativas no tempo de permanência na barra giratória em relação ao
controle (179,0 ± 0,6), porém, quando comparadas ao diazepam (160,4 ± 3,4) estas
foram significativamente maiores (Gráfico 3).

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
82
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O diazepam também alterou significativamente o tempo de permanência dos


animais sobre a barra giratória quando comparado ao grupo controle, assim como
ao grupo que recebeu pré-tratamento com flumazenil (179,0 ± 0,5), porém,
reduzindo esse tempo, o que sugere o envolvimento dos receptores
benzodiazepínicos neste processo.

200
b b b b b b
a
Tempo de permanência (s)

150

100

50

0
Controle DZP FLU 5 FLU 5 + DZP MIR25 MIR50 MIR75 FLU 5 + MIR 25

Gráfico 3. Efeito do mirtenol sobre o tempo de permanência dos animais na barra


giratória do Rota Rod. Controle (veículo), DZP (Diazepam, 5mg/kg), MIR (mirtenol: 25,
50 e 75mg/kg), FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média ± E.P.M.
a b
(n=10). p<0,0001 versus Controle, p<0,0001 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-
Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

Quanto ao número de quedas da barra giratória (Tabela 2), nas três doses
testadas (0,6 ± 0,3; 0,6 ± 0,4 e 0,6 ± 0,3; respectivamente), o mirtenol reduziu
significativamente esse parâmetro em relação ao grupo controle (1,1 ± 0,1), com
alteração significativamente melhor do que a droga de referência, neste parâmetro
(2,6 ± 0,2).
O diazepam também alterou o número de quedas dos animais da barra
giratória, porém com aumento significativo, quando em comparação ao grupo
controle.
Neste parâmetro, o flumazenil, administrado como pré-tratamento associado à
menor dose de mirtenol, promoveu um aumento significativo no número de quedas
dos animais da barra (179,0 ± 0,59) quando comparado ao grupo que recebeu
somente diazepam (160,0 ± 3,4), de modo similar ao grupo padrão pré-tratado,
sugerindo possível ação deste monoterpeno sobre os receptores benzodiazepínicos.

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
83
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Tabela 2. Efeito do mirtenol sobre o número de quedas dos animais.


Grupos Número de quedas
Controle 1,1 ± 0,1
DZP 2,6 ± 0,2a
MIR 25 0,6 ± 0,3a,b
MIR 50 0,6 ± 0,4a,b
MIR 75 0,6 ± 0,3a,b
FLU 1,1 ± 0,2
FLU+DZP 1,1 ± 0,2b
FLU+MIR 25 1,1 ± 0,3b

Controle(veículo); DZP(diazepam, 2mg/kg); MIR(mirtenol 25, 50 e 75mg/kg);


a
FLU(flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média ± E.P.M. (n=10). p<0,05
b
versus Controle; p<0,05 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-
Keuls como post hoc teste).

2.2. Avaliação da atividade ansiolítica do mirtenol no SNC

2.2.1. Efeito do mirtenol no teste do labirinto em cruz elevado (TLCE)

Os resultados do TLCE (Gráfico 4) mostraram um aumento significante, do


tipo dose-dependente (p<0,05), do número de entradas nos braços abertos nos
grupos tratados com as três doses de mirtenol (6,8 ± 0,3; 5,7 ± 0,6 e 4,3 ± 0,3;
respectivamente), quando comparados ao grupo controle (3,1 ± 0,1). O diazepam
também promoveu aumento significativo no parâmetro avaliado (5,50 ± 0,62),
quando comparado ao grupo controle.
O grupo tratado com a menor dose de mirtenol e pré-tratado com flumazenil
obteve redução significativa do NEBA (3,2 ± 0,1) quando comparado ao grupo que
recebeu somente diazepam, de modo similar ao grupo padrão pré-tratado (3,2 ±
0,1), sugerindo um possível envolvimento dos receptores benzodiazepínicos neste
processo.

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
84
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8
a,c
a a
6
c
NEBA

4 b b b

0
Controle DZP FLU 5 FLU 5 + DZP MIR25 MIR50 MIR75 FLU 5 + MIR 25

Gráfico 4. Efeito do mirtenol sobre o número de entradas dos animais nos braços
abertos no TLCE. NEBA (número de entradas nos braços abertos), Controle (veículo),
DZP (Diazepam, 2mg/kg), MIR (mirtenol: 25, 50 e 75mg/kg), FLU (Flumazenil, 5mg/kg).
a b
Cada coluna representa a média ± E.P.M. (n=10). p<0,0001 versus Controle; p<0,0001
c
versus DZP; p<0,01 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls
como post hoc teste).

Com relação ao tempo de permanência dos animais nos braços abertos


(Gráfico 5), os resultados obtidos demonstraram que, nas três doses testadas (116,5
± 8,3; 103,1 ± 5,4 e 100,9 ± 3,4; respectivamente), houve aumento significativo
desse parâmetro quando comparado ao grupo controle (47,5 ± 2,9). De maneira
similar ao mirtenol, o diazepam também promoveu aumento significativo deste
parâmetro quanto comparado ao grupo controle.
No grupo que recebeu a menor dose de mirtenol e pré-tratamento com
flumazenil houve redução significativa do TPBA (46,8 ± 2,9) quando comparado ao
grupo que recebeu somente diazepam, de modo semelhante ao grupo que recebeu
diazepam após tratamento com flumazenil (47,1 ± 2,3), sugerindo que este
monoterpeno exerce seu efeito, neste parâmetro, através do envolvimento com os
receptores benzodiazepínicos.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
85
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

150
a,b
a a a
100
TPBA (s)

b b b
50

0
Controle DZP FLU 5 FLU 5 + DZP MIR25 MIR50 MIR75 FLU 5 + MIR 25

Gráfico 5. Efeito do mirtenol sobre o tempo de permanência dos animais nos braços abertos
no TLCE. TPBA (tempo de permanência do animal nos braços abertos), Controle (veículo), DZP
(Diazepam, 2 mg/kg), MIR (mirtenol: 25, 50 e 75 mg/kg); FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna
a b
representa a média ± E.P.M. (n=10). p<0,0001 versus Controle; p<0,0001 versus DZP (ANOVA
seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

2.2.1. Efeito do mirtenol no teste de transição claro – escuro (TTCE)

Os resultados do teste de transição claro-escuro (Gráfico 6) mostraram um


aumento significante do tempo de permanência do animal no compartimento claro
nos grupos tratados com mirtenol nas três doses testadas (244,6 ± 17,4; 191,6 ±
16,4 e 125,9 ± 3,7; respectivamente), do tipo dose dependente, quando comparadas
ao controle (105,1 ± 1,7). Resultado similar foi obtido com a droga de referência
(221,1 ± 6,6) quando comparada também ao grupo controle. A maior dose de
mirtenol também promoveu discreto aumento deste parâmetro (105,8 ± 16,9),
entretanto, sem significância estatística quando comparada ao controle.
No grupo que recebeu a menor dose de mirtenol e o pré-tratamento com
flumazenil os animais reduziram significativamente o tempo de permanência no
compartimento claro (107,3 ± 1,4) quando comparados aos do grupo que recebeu
somente diazepam, de modo congênere ao grupo que recebeu diazepam após
tratamento com flumazenil (105,3 ± 1,6), sugerindo o envolvimento do mirtenol sobre
os receptores benzodiazepínicos neste processo.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
86
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

300
a,b
a
a
200
TPCC (s)

b b b
100

0
Controle DZP FLU 5 FLU 5 + DZP MIR25 MIR50 MIR75 FLU 5 + MIR 25

Gráfico 6. Efeito do mirtenol sobre o tempo de permanência dos animais no


compartimento claro no TTCE. TPCC (tempo de permanência no compartimento
claro); Controle (veículo); DZP (Diazepam, 2 mg/kg); MIR (mirtenol: 25, 50 e 75 mg/kg);
a
FLU (Flumazenil, 5mg/kg). Cada coluna representa a média ± E.P.M. (n=10). p<0,0001
b
versus Controle; p<0,0001 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-
Keuls como post hoc teste).

3. DISCUSSÃO

Uma etapa importante na investigação de uma nova substância é a


verificação de possíveis reações adversas, as quais são manifestadas por variados
fármacos disponíveis no comércio de medicamentos ansiolíticos. Os
benzodiazepínicos, por exemplo, embora sejam largamente prescritos no tratamento
de condições psíquicas, podem apresentar reações como miorrelaxamento e
sedação nos pacientes que fazem uso, sendo condições consideradas indesejáveis
para um ansiolítico (DE ALMEIDA et al., 2009; ALMEIDA et al., 2010).
Com essas considerações, alguns testes experimentais são utilizados nesta
fase da pesquisa, a fim de identificar possíveis efeitos miorrelaxantes ou sedativos
nos animais sob tratamento com a substância investigada (PULTRINI; GALINDO;
COSTA, 2006). Neste estudo, os ensaios para avaliação dos efeitos do mirtenol
sobre o comportamento motor e possível atividade miorrelaxante e sedativa dos
animais foram realizados através dos testes do campo aberto e Rota Rod.
No teste do campo aberto, buscou-se avaliar a emocionalidade e a atividade
motora do animal, visto que a ambulação e rearing estão relacionados à
coordenação motora efetiva, ao passo que o grooming ao seu estado emocional
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
87
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

(ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006). Os resultados apresentados neste teste revelaram


ausência de alterações significativas nos três parâmetros observados,
demonstrando que o mirtenol não interferiu no comportamento motor ou
emocionalidade do animal, conforme observado em outros estudos que utilizaram
monoterpenos com atividade ansiolítica (GOMES et al., 2010; NOGUEIRA NETO et
al., 2012; COSTA et al., 2012). O diazepam, neste teste, reduziu o número de
cruzamentos e rearing, demonstrando sua ação sedativa sobre os animais tratados,
enquanto que o parâmetro emocionalidade não foi alterado pela droga padrão. Estes
achados serviram para validar o experimento, demonstrando que o mirtenol,
contrariamente ao diazepam, não promoveu sedação nos animais experimentais.
O teste do Rota Rod tem o intuito de analisar o comportamento motor do
animal sob efeito de substâncias ou compostos bioativos, através do equilíbrio sob a
barra giratória. Neste estudo, os animais tratados com mirtenol e posicionados na
barra não alteraram seu tempo de permanência nem o número de quedas da
mesma, portanto descartando algum efeito relaxante muscular ou mesmo
neurotoxicidade deste monoterpeno, que é comum de algumas drogas com um perfil
de depressora do SNC (DE SOUSA et al., 2007), sugerindo que o mirtenol não
alterou a coordenação motora dos animais, diferentemente da droga padrão, que
causou efeito sedativo nos animais, reduzindo o tempo de permanência destes na
barra e aumentando o número de quedas, um efeito semelhante ao observado no
teste do campo aberto.
O fato de não haver alteração na coordenação motora e emocionalidade dos
animais tratados com mirtenol nos testes de campo aberto e Rota Rod constitui dado
relevante, uma vez que, outros modelos animais específicos para avaliar potencial
ansiolítico de substâncias, como o LCE e o de transição claro-escuro, poderiam
apresentar resultados falso-positivos se a função motora dos animais fosse
comprometida pelo mirtenol (TOLARDO, 2008).
Dessa forma, os resultados dos testes comportamentais com o mirtenol
agregam-se aos estudos já desenvolvidos com outros compostos terpênicos ou
plantas que apresentaram potencial ansiolítico sem, no entanto, alterarem o
comportamento e a atividade locomotora dos animais tratados (SOUSA et al., 2008;
PASSOS et al., 2009).

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Discussão
88
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Os ensaios para avaliação do potencial ansiolítico do mirtenol foram


realizados por meio do teste do labirinto em cruz elevado e de transição claro-
escuro. O teste do labirinto em cruz elevado é um modelo experimental largamente
utilizado na avaliação do efeito ansiolítico de drogas (PELLOW et al., 1985;.
PELLOW; FILE, 1986). Neste experimento foi buscado verificar, através da
preferência do animal pelos braços abertos ou fechados, o potencial ansiolítico ou
ansiogênico (respectivamente) da substância em estudo.
Neste ensaio, a administração do mirtenol aumentou significativamente o
número de entradas e tempo de permanência dos animais nos braços abertos, em
comparação com o grupo controle, sugerindo atividade ansiolítica, similar ao efeito
proporcionado pelo uso da droga padrão e conforme evidenciado em outros estudos
que utilizaram roedores no LCE após administração de monoterpenos (ALMEIDA et
al., 2004; DE ALMEIDA et al., 2012; LIMA et al., 2013). Contrariamente, as doses
testadas de mirtenol promoveram significativa diminuição do número de entradas
dos animais nos braços fechados e redução do tempo de permanência dos roedores
nestes braços, também de maneira similar ao grupo padrão, ratificando o efeito
ansiolítico da substância testada. Estes achados talvez tenham ocorrido porque os
animais podem ter ficado mais seguros para explorar o labirinto, reduzindo o medo
pelo ambiente desconhecido e elevado, revelando o perfil ansiolítico do mirtenol.
O teste de transição claro-escuro é outro ensaio que visa avaliar o potencial
ansiogênico ou ansiolítico de uma planta ou composto. Sob o mesmo princípio,
drogas ansiolíticas favorecem que os animais busquem preferencialmente o
compartimento claro, contrariamente às drogas ansiogênicas, onde o animal busca o
compartimento escuro. Este paradigma experimental baseia-se na aversão inata dos
roedores por áreas iluminadas, além do fato deles possuírem um comportamento
espontâneo de exploração dos ambientes novos (HASCÖET; BOURIN;
DHONNCHADEA, 2001). O resultado da exploração do novo ambiente com a
aversão pelo ambiente iluminado pode desencadear comportamentos comparados à
ansiedade (BOURIN; HASCÖET, 2003).
Neste estudo, os animais que receberam mirtenol aumentaram
significativamente o tempo de permanência no compartimento claro em relação ao
grupo controle. Este resultado serviu para validar o experimento, mostrando que o
mirtenol foi capaz de aumentar o tempo que os animais permaneceram no
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MOREIRA, M.R.C. Discussão
89
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compartimento claro, tendo o diazepam apresentado efeito similar, refletindo o


potencial ansiolítico deste monoterpeno e corroborando os achados no TLCE.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Discussão
90
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CAPÍTULO 2
Avaliação do efeito anticonvulsivante do mirtenol

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MOREIRA, M.R.C. Resultados e Discussão
91
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

1. EPILEPSIA E AÇÃO ANTICONVULSIVANTE

Epilepsia é uma condição neurológica que se manifesta por alterações


crônicas e recorrentes, em consquência a anormalidades na atividade elétrica
cerebral (ALMEIDA, 2006). Na fase aguda, é denominada de crise epiléptica, que
pode apresentar-se por alterações na cognição, nos movimentos (involuntários), no
comportamento (automatismo) e outras, dependendo da área cerebral envolvida
(CHAUDHARY; DUNCAN; LEMIEUX, 2011).
O episódio mais crítico na epilepsia é a convulsão, caracterizada por um
comportamento estereotipado envolvendo alterações sensoriais e motoras, onde seu
acometimento e recorrência espontânea são as condições principais para o
diagnóstico de epilepsia em humanos (ENGEL; PEDLEY; AICARDI, 2008 apud
OSES, 2008).
Em animais de laboratório, o quadro de convulsão pode ser induzido por uma
série de metodologias experimentais, como a indução por pilocarpina, picrotoxina,
pentilenotetrazol, eletrochoque e outras (LÖSCHER, 2011).
A pilocarpina (P) é um agonista colinérgico muscarínico utilizado em modelos
experimentais para reproduzir a fisiopatologia das crises convulsivas, possibilitando
identificar novos agentes terapêuticos para o tratamento da epilepsia refratária
(JOPE; MORRISETT; SNEAD, 1986). Estudos anteriores demonstraram que a
administração de pilocarpina induz o desenvolvimento das convulsões, estado de
mal epiléptico e lesão cerebral em roedores (TURSKI et al., 1989; MARINHO et al.,
1997; DE FREITAS; VIANA; FONTELES, 2003), por isso é um método bastante
utilizado como modelo animal de convulsão.
A picrotoxina (PIC) é um estimulante paroxístico do SNC, utilizado para
induzir modelo de epilepsia focal recorrente, para crises do tipo “pequeno mal” ou
crises de ausência (AMBAVADE et al., 2009; RAZA et al., 2010). A capacidade de
reverter o efeito convulsivante induzido pela PIC é um parâmetro válido na
investigação de substâncias com potencial anticonvulsivante, direcionando para
mecanismos que envolvem o sistema GABAérgico, sendo considerada um
antagonista desses receptores (NÓBREGA, 2012).
O pentilenotetrazol (PTZ) é um fármaco com ação convulsivante e
epileptogênica largamento utilizado em estudos experimentais na triagem pré-clínica
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
92
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

de substâncias com potencial anticonvulsivante (LÖSCHER; SCHMIDT, 1988;


PEDERSEN et al., 2009). Seu mecanismo de ação consiste em interagir com os
canais iônicos dos receptores GABAA, estimulando a produção de glutamato na
amígdala, córtex pré-frontal e líquido céfalo-raquidiano (HALONEN et al., 1992;
ROCHA et al., 1996; WALSH et al., 1999).
O tratamento da epilepsia tem ocorrido com a utilização de diversos fármacos
de classes diferentes, sendo os mais comumente prescritos os benzodiazepínicos
(NÓBREGA, 2012). Entretanto, estas drogas possuem uma variedade de efeitos
adversos, tais como a sedação, hepatotoxicidade, depressão, bradicardia,
tolerância, dentre outros (ALMEIDA, 2006; HUNG; SHIH, 2011).
Nesse sentido, algumas plantas e seus respectivos óleos essenciais têm sido
investigados quanto às suas propriedades anticonvulsivantes (QUINTANS-JÚNIOR
et al., 2007; CAMPÊLO et al., 2011; COSTA, 2012), uma vez que podem agir sobre
os problemas epilépticos com menor ou total ausência de efeitos indesejados,
tornando-se progressivamente importantes nas diversas subcategorias desta
condição neurológica. Em outros estudos, os compostos terpênicos têm sido
preferencialmente estudados, especialmente os monoterpenos, encontrando-se
resultados promissores decorrentes de estudos pré-clínicos (HOSSEINZADEH et al.,
2005; DE SOUSA et al., 2006; DE SOUSA et al., 2007a; DE SOUSA; QUINTANS-
JÚNIOR; ALMEIDA, 2007; SILVA et al., 2009; ALMEIDA et al., 2011).
Sob estes aspectos, o objetivo deste capítulo foi investigar o possível efeito
anticonvulsivante do mirtenol em modelos experimentais de convulsão induzida por
picrotoxina, pentilenotetrazol e pilocarpina, assim como seu possível mecanismo de
ação.

2. RESULTADOS

2.1. Efeito do mirtenol no teste da convulsão induzida por Pilocarpina

Os dados deste teste estão apresentados na Tabela 3. É possível verificar


que o mirtenol, nas três doses testadas, aumentou significativamente o tempo de
latência para as crises e reduziu o percentual de convulsões (35%, 50% e 75%,
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
93
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

respectivamente) e de mortes (35%, 50% e 75%, respectivamente) quando


comparado com o grupo controle.
A fim de determinar se os efeitos anticonvulsivantes do mirtenol são exercidos
por meio do sistema GABAérgico, os animais foram submetidos ao co-tratamento
com flumazenil, um antagonista do receptor benzodiazepínico. No entanto, a
presença de flumazenil não reverteu totalmente o efeito anticonvulsivante do
mirtenol, que ainda reduziu o percentual de convulsões e de mortalidade dos
animais em 25% quando comparado ao grupo que recebeu somente a maior dose
de mirtenol (150mg/kg).

Tabela 3. Efeito do mirtenol na convulsão induzida por pilocarpina.

Tratamentos Dose Latência % de % de


(mg/kg) (s) convulsões mortes
Controle - 11,9  0,9 100 100
MIR 50 13,7  0,3a 65b 65b
100 15,8  0,7a,g 50b 50b
150 34,9  0,3a,g,h 25b 25b
DZP 5 0,0  0,0 00b 00b
FLU 5 5 11,8  0,3c 100e 100e
DZP + FLU 5 5+5 11,7  0,2c 100e 100e
MIR + FLU 5 150 + 5 12,3  0,4d 75f 75f

Controle (veículo); MIR (mirtenol: 50, 100 e 150mg/kg), DZP (Diazepam, 5mg/kg); FLU
a
(Flumazenil, 5mg/kg). Valores representam a media ± E.P.M. (n=8). p<0,05 versus
Controle (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste);
p<0,01 versus Controle (teste  ); p<0.001 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-
b 2 c
d
Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); p<0,001 versus MIR 150mg/kg (ANOVA
e
seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); p<0,01 versus
DZP(teste  ); p<0,01 versus MIR 150mg/kg (teste  ); p<0,05 versus MIR 150mg/kg
2 f 2 g
h
(ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); p<0,05
versus MIR 100mg/kg (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post
hoc teste).

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
94
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.3. Efeito do mirtenol no teste da convulsão induzida por Pentilenotetrazol

Os dados deste teste estão apresentados na Tabela 4. É possível verificar


que o mirtenol, nas três doses testadas, aumentou significativamente o tempo de
latência para as crises e reduziu o percentual de convulsões (20%, 25% e 67%,
respectivamente) e de mortes (25%, 25% e 100%, respectivamente) quando
comparado com o grupo controle.

Tabela 4. Efeito do mirtenol na convulsão induzida por pentilenotetrazol.

Tratamentos Dose Latência % de % de


(mg/kg) (s) convulsões mortes
Controle - 87,3  5,3 100 100
MIR 50 129,3  15,4a 80b 75b
100 123,8  29,7a 75b 75b
150 588,1  114,8a,g,h 33b 00b
DZP 5 900,0  0,0a 00b 00b
FLU 5 5 91,3  0,7 100 100
DZP + FLU 5 5+5 89,4  0,9c 100e 100e
MIR + FLU 5 150 + 5 92,3  0,4d 87,5f 87,5f

Controle (veículo); MIR (mirtenol: 50, 100 e 150mg/kg), DZP (Diazepam, 5mg/kg), FLU
a
(Flumazenil, 5mg/kg). Valores representam a media ± E.P.M. (n=8). p<0,05 versus
Controle (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste);
p<0,01 versus Controle (teste  ); p<0,001 versus DZP (ANOVA seguido pelo teste t-
b 2 c
d
Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); p<0,001 versus MIR 150mg/kg (ANOVA
e
seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); p<0,01 versus DZP
2 f 2 g
( test); p<0,01 versus MIR 150mg/kg ( test); p<0,05 versus MIR 50mg/kg (ANOVA
h
seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); p<0,05 versus MIR
100mg/kg (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

O co-tratamento com o flumazenil não reverteu totalmente o efeito


anticonvulsivante do mirtenol, que ainda reduziu o percentual de convulsões e de
mortalidade dos animais em 12,5% quando comparado ao grupo que recebeu
somente a maior dose de mirtenol (150mg/kg).

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
95
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.3. Efeito do mirtenol no teste da convulsão induzida por Picrotoxina

Os dados deste teste estão apresentados na Tabela 5. Nos animais pré-


tratados com picrotoxina, o mirtenol, nas duas maiores doses testadas, aumentou
significativamente o tempo de latência para as crises; já em relação ao percentual de
convulsões e de mortes, em todas as doses o mirtenol conseguiu reduzir
significativamente esses parâmetros (redução do percentual de convulsões em
12,5%, 25% e 62,5%, respectivamente; redução do percentual de mortes em 12,5%,
25% e 62,5%, respectivamente) quando comparado com o grupo controle.

Tabela 5. Efeito do mirtenol na convulsão induzida por picrotoxina.

Tratamentos Dose Latência % de % de


(mg/kg) (s) convulsões mortes
Controle - 522,4  12,7 100 100
MIR 50 487,6  4,9 87,5b 87,5b
100 645,8  3,6a,c 75b 75b
150 954,7  2,3a,c,d 37,5b 37,5b
DZP 5 1.486,2  8,8a 00b 00b

Controle (veículo); MIR (mirtenol: 50, 100 e 150mg/kg), DZP (Diazepam, 5mg/kg).
a
Valores representam a media ± E.P.M. (n=8). p<0,05 versus Controle (ANOVA seguido
b
pelo teste t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste); p<0,01 versus Controle (teste
 ); p<0,005 versus MIR 50mg/kg (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls
2 c
d
como post hoc teste); p<0,001 versus MIR 100mg/kg (ANOVA seguido pelo teste t-
Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

3. DISCUSSÃO

Descobertas seguras e eficazes para o tratamento da epilepsia têm sido uma


preocupação constante. A necessidade de introdução de novas drogas na
terapêutica desta patologia é essencial para o tratamento ou o reforço desta, sempre
buscando alternativas menos tóxicas e com igual ou superior potencial terapêutico
(COSTA, 2012).

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
96
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Os testes experimentais de convulsão são mecanismos úteis na investigação


de potenciais agentes terapêuticos contra as crises epilépticas, que acarretam
eventos recorrentes de convulsão.
No presente estudo, após receberem doses de mirtenol, observou-se um
significante aumento do tempo de latência para as manifestações convulsivas nos
animais sob indução com picrotoxina, pentilenotetrazol ou pilocarpina, além da
redução no percentual de episódios convulsivos e de mortes.
Os antagonistas específicos utilizados nestes ensaios para verificarem
possíveis mecanismos de ação anticonvulsiva demonstraram que o mirtenol pode
estar envolvido no sistema GABAérgico, modulando a sinalização elétrica cerebral
envolvida nos processos convulsivos. Estes resultados combinados mostraram que
o mirtenol inibe a atividade convulsiva da pilocarpina, pentilenotetrazol e picrotoxina,
e protege os animais contra a morte induzida por convulsões.
Os resultados deste ensaio demonstram que o mirtenol apresenta-se como
um potencial fármaco provavelmente capaz de agir sobre os neurotransmissores
relacionados a algumas desordens neuropsiquiátricas, a exemplo, a epilepsia e seus
subtipos.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Discussão
97
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CAPÍTULO 3
Avaliação do efeito neuroléptico do mirtenol

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados e Discussão
98
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

1. CATALEPSIA E POTENCIAL NEUROLÉPTICO DOS COMPOSTOS NATURAIS

Catalepsia é uma condição psicomotora cuja manifestação clínica caracteriza-


se pela rigidez muscular, que leva à permanência do indivíduo em postura
prolongada, fixa e estática. Quando acompanhada de alterações mentais, passa a
denominar-se catatonia (KAPLAN; SADDOCK; GREBB, 1994/1997; POMMEPUY;
JANUEL, 2002 apud SILVA; SANTOS; HOSHINO, 2010).
Em animais de laboratório, é definida como catatonia ou catatonia
experimental (CESARE; CARLINI, G.; CARLINI, E. 1967; ROGERS; SLATER, 1971),
caracterizando-se pelo tempo em que o animal permanece imóvel na postura que
lhe é imposta (SANBERG et al., 1988). É também caracterizada tanto pela
imobilidade posicional, como pela dificuldade de iniciar movimentos espontâneos
(CORREIA, FERNANDES, BERNARDI, 2008), podendo ser induzida em roedores
através de métodos como o eletrochoque convulsivo, administração de
antipsicóticos (ex. haloperidol), convulsivantes (ex. picrotoxina) e outras drogas que
alterem a neurotransmissão (SANBERG et al., 1988).
Inicialmente definida como um distúrbio motor específico associado a diversas
condições psiquiátricas, no ano de 1874 por Kahlbaum, a catatonia foi
posteriormente restrita à esquizofrenia por Kraeplelin e Bleuler, e mais
recentemente, restabeleceu-se sua correlação com outros transtornos mentais,
notadamente os transtornos de humor, tais como o transtorno bipolar (VAL et al.,
2008), que possui alta prevalência entre a população brasileira (cerca de 8%),
estimando-se que 1,8 a 15 milhões de brasileiros sejam portadores da doença
(ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE TRANSTORNO BIPOLAR – ABTB, 2013).
Algumas classes de psicofármacos (neurolépticos) que têm sido utilizados no
tratamento dessas condições psiquiátricas apresentam efeitos sobre o sistema
locomotor, dentre eles as alterações motoras, especificamente, a acinesia
(incapacidade de iniciar movimentos) e a catatonia (permanência da imobilidade),
desencadeando a necessidade de ajuste de dose, substituição do fármaco ou
associação com benzodiazepínicos (ABREU; BOLOGNESI; ROCHA, 2000).
Por outro lado, quando não é possível a retirada do medicamento que
ocasiona a catatonia, há a associação deste com outros fármacos, que possuem
propriedades inibitórias dos neurotransmissores causadores do efeito indesejado.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
99
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Entretanto, essa associação medicamentosa acaba por potencializar a


farmacodependência dos seus usuários, uma vez que, em alguns casos, a
associação ocorre com benzodiazepínicos (ABREU; BOLOGNESI; ROCHA, 2000),
podendo acarretar mais efeitos indesejados para quem faz uso desta terapia.
Com vistas a minimizar possíveis efeitos adversos desses neurolépticos, a
indústria farmacêutica vem ampliando, em larga escala, estudos com novas fórmulas
ou ajustes de doses para que drogas sintéticas possam substituir as já disponíveis
no mercado, de forma a promover maior eficácia e segurança.
Concomitante, essas companhias farmacêuticas também vêm provendo
esforços no sentido de sintetizar produtos à base de compostos naturais que
detenham as mesmas propriedades farmacológicas oferecidas atualmente pelos
sintéticos disponíveis no mercado e ao mesmo tempo consigam evitar o
acometimento por estes eventos, característicos dos neurolépticos comercializados.
Nesse sentido, as plantas e seus respectivos óleos essenciais têm sido
investigados quanto às suas propriedades sobre o sistema nervoso central,
tornando-se progressivamente importantes nas diversas desordens psiquiátricas.
Alguns trabalhos publicados na literatura sobre estudos brasileiros com
plantas e seus efeitos neurolépticos tem sido relatadas, porém em quantidade
bastante incipientes. Ao buscar artigos na base de dados Pubmed, lançando os
termos “plant” and “catalepsy” and “Brazil”, somente 16 artigos foram listados, sendo
sua totalidade desenvolvida a partir de estudos pré-clínicos com extratos de plantas.
É válido mencionar que alguns desses trabalhos evidenciaram reversão dos estados
catatônicos experimentais induzidos nos animais; entretanto, outros estudos
verificaram efeito inverso.
Um estudo realizado com o óleo essencial da colônia [Alpinia speciosa Schum
e Apinia zerumbet (Pers.) Burtt & Smith] identificou propriedades antipsicóticas
através da indução da catalepsia em camundongos tratados com doses
administradas via intraperitoneal, semelhantes ao haloperidol (DE ARAÚJO et al.,
2009; MAIA, 2011). Outro estudo analisou o extrato aquoso da casca de nozes em
animais catatônicos e verificou que o extrato oferece potencial preventivo contra
distúrbios extrapiramidais, em especial, a catalepsia (TREVIZOL et al., 2011).
Outros trabalhos também evidenciaram redução da catalepsia nos animais
experimentais, a partir da utilização dos extratos das plantas investigadas (ALMEIDA
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MOREIRA, M.R.C. Resultados
100
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et al., 1998; FERRAZ et al., 1999; SCHWARZ et al., 2003; MILIOLI et al., 2007;
PEREIRA et al., 2011; BERGAMASCHI et al., 2011).
Em contraste, uma investigação com uma mistura de nove plantas utilizadas
por uma população quilombola do Brasil, conhecida popularmente como tira-capeta,
consumida em forma de cigarros para promover relaxamento, foi investigada quanto
ao seu potencial efeito sobre o SNC de camundongos. O extrato hidroalcoólico
revelou indução de catatonia nos animais pré-tratados, levantando hipóteses de que
o material vegetal pode acarretar reações catalépticas também em humanos
(RODRIGUES et al., 2008).
Outros estudos com extratos de plantas cultivadas e utilizadas como
medicinais no Brasil também revelaram efeito indutor de catalepsia ou
potencializador do efeito cataléptico do haloperidol em animais de experimentação
(ASSIS et al., 2001; SANTOS, K.; SANTOS, C., 2005; DE SOUSA; ALMEIDA, 2005)
Há ainda um estudo que utilizou o extrato das folhas de Ginkgo biloba L. para
verificar seu potencial neuroléptico através do teste de catalepsia em camundongos,
revelando que o extrato potencializou o efeito do haloperidol nos animais testados.
Tais achados são relevantes, uma vez que pode estar havendo uma interação
farmacológica entre o uso do vegetal e o tratamento com o haloperidol em pacientes
portadores de desordens psiquiátricas (FONTANA et al., 2005).
Nesse sentido, e considerando que a indução de catatonia em animais é
preditiva do potencial de indução de efeitos extrapiramidais, limitantes do tratamento
em humanos (ANTONIO et al., 2009), o objetivo deste capítulo foi investigar o
possível efeito neuroléptico deste composto em modelos experimentais de catatonia
induzida por haloperidol, após tratamento agudo com diferentes doses.

2. RESULTADOS

2.1. Efeito do mirtenol no teste da catatonia experimental

Os dados apresentados no Gráfico 7 evidenciam o tempo de catatonia dos


animais nos tempos 15, 60 e 90 minutos após os tratamentos. Na avaliação aos 15
minutos, o mirtenol, em todas as doses testadas, reduziu significativamente o tempo
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MOREIRA, M.R.C. Resultados
101
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de permanência dos animais na posição antifisiológica (2,5 ± 0,3; 3,3 ± 0,2 e 3,4 ±
0,3; respectivamente), quando comparado ao grupo que recebeu haloperidol (29,8 ±
0,3), não apresentando diferenças significativas em relação ao controle (1,4 ± 0,3).
Na avaliação dos 60 minutos, os grupos tratados com mirtenol em todas as
doses testadas (2,0 ± 0,3; 2,3 ± 0,2 e 2,5 ± 0,2; respectivamente) ficaram menos
tempo na posição antifisiológica do que os do grupo padrão (29,8 ± 0,3), não
diferindo estatisticamente em relação ao controle (1,4 ± 0,3).
Na avaliação do tempo de catatonia dos animais aos 90 minutos, o mirtenol
reduziu significativamente esse parâmetro em todas as doses testadas (1,4 ± 0,3;
1,2 ± 0,3 e 1,0 ± 0,3; respectivamente), quando comparado com o grupo padrão
(29,8 ± 0,3), de maneira similar ao grupo controle (1,4 ± 0,3).
Controle
HAL
HAL + MIR 25
MIR 25
HAL + MIR 50
MIR 50
HAL + MIR 75
a a a MIR 75
30 a
a,b a
a,b
Tempo de catatonia (s)

a,b
a,b
a,b
20

10

b b b
b b b b b
b b b
0
15' 60' 90'

Gráfico 7. Efeito do mirtenol sobre o tempo de catatonia induzida por haloperidol


nos intervalos mensurados. Controle (veículo); HAL (haloperidol, 1mg/kg); MIR
(mirtenol: 25, 50 e 75mg/kg). As colunas representam as médias ± E.P.M. (n=8).
a b
p<0,0001 versus Controle; p<0,0001 versus HAL (ANOVA seguido pelo teste
Bonferroni como post hoc teste).

Na avaliação do possível mecanismo de ação do mirtenol neste teste, o co-


tratamento com haloperidol foi realizado nos grupos experimentais, observando-se
que o mirtenol conseguiu reverter a catatonia induzida em todas as doses testadas e
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MOREIRA, M.R.C. Resultados
102
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nos três intervalos de tempo observados (25mg/kg= 27,9 ± 1,3 [15min]; 27,7 ± 0,5
[60min] e 24,4 ± 1,1 [90min]; 50mg/kg= 26,0 ± 1,3 [15min]; 21,0 ± 0,5 [60min] e 19,4
± 0,8 [90min]; 75mg/kg= 22,3 ± 1,6 [15min]; 1,9 ± 0,5 [60min] e 2,2 ± 0,3 [90min]),
quando comparadas ao grupo que recebeu somente haloperidol (27,8 ± 0,3),
verificando-se que estes resultados apresentaram significância estatística do tipo
dose – tempo (p<0,0001) e sugerindo possível envolvimento dos receptores
dopaminérgicos nesse processo.
Quanto aos resultados do tempo médio total de catatonia induzida por
haloperidol (Gráfico 8), verificou-se que nos grupos que receberam mirtenol, em
todas as doses testadas (0,8 ± 0,4; 1,0 ± 0,5 e 1,1 ± 0,5; respectivamente), este
parâmetro foi similar ao grupo controle (0,5 ± 0,4); porém, houve redução
significativa desse tempo de permanência quando comparado ao grupo padrão (29,7
± 0,2).

a
30
a

a,b
Tempo de catalepsia (s)

20

10 a,b

b b b
0
Controle HAL HAL + MIR25 MIR 25 HAL + MIR 50 MIR 50 HAL + MIR 75 MIR 75
Gráfico 8. Efeito do mirtenol sobre o tempo total de catatonia induzida por
haloperidol. Controle (veículo); HAL (Haloperidol, 1mg/kg); MIR (mirtenol: 25, 50 e
a
75mg/kg). As colunas representam as médias ± E.P.M. (n=8). p<0,0001 versus
b c
Controle, p<0,0001 versus HAL; p<0,0001 versus MIR 25mg/kg (ANOVA seguido pelo
teste Bonferroni como post hoc teste).

Na investigação do possível mecanismo de ação do mirtenol sobre a atividade


neuroléptica, utilizou-se o co-tratamento com o haloperidol, verificando-se que,
nestes grupos, houve aumento significativo do tempo de catalepsia dos animais
quando comparados ao grupo controle; entretanto, o mirtenol conseguiu reduzir

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
103
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significativamente o tempo de catalepsia dos animais nas doses de 50mg/kg (23,1 ±


1,2) e 75mg/kg (7,8 ± 0,7) quando comparados ao haloperidol, validando os
resultados iniciais e sugerindo possível participação dos sítios dopaminérgicos neste
processo.

3. DISCUSSÃO

É sabido que o sistema dopaminérgico está envolvido com a função motora.


Nesse aspecto, os modelos animais mais empregados para avaliar a função
dopaminérgica de uma substância são a catatonia experimental induzida por
antagonistas dopaminérgicos ou a estereotipia induzida por agonistas (CORREIA;
FERNANDES; BERNARDI, 2008). Estes modelos baseiam-se no aumento da
atividade muscarínica estriatal, decorrente da hipofunção ou bloqueio exercido pelo
antipsicótico nos receptores dopaminérgicos D2-símile, que podem ser verificados
através de manifestações como catalepsia, redução da atividade motora e discinesia
(GMIRO; SERDYUK, 2007; RASMUSSEM; HSU; YANG, 2007).
O teste da catalepsia, como modelo relacionado a alterações no sistema
dopaminérgico, apresenta implicações que podem ser úteis no estudo da doença de
Parkinson e da esquizofrenia (MAIA, 2011). Neste estudo, para avaliar o mirtenol
como um neuroléptico e sua influência sobre o sistema dopaminérgico utilizou-se
este teste experimental, cuja catalepsia é induzida pelo haloperidol, um neuroléptico
utilizado como padrão ouro por antagonizar receptores dopaminérgicos do tipo D 2-
símile (SANBERG et al., 1988).
No presente estudo, após receberem doses de mirtenol, observou-se uma
significante redução do tempo de permanência dos animais na posição
antifisiológica, diminuição esta mais evidente em relação ao tempo, onde o mirtenol
conseguiu reduzir o tempo de catalepsia nas três doses testadas, apresentando
melhores resultados aqueles grupos que receberam as doses de 50mg/kg e
75mg/kg, de forma contrária ao grupo somente tratado com haloperidol, o que
tornam válidos os achados obtidos neste ensaio.
É importante salientar que, logo aos 15 minutos, o mirtenol, nas três doses
testadas, conseguiu reverter o efeito catatônico causado pelo haloperidol nos
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MOREIRA, M.R.C. Discussão
104
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animais, embora de maneira parcial, obtendo-se melhores resultados conforme o


tempo e a dose utilizada, demonstrando bons resultados em curto espaço de tempo.
Estes achados sugerem um aumento na concentração de dopamina induzida
pelo mirtenol, possivelmente desbloqueando o haloperidol dos sítios D2-símile, com
conseqüente diminuição do tempo de catatonia, sugerindo que este composto
natural provoca estímulo ao sistema dopaminérgico. Isso sugere também que o
mirtenol estaria atuando na modulação dos neurônios dopaminérgicos, através do
sistema GABAérgico, antagonizando os efeitos extrapiramidais causados pelos
neurolépticos típicos utilizados atualmente nos transtornos psiquiátricos, a exemplo,
o haloperidol.
Os resultados deste ensaio demonstram que o mirtenol apresenta-se como
um potencial composto capaz de agir sobre os neurotransmissores relacionados a
algumas desordens neuropsiquiátricas, a exemplo, a doença de Parkinson e a
esquizofrenia catatônica, diferentemente de alguns produtos naturais já testados
para este fim, mas que, ao invés de obterem resultados favoráveis, induziram a
catalepsia nos roedores (MAIA, 2011; MEDEIROS, 2011; PINTO, 2011).

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MOREIRA, M.R.C. Discussão
105
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CAPÍTULO 4
Avaliação do potencial tóxico do mirtenol

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MOREIRA, M.R.C. Resultados e Discussão
106
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1. TOXICIDADE E POTENCIAL TÓXICO

Diversas plantas aromáticas e seus respectivos compostos ativos têm sido


investigados quanto às suas propriedades bioquímicas, a fim de serem
posteriormente analisadas quanto às propriedades farmacológicas sobre o sistema
nervoso central, tornando-se progressivamente importantes à medida que
apresentam resposta farmacológica favorável e baixa toxicidade.
De acordo com a toxicologia, toda substância poderá ser considerada um
agente tóxico, variando conforme a condição de exposição, tempo e frequência de
exposição (dose única ou repetida) e via de administração (GRAFF, 2006).
Nos estudos com animais de laboratório, além dos testes para determinação
da dose letal 50% (DL50) de um composto natural, outros parâmetros toxicológicos
devem ser observados, a exemplo, os hematológicos e bioquímicos, pois nem todos
os componentes de uma planta medicinal apresentam efeitos terapêuticos e, quando
o possuem, ainda podem apresentar graus de toxicidade que comprometem a
segurança do mesmo, inviabilizando seu uso em humanos.
Estudos sobre a toxicidade de um composto natural podem verificar de forma
aguda, subcrônica ou crônica, o potencial tóxico do produto investigado. Na
toxicidade aguda, são utilizados grupos de animais com diferentes doses chegando
a 2000 mg/Kg. A dose é administrada uma única vez e o animal é observado por um
período de 14 dias. Posteriormente é verificado se houve morte. O teste tem o
objetivo de identificar se uma dose alta do produto testado têm a capacidade de
gerar efeitos tóxicos no individuo (VALADARES, 2006 apud BEDNARCZUK et al.,
2010).
Já nos testes de toxicidade sub-crônica e crônica o período de exposição é
maior (90 e 120, respectivamente), utilizando doses repetidas, cujo objetivo é
verificar se por um longo período de tempo o produto testado causa efeitos tóxicos
(VILAS BOAS, 2006 apud BEDNARCZUK et al., 2010).
Outros sinais de intoxicação sistêmica podem ser verificados a partir da
redução de massa corporal dos animais experimentais, redução no consumo de
água e ração, diminuição no volume de excretas, além de outros que podem
sinalizar, por exemplo, dano hepático (RAUBER; MELLO F.; MELLO J., 2006).

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
107
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

A toxicidade de substâncias químicas pode ainda ser verificada através da


análise de determinados órgãos dos animais pré-tratados, como por exemplo, o
fígado, o rim, o coração e o pulmão, uma vez que nestes órgãos as substâncias
tóxicas alteram seus parâmetros, resultando em achados anormais nas avaliações
hematológicas ou bioquímicas.
Nesse contexto, o objetivo deste capítulo foi apresentar o potencial tóxico do
mirtenol, através de parâmetros comportamentais, hematológicos, bioquímicos,
morfológicos e histopatológicos dos animais tratados com este monoterpeno.

2. RESULTADOS

2.1. Determinação da dose letal 50% (DL50)

A toxicidade aguda do mirtenol, administrada em dose única, foi avaliada por


meio do número de mortes por um período de 14 dias. A DL 50 estimada para o
mirtenol no ensaio da toxicidade aguda utilizando camundongos machos foi de 296
mg/kg, i.p., com intervalo de confiança de 270,6 a 323,8 mg/kg. Nas duas menores
doses testadas de 100 e 200 mg/kg não houve mortalidade durante o período de
observação de 14 dias.
As alterações comportamentais observadas durante este período ocorreram
somente no primeiro dia e nas maiores doses, onde os animais apresentaram
diminuição da ambulação, resposta ao toque e sedação, características típicas de
drogas depressoras do SNC.
Com esse parâmetro, foi possível testar com segurança as doses testes de
25mg/kg, 50mg/kg e 75mg/kg de mirtenol nos ensaios comportamentais, visto que a
dose letal calculada ficou estimada em 10 vezes mais do que a dose inicial escolhida
para ser testada.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
108
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.2. Estudo da toxicidade após doses repetidas (agudo, subagudo, subcrônico


e crônico)

2.2.1. Screening hipocrático

Uma das metodologias utilizadas para avaliar o potencial tóxico do mirtenol


administrado em doses repetidas foi a análise dos animais de acordo com o método
do screening hipocrático, que verifica os efeitos produzidos por uma substância
quanto ao estado de consciência e disposição (aparência geral, frêmito vocal,
irritabilidade), coordenação motora (atividade geral, resposta ao toque, resposta ao
aperto de cauda, contorção abdominal, marcha, reflexo de endireitamento), tônus
muscular (tônus das patas, tônus do corpo, força para agarrar, ataxia), reflexos
(auricular, corneal), atividade do sistema nervoso central (tremores, convulsões,
estimulações, fenômeno de straub, sedação, hipnose, anestesia) e atividade do
sistema nervoso autônomo (lacrimação, ptosis, micção defecação, piloereção,
hipotermia, respiração) do animal (ALVES, 2007; DOS SANTOS E SILVA, 2012).
O Screening hipocrático dos animais tratados com mirtenol de forma aguda
(30 dias), subaguda (60 dias), subcrônica (90 dias) e crônica (120 dias) após doses
repetidas estão apresentados no Quadro 4. Os sinais fisiológicos se mantiveram
constantes nas três doses administradas, com aumento discreto após os
tratamentos, não sendo evidenciados sinais clínicos significativos de toxicidade.
Observa-se nos sinais e sintomas apresentados pelos animais que houve
presença de straub, piloereção, ausência de resposta no aperto da cauda e reflexo
corneal, manifestações características de toxicidade, porém, quando ocorrem de
maneira intensa e associadas a outros parâmetros sugestivos de processos tóxicos.
Neste estudo, essas manifestações constituíram uma resposta orgânica ao
composto estudado, não sendo característica de toxicidade, uma vez que esses
eventos foram discretos e não ocasionaram mortalidade nos animais.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
109
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Quadro 4. Screening hipocrático dos animais tratados com mirtenol.

Dose Período
(mg/kg) (dias) Sinais e Sintomas
00 30 Ausência de sinais e sintomas de intoxicação.
60 Ausência de sinais e sintomas de intoxicação.
90 Ausência de sinais e sintomas de intoxicação.
120 Ausência de sinais e sintomas de intoxicação.

25 30 Aumento de micção e defecação.


60 Aumento de defecação. Presença de straub e piloereção.
90 Aumento de micção e defecação. Presença de straub e
piloereção. Ausência de resposta no aperto da cauda.
120 Aumento de micção e defecação. Presença de straub e
piloereção. Ausência de resposta no aperto da cauda.

50 30 Aumento de micção e defecação. Presença de piloereção.


60 Aumento de defecação. Presença de straub e piloereção.
Ausência de resposta no aperto da cauda e reflexo corneal.
90 Aumento de defecação. Presença de straub e piloereção.
Ausência de resposta no aperto da cauda e reflexo corneal.
120 Aumento de defecação. Presença de straub e piloereção.
Ausência de resposta no aperto da cauda e reflexo corneal.

75 30 Aumento de micção e defecação. Presença de straub e


piloereção.
60 Aumento de micção e defecação. Presença de straub e
piloereção. Ausência de resposta no aperto da cauda.
90 Aumento de micção e defecação. Presença de straub e
piloereção. Ausência de resposta no aperto da cauda e
reflexo corneal.
120 Aumento de micção e defecação. Presença de straub e
piloereção. Ausência de resposta no aperto da cauda e
reflexo corneal.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
110
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O aumento da micção e defecação verificado no screening hipocrático, por ter


sido discreto, pode ter ocorrido apenas pela manipulação dos animais para a
administração das doses diárias, pois a ação do pesquisador pode ocasionar essas
alterações, na maioria das vezes, alterando os hábitos alimentares (CUNHA et al.,
2009), por isso dado não é considerado relevante de toxicidade quando analisado
isoladamente.
Entretanto, mesmo com este entendimento, foram mensurados os pesos dos
animais, o consumo de água e ração, além das excretas apresentadas durante os
mesmos períodos de avaliação do screening hipocrático para verificação de possível
alteração desses parâmetros com indicação de toxicidade.

2.2.2. Massa corporal e consumo de alimentos dos animais

Durante o período de tratamento, foram analisados os consumos de ração


(Gráfico 9) e água (Gráfico 10) dos animais, cujos resultados demonstraram que o
mirtenol, em nenhuma das três doses testadas, alterou significativamente o
consumo destes alimentos, havendo discreto aumento ao longo dos tratamentos e
relação com a dose administrada.

Controle
MIR25
MIR50
100 MIR75
Consumo de ração (g)

80

60

40

20

0
30 60 90 120
Duração do tratamento (dias)

Gráfico 9. Efeito da administração oral de mirtenol em doses repetidas sobre o


consumo de ração dos animais. MIR (mirtenol: 25mg/kg, 50mg/kg e 75mg/kg).

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
111
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Controle
MIR25
MIR50
MIR75
150
Consumo de água (mL)

100

50

0
30 60 90 120
Duração do tratamento (dias)

Gráfico 10. Efeito da administração oral de mirtenol em doses repetidas sobre o


consumo de água dos animais. MIR (mirtenol: 25mg/kg, 50mg/kg e 75mg/kg).

Em relação à produção de excretas, os animais tratados cronicamente com as


três doses de mirtenol não obtiveram alterações significativas em relação ao grupo
controle (Gráfico 11), apresentando oscilações discretas conforme o período de
tempo e a dose relacionada.
Controle
MIR25
MIR50
80
MIR75
Produção de excretas (g)

60

40

20

0
30 60 90 120
Duração do tratamento (dias)

Gráfico 11. Efeito da administração oral de mirtenol em doses repetidas sobre a


produção de excretas pelos animais. MIR (mirtenol: 25, 50 e 75mg/kg).
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MOREIRA, M.R.C. Resultados
112
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Avaliando-se a massa corporal dos animais, considerando ingestão,


eliminação e pesagem dos mesmos, os resultados demonstraram que não houve
mudanças significativas neste parâmetro, mesmo após o período crônico de
tratamento ou com o aumento da dose administrada, havendo discretos aumentos
conforme esses dois aspectos (Gráfico 12).
Controle
MIR25
MIR50
30 MIR75
Peso córporeo (g)

20

10

0
0 30 60 90 120
Duração do tratamento (dias)

Gráfico 12. Efeito da administração oral de mirtenol em doses repetidas sobre a


massa corporal dos animais. MIR (mirtenol: 25, 50 e 75mg/kg).

2.2.3. Análise dos parâmetros hematológicos e bioquímicos

Os parâmetros hematológicos e bioquímicos são úteis para a investigação de


toxicidade sistêmica nos animais tratados por longo período de tempo com
substâncias potencialmente nocivas, que ficam alterados frente a essa exposição
(CUNHA et al., 2009).
Neste estudo, os resultados dos parâmetros hematológicos dos animais
tratados com mirtenol estão apresentados na Tabela 6. Os dados demonstram que,
mesmo após o tratamento crônico, não houve alterações significativas nos grupos
tratados com nenhuma das doses de mirtenol testadas, quando comparados aos do
grupo controle.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
113
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Tabela 6. Efeito da administração crônica de mirtenol sobre os


parâmetros hematológicos dos animais.
Parâmetros Controle MIR 25 MIR 50 MIR 75
Hemácias (mm3) 9,97 ± 0,25 10,0 ± 0,73 10,7 ± 0,72 9,28 ± 0,49
Hemoglobina (g/dL) 15,39 ± 0,09 15,9 ± 0,65 15,6 ± 1,10 15,5 ± 0,46
Hematócrito (%) 43,28 ± 1,37 43,2 ± 3,96 43,5 ± 2,75 42,6 ± 2,25
VCM (fL) 49,69 ± 0,07 47,3 ± 1,07 48,1 ± 0,78 49,8 ± 1,00
HCM (pg) 17,67 ± 0,05 17,6 ± 0,37 17,2 ± 0,20 17,9 ± 0,29
CHCM (%) 38,95 ± 0,39 37,5 ± 0,53 36,1 ± 0,21 36,7 ± 0,42
Plaquetas (mm3) 447,40 ± 21,08 443,9 ± 38,85 448,8 ± 11,6 446,2 ± 31,9
3
Leucócitos totais (mm ) 4,92 ± 0,35 4,89 ± 0,25 4,86 ± 0,37 4,78 ± 1,14
Neutrófilos (%) 15,40 ± 0,89 15,5 ± 1,45 14,96 ± 2,42 15,46 ± 2,22
Eosinófilos (%) 0,31 ± 0,03 0,37 ± 0,16 0,36 ± 0,16 0,37 ± 0,06
Linfócitos (%) 71,19 ± 2,51 72,09 ± 3,52 69,99 ± 2,41 69,95 ± 3,21

VCM (Volume Corpuscular Médio); HCM (Hemoglobina Corpuscular Média); CHCM


(Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média); Controle (veículo); MIR (mirtenol,
a
25, 50 e 75mg/kg). Os valores representam a média + E.P.M. (n=10). p<0,05 versus
Controle (ANOVA seguido pelo teste t-Student–Newman–Keuls como post hoc teste).

Os dados relacionados aos parâmetros bioquímicos dos animais tratados com


mirtenol estão apresentados na Tabela 7. As enzimas hepáticas foram mensuradas
com o intuito de verificar possíveis danos hepáticos ou renais nos animais
experimentais.
Os resultados demonstram que houve uma redução estatisticamente
significativa nos níveis séricos de ácido úrico, triglicerídeos e colesterol total dos
animais tratados, nas três doses de mirtenol, quando comparados com os do grupo
controle. Nos demais parâmetros, nenhuma alteração importante foi verificada.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
114
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Tabela 7. Efeito da administração crônica de mirtenol sobre os


parâmetros bioquímicos de animais.
Parâmetros Controle MIR 25 MIR 50 MIR 75
Glicose (mg dL-1) 90,14 ± 1,43 91,2 ± 4,33 90,4 ± 1,85 89,4 ± 2,07
Uréia (mg dL-1) 50,67 ± 0,31 49,4 ± 1,18 51,7 ± 0,83 48,9 ± 2,03
-1
Creatinina (mg dL ) 0,37 ± 0,41 0,36 ± 0,03 0,36 ± 0,02 0,37 ± 0,02
Ácido úrico (mg dL-1) 2,41 ± 0,04 2,21 ± 0,17a 2,13 ± 0,21a 2,07 ± 0,23a
Triglicerídeos (mg dL-1) 96,7 ± 0,03 81,1 ± 1,58a 81,2 ± 1,12a 78,6 ± 1,82a
CT (mg dL-1) 85,35 ± 2,41 80,3 ± 2,17a 80,8 ± 2,14a 80,9 ± 2,91a
AST (U mL-1) 85,33 ± 2,05 80,8 ± 4,55 84,3 ± 5,16 87,6 ± 3,87
-1
ALT (U mL ) 50,34 ± 1,43 50,5 ± 2,10 49,8 ± 2,64 50,3 ± 1,99
Bilirrubina total (mg dL-1) 0,21 ± 0,02 0,21 ± 0,04 0,29 ± 0,01 0,27 ± 0,03
Bilirrubina direta (mg dL-1) 0,11 ± 0,01 0,11 ± 0,02 0,12 ± 0,02 0,10 ± 0,03

CT (Colesterol Total); AST (Aspartato Aminotransferase); ALT (Alanina


aminotransferase); Controle (veículo); MIR (mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg). Os valores
a
representam a média + E.P.M. (n=10). p<0,05 versus Controle (ANOVA seguido pelo
teste t-Student–Newman–Keuls como post hoc teste).

2.2.4. Análise morfológica macroscópica

Nos estudos de toxicidade de doses repetidas um dos principais parâmetros


avaliados são os sinais tóxicos gerais, alterações alimentares, aspectos laboratoriais
e avaliação anatomopatológica e comportamental (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO,
2008).
Na avaliação anatomomacroscópica dos órgãos removidos dos animais
submetidos a tratamento crônico com mirtenol (Tabela 8), não foram observadas
alterações visuais significativas quando comparados ao grupo controle.
Adicionalmente, não ocorreu variação estatisticamente significante nos pesos
dos órgãos dos animais tratados com diferentes doses de mirtenol em relação ao
grupo controle, após tratamento crônico. A dose administrada também não exerceu
efeito deletério sobre os órgãos analisados após tratamento crônico.

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
115
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Tabela 8. Efeito da administração crônica de mirtenol sobre o


peso dos órgãos dos animais.
Órgãos Controle MIR 25 MIR 50 MIR 75
Coração 0,11 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,12 ± 0,02 0,11 ± 0,02
Fígado 0,87 ± 0,01 0,86 ± 0,02 0,86 ± 0,01 0,85 ± 0,01
Baço 0,09 ± 0,00 0,09 ± 0,01 0,08 ± 0,02 0,08 ± 0,03
Rim 0,13 ± 0,00 0,10 ± 0,03 0,12 ± 0,03 0,12 ± 0,01
Cérebro 0,16 ± 0,02 0,16 ± 0,01 0,16 ± 0,03 0,16 ± 0,02
Pulmão 0,15 ± 0,00 0,14 ± 0,01 0,15 ± 0,01 0,15 ± 0,01

Controle (veículo), MIR (mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg). Os valores representam a média +


a
E.P.M. (n=10). p<0,05 versus Controle (ANOVA seguido pelo teste t-Student–Newman–
Keuls como post hoc teste).

2.2.5. Análise histopatológica

A principal finalidade da análise histopatológica é avaliar a integridade


tecidual dos órgãos extirpados. Dentre os principais parâmetros investigados estão
lesões celulares reversíveis (degenerações) e irreversíveis (necrose e apoptose),
infiltração de leucócitos, congestão, extravasamento de sangue e fibrose (CUNHA et
al., 2009).
Conforme esses parâmetros foram investigados o hipocampo, o corpo
estriado e o fígado dos animais tratados com mirtenol. O grau de lesão foi expresso
através de uma escala percentual de 0 (nenhum) a 100 (total) para cada tecido
examinado. Os animais foram definidos como tendo lesão cerebral quando havia
pelo menos 50% de alteração no tecido investigado.
Na análise histológica hipocampal (Figura 31), os resultados não
evidenciaram nenhuma lesão cerebral na área investigada, após o tratamento agudo
com mirtenol nas três doses testadas quando comparadas com o grupo controle.
A análise do corpo estriado (Figura 32) também revelou a ausência de lesão
após o tratamento com mirtenol quando comparado ao grupo controle.
O tecido hepático dos animais tratados com mirtenol (Figura 33) também
demonstrou a ausência de dano tecidual quando comparados com o grupo controle.

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
116
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Figura 31. Efeito do tratamento agudo com mirtenol


sobre o hipocampo dos animais experimentais.

(A) Ausência de alterações histopatológicas no hipocampo de camundongos


observados por 24 h após administração do Controle (Tween 80 0,05% dissolvido em
solução salina 0,9%, i.p.; n=8, Controle; Hematoxilina – Eosina (HE) X100; Barra de
Escala = 10 µm); (B, C e D) Ausência de alterações histopatológicas no hipocampo de
camundongos tratados com mirtenol nas doses de 25, 50 e 75mg/kg (i.p.; n=8; HE
X100; Barra de Escala = 10 µm), respectivamente.

Figura 32. Efeito do tratamento agudo com mirtenol


sobre o corpo estriado dos animais experimentais.

(A) Ausência de alterações histopatológicas no corpo estriado de camundongos


observados por 24 h após administração do veículo - (Tween 80 0,05% dissolvido em
solução salina 0,9%, i.p.; n=8, Controle; Hematoxilina – Eosina (HE) X100; Barra de
Escala = 10 µm); (B, C e D) Ausência de alterações histopatológicas no corpo estriado
de camundongos tratados com mirtenol nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg (i.p.; n=8; HE
X100; Barra de Escala = 10 µm), respectivamente.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
117
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Figura 33. Efeito do tratamento agudo com mirtenol


sobre o tecido hepático dos animais experimentais.

(A) Ausência de alterações histopatológicas no fígado de camundongos observados


por 24 h após administração do veículo - (Tween 80 0,05% dissolvido em solução
salina 0,9%, i.p.; n=8, Controle; Hematoxilina – Eosina (HE) X40; Barra de Escala = 10
µm); (B, C e D) Ausência de alterações histopatológicas no fígado de camundongos
tratados com mirtenol nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg (i.p.; n=8; HE X40; Barra de
Escala = 10 µm), respectivamente.

3. DISCUSSÃO

A investigação de efeitos tóxicos, sejam eles agudos ou crônicos, provocados


por substâncias possivelmente farmacológicas, é de grande relevância, visto que
podem interferir em vários mecanismos biológicos, inclusive na produção de células
sanguíneas ou na lesão de órgãos nobres, que revelam papel importante nas
funções vitais do organismo (OLSON et al., 2000; TAN et al., 2008; BRANCO, 2009).
Os estudos de toxicidade aguda objetivam caracterizar a relação
dose/resposta de uma substância que conduz ao cálculo da DL50, ou seja, a dose
que tem efeito letal em 50% dos animais de uma população. Apesar da
impossibilidade de calcular esta dose nos animais tratados com mirtenol, já que essa
se encontra superior a 1.000 mg/kg, isso não indica que o mesmo não apresenta
toxicidade, uma vez que qualquer substância química pode ser tóxica, se a dose ou
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MOREIRA, M.R.C. Resultados
118
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

a exposição se tornar suficientemente alta, de modo que as alterações observadas


forem atribuídas às altas doses utilizadas (VASCONCELOS et al., 2007).
Em estudos anteriores de investigação da DL50 do mirtenol, esta foi
determinada em ratos, após administração por via oral, onde os machos
apresentaram 2,45 g/kg, as fêmeas 0,63 g/kg e no geral, a DL 50 nesses roedores foi
determinada em 1,4 g/kg (RESEARCH INSTITUTE FOR FRAGRANCE
MATERIALS, 2001; BHATIA et al., 2008). No entanto, não há relatos na literatura de
determinação da DL50 em camundongos, por nenhuma via de administração.
No presente estudo, complementando os ensaios sobre as propriedades
farmacológicas do mirtenol, foi imprescindível investigar também a toxicidade aguda,
subaguda, subcrônica e crônica em doses repetidas, com o propósito de reforçar
seu uso clínico com segurança, pois os estudos toxicológicos crônicos objetivam
descobrir os efeitos qualitativos e quantitativos de uma substância por um longo
período de tempo de exposição, possibilitando a latência para a instalação dos
efeitos tóxicos e seu conseqüente aparecimento após o acúmulo da substância no
organismo (BARROS; DAVINO, 2003; OGA; CAMARGO; BASTITUZZO, 2008;
BRANCO, 2009).
Nesse sentido, foi realizada a avaliação do potencial tóxico por meio do
screening hipocrático. Além disso, foi mensurado o consumo alimentar, o volume de
excretas produzido e a massa corporal dos animais, assim como foram investigados
os parâmetros bioquímicos e hematológicos, efetuada a análise macroscópica
morfológica dos órgãos nobres e os estudos histopatológicos dos hipocampos dos
animais de cada grupo experimental, após os 120 dias dos protocolos.
Na avaliação geral da toxicidade, os sinais de toxicidade sistêmica são
definidos verificando-se as reduções na massa corporal dos animais experimentais
(RAZA et al., 2002), a redução nos consumos de água e ração, a alterações de
comportamento, a presença de piloereção, dentre outros (CUNHA et al., 2009). O
screening hipocrático tem sido um método bastante útil e comumente usado nessa
triagem preliminar de plantas e/ou compostos químicos para detectar essas
atividades farmacológicas e toxicológicas (LUCIO et al., 2000), assim, como os
hábitos fisiológicos diários (ingestão de ração e água e volume de excretas).
Neste estudo, os resultados do screening hipocrático revelaram boa
tolerabilidade do mirtenol em roedores, embora alguns sinais clínicos de toxicidade
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MOREIRA, M.R.C. Discussão
119
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

tenham sido apresentados ao longo dos dias observados, como a presença de


straub e piloereção. Além disso, a baixa mortalidade dos animais também foi
considerada um dado positivo no estudo, por conferir segurança no uso desta
substância em animais, gerando expectativas promissoras para estudos clínicos
futuros.
Na toxicidade subaguda, os sinais de toxicidade sistêmica podem ser
verificados pela redução na massa corporal dos animais experimentais (RAZA et al.,
2002; TEO et al., 2002). Além desse parâmetro, a toxicidade sistêmica também pode
se manifestar com a redução nos consumos de água e ração, alterações de
comportamento, apatia ou condição da pelagem, como a piloereção (CUNHA et al.,
2009).
Quanto aos estudos de toxicidade sub-crônica e crônica, estes se diferenciam
pelo período de exposição dos animais à substância testada, onde o objetivo é
verificar se por um longo período de tempo de exposição o produto testado causa
efeitos tóxicos (VILAS BOAS, 2006 apud BEDNARCZUK et al., 2010).
Em relação ao consumo de ração e água, não houve diferenças significativas
desses parâmetros ao longo dos dias observados, bem como o volume de excretas
foi proporcional ao ingerido, o que confere ausência de interferência do mirtenol
sobre esses parâmetros.
O acompanhamento da massa corporal do animal, outro importante indicador
para a avaliação da toxicidade de uma substância administrada (DA SILVA et al.,
2012), possibilitou verificar que, após administração de doses repetidas, o mirtenol
inicialmente aumentou a massa corporal dos animais, com discreta redução ao
longo dos tratamentos, o que indica ausência ou mínimo grau de toxicidade deste
composto, visto que esta perda não ultrapassou 10% do peso inicial do animal
(FÉRES et al., 2006).
Na avaliação dos parâmetros hematológicos, nem hepatotoxicidade, nem
quaisquer outros efeitos toxicológicos foram observados nos roedores tratados com
mirtenol. Nos parâmetros bioquímicos, as enzimas que denunciam lesão hepática
quando estão aumentadas, não tiveram alteração significativa neste estudo.
Contrariamente, a redução pequena, porém estatisticamente significativa, dos níveis
séricos de colesterol total, triglicerídeos e ácido úrico dos animais tratados com
mirtenol, sugere uma possível utilização deste monoterpeno para o tratamento de
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MOREIRA, M.R.C. Discussão
120
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dislipidemias, gota ou outras patologias nos quais estes parâmetros respondam pela
fisiopatologia inerente.
Quanto ao estudo morfológico macroscópico, não houve alteração na forma
ou no peso dos órgãos estudados (coração, rins, fígado, baço, cérebro e pulmão)
dos animais tratados com as doses de mirtenol, o que reforça os achados nos
demais parâmetros quanto à baixa toxicidade deste monoterpeno.
Estudos da ação de compostos isolados ainda são incipientes, entretanto a
avaliação de outros monoterpenos, de modo semelhante ao mirtenol, em roedores,
demonstrou que as substâncias não causaram efeitos colaterais ou tóxicos (COSTA
et al., 2012; SOUTO-MAIOR et al., 2011). Desse modo, os resultados aqui
apresentados corroboram a literatura encontrada no que se refere aos estudos de
toxicidade utilizando compostos naturais.
Entretanto, apesar do conhecimento de que os monoterpenos são muitas
vezes considerados como tendo baixa toxicidade (DE SOUSA et al., 2007; TANAKA
et al., 1996 apud CAMPÊLO, 2011), sugere-se que estudos adicionais sejam
realizados para avançar na avaliação da segurança do uso do mirtenol em futuros
estudos clínicos.

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MOREIRA, M.R.C. Discussão
121
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CAPÍTULO 5
Avaliação da atividade antioxidante do mirtenol

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MOREIRA, M.R.C. Resultados e Discussão
122
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1 ESTRESSE OXIDATIVO E AÇÃO ANTIOXIDANTE

O estresse oxidativo ocorre quando radicais livres de oxigênio são gerados


em excesso pela redução do oxigênio. As espécies reativas do oxigênio (ROS)
consistem radicais livres de oxigênio e entidades associadas que incluem
superóxido, peróxido de hidrogênio e óxido nítrico (CHONG; LI; MAIESE, 2005).
Muitas dessas espécies são geradas durante condições fisiológicas normais,
em resposta a estímulos internos e externos. Baixos níveis de ROS podem ser
fundamentais em diversos processos, incluindo apoptose, imunidade e defesa contra
microorganismos. Por outro lado, altas concentrações ou remoção inadequada das
ROS por sistemas antioxidantes endógenos resultam em estresse oxidativo, que
pode causar disfunções metabólicas severas e danos a macromoléculas biológicas.
Assim, o estresse oxidativo ocorre quando há um desequilíbrio gerado pelo excesso
de ROS e/ou pela depleção das defesas antioxidantes (MATÉS; SÁNCHEZ-
JIMÉNEZ, 1999 apud ABREU, 2009).
O estresse oxidativo no cérebro ocorre quando a geração de ROS supera a
habilidade dos sistemas antioxidantes endógenos em remover o excesso de ROS,
acarretando dano celular (ABREU, 2009). Além disso, representa uma via
significativa que leva à destruição de células neuronais e vasculares no SNC. Com
isso, a produção de ROS pode levar à injúria, através da destruição da membrana
lipídica e quebra do DNA (CHONG; LI; MAIESE, 2005).
Nesse processo, o sistema de defesa antioxidante inicia sua ação para inibir
e/ou reduzir danos causados pelas ROS. Tais ações podem ser alcançadas por
meio de diferentes mecanismos: impedindo sua formação [sistema de prevenção],
impedindo sua ação [sistemas varredores] ou reparando as estruturas biológicas
lesadas [sistemas de reparo] (CLARKSON; THOMPSON, 2000; KOURY;
DONANGELO, 2003 apud BARBOSA et al., 2010).
Esse sistema de defesa é operacionalmente dividido em não-enzimático e
enzimático, onde o primeiro é constituído por grande variedade de substâncias que
podem ter origem endógena ou dietética, a exemplo, a vitamina C, enquanto que o
segundo inclui as enzimas Superóxido Dismutase (SOD), Catalase (CAT) e
Glutationa Peroxidase (GPx), que agem por meio de mecanismos de prevenção,

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
123
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impedindo e/ou controlando a formação de radicais livres e, consequentemente,


evitando o dano oxidativo (BARBOSA et al., 2010).
Frente a esse contexto, o objetivo deste capítulo foi apresentar o possível
efeito antioxidante do mirtenol sobre as ROS e as enzimas antioxidantes, através de
metodologias in vitro e in vivo, assim como o seu possível mecanismo de ação
antioxidante.

2. RESULTADOS

2.1. Efeito antioxidante in vitro do mirtenol

2.1.1. Efeito do mirtenol sobre a produção de espécies reativas com o ácido


tiobarbitúrico (TBARS)

A peroxidação lipídica foi analisada inicialmente pelo método de quantificação


de TBARS, que é um ensaio largamente utilizado para estimar a peroxidação dos
lipidios nas membranas e sistemas biológicos. Para realizar essa quantificação, foi
necessário inicialmente utilizar o AAPH, um composto hidrossolúvel cuja
decomposição produz nitrogênio molecular, o qual reage com o ácido tiobarbitúrico,
formando TBARS. Neste método, a verificação de inibição de TBARS significa a
redução de radicais livres por diminuição da peroxidação lipídica sobre a membrana
celular (Gráfico 13).
Por este método, observou-se que o mirtenol conseguiu inibir, de modo
estatisticamente significante, a quantidade de TBARS formado em aproximadamente
60%, e consequentemente, preveniu a peroxidação lipídica em todas as
concentrações adotadas, permitindo destacar que a menor concentração utilizada
(0,9 µg/ml) conseguiu exercer efeito semelhante ao das concentrações maiores (1,8;
µg/ml; 3,6µg/ml; 5,4µg/ml e 7,2µg/ml), com inibições de 55,4%; 60,3%; 60,7%;
60,3% e 63,6%; respectivamente, quando comparadas ao AAPH.

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
124
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

125
Controle
Nível de TBARS (% AAPH)
100 AAPH
0,9 µg/ml
 60%  45%
75 1,8 µg/ml
a
3,6 µg/ml
50 a
a a a a 5,4 µg/ml
7,2 µg/ml
25
Trolox

0 _________________________
Control
AAPH0,9 ng/ml
1,8 ng/ml
3,6 ng/ml
5,4 ng/ml
7,2 ng/ml
Trolox
mirtenol
Gráfico 13. Efeito do mirtenol sobre a produção de TBARS. Controle (veículo); AAPH
(100% de dano oxidativo); (concentrações de mirtenol: 0,9, 1,8, 3,6, 5,4 e 7,2µg/mL);
Trolox 140 µg/mL (controle positivo). Valores representam média ± E.P.M, (n=5),
a
experimentos em duplicata. p<0,001 versus AAPH (ANOVA seguido do teste t-Student-
Neuman-Keuls como post hoc teste).

O mirtenol também conseguiu inibir a quantidade de TBARS em maior escala


do que a concentração de Trolox (aproximadamente 45%), um análogo sintético da
vitamina E que protege as membranas do dano oxidativo in vivo, sendo utilizado
como padrão antioxidante neste tipo de ensaio.
Verificou-se ainda que o mirtenol, além de diminuir os níveis de peroxidação
lipídica, promoveu a inibição de 50% da produção de TBARS com um valor de CI50
de aproximadamente 0,61µg/mL, variando de 0,31 a 1,18µg/mL (IC=95%).

2.1.2. Efeito do mirtenol sobre a remoção do radical nitrito (NO scavenging)

O método de remoção do radical nitrito baseia-se na produção de óxido nítrico


(NO) pela decomposição espontânea de nitroprussiato de sódio em solução aquosa
e de seu desdobramento em íons nitrito, resultante da interação com o oxigênio.
Estes íons, que possuem forte poder oxidante, podem ser medidos pela reação de
Griess (BASU; HAZRA, 2006).
Com este método, uma substância que tenha afinidade com o NO é
competitiva do oxigênio, o que resulta na diminuição da produção de nitritos,
caracterizando a atividade antioxidante desta substância (SERAFINI et al., 2011;
AHMADI et al., 2010).
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MOREIRA, M.R.C. Resultados
125
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Neste ensaio (Gráfico 14), o mirtenol apresentou efeito positivo significante na


atividade sequestrante do radical nitrito em todas as concentrações testadas,
reduzindo 41,5%; 47,1%; 49%; 48,8% e 55,2% (respectivamente) da produção de
nitritos do grupo NPS. O Trolox, um análogo sintético do α-tocoferol, usado como
padrão antioxidante, também apresentou redução significativa de íons nitrito em
torno de 59,8%. Este resultado permite verificar a atividade antioxidante
demonstrada pelo mirtenol, que foi similar à efetuada pelo Trolox.

125 Controle

NPS
(% de indução pelo NPS)

100
Produção de nitrito

 48,3% 0,9 µg/ml

1,8 µg/ml
75
a 3,6 µg/ml
a a a  59,8%
50 a a 5,4 µg/ml

7,2 µg/ml
25
Trolox

0
____________________________
ControlSNP 0,9 ng/ml
1,8 ng/ml
3,6 ng/ml
5,4 ng/ml
7,2 ng/ml
Trolox
mirtenol
Gráfico 14. Efeito do mirtenol sobre a remoção do radical nitrito. NPS (produção de
nitrito por meio da decomposição espontânea do nitroprussiato de sódio, considerada
100% da produção de óxido nítrico); (concentrações de mirtenol: 0,9, 1,8, 3,6, 5,4 e
7,2µg/mL); Trolox 140µg/mL (controle positivo). Valores representam a média ± E.P.M.
a
(n = 5), experimentos em duplicata. p<0,001 versus NPS (ANOVA seguida pelo teste t-
Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

A concentração inibitória 50% (CI50), que expressa a concentração do mirtenol


que é capaz de remover 50% do radical nitrito livre formado, foi de 0,086µg/mL,
variando de 0,04 a 0,17µg/mL (IC=95%).

2.1.3. Efeito do mirtenol sobre a remoção do radical hidroxila (OH scavenging)

No método de remoção do radical hidroxila, verifica-se que a capacidade de


uma substância remover este radical está diretamente relacionada à sua atividade
antioxidante (COSTA et al., 2012). Neste método, o radical hidroxila é obtido pela
reação de Fenton, que por sua vez degrada a desoxirribose em malondialdeído,

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
126
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

tornando possível sua quantificação (SERAFINI et al., 2011; PRIOR; WU; SCHAICH,
2005).
Neste ensaio (Gráfico 15), verificou-se que o mirtenol foi capaz de remover o
radical hidroxila de maneira significante somente na maior concentração testada
(redução de 7,2%), porém esta atividade antioxidante foi menor do que a droga
padrão, que demonstrou melhor resposta antioxidante do que a substância em
estudo, reduzindo aproximadamente 78% do radical formado.
degradação da 2-deoxirribose (%)

125
Controle
 7,2%
100 Sistema
a
0,9 µg/ml
75 1,8 µg/ml
3,6 µg/ml
50
5,4 µg/ml
78%
a 7,2 µg/ml
25
Trolox

0
Control
System ________________________
0,9 ng/ml
1,8 ng/ml
3,6 ng/ml
5,4 ng/ml
7,2 ng/ml
Trolox
mirtenol

Gráfico 15. Efeito do mirtenol sobre a remoção do radical hidroxila. Sistema


(produção de MDA gerado pela degradação da 2-desoxirribose na presença do FeSO4 e
H2O2); (concentrações de mirtenol: 0,9, 1,8, 3,6, 5,4 e 7,2 µg/mL); Trolox 140 µg/mL
(controle positivo). Valores representam a média ± E.P.M. (n=5), experimentos em
a
duplicata. p<0,001 versus Sistema (ANOVA seguido pelo teste t-Student-Neuman-Keuls
como post hoc teste).

Estes resultados demonstram que, embora o mirtenol não tenha removido o


radical hidroxila em todas as concentrações testadas, na concentração maior houve
atividade antioxidante significante.
Contudo, é válido ressaltar que este método possui uma desvantagem em
relação ao método de remoção do radical nitrito, porque muitos antioxidantes
também têm propriedade quelante de metais. Assim, é impossível distinguir se a
ação do mirtenol poderia ser a de remover radical hidroxila ou apenas funcionar
como quelante (PRIOR; WU; SCHAICH, 2005), o que torna menos significante o
resultado apresentado neste ensaio.

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
127
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

A concentração inibitória de 50% (CI50), que expressa a concentração do


mirtenol que é capaz de remover 50% do radical hidroxila livre formado, foi de
1,51µg/mL, variando de 0,95 a 2,40µg/mL (IC=95%).

2.2. Efeito antioxidante in vivo do mirtenol

2.2.1.Efeito do mirtenol sobre a peroxidação lipídica

A lipoperoxidação acarreta alterações na estrutura e na permeabilidade das


membranas celulares, com conseqüente perda da seletividade na troca iônica e
liberação do conteúdo de organelas celulares, como as enzimas hidrolíticas dos
lisossomos, e formação de produtos citotóxicos, culminando em morte celular
(ABREU, 2009).
O efeito do mirtenol sobre os níveis de peroxidação lipídica está apresentado
no Gráfico 16. Foi possível verificar que o mirtenol, nas três doses testadas (25, 50 e
75mg/kg), reduziu de maneira significante (84,5%; 87,3% e 88,7%, respectivamente)
os níveis de lipoperoxidação quando comparado ao grupo controle, obtendo
melhores resultados do que a vitamina C (redução de 56%), que é usada como
padrão antioxidante.

1.5
Nível de peroxidação lipídica
(nmol de MDA/g de tecido)

1.0
 56%
a
 86%
0.5

a,b a,b a,b

0.0
Controle AC 250 MIR25 MIR50 MIR75

Gráfico 16. Efeito do mirtenol sobre o nível de peroxidação lipídica em hipocampo


dos animais experimentais. Controle (veículo); AC (ácido ascórbico); MIR (mirtenol, 25,
a
50 e 75mg/kg). Os valores foram expressos em média ± E.P.M (n=8). p<0,001 versus
b
Controle; p<0,001 versus AC (ANOVA seguido do teste t-Student-Neuman-Keuls como
post hoc teste).
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
128
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.2.2. Efeito do mirtenol sobre a concentração de nitrito

A avaliação da concentração de nitrito possibilita verificar o processo de


formação de radicais livres de nitrogênio, que estão presentes em variados
processos de estresse oxidativo.
Neste ensaio (Gráfico 17), o mirtenol, nas três doses testadas (25, 50 e 75
mg/kg), reduziu de maneira significante 84,1%, 85,1% e 86,6% (respectivamente) o
teor de nitrito quando comparado ao grupo controle, obtendo melhores resultados do
que a vitamina C (redução de 24,5%).

120
Conteúdo de nitrito (nM)

 24,5%
80 a

 85,3%
40

a,b a,b a,b

0
Controle AC 250 MIR25 MIR50 MIR75

Gráfico 17. Efeito do mirtenol sobre o teor de nitrito no hipocampo dos animais
experimentais. Controle (veículo); AC (ácido ascórbico); MIR (mirtenol, 25, 50 e
a
75mg/kg). Os valores foram expressos em média ± E.P.M. (n=8). p<0,0001 versus
a b
Controle; p<0,0001 versus Controle; p<0,0001 versus AC (ANOVA seguido do teste t-
Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

2.2.3. Efeito do mirtenol sobre a atividade da catalase (CAT)

A catalase é uma enzima encontrada em todos os organismos conhecidos e


está envolvida em processos nos quais as células estão expostas a processos de
estresse oxidativo (MICHELS et al., 1994 apud FRAGOSO, 2007).
Neste ensaio (Gráfico 18), o mirtenol, nas três doses testadas (25, 50 e
75mg/kg), aumentou de maneira significante (88%, 94% e 125%, respectivamente) a

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
129
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

atividade da catalase quando comparado ao grupo controle; entretanto, esse


aumento foi inferior ao efetuado pela vitamina C (aumento de 144%).

50
 102,3%
 144%
(mmol/min/mg de proteína)

a a

a,b a,b
Catalase

25

0
Controle AC 250 MIR25 MIR50 MIR75

Gráfico 18. Efeito do mirtenol sobre a atividade da catalase no hipocampo dos


animais experimentais. Controle (veículo); AC (ácido ascórbico); MIR (mirtenol, 25, 50
a
e 75mg/kg). Os valores foram expressos em média ± E.P.M. (n=8). p<0,0001 versus
a b
Controle; p<0,001 versus Controle; p<0,01 versus AC (ANOVA seguido do teste t-
Student-Neuman-Keuls como post hoc teste).

2.2.4. Efeito do mirtenol sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD)

Esta enzima é necessária para manter a vida em condições aeróbicas e


parece ser a primeira envolvida na linha de defesa contra radicais livres derivados
de oxigênio e pode ser rapidamente induzida em condições de exposição das
células orgânicas ao estresse oxidativo (MICHIELS et al., 1994 apud FRAGOSO,
2007).
Neste ensaio (Gráfico 19), o mirtenol, em todas as doses testadas (25, 50 e
75mg/kg), aumentou a atividade da SOD, sendo significante nas duas maiores
doses (35% e 44%, respectivamente) quando comparado ao controle. Todas as
doses aumentaram a atividade da SOD em percentual maior do que a vitamina C
(aumento de 17%).

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
130
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 39,5%

4
a
a
Superóxido dismutase

 17%
(U/mg de proteína)

0
Controle AC 250 MIR25 MIR50 MIR75

Gráfico 19. Efeito do mirtenol sobre a atividade da superóxido dismutase no


hipocampo dos animais experimentais. Controle (veículo); AC (ácido ascórbico); MIR
(mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg). Os valores foram expressos em média ± E.P.M. (n=8).
a
p<0,05 versus Controle (ANOVA seguido do teste t-Student-Neuman-Keuls como post
hoc teste).

2.2.5. Efeito do mirtenol sobre a atividade da glutationa reduzida (GSH)

A glutationa reduzida é uma enzima considerada das mais importantes no


sistema de defesa antioxidante da célula, protegendo-a contra a lesão resultante da
exposição a agentes como íon ferro, radiação e luz ultravioleta (DENEKE;
FANBURG, 1989 apud ABREU, 2009).
Neste ensaio (Gráfico 20), o mirtenol, em todas as doses testadas (25, 50 e
75 mg/kg), aumentou de maneira significante a atividade da GSH (8,9%; 12,8% e
14,9%; respectivamente) quando comparado ao grupo controle. Todas as doses
aumentaram a atividade da GSH em percentual significativamente maior do que a
vitamina C (aumento de 6,2%).

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
131
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

 12,2%

a,b a,b
900  6,2% a
Nível de Glutationa reduzida
(ng/g de tecido)

600

300

0
Controle AC 250 MIR25 MIR50 MIR75

Gráfico 20. Efeito do mirtenol sobre a atividade da glutationa reduzida no


hipocampo dos animais experimentais. Controle (veículo); AC (ácido ascórbico); MIR
(mirtenol, 25, 50 e 75mg/kg). Os valores foram expressos em média ± E.P.M. (n=8).
a b
p<0,001 versus Controle; p<0,01 versus AC (ANOVA seguido do teste t-Student-
Neuman-Keuls como post hoc teste).

3. DISCUSSÃO

Neste estudo foi possível investigar a atividade antioxidante do mirtenol, por


meio de ensaios in vitro e in vivo. Quanto aos estudos in vitro, investigou-se sua
capacidade de reduzir a peroxidação lipídica, empregando-se o método de produção
de espécies reativas com ácido tiobarbitúrico (TBARS assay), remoção do radical
nitrito (NO-scavenging assay) e remoção do radical hidroxila (OH-scavenging assay)
(ZIN; ABDUL-HAMID; OSMAN, 2002; FITÓ; LA TORRE; COVAS, 2007; MOON;
SHIBAMOTO, 2009; SERAFINI, et al., 2011).
Os achados do ensaio de TBARS sugerem que o mirtenol pode proteger dos
processos oxidativos as biomoléculas essenciais ao funcionamento de órgãos
nobres, como o cérebro e o coração, de modo semelhante aos observados em
outros estudos utilizando monoterpenos (GUIMARÃES et al., 2010; COSTA, 2012).
Na avaliação da produção de íons nitrito, houve uma diminuição significativa
na sua produção pelo mirtenol, o que demonstra a propriedade antioxidante deste

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
132
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

monoterpeno, favorecendo a proteção das biomoléculas contra danos causados


pelos radicais livres derivados do nitrogênio.
O óxido nítrico desempenha um papel importante em vários tipos de
processos inflamatórios. É produzido por macrófagos no processo de resposta
orgânica inflamatória. Alguns estudos conferem propriedades mutagênicas, pois
interfere no reparo do DNA de maneira negativa (OKOKO, 2009). Além disso,
acredita-se que o NO pode estar implicado na gênese de doenças do sistema
nervoso central (COSTA, 2012), conferindo a necessidade de mais pesquisas
relacionadas ao desenvolvimento de novos compostos antioxidantes,
preferencialmente de origem natural, que confiram segurança e eficácia.
O radical hidroxila, de modo similar ao radical nitrito, é altamente reativo e
pode causar dano oxidativo ao DNA, lipídios e proteínas, apresentando efeitos
citotóxicos, mutagênicos e carcinogênicos (SHUKLA et al., 2009). O mirtenol,
embora não tenha removido o radical hidroxila em todas as concentrações testadas,
conseguiu removê-lo na maior concentração utilizada, apresentando-se como
agente protetor das membranas celulares contra os danos oxidativos provenientes
deste radical e potencial agente terapêutico nas patologias de origem oncogênica
(EVSTATIEVA et al., 2010; MEDINA-HOLGUÍN et al., 2008), necessitando de
posteriores investigações que melhor explorem esta questão.
Adicionalmente, para ampliar as evidências acerca do potencial antioxidante
do mirtenol, foram realizados testes in vivo, utilizando as metodologias que
investigaram a lipoperoxidação, o teor de nitrito e as atividades das enzimas
antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa reduzida nos tecidos
cerebrais dos animais tratados com este monoterpeno.
Um importante efeito demonstrado pelo mirtenol neste estudo foi a diminuição
dos níveis de peroxidação de lipídios e de nitrito no tecido cerebral dos animais
tratados com este monoterpeno, pois estudiosos acreditam que o NO pode estar
implicado na neurogênese de doenças do sistema nervoso central (COSTA, 2012),
sendo desta forma de fundamental importância a busca por novos compostos
naturais que tenham propriedades antioxidantes para espécies reativas ao oxigênio
e ao nitrogênio.
Também foi verificado o aumento da atividade das enzimas antioxidantes
investigadas, onde o mirtenol conseguiu promover esse aumento de maneira
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MOREIRA, M.R.C. Discussão
133
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significativa em todas as doses testadas e em todas as enzimas analisadas, sendo


melhor do que o efeito antioxidante promovido pela vitamina C, considerada
substância de referências em estudos desta natureza. Assim, os resultados obtidos
nesses ensaios in vivo ratificam os já evidenciados no estudos in vitro quanto à
atividade antioxidante do mirtenol.
Os resultados obtidos com os testes para avaliação do potencial antioxidante
de substâncias demonstraram um efeito benéfico do mirtenol sobre a modulação
antioxidante enzimática no SNC dos roedores, confirmando os achados nos ensaios
in vitro, o que o torna um composto capaz de aumentar a proteção do cérebro contra
danos oxidativos, contribuindo assim para o retardamento de sua deterioração, já
que diminuiu a peroxidação lipídica e a produção de nitrito e aumentou as
concentrações de glutationa reduzida, catalase e superóxido dismutase, agindo
como um potencial composto antioxidante.

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MOREIRA, M.R.C. Discussão
134
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CAPÍTULO 6
Prospecção do mirtenol no tratamento da ansiedade

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MOREIRA, M.R.C. Resultados e Discussão
135
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1. APLICAÇÕES DO MIRTENOL E GERAÇÃO DE PROPRIEDADE INTELECTUAL

As desordens que afetam o sistema nervoso central configuram crescente


interesse dos pesquisadores da área, sobretudo quando se pretende o
desenvolvimento de psicofármacos que consigam exercer suas propriedades
terapêuticas com o mínimo de reações indesejáveis e/ou adversas.
Os óleos essenciais e seus compostos aromáticos, em geral, apresentam tais
características e por isso têm sido alvo de diversos estudos no sentido de verificar
suas atividades farmacológicas sobre o SNC, onde alguns deles já se encontram
elucidados como agentes antiinflamatórios, analgésicos e anticonvulsivantes,
conforme pode ser verificado através dos estudos científicos publicados no âmbito
nacional e internacional, desencadeando a necessidade de também identificar
aqueles que apresentem atividade ansiolítica, capazes de exercer efeitos similares
às drogas disponíveis no comércio, mas com menores efeitos indesejáveis.
O mirtenol é um álcool natural primário com larga utilização na composição de
produtos de limpeza, detergentes, xampus, sabonetes e outros artigos de higiene.
Entretanto, seu uso na indústria farmacêutica tem sido incipiente, devido à ausência
de estudos que verificassem a existência de propriedades terapêuticas, tais como a
antioxidante, ansiolítica, sedativa e outras com influência sobre o sistema nervoso
central.
Entretanto, testes in vitro já comprovaram a atividade antioxidante do mirtenol,
quando experimentado em protocolos experimentais específicos, que apontaram sua
ação sobre a peroxidação lipídica com a remoção de radicais livres, indo atuar
diretamente contra o estresse oxidativo e conseqüente dano celular.
Quanto aos estudos in vivo, realizados com ratos e camundongos sobre os
efeitos ansiolíticos do mirtenol, estes revelaram que baixas doses são capazes de
alterar significativamente o comportamento dos roedores em diversos testes
experimentais, dentre eles, o Campo aberto, Rota Rod, Labirinto em cruz elevado e
Transição claro-escuro, tendo, em todos eles, resultados melhores ou similares as
drogas consideradas padrão ouro no tratamento da ansiedade, a exemplo o
diazepam. Além disso, diferentes vias de administração também foram testadas nos
modelos animais de ansiedade (via oral - gavagem, via intraperitoneal), conferindo-
se ao mirtenol boa absorção e resposta farmacológica em todas elas.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
MOREIRA, M.R.C. Resultados
136
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Com estes resultados, pretende-se ampliar os testes para uso clínico, o que
corresponderá às fases II, III e IV, findando-se na comercialização deste bioproduto
para os diversos públicos, cuja reivindicação de propriedade intelectual já foi
solicitada.

2. REGISTRO DE PATENTES DO MIRTENOL

A fim de verificar o histórico de registros de patentes relacionadas ao mirtenol,


efetuou-se uma pesquisa de prospecção durante o mês de junho de 2013, a partir
de consulta aos bancos de dados Espacenet (EP), Instituto Nacional de Propriedade
Intelectual (INPI) e United States Trademark Office (USPTO). Inicialmente, foram
analisados nos bancos de dados do INPI, USPTO e EP as palavras-chave
“mirtenol”, “ansiedade”, “neuroléptico”, “antioxidante”, “mirtenol and ansiedade”,
“mirtenol and neuroléptico”, “mirtenol and antioxidante”, nos idiomas português e
inglês, conforme apresentado na Tabela 9.

Tabela 9. Patentes encontradas nas bases de dados.


Palavras-chave INPI USPTO EP
Mirtenol (Myrtenol) 1 152 15
Ansiedade (Anxiety) 527 20.766 14.749
Mirtenol and ansiedade (Myrtenol and anxiety) 0 0 0
Neuroléptico (Neuroleptic) 10 3.205 1.229
Mirtenol and neuroléptico (Myrtenol and neuroleptic) 0 0 0
Antioxidante (Antioxidant) 460 60.322 37.787
Mirtenol and antioxidante (Myrtenol and antioxidant) 0 0 0
TOTAL 998 236.293 53.780
Fonte: INPI, USPTO, EP (Junho/2013).

Usando somente a palavra “mirtenol (myrtenol)” foram encontradas 168


patentes nas bases investigadas; entretanto, para verificar quais destas patentes
possuíam relação com propriedades farmacológicas, optou-se por realizar a leitura
de todos os resumos, classificando-as conforme suas aplicações mencionadas ou
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MOREIRA, M.R.C. Resultados
137
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

nos resumos ou nas reivindicações (Tabela 10). Estas patentes foram analisadas
também no que diz respeito aos detentores das patentes concedidas (Tabela 11),
bem como os países depositantes (Tabela 12).
Sobre as aplicações das invenções em relação ao mirtenol, observou-se que
a maioria dos registros referiu-se à biossíntese de compostos químicos que utilizam
o mirtenol ou outro monoterpeno álcool em sua formulação, com 4% do total de
patentes encontradas. Entretanto, embora um elevado percentual de patentes tenha
sido encontrado na busca com o termo “mirtenol” (93%), estas não apresentaram,
em seu título ou resumo, alguma correlação específica deste monoterpeno com a
invenção patenteada, havendo menção do mirtenol somente nos detalhes da
invenção, como referência de apoio.

Tabela 10. Aplicações das patentes relacionadas ao mirtenol.


Aplicações INPI USPTO EP
Biossíntese 1 0 5
Produto agrícola 0 1 0
Reações químicas 0 1 0
Produtos de limpeza 0 1 0
Cosméticos 0 0 0
Antioxidante para alimentos 0 0 1
Farmacologia* 0 0 1
Ausência de aplicação específica do mirtenol 0 149 8
TOTAL 1 152 15
* composição de produto para tratar problemas respiratórios e formulação de produto
acaricida.
Fonte: INPI, USPTO, EP (Junho/2013).

Ainda em relação à pesquisa de prospecção, foi possível observar que, em


relação aos depositários de patentes, as empresas são as maiores detentoras, com
91%, seguidas da pessoa física, com 5% e universidades, representando 4%.

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
138
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Tabela 11. Categorias de detentores das patentes concedidas


relacionadas ao mirtenol.
Detentores das patentes INPI USPTO EP
Empresa 0 140 12
Pessoa física 0 6 3
Universidade 1 6 0
TOTAL 1 152 15
Fonte: INPI, USPTO, EP (Junho/2013).

Esses resultados refletem que as empresas ainda são as maiores detentoras


de patentes no cenário atual, por isso, os processos de aproximação entre a
universidade e a indústria têm sido intensamente encorajados, buscando incentivar a
comercialização do conhecimento gerado nas universidades para benefício da
sociedade, posto que esta aproximação favorece a geração de novos empregos,
forma nova mentalidade e mantém a cultura do país (SIMÕES; SCHENKEL, 2002).
Quanto à pesquisa de patentes por países depositários, observou-se que há
um domínio de patentes para países ricos ou desenvolvidos. Estas patentes foram
depositadas em sua maioria pelos Estados Unidos (54%), seguido por Japão (14%).
Entretanto, para o tema pesquisado, o Brasil somente apresentou uma patente com
o termo “mirtenol”, demonstrando o déficit de pesquisas com este monoterpeno.

Tabela 12. Patentes relacionadas ao mirtenol depositadas por país.


País depositante INPI USPTO EP
Estados Unidos 0 89 4
Japão 0 19 6
Israel 0 12 0
França 0 11 3
Holanda do Norte 0 11 0
Alemanha 0 5 2
Grã-Bretanha 0 5 0
Brasil 1 0 0
TOTAL 1 152 15
Fonte: INPI, USPTO, EP (Junho/2013).
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MOREIRA, M.R.C. Resultados
139
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Quanto ao único registro de patente nacional encontrado na busca


(PI0401374-3 A2), trata-se de um processo de obtenção de derivados oxigenados
do beta-pineno pela sua oxidação catalisada por óxidos de metais de transição, a
exemplo, o mirtenal, mirtenol, pinocarveol e pinocarvona, que foi depositado pela
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) no ano de 2004 (INPI, 2013).
Um levantamento envolvendo 278 plantas nativas brasileiras revelou que
66,9% delas são sujeitas à aplicação ou à concessão de patentes. De 738
documentos de patentes analisados, apenas 5,8% foram aplicações brasileiras
(MOREIRA et al., 2006), confirmando os poucos achados encontrados nesta busca
em relação ao mirtenol.
Considerando esse cenário, o mirtenol e suas aplicações farmacêuticas
encontram-se com o pedido de depósito de patente efetuado no INPI, aguardando o
período legal para que haja seu registro definitivo.

3. PROTEÇÃO PATENTÁRIA DO MIRTENOL

Aplicações farmacêuticas do (-)-mirtenol para o tratamento da ansiedade


(Pedido de patente depositado). A presente invenção, sob pedido nº BR 10 2012
021831 3 A2, diz respeito ao desenvolvimento de formulações farmacêuticas à base
de cis-mirtenol [6,6-Dimetilbiciclo[3,1,1]hepta-2-eno-2-metanol], um derivado
sintético do mirtenol, para tratamento da ansiedade. Mais especificamente, a
presente invenção refere-se ao potencial ansiolítico do cis-mirtenol e sua utilização
na formulação de produto(s) farmacêutico(s) para tratamento de patologias
relacionadas com o sistema nervoso central (ANEXO B).

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MOREIRA, M.R.C. Resultados
141
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CONCLUSÕES

Este estudo teve o objetivo de avaliar o efeito do mirtenol sobre o sistema


nervoso central, cujos resultados possibilitaram as seguintes inferências:

 este monoterpeno apresenta potencial ansiolítico, sem causar efeitos


sedativos, cujo mecanismo de ação possivelmente envolve os receptores
benzodiazepínicos;

 possui atividade neuroléptica, pois reverteu os efeitos catatônicos causados


pelo haloperidol, cujo mecanismo de ação possivelmente envolve os receptores
dopaminérgicos do tipo D2-símile;

 apresenta atividade anticonvulsivante, uma vez que reverteu os efeitos


tóxicos causados pelas drogas convulsivantes padrão utilizadas;

 possui baixa toxicidade, verificada na avaliação da DL 50, na manutenção da


massa e do padrão alimentar dos animais, na inalteração dos parâmetros
hematológicos e bioquímicos e na preservação dos aspectos morfológicos dos
órgãos nobres avaliados, mesmo após administração de doses repetidas na
avaliação crônica (após 120 dias);

 revela-se como um composto antioxidante, verificado nos testes in vitro e in


vivo, sendo considerado uma substância neuroprotetora contra possíveis danos
degenerativos celulares geralmente ocasionados por doenças
neurodegenerativas.

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MOREIRA, M.R.C. Conclusões
143
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

PERSPECTIVAS

O mirtenol apresenta-se como um produto com baixa toxicidade, alto poder


antioxidante, apresentando ainda efeito ansiolítico, neuroléptico e anticonvulsivante,
derivado de produto natural, conferindo menores efeitos colaterais que a droga de
maior capacidade comercial destinada ao tratamento da ansiedade disponível no
mercado brasileiro. Com isto, pretende-se encapsular o mirtenol, a fim de elaborar
um novo fitofármaco, para ser testado em humanos e posteriormente
comercializado.
Sob outro prisma, devido a potencial versatilidade deste futuro
fitomedicamento quanto as suas formas de apresentação (comprimido, xarope,
solução) e sua eficácia terapêutica utilizando baixas dosagens, maior será a
possibilidade de adequação das posologias prescritas, podendo ser melhor aceito
pelos usuários e as formas de uso seguidas corretamente.
Quanto aos estudos experimentais, pretende-se continuar a testar o mirtenol,
tanto por outras vias de administração que não as utilizadas nos experimentos
realizados neste trabalho, bem como em modelos animais diferentes, a fim de
desvelar outras atividades deste monoterpeno sobre condições que afetam o SNC e
demais sistemas orgânicos, assim como elucidar melhor seus mecanismos de ação.

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MOREIRA, M.R.C. Perspectivas
145
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

REFERÊNCIAS

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ABREU, R.V. Efeito promnésico e antioxidante do café no sistema nervoso


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ANEXO A – Carta de aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal

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MOREIRA, M.R.C. Anexos
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ANEXO B – Depósito de pedido de patente do mirtenol

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MOREIRA, M.R.C. Anexos
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ANEXO C – Produção científica e intelectual relacionada à tese

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MOREIRA, M.R.C. Anexos

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