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PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO

Laboratório de Análises
clínicas e Complementares
Título: Dosagem de glicose
Análise Crítica: Alunos Allan Rogers, Aprovado: Aluno XXX
Ana Costa, Elisandra Miranda Data:18/10/2021
Data: 18/10/2021 Assinatura:
Assinaturas: XXX

1. Aplicação clínica: Sistema enzimático para a determinação da glicose no


sangue,liquor e líquidos asciticos, pleural e sinovial por método cinético ou de ponto
final
2. Princípio: A glicose oxidase catalisa a oxidação da Glicose. O peróxido de hidrogênio
formado reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob ação catalisadora da peroxidase,
através de uma reação oxidativa de acoplamento, formando uma antipirilquinonimina
vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à concentração da glicose na amostra.

3. Amostra:
 Preparo do paciente: para o exame o paciente deve estar em jejum de no
mínimo 8 horas

 Tipo: Plasma, soro, liquido ascitico, liquido pleural, liquido sinovial e líquor
 Volume mínimo: Volume mínimo de amostra para o teste é de 0,01mL
 Conservação: Realizar a colheita de sangue utilizando anticoagulante contendo
um inibidor da glicose. As amostras de sangue não contendo antiglicolítico
devem ser centrifugadas imediatamente após colheita, e o plasma ou soro
separado das células ou coagulo. Nos outros líquidos biológicos adicionar
anticoagulante contendo antiglicolitico na mesma proporção usada para a
amostra de sangue e centrifugar antes de iniciar a medição
 Causas de rejeição: Presença de coágulo
 Estabilidade: O analito é estável por 8 horas em amostras colhidas com
antiglicolítico. No plasma, soro e outros líquidos separados das células, a glicose
permanece estável por 3 dias entre 2 – 8 ºC, quando não ocorre contaminação
bacteriana.

Biossegurança: Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados na manipulação do


reagente. O reagente contém azida sódia que é tóxica. Deve-se tomar cuidado para evitar a
ingestão e no caso de contato com os olhos, deve-se lavar imediatamente com grande
quantidade de água e procurar auxilio médico. A azida pode formar compostos altamente
explosivos com tubulações de chumbo e cobre. Portanto, utilizar volumes de água para
descartar o reagente.

4. Metodologia:
 Método: GOD-Trinder
 Princípio: A GOD catalisa a oxidação da glicose para ácido glicônico e peróxido
de hidrogênio através de uma reação oxidativa – (POD), o peroxido de
hidrogênio forma reação com 4-aminoantipirina e fenol, formando quinoneimina,
com a absorbância medida em 505nm, sendo proporcional à concentração de
glicose na amostra.
Glicose + O2 + H2O (GOD) Ácido glicônico + H20
2H2O + 4-aminoantipirina + fenol (POD) Quinoeimina + 4H20
5. Reagente utilizado:
 Reagente 1 – Armazenar entre 2 a 8°C. Contém tampão fosfato, fenol, glicose oxidase,
peroxidase, 4-aminoantipirina, azida sódica e surfactantes.
 Reagente 2 (Padrão calibrador) – Armazenar entre 2 a 30°C. Contém glicose e biocida
não tóxico
 Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condições indicadas, são estáveis
até a data de expiração impressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estão
sujeitos a contaminações de natureza química e microbiana que podem provocar
redução da estabilidade. O reagente padrão pode precipitar em baixas temperaturas, o
que não interfere no seu desempenho

6. Componentes

Número 1 - Biureto - conservar entre 15 e 30ºC. Contém hidróxido de sódio 600


mmol/L, sulfato de cobre
.
Número 2 – Padrão calibrador – Reagente 2 – Contem glicose 100mg/dL e biocida não
tóxico

7. Equipamentos e instrumentos:

 Espectrofotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre 490 e 520


nm.
 Pipetas para medir amostras e reagente
 Cronometro
 Banho maria mantido a temperatura constante (37°C)

8. Procedimentos manual:

Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:

Branco Teste Padrão


Amostra ----- 0,01 mL ------
Padrão (n°2) ----- ----- 0,01 mL
Reagente 1 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

 Separar os reagentes;
 Identificar os tubos de ensaio com B(branco), P (padrão), T (teste);
 Tirar o soro da centrifuga e pipetar 0,01mL da amostra e adicionar no tubo T,
colocando no fundo para que o reagente entre em contato com o soro do paciente, e
logo após descartar a ponteira;
 Colocar o reagente (2) 0,01mL no tubo P, e novamente descartar a ponteira para
evitar contaminação;
 Depois colocar 1,0mL nos três tubos (B, T, e P) sem encostar a ponteira nos
tubos para que não contamine, depois de realizar esta etapa é necessário descartar a
ponteira;
 Após esses passos, levar em banho-maria por 10min;
 Passados os 10min em banho-maria, pipetar 1,0mL do branco e colocar na
cubeta, pegando-a pela parte frisada, ou em seu topo, evitando que haja dificuldade na
leitura do feixe de luz pelas possíveis sujidades adquiridas pelo contato na parte
translucida da cubeta;
 Pipetar com a pipeta na vertical 1,0mL do teste e transferir para a cubeta;
 Por último pipetar 1,0mL do Padrão e também colocá-lo na cubeta;
 Com tudo isso, ajustar o comprimento de onda do espectrofotômetro para
505nm;
 Abrir o equipamento e adicionar o primeiro B, em seguida o T, e após o P;
 Selecionar com o carrossel a cubeta com o elemento Branco, e apertar o 0A para
zerar o equipamento;
 Após mover novamente o carrossel e fazer a leitura do teste e anotar a sua
absobância;
 Novamente mover o carrossel e anotar absorbância da leitura da cubeta Padrão;
 Após esse processo, desprezar o conteúdo das cubetas e lavá-las dez vezes
com água destilada para limpá-las, deverá sempre guarda-las limpas;

Cálculos

Ver linearidade.
Absorbância do teste
Proteínas (g/dL) = x Concentração
padrão
Absorbância do padrão
g/dl = g/dl
9. Calibração:
 Calibrações manuais: Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentes ou
quando o controle interno de qualidade indicar
 Sistemas automáticos: Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de sódio
150mmol/L (0,85%). Padrões: Usar calibradores proteicos. A concentração de glicose
no calibrador da linha Calibra- Labtest é rastreável ao SMR 917 do NIST
 Intervalo de calibrações: Calibração do branco ao usar novo frasco de reagente.
Calibração de 2 pontos ao mudar de lote. Calibração de 2 pontos quando o controle
interno de qualidade indicar
10. Linearidade:
O resultado da medição é linear até 500 mg/dL. Quando for obtido valor igual ou maior que
500 mg/dL, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L, realizar nova medição e multiplicar o
resultado obtido pelo fator de diluição. Sugerimos a verificação da linearidade metodológica
e fotométrica, no mínimo semestralmente utilizando amostra com valores até 500 mg/dL.

11. Sensibilidade:
Uma amostra proteica contendo 44 mg/dL de glicose foi utilizada para calcular o limite
de detecção do ensaio tendo sido encontrado um valor igual a 1,77 mg/dL, equivalente
à 3 vezes o desvio padrão das replicatas da amostra. Utilizando-se a absorbância do
padrão como parâmetro, o limite de detecção fotométrica é 0,28 mg/dL correspondendo
a uma absorbância igual a 0,001.

12. Controle de Qualidade:


 Interno: O laboratório deve manter um programa de controle interno da
qualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos, normas, critérios
para limites de tolerância, ações corretivas e registro das atividades. Materiais
de controle devem ser utilizados para monitorar a imprecisão da medição e
desvios da calibração. Sugere-se que as especificações para o coeficiente de
variação e erro total sejam baseadas nos componentes da Variação Biológica
(VB). Sugere-se utilizar os produtos da linha Qualitrol - Labtest para controle
interno da qualidade em ensaios de química clínica.
13. Interpretação:
Valores elevados de glicose ocorrem nos vários tipos de diabetes primárias, nos
estados de intolerância à glicose e nas diabetes secundárias à várias doenças
(hipertireoidismo, hiperpituitarismo, hiperadrenocorticismo, etc.). Valores diminuídos de
glicose ocorrem nas hipoglicemias que podem ser devidas a várias causas. Quando a
ocorrência de sintomas de hipoglicemia é relacionada à alimentação, duas formas de
hipoglicemia podem ser definidas: hipoglicemia do jejum e pós-prandial. As causas mais
comuns de hipoglicemia do jejum são: hiperinsulinismo endógeno (insulinoma e
sulfonilurea), hiperinsulinismo exógeno (factício), tumores extrapancreáticos, síndrome
autoimune (formação espontânea de anticorpos para receptores da insulina),
insuficiência suprarrenal e ou hipofisária, doença hepática grave e alcoolismo. A
hipoglicemia pós-prandial dependendo da história clínica e da resposta ao teste oral de
tolerância à glicose, é classificada em hipoglicemia alimentar, hipoglicemia do diabético
tipo II e do paciente com intolerância à glicose, hipoglicemia funcional ou reativa.

14. Critérios para liberação de resultados:

15. Resultado

Unidade de medida
mg/dL =
Conversão de mg/dL para unidade SI: mmol/L = mg/dL x 0,0556

Valores de referência
Plasma: (jejum de 8 horas):
70 a 99 mg/dL – Glicemia de jejum normal
100 a 125 mg/dL – Glicemia de jejum alterada
maior ou igual a 126 mg/dL – Provável Diabetes Mellitus
Líquor: 2/3 da glicemia quando a medição é realizada em amostras colhidas simultaneamente.

Valores críticos
Plasma:
>400 mg/dL
<40 mg/dL

16. Interferentes:
 Método de ponto final: Concentrações de bilirrubina até 2,5 mg/dL e hemoglobina até
200 mg/dL não produzem interferências significativas. Concentrações de bilirrubina
maiores que 2,5 mg/dL produzem interferências negativas. Concentrações de
triglicérides até 1000 mg/dL não produzem interferência significativa quando se utiliza
branco de amostra. Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em uma
amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo: diluir 0,05 mL da amostra em
2,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85 %) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm,
acertando o zero com água deionizada ou destilada.

Hemoglobina (mg/dL) Absorbância405 x 601


Hemoglobina (mg/dL) Absorbância415 x 467
 Branco da amostra: Este procedimento é aplicável quando houver ação positiva de
interferentes. Misturar 1,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85 %) com 0,01 mL da amostra.
Medir a absorbância em 505 nm, acertando o zero com água destilada ou deionizada.
Diminuir a absorbância assim obtida, da absorbância do teste e calcular a
concentração.

 Método cinético: Concentrações de bilirrubina até 2,5 mg/dL, hemoglobina até 200
mg/dL e triglicérides até 1000 mg/dL não produzem interferências significativas.

 Pacientes diabéticos em uso continuado de clorpropamida (Diabinese) podem


desenvolver hipoglicemias importantes que são muito difíceis de corrigir.
 Publicações demonstram que a urina pode conter numerosas substâncias que
interferem nos métodos que utilizam a reação GOD-POD.
 Várias drogas podem afetar o metabolismo da glicose, dentre elas encontram-se os
corticóides, tiazídicos e outros diuréticos.

17. Referências bibliográficas:


https://labtest.com.br/wp-
content/uploads/2016/09/Ref_133_Edi%C3%A7%C3%A3oDezembro2011_Ref050219_Port.pd
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18. Natureza das Alterações

Versão Natureza da Alteração


01 02/2014 - Revisão geral do documento

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