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UNIVERSIDADE DO MINHO

Laboratórios Integrados de Biologia

Microbiologia Alimentar
Análise Microbiológica

Guimarães, Maura, 53823


21-01-2010

Resumo:

Microbiologia Alimentar é uma das áreas científicas que mais se reflectem no dia-a-dia de um
consumidor. Intimamente ligada ao estudo da microbiologia geral, centra-se nos alimentos como meios de
cultura de diversos microrganismos. Por vezes este actuam como agentes patogénicos, outras, são cruciais
na produção alimentar. Tudo isto levou ao desenvolver de técnicas laboratoriais que permitam assegurar
uma alimentação segura ao consumidor comum, sendo estas, o centro do nosso estudo, com conclusões
interessantes. Para o efeito, analisaremos amostras de água, de derivados de carne, vinhos e mostos e
produtos lácteos.

Palavras-chave: Microbiologia Alimentar, Microrganismos, Patogenicidade.

1.Introdução

A microbiologia alimentar tem vindo a tornar-se numa das áreas científicas de maior relevo nas
sociedades actuais. Com a descoberta da existência de seres microscópicos e o consequente aparecimento
da microbiologia por volta do século XIX, veio também a noção dos alimentos como excelentes meios de
cultura.
Para além da patogenicidade associada a muitos destes microrganismos, existem outros, que hoje
em dia são muito utilizados em diferentes áreas da Biotecnologia: na produção de vacinas, antibióticos,
ácidos orgânicos (acético, láctico e cítrico), enzimas, aminoácidos (como a lisina ou o ácido glutâmico)
ou de alimentos por fermentação láctica (picles, azeitona, queijo, iogurte). [1]
O desenvolvimento microbiano em qualquer meio de cultura, especialmente alimentar, é
condicionado por diversos factores. Estes podem ser intrínsecos:
-a actividade de água (aw) é uma medição da disponibilidade hídrica, a razão entre a humidade relativa do
ar e uma amostra de controlo preparada com água destilada. Por exemplo, a adição de sal a uma solução,
tornando-a hipertónica, leva à desidratação de alguns microrganismos e inibe o seu crescimento;

Valor mínimo de
MICRORGANISMO
aw

Maioria de bactérias 0,91


Maioria de leveduras 0,88

Figura 1: valor mínimo de aw para diferentes microrganismos [2]

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-o pH, uma vez que os níveis ácidos de pH são favoráveis ao crescimento de leveduras e bolores,
enquanto, em valores mais básicos, ou neutros a decomposição é dominada pelas bactérias. A presença
destes agentes leva à proteólise e a quebra anaeróbica das proteínas – geralmente denominada putrefacção
– levando à libertação de compostos aminados;
-o potencial de oxi-redução influencia a decomposição, uma vez que os produtos cozinhados têm um
baixo potencial de oxi-redução;
-a composição nutricional de um alimento é uma condicionante do crescimento microbiano, uma vez que
cada microrganismo tem uma dieta muito característica, o que leva a que um alimento rico em proteínas
possa ter uma flora microbiana diferente de um alimento que seja rico em lípidos por exemplo. [3]
E extrínsecos como:
-a temperatura porque cada grupo de microrganismos tem a sua temperatura óptima de crescimento, isto é
a temperatura a que o seu crescimento é máximo; é nesta base que a temperatura se torna numa
condicionante no crescimento microbiano. Por exemplo, em temperaturas compreendidas entre os 55 e os
75οC o crescimento de microrganismos termófilos é favorecido, no que se refere ao intervalo dos 30 aos
45οC, os organismos mesófilos encontram a sua temperatura óptima de crescimento, a temperaturas entre
os 25 e 30οC podemos encontrar microrganismos psicotrófilos e entre os 12 e os 15οC será provável
encontrar os psicrófilos [4]; e
-a humidade relativa do ambiente, uma vez que os altos níveis de humidade favorecem o crescimento
microbiano de determinados microrganismos enquanto os baixos níveis favorecem outros.
Outro factor condicionante do crescimento microbiano é a capacidade “anti-microbiana” de alguns
alimentos. Esta capacidade é determinada pela presença de alguma substâncias, como enzimas e
complexos químicos inibidores, tais como as curaminas, a lisozima – que lisa as paredes celulares das
bactérias gram-positivas −, os compostos aldeídicos e fenólicos, a alicina, o eugenol, os polifenóis. [3]
Teremos 8 amostras, de quatro tipos de alimento, em análise: água, com uma amostra conhecida
e considerada potável e outra desconhecida, vinho, embalado em caixa de cartão “tetrapack” e
engarrafado, duas amostra de carne picada, que serão tratadas em circunstâncias diferentes e, por fim,
produtos lácteos, representados por um iogurte probiótico e por queijo fresco.
Cada amostra que será alvo das nossas experiências têm um “grupo-alvo” de microrganismos,
isto é um grupo de microrganismo que mais facilmente se encontra na sua análise pela afinidade
conseguida através da combinação dos factores anteriormente descritos.

1.1 Microrganismos possíveis de encontrar nos meios de cultura em estudo:

Alguns dos microrganismos passíveis de serem encontrados nas nossas amostras constam da
seguinte lista:

AMOSTRA
O'DE É
MICRORGA'ISMO DESCRIÇÃO E'CO'TRADO
Em forma de pequeno bastonete é uma
bactéria Gram-negativa, que tem uma
Campylobacter jejuni Derivados de carne
temperatura óptima de crescimento de cerca
de 42ºC.
Em forma de bacilo, é uma bactéria Gram-
positiva, anaeróbia facultativa, mesófila, com
Listeria um pH óptimo de crescimento entre o valor 6 Produtos de origem
monocytogenes e 8, resiste a valores elevados de salinidade, láctea
sobrevivendo à desidratação. É destruída com
pasteurização.

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AMOSTRA
MICRORGA'ISMO DESCRIÇÃO O'DE É
E'CO'TRADO
São bactérias Gram-negativas, em forma de
bastonete, anaeróbicas facultativas, tem um
intervalo de temperatura de crescimento
Vibrio muito grande (entre os 8 e os 44ºC, sendo o Água
ideal 37ºC), tendo preferência por meios
alcalinos, com pH de cerca de 9.0. nem todas
as suas estirpes são patogénicas.
É uma bactéria de pequenas dimensões em
forma de bastonete, Gram-negativas. Muitas
Yersinia enterolytica Derivados de carne
das estirpes produzem uma enterotoxima, a
baixas temperaturas (cerca de 5ºC)
É conhecida como o "bacilo da disenteria",
Shigella idêntica à Salmonella, produz gás através dos Água
hidratos de carbono.
São cocos, Gram-positivos, geralmente
dispostos em cachos, e anaeróbios
facultativos, mesófilos, sensíveis a altas
Staphylococcus Produtos de origem
temperaturas. Produz uma enterotoxina
aureus láctea
resistente a temperaturas de cerca de 100ºC
por um período de 30 minutos. O pH óptimo
ao seu crescimento é de cerca de 6.
Em forma de bacilo, é uma bactéria Gram-
negativa, anaeróbia facultativa, fermentadora
da glicose com produção de gás, com Produtos de origem
Salmonella temperatura óptima de crescimento de 37ºC, láctea; derivados de
sensível à pasteurização. A doença mais grave carne; água
provocada por este microrganismo é a febre
tifóide.

Figura 3: Alguns microrganismos passíveis de serem encontrados nas amostras em estudo [3, 8]

Figura 4: Da esquerda para a direita: 1. Escherichia coli, 2. Staphylococcus aureus, 3. Salmonella [5]

Com isto, veio a necessidade de desenvolver técnicas de eliminação desses seres enquanto
agentes patogénicos do processo de produção alimentar industrial, e a beneficiação do crescimento dos
seres cruciais a esse mesmo processo.
Estas técnicas são estudadas e realizadas a nível laboratorial, tendo em vista a conjugação de
técnicas laboratoriais gerais com técnicas laboratoriais de microbiologia. As conclusões retiradas

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dividem-se em dois tipos de análise: qualitativa, referente a nomeação de microrganismos específicos
encontrados, e quantitativa, contagem de número de colónias e cálculo da densidade celular inicial. [6]

1.2 Esterilização:

Para que todos estes métodos tenham resultados reais e satisfatórios é necessário reunir
condições de ambiente estéril, de modo a que as nossas amostras não sejam contaminadas com
microrganismos possivelmente encontrados no material laboratorial ou até mesmo no ar: as condições de
assepsia.
Estas condições podem ser asseguradas através de vários métodos, comuns a todas as práticas
laboratoriais de Microbiologia. Embora todos tenham o mesmo fim, em determinadas circunstâncias, uns
tornam-se mais viáveis ou aconselháveis. Assim, neste trabalho laboratorial, as condições de assepsia
foram garantidas através da Esterilização. Esta pode ser assegurada por agentes químicos ou físicos.
Usamos preferencialmente os físicos, como:
• o Autoclave − conduz à desnaturação de proteínas;
• a Flamejação − passagem do material a esterilizar por uma chama;
• a Filtração − utilização favorável quando estamos perante soluções com
compostos químicos termo-sensíveis, como as vitaminas; e,
• a Estufa de ar quente − atinge temperaturas de cerca de 180ºC, o que conduz
à oxidação e desnaturação de proteínas, destruindo células vegetativas e
esporos.
Estes conduzem à rápida destruição dos microrganismos, muitas vezes por desnaturação das proteínas. [7]

1.3 Homogeneização das amostras:

As amostras de alimentos, quer sejam líquidos, pastosos ou sólidos, têm de sofrer um processo
de homogeneização que permita o isolamento e contagem dos microrganismos existentes. Este processo
de homogeneização implica a passagem de qualquer amostra para uma fase líquida, na qual estão
contidos os microrganismos.
Quando estamos perante uma amostra sólida é necessário proceder à sua trituração, na presença
de um meio de diluição, sendo esta efectuada por um triturador eléctrico com pás giratórias. De modo a
garantir integridade da amostra, a rotação destas pás é muito específica – entre as 8000 e as 45000
rotações por minuto. Isto previne o excesso de calor libertado pelo movimento das pás que pode interferir
no bom mantimento da flora microbiana, e por outro lado, este movimento pode desintegrar estruturas
filamentosas como hifas dos fungos ou o pseudomicélio das leveduras, levando ao erro, por excesso, na
contagem de microrganismos presentes.
Este processo pode ser substituído por um mais suave que não assegura uma homogeneização
tão eficaz. Este processo resume-se à colocação da amostra num saco esterilizado na presença do agente
de diluição.
Também o agente de diluição escolhido é um ponto importante no estudo, por cada um pode
representar como agente tóxico para determinados microrganismos.

1.4 Incorporação de meio sólido:

É uma medida quantitativa directa do número de microrganismos capazes de se multiplicar num


determinado volume. Para a realização desta técnica é necessário, duas horas antes do início, preparar e
autoclavar o meio R2A*1, deixando-o termostatizado a uma temperatura de 45οC até a sua utilização; de
seguida, é necessária a agitação vigorosa para perfeita homogeneização. Posto isto, e em condições de
assepsia, introduz-se 1 mL da amostra numa placa de Petri vazia, previamente identificada, na qual é
adicionado 10 mL de meio R2A a 45οC. Seguidamente, procede-se a uma agitação horizontal cuidadosa,
em movimento rotacional, até à completa homogeneização do meio com a amostra, esperando a

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solidificação do meio. Em término, incubar em posição invertida e à temperatura ambiente de 2 a 3 dias.
[7]

1.5 Diluições decimais:

Permitem a contagem com maior rigor de colónias perfeitamente isoladas, em meio YEPD*2, a
partir de suspensões densas de microrganismos.
Inicialmente preparam-se 6 tubos de ensaio com 9 mL de água peptonada*3 que serão
esterilizados em autoclave durante cerca de 20 minutos a temperaturas na ordem dos 120ºC e a pressão de
1 atmosfera (≈101300Pa).
Seguidamente, preparar a suspensão densa da amostra a analisar num tubo com água peptonada –
suspensão-mãe*4, agitando no vórtex cerca de 5 segundos. Com uma pipeta esterilizada de 1 mL retirar,
em condições de assepsia, 1 mL da suspensão, introduzindo-a no primeiro tubo de diluição (10-1) que
contém 9 mL de água peptonada, homogeneizando a solução por vortexização, com uma nova pipeta
estéril retirar 1 mL dessa diluição para outro tubo também com 9 mL de água peptonada, obtendo-se
assim a diluição 10-2, assim sucessivamente até 10-6. [7]
Por fim, e com auxílio de um espalhador esterilizado em álcool e ao de leve passado na chama de
uma lamparina, inocular o meio até sentir uma resistência que indica que já ocorreu a absorção pelo meio.
– Inoculação por espalhamento em meio sólido. [6]

1.6. Filtração em membrana:

Previamente, é necessário proceder à esterilização da montagem de filtração, colocando-o de


seguida num kitassato, ligado a uma bomba de vácuo. Seguidamente, colocar uma membrana estéril entre
o funil e o suporte, agitar a amostra até completamente homogeneização. Introduzir o volume pretendido,
filtrando-o de seguida. O processo conclui-se com a retirada da membrana com auxílio de uma pinça
estéril, e colocando-a no meio de cultura desejado.
Esta etapa é seguida de um período de incubação.

1.7 Contagem de Unidades Formadoras de Colónias (UFCs):

A contagem de UFCs é feita através do número de colónias contadas com o auxílio de um


contador, ou das câmaras de contagem de Neubauer, e do índice de diluição. A título de exemplo,
consideremos que temos α número de colónias contadas, e que o nosso índice de diluição é 10-n. Num
volume de γ µL, temos α.10-n UFCs. Se quisermos fazer uma estimativa de número de UFCs por mL,
podemos fazer uma razão simples:

α.10-n_________ γ µL
UFCs/mL______________1000 µL

UFCs α . 10ି୬ x 1000 µL


=
mL γ µL

Aos resultados obtidos estão associados erros de pipetagem, de diluição e até mesmo de
contagem. As placas consideradas de menor erro associado são aquelas que apresentam uma média de 30
a 300 UFCs.

*1
– Meio de cultura para a enumeração de bactérias heterotróficos em águas, rico em peptona (proteose) (0.5g), extracto de levedura
(0.5g), casaminoácidos (0.5g), dextrose (0.5g), amido (0.5g), piruvato de sódio (0.3g), hidrogenofosfato de potássio (0.3g), sulfato
de magnésio (0.05g) e agar (15g). [6]
*2
– Meio de cultura para leveduras, rico em extracto de levedura (10g), peptona (2g), glicose (20g), agar (20g) – para meios de
cultura sólidos -, água 1 L. [7]
*3
- Água contendo peptona, 0,1 %, p/v. Este reagente é mais apropriado para a diluição de suspensões celulares, uma vez que não
exerce stress osmótico sobre as células, como se verifica para o caso da água. [6]
*4
- Suspensão inicial de alimentos. [6]
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2. Materiais e Métodos

O nosso estudo será faseado em quatro etapas, correspondentes aos quatro tipos amostras
diferentes.

2.1 Análise microbiológica da água:

2.1.1 Recolha de amostras de água para análise microbiológica:

Utilizando um frasco esterilizado de volume igual a 500 mL, realizar a recolha da amostra em
condições de assepsia; no caso de a amostra provir da torneira, deixar previamente a água correr durante
alguns minutos, depois fechar a torneira e desinfectá-la com algodão embebido em álcool, flamejando-a
de seguida. Encher o frasco esterilizado.
A amostra deve ser do mesmo dia da análise e em dias de calor deve ser transportada em sacos
térmicos, para evitar os efeitos da diferença de temperatura na flora microbiana. [6]

2.1.2 Contagem de microrganismos totais pela técnica de incorporação em meio sólido:

Seguir a descrição declarada anteriormente para a incorporação em meio sólido (1.4). Depois de
concluído o período de incubação, contar as colónias visíveis com acesso a um contador, calculando
seguidamente as UFCs por cada 100 mL de amostra (1.6). [6]

2.1.3 Pesquisa e quantificação de Escherichia coli e outras bactérias coliformes pela técnica de
filtração em membrana:

Iniciando o processo de filtração em membrana, é necessário proceder a todos os passos


descritos em 1.6. No caso da amostra da água de torneira, utilizaremos 100 mL, enquanto na amostra
desconhecida colocamos apenas 10 mL, e perfazemos os 100 mL com água destilada.
Após a retirada da membrana, colocá-la no meio de cultura CCA*5 numa caixa de Petri,
incubando-a em posição invertida por um período de 48 horas. [6]

2.2 Análise microbiológica de vinhos e de mostos:

O processo de produção de vinho é muito complexo e onde intervêm diferentes microrganismos,


encontrados sequencialmente.
O processo mais importante é a fermentação alcoólica, onde intervém activamente uma levedura:
a Saccharomyces cerevisiae, cuja concentração nas amostras cresce gradualmente durante o processo
acontecendo o seu exponencial nesta fase.
Mas a flora microbiana do vinho tem de ser devidamente controlada, uma vez que embora
existam microrganismos que ajudam e até mesmo indispensáveis a este processo, por outro lado, outros
podem destruir o produto, azedando-o. [6]

2.2.1 Preparação e diluição de amostras:

No que se refere às amostras de mosto ou de mosto em fermentação deve ser recolhida uma
amostra de cerca de 250 mL, já em relação ao vinho engarrafado deve se ter em conta uma garrafa,
independentemente do volume. Se a amostra for relativa a mostos concentrados, leveduras secas activas
ou outros produtos enológicos, a amostra deve ser de mais de 50g.

*5
- Meio de cultura utilizado para a identificação de bactérias coliformes. A ß-D-galactosidase é uma enzima específica destas
bactérias e hidrolisa um dos constituintes do meio. Este meio é constituído por peptona (3.0g), cloreto de sódio (5.0g),
dihidrogenofosfato de sódio (2.2g), hidrogenofosfato de sódio (2.7g), piruvato de sódio (1.0g), triptofana (1.0g), tergitol (0.15g),
sorbit (1.0g), mistura cromogénica (0.2g) e agar (12g). [6]

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Para realizar a diluição faz amostras, deve ser preparada uma séria de diluições decimais (1.5)
tendo em conta o tipo de amostra a analisar. Assim:
-para mostos não fermentados: efectuar 4 diluições decimais;
-para mosto em fermentação: efectuar sete diluições decimais;
-para vinhos não filtrados em período de envelhecimento:
−Contagem de leveduras: efectuar 2 diluições decimais;
−Contagem de bactérias lácticas: efectuar 6 diluições decimais;
-para vinhos filtrados ou acondicionados: sem diluição;
-para mostos concentrados: diluir 10 mL em 100 de água peptonada;
-os vinhos engarrafados ou filtrados, bem como os mostos diluídos são analisados pela técnica de
filtração em membrana (1.6). Neste caso, o volume de amostra será de 100 mL, e após o processo a
membrana será colocada no meio de cultura YEPD, incubando de seguida, em posição invertida, a 25ºC
durante 48 horas.
Por fim, contar UFCs (1.7). [6]

2.3 Análise microbiológica de derivados de carne:

A análise microbiológica da carne permite-nos identificar dois tipos de flora microbiana, aquela
que se aloja a superfície e aquela que é encontrada em profundidade. Esta última resulta da passagem
destes microrganismos pelo sistema linfático e sanguíneos dos animais em questão. Nesta secção do
trabalho será feita distinção de microrganismos, psicrófilos, mesófilos e termófilos segundo os parâmetros
de temperatura e período de incubação.

2.3.1 Preparação e diluição das amostras:

Utilizando salsichas frescas, pesar em condições de assepsia 10g, transferindo-as para um


homogeneizador (1.3), sendo o agente de diluição a água peptonada (90 mL) – suspensão-mãe.
Seguidamente, preparar uma série de diluições decimais (1.5)em tubos de Eppendorf, cada um
com 900 µL de água peptonada.
Para a contagem do número total de microrganismos, usar placas de meio PCA*6, dividindo cada
em 6 secções. Transferindo 5 µL cada diluição para cada secção – devidamente identificada – e esperar
que as gotas sejam absorvidas pelo meio. Incubar as 3 placas em posição invertida a três valores de
temperatura e períodos de tempo diferentes: 6ºC - 1 semana - 25 ºC - 5 dias - 37ºC - 3 dias.
Em simultâneo, inocular também uma placa de Petri contendo meio CCA para a análise de
Escherichia coli e outras bactérias coliformes (2.1.3). [6]

2.4 Análise microbiológica de produtos lácteos:

Nos produtos resultantes da fermentação do leite, como por exemplo os iogurtes, a presença de
microrganismos é imprescindível, são eles que realizam os processos fermentativos. Estes processos em
sim funcionam como um factor de conservação, uma vez que diminuindo o pH, diminui a contaminação
por bactérias patogénicas. Nestes compostos podemos encontrar microrganismos mesófilos e termófilos.

2.4.1 Preparação de amostras:

• Requeijão:

Em condições de assepsia, pesar 10g de requeijão, transferindo-os para um homogeneizador (1.3), sendo o
agente de diluição a água peptonada (90 mL) – suspensão mãe.

*6
- Meio de cultura utilizado para a enumeração de microrganismos heterotróficos. A sua composição é dada por peptona de caseína
(5.0g), extracto de levedura (2.5g), glicose (1.0g) e agar (14.0g). [6]
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• Iogurte:

A suspensão-mãe será feita através da homogeneização da amostra de iogurte com o apoio de uma pipeta
estéril. Assim, pipetam-se 20 mL da amostra inicial para um balão de Erlenmayer adicionando 90 mL de água
peptonada. [6]

2.4.2 Diluição de amostras:

O procedimento será equivalente em amas as amostras. Preparam-se uma série de diluições


decimais, usando tubos de Eppendorf previamente enchidos com 900 µL de água peptonada. De modo a
determinar o número total de microrganismos é necessário utilizar um meio de cultura PCA, dividindo-a
em 6 secções. Em cada secção colocar 5µL de cada diluição, esperando até que sejam absorvidas pelo
meio. De seguida, incubar por um período de 3 dias, em posição invertida a 25ºC. Em simultâneo,
inocular também uma caixa de Petri com meio de cultura CCA para a análise de bactérias coliformes
como a Escherichia coli (2.1.6). [6]

3. Resultados

3.1 Análise microbiológica da água:

Detecção de E.coli e outras bactérias


Contagem total
coliformes

UFCs: outras
UFCs: E.coli bactérias coliformes
Tipo de amostra Temperatura UFCs
(azuis) / 100 mL (vermelhas) /
100 mL
4 0 0
22ºC 8 0 0
Torneira 1 0 0
(amostra 1) 1 0 0
37ºC 0 0 0
0 0 0
cerca de 1000 > 300 > 300
22ºC > 300 > 2000 > 2000
Desconhecida 62 > 1000 > 1000
(amostra 2) > 300 0 0
37ºC > 300 > 300 > 300
> 700 > 300 > 300

Figura 5: Resultados experimentais dos três turnos na análise microbiológica da água – turno 1; turno2; turno3.

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3.2. Análise microbiológica de vinhos e mostos:

Números de leveduras / 700 mL


Tipo de amostra
(1 garrafa)
21 leveduras
6 fungos; 133 bactérias
Vinho engarrafado 0
(amostra 3) 14 fungos
490
840
21 fungos; 21 bactérias
0
Vinho "tetrapack" 0
(amostra 4) 14 leveduras
fungo não quantificável
fungo não quantificável

Figura 6: Resultados experimentais dos três turnos na análise microbiológica de vinhos e mostos – turno 1; turno2;
turno3.

3.3. Análise microbiológica de derivados de carne:

Meio
Temperatura Temperatura Temperatura
de UFCs / g UFCs / g UFCs / g
(ºC) (ºC) (ºC)
cultura
6 6 x 107 25 2,2 x 105 37 -
5 5
6 6 x 10 25 1,2 x 10 37 2 x 104
6 2,6 x 108 25 1 x 107 37 4 x 1010
6 1,2 x 105 25 1,44 x 104 37 6 x 103
6 3,2 x 107 25 6,1 x 108 37 5,7 x 106
6 3,4 x 108 25 3,7 x 109 37 3,5 x 108
PCA
6 2,1 x 109 25 1,6 x 108 37 2,5 x 107
6 4 x 108 25 7 x 108 37 6 x 108
6 1,8 x 109 25 6 x 108 37 1,8 x 108
6 3,2 x 1011 25 5 x 1010 37 5 x 109
6 2 x 1010 25 3,4 x 1010 37 3,2 x 1010
6 6 x 108 25 1,6 x 109 37 2 x 108

Figura 7.1: Resultados experimentais dos três turnos na análise microbiológica de derivados de carne em meio PCA
turno 1; turno2; turno3.

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Meio
Temperatura
de UFCs / g
(ºC)
cultura
37 -
37 -
37
37
37 -
37 -
CCA
37 -
37
37 E.coli: 1,4 x 106; coliformes: 1,8 x 107
37 E.coli: 2 x 105; coliformes: 1 x 106
37 E.coli: 1,2 x 106; coliformes: 2 x 109
37 E.coli: 6 x 106; coliformes: 4 x 107

Figura 7.2: Resultados experimentais dos três turnos na análise microbiológica de derivados de carne em meio CCA
turno 1; turno2; turno3

3.4 Análise microbiológica de produtos lácteos:

Meio de Temperatura Meio de Temperatura


Tipo de amostra UFCs /g UFCs /g
cultura (ºC) cultura (ºC)
22 8x103 37
6
22 4,2x10 37
5
Queijo Fresco 22 5,3x10 37 E. coli =0; b. coliformes =2,2x105
(amostra 5) 37 3,4x105 37
8
22 1.8x10 37 1,0x107
22 4x109 37
PCA CCA
22 37
22 37
7
Iogurte 22 2,0x10 37 0
(amostra 6) 6
37 4,0x10 37 0
9
22 2x10 37
22 3,8x105 37

Figura 8: Resultados experimentais dos três turnos na análise microbiológica de produtos lácteos em meio CCA e
PCA – turno 1; turno2; turno3.

4. Discussão de Resultados

4.1 Análise microbiológica da água:

A água considerada própria para consumo não deverá apresentar mais de 100 UFCs por cada
mililitro a uma temperatura de incubação de 22 ºC, e de 20 UFCs por mililitro a uma temperatura de

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incubação de 37ºC [6], facto que é confirmado pelos dados dos três turnos. Assim, por este parâmetro
conclui-se que a água da torneira é própria para consumo.
Outro parâmetro foi muito importante na análise da qualidade da água foi estudado: a presença
de bactérias coliformes, e especificamente a Escherichia coli. Este parâmetro foi estudado através do
meio de cultura CCA, constituído por uma mistura cromogénica (*5). Esta mistura tem, entre outros
constituintes, a enzima ß-D-galactosidase, específica das bactérias coliformes, que hidrolisa o composto
“Salmon-GAL” e no caso da E.coli, hidrolisa também o composto “X-glucuronide”. Desta hidrólise
resulta um composto corado vermelho, no caso das bactérias coliformes, e no caso específico da E.coli
um composto azul, resultante das duas hidrólises. [6] Nos três turnos, tanto o resultados das bactérias
coliformes como da E.coli em particular deram nulo, o que reforça a conclusão dos primeiros resultados:
a amostra 1 é mesmo própria para consumo.
No caso da amostra desconhecida outro resultados foram obtidos.
Como é descrito 2.1.3, no caso desta amostra, só retiramos 10 mL que perfizemos até aos 100
mL com água destilada. Isto deve-se ao facto de, sendo uma amostra desconhecida, não sabemos o seu
grau de contaminação bacteriano. Usando um volume muito grande de amostra, correríamos o risco de a
placa de Petri ficar com tantas UFCs que se tornariam indistinguíveis, e consequentemente seria
impossível contá-las.
No que se refere a resultados propriamente ditos, temos que o valor de UFCs, nos três turnos e
para as duas temperaturas de incubação é muito mais elevado do que o aconselhado em água para
consumo. No entanto, e tal como descrito em 1.7, as placas têm um grande erro estatístico associado –
não pertencentes ao intervalo 30-300 UFCs, provavelmente proveniente de erros acumulados nas
pipetagem, diluições e/ou contagens. No que se refere ao estudo da presença de bactérias coliformes
temos que os valores obtidos são muito elevados, sublinhado a conclusão da impropriedade desta água
para consumo. A presença deste tipo de bactérias indica a contaminação da água por dejectos humanos
e/ou animais, visto serem constituintes da flora intestinal. [6]

4.2 Análise microbiológica de vinhos e mostos:

A presença de leveduras no produto vinícola final deve ser reduzida, de forma a garantir a
estabilidade microbiológica do mesmo. Apesar de não existir um limite legislado, e as empresas se
cingirem ao seu próprio limite, por convenção considera-se que 10 leveduras / garrafa garante a qualidade
do produto. [6] Assim, segundo os resultados do turno 1 no que se refere ao vinho engarrafado, e do
turno 2 em relação ao vinho “tetrapack” temos que apesar de terem um número relativamente reduzido de
leveduras, este ultrapassa o convencionado. No caso dos resultados do turno 3 sobre o vinho engarrafado,
estes são demasiadamente elevados. Isto pode ser justificável com erros de diluições, de contagem ou
outros associados aos métodos laboratoriais, pode ser consequência de uma alta rotação do
homogeneizador que levou à ruptura do pseudomicélio das leveduras (1.3); outra justificação possível é o
excesso de açúcar contido em alguns vinhos, que serve de “alimento” as leveduras – que realizam a
fermentação alcoólica – levando ao crescimento da população. No entanto, este crescimento teria de ser
exponencial para justificar os resultados obtidos.
A presença de fungos e bactérias nas amostras justifica-se com o facto do meio YEPD ser
favorável ao crescimento destes microrganismos. Estes provêm da contaminação das amostras pelos
esporos existentes no ar e pelos erros de esterilização e das condições de assepsia, o que levou à sua
proliferação.
O facto de existirem resultados nulos é impossível, uma vez que é inviável o desaparecimento
das leveduras no fim do processo de produção vinícola, apesar da centrifugação e pasteurização a cerca de
80 ºC que se realiza no fim do processo. Estes resultados são então justificáveis com erros crassos na
manipulação laboratorial das amostras.

4.3 Análise microbiológica de derivados de carne:

Neste ponto, e com meio de cultura PCA, lidaremos com três valores de temperatura de
incubação diferentes. Como foi referido anteriormente, a temperatura funciona como um factor

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condicionante da actividade microbiana, uma vez que diferentes organismos podem ter diferentes
temperaturas óptimas. Considerando a temperatura de 6ºC, as UFCs contabilizadas são referentes a
microrganismos psicrófilos, que encontram nesta temperatura a sua temperatura óptima de crescimento.
As diferenças de valores entre os turnos estarão relacionadas com erros sistemáticos, já nas outras etapas
referenciados, como de pipetagem, e até mesmo de contagem. Quando analisamos os resultados a
temperatura igual a 25ºC, observamos um aumento significativo nos resultados do turno 2 e 3. Apesar de
este intervalo ser favorável ao crescimento de microrganismos psicotrófilos, não sendo totalmente
desfavorável aos psicrófilos. É possível podermos encontrar já organismos mesófilos; assim, os valores
apresentados de UFCs acabam por ser um reflexo do crescimento destes dois tipos de microrganismos, e
do decréscimo gradual dos psicrófilos. No caso dos resultados do turno 1, o decréscimo apresentado não é
muito justificável, sendo possível estar associado a erros de manipulação laboratorial. Analisando os
resultados obtidos a temperaturas de 37ºC, temos um decréscimo de UFCs comparativamente aos 25ºC.
Este facto, conclusão dos resultados do turno 2 e 3, está relacionado como facto desta temperatura ser
completamente incompatível com o crescimento de microrganismos psicrófilos, não ser a temperatura
óptima dos psicotrófilos, e ainda serem escassos os organismos termófilos encontrados. Assim, o valor
obtido de UFCs está relacionado directamente com o número de organismos mesófilos e com o gradual
aparecimento de microrganismos termófilos.
Numa segunda fase da análise da carne picada, temos a cultura em meio CCA, que nos permite a
identificação de bactérias coliformes com a E.coli. esta fase foi realizada a uma temperatura de incubação
igual a 37ºC, e só tendo os resultados do turno 3, conclui-se que existe uma grande quantidade de UFCs
de bactérias coliformes, e especificamente de E.coli. a diferenciação foi feita através da coloração, tal
como foi explicada em 4.1.
É de realçar que a foi utilizada a “técnica de gotas” substituindo-se a técnica de espalhamento em
placa que exigia muitas placas de Petri. Em estudos de controlo alimentar a técnica de gotas é
automaticamente excluída dos protocolos experimentais visto não apresentar o rigor necessário. No caso
da análise de microrganismos em alimentos devem ser seguidas as normas legisladas,, que determinam
técnicas e meios de cultura mais adequados. [6]

4.4 Análise microbiológica de produtos lácteos:

Por fim, nesta análise, foram tidos em conta dois meios de cultura diferentes, PCA e CCA, e no
caso do PCA, duas temperaturas diferentes. No caso do meio PCA, e em relação à análise do queijo
fresco, a diferença de valores dos turnos não é significativa, uma vez que traduzem todos a mesma
conclusão à excepção do primeiro resultado do turno 1. Ignorando este por ser discrepante com os outros,
tem-se que o menor valor observado de UFCs é feito à temperatura de 37ºC o que indicia que esta não
pertença ao intervalo de temperatura óptima para os microrganismos encontrados na amostra. A mesma
reflexão é feita quando se observa os dois resultados referentes ao iogurte.
No caso do meio de cultura CCA, e no caso do queijo fresco, só o turno 2 obteve resultados, que
indicam a presença de bactérias coliformes, mas excluem a presença de Escherichia coli. Esta presença é
nula na amostra de iogurte segundo os resultados obtidos. A presença de bactérias no queijo fresco era
esperada uma vez que é um produto cuja produção é feita à base do recurso a microrganismos.

5. Bibliografia

[1]http://biomedicinacomangelica.blogspot.com/2009/06/biomedicina-e-microbiologia-alimentar.html

[2] Schuller, D. (1998), Desenvolvimento de um meio de cultura selectiva/diferencial para a levedura de


contaminação alimentar – Zygosaccharomyces bailii, http://repositorium.sdum.uminho.pt/, Departamento
de Biologia, Universidade do Minho, Braga − pág. 4.

[3]http://www.segurancalimentar.com/conteudos.php?id=23

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[4] Valsechi, O. (2006), Microbiologia dos Alimentos, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de
Tecnologia Agro-Industrial e Socioeconomia Rural, Araras, São Paulo – pág. 7.

[5]http://www.medioscultivo.com/por/microbiologia-de-alimentos.htm

[6] Schuller, D.(2009), Guia de Laboratório – Laboratórios Integrados de Biologia, Universidade do


Minho, Departamento de Biologia, Braga − pág. 53-54, 57-59, 62-63, 80-91.

[7] Casal, M., Schuller, D., Rodrigues, G., Pais, C., Unidade I - Métodos Convencionais em
Microbiologia, http://repositorium.sdum.uminho.pt/, Departamento de Biologia, Universidade do Minho,
Braga − pág. 6-8, 15, 28-20.

[8] Fernandes, A., (2007), Estimativa da Flora Microbiana e Potenciais Patogénicos em fórmulas
alimentares para lactentes, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa, Lisboa − pág.45-46.

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