ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO DE

FLAVONÓIDES E ESTABILIDADE DE
PIGMENTOS DE FRUTOS DE BERTALHA
(Basella rubra L.)

Doutoranda: Eliana Ferreira Ozela

Orientador: Paulo César Stringheta
 DESCRIÇÃO BOTÂNICA

Bertalha, bretalha, joão-gomes e couve

de cerca;

Família: Basellaceas;

Espécie: Basella rubra L.

 OBJETIVO
Isolar e caracterizar flavonóides
utilizando CLAE, RMN,
espectrofometria UV-Vis e reações
químicas;

Estudar a estabilidade dos pigmentos

frente a luz, pH e temperatura.
 INTRODUÇÃO
Definição: Corante
Função:
Restabelecer e compensar a coloração
original de produtos;
Uniformizar a cor do alimento;
Conferir cor a produtos incolores.
 ANTOCIANINAS
Compostos R R’
Cianidina OH H
Delfinidina OH OH
Malvidina OCH3 OCH3
Pelargonidina H H
Peonidina OCH3 H
Petunidina OCH3 OH

Figura 1: Estrutura básica das antocianinas (HARBONE, 1967).

 É o maior grupo de pigmentos naturais hidrossolúveis

largamente distribuído na natureza em flores, frutos,
folhas;
 São classificadas como flavonóides responsáveis pelas
colorações: vermelha, púrpura e azul;
 Quimicamente pode ser definida como glicosídeos de
antocianidinas.
 São dependentes de pH, temperatura e luz.
 TRANSFORMAÇÕES ESTRUTURAIS
DAS ANTOCIANINAS
A AH+
R R
OH OH
+
O HO O
O
R R
- H+

OGl OGl
OH OH
+ H2O
R R
- H+
OH OH

OH O OH
HO HO O
R R

OGl OGl
OH OH

C B

Figura 2: Transformações estruturais das antocianinas existentes em uma solução em equilíbrio (FRANCIS, 1992).
MATERIAL E MÉTODOS

Figura 3: Frutos de bertalha.

EXTRAÇÃO DO PIGMENTO

Figura 4: Extração do corante de bertalha.

IDENTIFICAÇÃO, RENDIMENTO E
ISOLAMENTO DAS FRAÇÕES

 Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE);

 SHIMADZU - Modelo SPD-10AV;
 Injetor - Loop 20 L;
 Detector UV/Vis= 275 nm;
 Coluna= RP-18 Phenomenex-Luna (2,5x4,6 nm; 5 m);
 Pré coluna Phenomex;
 Fase móvel: Acetonitrila:Água + 1% ácido fórmico (1:9);
 Fluxo:1 mL/min;
 Sistema isocrático;
 Tempo: 30 min.
 RECONHECIMENTO DAS
ANTOCIANINAS
1mg do extrato bruto + 10 ml metanol-HCL 0,01%;

1mg da F5 + 10 ml metanol-HCL 0,01%;

1mg da F 6 + 10 ml metanol-HCL 0,01%;

Espectro de absorção UV-Vis 220 a 650 nm

Espectrofotômetro SHIMADZU
 CARÁTER ÁCIDO-BASE

 Solução pH 1,0; 3,0; 6,0 e 9,0

 NaOH e HCL

 1mg da F5 e F 6

 Repouso 1 hora

 Espectro de absorção UV-Vis 220 a 650 nm

 DETERMINAÇÃO DO Rf
 Fase estacionária:
 Papel Whatmam n° 1;

 Fase móvel:
 Fórmico: Ac.fórmico: HCl:água ( 5:2:3);
BAW: Butanol: Ác. Acético: água (4: 1:5);
Forestal: Ác. Acético: HCl: água (30:3:10);
ESTABILIDADE
 ESTABILIDADE
 Efeito do pH;

 Efeito da luz;

 Efeito da temperatura;

 Cálculos:

absorvância (t ) 0,693
k ln t½=
absorvância (t ) K
ESTABILIDADE DAS FRAÇÕES
PURIFICADAS
2,0 mg balão volumétrico de 20 mL;
Acetonitrila:Água + ácido fórmico 1% (1:9);
0,05% sorbato de potássio;
2 mL 12 frascos 5 mL;
Leitura 12 em 12 horas;
CLAE analítico.
RESULTADOS E
DISCUSSÕES
 ISOLAMENTO E
CARACTERIZAÇÃO DOS
FLAVONÓIDES
Figura 5 – Perfil cromatográfico obtido por CLAE do extrato bruto de bertalha a 275 nm.
 8.818
20

10

0 5 10 15 20

mAbs

20

10
12.604

0 5 10 15 20
min

Figura 6 - Perfis cromatográficos obtido por CLAE das frações F5 e F6 a 275 nm.
 OR1
5'
6' OR2
4' OH
8 +
HO 9 O 2 2'''
1' 3' 3''' 4'''
7 2' OR3 HO
O
3
6 1''' OH 5'''
10 OH 4"
5 4 2" CH3
HO O 6'''
OH O
3"
6" OH
O 1" 5"

Figura 7 – Espectro de RMN de 1H a 300 MHz da F5 em solvente D2O:TFA (9:1).

 EB F5 F6

Figura 8 - Espectros de absorção UV-Vis do extrato bruto e das frações purificadas F5 e F6.
 pH 1,0 pH 3,0 pH 6,0 pH 9,0

Figura 9 - Espectro de absorção UV/Vis da antocianina da fração F5 a pH 1,0; 3,0;

6,0 e 9,0, apresentando comportamento ácido-base.
 Tabela 1 – Características cromatográficas para antocianidinas (HARBORNE, 1967)

Antocianidinas Rf% BAW Rf% Forestal Rf% Fórmico

Cianidina 68 49 22
Delfinidina 42 32 13
Malvidina 58 60 27
Pelargonidina 80 68 33
Peonidina 71 63 30
Petunidina 52 46 20

Tabela 2 – Características espectrais do extrato bruto, das frações 5 e 6, da malvidina

e cianidina (*HARBORNE, 1967 e **CONSTANT, 2003)
Característica max. max. Rf % Rf % Rf% Fluorescência
Vis (nm) UV (nm) BAW Forestal Fórmico
F5 540 276 58 58 28 Negativo
F6 533 285 64 49 21 Negativo
Extrato bruto 540 275 Negativo
Cianidina-3-GR** 530 282 Negativo
Malvidina* 543 278 58 60 27 Negativo
Cianidina* 535 277 68 49 22 Negativo
 OR1
5'
6' OR2
4' OH
8 +
HO 9 O 2 2'''
1' 3' 3''' 4'''
7 2' OR3 HO
O
3
6 1''' OH 5'''
10 OH 4"
5 4 2" CH3
HO O 6'''
OH O
3"
6" OH
R1, R2 e R3 = H ou Me O 1" 5"

Figura 10 – Estrutura química sugerida para F5 .

 5'
6' OR
4' OH
8 + 2'''
RO 9 O 2
1' 3'
3''' 4'''
7 2' OR HO
O OH
3 5'''
6 1'''
10 OH
RO 5 4 2'' 3'' 4'' CH3
HO O 6'''
O
6'' OR
O 1'' 5''

Figura 11 - Espectro de RMN de 1H a 300 MHz da F6 em solvente D2O:TFA (9:1).

 5'
6' OR
4' OH
8 + 2'''
RO 9 O 2
1' 3'
3''' 4'''
7 2' OR HO
O OH
3 5'''
6 1'''
10 OH
RO 5 4 2'' 3'' 4'' CH3
HO O 6'''
O
6'' OR
O 1'' 5''

Figura 12 – HSQC da F6 em solvente D2O:TFA (9:1)

 5'
6' OR
4' OH
8 + 2'''
RO 9 O 2
1' 3'
3''' 4'''
7 2' OR HO
O OH
3 5'''
6 1'''
10 OH
RO 5 4 2'' 3'' 4'' CH3
HO O 6'''
O
6'' OR
O 1'' 5''

Figura 13 – Expansão dos espectros de RMN de 13C a 100 MHz da F6 em solvente

D2O:TFA (1:9).
 pH 1,0 pH 3,0 pH 6,0 pH 9,0

Figura 14 - Espectro de absorção UV/Vis da antocianina da fração F6 a pH 1,0;

3,0; 6,0 e 9,0, apresentando comportamento ácido-base.
 Tabela 1 – Características cromatográficas para antocianidinas (HARBORNE, 1967)

Antocianidinas Rf% BAW Rf% Forestal Rf% Fórmico

Cianidina 68 49 22
Delfinidina 42 32 13
Malvidina 58 60 27
Pelargonidina 80 68 33
Peonidina 71 63 30
Petunidina 52 46 20

Tabela 2 – Características espectrais do extrato bruto, das frações 5 e 6, da malvidina

e cianidina (*HARBORNE, 1967 e **CONSTANT, 2003)
Característica max. max. Rf % Rf % Rf% Fluorescência
Vis (nm) UV (nm) BAW Forestal Fórmico
F5 540 276 58 58 28 Negativo
F6 533 285 64 49 21 Negativo
Extrato bruto 540 275 Negativo
Cianidina-3-GR** 530 282 Negativo
Malvidina* 543 278 58 60 27 Negativo
Cianidina* 535 277 68 49 22 Negativo
Aglicona 13C 1H

2 161,2*No
3 140,4
4 132,6
5 119,6 6,47
6 *NO

7 *NO

8 112,0 6,85
9 158,7*NO
10 111,4*NO
1’ 118,7*NO
2’ 116,6 6,70 – 7,40
3’ 147,7*NO
4’ 155,9
5’ 116,4 6,70 – 7,40
6’ 129,3 6,70 – 7,40
Açúcar A
1’’ 101,2 5,11 (d)
2’’ 73,8 3,10 – 4,00
3’’ 75,1
4’’ 68,1
5’’ 75,8
6’’ 60,2
Açúcar B
1’’’ 99,1 4,73 (s)
2’’’ 71,5 3,30 – 4,03
3’’’ 71,5
4’’’ 72,5
5’’’ 69,0
6’’’ 19,7 1,23 (d, J=6,6)
OAc
C=O 170,3
CH3 20,5 2,21 (s)
*Valores não observados e assinalados com base em ALBACH et al., (2000) e CONSTANT (2003).
 5'
6' OR
4' OH
8 + 2'''
RO 9 O 2
1' 3'
3''' 4'''
7 2' OR HO
O OH
3 5'''
6 1'''
10 OH
RO 5 4 2'' 3'' 4'' CH3
HO O 6'''
O
6'' OR
R= H ou Ac O 1'' 5''

Figura 15 – Estrutura química sugerida para a substância F6.

 OH
4''' 6''' OH
HO
3'' 5'''
2''' O
5'
OH 1''' 6' OH
4'
8
HO 9 O 2
1' 3'
7 2'
HO 5'' 1'' 4 3
6'' 6 10
O 5
HO
OH O
4'' HO 3'' 2''

Figura 16 – Espectro de RMN de 1H a 300 MHz em solvente CD3OD da F7.

 OH
4''' 6''' OH
HO
3'' 5'''
2''' O
5'
OH 1''' 6' OH
4'
8
HO 9 O 2
1' 3'
7 2'
HO 5'' 1'' 4 3
6'' 6 10
O 5
HO
OH O
4'' HO 3'' 2''

Figura 17 – Expansão dos espetros de RMN de 13C a 100 MHz em solvente CD3OD da F7.
 OH
4''' 6''' OH
HO
3'' 5'''
2''' O
5'
OH 1''' 6' OH
4'
8
HO 9 O 2
1' 3'
7 2'
HO 5'' 1'' 4 3
6'' 6 10
O 5
HO
OH O
4'' HO 3'' 2''

Figura 18 – Espectro de DEPT em CD3OD da F7.

Aglicona 13C 1H

2 162,8
3 109,9 6,62 (s)
4 183,9
5 103,4 7,89 (s)
6 *NO

7 162,7*NO
8 104,7
9 146,2
10 123,7
1’ 121,8*NO
2’ 130,1 8,01 (d, J=8,4 Hz)
3’ 117,0 6,93 (d, J=8,1 Hz)
4’ 159,9
5’ 117,0 6,93 (d, J=8,1 Hz)
6’ 130,1 8,01 d, J=8,4 Hz)
Açúcar A
1’’ 78,8 3,10 a 4,00
2’’ 72,3 3,10 a 4,00
3’’ 77,6 3,10 a 4,00
4’’ 73,9 3,10 a 4,00
5’’ 82,8 3,10 a 4,00
6’’ 61,2 3,10 a 4,00
Açúcar B
1’’’ 79,2 3,10 a 4,00
2’’’ 72,3 3,10 a 4,00
3’’’ 77,5 3,10 a 4,00
4’’’ 73,9 3,10 a 4,00
5’’’ 83,0 3,10 a 4,00
6’’’ 63,1 3,10 a 4,00
*Valores não observados e assinalados com base em SILVA, (2000).
 OH
4''' 6''' OH
HO
3'' 5'''
2''' O
5'
OH 1''' 6' OH
4'
8
HO 9 O 2
1' 3'
7 2'
HO 5'' 1'' 4 3
6'' 6 10
O 5
HO
OH O
4'' HO 3'' 2''

Figura 19 – Estrutura da 7,4’ –diihidróxi- 6,8, - glucopiranosil-flavona

sugerida para a fração 7.
 Rendimento das Frações 5 e 6

4
3,5 3,0541
3
Rendimento (%)

2,5 2,1154
2
1,5
1
0,5
0
Fração 5 5
FRAÇÃO Fração 6 6
FRAÇÃO

Figura 20 – Rendimento das frações 5 e 6 isoladas a partir do extrato bruto de

bertalha, por CLAE.
AVALIAÇÃO DA
ESTABILIDADE
 Tempo (hora)
0,00
0 100 200 300 400 500 600 700
Figura 21 – Curvas de degradação
-0,50
de extratos de bertalha ao longo
do tempo, em sistemas tampões
-1,00 (pH 4,0; 5,0 e 6,0), na presença de
Ln (A/Ao)

luz, à temperatura ambiente

(25°±1°C).
-1,50

-2,00
SISTEMA
pH 4,0 pH 5,0
pH
pH 6,0
k (h-1) R2 t1/2 (h)
LUZ 4,0 0,0033 0,9565 151,52
-2,50
5,0 0,0022 0,9846 227,27
6,0 0,0022 0,9871 227,27
ESCURO 4,0 0,0012 Tempo0,9316
(horas) 416,67
5,0 0
0,0010 0,9659 500,00
6,0 -0,2 0 0,0010
200 400 600
0,9272800 1000
500,00
1200 1400

-0,4
-0,6
Ln (A/Ao)

-0,8
-1
-1,2
-1,4
-1,6
-1,8 pH 4,0 pH 5,0 pH 6,0

-2
 Tempo (hora)
0,00

-0,200,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00

Figura 23 – Curvas de degradação
-0,40
de extratos de bertalha ao longo do
-0,60 tempo, em sistemas tampões (pH
4,0, 5,0 e 6,0), na presença de luz, à
Ln (A/Ao)

-0,80
temperatura de 40ºC.
-1,00

-1,20

-1,40 SISTEMA pH k (h-1) R2 t1/2 (h)

-1,60 40 ºCpH 4,0 pH 5,0 pH 6,0 4,0 0,1152 0,9684 4,34
-1,80 5,0 0,0928 0,9389 5,39
6,0 0,0964 0,9758 5,19
Tempo (hora)
60 ºC 4,0 0,00 0,3324 0,9645 1,50
5,0 0,2766 2,00 0,94453,00 4,00 1,81
6,0 -0,200,00 0,2559
1,00
0,9527 1,95
5,00

-0,40
-0,60
Figura 24 – Curvas de degradação
Ln (A/Ao)

-0,80
de extratos de bertalha ao longo do
tempo, em sistemas tampões (pH -1,00
4,0, 5,0 e 6,0), na presença de luz, à -1,20
temperatura de 60ºC. -1,40

-1,60 pH 4,0 pH 5,0 pH 6,0

-1,80
 TEMPO (hora)
0,50
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0,00

-0,50
Ln (A/Ao)

-1,00

-1,50

-2,00
FRAÇÃO 6 FRAÇÃO 5
-2,50

Figura 25 – Curvas de degradação das frações 5 e 6 extraídas dos frutos de

bertalha, em acetronitrila: solução aquosa de ácido fórmico 1,0% (1:9), na
presença de luz, à temperatura de 25ºC por CLAE.

Sistema k (h-1) R2 t1/2 (h)

Fração 5 1,36x0-2 0,8631 36,76
Fração 6 1,70x10-2 0,8328 29,41
CONCLUSÕES
 A técnica da CLAE foi um excelente método utilizado
no isolamento e rendimento das frações;

 A associação dos métodos espectrofotométricos,

cromatográficos e a RMN permitiram a caracterização
dos flavonóides presentes no fruto de bertalha;

 O extrato sofreu interferência da luz, do pH e da

temperatura;

 O extrato de bertalha pode ser empregado como

corante natural.
Agradecimentos
Ao orientador Prof. Paulo Cesar Stringheta,

Aos conselheiros José Carlos Gomes e Mara Silvia

Pinheiro Arruda;

As Profas Helena Maria Pinheiro Sant’ana e Tânia

Toledo de Oliveira,

À CEPLAC;

A Milton Nascimento da Silva;

A Marcelo Lobato Fonseca;

Aos amigos de curso;

A Sebastião Geraldo Augusto.

UFV

UFPA