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CINÉTICA ENZIMÁTICA

O modelo de Michaelis-Menten é útil para explicar a cinética das reações catalisadas por enzimas.

Aqui, serão mostradas as etapas necessárias para se chegar à equação de Michaelis-Menten e para ver como são determinadas as constantes cinéticas de uma enzima.

Tente responder as perguntas que aparecem em vermelho antes de continuar com o estudo.

O modelo de Michaelis-Menten considera que uma reação enzimática ocorre em dois passos:

ETAPA 1. Ligação de um substrato (S) a uma enzima (E), formando um complexo intermediário (ES)

Etapa 1 k 1 k 3 E + S ES E + P k 2
Etapa 1
k 1
k 3
E
+
S
ES
E +
P
k 2
k 4

Etapa 2

ETAPA 2. Formação do produto (P) a partir do complexo ES, com recuperação da forma livre da enzima (E)

A reação do slide anterior está representada no equilíbrio:

E

+

S

k 1 k 2
k 1
k 2

ES

k 3 k 4
k 3
k 4

E +

P

onde k 1 , k 2 , k 3 e k 4 são as constantes de velocidade de cada etapa.

Nesse caso, a da reação (V), ou seja, a velocidade de formação do produto será:

V = k 3 [ES] – k 4 [E][P]

(eq. 1)

Porém, no estado inicial, podemos simplificar a reação:

E

+

S

k 1
k
1

k 2

ES

k 3

podemos simplificar a reação: E + S k 1 k 2 ES k 3 E +

E +

P

Você saberia dizer por que não ocorre a reação 4 (k 4 )?

Qual seria a velocidade de reação neste caso?

E

+

S

k 1
k
1

k 2

ES

k 3

E + S k 1 k 2 ES k 3 E + P A reação 4

E +

P

A reação 4 (k 4 ) não ocorre nessa situação porque a quantidade de P é ainda muito pequena para estabelecer o equilíbrio.

A velocidade inicial de reação neste caso é dada por:

V 0 = k 3 [ES]

(eq. 2)

ATENÇÃO: Como estão duas reações acopladas (o produto da primeria é substrato da segunda), na maioria das vezes, estas reações ocorrem fora do equilíbrio mesmo na Etapa 1 apesar das duas reações (de constantes k 1 e k 2 ) estarem acontecendo. Por isso, definimos o ESTADO ESTACIONÁRIO (a seguir).

Na análise cinética da reação catalisada por uma enzima, consideramos apenas o ESTADO ESTACIONÁRIO, que é aquele em que, apesar de estarem mudando as concentrações de S (diminuindo) e de P (aumentando), não há variação da concentração dos intermediários da reação.

E

+

S

No caso descrito,

k 1
k
1

k 2

ES

k 3

E + S No caso descrito, k 1 k 2 ES k 3 E + P

E +

P

o intermediário é o complexo ES, e no estado estacionário temos:

Velocidade de formação de ES = Velocidade de decomposição de ES

OU

k 1 [E].[S] = (k 2 + k 3 )[ES]

(eq. 3)

A equação 3 pode ser re-arranjada em:

[E][S]

(k 2 + k 3 )/k 1

= [ES]

(eq. 4)

Para simplificar a equação 4, foi definida uma constante, Km, conhecida como Constante de Michaelis:

Km =

(k 2 + k 3 )

k 1

(eq. 5)

Antes de substituirmos Km na eq. 4, tente responder:

• Da forma como foi definido Km (eq. 5), SEM FAZER SUBSTITUIÇÕES POR CONCENTRAÇÕES, qual o seu significado?

• O que vai significar um valor alto de Km? E um valor baixo de Km?

Km =

(k 2 + k 3 )

k 1

(eq. 5)

de

velocidade e,

constante. Se você fizer o raciocínio considerando concentrações, Km nunca seria constante!

portanto, é uma

O Km é uma relação de constantes

No numerador, temos duas constantes de velocidade de reações de

DECOMPOSIÇÃO de ES e no denominador, a constante de velocidade da

FORMAÇÃO de ES.

Dessa forma, Km é uma medida da AFINIDADE da enzima pelo substrato.

Km ALTO = BAIXA AFINIDADE

e

Km BAIXO = ALTA AFINIDADE

[E][S]

(k 2 + k 3 )/k 1

= [ES]

(eq. 4)

Km =

(k 2 + k 3 )

k 1

Substituindo a eq. 5 na eq. 4, teremos:

[E][S] = [ES] Km

(eq. 6)

(eq. 5)

Como toda a enzima que estiver na solução de reação (E TOTAL ) corresponde à soma das espécies E (enzimas livres) e ES (enzimas no complexo com substrato),

[E] TOTAL = [E] + [ES]

ou

[E] TOTAL - [ES] = [E]

(eq. 7)

Substituindo a eq. 7 em 6, temos:

[ES] =

([E] TOTAL - [ES]).[S]

Km

(eq. 8)

Que pode ser transformada em

[ES] = [E] TOTAL .[S] [S] + Km

(eq. 9)

Podemos substituir esta equação na da velocidade inicial da reação é V 0 = k 3 .[ES]:

[E] TOTAL .[S]

[S] + Km

V 0 = k 3

(eq. 10)

Em que situação teremos V 0 = k 3 [E] TOTAL ?

Na eq. 10,

[E] TOTAL .[S]

[S] + Km

V 0 = k 3

(eq. 10)

para que V 0 = k 3 [E] TOTAL , é necessário que:

[S]

[S] + Km

= 1

(eq. 11)

A primeira idéia que vem à cabeça é que isso só será possível se Km for igual a ZERO. Mas Km não pode ser zero!!!!!!!! Então, devemos raciocinar em termos da relação entre Km e [S] na reação.

Pense, novamente, em como responder a questão, considerando Km (que é constante) igual a 1; veja como fica a relação da eq 11 se tivermos [S] igual a:

1

10

100

[S]

[S] + Km

= 1

1000

(eq. 11)

1000000000000

Agora você percebeu que Vo = k 3 [E] TOTAL quando a concentração de

substrato for MUITO MAIOR que Km!

Quando todas as enzimas estão na forma de complexo ES, atingimos a

velocidade máxima de reação, ou seja, se [E] TOTAL = [ES], então a

equação 10, pode ser representada por:

V 0 = Vmáx

[S]

[S] + Km

(eq. 12)

• Se a velocidade de reação for igual à metade da velocidade máxima, ou seja, V 0 = Vmáx/2, como fica a equação 12?

• Como será a velocidade da reação quando a concentração de substrato estiver muito baixa ([S]<<<Km)?

• E quando a concentração de substrato estiver muito alta ([S]>> Km) ?

• Se V 0 = Vmáx/2, temos:

Km = [S].

Ou seja, Km corresponde à concentração de S necessária para se atingir a metade da velocidade máxima!

• Se [S]<<<Km, então a eq. 12 fica:

V 0 = Vmáx

Km

• E se [S] >>>> Km, é a mesma situação que vimos antes, e

V 0 = k 3 [E] TOTAL

Este gráfico mostra como varia a velocidade inicial de uma reação

com o aumento da concentração de substrato:

Vmáx 2,00 1,75 1,50 1,25 Vmáx/2 1,00 0,75 0,50 0,25 Km 0,00 Vo (μmoles/min)
Vmáx
2,00
1,75
1,50
1,25
Vmáx/2
1,00
0,75
0,50
0,25
Km
0,00
Vo (μmoles/min)

012345

[S] (x 10 -5 M)

Ou seja, Vmáx e Km podem ser calculados quando V 0 é medida em função de várias concentrações de substrato.

A eq. 12:

V 0 = Vmáx

[S]

[S] + Km

(eq. 12)

pode ser representada na forma inversa (eq. 13) que representa uma equação do tipo y = ax + b:

1

Vo

=

1

Vmáx

+

Km

1

Vmáx

[S]

(eq. 13)

• Identifique a inclinação e o intercepto nessa equação de reta.

A eq. 13 representa uma equação de reta, ou seja, uma

equação do tipo y = ax + b:

ou seja, uma equação do tipo y = a x + b : 1 1 =
1 1 = Vo Vmáx
1
1
=
Vo
Vmáx

+

Km 1 Vmáx [S]
Km
1
Vmáx
[S]
a x + b : 1 1 = Vo Vmáx + Km 1 Vmáx [S] (eq.

(eq. 13)

a inclinação da reta corresponde a Km/Vmáx e o intercepto a

1Vmáx.

• No gráfico abaixo, obtido através da eq. 13, indique como podem ser obtidos os valores de Km e Vmax:

-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 1/Vo
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
1/Vo

1/[S]

inclinação = Km/Vmáx 0,50 1/V máx 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 1/[S] -1
inclinação = Km/Vmáx
0,50
1/V máx
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
1/[S]
-1
Km
1/Vo

É possível determinar os valores de Km e Vmax com precisão se utilizarmos o gráfico 1 e não o gráfico 2? Justifique

Vmáx 2,00 1,75 1,50 1,25 Vmáx/2 1,00 0,75 0,50 0,25 Km 0,00 Vo (μmoles/min)
Vmáx
2,00
1,75
1,50
1,25
Vmáx/2
1,00
0,75
0,50
0,25
Km
0,00
Vo (μmoles/min)
1/Vo
1/Vo

012345 -0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

[S] (x 10 -5 M)

1/[S]

GRÁFICO 1

GRÁFICO 2

Não é possível pois, experimentalmente, é muito difícil atingir a Vmáx de uma reação catalisada por uma enzima.

O gráfico dos duplos recíprocos (Gráfico 2) permite a determinação precisa de Km e Vmáx já que na extrapolação dos dados experimentais, chegamos a uma situação em que 1/V 0 = 1/Vmáx quando 1/[S] = 0; ou seja, quando a concentração de substrato for muito alta!!!!

Responsável pelo Estudo Dirigido: Profa. M. Lucia Bianconi (IBqM/UFRJ) e-mail:enzimas@bioqmed.ufrj.br