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Alim. Nutr. , Araraquara v.19, n.1, p. 43-53, jan./mar. 2008 ISSN 0103-4235 DESENVOLVIMENTO DE UMA

Alim. Nutr., Araraquara v.19, n.1, p. 43-53, jan./mar. 2008

ISSN 0103-4235

DESENVOLVIMENTO DE UMA BEBIDA LÁCTEA PROBIÓTICA UTILIZANDO COMO SUBSTRATOS SORO DE LEITE E EXTRATO HIDROSSOLÚVEL DE SOJA

RESUMO: Recentemente, a indústria de alimentos tem mostrado grande interesse em desenvolver novos produtos lácteos fermentados por microrganismos probióticos. Estes microrganismos têm a capacidade de manterem-se vivos no produto fermentado e sobreviverem à passagem pelo trato gastrointestinal, trazendo melhorias no balanço da ora mi- crobiana de indivíduos que consumam periodicamente es- tes produtos. Neste trabalho, utilizou-se a técnica do plane- jamento de experimentos para determinar a formulação da bebida láctea utilizando como substratos leite de vaca, soro de leite e extrato hidrossolúvel de soja. Através de análises sensoriais determinou-se a aromatização da formulação es- colhida, e associadas a análises físico-químicas e microbio- lógicas determinou-se o tempo de prateleira do produto. A formulação contendo 30% de extrato hidrossolúvel de soja, 36,6% de leite de vaca e 33,3% de soro de leite foi adotada como sendo a formulação base ideal determinada por aná- lises sensoriais e avaliação do crescimento celular duran- te a fermentação. Durante o período de armazenamento, a bebida láctea sabor morango apresentou células viáveis da cultura mista adicionada dentro dos padrões estabelecidos (1x10 6 ) até o 22° dia. A bebida láctea manteve a qualida- de microbiológica no decorrer do período de estocagem. A qualidade sensorial deniu o término do armazenamento no 25° dia, pelo fato da bebida já apresentar uma acidez bastante elevada, sendo rejeitada nas análises sensoriais.

PALAVRAS-CHAVE: Probióticos; formulação; Bidobacterium; bebida láctea; soja.

INTRODUÇÃO

A Ciência de Alimentos que anteriormente preocu- pava-se em desenvolver alimentos para a sobrevivência hu- mana passou a objetivar, recentemente, o conceito de pro- duzi-los com qualidade. Aliado a isto, a idéia passou a ser

Roberta KRÜGER* Aniela Pinto KEMPKA* Débora de OLIVEIRA** Eunice VALDUGA** Rogério Luis CANSIAN** Helen TREICHEL** Marco Di LUCCIO**

usá-los como veículo de promoção de bem-estar e saúde, ao mesmo tempo reduzindo o risco de doenças. Especicamente na área de laticínios uma nova ten-

dência que vem se apresentando é a produção de iogurtes

e leites fermentados funcionais. Isto porque, além destes

produtos possuírem grande aceitação pelo público em geral

e apresentarem excelente valor nutritivo, são veículos em

potencial para o consumo de probióticos. 3 Segundo Heller 9 , os consumidores estão familiarizados com o fato de que alimentos fermentados podem apresentar microrganismos vivos.

De acordo com a denição atualmente aceita, os

probióticos são microrganismos vivos que, quando ingeri- dos em concentrações adequadas, exercem benefícios para

a saúde do consumidor. Os microrganismos mais frequen-

temente utilizados como probióticos pertencem ao grupo das bactérias ácido lácticas, destacando-se, entre elas, os gêneros Lactobacillus e Bidobacterium, que são usados há séculos na produção de leites fermentados. Dentro de cada um dos géneros existem várias espécies, por exem- plo, Lactobacillus acidophilus e Bidobacterium bidum. Existem outros microrganismos, que não bactérias, que também são usados como probióticos, como é o caso de algumas leveduras, em particular a espécie Saccharomyces boulardii. 11 Apenas iogurtes e leites fermentados contendo cul- turas probióticas devem ser considerados funcionais. 2 No entanto, os consumidores em geral não sabem distinguir quais são os produtos lácteos funcionais. A própria legisla- ção brasileira para alimentos funcionais é incipiente. 3 Uma questão ainda não conclusa pela literatura é a quantidade e frequência de consumo de probióticos neces- sários para assegurar os benefícios funcionais a eles atri- buídos. 8 Preconiza-se a ingestão semanal mínima de 300 a 500 gramas de produtos lácteos fermentados contendo en- tre 10 6 a 10 7 UFC/mL. As embalagens de leites fermentados comercializados no Brasil apresentam geralmente 80mL de produto e, segundo Saxelin et al. 14 essas garrafas pequenas

* Curso de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos – URI - Campus de Erechim - 99700-000 – Erechim – RS – Brasil. ** Departamento de Engenharia de Alimentos – URI – Campus de Erechim – 99700-000 – Erechim – RS – Brasil.

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fazem parte do conceito de “dose diária” de companhias multinacionais. A ingestão diária de leites fermentados em- balados em garrafas de 80mL totaliza consumo semanal de 560mL. É preciso, no entanto, que estes produtos tenham sido fabricados adequadamente e estocados na temperatura de refrigeração correta para de fato apresentarem quantida- de alta de microrganismos probióticos viáveis. No Brasil, dos diversos leites fermentados disponí- veis no mercado, apenas alguns contêm no rótulo a identi- cação do microrganismo presente. Em geral, o fabrican- te limita-se a informar que o produto contém “fermentos lácteos”. No entanto, a linhagem do microrganismo presen- te no produto, bem como o número de células viáveis desta cultura é que determina se este é ou não funcional. A legis- lação deveria exigir que fosse veiculada esta informação no rótulo para assim permitir aos consumidores a escolha de produtos com linhagens potencialmente benécas à saúde. Além disso, sem estas informações do fabricante, é impos- sível o controle de qualidade pelas agências governamen- tais de scalização. 3 Neste contexto, as investigações cientícas mais recentes têm demonstrado clara e inequivocamente a rele- vância para a saúde de dois microrganismos probióticos:

Bidobacterium, uma bidobactéria (família de bactérias benécas presentes na ora intestinal ao nível do cólon) e Lactobacillus acidophilus (presente na ora intestinal do intestino delgado). Estas bactérias têm ações que se poten- cializam mutuamente, isto é, têm entre si uma relação de simbiose. 5 Por outro lado, os produtos à base de soja exempli- cam as características que se buscam nos alimentos fun- cionais. Além de possuírem uma proteína em quantidade e qualidade, melhorariam os aspectos de funcionalidade dos alimentos e o seu consumo regular contribuiria para dimi- nuir os níveis de colesterol e triglicerídeos, prevenindo, além disso, certos tipos de câncer. Além das vitaminas e minerais, a soja é também fonte de bras com propriedades funcionais. 10 Aliado à utilização do extrato hidrossolúvel de soja no desenvolvimento de novos produtos com características funcionais, as proteínas do soro de leite também contribuem para reduzir o colesterol sangüíneo, oferecendo certa prote- ção contra as doenças cardiovasculares. O uso de produtos de soro, além dos benefícios nutricionais, oferece uma boa relação custo/benefício. 10 Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desen- volver uma bebida láctea fermentada sabor morango utili- zando como substratos soro de leite, extrato hidrossolúvel de soja e leite de vaca.

MATERIAL E MÉTODOS

Matérias – Primas

As matérias-primas utilizadas na composição do substrato para fermentação foram leite de vaca, extrato hi-

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drossolúvel de soja e soro de leite. Utilizou-se leite UHT desnatado, adquirido em estabelecimentos comerciais da cidade.

O extrato hidrossolúvel de soja foi produzido no

Laboratório de Análise Sensorial do Centro Tecnológico da URI – Campus de Erechim, seguindo metodologia indicada pela EMATER regional.

O soro de leite, subproduto da produção de queijo

tipo lanche, foi gentilmente cedido pela Empresa COOCEL (Cooperativa de Prestação de serviços, Industrialização, Comercialização e Consultoria do Alto Uruguai Ltda).

Culturas Láticas

Para o desenvolvimento deste trabalho utilizou- se uma cultura mista de Streptococcus thermophilus,

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus e Bidobacterium sendo representada pelo nome comercial My Bio 6 e My Bio 2 procedentes da RHODIA BRASIL Ltda.

A cultura apresentava-se liolizada e procedeu-se

sua reativação em leite em pó desengordurado após este ter sido hidratado e esterilizado em autoclave a 121 o C por 15 min, e conservado em estufa por 24 horas a temperatura de 37 o C; procedimento este efetuado de acordo com recomen-

dações do fornecedor. Após este período, o inóculo foi repi- cado em caldo MRS (de Man, Rogosa e Sharp – MERCK) estéril, sendo utilizado 1mL de inóculo para 10mL de meio.

O meio foi mantido em estufa a 37 o C por 24 horas. Após

esta etapa, os pré-inóculos foram conservados em geladeira à temperatura de refrigeração até o momento de sua utili- zação.

Métodos

Os métodos físico-químicos e os demais métodos utilizados para produzir a bebida fermentada, acompa- nhar a evolução da fermentação e a estabilidade da bebida fermentada estão descritos a segui. A descrição detalhada de alguns métodos, rotineiramente utilizados em análises físico-químicas, são encontradas nas respectivas referên- cias.

Métodos Físico-Químicos

Determinação do pH

Os valores de pH foram determinados em potenciômetro digital (DIGIMED), devidamente calibra- dos com soluções tampão de pH 7,0 e pH 4,0. 12

Determinação da acidez total

A determinação da acidez total foi realizada medin- do o teor de ácido lático presente em 100g de amostra pela titulação com NaOH 0,1N de alíquota de 5mL de amostra

na presença de fenolftaleína como indicador. 12

Determinação do crescimento celular

A determinação do crescimento celular da cultura

mista ou de um dos probióticos inoculados foi realizada através de densidade ótica (D.O) da amostra, medida em espectrofotômetro (Agilent Tecnologies) em comprimento de onda de 650nm.

Obtenção do Extrato Hidrossolúvel de Soja

O uxograma de obtenção do extrato hidrossolúvel

de soja é apresentado na Figura 1.

A metodologia empregada na obtenção do extrato

hidrossolúvel de soja foi desenvolvida a partir de dados obtidos na EMATER regional, cujo processamento foi rea- lizado manualmente.

A adição de bicarbonato de sódio (NaHCO 3 ) foi rea-

lizada para promover a inativação da enzima lipoxigenase, responsável pelo sabor indesejável de feijão cru, caracterís- tico da soja. 10

Desproteinização do Soro de Leite

O soro de leite utilizado foi o soro proveniente da

fabricação do queijo tipo lanche. Após a coleta este mate- rial foi aquecido a 80 o C por 15 minutos e, posteriormente, ltrado a m de se promover a separação da proteína. 16

Tratamento Térmico dos Substratos

O tratamento térmico foi realizado para a mistura de

extrato hidrossolúvel de soja, soro de leite e leite de vaca nas devidas proporções. Corrigiu-se o pH da mistura para 7,5 com NaOH 0,4N, após as amostras de substrato foram pasteurizadas em erlenmeyer de 500mL em banho-maria a

80 o C por 20 minutos. 10

Otimização das Condições Operacionais da Cultura

O objetivo desta etapa foi otimizar o crescimento

da cultura mista de S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus, L. acidophilus e Bidobacterium visando obter as melhores condições de operação para a referida cultura.

Limpeza e seleção dos grãos

para a referida cultura. Limpeza e seleção dos grãos Adiç ão de á gua Fervura a

Adição de água

cultura. Limpeza e seleção dos grãos Adiç ão de á gua Fervura a 100 o C/5

Fervura a 100 o C/5 min

dos grãos Adiç ão de á gua Fervura a 100 o C/5 min Lavag em em

Lavagem em água corrente

gua Fervura a 100 o C/5 min Lavag em em á gua corrente Adiç ão de

Adição de água

o C/5 min Lavag em em á gua corrente Adiç ão de á gua Fervura a

Fervura a 100 o C/5 min

gua corrente Adiç ão de á gua Fervura a 100 o C/5 min Trituração dos grãos

Trituração dos grãos por 3 minutos

a 100 o C/5 min Trituração dos grãos por 3 minutos Adição de bicarbonato de sódio

Adição de bicarbonato de sódio

dos grãos por 3 minutos Adição de bicarbonato de sódio Filtra ção com coador de pano

Filtração com coador de pano esterilizado

de sódio Filtra ção com coador de pano esterilizado Cozimento por 10 minutos ap ós a

Cozimento por 10 minutos após a fervura

pano esterilizado Cozimento por 10 minutos ap ós a fervura Adição de sal e açúcar Homogeneização

Adição de sal e açúcar

por 10 minutos ap ós a fervura Adição de sal e açúcar Homogeneização Extrato hidrossolúvel de

Homogeneização

ap ós a fervura Adição de sal e açúcar Homogeneização Extrato hidrossolúvel de soja FIGURA 1

Extrato hidrossolúvel de soja

FIGURA 1 – Fluxograma do processo de obtenção do extrato hidrossolúvel de soja.

45

Para isto, utilizou-se uma técnica de planejamento de expe- rimentos, avaliando o efeito dos fatores: temperatura, pH e agitação sobre o crescimento celular. A análise estatística dos dados experimentais permitiu otimizar as condições operacionais em função do crescimento celular. Posterior- mente, esses dados foram utilizados para determinar as condições de fermentação da bebida láctea. O intervalo de estudo destes fatores foi denido em função de resultados apresentados na literatura. 16 Visando avaliar o efeito das variáveis de processo no crescimento celular, um planejamento experimental completo 2 3 com triplicata no ponto central para avaliação do erro experi- mental foi realizado. A Tabela 1 apresenta o intervalo de estudo das variáveis independentes.

Tabela 1 – Intervalo de estudo das variáveis.

Variáveis

(-1)

(0)

(+1)

Temperatura (ºC)

30

36

42

Agitação (rpm)

0

100

200

pH

5,5

6,5

7,5

Para cada experimento descrito utilizou-se para 1mL de inóculo para cada 50mL de caldo MRS. As amostras fo- ram mantidas em agitador orbital em temperatura e agita- ção controladas e amostras foram retiradas de 2 em 2 horas para avaliação do crescimento celular e pH. O crescimen- to celular foi avaliado através da densidade ótica (D.O), a qual foi determinada realizando-se leituras de absorbância das amostras em espectrofotômetro (Agilent Tecnologies) (λ=650nm) e pH em potenciômetro digital. Em uma pri- meira etapa foram realizados os experimentos apresentados na Tabela 2.

Tabela 2 – Matriz do planejamento experimental para oti- mização dos fatores (valores reais e codicados).

Ensaio

T (°C)

pH

Agitação

(rpm)

1 (-1)

30

5,5 (-1)

0

(-1)

2 (1)

42

5,5 (-1)

0

(-1)

3 (-1)

30

5,5 (-1)

200

(1)

4 (1)

42

5,5 (-1)

200

(1)

5 (-1)

30

7,5 (1)

0

(-1)

6 (1)

42

7,5 (1)

0

(-1)

7 (-1)

30

7,5 (1)

200

(1)

8 (1)

42

7,5 (1)

200

(1)

9 (0)

36

6,5 (0)

100

(0)

Planejamento das Formulações

Após determinadas as condições de operação mais favoráveis para o crescimento da cultura láctea, empregou- se outro planejamento experimental (Tabela 3) visando obter a concentração ideal de cada um dos substratos na formulação da bebida láctea. Todos os experimentos foram

46

realizados em duplicata e os dados apresentados referem- se a médias aritméticas, sendo os desvios-padrão obtidos inferiores a 5%.

Tabela 3 – Experimentos realizados para obtenção da for- mulação base da bebida láctea- etapa 1.

Ensaio

Extrato Hidrossolúvel de Soja (%)

Soro de Leite (%)

Leite de Vaca (%)

1 50

40

10

2 40

50

10

3 10

50

40

4 10

40

50

5 40

10

50

6 50

10

40

7 33

33

33

Neste planejamento, através de correlações feitas com o crescimento celular (D.O), avaliou-se que estas fai- xas estipuladas para os substratos poderiam ser ampliadas. Visando a otimização da mistura, dois novos planejamen- tos (Tabelas 4 e 5) foram necessários para se obter uma formulação base.

Tabela 4 – Experimentos realizados para obtenção da for- mulação base para bebida láctea fermentada – etapa 2.

Ensaio

Extrato hidrossolúvel de soja (%)

Soro de leite (%)

Leite de vaca (%)

1 25

25

50

2 33

33

33

3 22

45

33

4 30

45

25

Tabela 5 Experimentos realizados para obtenção da for-

mulação base para a bebida láctea fermentada – etapa 3.

Extrato hidrossolúvel de soja (%)

Leite de

Soro de leite (%)

Ensaio

vaca

(%)

1

25

30

45

2

33,3

30

36,6

3

30

25

45

4

30

33,3

36,7

Obtenção da Bebida Láctea Fermentada e Aromatiza- ção

A Figura 2 apresenta o uxograma geral para obten- ção da bebida láctea fermentada. Após a pasteurização a 80 o C por 20 minutos, as amostras foram resfriadas à temperatura de 40 0 C onde se procedeu à adição do estabilizante. Utilizou-se como esta- bilizante a Carragena (DCA – Indústria e Comércio Ltda)

na proporção de 0,1 grama para cada 100mL de produto, padrão obtido na Legislação para produtos fermentados. 10 Foram adicionados 2% de inóculo, para a mistura selecio- nada. A mistura assim obtida era acondicionada em agita- dor orbital nas condições de operação estabelecidas.

Formulação base

condições de operação estabelecidas. Formulação base Tratamento térmico Fermenta ção Adiç ão de

Tratamento térmico

estabelecidas. Formulação base Tratamento térmico Fermenta ção Adiç ão de estabilizante Adição de

Fermentação

Formulação base Tratamento térmico Fermenta ção Adiç ão de estabilizante Adição de aromatizante, corante

Adição de estabilizante

térmico Fermenta ção Adiç ão de estabilizante Adição de aromatizante, corante e polpa Embalagem

Adição de aromatizante, corante e polpa

de estabilizante Adição de aromatizante, corante e polpa Embalagem Armazenamento Avalia ção da estabilidade da

Embalagem

Adição de aromatizante, corante e polpa Embalagem Armazenamento Avalia ção da estabilidade da bebida FIGURA

Armazenamento

de aromatizante, corante e polpa Embalagem Armazenamento Avalia ção da estabilidade da bebida FIGURA 2 –

Avaliação da estabilidade da bebida

FIGURA 2 – Fluxograma do processo de produção da be- bida láctea fermentada.

A formulação otimizada foi aromatizada com aroma articial de morango (RCC 73993/9, RHODIA BRASIL

Ltda), colorida com corante articial Vermelho Bordeaux “S” (ARCOR), a seguir foi adicionada a polpa de morango (MAYSA Ltda) e adoçante (sacarose).

As concentrações de aroma e de corante utilizadas

foram às indicadas nos rótulos dos produtos. Para as con- centrações de polpa e de açúcar utilizou-se o resultado de um planejamento de experimentos citado em estudo ante- rior. 16

Tratamento Estatístico

O tratamento estatístico dos dados foi realizado

segundo metodologia de planejamento de experimentos e análise de superfície de resposta, em nível de 95% de conança, com auxílio do software Statistica 5.0 (Statsoft, USA).

Avaliação da Estabilidade da Bebida Láctea

A bebida fermentada sabor morango foi armazena- da sob refrigeração (4 o C), em copos plásticos de 250mL para avaliação de sua estabilidade físico-química, micro- biológica e sensorial realizada a partir do primeiro dia, nos intervalos de 7, 14, 19, 22 e 25 dias de estocagem, respec- tivamente.

Estabilidade físico-química

A estabilidade físico-química da bebida foi avalia-

da em amostras coletadas ao acaso e homogeneizadas pre- viamente às determinações de pH e acidez total (% ácido láctico).

Estabilidade microbiológica

A avaliação microbiológica da bebida láctea sabor

morango, foi realizada paralelamente à avaliação físico- química e sensorial, em amostras coletadas ao acaso. O número de células da microora essencial presente na bebida, S. thermophilus, L. delbrueckii, subsp. Bulgaricus, L. acidophilus e Bidobacterium foi determinado pela contagem total de células viáveis. Foram realizadas diferentes diluições da amostra em água peptonada 0,1%,

conforme o tempo de fermentação, através de testes prévios realizados, para que fosse possível a contagem das colônias. Assim semeou-se 1mL de amostra, nas diluições estabelecidas, em placa de Petry com meio MRS agar em camadas. Incubou-se as placas invertidas em jarras de

anaerobiose, contendo gerador de atmosfera de CO 2 , dentro de estufa à 42°C/48hs. 10

A contagem celular mínima de cultura especíca

recomendada para bebidas lácteas fermentadas é de 1,0 x

10 6 células viáveis/mL no momento do consumo. Alguns

autores indicam que a maioria dos produtos lácteos fermen- tados apresenta-se na faixa de 1 x 10 7 UFC/mL e que este valor poderia ser aceito com o possível limite mínimo para a contagem celular. 10 As demais determinações microbiológicas foram efetuadas de acordo com metodologia descrita por Silva et al. 15 onde se avaliou a presença de coliformes fecais (NMP), salmonella e contagem de bolores e leveduras. O número mais provável de bactérias do grupo coliforme, embora não estabelecido pela legislação, foi determinado, visto que es- tes microorganismos são indicadores das condições higiê- nicas mantidas durante o processamento do produto. Esta determinação foi realizada pela semeadura de três séries de tubos, contendo 9mL de caldo lauril sulfato triptose e tubo de Durhan invertido, com 1mL de diferentes diluições da amostra. Os tubos foram incubados a 37 o C por 24 a 48 horas para vericar a formação de gás e turvação do meio, indicativos da presença destes microorganismos. A partir dos tubos positivos, com formação de gás, foram semeados com alça de platina, os tubos contendo o meio Escherichia coli (E.C), mantidos em banho-maria a 44,5 o C por 24 à 48 horas para vericar a formação de gás. O NMP de colifor- mes fecais/mL de amostra foi calculado pelo número de tubos positivos conrmados. A contagem de bolores e leveduras foi realiza- da pela semeadura de diferentes diluições em meio Agar Padrão para Contagem (PCA) previamente esterilizado, com cloranfenicol. Nas placas adicionou-se aproximada- mente 20mL de meio e colocou-se 1mL das diferentes di- luições, distribuindo-se com uma alça de vidro. As placas

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foram incubadas a 25 o C por 5 dias e o resultado expresso em UFC/mL.

A análise de presença de salmonellas foi realizada

em 25mL de amostra homogeneizada em 225mL de caldo peptonado pré-enriquecimento em incubadora por 24 horas

a 37 o C. Após a incubação, 1mL da solução foi transferi-

do para tubos contendo 9mL de meio enriquecido seletivo (caldo selenito cistina e caldo tetrationato) e incubados a

37 o C por 24 horas, após esse período com o auxílio de uma alça de platina o material foi transferido para placas con- tendo meio Ramback (MERCK). Esta placa foi novamente incubada a 37 o C por mais 24 horas, sendo a conrmação dada pela presença de colônias vermelhas na placa.

Estabilidade sensorial

A ocorrência de alterações no sabor, aroma, apa-

rência e textura da bebida durante o período de armaze- namento foram determinadas pela avaliação sensorial. As amostras foram escolhidas ao acaso, homogeneizadas, dis- tribuídas em copos plásticos, com codicação balanceada e apresentadas à equipe de provadores selecionados. Foram

avaliados os atributos aparência, textura, aroma e sabor em escala estruturada de 9 pontos.

A estabilidade das características sensoriais da be-

bida láctea fermentada sabor morango durante a estocagem foi investigada em intervalos de 0, 7, 14, 19, 22 e 25 dias.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Estudo das Condições Operacionais da Cultura

Para se avaliar a melhor condição de processo para a

referida cultura utilizou-se um planejamento experimental, testando-se diferentes níveis de pH, temperatura e agita- ção. O efeito da agitação foi avaliado devido ao fato de

a cultura ser, segundo o fabricante, aeróbia facultativa. O

intervalo de estudo das variáveis foi denido em função de resultados apresentados na literatura. 16 O planejamento em- pregado nesta etapa com os resultados da densidade ótica, ao nal da fase de latência da curva de crescimento durante

a fermentação, é apresentado na Tabela 6.

Tabela 6 Crescimento celular obtido no planejamento ex- perimental.

Experimento

DO (λ=650nm)

1

2,7 (32 horas)

2

5,5 (24 horas)

3

2,5 (32 horas)

4

0,1 (12 horas)

5

3,6 (32 horas)

6

8,2 (24 horas)

7

13,0 (32 horas)

8

0,6 (16 horas)

9

0,2 (26 horas)

Conforme pode ser visualizado nas Figuras 2 e 3, a temperatura e a agitação exercem grande inuência sobre

48

o crescimento celular. À temperatura de 30 o C, com agita- ção de 0 e 200rpm, obteve-se o crescimento celular mais acentuado com pH inicial do meio de 7,5, porém o experi- mento com agitação apresentou uma fase lag muito longa,

o que seria inviável industrialmente. Aumentando-se esta

temperatura constatou-se um aumento no crescimento ce- lular. A 42°C e 0 rpm observou-se que para o pH 7,5 a D.O.

chegou a valores próximos a 8, enquanto que a 200 rpm

o crescimento foi muito inferior. Cabe salientar que estas

contagens podem ser referentes cultura mista previamente

inoculada ou a qualquer um dos microrganismos presentes na referida cultura. Os dados cinéticos referentes aos experimentos rea- lizados são apresentados nas Figuras 2, 3 e 4. Para vericar a inuência das variáveis de processo no crescimento, foi realizada a análise estatística dos dados experimentais. Os resultados estão apresentados na Tabela 7. Neste ponto, cabe frisar que a análise foi realizada para um tempo de 18 horas, fase exponencial de crescimento para todas as condições experimentais.

O modelo obtido para o crescimento celular em meio

sintético, com coeciente de correlação (R 2 ) = 0,9986, foi:

DO= 0,769+ 1,218*T+0,164*pH -1,57*agit -1,145*T*agit +1,06*pH*pH

Onde: T=temperatura; agit=agitação; pH=pH.

O desvio padrão médio dos parâmetros foi em tor-

no de 0,02, para as faixas estudadas. A análise estatística dos dados experimentais conrmou que a temperatura e a agitação foram os fatores que mais afetaram o crescimento

celular, sendo que a temperatura apresentou efeito positivo

e a agitação um efeito negativo no crescimento celular, este

último resultado já esperado já que as culturas lácteas são anaeróbicas facultativas. Já a interação das variáveis tem- peratura e agitação resultou em um efeito negativo, ou seja, mesmo tendo uma temperatura ideal se existir agitação não será obtido um bom resultado. Com os resultados obtidos pode-se concluir que, quando da utilização desta cultura mista em meio MRS, a

condição que maximiza o crescimento celular é a tempera- tura de 42 o C, pH inicial de 7,5 e agitação de 0rpm.

Planejamento das Formulações

A formulação base foi denida com base no cres-

cimento celular como aquela referente ao Experimento 4 (Tabela 5): 30% de extrato hidrossolúvel de soja, 33,3% de soro de leite e 36,7% de leite de vaca.

Aromatização da Bebida Láctea

As concentrações de aroma e de corante utilizadas foram as indicadas nos rótulos dos produtos. Para as con- centrações de polpa e de açúcar utilizou-se o resultado de um planejamento de experimentos citado em estudo ante- rior. 16

4 pH 5,5 pH 7,5 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10
4
pH 5,5
pH 7,5
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
Densidade ótica (650nm)

Tempo (horas)

(a)

14 13 pH 5,5 12 pH 7,5 11 10 9 8 7 6 5 4
14
13
pH 5,5
12
pH 7,5
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Densidade ótica (650 nm)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
Tempo (horas)
(b)
pH 5,5
pH 7,5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20

FIGURA 3 Dados cinéticos obtidos no planejamento experimental: T=30°C, 0rpm (a) e 200rpm (b).

8 pH 5,5 7 pH 7,5 6 5 4 3 2 1 0 0 2
8
pH 5,5
7
pH 7,5
6
5
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
Densidade ótica (650 nm)
Densidade ótica (650 nm)

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Tempo (horas)

Tempo (horas)

(a)

(b)

FIGURA 4 – Dados cinéticos obtidos no planejamento experimental: T=42°C e 0rpm (a) e 200rpm (b).

2,5 pH 6,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 2 4 6 8 10 12
2,5
pH 6,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
Densidade ótica (650 nm)

Tempo (horas)

FIGURA 5 – Dados cinéticos obtidos no planejamento experimental:

Ponto central – T=36°C, 100rpm.

49

pH

Tabela 7 Modelo estatístico experimental.

Modelo:

R= 0,99859

DO18= a 0 + a 1 *T+a 2 *pH+a 3 *agit+a 4 *T*agit+a 5 *pH*pH

 
 

a 0

a 1

a 2

a 3

a 4

a 5

Parâmetro

0,769

1,218

0,164

-1,570

-1,145

1,061

Assim, de niu-se para 200mL de bebida láctea 10g de polpa, 8g de açúcar, 0,25g de aroma e 0,1mL de coran- te.

Estabilidade da Bebida Láctea

Estabilidade físico-química

A análise dos dados permitiu observar que durante

o período de estocagem da bebida, o pH apresentou dimi- nuições consideráveis, visto que o pH inicial era de 4,98, chegando a pH 4,35 no 19 o dia de armazenamento, como pode ser observado na Figura 5.

1,0 5,0 0,9 0,8 4,8 0,7 0,6 4,6 0,5 0,4 4,4 0,3 0,2 4,2 acidez
1,0
5,0
0,9
0,8
4,8
0,7
0,6
4,6
0,5
0,4
4,4
0,3
0,2
4,2
acidez
0,1
pH
0,0
4,0
0
4
8
12
16
20
24
Acidez (% de ácido lático)

Tempo (dias)

FIGURA 6 – Relação entre pH e acidez durante o armaze- namento da bebida láctea sabor morango.

A partir de 22 dias de estocagem vericou-se acen-

tuada acidicação do produto, causando a desestabilidade da estrutura protéica e sua coagulação, visto que as proteí- nas do leite apresentam ponto isoelétrico em pH próximo a

4,60 10 e as da soja, pH 5,2. 1

A elevada acidez e o baixo pH aos 25 dias de ar-

mazenamento, possivelmente esteja relacionada a ação do Lactobacilus acidophilus, microorganismo conhecido pela grande capacidade de produção de ácido no meio de fer- mentação. Devido à sua característica de alta acidez, os

produtos acidólos são apreciados por um grupo restrito de consumidores. 10

O uso de bi dobactérias em culturas mistas, prin-

cipalmente com lactobacilos, proporciona a formação de ácido L(+)láctico e as propriedades benécas associadas a estas bactérias intestinais. 10

50

A utilização de bactérias bídas em culturas mistas

possibilita a produção de compostos voláteis que mascaram

o sabor e aroma característico da soja em misturas fermen- tadas. 10 Tortelli 16 em um estudo com cultura mista de S.

thermophilus e L. delbrueckii subsp. bulgaricus, utilizando

a formulação base para a bebida láctea de 55% de extrato

hidrossolúvel de soja, 35% de leite de vaca e 10% de soro de leite mostrou que durante o armazenamento a qualida-

de físico-química apresentou alterações signicativas, pelo fato da bebida inicialmente já apresentar um baixo valor de pH, a acidez cou bem evidenciada a partir do 7° dia. Constatou-se que no 10° dia de armazenamento, a aparên- cia e homogeneidade permaneceram praticamente inalte- radas, havendo também pouca alteração no aroma global

e ácido, porém o sabor apresentou alterações signicativas

no que diz respeito ao sabor de soja.

Estabilidade microbiológica

A contagem celular mínima de cultura especíca

recomendada para bebidas lácteas fermentadas é de 1,0 x 10 6 células viáveis/mL no momento do consumo (8). Al-

guns autores indicam que a maioria dos produtos lácteos fermentados apresenta-se na faixa de 1 x 10 7 UFC/mL e que este valor poderia ser aceito com o possível limite mínimo para a contagem celular. 10 A Tabela 8 apresenta o compor- tamento da cultura mista da bebida láctea no decorrer do armazenamento.

Tabela 8 Desenvolvimento da cultura mista na bebida lác- tea no decorrer do armazenamento.

Tempo de armazenamento (dias)

Células viáveis

0

7

14

19

22

25

(UFC/mL)

3x10 7

10 7

2x10 6 2x10 6 1x10 6

10 5

A contagem nal, após 22 dias de estocagem, de cé-

lulas viáveis na bebida fermentada mostrou-se dentro dos limites recomendados para este produto, tornando-o atrati- vo como adjunto na dieta humana. Cabe salientar que estas contagens podem ser referentes cultura mista previamente inoculada ou a qualquer um dos microrganismos presentes na referida cultura. As demais determinações microbiológicas foram

efetuadas de acordo com metodologia descrita por Silva et

al. 15 onde se avaliou a presença de coliformes fecais (NMP), salmonella e contagem de bolores e leveduras. O número mais provável de bactérias do grupo coliforme, embora não estabelecido pela legislação, foi determinado, visto que es- tes microrganismos são indicadores das condições higiêni- cas mantidas durante o processamento do produto. O resultado das análises microbiológicas realizadas ao longo do período de armazenamento estão apresentados na Tabela 9. A ausência de bactérias do grupo coliformes e sal- monela indica que as bebidas foram processadas em boas condições higiênico-sanitárias. A presença de bolores e le- veduras fornece informações sobre as condições higiênicas mantidas durante o processamento e estocagem de um ali- mento.

Assim, de acordo com a Resolução n o 12, de 2 ja- neiro de 2001 (Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA), a bebida láctea apresentou padrões microbioló- gicos situados dentro dos limites estabelecidos para leites fermentados, mostrando excelente qualidade microbiológi- ca, mantida durante o período de estocagem estabelecido para cada formulação.

Estabilidade sensorial

Os resultados da Análise Descritiva Quantitativa – Per l de Características da Formulação no decorrer do ar- mazenamento é apresentado na Tabela 10 e Figura 6. No 22° dia de armazenamento constatou-se um li- geiro incremento nos atributos aroma, sabor de soja e ácido. Os resultados mostraram que a bebida láctea fermentada apresentou estabilidade sensorial durante aproximadamen- te 22 dias. Macedo 10 manteve com a formulação base de uma bebida láctea contendo 35% de leite de vaca, 35% de soro de leite de búfula e 30% de extrato hidrossolúvel de soja e a combinação das culturas L. casei shirota e B. adolescentis uma estabilidade físico-química, microbiológica e senso- rial até o 28° dia de armazenamento. Tortelli 16 com a formulação base de 55% de extrato hidrossolúvel de soja, 35% de leite de vaca e 10% de soro de leite e a cultura mista S. thermophilus e L. delbrueckii susbp. bulgaricus, obteve para a bebida láctea desenvolvi- da, estabilidade físico-química, microbiológica e sensorial até o 7° dia de armazenamento.

Tabela 9 – Avaliação da estabilidade microbiológica durante o armazenamento da bebida láctea sabor morango.

Tempo de armazenamento (dias)

 

0

7

14

19

22

25

Coliformes Totais (NMP/mL)

A

A

AAAA

Coliformes Fecais (NMP/mL)

A

A

AAAA

Salmonella (em 25g)

A

A

AAAA

Bolores e leveduras (UFC/mL)

A

A

10 3

2,0x10 2

10 3

5,4x10 3

Tabela 10 Per l de características da bebida láctea fermentada sabor morango durante o período de estocagem, obtido através de análises sensoriais.

Tempo de armazenamento (dias)

Característica

0

7

14

19

22

25

Aparência

Homogeneidade

6,78 b

7,00 a

6,50 b

6,07 b

7,30 a

3,89 b

Aspecto

8,00 a

6,44 b

7,33 a

7,60 a

7,60 a

4,67 b

Textura

Consistência

7,25 a

6,87 a

4,80 b

5,54 a

5,80 a

3,89 b

Aroma

Global

6,60 ab

7,80 a

7,67 b

7,20a

5,80 ab

6,67 ab

Soja

4,00 b

3,67 a

4,00 b

3,64

a

4,57 ab

5,44 ab

Ácido

3,67 a

3,62 a

3,60 a

4,08

a

5,10 a

3,56 a

Sabor

Global

6,87

a

7,22 a

3,12 a

5,53

a

5,50 a

6,11 a

Soja

5,89 a

4,00 a

3,75 a

4,77

a

5,40 a

5,33

a

Ácido

3,00 b

5,00 ab

7,00 a

6,33

a

6,60 a

5,11 ab

51

Avaliação da bebida láctea sabor morango durante o armazenamento Homog. 9 8 Sabor ác. 7
Avaliação da bebida láctea sabor morango durante o
armazenamento
Homog.
9
8
Sabor ác.
7
Aspecto
0
dia
6
5
7
dias
4
3
2
Sabor soja
Consist.
14
dias
1
0
19
dias
22
dias
Sabor global
Aroma Global
25
dias
Aroma ác.
Aroma Soja
FIGURA 7 – Per fi l de características da bebida sabor morango durante o período de armazenamento.

Assim, a bebida láctea desenvolvida neste estudo apresentou um tempo de prateleira signicativo quando comparado aos estudos anteriores, representando um resul- tado satisfatório, considerando o fato de não se ter adicio- nado nenhum conservante no produto.

CONCLUSÕES

O tratamento térmico das matérias-primas mos-

trou-se eciente no controle microbiano, não apresentando alterações signicativas no decorrer do armazenamento, apresentando-se sempre com níveis inferiores ao padrão da Legislação em vigor para bebidas lácteas fermentadas.

O crescimento da cultura mista de S. thermophilus,

L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus e Bidobacterium em caldo MRS atingiu seu máximo crescimento em 4 horas de incubação nas condições de temperatura de 42 o C, sem agitação e com pH inicial de

7,5.

A formulação contendo 30% de extrato hidrosso-

lúvel de soja, 36,6% de leite de vaca e 33,3% de soro de

leite foi adotada como sendo a formulação base ideal deter- minada por análises sensoriais e avaliação do crescimento celular durante a fermentação. Durante o período de armazenamento, a bebida lác- tea sabor morango apresentou células viáveis da cultura mista adicionada dentro dos padrões estabelecidos (1x10 6 ) até o 22° dia.

A bebida láctea manteve a qualidade microbiológica

no decorrer do período de estocagem. A qualidade físico- química apresentou pequenas alterações signicativas, pelo fato da bebida inicialmente já apresentar um baixo valor de pH, a acidez cou bastante evidenciada a partir do 14 o

dia de armazenamento. A qualidade sensorial deniu o tér- mino do armazenamento no 25° dia pelo fato da bebida já apresentar uma acidez bastante elevada, sendo rejeitada nas análises sensoriais. Assim, a bebida láctea sabor morango

52

desenvolvida neste trabalho teve uma vida útil de aproxi- madamente 22 dias.

KRUGER, R.; KEMPKA, A.P.; OLIVEIRA, D.; VALDUGA, E.; CANSIAN, R.L.; TREICHEL, H.; DI LUCCIO, M. Formulation of a probiotic milky drink using as substrates milk whey and soy hidrosoluble extract. Alim. Nutr., Araraquara, v.19, n.1, p. 43-53, jan./mar. 2008.

ABSTRACT: In recent years, fermented milky products from probiotic microorganisms have awakened up a great interest in food industry. These microorganisms are able to stay alive in fermented product and can survive during the gastro-intestinal process, and thus, improve the microbial ora of humans being who consummate regularly these products. In this work, an experimental design is used in investigating the formulation of strawberry fermented milky drink from serum milk, cow milk and soy hidrosoluble extracts. By mean of sensorial analysis, the aromatic degree of the chosen formulation is determined. The formulation with 30% of soy hidrosoluble extract, 36.6% of cow milk and 33.3% of serum milk was dened as ideal in terms of sensorial analysis and evaluation of cell growth. By mean of sensorial, physicist-chemistries and microbiologicals analyses the shelf-life of the product was dened. During the storage period, the fermented milky drink presented viable cells according to the Legislation (1x10 6 UFC/mL). The acidity presented high values from 22 nd of storage. quality dened the shelf life as 25 days, with no addition of conservants, due to the high acidity of the fermented milky drink. The sensorial quality dened the shelf life as 25 days, with no addition of conservants, due to the high acidity of the fermented milky drink.

KEYWORDS: Probiotic; formulation; Bidobacterium; milky drink; soy hidrosoluble extract.

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