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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA


PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS

APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE CROMATOGRAFIA NO


DIAGNÓSTICO TOXICOLÓGICO

Daniel Silva Goulart


Orientador: Maria Clorinda Soares Fioravanti

GOIÂNIA
2012
ii

DANIEL SILVA GOULART

APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE CROMATOGRAFIA NO


DIAGNÓSTICO TOXICOLÓGICO

Seminário apresentado junto à Disciplina


Seminários Aplicados do Programa de Pós-
Graduação em Ciência Animal da Escola de
Veterinária e Zootecnia da Universidade
Federal de Goiás. Nível: Doutorado

Área de concentração:
Patologia Clínica e Cirurgia Animal

Linha de Pesquisa:
Alterações clínicas, metabólicas e toxêmicas
dos animais e meios auxiliares de diagnóstico

Orientador:
Prof. Dr. Maria Clorinda Soares Fioravanti - UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Emmanuel Arnhold - UFG
Prof. Dr. Franklin Riet-Correa Amaral - UFCG

GOIÂNIA
2012
iii

LISTA DE ABREVIATURAS

CCD cromatografia em camada delgada


CG cromatografia gasosa
CG-MS cromatografia gasosa acoplada a espectrofotometria de massa
HPLC cromatografia líquida de alta eficiência
HPLC-FI cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de
fluorescência
HPLC-IR cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a espectrofotometria
de infravermelho
HPLC-MS cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a espectrofotometria
de massa
LC-MS cromatografia liquida acoplada a espectrofotometria de massa
LC-MS/MS cromatografia liquida acoplada a espectrofotometria de massa
acoplada a espectrofotometria de massa
MF monofluoroacetato de sódio
U-HPLC cromatografia líquida de ultra eficiência
U-HPLC-MS/MS cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a espectrofotometria
de massa acoplada a espectrofotometria de massa
UV ultravioleta
WADA Word Anti-Doping Agency
iv

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 3
2.1 Breve histórico.................................................................................................. 3
2.2 Principais tipos de cromatografia ..................................................................... 4
2.2.1 Cromatografia em papel ................................................................................ 4
2.2.2 Cromatografia em camada delgada .............................................................. 5
2.2.3 Cromatografia gasosa ................................................................................... 5
2.2.4 Cromatografia líquida de alta eficiência......................................................... 6
2.2.5 Cromatografia multidimensional .................................................................... 7
2.3 Principais usos da cromatografia ..................................................................... 8
2.4 Uso da cromatografia na toxicologia ................................................................ 9
2.4.1 A cromatografia na toxicologia forense ......................................................... 9
2.4.2 A cromatografia na toxicologia veterinária ................................................... 13
2.4.3 A cromatografia para identificação de substâncias nocivas em alimentos .. 19
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................. 23
REFERÊNCIAS .................................................................................................... 24
1 INTRODUÇÃO

A cromatografia é uma técnica relatada cientificamente há pouco mais


de cem anos e baseia-se na migração de componentes de uma mistura entre
duas fases: a fase estacionária que retém elementos e a fase móvel que conduz a
mistura por meio de um soluto através da fase estacionária. É uma técnica que
pode ser utilizada para purificação de substâncias, na detecção de substâncias ou
auxiliar a separação de substâncias indesejáveis.
As técnicas cromatográficas podem ser divididas principalmente em
cromatografia em papel, cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia
gasosa (CG), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), e mais atualmente a
cromatografia líquida de ultra-eficiência (U-HPLC). Os métodos cromatográficos
podem ser utilizados separadamente ou em conjunto dependendo dos
componentes a serem separados ou identificados.
A cromatografia tem sido desenvolvida e utilizada em diversos meios
da ciência. A química é a área mais atuante no desenvolvimento de métodos
cromatográficos, mas outras áreas da ciência também utilizam dessas técnicas,
sendo elas muito difundidas na área farmacêutica e médica.
Devido à alta precisão e confiabilidade dessas técnicas, elas são muito
utilizadas na detecção ou separação de substâncias que estão em pequenas
quantidades em uma mistura. Assim, na área médica a cromatografia tem grande
utilização na toxicologia, seja para monitorar o uso de medicamento ou para o seu
uso na ciência forense, dosando drogas de abuso e auxiliando a elucidar crimes.
Da mesma forma que ocorre na medicina, na medicina veterinária as
técnicas cromatográficas podem ser empregadas no diagnóstico de doenças e em
estudos de farmacocinética, mas é na toxicologia que a técnica ganha maior
destaque. O estudo toxicológico envolve a identificação de substâncias, seja após
a intoxicação ou em estudos experimentais quando essa identificação pode ser
realizada previamente, certificando que a quantidade de princípio ativo a ser
utilizada esteja correta.
Outro grande interesse para o uso das técnicas cromatográficas na
medicina veterinária é na identificação de resíduos de drogas em produtos de
origem animal. Sabe-se que esses resíduos podem prejudicar o consumidor final,
2

e causar descrédito à cadeia produtiva, assim o monitoramento destes produtos


torna-se de fundamental importância.
Diante da versatilidade do uso da cromatografia e do potencial de sua
utilização na toxicologia, essa revisão teve o intuito de relatar as diferentes
aplicações de métodos cromatográficos no diagnóstico toxicológico, bem como
esclarecer seus usos na toxicologia veterinária.
3

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Breve histórico

A cromatografia foi relatada pela primeira vez há pouco mais de 100


anos por Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919). No período de 1899 à 1901
Tswett trabalhou em sua primeira pesquisa com a estrutura físico-química da
clorofila das plantas, sendo que no ano de 1903 relatou uma nova categoria de
análise adsortiva (ETTRE, 2000). O trabalho de Tswett foi apresentado em forma
de tratado para a Sociedade de Ciências de Varsóvia, no qual descreveu os
resultados preliminares de suas pesquisas com extrato de folhas, utilizando uma
coluna de vidro recheada com carbonato de cálcio, separando os constituintes do
extrato pela passagem de éter dietílico (COLLINS, 2006).
No entanto, as denominações de cromatografia e cromatograma
somente surgiram no segundo trabalho de Tswett, publicado em 1906. A palavra
cromatografia designava o processo de separação, tendo sua origem do grego
chroma, com o significado de ―cor‖, e também do grego graphe, significando
―escrever‖. Já a palavra cromatograma refere-se às bandas separadas na coluna
(COLLINS, 2006; NOGUEIRA, 2006).
Durante os cem anos que se seguiram da publicação de Tswett a
cromatografia passou por grande evolução. Em decorrência da técnica ser
baseada em duas fases (móvel e estacionária) e da possibilidade de utilização de
diferentes componentes nestas fases, a cromatografia demonstrou sua grande
flexibilidade. O controle do fluxo da fase móvel por gravidade, pressão, ação
capilar, eletro-osmose, aliado ao fato de o processo poder ser realizado em
diferentes temperaturas, permitiu que a técnica de separação pudesse ser
aplicada desde pequenos átomos a grandes quantidades de substâncias (ETTRE,
2000).
Assim, a evolução da técnica iniciou-se na cromatografia líquida de
adsorção seguida pela cromatografia de partição. Posteriormente surgiu a análise
de gases e amostras vaporizadas, seguida pelas trocas iônicas, separação por
tamanho molecular e eletrocromatografia (ETTRE, 2000).
4

Mais recentemente a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)


tem sido a técnica analítica mais desenvolvida, difundida e utilizada nos
laboratórios de análises químicas e farmacêuticas. Desta forma, nos últimos 40
anos muitos avanços em relação a esta técnica foram alcançados, impulsionados
pelo desenvolvimento contínuo de novas partículas de fase estacionária, capazes
de gerar colunas mais seletivas, eficientes e química e mecanicamente estáveis
(MALDANER & JARDIM, 2009).
A expansão da HPLC tem sido direcionada ao desenvolvimento de
análises mais rápidas, sem o comprometimento do desempenho cromatográfico.
Assim com a redução do tamanho das partículas da fase estacionária e das
colunas, com partículas menores que 2 µm, surgiu a cromatografia líquida de ultra
eficiência (U-HPLC), sendo esta uma das mais recentes evoluções da técnica
cromatográfica (MALDANER & JARDIM, 2009).

2.2 Principais tipos de cromatografia

2.2.1 Cromatografia em papel

A cromatografia em papel é uma técnica de partição líquido–líquido,


estando um deles fixado a um suporte sólido. Baseia-se na diferença de
solubilidade das substâncias entre duas fases imiscíveis (DEGANI et al. 1998;
ETTRE, 2000). A cromatografia em papel é uma das técnicas mais simples e que
requer menos instrumentos para sua realização, sendo muito útil para a
separação de compostos polares (PERES, 2002).
O papel é composto por moléculas de celulose que possuem afinidade
pela água, mas muito pouca afinidade pela fase orgânica, atuando como suporte
inerte contendo a fase estacionária aquosa (polar). À medida que o solvente
contendo o soluto flui ao longo do papel, uma partição deste composto ocorre
entre a fase móvel (pouco polar) e a fase estacionária. Com o fluxo contínuo de
solvente, o efeito desta partição entre as fases móvel e estacionária possibilita a
transferência do soluto do seu ponto de aplicação no papel para outro ponto
5

localizado a alguma distância do local de aplicação no sentido do fluxo de


solvente (PERES, 2002).

2.2.2 Cromatografia em camada delgada

A cromatografia em camada delgada é uma técnica de adsorção


líquido-sólido, na qual a separação se dá pela diferença de afinidade dos
componentes de uma mistura pela fase estacionária (DEGANI et al., 1998). A
CCD está embasada na separação de substâncias por meio das suas diferentes
velocidades de migração em razão da afinidade relativa com solventes, fixando-se
numa fase sólida (XAVIER et al., 2007). A CCD é um método simples, rápido e
econômico, sendo a técnica predominantemente escolhida para o
acompanhamento de reações orgânicas (DEGANI et al., 1998).
Neste método a fase estacionária é uma camada fina formada por um
sólido granulado (sílica, alumina e poliamida) depositado sobre uma placa que
deve atuar como suporte inerte. Na CCD gotas da solução a ser separada são
aplicadas em um ponto próximo ao extremo inferior da placa. Após a secagem da
placa, ela é colocada em um recipiente contendo a fase móvel, de modo que
somente sua base fique submersa. O solvente começa a molhar a fase
estacionária e sobe por capilaridade. Após o deslocamento da fase móvel deixa-
se a placa secar, e posteriormente é realizada a revelação da placa com reativos
que dêem cor as substâncias de interesse (PERES, 2002).
O parâmetro de maior importância na CCD é o fator de retenção, que é
a razão entre a distância percorrida pela substância e a distância percorrida pela
fase móvel. Esse fator determinará se a substância analisada confere com a
substância padrão (DEGANI et al., 1998).

2.2.3 Cromatografia gasosa

A cromatografia gasosa (CG) é uma técnica com alto poder de


resolução, possibilitando a análise de várias substâncias em uma mesma
6

amostra. Dependendo da substância a ser analisada e do tipo de detector


empregado pode-se detectar cerca de 10-12g do composto por mL-1, o que permite
que pequenas quantidades da amostra sejam analisadas (PERES, 2002).
Esta técnica está baseada na partição dos componentes de uma
amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária líquida ou sólida, que
propiciam a separação da mistura por meio de processos físicos e químicos
(DEGANI et al., 1998; PERES, 2002). A grande limitação deste método é a
necessidade de que a amostra seja volátil ou termicamente estável (PERES,
2002).

2.2.4 Cromatografia líquida de alta eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma técnica


responsável por grandes avanços na área cromatográfica. A HPLC utiliza suporte
com partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência, sendo um método
adequado para separação de espécies iônicas e macromoléculas (DEGANI et al.,
1998). Devido à utilização de colunas com grande capacidade de separação a
realização da HPLC requer a utilização de equipamentos específicos, com o uso
de bombas e colunas que suportem altas pressões necessárias para eluição da
fase móvel. Assim a realização da HPLC necessita da utilização de um
cromatógrafo composto de bomba, coluna cromatográfica, detector e registrador
(DEGANI et al., 1998; PERES, 2002).
Na HPLC a fase móvel deve ser um solvente que dissolva a amostra
sem que qualquer interação química ocorra entre ambas. A fase estacionária
dever ser compatível com o detector, possuindo polaridade adequada para
permitir a separação adequada dos componentes da amostra. Já a coluna
cromatográfica deve ser confeccionada de material inerte e que resista a altas
pressões. Por fim os detectores devem apresentar ampla faixa de aplicação,
sendo que os mais utilizados são os espectrais (PERES, 2002).
Recentemente a evolução das colunas e da fase estacionária permitiu
o uso de partículas muito pequenas, desenvolvendo assim a cromatografia líquida
de ultra eficiência (U-HPLC). A U-HPLC é um método cromatográfico com
7

análises mais rápidas, consumo menor de solventes e com eficiência muito mais
elevada que a HPLC. No entanto, apesar de todas as vantagens da U-HPLC, o
custo do equipamento e a manutenção requerida devido a utilização de condições
extremas de pressão requer ainda maior desenvolvimento da técnica
(MALDANER & JARDIM, 2009).

2.2.5 Cromatografia multidimensional

A cromatografia multidimensional é a utilização de técnicas de


separação associadas a técnicas de detecção. Na cromatografia multidimensional
é comum a utilização de hífen para associar as técnicas utilizadas, assim é
comum o surgimento de diferentes siglas para denominar as técnicas (MÜHLEN
et al., 2006).
A cromatografia multidimensional, também denominada de
cromatografia hifienizada em outros países, combina técnicas cromatográficas e
métodos espectrais, de forma que as vantagens de ambos possam ser
aproveitadas. A cromatografia produz frações puras ou próximas da pureza de
substâncias químicas. Já a espectrofotometria pode produzir informações
seletivas para identificação destas substâncias usando padrões ou bibliotecas
espectrais (PATEL et al., 2010). Desta forma a combinação dessas duas técnicas
tem melhorado substancialmente a análise de substâncias nas últimas duas
décadas (CHINCHOLE et al., 2012).
Diante do acoplamento da cromatografia a técnicas espectrais várias
siglas surgiram, sendo as mais utilizadas listadas a seguir a: cromatografia líquida
de alta eficiência acoplada a espectrofotômetro de massa (HPLC-MS),
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectroscopia de
infravermelha (HPLC-IR), cromatografia gasosa acoplada a espectrofotometria de
massas (GC-MS), entre inúmeras outras que surgem a cada método publicado
(PATEL et al., 2010; CHINCHOLE et al., 2012).
8

2.3 Principais usos da cromatografia

A cromatografia tem sido utilizada em diferentes áreas do


conhecimento. A grande sensibilidade de técnicas cromatográficas possibilitou o
seu uso de forma rotineira em análise de substâncias em baixa concentração,
como no caso do doping, controle de alimentos e medicamentos, contaminação
ambiental, na toxicologia entre muitas outras aplicações (NAKASHIMA, 2005;
ANVISA, 2012; CHINCHOLE et al., 2012; GILBERT-LÓPEZ et al., 2012; XU et al.,
2012).
A química é a área na qual as técnicas cromatográficas são mais
utilizadas, sendo muitos os trabalhos publicados que a empregam. Pode ser
utilizada para dosar compostos em alimentos (GILBERT-LÓPEZ et al. 2012; XU et
al., 2012), no monitoramento de componentes tóxicos no meio ambiente
(MARRIOTT et al., 2003) ou mesmo na indústria petroquímica (MÜHLEN et al.,
2006). Dessa forma é difícil definir em qual área dentro dessa ciência que mais se
utiliza das técnicas cromatográficas.
Na área farmacêutica a cromatografia também tem vasto campo de
utilização. Pode ser empregada para dosar princípios ativos de drogas em
medicamentos (ANVISA, 2012), isolar componentes medicinais de plantas (LÜ et
al., 2012), auxiliar em estudos de farmacocinética (AMORIM et al., 2008; GIORGI
et al., 2009), validar técnicas de identificação de agentes (AMORIM et al., 2008),
entre inúmeros outros usos.
Na medicina a cromatografia é utilizada para realização de exames
anti-doping (NAKASHIMA, 2005; CHINCHOLE et al., 2012), monitorar níveis de
drogas em pacientes que estejam em tratamento (VERDIER et al., 2012), realizar
diagnóstico de enfermidades (JELLUM, 1988; JEONG et al., 2009), em estudos
forenses e na toxicologia (NAKASHIMA, 2005; CHINCHOLE et al., 2012).
Na medicina veterinária a cromatografia tem a possibilidade de ser
utilizada em diversos meios, como em estudos de farmacocinética (AMORIM et
al., 2008), para monitorar resíduos de drogas em produtos de origem animal
(CARDOSO et al., 1999; FELTRIN et al., 2007; ANVISA, 2009), na toxicologia
(KAISER et al., 2010; OLIVEIRA-FILHO et al., 2010; LEE et al., 2012), entre
outros.
9

2.4 Uso da cromatografia na toxicologia

2.4.1 A cromatografia na toxicologia forense

O termo ―ciência forense‖ abrange profissões envolvidas na aplicação


de ciências sociais e físicas no sistema de justiça criminal. O cientista forense
precisa esclarecer, com mínimos detalhes, os fatos ocorridos no sistema criminal
utilizando para isso técnicas especializadas para se chegar a conclusões (WOOD
et al., 2006). Deste modo a análise de traços de substâncias exige métodos que
garantam um alto nível de confiabilidade, pois os resultados finais exercem
influência direta sobre o destino de um determinado indivíduo. Assim, o uso da
cromatografia associada a técnicas espectrais é de grande importância para a
detecção de drogas de abuso, para análises toxicológicas sistemáticas (WOOD et
al., 2006; CHINCHOLE et al., 2012), para identificação de drogas utilizadas em
doping (CHINCHOLE et al., 2012) e para identificar a causa mortis (MAURER,
1999).
As metodologias para identificação do consumo de drogas ilícitas têm
sido desenvolvidas com o auxilio da cromatografia associada a diferentes técnicas
espectrais, devido à possibilidade da utilização destas para identificação de
pequenas quantidades de inúmeras substâncias em diferentes matrizes.
Exemplos de matrizes que podem ser utilizadas na identificação de drogas de
abuso são sangue, urina, fluidos orais, cabelo e o mecônio, utilizado para
monitoração do uso de drogas durante a gravidez (CHINCHOLE et al., 2012).
A urina é a matriz biológica mais comumente utilizada nas análises
toxicológicas (ABRAHAM & LUTY, 2010). Assim, testes cromatográficos podem
determinar inúmeras substâncias nesta matriz. Em teste toxicológico em urina
humana, com o intuito de avaliar técnicas cromatográficas, pesquisadores
identificaram simultaneamente oito diferentes drogas de abuso ou seus
metabólitos, entre elas estavam metanfetamina, anfetamina, morfina, cocaína e
seu principal metabólito a bezoilecgonina (TATSUNO et al., 1996).
Em um estudo mais recente foi possível identificar simultaneamente 13
substâncias de abuso e seus metabólitos em amostras de urina humana. Os
10

pesquisadores utilizaram a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao


espectrofotômetro de massa (HPLC-MS). Eles ainda ressaltaram a importância da
técnica por eliminar a necessidade de testes de triagem e confirmatórios
(DUXBURY et al., 2010).
Apesar de a urina ser comumente utilizada, outra matriz biológica muito
utilizada na toxicologia forense é o sangue. Pesquisadores estudaram a
identificação das principais drogas de abuso utilizadas em festas ―Rave‖ em
amostras de sangue humano preparadas com princípios ativos e em amostras
provenientes do Forensic Pathology Department ou do Medico-Legal Department
of the North Branch of the National Institute of Legal Medicine. No estudo pôde-se
identificar por meio da cromatografia gasosa acoplada a espectrofotometria de
massa a metadona, cetamina, buprenorfina, entre outras drogas de abuso
(CASTRO et al., 2012).
Em outra pesquisa utilizando a CG-MS, empregando amostras de
sangue humano preparadas com os princípios ativos a serem estudados, os
pesquisadores puderam identificar simultaneamente sete tipos de anfetaminas.
Para comprovar a aplicação do teste na toxicologia forense, os pesquisadores
utilizaram uma amostra de sangue obtida de um cadáver humano que teve a urina
positiva para a presença de anfetamina. Nessa amostra utilizou-se a mesma
técnica utilizada no experimento isolando simultaneamente duas anfetaminas,
demonstrando a eficácia da técnica (KUMAZAWA et al., 2012).
No entanto, há testes que podem utilizar tanto o sangue como a urina,
como ocorreu em estudo no qual se identificaram nove tipos de fentanila e 16
outros opioides nessas duas matrizes biológicas de forma confiável em casos de
morte, óbitos que ocorrem durante a hospitalização e em mortes súbitas em
jovens (GERGOV et al., 2009).
O cabelo também pode ser utilizado como matriz biológica na pesquisa
do uso de drogas de abuso. Em um trabalho foi relatado à determinação
quantitativa de 13 drogas de abuso e de seus metabólitos em amostras de cabelo
humano, por meio da HPLC-MS. Os pesquisadores enriqueceram as amostras de
cabelo, provenientes de indivíduos que não eram usuários de drogas, com os
princípios ativos que seriam posteriormente pesquisados. Após, as amostras
foram extraídas e as substâncias alvo da pesquisa puderam ser identificadas.
11

Apesar de as amostras de cabelo do estudo terem sido enriquecidas com os


princípios ativos, os pesquisadores relataram que utilizam a mesma técnica na
rotina do laboratório, obtendo eficácia semelhante à atribuída no estudo (DI
CORCIA et al., 2012).
Em outro estudo envolvendo carabinoides, os quais são substâncias
que induzem efeitos semelhantes ao tetraidrocanabinol (principal substância
psicoativa encontrada nas plantas do gênero Cannabis), os pesquisadores
conseguiram isolar 22 substâncias dessa classe em cabelo humano. Foram
utilizadas tanto amostras embebidas com substâncias padrão como amostras de
usuários crônicos de substâncias com carabinoides em sua composição. Nas
amostras preparadas foi possível isolar os 22 carabinoides envolvidos na
pesquisa, e nas amostras dos usuários foi possível também isolar carabinoides
em todas as oito amostras testadas (HUTTER et al., 2012).
Outra utilização da cromatografia na toxicologia forense são os casos
em que se utiliza drogas para a prática de crimes. A vítima recebe determinada
substância que cause sonolência, amnésia ou inconsciência e é roubada ou até
mesmo sofre abuso sexual. Assim, métodos cromatográficos acoplados a
espectrofotometria de massa podem identificar simultaneamente 128 ou mais
drogas. Em um estudo, pesquisadores conseguiram isolar de uma amostra de
urina enriquecida com 128 padrões das drogas utilizadas nestes crimes, entre
elas estavam opioides, anfetaminas, barbitúricos, alucinógenos,
benzodiazepínicos, relaxantes musculares e outras drogas (ADAMOWICZ &
KALA, 2010).
Testes semelhantes ao descrito anteriormente podem também serem
aplicados no sangue. Pesquisadores utilizaram da U-HPLC associada ao
espectrômetro de massa para identificar 46 compostos utilizados na facilitação de
crimes ou de drogas de abuso no sangue de vítimas de abuso sexual (BIRKLER
et al., 2012).
Apesar do uso de matrizes biológicas como o sangue e a urina,
algumas vezes não há a disponibilidade de tecidos em bom estado de
conservação, como no caso de corpos que são encontrados em avançado estado
de decomposição. Nestes casos, a detecção de substâncias que possam estar
envolvidas na causa da morte pode ser realizada em larvas de insetos (BEYER et
12

al., 1980; GOSSELIN et al., 2010), que se alimentam dos tecidos em


decomposição, a qual pode ser realizada por meio da cromatografia (BEYER et
al., 1980).
O primeiro trabalho que relatou o uso da cromatografia para
identificação de compostos relacionados com a morte do indivíduo em larvas de
insetos, foi publicado em 1980. O trabalho descreveu um caso de um corpo que
foi encontrado aproximadamente 14 dias após a morte e estava em avançado
estado de decomposição. Havia a suspeita de suicídio pelo consumo de uma alta
dose de fenobarbital, no entanto não havia tecido humano para se realizar os
testes toxicológicos. Os pesquisadores coletaram larvas de insetos que se
alimentavam do cadáver, extraíram a amostra e realizaram a CG e CCD,
confirmando a overdose por fenobarbital (BEYER et al., 1980).
Em outro trabalho semelhante os pesquisadores utilizaram de tecido
cerebral de ratos e suínos e de larva de Lucilia sericata. Inicialmente eles
administraram metilfenidato por via intravenosa nos ratos e posteriormente
realizaram a eutanásia, separando o cérebro no qual foram colocadas as larvas
de insetos. No tecido cerebral de suínos o metilfenidato foi adicionado
diretamente, com posterior colocação das larvas. Nas larvas dos dois tipos de
tecido testado foi possível o isolamento do metilfenidato por cromatografia líquida
associada ao espectrofotômetro de massa. Assim o método mostrou-se como
alternativa toxicológica para o estudo do metilfenidato em larvas encontradas em
corpos em decomposição (BUSHBY et al., 2012).
No controle do doping em atletas o principal objetivo do emprego das
técnicas de cromatografia é a monitorização do uso ou do abuso de drogas que
podem estimular o crescimento muscular, aumentar a resistência em
competições, reduzir o peso corporal ou reduzir a dor causada por esforço
excessivo. (MAURER, 1999; BRABANTER et al., 2011; THOMAS et al. 2011;
DESHMUCK et al. 2012; THOMAS et al., 2012; WADA, 2012).
O uso de desmopressina é proibido entre atletas de elite, por mascarar
a ação de drogas diuréticas (WADA, 2011). Diante disto pesquisadores
desenvolveram, por meio da cromatografia acoplada ao espectrofotômetro de
massa, um teste para detecção de demospressina na urina humana, e
13

consideraram a técnica adequada para laboratórios que trabalham com o controle


de doping (THOMAS et al., 2011).
Além da desmopressina inúmeros outros compostos são proibidos para
atletas de elite e estão listados na The 2012 Prohibited List da World Anti-Doping
Agency (WADA, 2011). A WADA foi criada em 1999 como agência independente,
financiada pelo movimento desportivo de diferentes governos do mundo, e
estabelece que muitos dos testes anti-doping utilizem da cromatografia acoplada
a técnicas espectrométricas. Ela tem como objetivo a pesquisa científica,
desenvolvimento de métodos de detecção de doping e acompanhamento do
código mundial anti-doping (WADA, 2012), demonstrando assim a importância
das técnicas cromatográficas neste tipo de exame.

2.4.2 A cromatografia na toxicologia veterinária

Na medicina veterinária a cromatografia tem larga utilização em


estudos que trabalham com intoxicações, seja para monitorar princípios ativos
(LEE et al., 2012) ou para identificar substâncias causadoras de intoxicações em
animais (KAISER et al., 2010; OLIVEIRA-FILHO et al., 2010; RIVERO et al.,
2011).
Nos casos das intoxicações, é de fundamental importância identificar
os princípios ativos envolvidos, com o intuito de evitar que novos episódios
ocorram, que a terapêutica a ser utilizada seja a mais adequada e é indispensável
em situações que envolvam litígio. Nas intoxicações, os animais podem, muitas
vezes, apresentar sinais agudos e morte rápida, sem que o agente causador seja
identificado. No entanto, a identificação da droga ou veneno pode preservar a vida
de outros animais (XAVIER et al., 2007).
Em intoxicações causadas intencionalmente a cromatografia pode
auxiliar e até mesmo servir como prova da causa mortis. Em um estudo que
envolveu 50 amostras do conteúdo gástrico de cães e gatos, que possuíam como
hipótese diagnóstica a intoxicação exógena por aldicarb, foi realizada a
cromatografia em camada delgada como teste qualitativo quanto à presença
desta substância. O estudo envolveu ainda 50 amostras de alimentos que
14

continham material sugestivo do agente tóxico, as quais tinham sido utilizadas


como iscas para intoxicar animais. Todas as amostras testadas por CCD, tanto o
conteúdo gástrico como os alimentos, foram positivas para a presença do
aldicarb, que demonstrou a adequação da técnica para o auxílio no diagnóstico de
intoxicações (XAVIER et al., 2007).
Em outro estudo, em amostrais estomacais de cães e gatos,
envolvendo a intoxicação por pesticidas domésticos e raticidas, 68 amostras
foram analisadas por meio da CCD para detecção de carbamatos, warfarina e
estricnina, e por HPLC para detecção de diferentes carbamatos. As amostras
eram provenientes do Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal de
Santa Maria, e foram recebidas como casos fatais suspeitos de intoxicações. No
estudo foi possível confirmar que em 54,4% das amostras havia substâncias
tóxicas, sendo 39,9% carbamato, 4,4% warfarina, 8,8% estricnina e 1,4%
fluoroacetato de sódio (BULCÃO et al., 2010).
Apesar de muitas vezes as intoxicações em pequenos animais serem
causadas intencionalmente (XAVIER et al., 2007; BULCÃO et al., 2010) muitas
podem ocorrer ao acaso, sem causa aparente, de forma aguda, o que pode
rapidamente causar a morte dos animais. Em um caso em que dois cães
apresentaram sinais de intoxicação aguda, com morte de um dos animais poucas
horas após o aparecimento dos sintomas, foi diagnosticada a intoxicação por
pentobarbital por meio da CG-MS. Neste caso após a morte de um dos animais
foi realizada a necropsia quando foi encontrando grande quantidade de carne
crua e pêlos de cavalo, material o qual foi utilizado para o diagnóstico
toxicológico. A urina do animal que sobreviveu e do que veio a óbito foram
submetidos a CG-MS, o que revelou a presença de pentobarbital. Ao investigar as
proximidades da propriedade o proprietário dos animais encontrou um equino
parcialmente enterrado que tinha sido submetido a eutanásia, dois anos antes,
com grande quantidade do fármaco. Parte da carcaça do animal foi submetida a
CG-MS quando foi encontrada concentração de 4.000 ppm de pentobarbital no
tecido muscular do animal. Além do equino, outra carcaça de cão foi encontrada
em local próximo, da qual também foi detectada a presença de pentobarbital no
conteúdo gástrico. Assim os autores concluíram que a causa das intoxicações dos
15

animais foi pelo consumo da carne do animal que foi submetido a eutanásia
(KAISER et al., 2010).
Além dos pesticidas domésticos serem causas de intoxicações em
pequenos animais, outras causas seriam a ingestão de plantas que contém
toxinas (MOUSER et al., 2007) ou quando atacam animais venenosos (SONNE et
al., 2008).
Os cães, principalmente, têm o histórico de atacarem sapos do gênero
Bufo, que possuem toxinas que podem ocasionar o óbito do animal (REEVES,
2004). Em um caso, um cão foi encontrado morto pelo proprietário e o corpo do
animal foi encaminhado para o Setor de Patologia Veterinária da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul. No exame macroscópico e microscópico as
alterações foram inespecíficas, achados comumente encontrados em diferentes
tipos de intoxicações. O conteúdo gástrico, estômago, fígado e rins foram
coletados para a análise toxicológica. Para isso, foi utilizada a CCD e
cromatografia gasosa com detector de ionização de chama. As análises foram
negativas para a detecção de cumarínicos, arsênico, estricnina, organofosforados,
carbamato, cianeto e nitritos. No entanto, no ambiente onde o animal habitava,
foram encontrados sapos do gênero Bufo e por isso se desconfiou de um possível
envenenamento por toxinas expelidas pelo anfíbio. Assim os pesquisadores
realizaram a análise toxicológica por meio da utilização do veneno retirado das
glândulas do sapo como padrão de referência, confirmando o diagnóstico pela
CCD e pela CG (SONNE et al., 2008).
Plantas tóxicas presente nos quintais, utilizadas como plantas
ornamentais, como a Ricinis communis (mamona), podem estar envolvidas nas
intoxicações em pequenos animais (MOUSER et al., 2007). A R. communis é
considerada um das mais fortes plantas tóxicas e é listada na categoria B de
agente de bioterrorismo pela Center for Disease Control and Prevention (CDC,
2000). Em um relato envolvendo um cão Mastiff de 12 semanas, que morreu após
ingerir sementes de R. communis, foi utilizado LC-MS para confirmar o
diagnóstico por meio de amostras do conteúdo estomacal na qual foi confirmada a
presença de ricinina (MOUSER et al., 2007).
Em animais de produção as intoxicações geralmente ocorrem em
forma de surtos e é de grande interesse que a causa do surto seja esclarecida,
16

nesses casos, o emprego da cromatografia pode ser muito útil. Neste sentido a
cromatografia tem sido utilizada para detecção dos agentes envolvidos nestes
surtos. Os organofosforados são inseticidas que podem ser utilizados no combate
a ectoparasitas, no entanto a não observância da recomendação do fabricante
pode causar intoxicações em animais. Um relato de atendimento clínico a 26
animais pulverizados com uma sobredose de diazinon, no qual 11 animais vieram
à óbito, obteve-se o diagnóstico confirmado por meio da CCD. Apesar do histórico
e dos sinais clínicos dos animais, durante a necropsia de dois bovinos adultos não
foi possível constatar nenhuma alteração nos exames macro e microscópicos que
fossem dignos de nota. Mas os pesquisadores conseguiram detectar, por meio da
CCD, o princípio ativo em amostras de fígado e cérebro de um dos animais
necropsiados (CASTRO et al., 2007).
Em outro surto de intoxicação por organofosforados envolvendo 26
animais dos quais 20 vieram a óbito, foi feito o uso da cromatografia em camada
delgada como método qualitativo e a cromatografia gasosa como método
quantitativo. Este surto ocorreu em uma propriedade vizinha de uma empresa de
pulverização agrícola. Devido aos sinais clínicos dos animais e ao histórico
relatado pôde-se realizar técnicas cromatográficas para confirmar a suspeita,
após isolamento de carbamato e organofosforado dos órgãos dos animais. A
análise quantitativa por cromatografia gasosa para carbamato e organofosforados
no conteúdo do abomaso de um animal detectou 0,93 µg/g de mancozebe e
0,07µg/g de forato (OLIVEIRA-FILHO et al., 2010).
No Uruguai houve um surto de intoxicação por organoclorados
(endosulfan) com a morte de 51 bovinos, o qual pôde ser totalmente esclarecido
por meio das técnicas cromatográficas. O surto ocorreu após um avião de
pulverização agrícola ter perdido acidentalmente sua carga com solução contendo
o princípio. Na tarde do dia do incidente os animais foram liberados para o pasto
contaminado com a solução. Após 24 horas, os animais apresentaram os sinais
clínicos de intoxicação e os técnicos do Laboratório Regional Noroeste da Direção
de Laboratórios Veterinários do Ministério de Agricultura e Pesca do Uruguai foi
chamado para visitar a propriedade e colher amostras de água, peixes mortos e
de seis animais que foram necropsiados para determinação dos metabólitos
tóxicos. Nas amostras utilizou-se a técnica de cromatografia gasosa,
17

identificando-se o endosulfan no tecido adiposo, fígado, conteúdo ruminal dos


bovinos, nos peixes mortos e na água de um riacho que também foi atingido
(RIVERO et al., 2011).
A cromatografia pode também ser utilizada em estudos experimentais
na qual muitas vezes há a necessidade de dosar princípios ativos dos agentes
envolvidos na pesquisa. Em estudo com Bacharis megapotamica var. weirii, em
búfalos, os pesquisadores conseguiram induzir a intoxicação em todos os cinco
animais do experimento, sendo que quatro morreram com 18-49 horas após a
ingestão da planta. Neste estudo uma subamostra de B. megapotamica var. weirii
foi separada para dosagem de tricotecenos macrocíclicos. Para tanto foi utilizada
a U-HPLC com espectrometria de tempo-de-vôo de alta resolução e
espectrometria de massa. Por esta técnica foi possível dosar 51 tricotecenos
macrocíclicos, e os pesquisadores chegaram à conclusão que a técnica utilizada
provou ser uma técnica eficaz para dosagem desses compostos (OLIVEIRA-
FILHO et al., 2012).
O consumo de plantas tóxicas é responsável por grande número de
morte em animais (RIET-CORREA & MEDEIROS, 2001), e estudos são
norteados na tentativa de esclarecer as causas da morte (KUPPER et al., 2010)
ou os princípios envolvidos na intoxicação (MOUSER et al., 2007).
Pesquisadores de Zurique, Suíça, relataram um caso em que uma
novilha apresentou sinais de intoxicação. O animal foi tratado com carvão vegetal
e fluidoterapia intravenosa. Após leve melhora a novilha foi a óbito três dias após
o início dos sintomas. No histórico do animal sabia-se que o mesmo teve acesso
a um pasto úmido pertencente à área de conservação da propriedade, o qual
tinha presença de Colchicum autumnale, uma planta tóxica da região. Ao
inspecionar a pastagem pôde-se observar que essas plantas haviam sido
pastejadas. Para confirmar o diagnóstico a urina e sangue do animal foram
colhidos, dois dias após o início dos sintomas, e submetidos a LC-MS/MS,
quando foi confirmada a presença da principal toxina dessa planta, a colchicina
(KUPPER et al., 2010).
No Brasil várias plantas são incriminadas de causar morte súbita nos
animais. Dentre estas plantas encontram-se as Mascagnia rigida hoje nomeada
de Amorimia rigida (CUNHA et al., 2012) e a Pallicourea marcgravii (BARBOSA et
18

al., 2003). Muitos autores associam a morte súbita à presença da substância


tóxica monofluoroacetato de sódio (MF) ou ácido monufluoracético, o qual tem
sido identificado em diversos estudos por meio de técnicas cromatográficas
(CUNHA et al., 2012; LEE et al., 2012).
Em estudo recente os pesquisadores conseguiram isolar o MF, por
meio de HPLC acoplada a um espectrômetro de massa, com interface APCI
(ionização química à pressão atmosférica), de amostras de folhas maduras P.
marcgravii provenientes dos Estados de Goiás e São Paulo, nas concentrações
de 0,10 e 0,17% respectivamente. Neste mesmo estudo utilizando a mesma
técnica também foi possível isolar o MF de algumas espécies Amorimia, no
entanto em concentrações bem menores que a descrita para P. marcgravii. (LEE
et al., 2012). Em outro estudo envolvendo A. rigida, amostras da planta foram
colhidas no município de Cabeceira, Estado da Paraíba. Neste também foram
identificados o MF, no entanto, foi eles utilizada a CCD e a espectofotometria de
infravermelho como técnicas para avaliação da presença de MF (CUNHA et al.,
2012).
Além das plantas que causam intoxicações agudas nos animais
(BARBOSA et al., 2003; CUNHA et al., 2012), há um outro grupo de plantas no
Brasil que causam fotossensibilização e intoxicações crônicas nos animais
(ALBERNAZ et al., 2010; SOUZA et al., 2010). Uma das teorias é que a saponina,
produzida por espécies de gramíneas utilizadas em pastagens, esteja envolvida
na patogenia da doença (BRUM et al., 2007).
O Panicum dichotomiflorum é uma das plantas, que contêm saponinas,
incriminadas de causarem fotossensibilização hepatógena nos animais. Em um
surto de fotossensibilização em três rebanhos de ovinos no município de Casa
Nova, no Estado da Bahia, foi utilizada da HPLC acoplada a espectrofotometria
para avaliarem a presença de saponinas no P. dichotomiflorum. No surto de 365
animais, que foram alocados na pastagem, 81 foram afetados pela
fotossensibilização e 39 morreram. Foram colhidas duas amostras da pastagem
e realizaram CCD e a HPLC acoplada a espectrofotômetro. Após a análise os
autores puderam identificar a presença de protodioscina e metilprotodioscina, o
que sugeriu que o surto de fotossensibilização foi causado por estas saponinas
(RIET-CORREA et al., 2009).
19

O gênero Brachiaria também tem sido associado a casos de


intoxicação crônica causando uma perda progressiva de peso nos animais ou
casos de fotossensibilização (SOUZA et al., 2010). Em uma pesquisa envolvendo
a intoxicação por Brachiaria, em que foram avaliados dois surtos de intoxicação
em um experimento com cordeiros em pastagem com a mesma gramínea, foi
determinada a presença de saponinas por meio da CCD como meio qualitativo e
HPLC acoplado a um detector de evaporação por dispersão de luz como análise
quantitativa. Os pesquisadores encontraram valores de metilprotodioscina que
variaram de 0,92 a 1,13%, e de protodioscina de 0,88 a 1,62% (ALBERNAZ et al.,
2010).
Além dos casos em que a intoxicação por Brachiaria já esteja instalada,
a cromatografia tem auxiliado pesquisas para que seja determinado os fatores
envolvidos na produção de saponinas. Em estudo realizando a CCD como
método qualitativo e a espectrofometria como método quantitativo, foi possível
estabelecer que, no período de 2002 a 2003, em canteiros plantados com B.
brizantha e B. decumbens, os maiores níveis de saponinas ocorreram na fase
mais madura da planta, sugerindo que os animais estão mais sujeitos a
intoxicação durante esta fase (BRUM et al., 2009).

2.4.3 A cromatografia para identificação de substâncias nocivas em alimentos

A ausência de Boas Práticas Veterinárias na criação de animais de


produção pode acarretar o uso indiscriminado de medicamentos sem a
preocupação do resíduo destes no produto final o que pode significar risco à
saúde pública (ANVISA, 2006; ANVISA, 2009). Esses riscos podem ser
traduzidos pela ocorrência de resistência bacteriana (ANVISA, 2006; ANVISA,
2009), reações alérgicas que podem ocasionar choque anafilático (ANVISA,
2009), entre outros. Assim a utilização da cromatografia tem auxiliado na
detecção destas substâncias em produtos de origem animal (CARDOSO et al.,
1999; FELTRIN et al., 2007; ANVISA, 2009).
Os resíduos de antibióticos são quaisquer substâncias, mistura de
antibióticos, derivados específicos, metabólitos ou produtos de reação dos
20

antibióticos presentes nos alimentos para o homem ou para os animais, que


possam ser considerados de importância toxicológica (MANJARREZ et al., 2012).
No entanto, há relativamente poucos métodos analíticos capazes de medir as
concentrações residuais de muitos antibióticos. A baixa solubilidade de alguns
antibióticos em solventes orgânicos torna difícil o desenvolvimento de técnicas
para extrair seus resíduos de matrizes biológicas. Outros antibióticos são
demasiadamente instáveis termicamente ou insuficientemente voláteis para
serem processados por CG ou CG-MS. Dessa forma várias técnicas de detecção
de resíduos de antibióticos foram desenvolvidas utilizando HPLC. Apesar disso,
muitas vezes somente a HPLC não é suficiente para detecção de traços desses
medicamentos, sendo necessário associar a espectrofotometria de massas
(KENNEDY et al., 1998). Assim, muitos pesquisadores têm publicado trabalhos
que descrevem a detecção de antibióticos por técnicas cromatográficas (FELTRIN
et al., 2007; PIETRÓN et al., 2011; MANJARREZ et al., 2012).
Em um estudo que trabalhou com resíduos de sulfadimetoxina, os
pesquisadores detectaram resíduos do referido medicamento por HPLC. No
estudo as amostras de leite foram enriquecidas com solução padrão de
sulfadimetoxina, posteriormente foi realizada a extração com cartucho comercial
específico. Após a extração, as amostras foram submetidas a um cromatógrafo
líquido de alta eficiência com detector ultravioleta (UV). Por meio dessa técnica foi
possível recuperar entre 76 a 90% do padrão comercial adicionado à amostra
(FELTRIN et al., 2007).
Outro grupo de antibióticos muito utilizado em animais de produção são
as penicilinas. Estima-se que 3 a 10% da população sejam susceptíveis a reações
alérgicas quando expostas à alimentos contendo esse grupo de medicamentos
(ANVISA, 2009). Deste modo a cromatografia tem sido utilizada como ferramenta
de apoio na detecção de penicilinas em produtos de origem animal.
Pesquisadores utilizaram amostras de leite e carne enriquecidas com penicilina G,
oxacilina e cloxacilina. As amostras foram extraídas e posteriormente submetidas
a HPLC com detector UV. Os autores puderam concluir que os métodos para
determinação simultânea de penicilinas no leite e carne apresentaram resultados
favoráveis (KUKUSAMUDE et al., 2012).
21

Além dos antibióticos, outras drogas podem ser utilizadas no


tratamento dos animais de produção, como os antiinflamatórios e antihelmínticos,
no entanto elas também podem deixar resíduos nos produtos finais (SOUZA et
al., 2003; LOBATO et al., 2006; GENTILI et al., 2012). Recentemente foi utilizado
a cromatografia líquida acoplada ao espectofotômetro de massa, o que permitiu a
detecção simultânea de 15 diferentes agentes antiinflamatórios não esteroidais,
no leite e músculo de bovinos (GENTILI et al., 2012).
Já em relação aos antihelmínticos, pesquisadores utilizaram a HPLC
ligada a detector de fluorescência para dosar resíduos de ivermectinas no fígado
de bovinos. Os pesquisadores utilizaram fígado livre de resíduos dessas drogas,
separaram as amostras e posteriormente enriqueceram-nas com abamectina,
doramectina e ivermectina. Após a extração das amostras, o extrato derivativo foi
analisado por HPLC-FI. A taxa de recuperação para as amostras adicionadas de
solução padrão foi de 101,1; 101,0 e 96,7%, com coeficientes de variação de
11,2; 9,2 e 12,5% para abamectina, doramectina e ivermectina, respectivamente
(SOUZA et al., 2003). Em outro estudo pesquisadores colheram 168 amostras de
leite que estavam sendo comercializadas em supermercados de Campinas – SP e
da região metropolitana do Rio de Janeiro. Essas amostras foram analisadas por
HPLC com detector por fluorescência, e foi detectado que 17,8% das amostras
eram positivas para ivermectinas, no entanto as amostras não continham resíduos
em quantidade superior aos estabelecidos pelo Ministério da Agricultura Pecuária
e Abastecimento (LOBATO et al., 2006).
Outros agentes tóxicos comuns de alimentos de origem animal são as
micotoxinas. Essas toxinas podem ser transmitidas para os alimentos após o
consumo de rações contaminadas. Devido a isso pesquisadores têm utilizado de
métodos cromatográficos para detecção desses contaminantes (NETTO et al.,
2002). Em um estudo realizado com 75 amostras de queijo foram detectadas, por
meio de HPLC usando detector de fluorescência, que 56 (74,7%) estavam
contaminados com aflotoxina M1 (PRADO et al., 2000). Em outra pesquisa foi
realizado teste para detectar as aflotoxinas no leite de bovinos. A HPLC foi
utilizada e puderam constatar que 19 (52,8%) amostras estavam contaminadas,
mas os níveis da aflotoxina M1 estavam dentro dos padrões tolerados pela
legislação brasileira (PEREIRA et al., 2005).
22

Por fim, há drogas que por vezes são utilizadas, mas sem autorização
para seu emprego no Brasil. Dentre elas estão os esteroides anabolizantes, os
quais também podem deixar resíduos nos produtos de origem animal. Diante
disto, métodos cromatográficos são importantes ferramentas para a análise
dessas drogas (DUARTE et al., 2002). Com auxílio da cromatografia líquida de
ultra eficiência associada a espectrofotometria de massa pesquisadores puderam
desenvolver metodologia para detectar simultaneamente 34 anabolizantes
esteroides em músculo bovinos. No estudo, amostras de tecido muscular bovino,
livres destas drogas foram enriquecidas com padrões das mesmas,
posteriormente as amostras foram extraídas e submetidas a U-HPLC-MS/MS,
quando os esteroides anabolizantes foram identificados (VANHAECKE et al.,
2012).
23

3 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O uso da cromatografia abrange muitas áreas do conhecimento, e suas


funcionabilidades são inumeráveis. Os trabalhos envolvendo essas técnicas
multiplicam-se dia a dia, o que torna difícil acompanhar sua evolução nas
diferentes áreas.
Na medicina veterinária, apesar do uso estar relatado em diferentes
áreas, seu emprego está restrito a área toxicológica e na detecção de
contaminantes de alimentos de origem animal. Mesmo na área toxicológica a
quantidade de trabalhos que utilizam diretamente a cromatografia é pouca, a
grande parte utiliza-a como uma ferramenta muitas vezes apenas citada,
descrevendo muito sucintamente qual método cromatográfico foi utilizado, o que
torna difícil a repetibilidade da metodologia.
Apesar da grande utilidade da cromatografia, os equipamentos
empregados nas técnicas mais modernas têm alto custo e demanda de pessoal
especializado para operá-los. Assim o uso dessas técnicas fica restrita e muitas
vezes há a impossibilidade de realizá-las, e por vezes diagnósticos toxicológicos
não podem ser estabelecidos com precisão.
24

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