Biosseparação (BIO)

Profa Sonia Maria Alves Bueno

sonia@feq.unicamp.br
PED-C - Lucas Garcia Camargo (mestrando)
lcamargo@feq.unicamp.br

1. Objetivo(s)

 Purificar a imunoglobulina G humana (IgG) a partir de uma solução contendo IgG e

albumina de soro bovino (BSA) por cromatografia de troca-iônica em gel DEAE-
Sepharose;
 Determinar a isoterma de adsorção de BSA;
 Calcular os seguintes parâmetros: capacidade máxima de adsorção de BSA em DEAE-
Sepharose e constante de dissociação.

2. Fundamentação Teórica

O estudo da purificação de biomoléculas por cromatografia é assunto de grande

interesse dentro de diversas áreas da Biotecnologia. Dentro da área de purificação de
proteínas, a adsorção em resinas trocadoras de íons é uma das técnicas mais utilizada na
atualidade. Esta técnica baseia-se na interação eletrostática entre grupos ionizáveis presentes
na superfície das proteínas em solução com grupos de carga oposta presentes em uma fase
estacionária [1]. A carga líquida da proteína varia com o pH do meio onde se encontra e
depende do número e tipos de grupos R ionizáveis contidos na molécula. A escolha do
adsorvnete mais adequado (trocador de cátions ou trocador de ânions) dependerá, de forma
geral, do ponto isoelétrico da proteína alvo e do pH em que se deseja efetuar a adsorção
(Figura 1) [1]. Escolhido o adsorvente e as condições mais adequadas para a adsorção, faz-se
necessário a determinação dos parâmetros que descrevem o desempenho do sistema em
estudo. Uma das metodologias mais utilizadas para a obtenção de alguns dos principais destes
parâmetros consiste no estudo da adsorção em bateladas (frascos agitados) visando à
determinação de isotermas de adsorção. Nesse caso, o contato entre as fases é realizado de
modo que se tenha um estágio de equilíbrio. Uma isoterma de adsorção pode ser construída
plotando-se na abscissa, valores de concentração de soluto em equilíbrio na solução e na
ordenada, valores de concentração de soluto em equilíbrio na superfície do adsorvente.

Figura 1 – Representação esquemática, de acordo com a carga líquida de uma proteína

modelo, do comportamento da adsorção em resinas trocadoras de íons como função do pH. O
pI corresponde ao ponto isoelétrico da proteína. Fonte: Lucena, S. L. Tese de Doutorado.
FEQ, UNICAMP (1999) [2].
 No estudo do equilíbrio para a adsorção de um componente, o modelo matemático
mais utilizado, inclusive para correlacionar dados de adsorção de proteínas, é o modelo de
Langmuir [3], que pode ser descrito na forma (Eq. 1):

Qm .C * (1)
Q* 
Kd  C *

e pode assumir a forma linearizada (semi-recíproca, Eq. 2) [4],

C* 1 K (2)
 .C *  d
Q * Qm Qm

na qual C* é a concentração de soluto na fase líquida em equilíbrio com a fase sólida, Q* é a

quantidade de soluto adsorvido por unidade de massa ou volume de adsorvente, Qm é a
capacidade máxima do adsorvente em adsorver o soluto expressa em massa de soluto por
unidade de massa ou volume de adsorvente e Kd é a constante de dissociação efetiva que
descreve o equilíbrio da reação de adsorção [4].
Os parâmetros Qm e Kd podem ser obtidos a partir do ajuste não linear e linear da
equação de Langmuir. Outra informação importante que pode ser obtida a partir dos dados de
adsorção em batelada em tanques agitados é a presença ou não de cooperatividade no
fenômeno de adsorção. Isto pode ser feito analisando-se os dados segundo o modelo de
Langmuir-Freundlich (Eq. 3) [5]:
Qm .(C*)n (3)
Q* 
K dLF  (C*)n

na qual n é coeficiente de cooperatividade e KdLF é a constante do modelo de Langmuir-

Freundlich [5].

3. Equipamentos e Materiais

- Coluna cromatográfica contendo 1,0 mL de gel DEAE-Sepharose;

- Solução de IgG e BSA em tampão Tris-HCl a 25 mmol/L, pH 7,0 na concentração de 4,0
mg/mL;
- Sistema cromatográfico de baixa pressão;
- Tubos do tipo Eppendorf de 1,5 mL contendo 50 microlitros de gel DEAE-Sepharose;
- Equipamento de agitação;
- Micropipetas e tubos do tipo Eppendorf para determinações analíticas;
- Solução estoque contendo albumina de soro bovino (BSA) em tampão Tris-HCl 25
mmol/L, pH 7,0 na concentração de 20,0 mg/mL;
- Solução tampão Tris-HCl 25 mmol/L, pH 7,0 (tampão de adsorção e equilíbrio do gel)
- Espectrofotômetro na faixa visível de comprimento de onda;
- Solução (reagente de Bradford) para a determinação da concentração de proteína.

4. Procedimento Experimental

Purificação de IgG humana

Uma coluna cromatográfica modelo C 10/10 de 1,0 cm de diâmetro interno × 10,0 cm
de altura (GE Healthcare, EUA) empacotada com 1,0 mL de gel DEAE-Sepharose será
conectada a um sistema de cromatografia de baixa pressão, como o representado na Figura 2.
O adsorvente será equilibrado com o tampão Tris-HCl 25 mmol/L, pH 7,0 a uma vazão de 0,8
mL/min.

Figura 2 – Esquema do sistema cromatográfico de baixa pressão.

Após a etapa de equilíbrio, 1,0 mL de solução contendo IgG e BSA a uma

concentração de proteína total de 4,0 mg/ml será alimentada na coluna. Em seguida, a coluna
cromatográfica será lavada com o mesmo tampão utilizado para equilibrar a coluna com a
finalidade de eliminar as proteínas que não foram adsorvidas. A eluição será feita por
acréscimo de 0,5 mol/L de NaCl no tampão de equilíbrio. Finalizada a eluição, a coluna será
regenerada com solução de hidróxido de sódio a 50 mmol/L e, finalmente, com água. Durante
todo o experimento, serão coletadas frações das etapas de lavagem, eluição e regeneração para
análise. As frações obtidas serão monitoradas a 280 nm, quantificadas pelo método de
Bradford [6] e aquelas situadas nos picos de proteína serão agrupadas e analisadas por
eletroforese SDS-PAGE.

Isoterma de adsorção de BSA

a) Em tubos do tipo Eppendorf contendo o gel de troca iônica, preparar 1,0 mL de soluções
de BSA nas concentrações 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0; 5,0; 7,0; 10,0; 15,0 e 20,0 mg/mL, por
meio de diluição da solução estoque (20,0 mg/mL) fornecida em tampão de adsorção (25
mmol/L Tris-HCl pH 7,0). Agitar suavemente as soluções no interior dos frascos;
b) Colocar os tubos sob agitação por um período de 45 minutos;
c) Anotar a temperatura na qual o experimento é desenvolvido;
d) Após o tempo determinado (garantida a condição de equilíbrio), centrifugar os tubos a
4C por 10 minutos. Remover o sobrenadante dos tubos para o interior de novos tubos do
tipo Eppendorf numerados previamente;
e) Determinar, em duplicata, a concentração de equilíbrio das proteínas totais segundo a
metodologia de determinação proposta por Bradford [6]:
- No interior de frascos Eppendorf, adicionar 100 µL da amostra de solução protéica a ser
quantificada e 1000 µL (1,0 mL) da solução reagente de Bradford [6]. Em um dos
frascos, utilizar 100 µL da solução tampão no lugar da amostra. Esta solução será
utilizada como “branco” para “zerar” o espectrofotômetro;
- Agitar suavemente os frascos de modo a garantir a homogeneização da solução e
aguardar por dez minutos para efetuar a medida da absorbância das amostras;
- Utilizando cubetas de poliestireno, efetuar a medida das amostras em um
espectrofotômetro, utilizando o comprimento de onda de 595 nm;
- Repetir o procedimento todo para aquelas amostras cujo valor de absorbância exceder
0,600 unidades. Nesse caso, a amostra protéica deve ser diluída em tampão a fim de que a
concentração de proteína medida se enquadre na faixa estipulada;
f) Calcular as concentrações de proteína das amostras utilizando a curva de calibração dada
pela seguinte expressão: C = xx * A595 , onde C é a concentração de proteína da amostra
em mg/mL e A595 é a absorbância a 595 nm da referida amostra. O valor de xx será
fornecido no dia do experimento.

5. Cálculos e Análise dos Resultados

O relatório das experiências deverá conter:
a) Introdução;
b) Princípio do método de Bradford para dosagem de proteínas totais;
b) Materiais e Métodos;
c) Resultados e Discussão;
d) Análise crítica dos resultados e conclusão.
O relatório deverá conter ainda:
1. O perfil cromatográfico, o balanço de massa da purificação de IgG, a pureza de IgG obtida
no experimento, o fator de purificação e o rendimento (colocar a memória de cálculo).
Discutir criticamente os resultados obtidos com base na literatura apropriada de cromatografia
de troca iônica. Comparar os resultados obtidos com o de outros adsorventes comerciais ou
com dados encontrados na literatura pertinente.
2. A isoterma de adsorção de BSA em gel DEAE-Sepharose.
3. O ajuste de parâmetros Qm e Kd da equação de Langmuir na sua forma não-linear
(utilizando o MicrocalTM OriginTM ou outro software para o ajuste), incluindo memória de
cálculo. Realizar também o ajuste de parâmetros de equilíbrio Qm e Kd da equação de
Langmuir na sua forma linear. Calcular o parâmetro Kd em mol/L. Analisar os parâmetros
obtidos e comparar com aqueles obtidos para outros adsorventes de troca iônica.
4. O ajuste de parâmetros Qm e Kd(LF) da equação de Langmuir-Freundlich na sua forma não-
linear (utilizando o MicrocalTM OriginTM ou outro software para o ajuste), incluindo memória
de cálculo. Calcular o parâmetro Kd(LF) em mol/L.Analisar os parâmetros obtidos e comparar
com aqueles obtidos para outros adsorventes de troca iônica.
5. Discutir os resultados obtidos (análise crítica do experimento).

6. Bibliografia recomendada
 LUO, Q. E ANDRADE, J. D. Cooperative adsorption of proteins onto hydroxyapatite.
Journal of Colloid and Interface Science, 200 (1998) 104-113.
 Catálogos da GE Healthcare, Sigma, Fluka e Bio-Rad.
 COLLINS, C. H. Fundamentos de Cromatografia. Campinas: Editora da UNICAMP, 2006.
 HARRIS, E.L.V.; HANGAL, S. Protein Purification Methods – a Practical Approach, IRL
Press, New York, 1989.
 SCOPES, R. K. Protein Purification, Principles and Practices. NY, Springer Verlag, 1994.
7. Referências
[1] PESSOA-JR, A.; KILIKIAN, B. V. Purificação de Produtos Biotecnológicos. 1a ed.,
Editora Manole Ltda, v. 1. 444 p., 2005.
[2] LUCENA, S. L. Tese de doutorado. Faculdade de Engenharia Química, UNICAMP,
1999.
[3] BUENO, S.M.A.; HAUPT, K.; VIJAYALAKSHMI, M.A. Separation of immunoglobulin
G from human serum by pseudobioaffinity chromatography using immobilized L-
histidine in hollow fibre membranes. Journal of Chromatography B, 667 (1995) 57-67.
[4] MANDJINY, S.; VIJAYALAKSHMI, M.A. Quantitation of adsorption capacity of
immunoglobulin G on histidine-aminohexyl Sepharose and determination of affinity
constant. Journal of Chromatography, 616 (1993) 189-195.
[5] BRESOLIN, I. T. L.; BORSOI-RIBEIRO, M.; TAMASHIRO, W. M. S. C.; AUGUSTO,
E. F. P.; VIJAYALAKSHMI, M. A.; BUENO, S. M. A. Evaluation of Immobilized
Metal-Ion Affinity Chromatography (IMAC) as a Technique for IgG1 Monoclonal
Antibodies Purification: The Effect of Chelating Ligand and Support. Applied
Biochemistry and Biotechnology, 160 (2010) 2148-2165.
[6] BRADFORD, M. M. A Rapid and Sensitive Method for a Quatitation of Microgram
Quantities of Proteins Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical
Biochemistry, 72 (1976) 248-254.